TWI592482B - 黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株及利用其生產琥珀酸的方法 - Google Patents

Description

黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株及利用其生產琥珀酸的方法

本發明是有關於一種黑酵母菌及使用其生產琥珀酸的方法，且特別是有關於一種黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株及使用其生產琥珀酸的方法。

琥珀酸（succinic acid），又名丁二酸，其是生產1,4-丁二醇、丁二醇、γ-丁內酯、馬來酸和反丁烯二酸等化學品的重要原料。琥珀酸及其衍生物已被廣泛應用於食品及化學工業。目前琥珀酸的生產除了來自於石化原料以外，也可藉由微生物法來生產琥珀酸。具體來說，可以藉由微生物對葡萄糖進行糖解後而產生琥珀酸。以微生物法來生產琥珀酸具有可利用廢棄資源為原料、生產條件溫和以及對環境友善等優點。

目前已知可用於生產琥珀酸的微生物主要包括琥珀酸放線桿菌（ Actinobacillus succinogenes）、產琥珀酸放線桿菌（ Actinobacillus succinciproducens）以及產琥珀酸曼海姆菌（ Mannheinia succinciproducens），其皆為源自於自然環境的分離株。然而，上述三種菌株皆具有不耐酸、不耐氧以及只能利用葡萄糖作為碳源等缺點。因此，開發一種具有耐酸、耐氧特性且可利用多種碳源來生產琥珀酸的菌株，是目前研究人員亟欲解決的問題。

本發明提供一種經培養的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其具有耐氧、耐酸以及可利用多種碳源生產琥珀酸的特性。

本發明提供一種突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其具有耐氧、耐酸以及可利用多種碳源生產琥珀酸的特性。

本發明提供一種生產琥珀酸的方法，其利用黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株來代謝碳源以生產琥珀酸。

本發明提出一種經培養的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其會利用碳源生產琥珀酸。

在本發明的一實施例中，上述的碳源例如是醣類、有機酸或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的醣類例如是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、澱粉、木質素、半纖維素或纖維素。

在本發明的一實施例中，上述的有機酸例如是蘋果酸、延胡索酸或乳酸。

在本發明的一實施例中，上述的經培養的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可在pH值為3至9的環境下生長。

在本發明的一實施例中，上述的經培養的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可在有氧的環境下生長。

本發明提出一種突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC930183。

在本發明的一實施例中，上述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可利用碳源生產琥珀酸。

在本發明的一實施例中，上述的碳源例如是醣類、有機酸或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的醣類例如是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、澱粉、木質素、半纖維素或纖維素。

在本發明的一實施例中，上述的有機酸例如是蘋果酸、延胡索酸或乳酸。

在本發明的一實施例中，上述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可衍生自上述經培養的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。

在本發明的一實施例中，上述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可在pH值為3至9的環境下生長。

在本發明的一實施例中，上述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可在有氧的環境下生長。

本發明提出一種生產琥珀酸的方法，其包括以下步驟。將上述的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種於包括碳源的第一培養基中。培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基，以得到含有琥珀酸的所述第一培養基，其中黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株利用所述碳源生產琥珀酸。

在本發明的一實施例中，可於pH3至9、20℃至40℃、0 rpm至500 rpm以及有氧環境的條件下培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基。其中，可以在通入氣體或不通入氣體的條件下培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基。

在本發明的一實施例中，更包括於通入空氣量為0.1 vvm至2 vvm的條件下培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基。

在本發明的一實施例中，上述培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基可包括以下步驟。於通氣條件下進行第一發酵培養，使得菌株達到生長對數期。於停止通氣的條件下進行第二發酵培養。

在本發明的一實施例中，通氣條件例如是通入空氣量為0.1 vvm至2 vvm。

在本發明的一實施例中，可於pH3至9、20℃至40℃以及0 rpm至500 rpm的條件下進行第一發酵培養。

在本發明的一實施例中，可於於pH3至9、20℃至40℃以及0 rpm至500 rpm的條件下進行第二發酵培養。

在本發明的一實施例中，其中進行第一發酵培養的時間小於或等於24小時。

在本發明的一實施例中，上述的第一培養基可包括0.1%至6%的氮源以及1%至9%的碳源。

在本發明的一實施例中，上述的碳源例如是醣類、有機酸或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的醣類例如是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、澱粉、木質素、半纖維素或纖維素。

