CN109536466A

CN109536466A - 醛脱氢酶及其基因、重组菌构建及其在呋喃羧酸合成中的应用

Info

Publication number: CN109536466A
Application number: CN201811376243.XA
Authority: CN
Inventors: 李宁; 张雪莹; 宗敏华
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109536466B

Abstract

本发明涉及基因工程技术及生物催化领域，公开了醛脱氢酶及其基因、重组菌构建及其在呋喃羧酸合成中的应用。本发明通过基因挖矿技术从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588中筛选出五种醛脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID.1、SEQ ID.2、SEQ ID.3、SEQ ID.4或SEQ ID.5所示。本发明五种醛脱氢酶均可高效催化生物基呋喃选择性氧化合成相应的呋喃羧酸，目标产物的产率高达90％左右，最高产率甚至可以达到100％；时空产率达1.9g/L h。本发明生产过程简单、生产条件温和、生产效率高。

Description

醛脱氢酶及其基因、重组菌构建及其在呋喃羧酸合成中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物催化领域，具体涉及睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588来源的五种醛脱氢酶、编码基因、表达醛脱氢酶的重组菌以及其在催化生物基呋喃选择性氧化合成呋喃羧酸中的应用。

背景技术

呋喃羧酸如5-羟甲基-2-呋喃羧酸(5-hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid,HMFCA)、2-呋喃羧酸(2-furancarboxylic acid，FCA)及2,5-呋喃二羧酸(2,5-furandicarboxylic acid，FDCA)等是一类重要的生物基化学品，在高分子、医药等领域具有重要的应用价值。例如，HMFCA是合成各种生物基聚酯(Makromol.Chem.,1984,185,2347)和生物基对苯二甲酸的关键原料(ACS Catal.,2016,6,5052)。对苯二甲酸与乙二醇经缩聚反应后得到的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是开发最早、产量最大、应用最广的聚酯产品。HMFCA还可用于合成一种白细胞介素抑制剂(J.Am.Chem.Soc.,2003,125,3714)。此外，研究发现HMFCA具有抗肿瘤活性(Agric.Biol.Chem.,1981,45,2149)。FCA同样也广泛用于医药、农业化学品、香精香料等工业中(Energy Environ.Sci.,2016,9，1144)。FDCA是替代对苯二酸合成PET类似物(PEF)的关键原料，在生物基聚酯材料制备中具有广阔的应用前景(J.Polym.Sci.,Part A:Polym.Chem.,2017,55,1478)。

HMFCA的制备方法可分为化学法和生物催化法。以生物基平台化合物5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)作为起始原料，选择性地将HMF中的醛基氧化为羧基即可得到HMFCA。目前，化学催化仍是合成HMFCA的主要途径，其中惰性载体担载的贵金属如铂、金等是合成HMFCA的常见催化剂(J.Mol.Catal.A:Chem.,2014,388-389,123；Catal.Today,2011,160,55；ChemSusChem,2009,2,1138)。Zhang等报道二氧化钼乙酰丙酮酸盐能高效催化HMF氧化合成HMFCA，3h后目标产物产率为87％(Green Chem.,2014,16,2762)。工业上，FCA主要通过NaOH催化糠醛进行Cannizzaro反应得到(EnergyEnviron.Sci.,2016,9，1144)，该法的缺点之一在于合成FCA的同时生成了等摩尔的糠醇，导致FCA的理论选择性仅为50％。

化学法通常在高温或高压下催化反应的进行，反应条件较苛刻；需要使用碱性溶液或有机溶剂，环境不友好。生物基呋喃如糠醛、HMF等在激烈的反应条件下通常不稳定，易导致大量副产物的产生(Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55,8338)。而生物催化反应条件温和、具有高效、高选择性等特点；同时，生物催化剂环境友好。因此，近年来生物催化生物基呋喃转化受到人们越来越多的关注。Krystof等以H₂O₂作为氧化剂，在乙酸乙酯-叔丁醇体系中利用脂肪酶分别催化HMF和糠醛氧化合成HMFCA和FCA，反应24h后目标呋喃羧酸产率为80-91％(ChemSusChem,2013,6,826)。Zong等以黄嘌呤氧化酶作为催化剂催化HMF氧化制备HMFCA，反应7h后HMFCA产率达94％(Green Chem.,2015,17,3718)。最近，该课题组又以马肝醇脱氢酶结合NAD⁺原位再生体系催化HMF氧化合成HMFCA，反应60h后HMFCA产率为81％(ChemSusChem,2017,10,3524)。Knaus等分别以牛眼晶状体醛脱氢酶和大肠杆菌(Escherichia coli)醛脱氢酶作为催化剂催化HMF氧化制备HMFCA，同时向反应体系中加入NADH氧化酶用于NAD⁺的再生，HMFCA产率为90-91％，但底物浓度较低，仅为20mM(GreenChem.,2018,20,3931)。

以游离酶作为催化剂合成呋喃羧酸时，底物的浓度通常较低，且酶的分离纯化以及辅酶再生体系使得操作过程复杂、耗时，反应成本较高。全细胞催化免除了繁琐昂贵的分离纯化过程，节约成本；其次，酶蛋白在细胞膜的保护下免受外部条件干扰，更加稳定；另外，使用全细胞催化时不需要添加辅酶。Mitsukura等用Serratia liquefaciens LF14细胞在磷酸盐缓冲液中催化HMF氧化合成HMFCA，采用底物分批流加的方法共转化了2.6mmolHMF，目标产物的产率达97％，时空产率为0.9g/L h(Biotechnol Lett,2005,26,1643)。本课题组从土壤里筛选得到一株对HMF具有高耐受性，并且能催化HMF氧化合成HMFCA的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588。当HMF浓度为160mM时，反应36h后HMFCA产率达98％(Green Chem.,2017,19,4544)。该菌催化50mM糠醛氧化，需要反应96h才能获得较高的产率。生物基呋喃对微生物具有强烈的抑制作用，会破坏微生物细胞的细胞膜和细胞壁、抑制RNA的合成(Bioresour.Technol.,2000,74,25；Biochem.J.,2002,363,769；Biotechnol.Bioeng.,1999,65,24)。因此，随着底物浓度的提高，反应时间逐渐延长，转化效率逐渐降低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明借助基因组挖矿技术，从C.testosteroni SC1588的基因组中挖掘到了催化HMF氧化合成HMFCA的五个关键醛脱氢酶，即松柏醛脱氢酶1(CtCALDH1)，松柏醛脱氢酶2(CtCALDH2)，香草醛脱氢酶1(CtVDH1)，香草醛脱氢酶2(CtVDH2)和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶(CtSAPDH)，利用E.coli BL21(DE3)作为宿主，成功构建了能够高效表达上述醛脱氢酶的重组菌，以期开发出一种生产过程简单、生产条件温和、生产效率高的全细胞催化生物基呋喃氧化合成呋喃羧酸的方法。

