CN108728370B - 一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株qd-01及其发酵方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD‑01及其发酵方法和应用。本发明对筛选到的菌株进行了发酵条件的优化研究，其中包括对产壳聚糖酶的单因素条件的优化和正交实验优化，获得了最佳的产酶条件。所述菌株产生的壳聚糖酶适应温度范围为35~60℃；pH为4.0~9.0；将该壳聚糖酶发酵液及冻干粗酶粉的酶活进行了比较，结果发现粗酶粉酶活基本不变，因此该制剂可冻干成粉，便于储存运输。本发明采用发酵产生的壳聚糖酶对壳寡糖制备工艺进行了摸索，缩短了壳寡糖的制备周期；而且该壳聚糖酶具有高度专一性。本发明提供的菌株以及制备得到的壳聚糖酶具有广泛的市场应用前景。

Description

一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD-01及其发酵方 法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD-01及其发酵方法和应用。

背景技术

目前生物法即通过壳聚糖酶来降解壳聚糖的生产工艺逐步代替传统的化学法，其具有降解效率高、产物较为均一，环境污染小等优点；现在市面上的壳聚糖酶制剂存在纯度小，酶活力不高，贮存周期较短的确定，所以人们不断的研究高效的壳聚糖酶希望改进生产工艺，提高生产效率。

能产生壳聚糖酶的细菌和真菌大都存在产酶量低的缺点，人们希望通过基因突变、工程菌改造等方式定向改变菌株以提高壳聚糖酶的产量，但是通过这两种手段存在成功率低，周期长等缺点，不利于工业化的生产。

发明内容

本发明的目的是提供了一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD-01及其发酵方法和应用。本发明从海洋环境中筛选到一株可以高效产壳聚糖酶的菌株QD-01，并对其发酵条件进行了优化，菌株产生的壳聚糖酶具有良好的性质，具有良好的市场应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD-01，其分类命名为鲑亚科肾杆菌Renibacterium salmoninarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.13655。

本发明提供了利用所述的菌株QD-01产壳聚糖酶的发酵方法，将所述菌株QD-01接种到种子培养基中培养12-16h，培养的温度为18-28℃；然后将种子培养液接种到发酵培养基中进行培养48-72h，发酵的温度在24℃-30℃；获得发酵培养液离心后进行膜过滤，最终获得高纯度的壳聚糖酶。

进一步的：所述发酵所用的碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖和马铃薯中的至少一种。

进一步的：所述发酵所用的氮源为蛋白胨、酵母粉、氯化铵、硫酸铵和大豆粉中的至少一种。

进一步的：所述发酵所用的缓冲液组分为K₂HPO₄-KH₂PO₄。

进一步的：所述菌株QD-01产酶的最佳条件是乳糖含量为0.1％、酵母粉含量为0.07％、壳聚糖浓度为0.75％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.4％，以质量比计。

本发明提供了所述的菌株QD-01发酵产生的壳聚糖酶。

进一步的：所述壳聚糖酶的适应温度为35～60℃，pH范围为4.0～9.0。

本发明还提供了所述的壳聚糖酶在生产壳聚糖中的应用。

具体应用步骤为：将壳聚糖加入到稀酸溶液中，加热条件下搅拌均匀，加入所述壳聚糖酶溶液进行反应，反应结束后加热煮沸，冷却后喷干，获得壳聚糖。

本发明的优点和技术效果是：本发明对筛选到的鲑亚科肾杆菌菌株进行了发酵条件的优化研究，其中包括对产壳聚糖酶的单因素条件进行了优化：碳源、氮源、无机盐、缓冲液体系、和温度等，获得了最佳的单因素条件；采用正交实验对菌株产壳聚糖酶的条件进行了优选，最终获得最佳的产酶条件：乳糖含量为0.1％、酵母粉含量为0.07％、壳聚糖浓度为0.75％、磷酸缓冲溶液(磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾0.4％)。

所述菌株产生的壳聚糖酶最适使用温度为35～60℃；最适pH为4.0～9.0，适应的pH范围广泛，明显优于现有的壳聚糖酶；通过对产生的壳寡糖结构分析发现该壳聚糖酶为内切酶。通过对壳聚糖酶蛋白片段(超滤、膜分离)分析发现，该壳聚糖酶发挥作用的主要是7KDa以上的蛋白片段，因此通过膜分离的方式获得该片段；将该壳聚糖酶发酵液及冻干粗酶粉的酶活进行了比较，实验发现粗酶粉酶活基本不变，因此该制剂可冻干成粉，便于储存运输。

