CN114164129B - 一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备中的应用 - Google Patents

一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备中的应用，属于生物工程技术领域。本发明首先构建得到一种可异源表达黑芥子酶的重组菌株，并利用该重组菌株发酵生产黑芥子酶后，通过固定化酶催化萝卜硫苷生成萝卜硫素。采用本发明提供的重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα‑BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR在3L发酵罐中制备萝卜硫素时，产量达到0.91g/L，萝卜硫苷的摩尔转化率达到90％，本发明提供的这种生物法制备萝卜硫素的方法，具有反应条件温和、工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

Description

一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备 中的应用
技术领域
本发明涉及一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
萝卜硫素是十字花科植物中萝卜硫苷在黑芥子酶作用下产生的一种含硫化合物，属于一种抗氧化剂，是自然界存在的抗氧化、防癌、抗癌能力最强的异硫氰酸酯类化合物，可以降低乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌和结肠癌等癌症的发病率。近年来癌症的发生率有逐渐上升的趋势，癌症已严重影响人们的健康，萝卜硫素分别作为阻遏因子和抑制因子，在癌症预防和治疗中起作用。
目前报道的萝卜硫素的制备方法主要有植物提取法和化学合成法两种。
植物提取法主要是从十字花科植物尤其是西兰花中提取的手段获得萝卜硫素，主要从三个部位进行提取：(1)从西兰花种子提取，这是目前提取萝卜硫素的普遍做法，但提取过程中使用化学试剂较多，记载于公开号为CN108048498A的中国发明专利申请文件中，公开了仅利用水和甲醇提取，10g西兰花种子得到1.2g纯度为39.4％提取物。(2)从西兰花副产物茎叶中提取，减少了资源浪费，将西兰花茎叶制成粉后加入外源黑芥子酶混合，经过酶解、冻干、提取、抽滤后得到萝卜硫素提取液(记载于公开号为CN108912024A的中国发明专利申请文件中)。(3)从西兰花可食用部分提取，花枝脱水粉碎成粉后加入从芥籽粉中提取得到粗酶液，经酶解、提取、真空抽滤后得到萝卜硫素粗提取液(记载于公开号为CN103436565B的中国发明专利中)。植物提取法转化率低，且由于植物生长周期长，分离纯化工艺复杂，对生产条件的工艺要求非常高，产品纯度低且纯化过程中使用有机试剂会造成环境污染等原因限制了规模化生产。
而现有化学合成法操作复杂，(1)4-氨基-1-丁醇在酸性条件下反应后在三乙胺存在条件下与二硫化碳反应1h，再加入对甲苯磺酰氯处理0.5h，用m-CPBA氧化生成萝卜硫素，经过6步反应后总收率为64％(记载于公开号为CN102249968B的中国发明专利文本中)。(2)将二甲基亚砜和氢化钠在常温下反应完全后加入1，3-丙二醇和氢溴酸加热反应后溶液，反应完成后少量水洗涤并用二氯甲烷萃取，取有机层旋蒸后溶于有机试剂，加入氯化试剂进行氯化反应，在氮气保护下将产物溶于有机溶剂并加入硫氰化试剂，加热反应，结束后水洗涤，有机溶剂萃取旋蒸后得到萝卜硫素(记载于公开号为CN102993273 A的中国发明专利申请文件中)。化学合成步骤繁琐，耗资大，需使用大量有机试剂，副产物多，毒性大且原料成本高，合成萝卜硫素比天然萝卜硫素安全性低，功能减弱。
因此，寻找一种高效、低成本的萝卜硫素的制备方法，对工业生产来说，有很重要的意义。
发明内容
本发明首先构建得到一种可异源表达黑芥子酶的重组菌株，并利用该重组菌株发酵生产黑芥子酶后，通过固定化酶催化萝卜硫苷生成萝卜硫素，一方面，微生物的生长周期短，发酵产酶成本低，另一方面，固定化酶可实现酶的高效利用，减少催化过程的副反应，其用于进行萝卜硫素的生产可以避免植物本身存在的其他次生代谢途径的竞争问题，实现单一产物的快速、大量产生。
本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母表达了西兰花或甘蓝蚜虫来源的黑芥子酶。
在本发明的一种实施方式中，所述西兰花来源的黑芥子酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述甘蓝蚜虫来源的黑芥子酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述西兰花来源的黑芥子酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述甘蓝蚜虫来源的黑芥子酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以pPIC9K或pPICZα为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母GS115或毕赤酵母X33为表达宿主。
本发明还提供了上述重组毕赤酵母的制备方法，所述方法为：
(1)委托金唯智对西兰花来源黑芥子酶BoTGG1及甘蓝蚜虫来源黑芥子酶BMYR进行密码子优化，得到基因BoTGG1、BMYR；将PCR克隆得到的质粒pPIC9K或pPICZα与PCR克隆得到的黑芥子酶BoTGG1基因或黑芥子酶BMYR基因通过一步克隆连接获得重组载体pPIC9K-BoTGG1、pPIC9K-BMYR或pPICZα-BMYR。
