CN110591995A - 一种共表达重组菌及其在合成呋喃羧酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术及生物催化领域，公开了一种共表达重组菌及其在合成呋喃羧酸中的应用，本发明借助双酶共表达技术将来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588的醛脱氢酶基因分别与5‑羟甲基糠醛氧化还原酶和NADH氧化酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中构建共表达体系，得到共表达重组菌。该重组菌可催化高浓度(150～250mM)底物氧化合成目标产物，产率达90％以上，时空产率高达5.6g/L h。本发明制备的生物催化剂不仅具有高浓度底物耐受能力、高催化活性及高选择性的优点，而且呋喃羧酸合成工艺条件温和、绿色、高效。

Description

一种共表达重组菌及其在合成呋喃羧酸中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术及生物催化领域，具体涉及醛脱氢酶与NADH氧化酶、醛脱氢酶与5-羟甲基糠醛氧化还原酶共表达重组菌以及这些共表达重组菌在催化呋喃醛选择性氧化合成呋喃羧酸中的应用。
背景技术
呋喃羧酸如5-羟甲基-2-糠酸(5-hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid，HMFCA)、2- 糠酸(2-furoic acid，FCA)、5-甲氧甲基-2-糠酸(5-methoxymethyl-2-furancarboxylic acid， MMFCA)以及2,5-呋喃二甲酸(2,5-furandicarboxylic acid，FDCA)是一类重要的生物基化学品，在高分子、医药及食品等领域具有广阔的应用前景。例如，HMFCA可作为合成聚酯的单体(Makromol.Chem.,1984,185,2347)，作为白介素抑制剂的基础材料(J.Am. Chem.Soc.,2003,125,3714)，作为合成生物基对苯二甲酸(TPA)的前体物质(ACS Catal., 2016,6,5052)。而对苯二甲酸与乙二醇经缩聚反应后得到的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET) 是开发最早、产量最大、应用最广的聚酯产品。此外，HMFCA还具有抗肿瘤活性(Agric. Biol.Chem.,1981,45,2149)。据报道，MMFCA也可作为合成TPA的基础材料(Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.,2014,111,8363)。FDCA与对苯二甲酸(TPA)具有相似的共轭等电子结构，乙二醇和FDCA经酯化作用生成的聚2,5-呋喃二甲酸乙二醇酯(PEF)与PET性质相似。因此，FDCA被认为能够替代化石来源的TPA用于生产聚酯(Green Chem.,2011,13,1061)。FCA及其衍生物同样也广泛应用于聚酯、医药、农业、香精香料等领域(EnergyEnviron.Sci.,2016,9,1144)。
目前，呋喃羧酸主要是通过化学催化制备得到。Brandolese等以含氮杂环卡宾作为催化剂、空气作为氧化剂，在二甲基四氢呋喃中催化5-羟甲基糠醛(HMF)氧化合成HMFCA，HMFCA产率为87％(Org.Biomol.Chem.,2018,16,8955)。Gorbanev等将Ru(OH)x负载至金属氧化物(如MgO、MgAl2O4和HT)上催化HMF氧化，合成FDCA(Catal.Lett.,2011, 141,1752)。Douthwaite等以AuPd/Mg(OH)2作为催化剂在碱性条件下氧化糠醛合成FCA(Catal.Sci.Technol.,2017,7,5284)。尽管化学催化呋喃醛氧化合成呋喃羧酸已取得重大进展，但该法存在反应条件激烈、环境不友好、选择性不佳等缺点。生物催化能有效克服上述缺点，在合成化学中已成为了补充甚至替代化学催化的一种重要方法。尤其是对于HMF、糠醛等稳定性较差的生物基呋喃醛高值化转化，生物催化与化学催化相比更具应用潜力。但是，以游离酶作为催化剂时底物添加量较低，并且在制备FDCA过程中通常采用多酶级联协同催化，导致生产工艺较复杂。与游离酶相比，全细胞生物催化剂更易制备、酶蛋白在细胞膜的保护下更稳定、且更易实现胞内多酶级联反应的进行。然而，HMF和糠醛对微生物具有强烈的毒性及抑制作用，因此迫切需要具有高底物耐受、且能高效、高选择性催化呋喃醛氧化的生物催化剂。
醛脱氢酶是生物体中催化醛氧化的天然催化剂。最近本课题组从土壤微生物睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588中挖掘出一系列醛脱氢酶(CN109536466A)，包括松柏醛脱氢酶1(CtCALDH1)，松柏醛脱氢酶2(CtCALDH2)，香草醛脱氢酶1 (CtVDH1)，香草醛脱氢酶2(CtVDH2)和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶(CtSAPDH)。但过量表达这些醛脱氢酶的重组菌在催化HMFCA合成中，会产生一定量副产物2,5-二(羟甲基)呋喃(BHMF)，因此降低了重组菌的催化效率和反应选择性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种简单、高效合成呋喃羧酸的生物催化剂。一种方法是采用双酶共表达技术将NADH氧化酶(NOX)与C.testosteroniSC1588醛脱氢酶在大肠杆菌中进行共表达，促进重组菌胞内NAD+再生，提高重组菌催化效率及选择性。另一种方法是采用双酶共表达技术构建含有醛脱氢酶和5-羟甲基糠醛氧化还原酶(HmfH)的共表达菌株用于合成FDCA。酶蛋白在细胞膜的保护下更加稳定，并且简化了生成工艺。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建：将来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588的醛脱氢酶基因与NOX基因同时导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)，获得共表达醛脱氢酶和NOX的重组菌；所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID.1、SEQ ID.2或SEQ ID.3，所述NOX基因在GenBank上的核苷酸序列登录号为CP021479.1。
一种共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建：将来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588的醛脱氢酶基因与5-羟甲基糠醛氧化还原酶(HmfH) 基因同时导入E.coliBL21(DE3)，获得共表达醛脱氢酶和HmfH的重组菌；所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID.2，所述HmfH基因在GenBank上的核苷酸序列登录号为 GU556183.1。
所述共表达醛脱氢酶和NOX的重组菌在催化呋喃醛选择性氧化合成呋喃羧酸中的应用，包括如下步骤：
(1)将所述的重组菌接种至含有100±30μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37 ±2℃、180±40rpm下培养12±3h；然后，按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有100±30μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37±2℃、180±40rpm下培养；当菌液的OD600达到0.6～1.2时，加入0.1～0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于16～20℃、 160±40rpm下诱导培养20±4h，培养结束后收集菌体细胞，并用生理盐水清洗细胞；
(2)将上述收集的菌体细胞和含有呋喃醛的磷酸盐缓冲液加入反应器中，按细胞湿重计，所述菌体细胞浓度为20～100mg/mL，呋喃醛浓度为50～280mM，在30±5℃、150±30rpm 下反应2～24h，得到呋喃单羧酸。
