CN103502441A

CN103502441A - 基因修饰的细胞和使用所述细胞的方法

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Publication number: CN103502441A
Application number: CN201280012453.5A
Authority: CN
Inventors: 尼克·约翰尼斯·皮特斯·维尔克斯; 汤姆·丹尼尔·伊林克·舒尔曼; 斯皮克·马特恩·库基伯尔; 哈拉德·约翰·鲁杰瑟纳斯
Original assignee: Purac Biochem BV
Current assignee: Purac Biochem BV
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2032-03-07
Also published as: BR112013022915A2; EP2683815B1; HUE027066T2; EP2683815A2; US10023890B2; ES2543568T3; WO2012064195A2; JP2017060471A; AU2012202889B2; PL2683815T3; WO2012064195A3; BR112013022915B1; KR101947202B1; DK2683815T3; US20180023105A1; MX336694B; MX2013010226A; EA023764B9; US9309546B2; NL2006359C2

Abstract

本发明涉及呋喃化合物的生物转化的领域。更具体地，本发明涉及具有改善的呋喃化合物生物催化转化特征的新的基因修饰的细胞和适于宿主细胞的基因修饰的载体。本发明进一步的方面旨在使用根据本发明的细胞生物转化5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)和其前体的方法。

Description

基因修饰的细胞和使用所述细胞的方法

技术领域

本发明大体上涉及呋喃化合物生物转化的领域。这种生物转化可用于生产呋喃-2，5-二羧酸(FDCA)和处理含木质纤维素的材料(例如用于生产生物燃料和生物化学品)。更具体地，本发明涉及新的基因修饰的细胞，其具有改善的用于呋喃化合物的生物催化转化的特征。本发明的进一步方面涉及适合宿主细胞基因修饰以提高其呋喃化合物的生物转化特征的载体。本发明的其他方面涉及使用根据本发明的细胞生物转化5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)和其前体的方法。

背景技术

呋喃化合物的生物转化逐渐引起人们注意。这涉及下述两个方面：从生物质中生物生产有希望的增值化学品——呋喃-2，5-二羧酸(FDCA)的方面(Werpy等(2004))，和它们在从含木质纤维素的材料发酵生产生物燃料和生物化学品的不利作用方面(Almeida等(2009))。

最近已经分离了利用呋喃化合物的生物体，Cupriavidus basilensisHMF14(Koopman等(2010a)。该生物体能够代谢糠醛和5-(羟甲基)呋喃-2-甲醛(HMF)。Koopman等(2010a)已经公开了Cupriavidus basilensis HMF14中糠醛和HMF降解路径以及涉及的基因。

Koopman等(2010b)公开了将来自Cupriavidus basilensis HMF14的hmfH基因功能性引入Pseudomonas putida S12中。所得菌株具有好的使用HMF作为底物的FDCA生产能力。然而，观测到的5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)的积累物将需要长的处理时间或需要采取措施以去除该副产品。对于可能生产FDCA的许多应用，期望充分去除HMF-酸副产品，并且有时甚至是必要的。

在寻找HMF-酸积累问题的解决方案时，本发明的发明人现在已经令人吃惊地发现Pseudomonas putida S12 FDCA生产系统中某些多肽的表达有效降低HMF-酸积累。

发明内容

发明人的该发现已经得出下述一般概念：宿主中具有SEQ ID.NO.1或2或其相似物/同源物(比如SEQ ID NO：3或4)的氨基酸序列的多肽与一种或多种能够转化5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)的多肽一起表达产生有效的HMF-酸生物转化。提高的HMF-酸生物转化有益于从那些呋喃化合物被认为是有害的原料(比如用于生产例如生物燃料的产醇发酵原料或用于化学品的生物学生产的发酵原料)中消除HMF-酸和其呋喃前体。在其他应用中，改善的HMF-酸生物转化将比如在FDCA生物生产中改善其中HMF-酸是起始材料或中间产物的化学品的生物生产。

因此本发明的第一目标是基因修饰的细胞，其包含编码具有SEQ ID.NO：1、2、3或4或其相似物/同源物的氨基酸序列的第一多肽的第一多核苷酸序列和编码具有HMF-酸转化活性的第二多肽的第二多核苷酸序列。转化HMF-酸的多肽可以是由之前描述的Cupriavidus basilensis HMF14 hmfH基因(Koopman等2010a和Koopman等2010b)编码的氧化还原酶。根据某些实施方式，优选地，基因修饰的细胞包含第三多核苷酸序列，其编码具有SEQID.NO：19、20、21、22、23、24、25或其相似物/同源物的氨基酸序列的第三多肽。第三氨基酸序列的功能性表达产生能够转化呋喃醛的醛脱氢酶活性。

如果第二多肽是氧化还原酶，第一多肽与氧化还原酶的同时共表达就生物催化FDCA生产而言也可提高包含氧化还原酶的全细胞生物催化剂的质量。

通过功能性引入至少第一多核苷酸序列来对根据本发明的细胞进行基因修饰。优选地，通过功能性引入第一和第二多核苷酸序列二者对细胞进行基因修饰。或者，通过功能性引入第一和第三多核苷酸序列对细胞进行基因修饰。功能性引入第一、第二和第三多核苷酸所有三个多核苷酸是进一步可选的。

本发明的进一步方面涉及适合宿主细胞基因修饰的载体。载体包含编码具有SEQ ID.NO.1、2、3或4或其相似物/同源物的氨基酸序列的第一多肽的第一多核苷酸序列和编码具有5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)转化活性的第二多肽的第二多核苷酸序列。任选地载体可包含编码具有SEQ ID.NO：19、20、21、22、23、24、25或其相似物/同源物的氨基酸序列的第三多肽的第三多核苷酸序列。这种载体适合获得根据本发明的基因修饰的细胞。

本发明的其他方面涉及转化5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)的方法。该方法利用根据本发明的细胞。根据优选的实施方式，该方法适合生产FDCA。

本发明的进一步方面在于根据本发明的基因修饰的细胞的用途，所述细胞用于将呋喃前体生物转化成FDCA。

附图说明

图1公开呋喃化合物氧化反应生成2，5-呋喃二羧酸的示意性标示图。列出了下列呋喃化合物：1，HMF-醇；2，HMF；3，HMF-酸；4，FFA；5，FDCA。

图2公开P.putida S12_2642(图2a)和P.putida S12_B38(图2b)的进料HMF的培养物中FDCA生产和HMF-酸积累(◆，FDCA(mM)；■，HMF-酸(mM)；○，细胞干重(CDW；g/l)；虚线：HMF进料速度(ml，4M溶液/h))。

图3公开图2中显示的分批进料过程期间在不同时间点下的FDCA比生产率(深：P.putida S12_2642；浅：P.putida S12_B38)。

图4公开P.putida S12_B38(图4a)和B51(图4b)摇瓶实验中FDCA生产和HMF-酸积累(▲，HMF(mM)；◆，FDCA(mM)；■，HMF-酸(mM)；○，细胞干重(CDW；g/l))；

图5公开以高细胞密度开始对P.putida S12_B38的进料HMF的高细胞密度培养物中FDCA生产和HMF-酸积累(□，HMF；◆，FDCA(mM)；■，HMF-酸(mM)；○，细胞干重(CDW；g/l)；虚线：HMF进料速度(ml 4M溶液/h))。

图6公开FDCA、FFA和HMF-酸在P.putida S12_B38(共表达的HmfH和HmfT1；A)；S12_B97(共表达的HmfH，HmfT1和醛脱氢酶；B)；和S12_B101(共表达的HmfH和醛脱氢酶；C)的含HMF的摇瓶培养物中的积累。▲，HMF(mM)；◆，FDCA(mM)；■，HMF-酸(mM)；●，FFA(mM)；○，细胞干重(CDW；g/l)。