(2)分别将重组载体pPIC9K-BoTGG1、pPIC9K-BMYR电击导入毕赤酵母P.pastorisGS115；将pPICZα-BMYR电击导入毕赤酵母P.pastoris X33，分别筛选阳性转化子得到重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR。
本发明还提供了一种固定化黑芥子酶的方法，所述方法为：将上述重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR诱导发酵得到黑芥子酶粗酶液，粗酶液与大孔树脂混合并制成固定化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将获得的酶液，用活化后的树脂中进行固定化得到固定化酶。所述树脂为氨基树脂或环氧树脂，树脂：酶液(质量/体积比)为(1:2)～(1.5:1)，固定化温度为20～30℃，固定转速为80～120rpm，固定时间为15～25h。
本发明还提供了一种制备萝卜硫素的方法，所述方法为，将上述重组毕赤酵母，或上述发酵制备得到黑芥子酶，或上述得到的固定化黑芥子酶，以萝卜硫苷为底物，制备得到萝卜硫素。
在本发明的一种实施方式中，将上述重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR诱导发酵得到黑芥子酶粗酶液，粗酶液与大孔树脂混合并制成固定化酶，固定化酶与萝卜硫苷反应生成萝卜硫素。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR通过甲醇诱导培养，离心得到粗酶液后通过树脂进行固定化，催化萝卜硫苷制备萝卜硫素。
在本发明的一种实施方式中，将重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR活化后，转接到30mL BMGY培养基中，以220rpm的转速在30℃培养24h后，转移至灭菌离心管中，5000r/min离心5min，并用灭菌水洗两遍。将得到的菌体重悬在30mL BMMY培养基中，以220rpm的转速在28℃培养4d，每隔24h添加一次甲醇进行诱导，每次添加至终浓度为1％(v/v)。诱导结束后8000r/min离心5min收集上清液，即为粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，获得粗酶液用活化后的树脂中进行固定化得到固定化酶，固定化酶催化萝卜硫苷生成萝卜硫素。所述树脂为氨基树脂或环氧树脂，树脂：酶液(质量/体积比)为1:2-1.5:1，固定化温度为20～30℃，固定转速为80～120rpm，固定时间为15～25h。所述萝卜硫苷由西兰花种子中提取，将0.05～0.15g固定化酶添加至500μL西兰花种子提取液中于37℃反应2～12h。
在本发明的一种实施方式中，西兰花种子提取液的制备方法为：称取1g西兰花种子经清洗并擦干后，于110℃烘箱中静置30min，研磨粉碎后用10mL PH＝5.5磷酸盐缓冲液提取萝卜硫苷，提取在80℃、150r/min水浴摇床中进行，时间为2h。提取结束后8000r/min离心2min并利用0.22μm滤头过滤得到西兰花种子提取液。
在本发明的一种实施方式中，底物萝卜硫苷的添加浓度至少为1.0g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基，包括BMGY培养基，其组分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、13.4g/L YNB、10g/L甘油、0.1M PH＝6.0的KH2P04/K2HP04缓冲液；BMMY培养基，其组分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、13.4g/L YNB、10g/L甲醇、0.1M PH＝6.0的KH2P04/K2HP04缓冲液。
有益效果
(1)本发明首先构建得到一种可异源表达黑芥子酶的重组菌株，并利用该重组菌株发酵生产黑芥子酶后，通过固定化酶催化萝卜硫苷生成萝卜硫素，一方面，微生物的生长周期短，发酵产酶成本低，另一方面，固定化酶可实现酶的高效利用，减少催化过程的副反应，其用于进行萝卜硫素的生产可以避免植物本身存在的其他次生代谢途径的竞争问题，实现单一产物的快速、大量产生。
(2)采用重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα-BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR，在摇瓶阶段制备萝卜硫素时，萝卜硫素的含量为：0.58g/L；
重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα-BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR，在3L发酵罐中制备萝卜硫素时，产量达到0.91g/L，萝卜硫苷的摩尔转化率达到90％。
(3)同时，本发明制备得到了一种固定化黑芥子酶，该固定化黑芥子酶的重复利用率高，使用10次后黑芥子酶酶活未见明显下降。
附图说明
图1：本发明产物萝卜硫素的LC-MS图。
图2：重组毕赤酵母进行表达得到粗酶液的电泳图，其中，1为P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1表达得到粗酶液，2为P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR表达得到粗酶液，3为P.pastoris X33/pPICZα-BMYR表达得到粗酶液。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
BMGY液体培养基：其组分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、13.4g/L YNB、10g/L甘油、0.1M PH＝6.0的KH2PO4/K2HPO4缓冲液。