优选地，所述呋喃醛结构通式如下所示：
其中，R基团为H、CH2OH或CH2OCH3。
优选地，所述呋喃醛浓度为150～250mM。
优选地，控制步骤(2)反应体系的pH值为5～8。
优选地，步骤(2)当反应器中呋喃醛浓度几乎完全消耗时，向反应体系中补充呋喃醛和等摩尔当量的碳酸氢钠继续进行反应。
所述共表达醛脱氢酶和HmfH的重组菌在催化5-羟甲基糠醛氧化合成2,5-呋喃二羧酸中的应用，包括如下步骤：
(1)将权利要求2所述的重组菌接种至含有25±5μg/mL卡那霉素和17±3μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37±2℃、180±40rpm下培养12±3h；然后按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有25±5μg/mL卡那霉素和17±3μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37±2℃、180±40rpm下培养；当菌液的OD600达到0.4～1.2时，加入0.05～1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于17～35℃、160±40rpm下诱导培养8～28h；培养结束后收集菌体细胞，并用生理盐水清洗细胞；
(2)将上述收集的菌体细胞和含有5-羟甲基糠醛的缓冲液加入反应器中，按细胞湿重计，所述菌体细胞浓度为50～150mg/mL，HMF浓度为50～175mM，在20～40℃下反应12～84h，得到2,5-呋喃二羧酸。
优选地，控制步骤(2)反应体系的pH值为5～8，30±5℃下反应14～72h；所述HMF浓度为75～150mM。
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加量为0.1～0.2mM。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明的生物催化剂(重组菌)对底物具有高耐受性，能高效、高选择性催化高浓度(150～250mM)底物5-羟甲基糠醛、糠醛和5-甲氧甲基糠醛氧化，合成5-羟甲基-2- 糠酸、2,5-呋喃二羧酸、2-糠酸和5-甲氧甲基-2-糠酸，目标产率达90％以上，产物时空收率高达5.6g/L h。
(2)本发明反应过程简单，易控、条件温和，活泼的呋喃醛在反应过程中不易发生副反应，不仅提高产品品质、降低了能耗，而且有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。
(3)与游离酶催化相比，利用全细胞催化剂不仅能够降低催化剂的制备成本，而且由于酶蛋白在细胞膜的保护下具有更好的稳定性；此外，与酶催化相比，胞内的辅酶循环更容易实现，并且无需添加昂贵的辅酶。
本发明睾丸酮丛毛单胞菌SC1588，于2016年10月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO.M 2016562，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株已在中国专利CN107365724A中公开，属于现有技术。
附图说明
图1为HMF及其衍生物结构图。
图2为CtCALDH1、CtCALDH2、CtVDH1、CtVDH2、CtSAPDH(a)、NOX(b)和 HmfH(c)基因扩增电泳图。图中标记：条带M，DNA分子量标准；条带1，CtCALDH1 基因；条带2，CtCALDH2基因；条带3，CtVDH1基因；条带4，CtVDH2基因；条带5， CtSAPDH基因；条带6，NOX基因；条带7，HmfH基因。
图3为HMFCA样品分析的液相色谱图(HMFCA、BHMF及HMF的保留时间分别为 6.2、8.1及9.8min)。
图4为FCA样品分析的液相色谱图(FCA、糠醇及糠醛的保留时间分别为9.2、14.3及16.3min)。
图5为MMFCA样品分析的液相色谱图(MMFCA、5-甲氧甲基糠醇和5-甲氧甲基糠醛保留时间分别为5.0、7.1和10.4min)。
图6为FDCA样品分析的液相色谱图(FDCA、HMFCA、BHMF及HMF的保留时间分别为4.8、6.0、7.8及9.4min)。
具体实施方式
通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。
实施例1共表达醛脱氢酶和NOX重组菌的构建方法
(1)以C.testosteroniSC1588基因组DNA为模板，通过设计特异性引物扩增CtCALDH2、 CtVDH1、CtVDH2和CtSAPDH基因全长序列(核苷酸序列分别为SEQ ID.1、SEQID.2、 SEQ ID.3或SEQ ID.4)；
(2)以携带NOX基因(GenBank上的核苷酸序列登录号为CP021479.1)的重组质粒pET28a-NOX为模板，通过设计特异性引物扩增NOX基因全长序列；
(3)将所述醛脱氢酶基因和NOX基因连接到共表达质粒pETDuet-1中，得到共表达重组质粒，并测序验证；
(4)将上述共表达重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)，得到共表达醛脱氢酶和NOX的重组菌E.coli-CtCALDH2-NOX、E.coli-CtVDH1-NOX、E.coli-CtVDH2-NOX和E. coli-CtSAPDH-NOX。
表1引物信息
引物名称 引物序列(5’-3’)
CtCALDH2上游引物 CG<u>CGGATCC</u>GATGAACTACATGGACTTGCACCGCA
CtCALDH2下游引物 GCG<u>AAGCTT</u>TCAGAGCCAGCGTCGCATGAA
CtVDH1上游引物 CGC<u>GGATCC</u>GATGATCGAACAAAAAATGCTGATAG
CtVDH1下游引物 GCG<u>AAGCTT</u>TTAGAACGGATAGTGGCGTTCTGC
CtVDH2上游引物 CGC<u>GGATCC</u>GATGATTGAACAAAGCATGCTCATCG
CtVDH2下游引物 GCG<u>AAGCTT</u>TTAGAAGGGGTAGTGACGTGCGGTG
CtSAPDH上游引物 CGC<u>GGATCC</u>GATGCAAGACCATCTGCAGTTCTATATCGAC
CtSAPDH下游引物 ATG<u>AAGCTT</u>TCAGGCCGCGCCGTAGCCCAT
NOX上游引物 CGC<u>CATATG</u>AAAGTCACAGTTGTTGGTTGT
NOX下游引物 CCG<u>CTCGAG</u>TTAAGCGTTAACTGATTGGGC
实施例2E.coli-CtVDH1-NOX和E.coli-CtVDH2-NOX的诱导表达
将实施例1中获得的重组菌E.coli-CtVDH1-NOX(或E.coli-CtVDH2-NOX)接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.6～0.8时，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次，获得诱导表达的重组菌E.coli-CtVDH1-NOX(或E.coli-CtVDH2-NOX)。
实施例3
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF初始浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH1-NOX，于30℃及150rpm下反应。利用液相色谱监控反应(图3)。2h后， HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为96％。
实施例4
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.8mmol HMF(HMF初始浓度为 200mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E.coli-CtVDH1-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH 调至7.0。7h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为97％。
实施例5