序列概述

SEQ ID NO：1列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的HmfT1的氨基酸序列。该序列的GenBank获取号为ADE20411.1。

SEQ ID NO：2列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的HmfT2的氨基酸序列。该序列的GenBank获取号为ADE20404.1。

SEQ ID NO：3列出来自具有来自Methylobacterium radiotolerans JCM2831(＝ATCC 27329＝DSM 1819)的基因座标签(locus tag)mrad2831_4728的基因的蛋白产物的氨基酸序列。该序列的GenBank获取号为ACB26689.1。

SEQ ID NO：4列出来自Sulfolobus acidocaldarius DSM 639的saci_2058基因蛋白产物的氨基酸序列。该序列的GenBank获取号为AAY81352.1。

SEQ ID NO：5列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的HmfH的氨基酸序列。该序列的GenBank获取号为ADE20408.1。

SEQ ID NO：6列出来自Bradyrhizobium japonicum USDA 110的blr0367基因的蛋白产物的氨基酸序列。该序列的GenBank获取号为BAC45632.1。

SEQ ID NO：7列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的hmfT1的编码序列。

SEQ ID NO：8列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的hmfT2的编码序列。

SEQ ID NO：9列出来自Methylobacterium radiotolerans JCM 2831(＝ATCC 27329＝DSM 1819)的具有基因座标签mrad2831_4728的基因的编码序列。

SEQ ID NO：10列出来自Sulfolobus acidocaldarius DSM 639的saci_2058基因的编码序列。

SEQ ID NO：11列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的hmfH的编码序列。

SEQ ID NO：12列出来自Bradyrhizobium japonicum USDA 110的blr0367基因的编码序列。

SEQ ID NO：13-18列出各种合成引物的序列。示出了限制区域(下划线)、起始密码子和终止密码子(反向互补)(斜体)和推定的核糖体结合位点(小写)。设计FN23引物刚好在hmfH起始密码子的上游。

SEQ ID NO：13列出合成DNA引物hmfT1(f)的核苷酸序列

5’-ACGAATTCAAaggagACAACAGAAG-3’

SEQ ID NO：14列出合成DNA引物hmfT1(r)的核苷酸序列

5’-AAGCTAGCTGAGCAGTCACCC

CTC-3’

SEQ ID NO：15列出合成DNA引物FN23的核苷酸序列。

5’-CGGAATTCCACATGACAagggagACCG-3’

SEQ ID NO：16列出合成DNA引物FN24的核苷酸序列。

5’-CGGAATTCGCTTCGGTCT

ACTCGGATG-3’

SEQ ID NO：17列出合成DNA引物mrad(f)的核苷酸序列。

5’-ACGAATTCggaggAAATCT

CAGACC-3’

SEQ ID NO：18列出合成DNA引物mrad(r)的核苷酸序列。

5’-AAGCTAGCGCAGAACCGTATCG

G-3’

SEQ ID NO：19列出来自Cupriavidus basilensis HMF14的醛脱氢酶Adh的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20列出具有Genbank获取号：YP_003609156.1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21列出具有Genbank获取号：ZP_02881557.1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22列出具有Genbank获取号：YP_003451184.1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23列出具有Genbank获取号：ACA09737.1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24列出具有Genbank获取号：YP_530742.1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25列出具有Genbank获取号：YP_001541929.1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26列出编码来自Cupriavidus basilensis HMF14的醛脱氢酶Adh的adh的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：27列出编码列具有Genbank获取号：YP_003609156.1的氨基酸序的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：28列出编码具有Genbank获取号：ZP_02881557.1的氨基酸序列的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：29列出编码具有Genbank获取号：YP_003451184.1的氨基酸序列的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：30列出编码具有Genbank获取号：ACA09737.1的氨基酸序列的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：31列出编码具有Genbank获取号：YP_530742.1的氨基酸序列的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：32列出编码具有Genbank获取号：YP_001541929.1的氨基酸序列的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：33列出合成DNA引物FN13的核苷酸序列：5’-ATGCGGCCGCAACAaggagAAGATGGA

AACG-3’(下划线序列：NotI限制性酶切位点；醛脱氢酶编码基因的起始密码子(ATG)为斜体；推定的核糖体结合位点(RBS)为小写)。

SEQ ID NO：34列出合成DNA引物FN14的核苷酸序列：5’-ATGCGGCCGCGCGTCGGGGTCGGTG

-3’(下划线序列：NotI限制性酶切位点；终止密码子(反向互补链)为斜体)。

发明详述

在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其语法变体如“包含”(″comprises″，″comprising″)、“包括”(″includes″and″including″)应被解释为开放式的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。

冠词“一”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一个元件”可表示一个元件或多于一个元件。

术语“许多”应理解为具有一种或多种的意思。

本文中呋喃化合物被理解为具有呋喃环的任何化合物。优选地呋喃化合物是可氧化成2，5-呋喃-二羧酸的化合物。与本发明背景相关的呋喃化合物包括[5-(羟甲基)呋喃-2-基]甲醇(“HMF-醇”)、5-(羟甲基)呋喃-2-甲醛(“HMF”)、5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(“HMF-酸”)、5-甲酰呋喃-2-羧酸(“FFA”)、呋喃-2，5-二甲醛(DFF)和呋喃-2，5-二羧酸(“FDCA”)。呋喃环或任何其可取代的侧基可用例如OH、C1-C10烷基、烷基、烯丙基、芳基或RO-醚部分，包括环状基团，在呋喃环的任何可用位置上取代。下面列出了许多相关呋喃化合物的化学结构。

术语“多核苷酸”包括多脱氧核糖核酸(DNA)和多核糖核酸(RNA)并且该术语可指DNA或RNA。本领域技术人员明白DNA和RNA分子稳定性的差异。因此，本领域技术人员能够从术语“多核苷酸”使用的背景理解哪种形式的多核苷酸(DNA和/或RNA)是合适的。

如本文所使用，术语序列“相似度”指与单个多核苷酸或蛋白序列相似的程度。两条序列之间的相似度的程度是基于同一性的程度结合保守改变的程度。“序列相似度”的百分数是相同的或保守改变的氨基酸或核苷酸的百分数，即“序列相似度”＝(％序列同一性)+(％保守改变)。

为了本发明的目的，“保守改变”和“同一性”认为是更宽的术语“相似度”的下位概念。因此，任何时候使用术语序列“相似度”，其涵盖了序列“同一性”和“保守改变”。

本领域技术人员知道术语“序列同一性”。为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列共有的序列同一性程度，就最适比较的目的而言比对所述序列(例如为了与第二氨基酸或核酸序列最适比对，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。这类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可在更短的比较长度上进行，例如在约20个、约50个、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。

然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。序列之间共有的同一性程度典型地被表述为所述两条序列之间的同一性百分比，并且是所述序列中相同残基共有的相同位置数的函数(即％同一性＝相应位置处的相同残基的数量/位置总数x100)。优选地，被比较的两条序列具有相同或基本相同的长度。

可类似于序列同一性的百分数，确定“保守改变”的百分数。然而，在该情况下，在可能保留初始残基的功能性质的氨基酸或核苷酸序列的具体位置处改变被打分，就像没有发生改变一样。

对于氨基酸序列，相关的功能性质是氨基酸的物理化学性质。本发明多肽中氨基酸的保守置换可选自氨基酸所属类的其他成员。例如，蛋白生物化学领域熟知，属于具有具体尺寸或特性(比如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸分组的氨基酸可替换为另一氨基酸而不改变蛋白的活性，尤其在不与生物活性直接关联的蛋白区域。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、大冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守置换包括，例如，Lys置换为Arg且反之亦然以保持正电荷；Glu置换为Asp且反之亦然以保持负电荷；Ser置换为Thr从而保持游离的-OH；和Gln置换为Asn以保持游离的-NH₂。