所述CtCALDH1基因的氨基酸序列如SEQ ID.1所示，核苷酸序列如SEQ ID.6所示。

所述CtCALDH2基因的氨基酸序列如SEQ ID.2所示，核苷酸序列如SEQ ID.7所示。

所述CtVDH1基因的氨基酸序列如SEQ ID.3所示，核苷酸序列如SEQ ID.8所示。

所述CtVDH2基因的氨基酸序列如SEQ ID.4所示，核苷酸序列如SEQ ID.9所示。

所述CtSAPDH基因的氨基酸序列如SEQ ID.5所示，核苷酸序列如SEQ ID.10所示。

一种产醛脱氢酶的重组菌，所述重组菌为上述醛脱氢酶编码基因导入大肠杆菌获得。

所述产醛脱氢酶的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588基因组DNA为模板，通过设计特异性引物扩增CtCALDH1、CtCALDH2、CtVDH1、CtVDH2和CtSAPDH基因全长序列；

(2)将所述醛脱氢酶基因连接到表达载体pET-28a中，得到重组质粒；

(3)将经测序验证的重组质粒转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)，得到产醛脱氢酶的重组菌。

所述的重组菌在催化生物基呋喃选择性氧化合成呋喃羧酸中的应用，包括如下步骤：

(1)将权利要求3所述的重组菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h；

(2)按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.05～1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，置于15～35℃、160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞；

(3)将上述收集的菌体细胞和含有生物基呋喃的磷酸盐缓冲液加入反应器中，所述生物基呋喃浓度为50～225mM，在20～40℃、150rpm下反应2～96h，得到呋喃羧酸。

控制步骤(3)反应体系的pH值为5～8。

通过分批流加底物生物基呋喃，以在反应体系中积累高浓度的呋喃羧酸。

分批流加的具体步骤如下：步骤(3)当反应器中生物基呋喃浓度几乎完全消耗时，向反应体系中补充生物基呋喃和等摩尔当量的弱碱，继续进行反应，重复上述底物添加步骤以积累高浓度的产物呋喃羧酸。

所述生物基呋喃结构如下通式所示：

其中，R基团为H、CH₂OH、CH₂OCH₃、CH₃或COOH。

所述弱碱为碳酸氢钠或碳酸钙。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了五种醛脱氢酶，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效表达上述醛脱氢酶的重组菌。上述重组菌均能高效催化生物基呋喃选择性氧化合成呋喃羧酸，目标产物产率达90％左右，最高产率甚至可以达到100％；时空产率达1.9g/L h。

(2)本发明生产过程简单、生产条件温和、生产效率高。

附图说明

图1为生物基呋喃及其氧化产物呋喃羧酸的结构图。

图2为CtCALDH1、CtCALDH2、CtVDH1、CtVDH2和CtSAPDH基因扩增电泳图。

图中标记：M，DNA分子量标准；1，CtCALDH1基因；2，CtCALDH2基因；3，CtVDH1基因；4，CtVDH2基因；5，CtSAPDH基因。

图3为CtCALDH1(a),CtCALDH2(b),CtVDH1(c),CtVDH2(d)和CtSAPDH(e)的SDS-PAGE图谱。

图中标记：M，蛋白分子量标准；1，未经IPTG诱导的重组大肠杆菌；2经IPTG诱导的重组大肠杆菌；3，纯酶。

图4为HMFCA样品分析的液相色谱图(HMFCA、2,5-二羟甲基呋喃及HMF的保留时间分别为6.1、8.1及9.8min)。

图5为FCA样品分析的液相色谱图(FCA、糠醇及糠醛的保留时间分别为9.2、14.3及16.3min)。

图6为5-甲基-2-呋喃羧酸样品分析的液相色谱图(5-甲基-2-呋喃羧酸、5-甲基糠醇及5-甲基糠醛的保留时间分别为12.1、13.1及15.7min)。

图7为5-甲氧基甲基-2-呋喃羧酸样品分析的液相色谱图(5-甲氧基甲基-2-呋喃羧酸、5-甲氧基甲基糠醇及5-甲氧基甲基糠醛的保留时间分别为5.0、7.1及10.4min)。

图8为FDCA样品分析的液相色谱图(FDCA、5-甲酰基-2-呋喃羧酸及HMFCA的保留时间分别为4.9、6.1及6.4min)。

具体实施方式

通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。

实施例1

醛脱氢酶编码基因的挖掘

为了挖掘出睾丸酮丛毛单胞菌SC1588基因组中可催化生物基呋喃氧化合成呋喃羧酸的关键酶，委托深圳华大基因科技服务有限公司对睾丸酮丛毛单胞菌SC1588的基因组草图进行测序，根据预测的编码序列的功能注释，从基因组中挖掘出5个醛脱氢酶基因，即CtCALDH1基因，CtCALDH2基因，CtVDH1基因，CtVDH2基因和CtSAPDH基因。

实施例2

重组菌的构建

(3)将经测序验证的重组质粒转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)，得到产醛脱氢酶的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtCALDH1、E.coli BL21(DE3)_CtCALDH2、E.coli BL21(DE3)_CtVDH1、E.coli BL21(DE3)_CtVDH2和E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH。

表1引物信息

引物名称	引物序列(5’-3’)
		CtCALDH1上游引物	CAGGATCCATGACCCAGACGAATTCGTCCATC
CtCALDH1下游引物	ATGAAGCTTGGGAGTGACTGCGGCCTGCA
		CtCALDH2上游引物	CGGGATCCATGAACTACATGGACTTGCACCGCA
CtCALDH2下游引物	GCGAAGCTTTCAGAGCCAGCGTCGCATGAA
		CtVDH1上游引物	CGGGATCCATGATCGAACAAAAAATGCTGATAG
CtVDH1下游引物	GCGAAGCTTGAACGGATAGTGGCGTTCTGC
		CtVDH2上游引物	CGGGATCCATGATTGAACAAAGCATGCTCATCG
CtVDH2下游引物	GCGAAGCTTGAAGGGGTAGTGACGTGCGGTG
		CtSAPDH上游引物	CGGGATCCATGCAAGACCATCTGCAGTTCTATATCGAC
CtSAPDH下游引物	ATGAAGCTTGGCCGCGCCGTAGCCCAT