BMMY液体培养基：其组分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、13.4g/L YNB、10g/L甲醇、0.1M PH＝6.0的KH2PO4/K2HPO4缓冲液。
YPD固体培养基：其组分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂粉。
BSM液体培养基：其组分包括85％H3PO4 26.7mL/L、CaSO4 2H2O 0.93g/L、K2SO418.2g/L、MgSO4 2H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40g/L、PTM1 4.0mL/L。
LB液体培养基：其组分包括10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L NaCl。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
黑芥子酶酶活的检测：以萝卜硫苷(10mg/mL)为底物，在pH 5.5，37℃的条件下反应30min，通过生物传感分析仪测定生成葡萄糖量，计算酶活。
酶活定义为每分钟催化生成1μmol葡萄糖所需要的酶量，定义为1个活力单位。
萝卜硫苷的含量的检测：
用高效液相色谱测定西兰花种子提取液中萝卜硫苷的含量：Waters，Agilent C18柱，流动相为10：90的甲醇：0.1％的甲酸，流速为1mL/min，检测波长为229nm。
萝卜硫苷的摩尔转化率的计算方法：
萝卜硫素的确认及含量的检测：
用高效液相色谱测定催化生成萝卜硫素的含量：Waters，Agilent C18柱，柱温30℃，流动相为20：80的乙腈，流速为1mL/min，检测波长为205nm。
用液相色谱-质谱联用确认催化生成产物为萝卜硫素：色谱条件：C18柱，柱温30℃，进样量1μL，流动相A:乙腈，B:水，流速0.3mL/min，梯度洗脱，运行时间8min。质谱条件：电子电离源正离子模式，扫描模式Full MS-dd-MS2，分辨率7 000，扫描范围m/z 100-300；雾化气N2，1.5mL/min；辅助气N2，8mL/min；喷雾电压3.4kV；毛细管温度320℃；辅助气加热温度350℃；二级质谱碰撞电压15/30/45V；分辨率17500。
下述实施例中所涉及的电击法的操作为：
(1)将感受态细胞与线性化后DNA混合，然后转移到冰预冷的电击杯中，轻敲电击杯确保细胞沉到杯底。
(2)操作进行电击。
(3)电击后立即向杯中加入1mL冰冷的山梨醇，并转移到一个1.5mL离心管中。
(4)将离心管置于28℃静止培养1～2h。
(5)取100μL细胞液均匀涂布于MD平板。
(6)将平板于28℃倒置培养3～10d至克隆出现。
(7)分别经含0.5g/L、2g/L、4g/L、6g/L浓度G418的YPD培养基上进行筛选。
实施例1：重组载体的制备
构建重组载体pPIC9K-BoTGG1、pPIC9K-BMYR或pPICZα-BMYR，具体步骤如下：
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码西兰花来源的黑芥子酶的基因BoTGG1，采用一步克隆的方法，得到重组质粒pPIC9K-BoTGG1。
(2)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码甘蓝蚜虫来源的黑芥子酶的基因BMYR。将通过PCR克隆得到的质粒pPIC9K或pPICZα和通过PCR克隆得到的基因BMYR利用一步克隆，分别获得重组质粒pPIC9K-BMYR或pPICZα-BMYR。
实施例2：重组毕赤酵母的制备
重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR的构建步骤如下：
(1)采用电击法，将步骤实施例1制备得到的重组质粒pPIC9K-BoTGG1转化至毕赤酵母GS115，制备得到重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1；
(2)采用电击法，将步骤实施例1制备得到的重组质粒pPIC9K-BMYR转化至毕赤酵母GS115，制备得到重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR；
(3)采用电击法，将步骤实施例1制备得到的重组质粒pPICZα-BMYR转化至毕赤酵母X33，制备得到重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα-BMYR。
实施例3：重组菌株摇瓶发酵生产萝卜硫素
具体步骤如下：
(1)分别将实施例2制备得到的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1、P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR划线于YPD固体培养基中，在30℃培养箱培养3d，得到单菌落；
(2)分别将上述单菌落接种至30mL BMGY液体培养基中，以220rpm的转速在30℃培养24h，制备得到发酵液；
(3)分别将制备得到的发酵液置于灭菌离心管中，在5000r/min离心5min，取沉淀并用灭菌水洗两遍后，得到菌体，分别将菌体重悬在30mL BMMY液体培养基中，以220rpm的转速，在28℃培养4d，每隔24h添加一次甲醇进行诱导，每次添加至终浓度为1％(v/v)。诱导结束后8000r/min离心5min收集上清液，即，分别制备得到粗酶液。
分别将上述粗酶液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示，结果显示：有目的蛋白黑芥子酶的表达，其分子质量接近63KDa。