在本發明的一實施例中，上述的有機酸例如是蘋果酸、延胡索酸或乳酸。

在本發明的一實施例中，上述的氮源例如是蛋白質、黃豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨鹽、氨水、胺基酸或其組合。

在本發明的一實施例中，琥珀酸的含量例如是10克/公升至50克/公升。

在本發明的一實施例中，將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種於包括碳源的第一培養基中可包括以下步驟。將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種至第二培養基中。對接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第二培養基進行種子培養，以得到種菌液。將種菌液接種至所述第一培養基中。

在本發明的一實施例中，上述的進行種子培養的方式例如是將接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第二培養基於pH3至9、20℃至40℃以及0 rpm至500 rpm下培養8至48小時。

在本發明的一實施例中，上述的第二培養基為營養液體（Nutrient Broth；NB）培養基、麥芽抽出物培養基（malt extract agar；MEA）或馬鈴薯葡萄糖培養基（potato dextrose agar；PDA）。

基於上述，與習知以不耐酸、不耐氧且僅可以葡萄糖作為碳源的菌株和使用其生產琥珀酸的方法相比較，在本發明所提出的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株以及生產琥珀酸的方法中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可在弱酸以及有氧環境培養條件下，利用多種碳源產生大量的琥珀酸。

為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

本發明的第一實施例提供一種黑酵母菌（black yeast）出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其是以pH值為3之平板培養機作為分離培養基，由土壤以及污泥樣品中所篩選獲得。所獲得的出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株經培養後可利用碳源生產琥珀酸。

以下將詳細說明本發明的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的篩選流程及鑑定結果。

[菌株的篩選]

本發明的出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株是分離自土壤以及污泥。具體來說，出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的篩選流程包括以下步驟。

首先，將土壤以及污泥樣品塗布至pH值為3的營養液體（Nutrient Broth；NB）平板培養基（作為分離培養基），以分離出多個耐酸性的第一分離株。

接著，將該些耐酸性的第一分離株分別於NB平板培養基上培養1-2天後，以無菌接種環刮取約1 μL菌體，接種至5 mL NB液體培養基中，於30℃以及100 rpm的條件下培養1天，以得到種菌液。

然後，吸取50 μL的種菌液，分別接種至葡萄糖培養基（含有3%葡萄糖、0.5%酵母萃取物以及0.5%消化蛋白，後文中簡稱為HG培養基）以及木糖培養基（含有3%木糖、0.5%酵母萃取物以及0.5%消化蛋白，後文中簡稱為XYP培養基）中，使得接種量為1%，並於30℃、100 rpm以及有氧環境的條件下培養3天，以進行搖瓶發酵培養。而後，利用高效液相層析（high performance liquid chromatography；HPLC）法分析發酵液中琥珀酸的含量。藉此，篩選出多個以葡萄糖或木糖為碳源且在有氧環境下具有高琥珀酸產量（大於10克/升）的第二分離株。

之後，將該些第二分離株分別於NB平板培養基上培養1-2天後，以無菌接種環刮取約1 μL菌體，接種至5 mL NB液體培養基中，於30℃以及80 rpm的條件下培養1天，以得到種菌液。

然後，吸取50 μL的種菌液，分別接種於不同pH值（pH值分別為3、5以及7）的木糖液體培養基（XYP，5 mL）中，於30℃、80 rpm以及有氧環境的條件下培養3天，以進行搖瓶發酵培養。而後，利用高效液相層析法分析發酵液中琥珀酸的含量。藉此，篩選出在pH值為3的條件下（相對於pH值為5與pH值為7的條件下）具有最大琥珀酸產量的第三分離株。

[菌株的鑑定]

型態觀察

圖1A至圖1D為黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的菌落型態圖。圖1E至圖1N為黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的顯微構造圖。