实施例3

醛脱氢酶的诱导表达

将实施例2中获得的重组菌接种至30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量转种到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、180rpm下培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为0.1mM，置于18℃、160rpm下诱导培养20h。培养结束后，于8000rpm、4℃下离心5min，收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。

实施例4

重组醛脱氢酶的SDA-PAGE分析。

将实施例3中收集的菌体细胞用磷酸盐缓冲液重悬，冰水浴中超声破碎20min。然后，破碎液于12000rpm、4℃下离心20min，收集上清液，得到重组酶的粗酶液。最后，利用镍亲和层析柱将重组酶进行分离纯化，纯化后的酶用于SDS-PAGE分析(图3)。

实施例5

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF最终浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtCALDH2，于30℃及150rpm下反应。利用液相色谱监控反应(图4)。5h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为83％。

实施例6

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF最终浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH1，于30℃及150rpm下反应。5h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为89％。

实施例7

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF最终浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH2，于30℃及150rpm下反应。5h后，HMF转化率为97％，目标产物HMFCA产率为78％。

实施例8

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF最终浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应。5h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为85％。

实施例9

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.6mmol HMF(HMF最终浓度为150mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH1，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。5h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为91％。

实施例10

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.7mmol HMF(HMF最终浓度为175mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH1，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。9h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为90％。

实施例11

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.8mmol HMF(HMF最终浓度为200mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH1，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。12h后，HMF转化率为100％，目标产物HMFCA产率为92％。

实施例12

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.9mmol HMF(HMF最终浓度为225mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH1，于30℃及150rpm下反应，每隔2h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。12h后，HMF转化率为18％，目标产物HMFCA产率为11％。

实施例13

在8mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.4mmol HMF(HMF最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例3获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtVDH1，于30℃及150rpm下反应。当HMF几乎耗尽时，向反应体系中补充约0.4mmolHMF和0.4mmol碳酸氢钠，重复操作6次，反应22.5h后，共合成2.45mmol目标产物HMFCA，HMFCA的产率为90％，时空产率为1.9g/L h。

实施例14

CtSAPDH醛脱氢酶的诱导表达

将实施例2中获得的重组菌接种至30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量转种到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、180rpm下培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为0.05mM，置于35℃、160rpm下诱导培养20h。培养结束后，于8000rpm、4℃下离心5min，收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。

实施例15

在1mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.05mmol糠醛(糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例14获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应。液相色谱监控反应过程(图5)，反应10h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为96％。

实施例16

CtSAPDH醛脱氢酶的诱导表达

将实施例2中获得的重组菌接种至30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量转种到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、180rpm下培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为0.05mM，置于15℃、160rpm下诱导培养20h。培养结束后，于8000rpm、4℃下离心5min，收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。

实施例17

在1mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.05mmol糠醛(糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例16获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应，10h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为85％。

实施例18

CtSAPDH醛脱氢酶的诱导表达

将实施例2中获得的重组菌接种至30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量转种到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、180rpm下培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为0.05mM，置于30℃、160rpm下诱导培养20h。培养结束后，于8000rpm、4℃下离心5min，收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。

实施例19

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.2mmol糠醛(糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例18获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应，10h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为99％。

实施例20

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.4mmol糠醛(糠醛最终浓度为100mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例18获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应，48h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为95％。

实施例21

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.2mmol糠醛(糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例18获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应。当糠醛基本完全转化时，向反应体系中补充约0.2mmol糠醛和0.2mmol碳酸钙，重复操作2次，反应96h后，共生成了0.59mmol FCA，目标产物FCA的产率为98％。

实施例22

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.2mmol 5-甲基糠醛(5-甲基糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例18获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应。液相色谱监控反应(图6)，反应5h后，5-甲基糠醛转化率为100％，目标产物5-甲基-2-呋喃羧酸产率为100％。

实施例23

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.2mmol 5-甲氧基甲基糠醛(5-甲氧基甲基糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例18获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应。液相色谱监控反应(图7)，反应5h后，5-甲氧基甲基糠醛转化率为100％，目标产物5-甲氧基甲基-2-呋喃羧酸产率为95％。

实施例24

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.2mmol 5-甲酰基-2-呋喃羧酸(5-甲酰基-2-呋喃羧酸最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例18获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应。液相色谱监控反应过程(图8)，12h后，5-甲酰基-2-呋喃羧酸转化率为100％，目标产物FDCA产率为100％。

实施例25

CtSAPDH醛脱氢酶的诱导表达

将实施例2中获得的重组菌接种至30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)中，在37℃、180rpm下培养12h。然后，按1％的接种量转种到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、180rpm下培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为1mM，置于17℃、160rpm下诱导培养20h。培养结束后，于8000rpm、4℃下离心5min，收集菌体细胞，并用0.85％的生理盐水清洗细胞2次。

实施例26

在4mL磷酸盐缓冲液(200mM,pH 7.0)中加入0.2mmol糠醛(糠醛最终浓度为50mM)，混合均匀后，按50mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例25获得的重组菌E.coli BL21(DE3)_CtSAPDH，于30℃及150rpm下反应，10h后，糠醛转化率为100％，目标产物FCA产率为93％。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 醛脱氢酶及其基因、重组菌构建及其在呋喃羧酸合成中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Gln Thr Asn Ser Ser Ile Gly Ile Arg Gln Leu Leu Asp Met

1 5 10 15

Gln Lys Gln Ala Phe Ile Glu Glu Ala Ala Val Ser Ala Asp Val Arg

20 25 30

Met Gln Arg Ile Gln Gln Val Ile Asp Met Leu Val Glu His Lys Glu

35 40 45

Glu Leu Cys Gln Ala Met Gly Glu Asp Phe Gly Gly Arg Pro Ala Val

50 55 60

Phe Ser Leu Ala Asn Asp Ile Leu Gly Ser Leu Ser Ser Leu Lys His

65 70 75 80

Ala Arg Asp His Leu Arg Asp Trp Leu Gly Asp Ser Glu Arg Pro Ser

85 90 95

Val Lys Pro Phe Asp Met Phe Gly Ala Thr Ala Trp Val Lys Tyr Gln

100 105 110

Pro Lys Gly Val Ile Gly Ile Ile Gly Thr Trp Asn Ala Pro Leu Phe

115 120 125

Thr Leu Leu Ser Pro Leu Ala Cys Ala Phe Ala Ala Gly Asn Arg Ala

130 135 140

Val Leu Lys Pro Ser Glu Ile Ala Pro Arg Thr Ala Gln Val Leu Ala

145 150 155 160

Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asp Pro Gln Val Leu Ala Val Val Gln