本发明采用发酵产生的壳聚糖酶对脱乙酰度为90％、分子量为1KDa的壳寡糖制备工艺进行了摸索，制备工艺便捷高效，缩短了壳寡糖的制备周期，由原来的1.5天缩短到0.5天。

本发明采用发酵产生的壳聚糖酶对分子量为1KDa左右、不同脱乙酰度壳寡糖的制备工艺进行了摸索，并获得了脱乙酰度为70％、80％的壳寡糖。

本发明采用发酵产生的壳聚糖酶对其他糖类(褐藻胶、卡拉胶、琼胶、绿藻多糖)及胶原蛋白等进行了降解，发现该壳聚糖酶对上述糖及蛋白均没有降解作用，说明该壳聚糖酶的高度专一性。

所以本发明提供的菌株以及制备得到的壳聚糖酶具有广泛的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明菌株筛选的步骤示意图；

图2是本发明筛选到的细菌A在平板上生长情况；

图3是菌种DNA的凝胶电泳图谱；

图4是菌种16SrDNA基因序列的系统发育树；

图5是发酵碳源对菌株产酶的影响实验结果；

图6是发酵氮源对菌株产酶的影响实验结果；

图7是磷酸盐缓冲体系对产酶条件的影响实验结果；其中A：K₂HPO₄4g-KH₂PO₄ 2g；B：K₂HPO₄2g-KH₂PO₄ 4g；C：K₂HPO₄3g-KH₂PO₄ 1g；D：K₂HPO₄2g-KH₂PO₄ 2g；E：K₂HPO₄2g-KH₂PO₄3g；

图8是壳聚糖浓度对产酶条件的影响实验结果；

图9是CaCl₂添加方式对产酶条件的影响实验结果；其中，A表示未加氯化钙、B表示添加0.005％的CaCl₂、C表示添加0.01％的CaCl₂、D表示在发酵的第二天添加CaCl₂；

图10是温度对酶活的影响实验结果；

图11是pH对酶活的影响实验结果；

图12是壳寡糖TLC图谱，其中，1-GlcNH₂，2-原料CTS，3-降解产物COS；

图13是分子量1KDa壳寡糖质谱图；

图14是不同脱乙酰度壳寡糖TLC图谱，其中，0-GlcNH2，7-70％D.D，8-80％D.D，9-90％D.D；

图15是脱乙酰度为80％的壳寡糖质谱图；

图16是脱乙酰度为70％的壳寡糖质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

一、菌种的筛选

1.1菌株筛选的步骤

菌株筛选的步骤如图1所示。首先在青岛海边采回样品和海参加工废液进行预处理，然后将预处理样品直接与含有1％壳聚糖胶体的LB液体营养培养基混合在25℃的摇床培养箱中富集培养5d。

平板初筛选：取一定量富集好的样品置于加有无菌水的三角瓶中让样品充分打散，再用无菌水稀释成不同稀释度的悬浮液，取一定量的液体涂布于以壳聚糖为碳源的培养基中25℃培养4d，挑取有较大透明圈产生的菌株进行平板划线纯化。

平板二次筛选：将纯化后的菌株点接于壳聚糖培养基中，于28℃培养4d,测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，以D/d比值和d值为指标初步挑选出产壳聚糖酶能力相对较强的菌株作为研究对象。

1.2菌种的筛选结果与分析

根据菌种的筛选方法，本发明从海洋环境中一共筛选到15株菌，包括6株细菌9株真菌。根据水解壳聚糖胶体透明圈的大小挑选出其中一株高产酶量的细菌菌株A作为研究对象。

细菌A在平板上生长情况如图2所示。由图2得知，细菌A在1％壳聚糖培养基上生长状况：在接种的第一天细菌A生长并没有出现透明圈，D/d(透明圈直径/菌株直径，判断产酶能力大小)比值为零；细菌A生长的第二天菌落周围出现明显的透明圈，其D/d比值为2.7；细菌A生长的第五天其D/d比值为8，说明细菌A在生长的过程中产生大量的壳聚糖酶。而据现有文献报道为细菌在0.5％的壳聚糖培养基上的生长情况：细菌第五天的D/d比值2.65，远低于细菌A的D/d比值。因此表明细菌A可高效产生壳聚糖酶，易于在生产中推广。