將上述所篩選的第三分離株接種於麥芽抽出物培養基及馬鈴薯葡萄糖培養基中，經培養後進行型態觀察。在25℃下於MEA培養7天後，菌落正面平滑且黏稠，其中心呈現黏液狀。菌落中心呈現橄欖棕色至黑色，而菌落周圍呈現黃白色至黃色（如圖1A所示）。菌落背面中心呈現橄欖灰色至橄欖色，而菌落背面周圍呈現黃白色至灰黃色（如圖1B所示）。

在25℃下於PDA培養7天後，菌落正面平滑且黏稠。菌落的顏色呈現黃白色至棕黃色，部分呈現橄欖棕色（如圖1C所示）。菌落背面呈現黃白色至灰黃色，部分呈現橄欖棕色（如圖1D所示）。

在光學顯微鏡觀察下，具有透明及褐色至黑褐色菌絲（如圖1M所示，比例尺為10 μm）。其中，褐色菌絲具橫隔及厚壁，其直徑為4.1 μm至8.0 μm。透明菌絲平滑且具橫隔及薄壁，其直徑為1.8 μm至8.1 μm。隨著培養時間增長，菌絲會逐漸增厚變黑，可見黑褐色厚壁孢子（chlamydospore）產生，形狀為球形至不規則（如圖1N所示，比例尺為10 μm）。產孢細胞（coindiogenous cell）未分化，位於透明菌絲中間或末端，具有小齒（dentile）（如圖1E至圖1N所示，比例尺為10 μm）。具有透明及黑褐色分生孢子（conidia），其中透明分生孢子外壁平滑，形狀及大小變化大，常見側生出芽生殖，大小為4.2 μm-13.2 μm × 3.3 μm-7.2 μm（如圖1I至圖1J所示，比例尺為10 μm）。黑褐色分生孢子具厚壁及具有0-2個橫隔，其中無橫隔分生孢子的大小為7.1 μm-16.5 μm × 6.2 μm-9.1 μm。具有橫隔分生孢子的大小為11.0 μm-20.4 μm × 8.0 μm-10.1 μm（如圖1K至圖1L所示，比例尺為10 μm）。

LSU D1/D2片段及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段序列分析

首先，利用聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction；PCR）來擴增第三分離株的LSU D1/D2片段（具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列）及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段（具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列）。所得的SEQ ID NO:1的序列總長為571 bp，而所得的SEQ ID NO:2的序列總長為580 bp。

將上述所擴增的第三分離株的LSU D1/D2片段及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段與NCBI GenBank資料庫進行比對。比對的結果顯示，LSU D1/D2片段與 Aureobasidium melanogenumCBS 105.22T（FJ150926）的相似度為99.82%。rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段與 Aureobasidium melanogenumCBS 105.22T（FJ150886）的相似度為98.34%。

依據上述對第三分離株的型態觀察以及LSU D1/D2片段及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段的序列分析結果，鑑定第三分離株為本發明的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。

在本實施例中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株包括下列生化性質： （1）可利用醣類、有機酸或其組合作為碳源來生產琥珀酸。醣類例如是單醣、雙醣或多醣。單醣例如是葡萄糖、木糖、果糖或半乳糖。雙醣例如是蔗糖。多醣例如是澱粉、木質素、半纖維素或纖維素。有機酸例如是蘋果酸、延胡索酸或乳酸。 （2）可在pH值為3至9的環境下生長。 （3）可在有氧的環境下生長。

本發明的第二實施例提供一種突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。具體來說，此突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株衍生自上述第一實施例所述的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。

以下將詳細說明獲得本發明的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的詳細步驟。

首先，提供上述第一實施例的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株以作為母株。接著，依序使用10%的甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate；EMS）以及能量為0.1焦耳的紫外光對潛力菌株進行化學誘變以及紫外線誘變，以誘導突變株產生。然後，對上述所獲得的突變株於有氧環境下進行進行搖瓶振盪發酵培養，篩選琥珀酸高產株，以得到本發明的具有高琥珀酸產量的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。

上述所獲得的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株已於2016年8月15日寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC930183。