165 170 175

Gly Gly Pro Glu Val Ala Ala Ala Phe Ala Glu Gln Pro Trp Asn His

180 185 190

Met Val Phe Thr Gly Ser Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile Met Ala Ala

195 200 205

Ala Ala Arg Asn Leu Val Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser

210 215 220

Pro Val Leu Val Gly Asp Ser Ala Asp Ile Ala Asn Ala Ala Glu Arg

225 230 235 240

Ile Ala Val Gly Lys Ser Leu Asn Ser Gly Gln Leu Cys Val Ser Pro

245 250 255

Asp Val Val Trp Val His Glu Ser Arg Leu Gln Ala Leu Ala Asp Gly

260 265 270

Ile Ala Ser Gln Tyr Gln Ala Leu Tyr Pro Ser Val Thr Gly Asn Ala

275 280 285

Asp Met Thr Pro Val Ile Asn Glu Arg His His Ala Arg Val Lys Ala

290 295 300

Tyr Val Asp Asp Ala Lys Ala Arg Gly Leu Thr Val Leu Glu Val Gly

305 310 315 320

Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Arg Arg Leu Pro Leu Ala Leu Val Val

325 330 335

Asn Pro Pro Ala Glu Ala Glu Ile Ser Arg His Glu Ile Phe Gly Pro

340 345 350

Ala Val Val Leu Arg Ser Phe Leu Asn Ile Arg Asp Ala Val Ala Ala

355 360 365

Ile Asn Ala Gly Glu Arg Pro Leu Ala Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp

370 375 380

Glu Thr Glu Gln Asn Trp Val Leu Asp Asn Thr Leu Ser Gly Gly Val

385 390 395 400

Ser Ile Asn Asp Val Val Met His Pro Ala Leu Glu Asp Ala Pro Phe

405 410 415

Gly Gly Val Gly Ala Ser Gly Met Gly His Tyr His Gly Arg Glu Gly

420 425 430

Phe Leu Glu Phe Ser His Ala Arg Ser Val Tyr Lys Ala Gly Asn His

435 440 445

Asp Pro Arg Arg Glu Trp Gly Met Leu Pro Pro Tyr Asn Pro Gln Phe

450 455 460

Glu Gln Met Leu Gln Ala Ala Val Thr Pro

465 470

<210> 2

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Tyr Met Asp Leu His Arg Ile Phe Asp Leu Gln Tyr Gln Ala

1 5 10 15

Ser Arg Thr Gln Val Asp Val Pro Leu Leu Val Arg Arg Glu Arg Leu

20 25 30

Leu Arg Leu Gln Lys Met Leu Asp Glu Asn Gly Pro Ala Leu Cys Ala

35 40 45

Ala Val Glu Gln Asp Phe Gly Val Arg Ser Glu Arg Trp Thr Glu Met

50 55 60

Leu Asp Leu Met Leu Val Arg Asn Met Leu Arg His Thr Leu Lys His

65 70 75 80

Leu Pro Lys Trp Ser Lys Arg Gln Arg Val Arg Thr Pro Leu Met Leu

85 90 95

Gln Pro Gly Lys Ala Trp Val Glu Arg Gln Pro Leu Gly Val Val Gly

100 105 110

Ile Ile Ser Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Gln Leu Ser Leu Ala Pro Ala

115 120 125

Ile Thr Ala Leu Ala Ala Gly Asn Arg Val Met Leu Lys Pro Ser Glu

130 135 140

Leu Thr Pro His Thr Ser Ala Lys Met Gly Glu Leu Val Ala Gln Phe

145 150 155 160

Phe Ala Pro Glu Glu Phe Cys Val Ile Glu Gly Asp Val Ala Val Ala

165 170 175

Thr Gln Phe Ser Gly Leu Gln Phe Asp His Leu Leu Phe Thr Gly Ser

180 185 190

Thr Ala Val Gly Arg Arg Val Ala Gln Ala Ala Ala Val His Leu Thr

195 200 205

Pro Thr Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Cys Ile Ile Ala Gln

210 215 220

Asp Cys Asp Met Gln Ala Ala Ala Leu Lys Val Ala Tyr Gly Lys Leu

225 230 235 240

Val Asn Ala Gly Gln Thr Cys Ile Ala Pro Asp Tyr Val Leu Leu Pro

245 250 255

Arg Gly Lys Glu Gln Glu Phe Ala Glu Ala Tyr Gln Ala Ala Val Gln

260 265 270

Gln Leu Tyr Pro Arg Ile Ser Gly Asn Pro Asp Tyr Thr Ala Ile Ile

275 280 285

Ser Lys Arg His Leu Ala Arg Leu Lys Gln Met Leu Arg Gln Ala Gln

290 295 300

Ser Leu Gly Ala Gln Val His Trp Met His Glu Ala Ala Ala Pro Ala

305 310 315 320

Ala Asp Gly Asp Thr Thr Ala Trp Gly Glu Ala Val Glu Arg Gln Phe

325 330 335

Ala Pro Ala Leu Val Phe Gly Ala Thr Gly Glu Met Gln Leu Met Gln

340 345 350

Glu Glu Ile Phe Gly Pro Ile Leu Pro Val Ile Ser Tyr Glu His Ile

355 360 365

Glu Asp Val Ile Asn Ala Ile Asn Ala Ser Pro Arg Pro Leu Ala Leu

370 375 380

Tyr Trp Phe Gly Asn Asp Glu Ala Glu Arg Asn Ala Val Leu Met Arg

385 390 395 400

Thr Val Ser Gly Gly Val Cys Val Asn Asp Thr Leu Leu His Val Ala

405 410 415

His Glu Asn Leu Pro Phe Gly Gly Val Gly Asp Ser Gly Trp Gly Ala

420 425 430

Tyr His Ala Glu Gln Gly Phe Leu Arg Phe Val His Gln Lys Ala Val

435 440 445

Phe Val Gln Ser Arg Trp Ala Ala Thr Ser Leu Leu Tyr Pro Pro Phe

450 455 460

Gly Glu Lys Phe Asp Arg Val Met Asp Phe Met Arg Arg Trp Leu

465 470 475

<210> 3

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ile Glu Gln Lys Met Leu Ile Ala Gly Gln Glu Cys Ala Ala Ser

1 5 10 15

Asn Gly Ala Val Phe Glu Arg Lys Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val Ala

20 25 30

Thr Arg Ala Pro Ala Ala Thr Thr Glu Asp Ala Ile Arg Ala Cys Asp

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Phe Pro Ala Trp Ser Gln Leu Gly Pro Asn Ala