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入1.0mmol HMF(HMF初始浓度为 250mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E.coli-CtVDH1-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH 调至7.0。9h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为95％。
实施例6
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF初始浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。2h后，HMF转化率为100％，目标产物 HMFCA产率为94％。
实施例7
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.8mmol HMF(HMF初始浓度为200mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至 7.0。9h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为92％。
实施例8
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入1.0mmol HMF(HMF初始浓度为250mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至 7.0。12h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为92％。
实施例9E.coli-CtCALDH2-NOX和E.coli-CtSAPDH-NOX的诱导表达
将实施例1中获得的重组菌E.coli-CtCALDH2-NOX(或E.coli-CtSAPDH-NOX)接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于 37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.6～0.8时，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于16℃、160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次，得到诱导表达的重组菌E.coli-CtCALDH2-NOX(或E. coli-CtSAPDH-NOX)。
实施例10
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF初始浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌E. coli-CtCALDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。6h后，HMF转化率为92％，目标产物 HMFCA产率为89％。
实施例11
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF初始浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌E. coli-CtSAPDH-NOX，于30℃及150rpm下反应。6h后，HMF转化率为51％，目标产物 HMFCA产率为47％。
实施例12
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.2mmol糠醛(糠醛初始浓度为50mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH1-NOX，于30℃及150rpm下反应。利用液相色谱监控反应(图4)。12h后，糠醛转化率为99％，目标产物FCA产率为89％。
实施例13
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.2mmol糠醛(糠醛初始浓度为50mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌E. coli-CtCALDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。12h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为92％。
实施例14
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol糠醛(糠醛初始浓度为100mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌E. coli-CtCALDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。12h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为95％。
实施例15
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.2mmol糠醛(糠醛初始浓度为50mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。12h后，糠醛转化率为100％，目标产物 FCA产率为96％。
实施例16
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol糠醛(糠醛初始浓度为100mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。12h后，糠醛转化率为100％，目标产物 FCA产率为93％。
实施例17
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.6mmol糠醛(糠醛初始浓度为150mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至 7.0。12h后，糠醛转化率为88％，目标产物FCA产率为83％。
实施例18
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.6mmol糠醛(糠醛初始浓度为150mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至 7.0。6h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为95％。
实施例19
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.72mmol糠醛(糠醛初始浓度为180mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。9h后，糠醛转化率为99％，目标产物FCA产率为93％。
实施例20
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.96mmol糠醛(糠醛初始浓度为240mM)，混合均匀后，按100mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。24h后，糠醛转化率为97％，目标产物FCA产率为90％。
实施例21
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol糠醛(糠醛初始浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E. coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。当糠醛几乎耗尽时，向反应体系中补充约 0.4mmol糠醛和0.4mmol碳酸氢钠。反应6h后共合成177mM FCA，糠醛转化率为98％， FCA产率为90％，其时空产率为3.3g/L h。
实施例22