在本實施例中，突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株包括下列生化性質： （1）可利用醣類、有機酸或其組合為碳源來生產琥珀酸。醣類例如是單醣、雙醣或多醣。單醣例如是葡萄糖、木糖、果糖或半乳糖。雙醣例如是蔗糖。多醣例如是澱粉或纖維素。有機酸例如是蘋果酸、延胡索酸或乳酸。 （2）可在pH值為3至9的環境下生長。 （3）可在有氧的環境下生長。

圖2為依照本發明之一實施例的一種生產琥珀酸的流程步驟圖。

請參考圖2，並提供生產琥珀酸步驟的詳細敘述如下。

首先，執行步驟S100：將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種於包括碳源的第一培養基中。在本實施例中，步驟S100可進一步包括子步驟S102、S104、S106。在本實施例中，執行子步驟S102：將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種至第二培養基中。在本實施例中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株包括上述第一實施例或第二實施例中的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株中的至少一者。第二培養基例如是NB液體培養基。

接著，執行子步驟S104：對接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第二培養基進行種子培養，以得到種菌液。具體來說，進行種子培養的方式例如是將接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第二培養基於20℃至40℃以及0 rpm至500 rpm的條件下培養8小時至48小時，以得到種菌液。

然後，執行子步驟S106：將種菌液接種至第一培養基中。在本實施例中，按體積比計算，種菌液的接種量例如是0.1%至10%。第一培養基包括0.1%至6%的氮源以及1%至9%的碳源。碳源例如是醣類、有機酸或其組合。醣類例如是單醣、雙醣或多醣。單醣例如是葡萄糖、木糖、果糖或半乳糖。雙醣例如是蔗糖。多醣例如是澱粉、木質素、半纖維素或纖維素。有機酸例如是蘋果酸、延胡索酸或乳酸。黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可利用第一培養基中的碳源來生產琥珀酸。氮源例如是蛋白質、黃豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨鹽、氨水、胺基酸或其組合。在本實施例中，第一培養基的氮源例如是0.1%至3%的消化蛋白以及0.1%至3%的酵母萃取物。第一培養基的pH值例如是3至9。在一較佳實施例中，第一培養基的pH值例如是3至6.5。

之後，執行步驟S110：培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基，以得到含有琥珀酸的所述第一培養基，其中黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株利用碳源生產琥珀酸。在本實施例中，例如是於20℃至40℃、0 rpm至500 rpm以及有氧環境下培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基。在進行培養過程中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株會利用第一培養基中的碳源來產生琥珀酸。

除了在上述條件下進行培養外，更可在通空氣的條件下進行培養。具體來說，例如是於通入空氣量為0.1 vvm至2 vvm的條件下培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基。在上述通氣量的範圍內進行培養，有助於黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株產生高量的琥珀酸。至此，即完成了琥珀酸的生產。琥珀酸含量的例如是5克/公升至50克/公升。

在執行步驟S110之後，可進一步將含有琥珀酸的第一培養基進行純化，以得到具有高純度的琥珀酸。

圖3為依照本發明的另一實施例的生產琥珀酸的流程步驟圖。在此必須說明的是，下述實施例沿用前述實施例的部份流程步驟，並在執行步驟S100後進行後續的步驟。因此，下述實施例將沿用前述實施例的部分內容，並且省略了相同技術內容的說明。關於省略部分的說明可參考前述實施例，下述實施例不再重複贅述。

在執行步驟S100之後，執行步驟S120：培養接種有黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的第一培養基，以得到含有琥珀酸的所述第一培養基，其中黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株利用碳源生產琥珀酸。在本實施例中，執行步驟S120的方式例如是二階段發酵法：首先，在通空氣的條件下進行第一階段發酵培養，以快速增加提高菌株密度；接著，在停止通氣的條件下進行第二階段發酵培養，以產生大量的琥珀酸。

步驟S120可進一步包括子步驟S122、S124。執行子步驟S122：於通氣條件下進行第一發酵培養，使得菌株達到生長對數期，例如是生長對數期的前期或中期。具體來說，於通氣條件例如是通入空氣量為0.1 vvm至2 vvm的條件下進行第一發酵培養。在本實施例中，可於pH3至9、20℃至40℃以及0 rpm至500 rpm的條件下進行第一發酵培養。在一較佳實施例中，可於pH3至6.5、20℃至40℃以及50 rpm至500 rpm的條件下進行第一發酵培養。在進行第一發酵培養的過程中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株會快速生長，以提高第一培養基中的菌株密度。在本實施例中，進行第一發酵培養的時間例如是小於或等於24小時。更具體來說，藉由進行第一發酵培養，使得菌株生長達到生長對數期的中期。