50 55 60

Arg Arg Ala Met Leu Met Lys Ala Ser Gln Ala Leu Glu Ala Lys Gly

65 70 75 80

Glu Ala Ile Ala Ala Ala Met Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Gly Ile

85 90 95

Trp Ala Gly Phe Asn Val His Leu Ala Ala Ser Met Leu Leu Glu Ala

100 105 110

Ala Ser Leu Thr Thr Gln Ile Asn Gly Glu Ile Ile Pro Ser Asp Val

115 120 125

Pro Gly Ser Leu Ala Met Ala Val Arg Gln Pro Ala Gly Val Val Leu

130 135 140

Gly Ile Ala Pro Trp Asn Ala Pro Val Ile Leu Ala Val Arg Ser Ile

145 150 155 160

Ser Thr Ala Leu Ala Cys Gly Asn Thr Val Ile Leu Lys Gly Ser Glu

165 170 175

Leu Cys Pro Ala Thr His Gly Leu Ile Ile Glu Ala Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Gly Leu Pro Ala Gly Val Val Asn Phe Val Thr Asn Ala Pro Ala Asp

195 200 205

Ala Gly Ser Val Val Glu Ala Ile Val Ala His Pro Ala Val Arg Arg

210 215 220

Val Ser Phe Thr Gly Ser Thr Arg Val Gly Arg Ile Ile Gly Gln Thr

225 230 235 240

Cys Ala Lys His Leu Lys Pro Ala Leu Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ala

245 250 255

Pro Phe Leu Val Leu Asp Asp Ala Asp Ile Asp Ala Ala Val Ser Ala

260 265 270

Ala Thr Phe Gly Ala Phe Ala Asn Ser Gly Gln Ile Cys Met Ser Thr

275 280 285

Glu Arg Phe Val Val Asp Asn Lys Val Ala Asp Glu Phe Ile Ala Lys

290 295 300

Phe Ala Ala Lys Ala Arg Ser Leu Pro Leu Gly Asp Pro Arg Lys Gly

305 310 315 320

Pro Val Val Leu Gly Ser Val Val Asp Leu Ala Thr Val Glu Arg Cys

325 330 335

Asn Ala Met Ile Asp Asp Ala Leu Ala Lys Gly Gly Lys Leu Val Cys

340 345 350

Gly Gly Lys Ala Glu Ser Thr Leu Met Pro Ala Thr Leu Ile Asp His

355 360 365

Val Thr Pro Ala Met Arg Ile Phe His Glu Glu Ser Phe Gly Pro Val

370 375 380

Lys Gly Ile Val Arg Val Asn Gly Glu Glu Glu Ala Ile Ala Thr Ala

385 390 395 400

Asn Asp Asn Glu Phe Gly Leu Ser Ser Ala Val Phe Thr Arg Asp Thr

405 410 415

Ala Arg Gly Trp Arg Val Ala Ala Arg Ile Glu Ala Gly Ile Cys His

420 425 430

Ile Asn Gly Pro Thr Val His Asp Glu Ala Gln Met Pro Phe Gly Gly

435 440 445

Val Lys Ala Ser Gly Tyr Gly His Phe Gly Gly Gln Gln Gly Ile Asn

450 455 460

Ala Phe Thr Glu Thr Arg Trp Val Thr Met Gln Thr Ala Glu Arg His

465 470 475 480

Tyr Pro Phe

<210> 4

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ile Glu Gln Ser Met Leu Ile Gly Gly Gln Thr Ala Gln Ala Ser

1 5 10 15

Asn Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val Ala

20 25 30

Thr Arg Ala Pro Ala Ala Thr Thr Ala Asp Ala Val Arg Ala Val Glu

35 40 45

Ala Ala Gln Ala Ala Phe Pro Ala Trp Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu

50 55 60

Arg Arg Leu Met Leu Met Lys Ala Ser Gln Ala Leu Glu Ala Lys Ala

65 70 75 80

Glu Ala Phe Ala Ala Ala Met Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Gly Ile

85 90 95

Trp Ala Gly Phe Asn Val His Leu Ala Ala Asn Met Phe Leu Glu Ala

100 105 110

Ala Ser Leu Thr Thr Gln Ile Asn Gly Gln Leu Ile Pro Ser Asp Ile

115 120 125

Pro Gly Ser Met Ala Met Ala Val Arg Gln Pro Ala Gly Val Val Leu

130 135 140

Gly Ile Ala Pro Trp Asn Ala Pro Ile Ile Leu Ala Val Arg Ala Ile

145 150 155 160

Ala Thr Pro Leu Ala Cys Gly Asn Thr Val Ile Leu Lys Gly Ser Glu

165 170 175

Leu Cys Pro Ala Thr His Gly Leu Ile Ile Glu Ala Leu Gln Glu Gly

180 185 190

Gly Leu Pro Pro Gly Val Val Asn Phe Val Thr Asn Ala Pro Glu Asp

195 200 205

Ala Gly Thr Val Val Glu Ala Met Val Ala His Pro Ala Val Arg Arg

210 215 220

Val Asn Phe Thr Gly Ser Thr Arg Val Gly Arg Ile Ile Gly Gln Thr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Tyr Leu Lys Pro Val Ile Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ala

245 250 255

Pro Phe Leu Val Leu Asp Asp Ala Asp Ile Asp Ser Ala Val Ala Gly

260 265 270

Cys Thr Phe Gly Ala Phe Ala Asn Ser Gly Gln Ile Cys Met Ser Thr

275 280 285

Glu Arg Ile Ile Val Asp Glu Ala Val Ala Glu Glu Phe Ile Ala Lys

290 295 300

Leu Val Gly Arg Ala Thr Thr Leu Pro Leu Gly Asp Pro Arg Lys Gly

305 310 315 320

Pro Val Val Leu Gly Ser Val Val Asp Met Asn Thr Val Asn Arg Val

325 330 335

Asn Glu Leu Ile Asp Asp Ala Val Ala Lys Gly Ala Arg Ile Leu Cys

340 345 350

Gly Gly Lys Ala Asn Asp Thr Leu Met Ala Ala Thr Leu Ile Asp Gly

355 360 365

Val Thr Pro Glu Met Arg Ile Phe Arg Glu Glu Thr Phe Ala Pro Val

370 375 380

Lys Ala Ile Val Arg Val Arg Gly Glu Glu Gln Ala Ile Ala Met Ala

385 390 395 400

Asn Asp Asn Glu Phe Gly Leu Ser Ser Ala Val Tyr Thr Arg Asp Thr

405 410 415

Ala Arg Gly Trp Arg Val Ala Gly Arg Ile Glu Ala Gly Ile Cys His

420 425 430

Val Asn Gly Pro Thr Val His Asp Glu Ala Gln Met Pro Phe Gly Gly

435 440 445

Val Lys Asn Ser Gly Tyr Gly His Phe Gly Gly Gln Ala Gly Ile Asp

450 455 460

Ala Phe Thr Asp Thr Arg Trp Ile Thr Met Gln Thr Thr Ala Arg His

465 470 475 480

Tyr Pro Phe

<210> 5

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gln Asp His Leu Gln Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Trp Val Asn Pro

