CN110724654A - 一株生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株生产5‑羟甲基‑2呋喃甲酸的铜绿假单胞菌及其应用，属于生物技术领域。本发明公开的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC‑1，保藏号为CCTCC NO：M 2019537。利用该菌株转化5‑羟甲基糠醛为5‑羟甲基‑2呋喃甲酸，具有反应时间短，条件温和，对环境无污染，产物选择性高的特点。同时本发明还提供了该菌株在制备5‑羟甲基糠醛中的应用，产物产量高，具有广泛地应用前景。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及到一种铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的分离，以及该菌在催化5-羟甲基糠醛生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的应用。
背景技术
随着石油资源的日益匮乏和全球变暖的加剧，近年来，人们逐渐将目光转移到生物基能源和平台化合的开发和利用。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethy1furfural，HMF）是一种重要的生物基平台化合物，位于美国能源部宣布的“Top 10+4”平台化合物之列，化学性质比较活泼，可以制备多种衍生物（Green Chem, 2017, 19, 4544）。5-羟甲基糠醛经过选择性还原可以制备5-羟甲基-2呋喃甲酸（5-hydroxymethylfuroicacid，HMFCA），5-羟甲基-2呋喃甲酸是重要的药物中间体，广泛应用于各种生物可降解材料的制备，也是合成各种聚酯材料和白细胞介素抑制剂的重要合成砌块（Green Chem, 2014, 16, 2762），具有重要的应用价值。
目前，5-羟甲基糠醛制备5-羟甲基-2呋喃甲酸的主要方法是通过化学法来实现（Chem Rev, 2013, 113, 1499）。但化学方法常需使用化学计量的氧化剂或催化计量的重金属催化剂，对环境污染很大。此外，化学法易导致活性羟基或醛基的过度氧化，产生副产物，影响后续分离纯化；并且通常以毒性较大的吡啶、DMSO等做为溶剂。近年来，生物催化法作为一种绿色的方法引起了广泛地重视，具有反应条件温和，操作简单，产物选择性高等特点（ChemRev, 2013, 114, 1871）。但是，5-羟甲基糠醛是一种微生物抑制物，可在5-羟甲基糠醛中生长的微生物较少，而针对利用5-羟甲基糠醛制备5-羟甲基-2呋喃甲酸的研究还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在5-羟甲基糠醛生长的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1。
本发明的又一目的是提供一种利用该菌株生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，该方法具有反应时间短，条件温和，对环境无污染，产物选择性高的优点。
本发明的再一目的是提供一种所述菌发酵制备5-羟甲基糠醛的应用，该应用方法操作简单，产量高。
本发明的目的采用下述技术方案实现。
本发明提供一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2019537，该微生物具有5-羟甲基糠醛耐受性，可在含有5-羟甲基糠醛的培养基中生长发酵。
本发明还提供一种利用铜绿假单胞菌PC-1转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，该方法属于生物催化法，选择性高、操作简单、反应条件温和、用时短且无污染。
所述方法具体包括，将铜绿假单胞菌PC-1接种于含有5-羟甲基糠醛的培养基中培养，获得5-羟甲基-2呋喃甲酸。其中接种量为2.5-20 mg/mL，培养基的pH为5.5-8.0、5-羟甲基糠醛的浓度为50-200mM，培养温度为15-45 ℃，在上述条件下，铜绿假单胞菌PC-1可高效转化5-羟甲基糠醛，5-羟甲基-2呋喃甲酸选择性好。
优选的技术方案中，培养基中5-羟甲基糠醛的浓度为95-105mM。
优选的技术方案中，菌株接种量为9.5-10.5 mg/mL。
优选的技术方案中，转化pH为6.8-7.2。
优选的技术方案中，培养温度为32-37℃。
优选的技术方案中，培养过程中，每隔5-7小时向培养基中补加5-羟甲基糠醛，每升培养基中每次补加5-羟甲基糠醛90-110mmol。
有益效果：
1）本发明提供的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1具有5-羟甲基糠醛耐受性，不光可在含有5-羟甲基糠的培养基中生长，还可催化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸。
2）本发明转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，具有操作简单，条件温和，转化率高，副产物低，反应时间短等特点。现有技术中均无法达到此效果。通过批次补料或者流加补料的方式获得高产的5-羟甲基-2呋喃甲酸，具有很好的应用前景。
附图说明
图1显示铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1的转化时间对5-羟甲基糠醛（HMF）转换率与5-羟甲基-2呋喃甲酸（HMFCA）的产率的影响。
图2显示不同5-羟甲基糠醛浓度对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PC-1菌株生长的影响。
图3显示不同PH对5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产率的影响。
图4显示不同温度对5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产率的影响。
图5显示铜绿假单胞菌PC-1接种量对5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产率的影响
图6显示流加补料过程中5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产量的变化。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1，已经保藏。分类命名为Pseudomonas aeruginosa PC-1，保藏日期为2019年07月11日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO.M2019537。
具体实施方式
材料：
筛选固体培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 2 g/L，5-羟甲基糠醛 50 mM，琼脂3 g/L。