接著，執行子步驟124：於停止通入空氣的條件下進行第二發酵培養。在本實施例中，例如是於pH3至9、20℃至40℃以及0 rpm至500 rpm的條件下進行第二發酵培養。在一較佳實施例中，可於pH3至6.5、20℃至40℃以及50 rpm至200 rpm的條件下進行第一發酵培養。在進行第二發酵培養過程中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的生長會趨緩，且會大量利用碳源來產生琥珀酸。至此，即完成了琥珀酸的生產。琥珀酸含量的例如是10克/公升至50克/公升。在本實施例中，碳源例如是木糖。

在執行步驟S120之後，可進一步將含有琥珀酸的第一培養基進行純化，以得到具有高純度的琥珀酸。

以下將以實驗例具體說明本發明，但實驗例之參數與其數據結果僅是用來說明本發明的功效，而並非是用以限定本發明之範圍。

[氮源含量及供氧對菌株生長與琥珀酸生產的影響]

實驗例1

首先，將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種於含有100 mL NB培養基的250 mL搖瓶中，於30℃、80 rpm下培養1天，以得到種菌液。在本實驗例中，是使用第一實施例中的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。接著，按體積比將種菌液以1%的接種量接種至含50 mL的高氮培養基（含有3%木糖、1%酵母萃取物以及1%消化蛋白）的250 mL搖瓶中，於30℃、80 rpm、弱酸（PH值小於5.8）下進行震盪培養3天，並於培養24小時、48小時及66小時後，取樣分析OD ₆₀₀值及琥珀酸含量。在本實驗例中，以震盪培養提供高氧環境。

實驗例2

使用與實驗例1類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於以靜置培養取代震盪培養。在本實驗例中，以靜置培養提供低氧環境。

實驗例3

使用與實驗例1類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於以低氮培養基（含有3%木糖、0.1%酵母萃取物以及0.1%消化蛋白）取代高氮培養基。

實驗例4

使用與實驗例1類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於以低氮培養基取代高氮培養基以及以靜置培養取代震盪培養。

圖4為實施例1至實施例4的生長曲線圖。圖5為實施例1至實施例4的培養時間對應琥珀酸產量的關係圖。

請參照圖4，無論是使用高氮培養基或低氮培養基來進行培養，菌株在高氧環境下（即震盪培養）生長較佳，且在震盪培養48小時後，菌株OD ₆₀₀值達最高。也就是說，在高氧環境下有助於黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株生長。

此外，請參照圖5，無論是在高氧環境（震盪培養）或低氧環境（靜置培養）下進行培養，菌株於高氮培養基中培養可生產較高量的琥珀酸。也就是說，高氮培養基有助於黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株生產琥珀酸。另外，當黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株於高氮培養基中進行震盪培養（即實施例1）48小時時，可產生最大量的琥珀酸。

[攪拌轉速及通氣量對菌株生長、琥珀酸生產及木糖消耗量的影響]

實驗例5

首先，將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種於含有100 mL NB培養基的250 mL搖瓶中，於30℃、80 rpm下培養1天，以得到種菌液（OD ₆₀₀值=0.8-0.9）。在本實驗例中，是使用第一實施例中的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。接著，按體積比將種菌液以1%的接種量接種至含3 L的XYP培養基（含有3%木糖、1%酵母萃取物以及1%消化蛋白）的5 L攪拌式發酵槽中，於30℃、300 rpm、1 vvm、弱酸（PH值小於5.8）下進行發酵培養，並於培養0、16、24、40、48及65小時後，取樣分析OD ₆₀₀值、琥珀酸含量及XYP培養基中的木糖含量。

實驗例6

使用與實驗例5類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於攪拌轉速為100 rpm。

實驗例7

使用與實驗例5類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於攪拌轉速為100 rpm以及通氣量為0.33 vvm。