1.3菌株A的细胞形态和理化实验结果

表1菌株A的细胞形态和理化实验结果

二.菌种鉴定结果

2.1菌种的鉴定

通过提取此细菌A的菌种DNA，经过扩增、分离、纯化、连接等步骤获得菌种的16SrDNA序列，将其与NCBI中的序列进行比对分析，得到菌种的具体信息。其菌种DNA的凝胶电泳图谱如图3所示。

16SrDNA基因序列测序结果如下所示(SEQ ID No:1所示)：

ATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTAACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACTGGATATGACCTGTCATCGCATGGTGGTGGGTGGAAAGTTTTTGCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAACAAGGCATCATTTTTGTGGTGTTGAGGGTACTTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCCGTGAAAGTCCGGGGCTCAACTCCGGATCTGCGGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGATGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCATTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGGATTAGAAAAGTGCAGAAATGTACTCCCCCTTTTGGGCTGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGG

上述为16SrDNA测序结果，大小为1400bp左右，其分析及发育树的构建如表4及图4所示。

表4 16SrDNA基因序列的分析和系统发育树的构建

根据16SrDNA序列选取具有较高同源性的Renibacterium菌属及其他一些标准菌株的16SrDNA基因序列进行系统学分析构建系统发育树如图4所示，菌株A与Renibacteriumsp菌(鲑鱼肾杆菌属)聚为一族。通过NCBI中菌株A的16SrDNA序列对比判断其与Renibacterium salmoninarum的相似度极高，将其命名为鲑鱼肾杆菌属(Renibacteriumsp.)中的鲑亚科肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)。

将筛选获得的菌株QD-01进行菌种保藏，保藏单位的名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，Renibacterium salmoninarum的保藏日期：2017年2月8日；保藏编号：CGMCCNo.13655。

三.菌株产壳聚糖酶条件的优化

为了提高菌株QD-01壳聚糖酶的产量，本发明主要从碳源、氮源、无机盐、缓冲液体系、温度等方面对菌株的发酵条件进行初步优化，以期为工业化生产打下基础。

本发明所述的菌株QD-01产壳聚糖酶的发酵方法包括以下步骤：

(1)将所述菌株QD-01接种到种子培养基中培养12-16h，培养的温度为18-28℃，当温度超过28℃时，菌体生长受到限制；

(2)然后将获得的种子培养液接种到发酵培养基中进行培养48-72h，发酵的温度在24℃-30℃，当温度超过30℃时细菌不再产酶；

(3)获得的发酵培养液离心去除溶液中的菌体及沉淀，再将发酵液进行膜过滤，去除溶液中的无机盐等小分子物质，最终获得纯度较高的壳聚糖酶。

3.1单因素条件

3.1.1发酵碳源对菌株产酶的影响

本实验验证了几种不同碳源对菌株产酶的影响，由于通过壳聚糖的诱导作用产酶，故试验中的碳源浓度低于壳聚糖的浓度；对照组中碳源为0.5％的壳聚糖，实验组中为在此基础上添加不同种类的低浓度糖类，图5显示四种常用的碳源对细菌产酶都有促进作用，其中乳糖的促进产酶效果最明显，其他几种碳源作用基本相似。

3.1.2发酵氮源对菌株产酶的影响

本试验以不同种类的氮源为研究，观察其对菌株产酶的影响。图6实验结果显示有机氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粉)对细菌产酶的促进作用明显高于无机氮源(氯化铵、硫酸铵)；其中酵母粉的促进产酶作用最明显，其次是大豆粉。

3.1.3缓冲溶液

在配制液体培养基的初期，溶液中pH会因壳聚糖的添加偏酸，而且K⁺对菌株产酶有一定的促进作用，因此在培养基中加入KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液体系。其中A：K₂HPO₄4g-KH₂PO₄2g、B：K₂HPO₄2g-KH₂PO₄ 4g、C：K₂HPO₄3g-KH₂PO₄ 1g、D：K₂HPO₄2g-KH₂PO₄ 2g、E：K₂HPO₄2g-KH₂PO₄ 3g物种不同的比例。通过对成分浓度的调整研究不同组合对菌株液体发酵产酶的影响，以520nm处紫外吸光度值的大小表示酶活力的大小，进而表示缓冲溶液对产酶条件的影响。