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.2mmolMMF(MMF初始浓度为50 mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌 E.coli-CtCALDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。利用液相色谱监控反应(图5)。6h 后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为96％。
实施例23
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol MMF(MMF初始浓度为100 mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌 E.coli-CtCALDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。6h后，MMF转化率为98％，目标产物MMFCA产率为90％。
实施例24
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.6mmol MMF(MMF初始浓度为150 mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例9获得的重组菌 E.coli-CtCALDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH 调至7.0。9h后，MMF转化率为83％，目标产物MMFCA产率为79％。
实施例25
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.2mmol MMF(MMF初始浓度为50 mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。6h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为94％。
实施例26
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol MMF(MMF初始浓度为100 mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。6h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为92％。
实施例27
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.6mmol MMF(MMF初始浓度为150 mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。9h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为92％。
实施例28
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.6mmol MMF(MMF初始浓度为150 mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。6h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为99％。
实施例29
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.72mmol MMF(MMF初始浓度为180mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH 调至7.0。6h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为100％。
实施例30
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.96mmol MMF(MMF初始浓度为240mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH 调至7.0。9h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为99％。
实施例31
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入1.12mmol MMF(MMF初始浓度为280mM)，混合均匀后，按100mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH 调至7.0。24h后，MMF转化率为77％，目标产物MMFCA产率为73％。
实施例32
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.4mmol MMF(MMF初始浓度为100 mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH2-NOX，于30℃及150rpm下反应。当MMF几乎耗尽时，向反应体系中补充约0.4mmol MMF和0.4mmol碳酸氢钠，重复添加两次。反应8h后共生成了287mM MMFCA，MMF转化率为99％，MMFA产率为91％，时空产率为5.6g/Lh。
实施例33
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中加入0.08mmol MMF(MMF初始浓度为 20mM)，混合均匀后，按20mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例2获得的重组菌 E.coli-CtVDH1-NOX，于30℃及150rpm下反应。3h后，MMF转化率为100％，目标产物MMFCA产率为94％。
实施例34共表达醛脱氢酶和HmfH重组菌的构建
(1)利用NCBI数据库，获得HmfH的基因全长序列(GenBank上的核苷酸系列登录号为GU556183.1)，合成后连接到经过优化的表达质粒pACYCDuet-1(T7启动子替换为Trc 启动子，第一个多克隆位点前的核糖体结合位点序列由AAGGAGATATACC替换为AAAAATTTGATTATAAGGACGGTAATTT)的第一个多克隆位点，得到重组质粒；
(2)携带醛脱氢酶基因的pET-28a重组质粒已在专利CN109536466A中构建得到；
(3)将上述含有醛脱氢酶基因的重组质粒和含有HmfH基因的重组质粒同时转化至E. coliBL21(DE3)，得到共表达醛脱氢酶和HmfH的重组菌E.coli-CtCALDH1-HmfH、E.coli-CtCALDH2-HmfH、E.coli-CtVDH1-HmfH、E.coli-CtVDH2-HmfH和E. coli-CtSAPDH-HmfH。
实施例35共表达醛脱氢酶和HmfH重组菌的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基(胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，72mM K2HPO4，17mM KH2PO4)中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.6～0.8时，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例36
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例35获得的重组菌E.coli-CtCALDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。利用液相色谱监控反应(图6)。 30h后，HMF转化率为34％，目标产物FDCA产率为8％。
实施例37
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例35获得的重组菌E.coli-CtCALDH2-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后，HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为55％。
实施例38