增菌培养液：酵母粉5 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 2 g/L。
液体培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0。
上述三种培养基中的溶剂均为水。
高效液相检测方法：将反应液通过Dionex P680使用Kromasil 100-5 C18柱（4.6mm×250 mm）在240 nm处检测
实施例一
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1的分离和鉴定
以高浓度5-羟甲基糠醛为筛选压力从南京、苏州药厂周边土壤等样品中筛选获得铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1。
（1）将土样用去离子水溶解后，将上清液涂布至筛选固体培养基进行培养，培养温度为35 ℃，培养时间为24～48 h。此方法可筛选到耐高浓度5-羟甲基糠醛微生物。
（2）将步骤（1）获得的菌株挑到增菌培养液中进行富集培养，培养温度为35 ℃，培养12～14 h后获得种子液。
（3）将步骤（2）获得的种子液按照0.5 mg/mL接种量接种于含有100 mM 5-羟甲基糠醛的液体培养基中进行转化检测。转化温度为35 ℃，转化时间为7h，转速为150 rpm，通过高效液相检测5-羟甲基糠醛转化为5-羟甲基-2呋喃甲酸转化能力。结果如图1所示，培养转化6h后，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率在85%以上。
通过上述方法，发明人获得了一株具有高效转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸菌株PC-1。该菌株的16S rDNA如SEQ ID No.1所示，经过16S rDNA序列分析，表明该菌株与多株Pseudomonas aeruginosa 菌的同源性为99%，故属于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌属，并命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1。
经鉴定，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1的生物学特征为革兰氏阴性菌株，无芽孢，菌落呈淡黄色，轻微隆起，圆形，边缘整齐，湿润、粘稠、易挑起；显微镜观察菌体为杆菌，有的微弯，专性好氧，最适生长温度为25℃～42℃。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应、氧化酶反应、硝酸还原反应结果为阳性，有动力，氧化葡萄糖、木糖产酸，可利用木糖、蔗糖、甘露糖，不能利用乳糖，淀粉。
实施例二
本实施例说明5-羟甲基糠醛浓度对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PC-1生长量及5-羟甲基糠醛的转化率的影响。
按实施例一的方法获得种子液。分别于5瓶装有等体积的液体培养基中加入不同浓度的5-羟甲基糠醛（50mM、75mM、100mM、150 mM、200mM），同时以1瓶不加入5-羟甲基糠醛作为对照，混匀后每瓶均按5 mg/mL接种量接种，150 rpm、35 ℃培养12 h后，用分光光度计测量铜绿假单胞菌PC-1浓度，结果如图2所示，随着5-羟甲基糠醛浓度的增加，菌体的生长逐渐受到抑制。当5-羟甲基糠醛的初始浓度不高于100 mM时，培养12h菌体生长量受到的影响较小，当5-羟甲基糠醛的初始浓度高于100 mM时，菌体生长受到抑制，几乎停止生长。通过高效液相测定测定5-羟甲基糠醛转化为5-羟甲基-2呋喃甲酸转化能力。当5-羟甲基糠醛的初始浓度为50mM和100 mM时，转化率均为100%，当浓度为100 mM时，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率最高，达85.4%。因此，选择100 mM作为5-羟甲基糠醛的初始添加浓度。
实施例三
本实施例说明不同PH对5-羟甲基-2呋喃甲酸产率与5-羟甲基糠醛转化率的影响
按实施例一的方法获得种子液后，分别以10 mg/mL的接种量接种于不同PH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）含有100 mM 5-羟甲基糠醛的液体培养基中，150 rpm培养35℃、6 h后，分别取样进行高效液相检测。结果如图3所示，当PH7.0时，5-羟甲基糠醛转化率达到100%，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率最高，达到89.2%，为最优反应条件。
实施例四
本实施例说明不同温度对5-羟甲基-2呋喃甲酸产率与5-羟甲基糠醛转化率的影响
按实施例一的方法获得种子液后，分别以10 mg/mL的接种量接种于PH7.0的含有100mM 5-羟甲基糠醛的液体培养基中，分别放置于不同温度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）的摇床中进行培养、150rpm、反应6 h后，分别取样进行高效液相检测。结果如图4所示，当温度达到35℃时，5-羟甲基糠醛转化率达到100%，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率最高，达到90.6%，为最优反应条件。
实施例五
本实施例说明铜绿假单胞菌PC-1接种量对5-羟甲基-2呋喃甲酸产率与5-羟甲基糠醛转化率的影响
按实施例一的方法获得种子液后，按不同接种量（2.5、5、10、15、20 mg/mL）分别接种于液体培养基中，并加入100 mM的5-羟甲基糠醛，150rpm培养35 ℃、6 h后，分别取样进行高效液相检测。结果如图5所示，随着接种量的变化，5-羟甲基糠醛的转化率和5-羟甲基-2呋喃甲酸产率在10 mg/mL都达到最大。当超过10 mg/mL后, 5-羟甲基糠醛的转化率和5-羟甲基-2呋喃甲酸产率皆下降。因此，选择10 mg/mL为最佳的菌株接种量。此条件下，5-羟甲基糠醛的转化率均为100%，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率为91.5%。
实施例六
本实施例说明一种利用铜绿假单胞菌PC-1转化5-羟甲基糠醛生产5-羟甲基-2呋喃甲酸在工业上的应用
由图1得知，当5-羟甲基糠醛消耗量逐渐加大时，产物5-羟甲基-2呋喃甲酸浓度逐渐趋于饱和，因此为提高产量，以流加补料方式进行发酵生产。
按照实施例一的方法获得种子液，以10 mg/mL接种量接种于含有100 mM 5-羟甲基糠醛的液体培养液中（5 L发酵罐装液量2.5 L），以150rpm，35 ℃培养。以高效液相色谱检测5-羟甲基糠醛转化率和5-羟甲基-2呋喃甲酸产量变化，每隔6h向体系中添加250mmol5-羟甲基糠醛，培养54 h后，5-羟甲基糠醛总转化率达到89.8 %，产量为808.88 mM，产量呈直线增长（图6）。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京科技职业学院