本试验通过改变溶液中KH₂PO₄-K₂HPO₄比例及含量来调节溶液中的pH值及K⁺的含量。图7实验结果发现缓冲液A组分对菌株提高产酶量促进作用最大，说明高浓度的K⁺能够促进细菌产酶。

3.1.4壳聚糖浓度对产酶条件的影响

通过图8实验结果可知，随着壳聚糖浓度的增加，菌种产酶量也呈增加的趋势；但是随着浓度的增加，发酵结束后溶液中的未被利用的壳聚糖也是呈现上升的趋势，也会导致测定的结果呈现假阳性。

3.1.5 CaCl₂添加方式对产酶条件的影响

以初筛培养基进行液体发酵时，氯化钙能影响某些细菌细胞壁的通透性从而影响细菌的产酶，因此本试验研究不同浓度的氯化钙以及不同添加时间对细菌液体发酵产酶的影响。其中A表示未加氯化钙、B表示添加0.005％的CaCl₂、C表示添加0.01％的CaCl₂、D表示在发酵的第二天添加CaCl₂，以520nm处紫外吸光度值的大小表示酶活力的大小，进而表示CaCl₂对产酶条件的影响。

由图9可知，CaCl₂浓度的大小及添加CaCl₂的时间对细菌产酶的影响差别不是很大，未添加CaCl₂的酶活力最高，其次是添加0.01％CaCl₂，因此试验证明氯化钙对促进细菌产酶影响不大。

综上所述，对菌株产生壳聚糖酶影响较大的是碳源(乳糖)、氮源(酵母粉)、壳聚糖浓度％；而缓冲溶液、CaCl₂添加方式对菌株产酶影响较小。

3.2正交条件

根据单因素条件的结果，将影响菌株产壳聚糖酶的主要因素设计正交实验L₍₉₎3⁴，如表5和表6所示。

表5单因素水平

表6正交实验表

采用正交实验对菌株产壳聚糖酶的条件进行了优选，最终获得最佳的产酶条件：乳糖含量为0.1％、酵母粉含量为0.07％、壳聚糖浓度为0.75％、磷酸缓冲溶液(磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾0.4％)，上述比例为上述组分的质量分别占培养基总体积的质量体积比。其中壳聚糖的浓度对菌株产酶的影响最大，其次为酵母粉及缓冲溶液，最后为乳糖的浓度。

四、壳聚糖酶学特性的研究

4.1温度对酶活力的影响

本试验主要观察温度对酶活的影响，实验发现从25℃到70℃呈现正态分布状态，其中40℃时酶活最高，70℃时酶活骤减，此时酶可能部分失活。由图10得出结论，该酶在35～60℃范围内酶活较高，最适使用温度为40℃。

4.2 pH对酶活力的影响

本试验主要观察pH对酶活的影响，图11实验结果发现从pH4.0～9.0范围酶活较高，适应的pH范围较广，从酸性跨越到碱性均可应用，扩大了该酶的使用范围，具有更高的应用价值。一般文献中报道及市面上的壳聚糖酶为中性偏酸性酶，使用pH一般为5.0～7.0左右，而利用该菌株产生的壳聚糖酶适应的pH范围较广，具有显著的使用优越性。

4.3壳聚糖酶蛋白活性片段的初步验证

通过对壳聚糖酶片段(超滤、膜分离)分析发现，该壳聚糖酶发挥降解作用的主要是7KDa以上的片段，通过膜分离的方式获得该片段并将其用于壳聚糖的降解，如图12所示。通过图12实验结果发现，<7KDa的壳聚糖酶片段却不能降解壳聚糖酶，而>7KDa的壳聚糖酶片段可降解壳聚糖(如图12)，说明此片段中含有壳聚糖酶的有效片段。