分别检测上述粗酶液的酶活，结果如下：
采用重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BoTGG1制备得到的含有西兰花来源的BoTGG1粗酶液的酶活为：0.039U/mL(BoTGG1粗酶液)。
采用重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR粗酶液的酶活为：0.074U/mL(BMYR粗酶液1)。
采用重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZ-oporiSP-BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR粗酶液的酶活为：0.083U/mL(BMYR粗酶液2)。
(4)分别取255μL的上述粗酶液与45μL的浓度为10mg/L萝卜硫苷混合后，在37℃反应30min，用HPLC检测转化液中的产物萝卜硫素(Waters,Agilent C18柱，流动相为20：80的乙腈，流速为1mL/min，检测波长为205nm)，检测结果如下所示：
采用BoTGG1粗酶液反应时，萝卜硫素的含量为0.05g/L。
采用BMYR粗酶液1反应时，萝卜硫素的含量为：0.32g/L。
采用BMYR粗酶液2反应时，萝卜硫素的含量为：0.58g/L。
实施例4：重组菌株3L发酵罐高密度发酵生产萝卜硫素
具体步骤如下：
(1)分别将实施例2制备得到的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR或P.pastoris X33/pPICZα-BMYR添加至YPD固体培养基中，在30℃培养箱培养3d，得到单菌落，接种至100mL YPD培养基中，以220rpm的转速在30℃培养24h，分别制备得到种子液；
(2)分别将上述种子液按照5％(v/v)的添加量添加至已灭菌含有900mL BSM液体培养基的3L发酵罐中；培养20h后溶氧反弹，补加甘油至菌株OD600为100～120，停止流加甘油，饥饿培养1h后根据溶氧状况流加甲醇进行诱导。诱导120h后8000r/min离心5min收集上清液，即为粗酶液。
分别检测上述粗酶液的酶活，结果如下：
采用重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR粗酶液的酶活为：0.32U/mL(BMYR粗酶液1)。
重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα-BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR粗酶液的酶活为：0.64U/mL(BMYR粗酶液2)。
(3)制备西兰花种子提取液
称取1g西兰花种子经清洗并擦干后，于110℃烘箱中静置30min，研磨粉碎后用10mL PH＝5.5磷酸盐缓冲液提取萝卜硫苷，提取在80℃、150r/min水浴摇床中进行，时间为2h。提取结束后8000r/min离心2min并利用0.22μm滤头过滤得到西兰花种子提取液，检测制备得到的西兰花种子提取液中的底物萝卜硫苷含量，其中，底物萝卜硫苷含量在3.1g/L。
(4)分别取上述粗酶液40μL与160μL的西兰花种子提取液混合，底物萝卜硫苷含量在2.5g/L，37℃反应30min，用HPLC检测转化液中的产物萝卜硫素(Waters,Agilent C18柱，流动相为20：80的乙腈，流速为1mL/min，检测波长为205nm)，结果(如图1所示)如下：
采用BMYR粗酶液1反应时，萝卜硫素的含量为：0.40g/L，底物萝卜硫苷的摩尔转化率达到39.5％。
采用BMYR粗酶液2反应时，萝卜硫素的含量为：0.91g/L，底物萝卜硫苷的摩尔转化率达到90％。
实施例5：重组菌株摇瓶发酵生产萝卜硫素
(1)制备粗酶液
采用重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα-BMYR按照实施例3的方法，制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR粗酶液(BMYR粗酶液2)。
(2)固定化酶的制备
使用环氧树脂LXTE-600作为载体，按照载体/磷酸盐缓冲液1：1(质量/体积比)的比例反复清洗3次平衡。将平衡后环氧载体：酶液(质量/体积比)为1：1在25℃条件下以转速100rpm搅拌固定20h。
(3)采用考马斯亮蓝溶液测定固定后酶液蛋白浓度，粗酶液固定化前蛋白浓度为0.34g/L，固定化后溶液中蛋白浓度为0.04g/L，酶液中90％的蛋白被固定在载体上。
(4)萝卜硫素的制备
称取0.05g上述固定后的载体，加入500μL西兰花种子提取液(制备方法同实施例4的步骤3)，于37℃反应12h，间隔3h取样一次，测定葡萄糖浓度以计算萝卜硫苷转化率，反应9h后，葡萄糖浓度达1.11g/L，此时提取液中萝卜硫苷完全转化，且12h时葡萄糖含量不再增加。
(5)固定化酶的重复利用
将上述固定化酶载体用去离子水反复清洗后，再次加入500μL实施例4制备得到的西兰花种子提取液，37℃反应9h后，测定葡萄糖浓度以计算萝卜硫苷转化率，重复10次后依旧能在9h时使萝卜硫苷转化率达90％以上。结果如表1所示：
表1：固定化酶在不同反应次数条件下的葡萄糖生成量及萝卜硫苷转化率
重复次数 葡萄糖生成量(g/L) 萝卜硫苷转化率％
1 0.97 98.58％
2 0.8 81.30％
3 0.95 96.54％
4 1.00 101.63％
5 0.93 94.51％
6 0.89 90.45％
7 0.91 92.48％
8 0.93 95.51％
9 0.94 95.53％
10 0.89 90.45％
对比例1：不同表达载体对重组菌株黑芥子酶酶活的影响