对于核苷酸序列，相关的功能性质主要是某些核苷酸在开放阅读框序列中携带的关于转录和/或翻译机制的生物学信息。人们公知遗传密码具有简并性(或冗余性)并且多个密码子可携带关于它们编码的氨基酸的同样的信息。例如在某些物种中，氨基酸亮氨酸由UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG密码子(或DNA的TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG)编码，并且氨基酸丝氨酸由UCA、UCG、UCC、UCU、AGU、AGC(或DNA的TCA、TCG、TCC、TCT、AGT、AGC)表示。不改变翻译信息的核苷酸改变被认为是保守改变。

本领域技术人员明白下述事实：可获得使用不同数学算法的若干种不同的计算机程序以测定两条序列之间的同一性。例如，可使用采用Needleman和Wunsch算法的计算机程序(Needleman等(1970))。根据一种实施方式，计算机程序是Accelerys GCG软件包中的GAP程序(Accelerys Inc.，San DiegoU.S.A)。可使用的置换矩阵是，例如BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4和长度权重为1、2、3、4、5或6。本领域技术人员将意识到所有这些参数将产生些许不同的结果，但是当使用不同的算法时两条序列同一性的总体百分数不会明显改变。

根据一种实施方式，使用Accelrys GCG软件包中的GAP程序(AccelerysInc.，San Diego U.S.A)测定两条核苷酸序列之间的同一性百分数。使用NWSgapdna CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。

在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(Meyers等(1989))的算法，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12和缺口罚分4测定两条氨基酸或核苷酸序列的同一性百分数，所述算法已经整合进ALIGN程序(2.0版)中(可使用Genestream server IGH Montpellier France序列数据，获得自ALIGN Query http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。

对于本发明，最优选使用BLAST(Basic Local Alignment Tool)测定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分数和/或相似度。

使用Altschul等(1990)的BLASTn、BLASTp、BLASTx、tBLASTn和tBLASTx程序的查询可经http://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得的在线版BLAST提交。可选地可使用也经NCBI因特网站下载的单机版的BLAST(例如，2.2.24版(2010年8月23日发行))。优选地用下列参数进行BLAST查询。为测定氨基酸序列之间的同一性百分数和/或相似度：算法：blastp；字长：3；打分矩阵：BLOSUM62；缺口成本：存在：11，延伸：1；运算调整：条件运算打分矩阵调整；滤波器：关；屏蔽：关。为测定核苷酸序列之间的同一性百分数和/或相似度：算法：blastn；字长：11；查询范围最大匹配：0；匹配/错配分数：2、-3；缺口成本：存在：5，延伸：2；滤波器：地复杂性区域；屏蔽：仅屏蔽查询表。

在指定的算法和计算机程序帮助下，类似于序列同一性的百分数，测定“保守改变”的百分数。一些计算机程序，例如，BLASTp，提供阳性的数量/百分数(＝相似度)和同一性的数量/百分数。可通过从阳性/相似度的百分数减去同一性的百分数获得保守改变的百分数(保守改变百分数＝相似度百分数-同一性百分数)。

一般的分子生物学技术，比如杂交实验、PCR实验、限制性酶消化、宿主的转化等等可根据本领域技术人员已知的标准实践进行，如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel等(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(JohnWiley&Sons，N.Y.)中公开。

第一多核苷酸和多肽

根据本发明的基因修饰的细胞包含编码第一多肽的第一多核苷酸。第一多肽包含与SEQ ID NO：1、2、3或4的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列。

或者，序列相似度可表示为至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的相似度。根据一种实施方式，示出的相似度百分数可以是同一性百分数。在具体的实施方式中，第一多肽可包含如SEQ ID NO：1、2、3或4的任一条列出的氨基酸序列。

这种多肽能够提供HMF-酸生物转化方面的改进。

不希望被任何理论束缚，认为这种多肽具有HMF-酸运输能力。通过第一多肽将HMF-酸运输至细胞内，HMF-酸对于胞内转化而言可更好地获得。因此可改善HMF-酸生物转化。

HMF-酸生物转化的这种改善已经在HmfT1(SEQ ID NO：1)和来自Methylobacterium radiotolerans JCM 2831(＝ATCC 27329＝DSM 1819)具有基因座标签mrad2831_4728的基因的蛋白产物(SEQ ID NO：3)的例子中显示。基于这些序列的序列相似度/同一性水平，预期HmfT2(SEQ ID NO：2)和来自Sulfolobus acidocaldarius DSM 639的Saci_2058基因的蛋白产物将具有类似的作用是合理的。

HmfT2(SEQ ID NO：2)与HmfT1(SEQ ID NO：1)具有超过90％的相似度。同一性水平是87％。

基于来自不同功能家族的转运蛋白的CLUSTALW2多重序列比对，预期来自Sulfolobus acidocaldarius DSM 639的saci_2058基因的蛋白产物(SEQ IDNO：4)具有类似的功能。Sulfolobus转运蛋白形成具有HmfT1(SEQ ID NO：1)和Mrad2831_4728(SEQ ID NO：3)的簇。而且，对S.acidocaldarius基因组的分析已经显示转运蛋白基因saci_2058的侧翼有下述基因，所述基因分别编码与hmf基因簇类似功能——预期降解HMF(或HMF样化合物)的活性类型。例子：Saci_2057，醇脱氢酶；Saci_2059/2060，芳环双加氧酶；Saci_2062，酰基-CoA合成酶(功能上与hmfD相当)；Saci_2063，烯酰-CoA水合酶(功能上与hmfE相当)；Saci_2064，醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶(功能上与hmfABC相当)。基于该分析预期来自Sulfolobus acidocaldarius DSM 639的Saci_2058基因的蛋白产物(SEQ ID NO：4)将具有与HmfT1(SEQ ID NO：1)和/或来自具有来自Methylobacterium radiotolerans JCM 2831(＝ATCC 27329＝DSM 1819)的基因座标签mrad2831_4728的基因的蛋白产物(SEQ ID NO：3)相类似的作用是合理的。

第一多肽可由与SEQ ID NO：7、8、9或10列出的多核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的第一多核苷酸序列编码。第一多核苷酸与SEQ ID NO：7、8、9或10列出的序列的合适的其他可选的相似度水平可以是至少66％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相似度。根据一种实施方式，示出的相似度百分数可以是同一性百分数。在具体的实施方式中，第一多肽可由SEQID NO 7、8、9或10列出的多核苷酸序列编码。

第一多肽或编码第一多肽的多核苷酸可分离自生物体，优选在某些生长条件下表达第一多肽的微生物。该微生物可以能够使用HMF-酸或相关的呋喃物质，比如HMF或HMF-醇，作为碳源，但这不是必须的。

在典型的方法中，可对基因库进行筛选以分离其他可选的合适的多核苷酸。该库可由来自细菌超界的微生物构建。这些微生物可属于蛋白菌门，更具体地属于α蛋白菌或β蛋白菌纲。α蛋白菌可属于根瘤菌目，属于慢生根瘤菌科或甲基杆菌科。慢生根瘤菌科可属于Bradyrhizobium属，例如，Bradyrhizobium japonicum或属于Afipia属。甲基杆菌科可属于Methylobacterium属，例如，Methylobacterium nodulans或Methylobacteriumradiotolerans。β蛋白菌可属于伯克氏菌目，更具体地属于伯克霍尔德氏菌科。它们可属于Cupriavidus属，例如，Cupriavidus basilensis；或属于Ralstonia属，例如，Ralstonia eutropha；或属于Burkholderia属，例如，Burkholderia phymatum、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia xenovorans或Burkholderia graminis。细菌也可属于硬壁菌门，更具体地杆菌纲，更具体地芽孢杆菌目。芽孢杆菌目可属于芽孢杆菌科，更具体地属于Geobacillus属，例如，Geobacillus kaustophilus。可选地，微生物可属于古细菌超界，更具体地属于阔古细菌界门或圆齿古细菌界门。阔古细菌门可属于未分类的属，例如，Cand.Parvarchaeum acidiphilum或属于热源体纲，更具体地属于热源体目。热源体纲目可属于热源体科，更具体地Thermoplasma属，例如，Thermoplasma acidophilum或Thermoplasma volcanium。远古细菌界可属于热变形菌纲，更具体地属于硫化叶菌目。硫化叶菌目可属于硫化叶菌科，更具体地属于Sulfolobus属，例如，Sulfolobus acidocaldarius、Sulfolobusislandicus、Sulfolobus solfataricus或Sulfolobus tokodaii；或属于Metallosphaera属，例如，Metallosphaera sedula。热变形菌纲也可属于热变形菌目，热变形菌科。热变形菌科可属于Vulcanisaeta属，例如，Vulcanisaeta distributa；或属于Caldivirga属，例如，Caldivirgamaquilingensis。