五、壳寡糖的制备方法

采用上述菌株QD-01发酵的壳聚糖酶应用到不同类型的壳寡糖的制备工艺中，主要分为以下三部分：

5.1脱乙酰度为90％、1KDa的分子量的壳寡糖的制备

采用壳聚糖酶对脱乙酰度为90％、分子量为<1KDa的壳寡糖的制备方法进行了摸索，具体步骤为：将1Kg脱乙酰度为90％的壳聚糖加入到稀盐酸溶液中，50℃下搅拌均匀，加入50mL酶溶液反应3h，升温至100℃加热煮沸10min，冷却后喷干。该工艺便捷高效，缩短了壳寡糖的制备周期，由原来的1.5天缩短到0.5天。

其中图13为脱乙酰度为90％、分子量<1KDa壳寡糖质谱图，其中m/z为323为壳寡糖二糖、m/z502为壳寡糖三糖、m/z663为壳寡糖四糖、m/z824为壳寡糖五糖、m/z985为壳寡糖六糖，因此该壳聚糖酶可产生聚合度为3～6的壳寡糖；且通过质谱的分析发现该壳聚糖酶为内切酶。

5.2分子量为1KDa左右、不同脱乙酰度的壳寡糖的制备

采用壳聚糖酶对分子量为1KDa左右、不同脱乙酰度壳寡糖的制备方法进行了摸索，具体步骤为：将1Kg脱乙酰度不同的壳聚糖加入到稀盐酸溶液中，50℃下搅拌均匀，加入50mL酶溶液反应3h，升温至100℃加热煮沸10min，冷却后喷干，获得了脱乙酰度为70％、80％、90％(图13)的壳寡糖，聚合度为2～5，如图15、16所示。

5.3壳聚糖酶对其他糖类/蛋白的降解作用

采用该壳聚糖酶分别作用于褐藻胶、卡拉胶、琼胶、胶原蛋白，实验发现该壳聚糖酶对几种糖类及蛋白均没有降解作用，说明该壳聚糖酶的高度专一性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司

<120> 一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD-01及其发酵方法和应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 鲑亚科肾杆菌

<400> 1

attagtggcg aacgggtgag taacacgtga gtaacctgcc cttaacttcg ggataagcct 60

gggaaactgg gtctaatact ggatatgacc tgtcatcgca tggtggtggg tggaaagttt 120

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cgaaagcatg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgttggg 720

cactaggtgt ggggggacat tccacgtttt ccgcgccgta gctaacgcat taagtgcccc 780

gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaagaaat tgacgggggc ccgcacaagc 840

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tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgttct 1020

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ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtcttg ggcttcacgc atgctacaat 1140

ggccggtaca aagggttgcg atactgtgag gtggagctaa tcccaaaaag ccggtctcag 1200

ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca 1260

gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgg 1287

Claims (7)

1.一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株QD-01，其特征在于：其分类命名为鲑亚科肾杆菌Renibacterium salmoninarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No. 13655；所述鲑亚科肾杆菌菌株QD-01的16SrDNA序列如SEQID No:1所示。

2.利用权利要求1所述的菌株QD-01产壳聚糖酶的发酵方法，其特征在于：将所述菌株QD-01接种到种子培养基中培养12-16h，培养的温度为18-28℃；然后将种子培养液接种到发酵培养基中进行培养48-72 h，发酵的温度在24℃-30℃；获得发酵培养液离心后进行膜过滤，最终获得高纯度的壳聚糖酶；

所述菌株QD-01产酶的最佳条件是乳糖含量为0.1%、酵母粉含量为 0.07%、壳聚糖浓度为0.75%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钾0.4%，以质量体积比计。

3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵所用的碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖和马铃薯中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵所用的氮源为蛋白胨、酵母粉、氯化铵、硫酸铵和大豆粉中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵所用的缓冲液组分为K₂HPO₄-KH₂PO₄。

6.权利要求1所述的菌株QD-01发酵产生的壳聚糖酶，其特征在于：所述壳聚糖酶的适应温度为35 ~ 60℃，最适使用温度为40℃；pH范围为4.0 ~ 9.0。

7.利用权利要求6所述的壳聚糖酶在生产壳聚糖中的应用，其特征在于：具体应用步骤为：将壳聚糖加入到稀酸溶液中，加热条件下搅拌均匀，加入所述壳聚糖酶溶液进行反应，反应结束后加热煮沸，冷却后喷干，获得壳聚糖。

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