扬州大学附属医院
南京钟鼎生物科技有限公司
<120> 一株生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的铜绿假单胞菌及其应用
<130> 20191122
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1499
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1
<400> 1
agattagagt ttgatcctgg ctcagattga acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt 60
cgagcggatg aagggagctt gctcctggat tcagcggcgg acgggtgagt aatgcctagg 120
aatctgcctg gtagtggggg ataacgtccg gaaacgggcg ctaataccgc atacgtcctg 180
agggagaaag tgggggatct tcggacctca cgctatcaga tgagcctagg tcggattagc 240
tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgatccgta actggtctga gaggatgatc 300
agtcacactg gaactgagac acggtccaga ctcctgcggg aggcagcagt ggggaatatt 360
ggacaatggg cgaaagcctg atccagccat gccgcgtgtg tgaagaaggt cttcggattg 420
taaagcactt taagttggga ggaagggcag taagttaata ccttgctgtt ttgacgttac 480
caacagaata agcaccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggtgcaag 540
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc gcgtaggtgg ttcagcaagt tggatgtgaa 600
atccccgggc tcaacctggg aactgcatcc aaaactactg agctagagta cggtagaggg 660
tggtggaatt tcctgtgtag cggtgaaatg cgtagacata ggaaggaaca ccagtggcga 720
aggcgaccac ctggactgat actgacactg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcgacta gccgttggga tccttgagat 840
cttagtggcg cagctaacgc gataagtcga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 900
actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttacctgg ccttgacatg ctgagaactt tccagagatg gattggtgcc 1020
ttcgggaact cagacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt ccttagttac cagcacctcg ggtgggcact 1140
ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc 1200
ccttacggcc agggctacac acgtgctaca atggtcggta caaagggttg ccaagccgcg 1260
aggtggagct aatcccataa aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1320
gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgtgaat cagaatgtca cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgct ccagaagtag ctagtctaac 1440
cgcaaggggg acggttacca cggagtgatt catgactggg gtgagagtcg taaggaggg 1499
Claims (9)
1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1，保藏编号为CCTCC NO：M2019537。
2.一种转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在于以权利要求1所述菌株作为生物催化剂。
3.根据权利要求2所述转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在将权利要求1所述菌株接种于含有5-羟甲基糠醛的培养基中培养，获得5-羟甲基-2呋喃甲酸；所述菌株的接种量为2.5-20 mg/mL，所述培养基的pH为 5.5-8.0、5-羟甲基糠醛的浓度为50-200 mM，培养温度为15-45 ℃。
4.根据权利要求3所述转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在于所述培养基中5-羟甲基糠醛的浓度为95-105mM。
5.根据权利要求3所述转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在所述菌株的接种量为9.5-10.5 mg/mL。
6.根据权利要求3所述转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在于所述培养基的pH为6.8-7.2。
7.根据权利要求3所述转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在于所述培养温度为32-37℃。
8.根据权利要求7所述转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，其特征在于培养过程中，每隔5-7小时向培养基中补加5-羟甲基糠醛，每升培养基中每次补加5-羟甲基糠醛90-110mmol。
9.权利要求1所述菌株在制备5-羟甲基糠醛中的应用。
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