實驗例8

使用與實驗例5類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於攪拌轉速為50 rpm以及通氣量為0.33 vvm。

圖6為實驗例5至實驗例8的生長曲線圖。圖7為實驗例5至實驗例8的培養時間對應琥珀酸產量的關係圖。圖8為實驗例5至實驗例8的培養時間對應XYP培養基中的木糖含量的關係圖。

請參照圖6，在相同的通氣量下，攪拌轉速越高，菌株生長較佳。而在相同攪拌轉速下，通氣量越高，菌株生長較佳。也就是說，提高供氧可有助於黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株生長。此外，由圖6的結果也可以看出，在攪拌轉速300 rpm及通氣量1 vvm的條件下，最有利黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株生長。

請參照圖7，在實驗例5中，在進行發酵培養24小時會有最高的琥珀酸含量，但在進行發酵培養24小時後，琥珀酸的含量會快速下降，也就是說，在進行發酵培養24小時後，琥珀酸會被快速消耗。而在實驗例5至實驗例8中，實驗例6具有最高的琥珀酸產量，且在進行發酵培養65小時時，琥珀酸的含量達8克/升。此外，由圖8的結果可知，在進行發酵培養16小時的過程中，實驗例5至實驗例8中的XYP培養基中的木糖含量仍保持高含量，也就是說，在進行發酵培養16小時的過程中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株並不太使用木糖，而是利用其他碳源。而在進行發酵培養16小時後（即菌株生長減緩及琥珀酸開始明顯產生時），實驗例5至實驗例8中的XYP培養基中的木糖含量開始下降。也就是說，在進行發酵培養16小時後，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株才會大量利用木糖來生產琥珀酸。此外，實驗例5中的菌株由於在高攪拌轉速及高通氣量下會生長快速（如圖6所示），也就是說，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株需要較多的碳源來提供生長所需的能量，因此黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株除了會使用XYP培養基中的木糖，也會消耗所產生的琥珀酸。

[二階段發酵對菌株生長、琥珀酸生產及木糖消耗量的影響]

實驗例9

首先，將黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株接種於含有100 mL NB培養基的250 mL搖瓶中，於30℃、80 rpm下培養1天，以得到種菌液（OD ₆₀₀值=0.8-0.9）。在本實驗例中，是使用第一實施例中的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。接著，按體積比將種菌液以1%的接種量接種至含3 L的XYP培養基（含有3%木糖、1%酵母萃取物以及1%消化蛋白）的5 L攪拌式發酵槽中。然後，於30℃、300 rpm、1 vvm、弱酸（pH值小於5.8）下發酵培養24小時（第一階段）。之後，停止通氣，並於30℃、300 rpm以及弱酸（pH值小於5.8）的條件下進行發酵培養（第二階段）。於不同培養時間點（0、16、24、40、48及65小時）取樣分析OD ₆₀₀值、琥珀酸含量及XYP培養基中木糖的消耗量。

實驗例10

使用與實驗例5類似的方法來培養黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株，其差別只在於是使用第二實施例中的突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株。

圖9為實驗例9的培養時間對應OD ₆₀₀值、琥珀酸產量及木糖消耗量的關係圖。圖10為實驗例10的培養時間對應OD ₆₀₀值、琥珀酸產量及木糖消耗量的關係圖。

請參照圖9，在進行發酵培養24小時時（第一階段），黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的密度達到最高。而後，由於在停止通氣下進行發酵培養（第二階段），因此黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的生長速度開始趨緩。此外，由圖9的結果也可看出，在進行第二階段發酵培養過程中，XYP培養基中的木糖消耗量以及琥珀酸含量明顯隨培養時間增長而增加。也就是說，在進行第二階段發酵培養過程中，由於黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的生長趨緩，因此黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可減少利用木糖來提供生長時所需要的碳源，而可利用木糖來生產較高量的琥珀酸。在本實驗例中，琥珀酸的產量可提高至13.9克/升。