优选地，第一多肽和/或编码第一多肽的第一多核苷酸分离自Cupriavidus basilensis HMF14(Wierckx等2010)。根据其他可选的实施方式，第一多肽和/或编码第一多肽的第一多核苷酸可分离自Methylobacteriumradiotolerans。

基于SEQ ID.NO：1、2、3或4提供的氨基酸序列和/或SEQ ID.NO：7、8、9或10提供的核苷酸序列，本领域技术人员能够构建合适的探针和/或引物以分离编码第一多肽的核苷酸序列。

或者，基于SEQ ID.NO：1、2、3或4提供的氨基酸序列和/或SEQ ID.NO：7、8、9或10提供的核苷酸序列，本领域技术人员可从商业途径获得编码第一多肽的合成的序列，因为基因合成日益变得可行。合成的序列可例如购自Geneart A.G.(Regensburg，德国)或购自Genscript USA Inc.(Piscataway，NJ，美国)等等。

通过功能性引入第一多核苷酸，对根据本发明细胞进行基因修饰。功能性引入多核苷酸的意思是在细胞中引入所述多核苷酸，从而所述细胞获得表达多核苷酸的功能性多肽的可能性。宿主细胞中功能性引入多核苷酸的方法和技术属于本领域技术人员的一般知识。

转化HMF-酸的多肽

根据本发明的基因修饰的细胞包含编码第二多肽的第二多核苷酸。第二多肽具有转化HMF-酸的活性并且可选自能够将HMF-酸转化成产品的任何多肽。发明人已经观察到通过在细胞中表达第一多肽，有效提高了通过转化HMF-酸的第二多肽的HMF-酸的生物转化。

编码第二多肽的第二多核苷酸可以是根据本发明细胞的天然组分，即，就第二多核苷酸而言不需要对细胞进行基因修饰。然而，根据本发明的某些实施方式，通过功能性引入第二多核苷酸，就第二多核苷酸而言对根据本发明的细胞进行基因修饰。上面已经结合第一多肽和第一多核苷酸解释了术语“功能性引入”。

根据本发明优选的实施方式，第二多肽是转化HMF-酸的氧化还原酶。该转化HMF-酸的氧化还原酶可包含SEQ ID NO：5或6列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO 5或6列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的变体多肽的氨基酸序列。

或者，序列相似度可为至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相似度。根据实施方式，示出的相似度百分数可以是同一性百分数。在具体的实施方式中，第二多肽可包含如SEQ ID NO：5或6列出的氨基酸序列。

Koopman等(2010a)和Koopman等(2010b)之前公开了SEQ ID NO：5的转化HMF-酸的氧化还原酶并且命名为HmfH。SEQ ID NO：6的转化HMF-酸的氧化还原酶可分离自Bradyrhizobium japonicum USDA 110并且对应于blr0367基因翻译的蛋白产物。B.japonicum USDA 110在其基因组中含有来自C.basilensis HMF14的HMF/糠醛用基因的同源物(Koopman等2010a)。blr0367基因的翻译产物是B.japonicum USDA 110蛋白质，其显示与来自C.basilensis HMF14的最高的同源性。考虑到B.japonicum USDA 110显示使用HMF作为唯一源(Koopman等2010a)的事实，其必须具有功能性HmfH同源物。因此预期HmfH类似的活性源于blr0367是合理的。

尽管参考许多转化HMF-酸的氧化还原酶例证了本发明，但是应注意在本发明内清楚地允许第二多肽是不同的转化HMF-酸的氧化还原酶或可以是不具有氧化还原酶活性的不同的转化HMF-酸的多肽。

第二多肽可由与SEQ ID NO：11或12列出的多核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的第二多核苷酸序列编码。第一多核苷酸与SEQ IDNO：11或12列出的序列的合适的其他可选的相似度水平可以是至少66％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相似度。在一种实施方式中，示出的相似度百分数可以是同一性百分数。在具体的实施方式中，第二多肽可由SEQ ID NO 11或12列出的多核苷酸序列编码。

Koopman等(2010a)已经公开了来自Cupriavidus basilensis的编码具有氧化还原酶活性的第二多肽的合适多核苷酸的分离。该基因命名为hmfH。

在第二多核苷酸分离的方法中，可对基因库进行筛选以分离合适的多核苷酸。该库可从来自细菌超界的微生物构建。这些微生物可属于蛋白菌门，更具体地属于α蛋白菌、β蛋白菌或γ蛋白菌纲。α蛋白菌可属于根瘤菌目或鞘脂单孢菌目。根瘤菌目可属于甲基杆菌科，例如，来自Methylobacterium属比如M.nodulans或M.radiotolerans的生物体或来自根瘤菌科的生物体。根瘤菌科可属于根瘤菌属/土壤杆菌属，更具体地属于Rhizobium属，比如R.，leguminosarum或R.leguminosarum bv.trifolii。它们也可属于Agrobacterium属，比如A.radiobacter。根瘤菌科也可属于慢生根瘤菌，更具体地属于短根瘤菌属，比如B.japonicum。鞘脂单胞菌属可属于鞘氨醇单胞菌科，更具体地属于Sphingomonas属，比如S.wittichii或S.chlorophenolicum。β蛋白菌可属于嗜甲基菌目或伯克氏菌目。嗜甲基菌目可属于嗜甲基菌科可，例如，来自嗜甲基菌属的生物体。伯克氏菌目可属于伯克霍尔德氏菌科，例如，来自Cupriavidus属，比如Cupriavidus basilensis生物体。它们也可属于Burkholderia属，比如Burkholderia phytofirmans，B.phymatum，B.graminis，B.xenovorans或B.cenocepacia或属于草酸杆菌科，Janthinobacterium属。γ蛋白菌可属于肠杆菌目，肠杆菌科，Yersinia属比如Yersinia ruckeri。微生物可进一步是放线菌门，放线菌纲，放线菌亚纲，放线菌目的细菌。放线菌目可属于链霉菌亚目、假诺卡氏菌亚目或微单胞菌亚目。链霉菌亚目可属于链霉菌科，更具体地Streptomyces属，比如S.violaceusniger，S.hygroscopicus或S.clavuligerus。假诺卡氏菌亚目可属于假诺卡氏科，更具体地Saccharopolyspora属比如S.erythraea；或属于束丝放线菌科，更具体地属于Saccharothrix属比如S.mutabilis或S.mutabilis亚种capreolus或属于Actinosynnema属，比如A.mirum。微单胞菌亚目可属于小单胞菌科，更具体地Micromonospora属。

基于SEQ ID.NO：5或6提供的氨基酸序列和/或SEQ ID.NO：11或12提供的核苷酸序列，本领域技术人员能够构建合适的探针和/或引物以分离编码第二多肽的核苷酸序列。

可选地，基于SEQ ID.NO：5或6提供的氨基酸序列和SEQ ID.NO：11或12提供的核苷酸序列，本领域技术人员可从商业途径获得编码第二多肽的合成的序列，如在讨论第一多肽的部分已经指出。