具体步骤如下：
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码西兰花来源的黑芥子酶的基因BoTGG1，将BoTGG1基因经一步克隆连接到质粒pPIC3.5K上，获得重组质粒pPIC3.5K-BoTGG1。
(2)将步骤(1)制备得到的重组质粒pPIC3.5K-BoTGG1用电击法转入毕赤酵母GS115中，得到重组菌P.pastoris GS115/pPIC3.5K-BoTGG1。
(3)将步骤(2)制备得到的重组菌按照实施例3中的条件进行培养和催化，区别在于，诱导结束后8000r/min离心5min收集菌体，与在1M/L的山梨醇溶液中溶解的蜗牛酶混合后在37℃静置反应2h以破碎菌体，取细胞破碎液，即为粗酶液；结果显示，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC3.5K-BoTGG1诱导产生黑芥子酶的酶活为0.004U/mL。
(4)将上述黑芥子酶按照实施例3的方法制备萝卜硫素，但是，催化后几乎无萝卜硫素生成，效率远低于GS115-pPIC9K-BoTGG1，并且GS115-pPIC3.5K-BoTGG1为胞内表达酶，酵母细胞破碎困难增大实验难度。
对比例2：不同表达系统对重组菌株黑芥子酶酶活的影响
具体步骤如下：
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码西兰花来源的黑芥子酶的基因BoTGG1一步克隆连接到质粒PET-28a、PETDuet-1或PACYCDuet-1上，分别获得重组质粒PET-28a-BoTGG1、PETDuet-1-BoTGG1、PACYCDuet-1-BoTGG1；
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码甘蓝蚜虫来源的黑芥子酶的基因BMYR一步克隆连接到质粒PET-28a，获得重组质粒PET-28a-BMYR。
(2)分别将上述重组质粒用热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)，分别制备得到重组菌E.coli.BL21(DE3)/PET-28a-BoTGG1、E.coli.BL21(DE3)/PETDuet-1-BoTGG1、E.coli.BL21(DE3)/PACYCDuet-1-BoTGG1、E.coli.BL21(DE3)/PET-28a-BMYR。
(3)分别将步骤(2)制备得到的重组菌活化后转接到添加相应抗性的LB培养基中，以220rpm的转速在37℃培养12h，制备得到种子液，将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量接种到新鲜的添加相应抗性的LB液体培养基中，于37℃培养到OD600为0.6-0.8时，添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG于20℃进行诱导表达，诱导10h后离心收集菌体，并超声破碎(工作5s，间歇5s，共计10min)，10000rpm；离心10min，分别得到粗酶液。
(4)分别将上述粗酶液255μL与45μL的浓度为10mg/L萝卜硫苷混合后，在37℃反应30min进行催化反应。结果仅E.coli.BL21(DE3)/PET-28a-BMYR所表达黑芥子酶检测到0.01g/L产物生成，其余未检测到萝卜硫素生成。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
无锡新和源发酵技术研究院有限公司
<120> 一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备中的应用
<130> BAA211379A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Leu Leu His Gly Leu Ala Leu Val Phe Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ser Cys Lys Ala Asp Glu Glu Ile Thr Cys Glu Glu Asn Asn Pro Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Asn Thr Asp Ile Leu Ser Ser Lys Asn Phe Gly Lys Asp
35 40 45
Phe Ile Phe Gly Val Ala Ser Ser Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Gly Arg
50 55 60
Gly Arg Gly Val Asn Val Trp Asp Gly Phe Ser His Arg Tyr Pro Glu
65 70 75 80
Lys Ser Gly Ser Asp Leu Lys Asn Gly Asp Thr Thr Cys Glu Ser Tyr
85 90 95
Thr Arg Trp Gln Lys Asp Val Asp Val Met Gly Glu Leu Asn Ala Thr
100 105 110
Gly Tyr Arg Phe Ser Phe Ala Trp Ser Arg Ile Ile Pro Lys Gly Lys
115 120 125
Val Ser Arg Gly Val Asn Gln Gly Gly Leu Asp Tyr Tyr His Lys Leu
130 135 140
Ile Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asn Ile Thr Pro Phe Val Thr Leu Phe
145 150 155 160