請參照圖10，在進行發酵培養24小時時（第一階段），突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的密度達到最高。而後，由於在停止通氣下進行發酵培養（第二階段），因此突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的生長速度開始趨緩。此外，由圖10的結果也可看出，在進行第二階段發酵培養過程中，XYP培養基中的木糖消耗量以及琥珀酸含量明顯隨培養時間增長而增加。也就是說，在進行第二階段發酵培養過程中，由於突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的生長趨緩，因此突變型黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可減少利用木糖來提供生長時所需要的碳源，而可利用木糖來生產較高量的琥珀酸。在本實驗例中，琥珀酸的產量可提高至17.7克/升。

綜上所述，與習知以不耐酸、不耐氧且僅可以葡萄糖作為碳源的菌株和使用其生產琥珀酸的方法相比較，在本發明所提出的黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株以及生產琥珀酸的方法中，黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株可在弱酸以及有氧環境培養條件下，利用多種碳源產生大量的琥珀酸。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

S100、S110、S120‧‧‧步驟

S102、S104、S106、S122、S124‧‧‧子步驟

圖1A至圖1D為黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的菌落型態圖。 圖1E至圖1N為黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株的顯微構造圖。 圖2為依照本發明的一實施例的生產琥珀酸的流程步驟圖。 圖3為依照本發明的另一實施例的生產琥珀酸的流程步驟圖。 圖4為實施例1至實施例4的生長曲線圖。 圖5為實施例1至實施例4的培養時間對應琥珀酸產量的關係圖。 圖6為實驗例5至實驗例8的生長曲線圖。 圖7為實驗例5至實驗例8的培養時間對應琥珀酸產量的關係圖。 圖8為實驗例5至實驗例8的培養時間對應XYP培養基中的木糖含量的關係圖。 圖9為實驗例9的培養時間對應OD ₆₀₀值、琥珀酸產量及木糖消耗量的關係圖。 圖10為實驗例10的培養時間對應OD ₆₀₀值、琥珀酸產量及木糖消耗量的關係圖。

TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2016/08/15，BCRC930183

＜110＞ 國立清華大學、長春人造樹脂廠股份有限公司、長春石油化學股份有限公司   ＜120＞ 黑酵母菌出芽短梗黴 Aureobasidium melanogenum菌株及利用其生產琥珀酸的方法   ＜160＞ 2   ＜210＞ 1   ＜211＞ 571   ＜212＞ DNA   ＜213＞ Aureobasidium melanogenum＜400＞ 1 aaaccaacag ggattgccct agtaacggcg agtgaagcgg caacagctca aatttgaaag     60 ctggccttcg ggtccgcatt gtaatttgta gaggatgctt tgggtgaaac gccagtctaa        120 gttccttgga acaggacgtc atagagggtg agaatcccgt atgtgactgg aaatgttaac       180 ctatgtaaag ctccttcgac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa atgggaggta        240 aatttcttct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gcacaagtag agtgatcgaa       300 agatgaaaag cactttggaa agagagttaa aaagcacgtg aaattgttga aagggaagcg      360 cttgcaatca gacttgttta aactgttcgg ccggtcttct gaccggttta ctcagtttgg          420 acaggccagc atcagtttcg gcggccggat aaaggctctg ggaatgtggc cttcacttcg       480 gtgaaggtgt tatagcccag tgtgtaatac ggccagccgg gactgaggtc cgcgcttcgg       540 ctaggatgct ggcgtaatgg ttgtaagcga c                                 571   ＜210＞ 2   ＜211＞ 580   ＜212＞ DNA   ＜213＞ Aureobasidium melanogenum＜400＞ 2   aagtcgtaac aaggtttccg taggtgaacc tgcggaagga tcattaaaga gtaagggtgc      60 tcagcgcccg acctccaacc ctttgttgtt aaaactacct tgttgctttg gcgggaccgc        120 tcggtctcga gccgctgggg attcgtccca ggcgagcgcc cgccagagtt aaaccaaact     180 cttgttatca aaaccggtcg tctgagtaaa aattttgaat aaatcaaaac tttcaacaac         240 ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt       300 gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgccccttgg tattccgagg        360 ggcatgcctg ttcgagcgtc attacaccac tcaagctatg cttggtattg ggtgccgtcc        420 ttagttgggc gcgccttaaa gacctcggcg aggcctcacc ggctttaggc gtagtagaat       480 ttattcgaac gtctgtcaaa ggagaggact tctgccgact gaaacctttt attttttcta          540 ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa                         580