第三多核苷酸和多肽

根据其他可选的实施方式，根据本发明的基因修饰的细胞包含编码第三多肽的第三多核苷酸。第三多肽包含与SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24或25的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列。

或者，序列相似度可表示为至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相似度。根据一种实施方式，示出的相似度百分数可以是同一性百分数。在具体的实施方式中，第一多肽可包含如在SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24或25任何一条中列出的氨基酸序列。SEQ ID NO：19的氨基酸序列是第三多肽的优选的选择。该氨基酸序列最近公开在WO2011/026906(SEQ ID NO：15)中。

这种第三多肽的功能性表达产生能够转化呋喃醛的醛脱氢酶活性(Adh)，并且就HMF-酸生物转化和/或FDCA生产而言提供进一步改善。

与第三多肽的表达相关的作用已经显示在SEQ ID NO：19的氨基酸序列的例子中。基于序列相似度/同一性的水平，预期SEQ ID 20-25的多肽和它们相似物/同源物将具有类似的作用是合理的。

第三多肽可由与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31或32列出的多核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的第三多核苷酸序列编码。优选地第三多肽由SEQ ID NO：26列出的多核苷酸序列或与SEQ ID NO：26列出的多核苷酸序列具有指出的序列相似度的同源物编码。SEQ ID NO：26的多核苷酸序列最近公开在WO2011/026906(SEQ ID NO：16)中。第三多核苷酸与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31或32中列出的序列的合适的其他可选的相似度水平可以是至少66％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相似度。根据一种实施方式，示出的相似度百分数可以是同一性百分数。在具体的实施方式中，第三多肽可由SEQ ID NO 26、27、28、29、30、31或32列出的多核苷酸序列编码。

第三多肽和相应的第三多核苷酸的分离和进一步操作可大体上如上面和下文对第一多肽和相应第一多肽所讨论的进行。

载体

本发明的另一方面涉及包含第一和第二多核苷酸或其功能等同物的载体，其包括克隆载体和表达载体；并涉及在例如本发明多肽发生表达的条件下，在合适的宿主细胞中培养、转化或转染这类载体的方法。本文使用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。

第一和第二多核苷酸和任选地第三多核苷酸可以被掺入重组的可复制载体中，例如克隆载体或表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在另一种实施方案中，本发明提供了如下制造本发明的多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。载体可以从宿主细胞中被回收。合适的宿主细胞在下文讨论。

其中插入本发明表达盒或多核苷酸的载体可以是能够便利地进行重组DNA操作的任何载体，并且所述载体的选择通常应取决于要引入它的宿主细胞。

根据本发明的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者载体可以是被引入宿主细胞中后被整合进宿主细胞基因组中，并与整合了它的染色体一起复制的载体。

一种类型的载体是“质粒”，质粒是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以被连接进病毒基因组中。某些载体在它们被引入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在被引入宿主细胞后被整合进宿主细胞的基因组中，从而随宿主细胞的基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常是质粒形式。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这类表达载体的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)噬菌体载体和转座子和转座质粒。

本领域技术人员能够基于提供的氨基酸和多核苷酸序列、本领域的知识和商业上可获得的技术手段来构建根据本发明的载体。

根据优选的实施方式第一和第二多核苷酸序列位于单个载体上。该载体任选地进一步包含第三多核苷酸序列。因为本领域技术人员理解，包含第一和第二多核苷酸序列(和任选地进一步包含第三多核苷酸序列)的载体的使用大大简化了功能上表达第一和第二多肽(任选地与第三多肽一起)的基因修饰的细胞的构建。然而，如本领域技术人员也理解，功能上表达第一和第二多肽的基因修饰的细胞可经涉及其他可选的载体的各种其他转化方案获得。就此方面而言，应注意根据某些实施方式，第二多核苷酸序列的功能性引入不是必须的。还根据某些进一步其他可选的实施方式，第三多核苷酸序列的功能性引入不是必须的。

宿主细胞

根据本发明的基因修饰的细胞可从任何合适的宿主细胞构建。宿主细胞可以是未修饰的细胞或可以是已经基因修饰的。细胞可以是原核细胞、真核细胞、植物细胞或动物细胞。在这种细胞中，可全部或部分缺失、敲除或分裂一个或多个基因，其中任选地一个或多个基因编码蛋白酶。根据实施方式，根据本发明的宿主细胞是真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9和Sf21细胞和其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，即，酵母细胞，比如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia strain。更优选地，真核细胞是Kluyveromyces lactis、Saccharomyces cerevisiae、Hansenulapolymorpha、Yarrowia lipolytica、Pichia stipitis和Pichia pastoris或丝状真菌细胞。在某些实施方式中，真核细胞是丝状真菌细胞。

“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门(如Hawksworth等，(1995)定义的)的所有的丝状形式。丝状真菌的特征是由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行，并且碳代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Phanerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。

优选的丝状真菌细胞属于Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces的种或Trichoderma属，和最优选地选自Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporiumlucknowense、Trichoderma reesei或Penicillium chrysogenum的种。

根据另一种实施方式，根据本发明的宿主细胞是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物二者。合适的细菌可选自，例如，Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Bradyrhizobium、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus、Streptomyces、Zymomonas、Acetobacter、Streptococcus、Bacteroides、Selenomonas、Megasphaera、Burkholderia、Cupriavidus、Ralstonia、Methylobacterium、Methylovorus、Rhodopseudomonas、Acidiphilium、Dinoroseobacter、Agrobacterium、Sulfolobus或Sphingomonas的属。优选地，细菌细胞选自由下述组成的组：Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Bacillus puntis、Bacillus megaterium、Bacillus halodurans、Bacillus pumilus、Gluconobacter oxydans、Caulobacter crescentus、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotolerans、Methylobacterium nodulans、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Pseudomonas putida、Pseudomonas putida S12、Paracoccus denitrificans、Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium meliloti、Bradyrhizobium japonicum、Rhizobium radiobacter、Rhizobiumleguminosarum、Rhizobium leguminosarum bv.trifolii、Agrobacteriumradiobacter、Cupriavidus basilensis、Cupriavidus necator(Ralstoniaeutropha)、Ralstonia pickettii、Burkholderia phytofirmans、Burkholderiaphymatum、Burkholderia xenovorans、Burkholderia graminis、Rhodopseudomonas palustris、Acidiphilium cryptum、Dinoroseobacter shibae、Sulfolobus acidocaldarius、Sulfolobus islandicus、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus tokodaii。

非常优选的宿主细胞是Pseudomonas putida S12。在该菌株中，来自Cupriavidus basilensis HMF14的hmfH基因的功能表达已经证明对引入HMF氧化能力来而言是有效的，导致从该底物进行FDCA生产。

对于根据本发明细胞的具体应用，可根据该应用选择宿主细胞。尤其优选的是适合木质纤维原料转化的那些宿主和对优选用于生产呋喃化合物，比如FDCA的条件抗性的那些。本领域技术人员有能力使用合适的方式和方法将第一和任选地第二多核苷酸功能性引入任何提到的宿主细胞。

HMF-酸生物转化

根据本发明的经基因工程改造的细胞具有提高的HMF-酸生物转化。提高的HMF-酸生物转化有益于从其中呋喃化合物认为是有害的原料(比如用于生产生物燃料和生物化学品的产醇发酵原料)中消除HMF-酸和其呋喃前体。在其他应用中，提高的HMF-酸生物转化将改善其中HMF-酸是起始材料或中间产物的化学品的生物生产，比如在FDCA生物生产中。

如果转化HMF酸的酶是转化HMF-酸的氧化还原酶，根据本发明的细胞能够进行生物氧化反应。本文中氧化反应是氧化剂与HMF-酸在氧化还原酶存在的情况下的一种或多种反应。