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例35获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后，HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为94％。
实施例39
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例35获得的重组菌E.coli-CtVDH2-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后，HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为39％。
实施例40
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例35获得的重组菌E.coli-CtSAPDH-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后，HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为53％。
实施例41E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.6～0.8时，加入0.05mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例42
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例41获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为88％。
实施例43E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.6～0.8时，加入1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例44
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例43获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为92％。
实施例45E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.6～0.8时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例46
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例45获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为95％。
实施例47E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.4时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例48
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例47获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为86％。
实施例49E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到1.2时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例50
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例49获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为91％。
实施例51E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.8～1.0时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于17℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例52
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例51获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为89％。
实施例53E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.8～1.0时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于35℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例54
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例53获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为18％。
实施例55E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.8～1.0时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养8h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例56
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例55获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为59％。
实施例57E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.8～1.0时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养28h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例58
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例57获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为93％。
实施例59E.coli-CtVDH1-HmfH的诱导表达
将实施例34中获得的重组菌接种至含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量将上述菌悬液转种到含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD600达到0.8～1.0时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于20℃、 160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。
实施例60
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为96％。
实施例61
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于20℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为54％。
实施例62
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于40℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为70％。
实施例63
在4mL Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(200mM，pH 6.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59 获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为 100％，目标产物FDCA产率为6％。