His Trp Asp Leu Pro Gln Thr Leu Gln Asp Glu Tyr Glu Gly Phe Leu
165 170 175
Asp Arg Gln Ile Ile Gln Asp Phe Lys Asp Tyr Ala Asp Leu Cys Phe
180 185 190
Lys Glu Phe Gly Gly Lys Val Lys His Trp Ile Thr Ile Asn Gln Leu
195 200 205
Tyr Thr Val Pro Thr Arg Gly Tyr Ala Ile Gly Thr Asp Ala Pro Gly
210 215 220
Arg Cys Ser Pro Met Val Asp Thr Lys His Arg Cys Tyr Gly Gly Asn
225 230 235 240
Ser Ser Thr Glu Pro Tyr Ile Val Ala His Asn Gln Leu Leu Ala His
245 250 255
Ala Ala Val Val Asp Leu Tyr Arg Thr Lys Tyr Lys Phe Gln Lys Gly
260 265 270
Lys Ile Gly Pro Val Met Ile Thr Arg Trp Phe Leu Pro Phe Asp Glu
275 280 285
Ser Asp Pro Ala Ser Ile Glu Ala Ala Glu Arg Met Asn Gln Phe Phe
290 295 300
His Gly Trp Tyr Met Glu Pro Leu Thr Lys Gly Arg Tyr Pro Asp Ile
305 310 315 320
Met Arg Gln Ile Val Gly Ser Arg Leu Pro Asn Phe Thr Glu Glu Glu
325 330 335
Ala Glu Leu Val Ala Gly Ser Tyr Asp Phe Leu Gly Leu Asn Tyr Tyr
340 345 350
Val Thr Gln Tyr Ala Gln Pro Lys Pro Asn Pro Tyr Pro Ser Glu Thr
355 360 365
His Thr Ala Met Met Asp Ala Gly Val Lys Leu Thr Tyr Asp Asn Ser
370 375 380
Arg Gly Glu Phe Leu Gly Pro Leu Phe Val Glu Asp Lys Val Asn Gly
385 390 395 400
Asn Ser Tyr Tyr Tyr Pro Lys Gly Ile Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Phe
405 410 415
Lys Thr Lys Tyr Gly Asp Pro Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly Phe
420 425 430
Ser Thr Pro Ser Ser Glu Asn Arg Glu Gln Ala Ile Ala Asp Tyr Lys
435 440 445
Arg Ile Asp Tyr Leu Cys Ser His Leu Cys Phe Leu Arg Lys Val Ile
450 455 460
Lys Glu Lys Gly Val Asn Val Arg Gly Tyr Phe Ala Trp Ala Leu Gly
465 470 475 480
Asp Asn Tyr Glu Phe Cys Lys Gly Phe Thr Val Arg Phe Gly Leu Ser
485 490 495
Tyr Val Asn Trp Glu Asp Leu Asp Asp Arg Asn Leu Lys Glu Ser Gly
500 505 510
Lys Trp Tyr Gln Arg Phe Ile Asn Gly Thr Val Lys Asn Ser Ala Lys
515 520 525
Gln Asp Phe Leu Arg Ser Ser Leu Ser Ser Gln Ser Gln Lys Lys Arg
530 535 540
Leu Ala Asp Ala
545
<210> 2
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asp Tyr Lys Phe Pro Lys Asp Phe Met Phe Gly Thr Ser Thr Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Gly Trp Asn Glu Asp Gly Lys Gly Glu Asn
20 25 30
Ile Trp Asp Arg Leu Val His Thr Ser Pro Glu Val Ile Lys Asp Gly
35 40 45
Thr Asn Gly Asp Ile Ala Cys Asp Ser Tyr His Lys Tyr Lys Glu Asp
50 55 60
Val Ala Ile Ile Lys Asp Leu Asn Leu Lys Phe Tyr Arg Phe Ser Ile
65 70 75 80
Ser Trp Ala Arg Ile Ala Pro Ser Gly Val Met Asn Ser Leu Glu Pro
85 90 95
Lys Gly Ile Ala Tyr Tyr Asn Asn Leu Ile Asn Glu Leu Ile Lys Asn
100 105 110