优选的氧化反应是FDCA的生产，其中在转化HMF-酸的氧化还原酶存在的情况下，HMF-酸通过与氧化剂反应转化成FDCA。其中HMF-酸是中间产物的呋喃化合物生物转化成FDCA已经在现有技术中公开，例如使用HMF作为起始材料(见Koopman等2010a和Koopman等2010b)。如果他们通过根据本发明的细胞进行，这种生物转化也被改善。

HMF-酸可由一种或多种呋喃前体通过本发明的细胞或存在的任何其他细胞原位产生。原位产生的意思是HMF-酸不从系统外部添加。取而代之，经由将呋喃前体转化成HMF-酸的一种或多种生物转化在系统内产生HMF-酸。

HMF-酸的呋喃前体可选自由下述组成的组：5-(羟甲基)呋喃-2-甲醛(HMF)、呋喃-2，5-二甲醛(DFF)和[5-(羟甲基)呋喃-2-基]甲醇(HMF醇)，并且优选地呋喃前体是HMF。

如本领域已知的，可通过酸催化的脱水反应，从一种或多种己糖获得HMF。己糖可获得自生物质，优选木质纤维生物质。

氧化反应可包括导致产物形成的许多连续的氧化反应步骤，例如HMF-酸氧化成FFA，并且进一步地FFA氧化成FDCA。图1给出了氧化反应的例子。

优选地，在相对温和的温度，即10-80℃，更优选地20-45℃，最优选地大约25-40℃下进行氧化反应。优选地在FDCA为中性形式或完全解离形式的pH下进行，以便可控制盐形成。考虑到FDCA中存在两个酸部分，有两个分开的优选的pH范围。反应期间的pH可为从1到6的pH，优选地从1到4的pH，最优选地从1到3的pH。或者，反应期间的pH可以是从5到9的pH，优选地从5到8的pH，最优选地从5到7的pH。本领域技术人员理解宿主细胞的需求也将影响方法的合适pH值的选择。合适本发明的适合各种宿主细胞的pH值选择在本领域技术人员的范围内并且可从标准教科书中获得。对于Pseudomonas putida，包括Pseudomonas putida S12，优选的pH范围是从5到7的pH。

反应时间可以是6-150h，并添加来自氧源的氧，所述氧源是比如取决于呋喃氧化酶的要求的分子氧或水或不同氧源。空气可方便地用作分子氧的来源。

反应器可以是任何合适的(充气的)生物反应器。其可以分批、连续或以分批进料方式操作。

生物转化之后，细胞可通过建立的方法从发酵液中分离并且重复使用。可通过(酸)沉淀从反应混合物中回收氧化产物比如FDCA、HMF-酸等，随后冷却结晶，并分离结晶的氧化产物，例如，结晶的FDCA。然而，如本领域已知的，其他回收方法也是合适的，比如但不限于酸沉淀和溶剂萃取。

对于许多应用，比如从木质纤维进料中去除HMF-酸，HMF-转化的确切的方式是不重要的。重要的是HMF-酸被有效转化，以便等量地将其去除，或如果其是由呋喃前体形成的，以便防止其积累。对于这种应用，转化HMF-酸的多肽可以是具有转化HMF的活性的目前已知的或仍未发现的任何多肽。

本发明的进一步方面的目的是使用根据本发明的基因修饰的细胞，用于将呋喃前体生物转化成FDCA。呋喃前体可尤其选自5-(羟甲基)呋喃-2-甲醛(HMF)、[5-(羟甲基)呋喃-2-基]甲醇(HMF醇)、呋喃-2，5-二甲醛(DFF)、5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)或5-甲酰呋喃-2-羧酸(FFA)。优选地HMF是选择的呋喃前体。HMF-酸可以是将HMF生物转化成FDCA的中间产物。

将参考下列实施例进一步阐释本发明。

实施例

一般方法

菌株和质粒Pseudomonas putida S12(ATCC 700801)用作宿主，用于表达来自Cupriavidus basilensis HMF14(Wierckx等，2010；Koopman等2010a)和Methylobacterium radiotolerans JCM 2831(＝ATCC 27329＝DSM 1819；基因组序列在http://genome.jgi-psf.org/metra/metra.home.html中可得到)的基因。Escherichia coli菌株DH5α或TOP10(Invitrogen)用于一般的克隆目的。

对于C.basilensis或M.radiotolerans基因的附加体表达，使用源于pUCP22的pJT’mcs(Koopman等，2010a)或pJNNmcs(t)(Wierckx等，2008)或源于pBBR1MCS的pBT’mcs(Koopman等，2010a)。在pJT’mcs和pBT’mcs中，目标基因的表达由组成型tac启动子驱动。在pJNNmcs(t)中，表达由水杨酸盐可诱导的NagR/P_nagAa表达盒驱动。

培养基&培养条件矿物盐培养基(MM)用作确定成分的培养基。MM包含下述(每升去矿物质水)：3.88g的K₂HPO₄、1.63g的NaH₂PO₄、2.0g的(NH₄)₂SO₄、0.1g的MgCl₂·6H₂O、10mg的EDTA、2mg的ZnSO₄·7H₂O、1mg的CaCl₂·2H₂O、5mg的FeSO₄·7H₂O、0.2mg的Na₂MoO₄·2H₂O、0.2mg的CuSO₄·5H₂O、0.4mg的CoCl₂·6H₂O和1mg的MnCl₂·2H₂O，补充有指定的碳源。Luria发酵液(L-发酵液：10g/l Bacto蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l NaCl)用作完全培养基，用于P.putida S12的繁殖和衍生菌株C.basilensis、M.radiotolerans和E.coli DH5α和衍生物的繁殖。对于平板培养，L-发酵液用1.5％(w/v)的琼脂(Difco)固化。将氨苄西林(Amp)添加至培养基至100μg/ml，用于选择携带源于质粒的pJT’mcs或pJNNmcs(t)的E.coli转化株。在Luria发酵液中，将庆大霉素(Gm)添加至30μg/ml，和在矿物盐培养基中，将庆大霉素(Gm)添加至10μg/ml，用于选择携带源于质粒的pJT’mcs或pJNNmcs(t)的P.putida S12转化株。对于选择携带源于质粒的pBT’mcs的E.coli或P.putida S12转化株，将50μg/ml的卡那霉素(Km)添加至培养基。抗生素购自Sigma-Aldrich。将P.putida、C.basilensis和M.radiotolerans在30℃下培养；E.coli在37℃下培养。

用源自P.putida S12的菌株在Labfors 4生物反应器系统(Infors BeneluxBV)或BioFlo 110控制器(New Brunswick Scientific)控制的2-L容器中进行分批进料实验。在顶部空间提供压缩空气或纯氧或者使压缩空气或纯氧喷射穿过发酵液。温度控制在30℃并且通过自动添加NH₄OH、NaOH或KOH将pH保持在7.0。在补充菌株特异性的抗生素和40g/l甘油的2x MM培养基中进行分批实验阶段。对于高细胞密度培养物，将分批实验阶段培养基进一步补充10g/l的酵母提取物(YE)。耗尽初始甘油之后，开始进料(100mM MgCl₂中4或8M的甘油，当需要时补充1mM的水杨酸钠)并且控制进料以允许生长，同时保持甘油作为培养的限制性底物。通过另外的进料泵进料HMF原料(在去矿物质水中为4M)；根据使用的菌株和研究的条件调整进料速度。持续监测溶解氧压(DO)并且调整搅拌速度以保持足够的通风。

测定&分析方法细胞干重(CDW)测量：使用平底96-孔微量培养板(Greiner)，使用Biowave细胞密度计(WPA Ltd)或μQuant MQX200通用微量培养板分光光度计(Biotek)，通过测量600nm处的光密度(OD₆₀₀)，测定细菌培养物的细胞干重(CDW)含量。对P.putida而言，1.0的OD₆₀₀对应于0.56g CDW/L(Biowave)或1.4g CDW/L(μQuant)。