实施例64
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 8.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。30h后HMF转化率为67％，目标产物FDCA产率为65％。
实施例65
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.2mmol HMF(HMF初始浓度为 50mM)，混合均匀后，按150mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应。14h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为99％。
实施例66
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.3mmol HMF(HMF初始浓度为 75mM)，混合均匀后，按150mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应，每隔12h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。28h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为96％。
实施例67
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF初始浓度为100mM)，混合均匀后，按150mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应，每隔12h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。48h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为97％。
实施例68
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.5mmol HMF(HMF初始浓度为125mM)，混合均匀后，按150mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应，每隔12h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。72h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为100％。
实施例69
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.6mmol HMF(HMF初始浓度为150mM)，混合均匀后，按150mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应，每隔12h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。72h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为95％。
实施例70
在4mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)中加入0.8mmol HMF(HMF初始浓度为200mM)，混合均匀后，按150mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例59获得的重组菌E.coli-CtVDH1-HmfH，于30℃及150rpm下反应，每隔12h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。96h后HMF转化率为100％，目标产物FDCA产率为57％。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种共表达重组菌及其在合成呋喃羧酸中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaactaca tggacttgca ccgcattttt gacttgcagt accaagccag ccgcacgcag 60
gtcgatgtac ctttgctggt gcgccgggag aggctgctgc gtctgcagaa gatgctggac 120
gagaacggcc cggctttgtg cgcggcggtg gagcaggact ttggcgtgcg ctccgagcgc 180
tggaccgaga tgctggatct gatgctggtg cgcaatatgc tcaggcacac gctcaagcat 240
ctgcccaagt ggagcaagcg tcagcgcgtg cgcacgccac tgatgctgca gccgggcaag 300
gcctgggtgg agcgccagcc tctgggcgtg gtgggcatca tctcgccctg gaactatccg 360
ttgcaactat cgctggcgcc ggccatcacg gctctggcgg cgggcaatcg cgtgatgctc 420
aagcccagcg agctgacgcc gcatacctcg gcaaaaatgg gcgagctggt cgcccagttc 480
tttgcacccg aagagttctg cgtgatcgag ggggacgtgg ccgtggccac gcagttctcg 540
ggtctgcaat tcgatcatct gctgttcacc ggctccacgg ccgtggggcg gcgtgtggcg 600
caggcggcag ccgtgcacct gacgcccacc acactggagc tcgggggcaa atcgccctgc 660
atcattgcgc aggactgcga tatgcaggcc gctgcgctca aggtggccta tggcaagctg 720
gtcaatgccg ggcagacctg catcgctccc gactatgtgc tgctgccgcg cggcaaggag 780
caggagtttg ccgaggccta tcaggcggcg gtgcagcagc tgtacccgcg catctcgggc 840
aacccggact acacggccat catcagcaag cgccatctgg cacgactcaa gcagatgctg 900
cgccaggcgc aaagcctggg agcgcaggtg cactggatgc atgaagcggc tgccccggct 960
gcggatggtg acaccacggc ctggggcgag gccgtggaga ggcagttcgc tccggcgctg 1020
gtgttcggtg ccaccggcga gatgcagctg atgcaggaag agatcttcgg ccccatcctg 1080
cctgtgatct cctacgagca tatcgaagac gtgatcaatg ccatcaacgc cagcccgcgc 1140
ccgctggcgc tgtactggtt tggcaacgac gaggccgagc gcaatgcggt gttgatgcgc 1200
accgtcagcg gaggcgtctg tgtgaacgac accttgctgc atgtggcgca tgagaacttg 1260
ccattcggcg gtgtcggcga cagcggctgg ggtgcctatc acgcagagca gggctttttg 1320
cgctttgtgc accagaaggc ggttttcgtg cagtcgcgct gggcggcgac ttccctgctg 1380
tacccgccgt tcggggaaaa attcgaccgg gtgatggact tcatgcgacg ctggctctga 1440
<210> 2
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatcgaac aaaaaatgct gatagccggc caggaatgtg ccgccagcaa tggcgcagtt 60