Asp Ile Ile Pro Leu Val Thr Met Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Leu Gly Gly Trp Val Asn Pro Ile Met Ser Asp Tyr Phe
130 135 140
Lys Glu Tyr Ala Arg Val Leu Phe Thr Tyr Phe Gly Asp Arg Val Lys
145 150 155 160
Trp Trp Ile Thr Phe Asn Glu Pro Ile Ala Val Cys Lys Gly Tyr Ser
165 170 175
Ile Lys Ala Tyr Ala Pro Asn Leu Asn Leu Lys Thr Thr Gly His Tyr
180 185 190
Leu Ala Gly His Thr Gln Leu Ile Ala His Gly Lys Ala Tyr Arg Leu
195 200 205
Tyr Glu Glu Met Phe Lys Pro Thr Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ser
210 215 220
Ile Ser Gly Val Phe Phe Met Pro Lys Asn Ala Glu Ser Asp Asp Asp
225 230 235 240
Ile Glu Thr Ala Glu Arg Ala Asn Gln Phe Glu Arg Gly Trp Phe Gly
245 250 255
His Pro Val Tyr Lys Gly Asp Tyr Pro Pro Ile Met Lys Lys Trp Val
260 265 270
Asp Gln Lys Ser Lys Glu Glu Gly Leu Pro Trp Ser Lys Leu Pro Lys
275 280 285
Phe Thr Lys Asp Glu Ile Lys Leu Leu Lys Gly Thr Ala Asp Phe Tyr
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Ala Trp Leu Lys Pro Asn Glu Thr Pro Tyr Ile Ile Pro Val Pro Glu
340 345 350
Gly Leu Arg Lys Leu Leu Ile Trp Leu Lys Asn Glu Tyr Gly Asn Pro
355 360 365
Gln Leu Leu Ile Thr Glu Asn Gly Tyr Gly Asp Asp Gly Gln Leu Asp
370 375 380
Asp Phe Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Lys Asn Tyr Leu Asn Ala Thr Leu
385 390 395 400
Gln Ala Met Tyr Glu Asp Lys Cys Asn Val Ile Gly Tyr Thr Val Trp
405 410 415
Ser Leu Leu Asp Asn Phe Glu Trp Phe Tyr Gly Tyr Ser Ile His Phe
420 425 430
Gly Leu Val Lys Ile Asp Phe Asn Asp Pro Gln Arg Thr Arg Thr Lys
435 440 445
Arg Glu Ser Tyr Thr Tyr Phe Lys Asn Val Val Ser Thr Gly Lys Pro
450 455 460
<210> 3
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaactgc tgcatggtct ggccctggtt tttctgctgg ccgccgcctc ttgtaaagcc 60
gatgaagaaa ttacctgtga agaaaataat ccgtttacct gttctaatac cgatattctg 120
tcttctaaaa attttggtaa agattttatt tttggtgttg cctcttctgc ctatcagatt 180
gaaggtggtc gtggtcgcgg tgtaaatgtt tgggatggtt tttctcatcg ctatcccgaa 240
aagtctggtt ctgatctgaa aaatggtgat accacctgtg aatcttatac ccgttggcag 300
aaagatgttg atgttatggg tgaactgaat gccaccggtt atcgtttttc ttttgcctgg 360
tctcgtatta ttccgaaagg taaagtttca cgtggtgtta atcaaggtgg tctggattat 420
tatcataaac tgattgatgc cctgctggag aaaaatatta ccccgtttgt taccctgttt 480
cattgggatc tgccgcagac cctgcaagat gaatatgaag gttttctgga tcgtcagatt 540
attcaagatt ttaaagatta tgccgatctg tgttttaaag aatttggtgg taaagttaaa 600
cattggatta ccattaatca gctgtatacc gttccgaccc gtggttatgc cattggtacc 660
gatgccccgg gtcgttgttc tccgatggtt gataccaaac atcgttgtta tggtggtaat 720
tcttctaccg aaccgtatat tgttgcccat aatcagctgc tggcccatgc cgccgttgtt 780