1 5 10 15

Val Ser Pro Arg Ser Leu Glu Val Ile Asn Pro Ser Asn Glu Gln Ala

20 25 30

Ile Ala Arg Ile Ser Met Gly Ser Ala Ala Asp Val Asp Lys Ala Val

35 40 45

Ala Ala Ala Arg Leu Ala Phe Glu Ser Tyr Ser Arg Thr Ser Arg Glu

50 55 60

Glu Arg Leu Ala Leu Leu Ala Lys Val Leu Glu Val Tyr Gln Ser Arg

65 70 75 80

Tyr Gly Asp Phe Val Gln Thr Ile Ser Gln Glu Met Gly Ala Pro Leu

85 90 95

Trp Leu Ser Lys Ala Ala Gln Ala Ala Met Gly Val Ala His Leu Ser

100 105 110

Ser Thr Ile Glu Val Leu Lys Asn Phe Ala Phe Glu His Val Gln Gly

115 120 125

Ser Thr Ala Val Val His Glu Pro Val Gly Val Val Gly Met Ile Thr

130 135 140

Pro Trp Asn Trp Pro Ile Asn Gln Ile Met Cys Lys Val Ala Pro Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Gly Cys Thr Met Val Leu Lys Pro Ser Glu Val Ala Pro

165 170 175

Leu Asn Ala Leu Leu Val Ala Glu Val Leu His Glu Ala Gly Val Pro

180 185 190

Ala Gly Val Phe Asn Leu Val Asn Gly Asp Gly Pro Gly Val Gly Glu

195 200 205

Ala Met Ser Ser His Pro Gly Ile Asp Met Met Thr Phe Thr Gly Ser

210 215 220

Thr Arg Ala Gly Ile Ala Val Ala Lys Ala Ala Ala Asp Ser Val Lys

225 230 235 240

Arg Val Ala Gln Glu Leu Gly Gly Lys Ser Ala Asn Ile Val Leu Asp

245 250 255

Asp Ala Asn Leu Gln Lys Ala Val Thr Gln Gly Val Gln Ala Val Leu

260 265 270

Met Asn Ser Gly Gln Ser Cys Asn Ala Pro Thr Arg Met Phe Val Pro

275 280 285

Arg Ala Leu His Gly Gln Ala Val Glu Ile Ala Arg Ser Val Ala Gly

290 295 300

Ala Ala Thr Val Ala Asp Ala Leu Ala Glu Gly Met His Met Gly Pro

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Val Val Ser Glu Ala Gln Trp Gly Lys Ile Gln Ala Leu Ile Arg Lys

325 330 335

Gly Ile Glu Glu Gly Ala Thr Leu Val Ala Gly Gly Thr Gly Arg Pro

340 345 350

Glu Gly Leu Val Gln Gly Tyr Phe Val Lys Pro Thr Val Phe Ala Asp

355 360 365

Val Ser Asn Asp Met Ser Ile Ala Arg Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val

370 375 380

Leu Val Met Ile Pro Tyr Asp Asp Glu Glu Asp Ala Ile Arg Met Ala

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Asn Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ser Gly Tyr Val Gln Ser Gly Ser Leu

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Glu Arg Ala Arg Ser Val Ala Ala Arg Leu Arg Thr Gly Met Val His

420 425 430

Leu Asn Gly Ala Gly Pro Asp Phe Asn Ala Pro Phe Gly Gly Tyr Lys

435 440 445

Gln Ser Gly Asn Gly Arg Glu Trp Gly Glu His Gly Phe Arg Asp Phe

450 455 460

Leu Glu Thr Lys Ala Val Met Gly Tyr Gly Ala Ala

465 470 475

<210> 6

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacccaga cgaattcgtc catcggcatt cgccagctgc tggacatgca aaaacaggcc 60

tttatcgaag aggctgcggt cagcgccgat gtgcgcatgc agcgcattca gcaagtcatc 120

gacatgctgg tggagcacaa ggaggaactt tgccaggcca tgggcgaaga ctttggtggc 180

cgccccgccg tgttctcgct ggccaatgac attcttggct cgctctcctc gctcaagcat 240

gcacgcgatc acctcaggga ctggctgggt gactccgaac gccccagcgt caaacccttt 300

gacatgtttg gcgccacggc ctgggtcaaa taccagccca agggcgtgat cggcatcatc 360

ggcacctgga atgcacctct gttcaccttg ctgtcgccgc tggcctgcgc gttcgcggcg 420

ggcaaccggg ccgtgctcaa gccctccgaa attgcgccgc gtacggccca ggtgctggcc 480

gaggccgtgg ccaggcgctt tgatccccag gtgctggccg tggtgcaggg aggccccgaa 540

gtggctgcgg cgtttgccga gcagccctgg aaccatatgg tcttcacggg ctccaccagc 600

gtgggcaagc tcatcatggc tgccgccgcc agaaacctgg tgcccgtgac gctggagctg 660

ggtggcaagt ctcccgtgct ggtgggcgat tccgccgaca tcgccaatgc ggccgagcgc 720

atcgccgtag gcaaatcgct caactccggc cagctttgcg tgtcacccga cgtggtctgg 780

gtccatgaat cccgcctgca ggcgctggcc gatggcattg cctcgcaata ccaggcgctg 840

tatccctcgg tgacaggcaa cgcagacatg acgcccgtga tcaacgagcg ccaccacgca 900

cgtgtgaaag cctatgtcga tgatgccaag gcgcgcggtc tgaccgtgct ggaggtcggc 960

gccgcgcaag ccggcgcaga ccgccgcctg ccgctggcgc tggtcgtcaa cccgccagcc 1020

gaagccgaaa tctctcggca cgagatcttt ggcccggccg tggtgctgcg cagcttcctg 1080

aacatccgcg atgccgtggc cgcgatcaat gccggtgagc gcccgctggc cctgtactac 1140

ttcggcagcg acgagacgga gcagaactgg gtgctggaca acacgctgtc cggcggtgtc 1200

tccatcaatg atgtggtcat gcatccggcg ctggaggatg cgccgtttgg cggcgtgggc 1260

gcttcgggca tgggccacta tcatggccgc gagggttttc tcgagttcag ccatgcccgc 1320

tccgtctaca aggccggcaa ccacgacccg cgtcgcgagt ggggcatgct gccgccctac 1380

aacccgcagt tcgaacagat gctgcaggcc gcagtcactc cctga 1425

<210> 7

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaactaca tggacttgca ccgcattttt gacttgcagt accaagccag ccgcacgcag 60