tttgagcgca agaacccgct ggatggctcg gttgccacgc gtgcgcccgc cgccaccacc 120
gaagacgcca tccgcgcctg cgatgcagcg gcagcagcct tccccgcctg gtcgcaactg 180
gggccgaacg cccgccgcgc catgctgatg aaggcctcgc aggcgctgga agccaagggc 240
gaagcgattg ccgcagccat ggctgccgag accggcgcct cgggcatctg ggccggcttc 300
aacgtgcatc tggccgccag catgctgctg gaagcggctt cgctgaccac gcagatcaat 360
ggcgagatca ttccctccga cgtgcccggc agcctggcca tggccgtgcg ccagcccgcc 420
ggcgtggtgt tgggcatcgc gccctggaat gcccccgtga ttctggccgt gcgcagcatc 480
tccacggccc tggcctgcgg caataccgtg atcctcaagg gatcggaact ctgccccgcc 540
acccacggcc tgatcatcga agcgctgcag gacgcaggcc tgcccgccgg cgtggtgaac 600
tttgtgacca atgcgcccgc cgatgcgggc agcgtggtcg aggccatcgt ggcccatccg 660
gccgtgcgcc gcgtgagctt taccggctcc acacgtgtgg gccgcatcat cggccagacc 720
tgcgccaagc atctcaagcc cgcgctgctg gagctcggcg gcaaagctcc cttcctggtg 780
ctggacgatg ccgatatcga tgcggccgtg agcgccgcca cctttggcgc gtttgccaac 840
tcgggccaga tctgcatgtc caccgagcgc ttcgtggtgg ataacaaggt ggccgacgag 900
ttcatcgcca agtttgccgc caaggcccgc agcctgcctc tgggcgaccc gcgcaagggg 960
cccgtggtgc tgggctcggt ggtcgacctg gccacggtgg agcgctgcaa tgccatgatc 1020
gacgacgcgc tggccaaggg cggaaaactg gtctgcggcg gcaaggccga gagcaccctg 1080
atgcccgcca cactgatcga ccatgtgacg ccggcgatgc gcatcttcca cgaggagagc 1140
ttcggcccgg tcaagggcat cgtgcgcgtg aacggcgagg aagaagccat tgccacggcc 1200
aatgacaacg agttcggtct gtcctcggca gtcttcaccc gggacacggc ccgcggctgg 1260
cgtgtggcgg cgcgcatcga ggccggcatc tgccatatca acggccccac ggtgcatgac 1320
gaagcccaga tgccttttgg cggcgtcaag gcctcgggct atggccattt cggcggccag 1380
cagggcatca atgcctttac cgaaacccgc tgggtgacca tgcagaccgc agaacgccac 1440
tatccgttct aa 1452
<210> 3
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgattgaac aaagcatgct catcggcggt cagaccgcac aggccagcaa tggcgccact 60
ttcgagcgca gaaaccctct ggacggatcg gtcgccacgc gtgccccggc cgccacaaca 120
gccgacgccg tgcgtgccgt ggaagccgct caggcggcct tccctgcctg ggcggccctg 180
ggccccacag aacgcaggct gatgctgatg aaggcctcgc aggccctgga ggccaaggcc 240
gaagcctttg ccgcagccat ggcggcagaa accggcgcct ccggtatctg ggccggcttc 300
aatgtgcatc tggccgccaa tatgtttctc gaagccgcgt cgctgaccac ccagatcaac 360
ggccagctga ttccttcgga catccccggc agcatggcca tggccgtgcg ccagcccgcc 420
ggcgtggtgc tgggcatcgc cccctggaat gcccccatca tcttggccgt acgcgccatt 480
gccacgcccc tggcctgcgg caacaccgtg atcctcaagg gctcggagct gtgtcccgcc 540
acgcacggcc tgatcatcga agcgctgcag gaaggcggct tgccgcccgg cgtggtgaac 600
tttgtgacca atgcgcccga agacgccggc acagtggtcg aggccatggt ggcccacccc 660
gccgtacgcc gcgtgaactt cacgggctcc acgcgcgtgg gccgcatcat cggccagacc 720
tgcgccaaat acctcaagcc cgtcatcctg gagctgggcg gcaaggcccc gttcctggtc 780
ctggacgatg ccgacatcga ctccgcggtg gccggctgca cctttggcgc cttcgccaac 840
tcgggccaga tatgcatgtc caccgagcgc atcatcgtgg acgaggccgt ggccgaggaa 900
ttcatcgcca agctggtggg ccgcgccaca accctgcctc tgggcgaccc ccgcaaaggc 960
cctgtggtgc tgggctcagt cgtggacatg aacaccgtga accgcgtcaa cgagctcatc 1020
gacgatgccg tcgccaaggg tgccaggatt ctttgcggcg gcaaggccaa cgacaccttg 1080
atggcagcca cgctgataga cggcgtgact cccgagatgc gaatcttccg tgaagagacc 1140
tttgccccgg taaaagccat cgtacgcgtg cgtggcgaag agcaggccat cgccatggcc 1200
aacgacaacg agttcggcct gtcttccgcc gtctacacca gggacacagc gcgtggctgg 1260
cgcgtggctg gccgcatcga agcgggcatc tgtcatgtca acggccccac cgtgcacgac 1320
gaggcacaga tgcctttcgg cggcgtgaag aactcgggct acggccactt cggcggccag 1380
gccggtatcg atgccttcac cgacacccgc tggatcacca tgcagaccac cgcacgtcac 1440
taccccttct aa 1452
<210> 4
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcaagacc atctgcagtt ctatatcgac ggccaatggg tgaatccggt cagcccgcgc 60
agcctggagg tcatcaatcc ctccaacgag caagccattg cccgcatcag catgggctcg 120
gccgccgacg tggacaaggc cgtggccgcc gcgcgtctcg ccttcgagag ctactcgcgc 180