gatctgtatc gtaccaaata taaatttcag aaaggtaaaa ttggtccggt tatgattacc 840
cgttggtttc tgccgtttga tgaatctgat ccggcctcta ttgaagccgc cgaacgtatg 900
aatcagtttt ttcatggttg gtatatggaa ccgctgacca aaggtagata tccggatatt 960
atgcgtcaga ttgttggttc tcgtctgccg aattttaccg aagaagaagc cgaactggtt 1020
gccggttctt atgattttct gggtctgaat tattatgtta ctcagtatgc tcagccgaaa 1080
ccgaatccgt atccgtctga aacccatacc gccatgatgg atgccggtgt taaactgacc 1140
tatgataatt ctcgtggtga atttctgggt ccactttttg ttgaagacaa agtaaacggt 1200
aattcttatt attatccgaa gggtatttac tacgttatgg attattttaa aaccaaatat 1260
ggtgatccgc tgatttatgt taccgaaaat ggtttttcta ccccgtcttc tgaaaatcgt 1320
gaacaagcca ttgccgacta taaacgtatt gattatctgt gttctcatct gtgttttctg 1380
cgtaaagtta ttaaagaaaa aggtgttaat gttcgtggtt attttgcctg ggccctgggt 1440
gataattatg aattttgtaa aggttttacc gttcgttttg gtctgtctta tgttaattgg 1500
gaagatctgg atgatcgtaa tctgaaagaa tctggtaaat ggtatcagcg ttttattaat 1560
ggtaccgtta aaaattctgc caaacaagat tttctgcgtt cttctctgtc ttctcagtct 1620
cagaaaaaac gtctggccga tgcctaa 1647
<210> 4
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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tattataaca acctgattaa cgaactgatt aaaaacgata ttattccgct ggtgaccatg 360
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gcgcatggca aagcgtatcg cctgtatgaa gaaatgttta aaccgacgca gaacggcaaa 660
attagcatta gcattagcgg cgtgtttttt atgccgaaaa acgcggaaag cgatgatgat 720
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gcggattttt atgcgctgaa ccattatagc agccgcctgg tgacctttgg cagcgatccg 960
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gatccgcagc gcacccgcac caaacgcgaa agctatacct attttaaaaa cgtggtgagc 1380
accggcaaac cgtaa 1395

Claims (7)

1.一种制备萝卜硫素的方法，其特征在于，以重组毕赤酵母为生产菌株，或以所述重组毕赤酵母表达得到的黑芥子酶为催化剂，以萝卜硫苷为底物，制备得到萝卜硫素；
所述重组毕赤酵母以毕赤酵母GS115或毕赤酵母X33为表达宿主；以pPIC9K或pPICZα为表达载体，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的黑芥子酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述黑芥子酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述黑芥子酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，采用氨基树脂或环氧树脂对黑芥子酶进行固定，制备固定化黑芥子酶，将制备得到的固定化黑芥子酶加入到底物萝卜硫苷中，制备得到萝卜硫素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固定化黑芥子酶的制备方法为，将氨基树脂或环氧树脂与酶液按照质量/体积比为（1:2）~（1.5:1）进行固定，固定化温度为20~30℃，固定转速为80~120 rpm，固定时间为15~25 h。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，底物萝卜硫苷的添加浓度至少为1.0 g/L。
7.权利要求1~6任一所述的方法在制备含有萝卜硫素的产品中的应用。
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芥蓝黑芥子酶基因的克隆与原核表达;谢丽雪;黄科;李宾;黄志伟;郑金贵;;福建农林大学学报(自然科学版)(第05期);全文 *

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