gtcgatgtac ctttgctggt gcgccgggag aggctgctgc gtctgcagaa gatgctggac 120

gagaacggcc cggctttgtg cgcggcggtg gagcaggact ttggcgtgcg ctccgagcgc 180

tggaccgaga tgctggatct gatgctggtg cgcaatatgc tcaggcacac gctcaagcat 240

ctgcccaagt ggagcaagcg tcagcgcgtg cgcacgccac tgatgctgca gccgggcaag 300

gcctgggtgg agcgccagcc tctgggcgtg gtgggcatca tctcgccctg gaactatccg 360

ttgcaactat cgctggcgcc ggccatcacg gctctggcgg cgggcaatcg cgtgatgctc 420

aagcccagcg agctgacgcc gcatacctcg gcaaaaatgg gcgagctggt cgcccagttc 480

tttgcacccg aagagttctg cgtgatcgag ggggacgtgg ccgtggccac gcagttctcg 540

ggtctgcaat tcgatcatct gctgttcacc ggctccacgg ccgtggggcg gcgtgtggcg 600

caggcggcag ccgtgcacct gacgcccacc acactggagc tcgggggcaa atcgccctgc 660

atcattgcgc aggactgcga tatgcaggcc gctgcgctca aggtggccta tggcaagctg 720

gtcaatgccg ggcagacctg catcgctccc gactatgtgc tgctgccgcg cggcaaggag 780

caggagtttg ccgaggccta tcaggcggcg gtgcagcagc tgtacccgcg catctcgggc 840

aacccggact acacggccat catcagcaag cgccatctgg cacgactcaa gcagatgctg 900

cgccaggcgc aaagcctggg agcgcaggtg cactggatgc atgaagcggc tgccccggct 960

gcggatggtg acaccacggc ctggggcgag gccgtggaga ggcagttcgc tccggcgctg 1020

gtgttcggtg ccaccggcga gatgcagctg atgcaggaag agatcttcgg ccccatcctg 1080

cctgtgatct cctacgagca tatcgaagac gtgatcaatg ccatcaacgc cagcccgcgc 1140

ccgctggcgc tgtactggtt tggcaacgac gaggccgagc gcaatgcggt gttgatgcgc 1200

accgtcagcg gaggcgtctg tgtgaacgac accttgctgc atgtggcgca tgagaacttg 1260

ccattcggcg gtgtcggcga cagcggctgg ggtgcctatc acgcagagca gggctttttg 1320

cgctttgtgc accagaaggc ggttttcgtg cagtcgcgct gggcggcgac ttccctgctg 1380

tacccgccgt tcggggaaaa attcgaccgg gtgatggact tcatgcgacg ctggctctga 1440

<210> 8

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgatcgaac aaaaaatgct gatagccggc caggaatgtg ccgccagcaa tggcgcagtt 60

tttgagcgca agaacccgct ggatggctcg gttgccacgc gtgcgcccgc cgccaccacc 120

gaagacgcca tccgcgcctg cgatgcagcg gcagcagcct tccccgcctg gtcgcaactg 180

gggccgaacg cccgccgcgc catgctgatg aaggcctcgc aggcgctgga agccaagggc 240

gaagcgattg ccgcagccat ggctgccgag accggcgcct cgggcatctg ggccggcttc 300

aacgtgcatc tggccgccag catgctgctg gaagcggctt cgctgaccac gcagatcaat 360

ggcgagatca ttccctccga cgtgcccggc agcctggcca tggccgtgcg ccagcccgcc 420

ggcgtggtgt tgggcatcgc gccctggaat gcccccgtga ttctggccgt gcgcagcatc 480

tccacggccc tggcctgcgg caataccgtg atcctcaagg gatcggaact ctgccccgcc 540

acccacggcc tgatcatcga agcgctgcag gacgcaggcc tgcccgccgg cgtggtgaac 600

tttgtgacca atgcgcccgc cgatgcgggc agcgtggtcg aggccatcgt ggcccatccg 660

gccgtgcgcc gcgtgagctt taccggctcc acacgtgtgg gccgcatcat cggccagacc 720

tgcgccaagc atctcaagcc cgcgctgctg gagctcggcg gcaaagctcc cttcctggtg 780

ctggacgatg ccgatatcga tgcggccgtg agcgccgcca cctttggcgc gtttgccaac 840

tcgggccaga tctgcatgtc caccgagcgc ttcgtggtgg ataacaaggt ggccgacgag 900

ttcatcgcca agtttgccgc caaggcccgc agcctgcctc tgggcgaccc gcgcaagggg 960

cccgtggtgc tgggctcggt ggtcgacctg gccacggtgg agcgctgcaa tgccatgatc 1020

gacgacgcgc tggccaaggg cggaaaactg gtctgcggcg gcaaggccga gagcaccctg 1080

atgcccgcca cactgatcga ccatgtgacg ccggcgatgc gcatcttcca cgaggagagc 1140

ttcggcccgg tcaagggcat cgtgcgcgtg aacggcgagg aagaagccat tgccacggcc 1200

aatgacaacg agttcggtct gtcctcggca gtcttcaccc gggacacggc ccgcggctgg 1260

cgtgtggcgg cgcgcatcga ggccggcatc tgccatatca acggccccac ggtgcatgac 1320

gaagcccaga tgccttttgg cggcgtcaag gcctcgggct atggccattt cggcggccag 1380

cagggcatca atgcctttac cgaaacccgc tgggtgacca tgcagaccgc agaacgccac 1440

tatccgttct aa 1452

<210> 9

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgattgaac aaagcatgct catcggcggt cagaccgcac aggccagcaa tggcgccact 60