HPLC分析：通过RP-HPLC分析呋喃化合物(FDCA、HMF、HMF-醇、HMF-酸和FFA)，如Koopman等(2010a)描述的。也使用折射率(RI)探测器通过HPLC(Agilent 1100系统)分析糖、醇和有机酸。使用的柱是Bio-RadAminex HPX-87H(300x7.8mm，氢形式，9μm颗粒尺寸，8％交联键，pH范围1-3)，5mM H₂SO₄作为洗脱剂，流速为0.6ml/min。

化学品

在Sigma，Eurolabs Ltd(Poynton，英国)或Yore Chemipharm Co.Ltd.(宁波，中国)购买HMF。FDCA和5-羟甲基-糠酸(HMF酸)的分析标准物分别购自Immunosource B.V.(Halle-Zoersel，比利时)、Matrix Scientific(ColumbiaSC，美国)。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich Chemie B.V.(Zwijndrecht，荷兰)。

分子和遗传技术：使用DNeasy组织试剂盒(QIAGEN)从C.basilensisHMF14和M.radiotolerans JCM 2831中分离基因组DNA。用QIAprep小量提取试剂盒(QIAGEN)分离质粒DNA。用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离琼脂糖捕获的DNA片段。

根据制造商的说明书，用Accuprime Pfx聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应。由MWG Biotech AG(德国)合成寡核苷酸引物(实施例中指定的)。使用Gene Pulser电穿孔设备(BioRad)将质粒DNA引入电感受态细胞中。根据Sambrook和Russell(2001)进行其他标准分子生物学技术。

实施例I：HmfH和HmfT1的共表达改善P.putida S12中的FDCA生产

使用引物hmfT1(f)(SEQ ID NO：13)和hmfT1(r)(SEQ ID NO：14)通过PCR扩增来自Cupriavidus basilensis HMF14的基因组DNA的hmfT1基因(之前命名为mfs1(Koopman等，2010a)；SEQ ID NO：7)。PCR产物作为1359-bp EcoRI-NheI片段引入pJNNmcs(t)中产生pJNNhmfT1(t)。使用引物FN23(SEQ ID NO 15)和FN24(SEQ ID NO：16)通过PCR从C.basilensisHMF14的基因组DNA扩增包括其大然核糖体结合位点(RBS)的hmfH基因(SEQ ID NO：11)。在pBT’mcs中PCR产物克隆为1777-bp EcoRI片段，产生质粒pBT’hmfH。将质粒pBT’hmfH和pJNNhmfT1(t)相继引入P.putidaS12，产生P.putida S12_B38。

如在“一般方法”章节描述的，以分批进料培养P.putida S12_B38。在分批阶段，实现约3g CDW/l的细胞密度，其后开始甘油进料和HMF进料。用不表达HmfT1的P.putida S12_2642(类似于P.putida S12_hmfH(Koopman等，2010b))进行对照分批进料培养。

图2显示P.putida菌株S12_2642和S12_B38的HMF进料培养物中FDCA和HMF-酸的浓度。P.putida S12_2642的HMF-酸的过度积累是明显的。相反，P.putida S12_B38中HMF-酸积累可忽略不计。减少的HMF-酸积累进一步允许增加的HMF进料速度，其在相当短的过程时间内产生更高的FDCA滴度。这也在测试菌株的FDCA比生产率中反映出来(图3)。

实施例II：HmfH和来自Methylobacterium radiotolerans JCM 2831的多肽的共表达改善P.putida S12中的FDCA生产

使用引物Mrad(f)(SEQ ID NO：17)和Mrad(r)(SEQ ID NO：18)通过PCR从Methylobacterium radiotolerans JCM2831的基因组DNA扩增具有基因座标签mrad2831_4728的基因(SEQ ID：9)。PCR产物作为1381-bp EcoRI-NheI片段被引入pJNNmcs(t)，产生pJNN_Mrad(t)。将质粒pBT’hmfH(见实施例I)和pJNN_Mrad(t)相继引入P.putida S12，产生P.putida S12_B51。

在摇瓶中在补充1g/l酵母提取物、80mM甘油、2mM葡萄糖、100μM水杨酸钠、50μg/ml卡那霉素和10μg/ml庆大霉素的矿物盐培养基(4x缓冲强度)中培养P.putida_B51。作为对照菌株，使用P.putida S12_B38(见实施例I)。过夜培养之后，将培养物补充80mM甘油和100μM水杨酸钠。随后，添加大约10mM HMF并且评估FDCA生产。

图4显示，对于两个菌株而言，在FDCA生产期间HMF-酸积累是可忽略不计的，这确认HmfT1和Mrad2831_4728多肽显示类似的功能。对于P.putida S12_B38，FDCA生产显示更长的滞后期和些许更慢的速度，其可能归因于更低的初始生物质密度(图4A)。然而，对于两个菌株而言，最大FDCA比生产率是相同的，即，2.36mmol FDCA/(g CDW，h)，这表示Mrad2831_4728和HmfT1多肽在HMF-酸积累最小化和使FDCA生产最大化中同样有效。

实施例III：通过共表达HmfH和HmfT1的P.putida S12的高水平的HMF-酸转化能力

如实施例I中所示，P.putida S12中HmfH和HmfT1的共表达极大提高将HMF氧化成FDCA的单位能力(specific capacity)。为了最佳利用这种提高的能力，用P.putida S12_B38以高生物质密度开始进行分批进料实验。

用高速度(20ml/h；4M HMF进料溶液)开始HMF进料，以便使P.putida S12_B38的氧化能力饱和并且引起HMF和HMF-酸的积累(图5)。当HMF-酸已经积累至大约20mM时，HMF进料速度降低至5ml/h并且监测呋喃浓度。起初，由于残留积累的HMF的氧化，HMF-酸浓度增加至大约37mM，其后以0.72mmol/(g CDW.h)的HMF进料速度，在5h内HMF-酸浓度下降至小于2mM。

这些结果清楚地表明通过HmfH和HmfT1的共表达提高了HMF-酸氧化能力。Koopman等(2010b)的结果显示为了使HMF-酸浓度从大约50mM下降至小于5mM，P.putida S12_hmfH(缺少HmfT1)以更低的HMF进料速度(0.09mmol/(g CDW.h))需要超过50h的时间。提高的HMF-酸氧化能力导致在更短的处理时间内(94h对比Koopman等(2010b)的115h)进一步实现更高的终FDCA滴度(152g/l对比Koopman等(2010b)的30.1g/l)。

实施例IV：HmfH、HmfT1和来自C.basilensis HMF 14的醛脱氢酶的共表达提高P.putida S12中的FDCA生产

使用引物FN13(SEQ ID 33)和FN14(SEQ ID 34)通过PCR扩增编码与Cupriavidus basilensis HMF14中的HMF-降解操纵子(Wierckx等，2011)关联的醛脱氢酶的基因(SEQ ID 26；翻译的氨基酸序列：SEQ ID 19)。PCR产物作为1543-bp NotI片段引入Bsp120I消化的(与NotI相容)pBT’hmfH中(见实施例I)，产生pBT’hmfH-adh。质粒变体和pJNNhmfT1(t)(见实施例I)相继被引入P.putida S12，所述质粒变体中醛脱氢酶编码基因存在于正向(f)(pBT’hmfH-adh(f))中。所得菌株P.putida S12_B97共表达HmfH、HmfT1和醛脱氢酶。作为HmfH氧化还原酶和醛脱氢酶(即，没有HMF-酸转运蛋白HmfT1)共表达的对照菌株，构建仅仅含有pBT’hmfH-adh(f)的P.putidaS12_B101。P.putida S12_B38(见实施例I)用作没有醛脱氢酶的HmfT1和HmfH共表达的对照菌株。