accagccgcg aagagcgcct ggccctgctg gccaaggtgc tggaggtcta ccagagccgc 240
tacggcgact ttgtgcagac catctcgcag gagatggggg cgccgctgtg gctgtccaag 300
gcggcacagg ccgccatggg cgtggcccat ctgagctcca ccatcgaggt cctcaagaac 360
ttcgccttcg aacatgtgca gggcagcacg gccgtcgtgc atgagcccgt gggcgtggtc 420
ggaatgatca cgccctggaa ctggcccatc aaccagatca tgtgcaaggt cgccccggcc 480
ctggccgctg gctgcaccat ggtgctcaag ccctcggagg tcgccccgct caatgccctg 540
ctcgtggccg aggtgctgca cgaggcgggc gtgccggccg gcgtcttcaa cctcgtcaac 600
ggcgacggcc ccggtgtggg cgaggccatg tcctcccacc ccggcataga catgatgacc 660
ttcacgggct ccacgcgcgc gggcattgcc gtggccaagg ccgcggccga cagcgtcaag 720
cgtgtggccc aggaattggg cggcaagtct gccaacatcg tgctggatga cgccaacctg 780
caaaaggccg tgacccaggg cgtgcaggcg gtgctgatga attcgggcca gagctgcaac 840
gcacccacgc gcatgtttgt gccgcgcgcc ctgcatgggc aggccgtgga gatcgcccgt 900
agcgtcgccg gcgcagcgac cgtggccgat gcgctggccg agggcatgca catgggcccc 960
gtggtcagcg aggcgcaatg gggcaagatc caggccctga tccgcaaggg cattgaagag 1020
ggggcgaccc tggtggcggg cggaacaggc cgccccgaag ggctggtcca gggctacttt 1080
gtcaaaccca cggtgtttgc cgacgtgagc aatgacatga gcattgcgcg cgaggaaatc 1140
ttcggtcctg tgctggtgat gattccctac gatgacgagg aagacgccat ccgcatggcc 1200
aacgacacgg tgtacggcct ttcgggctat gtgcaatcgg gcagcctgga gcgtgcgcgc 1260
agcgtggccg cgcgcctgcg cacaggcatg gtccacctca acggcgcggg gcctgacttc 1320
aatgcgccgt tcggcggcta caagcagtca ggcaatggcc gtgaatgggg cgagcacggt 1380
ttccgcgatt tcctcgaaac caaggcagtc atgggctacg gcgcggcctg a 1431

Claims (10)

1.一种共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建：将来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588的醛脱氢酶基因与NADH氧化酶基因同时导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)，获得共表达醛脱氢酶和NADH氧化酶的重组菌；所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID.1、SEQ ID.2或SEQ ID.3，所述NADH氧化酶基因在GenBank上的核苷酸序列登录号为CP021479.1。
2.一种共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建：将来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588的醛脱氢酶基因与5-羟甲基糠醛氧化还原酶基因同时导入E.coliBL21(DE3)，获得共表达醛脱氢酶和5-羟甲基糠醛氧化还原酶的重组菌；所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID.2，所述5-羟甲基糠醛氧化还原酶基因在GenBank上的核苷酸序列登录号为GU556183.1。
3.权利要求1所述的重组菌在催化呋喃醛选择性氧化合成呋喃羧酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的重组菌接种至含有100±30μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37±2℃、180±40rpm下培养12±3h；然后，按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有100±30μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37±2℃、180±40rpm下培养；当菌液的OD600达到0.6～1.2时，加入0.1～0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于16～20℃、160±40rpm下诱导培养20±4h，培养结束后收集菌体细胞，并用生理盐水清洗细胞；
(2)将上述收集的菌体细胞和含有呋喃醛的磷酸盐缓冲液加入反应器中，按细胞湿重计，所述菌体细胞浓度为20～100mg/mL，呋喃醛浓度为50～280mM，在30±5℃、150±30rpm下反应2～24h，得到呋喃单羧酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述呋喃醛结构通式如下所示：
其中，R基团为H、CH2OH或CH2OCH3；所述呋喃醛浓度为150～250mM，控制步骤(2)反应体系的pH值为5～8。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)当反应器中呋喃醛浓度几乎完全消耗时，向反应体系中补充呋喃醛和等摩尔当量的碳酸氢钠继续进行反应。
7.权利要求2所述的重组菌在催化5-羟甲基糠醛氧化合成2,5-呋喃二羧酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求2所述的重组菌接种至含有25±5μg/mL卡那霉素和17±3μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37±2℃、180±40rpm下培养12±3h；然后按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有25±5μg/mL卡那霉素和17±3μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，于37±2℃、180±40rpm下培养；当菌液的OD600达到0.4～1.2时，加入0.05～1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于17～35℃、160±40rpm下诱导培养8～28h；培养结束后收集菌体细胞，并用生理盐水清洗细胞；
(2)将上述收集的菌体细胞和含有5-羟甲基糠醛的缓冲液加入反应器中，按细胞湿重计，所述菌体细胞浓度为50～150mg/mL，HMF浓度为50～175mM，在20～40℃下反应12～84h，得到2,5-呋喃二羧酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，控制步骤(2)反应体系的pH值为5～8，30±5℃下反应14～72h；所述HMF浓度为75～150mM。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加量为0.1～0.2mM。
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