ttcgagcgca gaaaccctct ggacggatcg gtcgccacgc gtgccccggc cgccacaaca 120

gccgacgccg tgcgtgccgt ggaagccgct caggcggcct tccctgcctg ggcggccctg 180

ggccccacag aacgcaggct gatgctgatg aaggcctcgc aggccctgga ggccaaggcc 240

gaagcctttg ccgcagccat ggcggcagaa accggcgcct ccggtatctg ggccggcttc 300

aatgtgcatc tggccgccaa tatgtttctc gaagccgcgt cgctgaccac ccagatcaac 360

ggccagctga ttccttcgga catccccggc agcatggcca tggccgtgcg ccagcccgcc 420

ggcgtggtgc tgggcatcgc cccctggaat gcccccatca tcttggccgt acgcgccatt 480

gccacgcccc tggcctgcgg caacaccgtg atcctcaagg gctcggagct gtgtcccgcc 540

acgcacggcc tgatcatcga agcgctgcag gaaggcggct tgccgcccgg cgtggtgaac 600

tttgtgacca atgcgcccga agacgccggc acagtggtcg aggccatggt ggcccacccc 660

gccgtacgcc gcgtgaactt cacgggctcc acgcgcgtgg gccgcatcat cggccagacc 720

tgcgccaaat acctcaagcc cgtcatcctg gagctgggcg gcaaggcccc gttcctggtc 780

ctggacgatg ccgacatcga ctccgcggtg gccggctgca cctttggcgc cttcgccaac 840

tcgggccaga tatgcatgtc caccgagcgc atcatcgtgg acgaggccgt ggccgaggaa 900

ttcatcgcca agctggtggg ccgcgccaca accctgcctc tgggcgaccc ccgcaaaggc 960

cctgtggtgc tgggctcagt cgtggacatg aacaccgtga accgcgtcaa cgagctcatc 1020

gacgatgccg tcgccaaggg tgccaggatt ctttgcggcg gcaaggccaa cgacaccttg 1080

atggcagcca cgctgataga cggcgtgact cccgagatgc gaatcttccg tgaagagacc 1140

tttgccccgg taaaagccat cgtacgcgtg cgtggcgaag agcaggccat cgccatggcc 1200

aacgacaacg agttcggcct gtcttccgcc gtctacacca gggacacagc gcgtggctgg 1260

cgcgtggctg gccgcatcga agcgggcatc tgtcatgtca acggccccac cgtgcacgac 1320

gaggcacaga tgcctttcgg cggcgtgaag aactcgggct acggccactt cggcggccag 1380

gccggtatcg atgccttcac cgacacccgc tggatcacca tgcagaccac cgcacgtcac 1440

taccccttct aa 1452

<210> 10

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgcaagacc atctgcagtt ctatatcgac ggccaatggg tgaatccggt cagcccgcgc 60

agcctggagg tcatcaatcc ctccaacgag caagccattg cccgcatcag catgggctcg 120

gccgccgacg tggacaaggc cgtggccgcc gcgcgtctcg ccttcgagag ctactcgcgc 180

accagccgcg aagagcgcct ggccctgctg gccaaggtgc tggaggtcta ccagagccgc 240

tacggcgact ttgtgcagac catctcgcag gagatggggg cgccgctgtg gctgtccaag 300

gcggcacagg ccgccatggg cgtggcccat ctgagctcca ccatcgaggt cctcaagaac 360

ttcgccttcg aacatgtgca gggcagcacg gccgtcgtgc atgagcccgt gggcgtggtc 420

ggaatgatca cgccctggaa ctggcccatc aaccagatca tgtgcaaggt cgccccggcc 480

ctggccgctg gctgcaccat ggtgctcaag ccctcggagg tcgccccgct caatgccctg 540

ctcgtggccg aggtgctgca cgaggcgggc gtgccggccg gcgtcttcaa cctcgtcaac 600

ggcgacggcc ccggtgtggg cgaggccatg tcctcccacc ccggcataga catgatgacc 660

ttcacgggct ccacgcgcgc gggcattgcc gtggccaagg ccgcggccga cagcgtcaag 720

cgtgtggccc aggaattggg cggcaagtct gccaacatcg tgctggatga cgccaacctg 780

caaaaggccg tgacccaggg cgtgcaggcg gtgctgatga attcgggcca gagctgcaac 840

gcacccacgc gcatgtttgt gccgcgcgcc ctgcatgggc aggccgtgga gatcgcccgt 900

agcgtcgccg gcgcagcgac cgtggccgat gcgctggccg agggcatgca catgggcccc 960

gtggtcagcg aggcgcaatg gggcaagatc caggccctga tccgcaaggg cattgaagag 1020

ggggcgaccc tggtggcggg cggaacaggc cgccccgaag ggctggtcca gggctacttt 1080

gtcaaaccca cggtgtttgc cgacgtgagc aatgacatga gcattgcgcg cgaggaaatc 1140

ttcggtcctg tgctggtgat gattccctac gatgacgagg aagacgccat ccgcatggcc 1200

aacgacacgg tgtacggcct ttcgggctat gtgcaatcgg gcagcctgga gcgtgcgcgc 1260

agcgtggccg cgcgcctgcg cacaggcatg gtccacctca acggcgcggg gcctgacttc 1320

aatgcgccgt tcggcggcta caagcagtca ggcaatggcc gtgaatgggg cgagcacggt 1380

ttccgcgatt tcctcgaaac caaggcagtc atgggctacg gcgcggcctg a 1431

Claims

1.一种醛脱氢酶，其特征在于，所述醛脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID.1、SEQ ID.2、SEQID.3、SEQ ID.4或SEQ ID.5所示。

2.一种醛脱氢酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID.6、SEQ ID.7、SEQID.8、SEQ ID.9或SEQ ID.10所示。

3.一种产醛脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌为将权利要求2所述醛脱氢酶编码基因导入宿主菌获得。

4.权利要求3所述产醛脱氢酶的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588基因组DNA为模板，通过设计特异性引物扩增权利要求2所述醛脱氢酶编码基因全长序列；

(3)将经测序验证的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到产醛脱氢酶的重组菌。

5.权利要求3所述的重组菌在催化生物基呋喃选择性氧化合成呋喃羧酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(2)按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养，当菌液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.05～1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于15～35℃、160rpm下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物基呋喃结构如下通式所示：

其中，R基团为H、CH₂OH、CH₂OCH₃、CH₃或COOH。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，控制步骤(3)反应体系的pH值为5～8。

9.根据权利要求6～9任意一项所述的应用，其特征在于，步骤(3)当反应器中生物基呋喃浓度几乎完全消耗时，向反应体系中补充生物基呋喃和等摩尔当量的弱碱继续进行反应，重复上述底物添加步骤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述弱碱为碳酸氢钠或碳酸钙。