P.putida菌株S12_B38、S12_B97和S12_B101在摇瓶中在补充1g/l酵母提取物、80mM甘油、2mM葡萄糖、50μg/ml卡那霉素和10μg/ml庆大霉素(注意：对于菌株B101仅仅添加卡那霉素)的矿物盐培养基(4x缓冲强度)中培养。添加水杨酸钠(1μM)用于仅诱导预培养物中的hmfT1。添加大约10mM HMF之后，评估FDCA和HMF-酸的积累。

在共表达HmfH(氧化还原酶)和HmfT1(HMF-酸转运蛋白)的菌株(菌株S12_B38；图6A)中，仅仅在FFA已经积累至很大水平时之后开始FDCA生产。积累的HMF酸短时间内到达低的量，如之前所观察的(见实施例II)。当醛脱氢酶与HmfH和HmfT1共表达时(菌株S12_B97；图6B)，没有延迟地开始FDCA形成，并且仅仅观察到痕量的FFA和HMF-酸二者。醛脱氢酶和没有HmfT1的HmfH的共表达(菌株S12_B101；图6C)，产生HMF-酸的过度积累而仅仅产生小量的FFA和FDCA。

结果表明通过表达醛脱氢酶显著增强HMF向HMF-酸的氧化。然而，HmfT1必须是共表达的，以能够有效地对产生的HMF-酸进行生物转化。醛脱氢酶进一步改善中间产物FFA向FDCA的氧化。因此，醛脱氢酶和HmfT1的同时表达显著提高经由HMF-酸成为终产物的HMF氧化的总体潜能和速度。

参考文献

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Claims

1.基因修饰的细胞，其包含：

(i)第一多核苷酸序列，其编码第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1、2、3或4列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列；和

(ii)第二多核苷酸序列，其编码具有转化5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)的活性的第二多肽；

其特征在于，通过功能性引入至少所述第一多核苷酸序列，和优选地通过功能性引入所述第一和第二多核苷酸序列二者，对所述细胞进行基因修饰。

2.根据权利要求1所述的基因修饰的细胞，其中所述第二多肽是5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸氧化还原酶，优选地是与SEQ ID NO：5或6列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列的多肽。

3.根据权利要求1-2任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO：7、8、9或10列出的核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述第二多核苷酸序列包含与SEQ ID NO：11或12列出的核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的核苷酸序列。

5.根据权利要求1-4任一项所述的基因修饰的细胞，包含第三多核苷酸序列，其编码第三多肽，第三多肽包含与SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24或25列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述第三多核苷酸序列包含与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31或32列出的核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的核苷酸序列。

7.根据权利要求1-6任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述细胞是原核细胞，比如细菌细胞，或真核细胞，比如酵母细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。

8.根据权利要求1-7任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述细胞是原核细胞，优选地选自下述属的细菌细胞：Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Bradyrhizobium、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus、Streptomyces、Zymomonas、Acetobacter、Streptococcus、Bacteroides、Selenomonas、Megasphaera、Burkholderia、Cupriavidus、Ralstonia、Methylobacterium、Methylovorus、Rhodopseudomonas、Acidiphilium、Dinoroseobacter、Agrobacterium、Sulfolobus或Sphingomonas，更优选由下述组成的组：Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Bacillus puntis、Bacillus megaterium、Bacillus halodurans、Bacillus pumilus、Gluconobacter oxydans、Caulobacter crescentus、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotolerans、Methylobacterium nodulans、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Pseudomonas putida、Pseudomonas putida S12、Paracoccus denitrificans、Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium meliloti、Bradyrhizobium japonicum、Rhizobium radiobacter、Rhizobiumleguminosarum、Rhizobium leguminosarum bv.Trifolii、Agrobacteriumradiobacter、Cupriavidus basilensis、Cupriavidus necator(Ralstoniaeutropha)、Ralstonia pickettii、Burkholderia phytofirmans、Burkholderiaphymatum、Burkholderia xenovorans、Burkholderia graminis、Rhodopseudomonas palustris、Acidiphilium cryptum、Dinoroseobactershibae、Sulfolobus acidocaldarius、Sulfolobus islandicus、Sulfolobussolfataricus、Sulfolobus tokodaii。

9.根据权利要求1-8任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述细胞是真核宿主细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞，比如选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞或杂交瘤的哺乳动物细胞，选自Sf9或Sf21细胞和其衍生物的昆虫细胞，优选选自真菌或酵母细胞的真核细胞，比如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia species，更优选选自Kluyveromyces lactis、Saccharomyces cerevisiae、Hansenulapolymorpha、Yarrowia lipolytica、Pichia stipitis或Pichia pastoris的真核细胞，或来自下述种的丝状真菌细胞，所述种选自亚门Eumycota和Oomycota或选自属Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Phanerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium或Trichoderma比如Aspergillus niger、Aspergillusawamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Trichoderma reesei或Penicillium chrysogenum。

10.根据权利要求1-9任一项所述的基因修饰的细胞，其中所述第一和第二多核苷酸序列位于单个载体上，任选地位于进一步包含所述第三多核苷酸序列的载体上。

11.一种载体，其包含：

(i)第一多核苷酸序列，其编码第一多肽，第一多肽包含与SEQID NO：1、2、3或4列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列；和

(ii)第二多核苷酸序列，其编码具有5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)转化活性的第二多肽。

12.根据权利要求11所述的载体，其中所述第二多肽是5-羟甲基糠酸氧化还原酶，优选是具有与SEQ ID NO：5或6列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列的多肽。

13.根据权利要求11-12任一项所述的载体，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO：7，8，9或10列出的核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的核苷酸序列。

14.根据权利要求11-13任一项所述的载体，其中所述第二多核苷酸序列包含与SEQ ID NO：11或12列出的核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的核苷酸序列。

15.根据权利要求11-14任一项所述的载体，其包含编码第三多肽的第三多核苷酸序列，所述第三多肽包含与SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24或25列出的氨基酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的氨基酸序列。

16.根据权利要求11-15任一项所述的载体，其中所述第三多核苷酸序列包含与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31或32列出的核苷酸序列具有至少45％，优选至少60％，比如至少70％，更优选至少80％，比如90％，最优选至少95％序列相似度的核苷酸序列。

17.5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)转化方法，其包括在存在HMF-酸的情况下孵育根据权利要求1-10任一项所述的细胞，其在适合HMF-酸被所述细胞转化的条件下进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述HMF-酸由HMF-酸的一种或多种呋喃前体在适合通过所述细胞将所述一种或多种呋喃前体转化成HMF-酸的条件下原位形成。

19.根据权利要求17-18任一项所述的方法，其中所述所述细胞的第二多肽是HMF-酸氧化还原酶，并且还包括使所述细胞经历适合将HMF-酸转化成FDCA的条件。

20.根据权利要求17-19任一项所述的方法，其中呋喃前体选自由下述组成的组：5-(羟甲基)呋喃-2-甲醛(HMF)、呋喃-2，5-二甲醛(DFF)、[5-(羟甲基)呋喃-2-基]甲醇(HMF醇)，并且优选是HMF。

21.根据权利要求17-20任一项所述的方法，其中所述呋喃前体获得自一种或多种己糖，优选地获得自木质纤维生物质的一种或多种己糖，例如通过酸催化脱水获得。

22.根据权利要求17-21任一项所述的方法，其中通过包含酸沉淀然后冷却结晶或然后溶剂萃取的方法从反应混合物中回收FDCA。

23.根据权利要求1-10任一项所述的基因修饰的细胞的用途，用于将许多呋喃前体生物转化成FDCA。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述许多呋喃前体选自由下述组成的组：5-(羟甲基)呋喃-2-甲醛(HMF)、[5-(羟甲基)呋喃-2-基]甲醇(HMF醇)、5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(HMF-酸)、呋喃-2，5-二甲醛(DFF)或5-甲酰呋喃-2-羧酸(FFA)。