S100、S110‧‧‧步驟

S102、S104、S106‧‧‧子步驟

Claims (25)

1. 一種突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC930183。
2. 如申請專利範圍第1項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其會利用碳源生產琥珀酸。
3. 如申請專利範圍第2項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述碳源為醣類、有機酸或其組合。
4. 如申請專利範圍第3項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述醣類包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、澱粉、木質素、半纖維素、纖維素或其組合。
5. 如申請專利範圍第3項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述有機酸包括蘋果酸、延胡索酸、乳酸或其組合。
6. 如申請專利範圍第1項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其衍生自申請專利範圍第1項所述的經培養的黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株。
7. 如申請專利範圍第1項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其在pH值為3至9的環境下生長。
8. 如申請專利範圍第1項所述的突變型黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株，其在有氧的環境下生長。
9. 一種生產琥珀酸的方法，包括：將如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株接種於包括碳源的第一培養基中；以及培養接種有所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培養基，以得到含有琥珀酸的所述第一培養基，其中所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株利用所述碳源生產琥珀酸。
10. 如申請專利範圍第9項所述的生產琥珀酸的方法，於pH3至9、20℃至40℃、0rpm至500rpm以及有氧環境的條件下培養接種有所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培養基。
11. 如申請專利範圍第10項所述的生產琥珀酸的方法，更包括於通入空氣量為0.1vvm至2vvm的條件下培養接種有所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培養基。
12. 如申請專利範圍第9項所述的生產琥珀酸的方法，其中培養接種有所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培養基的步驟包括：於通氣條件下進行第一發酵培養，使得所述菌株達到生長對數期；以及於停止通氣的條件下進行第二發酵培養。
13. 如申請專利範圍第12項所述的生產琥珀酸的方法，所述通氣條件為通入空氣量為0.1vvm至2vvm。
14. 如申請專利範圍第12項所述的生產琥珀酸的方法，於pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的條件下進行所述第一發酵培養。
15. 如申請專利範圍第12項所述的生產琥珀酸的方法，於pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的條件下進行所述第二發酵培養。
16. 如申請專利範圍第12項所述的生產琥珀酸的方法，其中進行所述第一發酵培養的時間小於或等於24小時。
17. 如申請專利範圍第9項所述的生產琥珀酸的方法，其中所述第一培養基包括：0.1%至6%的氮源；以及0.1%至9%的所述碳源。
18. 如申請專利範圍第9項所述的生產琥珀酸的方法，其中所述碳源包括醣類、有機酸或其組合。
19. 如申請專利範圍第18項所述的生產琥珀酸的方法，其中所述醣類包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、澱粉、木質素、半纖維素、纖維素或其組合。
20. 如申請專利範圍第18項所述的生產琥珀酸的方法，其中所述有機酸包括蘋果酸、延胡索酸、乳酸或其組合。
21. 如申請專利範圍第17項所述的生產琥珀酸的方法，其中所述氮源包括蛋白質、黃豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨鹽、氨水、胺基酸或其組合。
22. 如申請專利範圍第9項所述的生產琥珀酸的方法，其中琥珀酸的含量為5克/公升至50克/公升。
23. 如申請專利範圍第9項所述的生產琥珀酸的方法，其中將所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株接種於包括所述碳源的所述第一培養基中的步驟包括：將所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株接種至第二培養基中；對接種有所述黑酵母菌出芽短梗黴Aureobasidium melanogenum菌株的所述第二培養基進行種子培養，以得到種菌液；以及將所述種菌液接種至所述第一培養基中。
24. 如申請專利範圍第23項所述的生產琥珀酸的方法，其中進行所述種子培養的方式包括將接種有所述黑酵母菌出芽短梗 黴Aureobasidium melanogenum菌株的所述第二培養基於pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的條件下培養8小時至48小時。
25. 如申請專利範圍第23項所述的生產琥珀酸的方法，其中所述第二培養基為營養液體培養基、麥芽抽出物培養基或馬鈴薯葡萄糖培養基。