CN107858340A - 高催化活性的d‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用 - Google Patents

高催化活性的d‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供酶活性显著提高的新的FSAA突变体及其核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和基因工程菌，通过这些FSAA突变体或含有相应突变体蛋白的基因工程菌不对称催化噻吩‑2‑甲醛、噻吩‑3‑甲醛、苯并噻吩‑2‑甲醛、糠醛、吡啶‑2‑甲醛中的一种和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应可制备高光学纯度的手性产物，催化活性高，产物光学纯度高。

Description

高催化活性的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体、重组表达载体、 基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及D-果糖-6-磷酸醛缩酶A的分子改造，获得突变体、重组表达载体，基因工程菌以及不对称催化噻吩-2-甲醛及类似物和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。
背景技术
不对称直接羟醛缩合反应是一类非常重要的C-C加成反应。其产物为天然多羟基化合物或全新的多羟基小分子。由于羟基能够轻易被转换为多种其他功能基团，这些多羟基小分子成为最重要的手性砌块之一，尤其是在医药领域具有重要的应用价值。例如，噻吩-2-甲醛(1a)的衍生物Duloxetin用于抑郁症的治疗，以及苯并噻吩-2-甲醛(1c)的衍生物苯并噻吩多羟基醇可与天然核苷酸间形成氢键而结合，从而具备作为分子诊断探针的潜力。相应的醛受体(1)与羟基丙酮(HA,2)通过羟醛缩合生成的1,2-二醇(3)可作为上述医药化合物的重要手性前体。当前3的合成路径主要依赖于化学催化的噻吩-2-甲醛及类似物(1)和HA的羟醛缩合反应。涉及到的催化剂为L-脯氨酸衍生物或α-氨基酸胺类衍生手性离子液体(α-amino acid amides-derived chiral ionic liquid)，转化率相对较高，但是前者立体选择性不足，后者催化剂价格昂贵、合成复杂。由于该反应生成了两个新的功能性手性中心，对该反应手性化学的绝对控制显得尤为重要，同时需要考虑反应的方便性和经济性。因此，噻吩-2-甲醛及类似物(1)和HA缩合的高立体选择性及廉价易得的催化剂是化学催化该反应的主要障碍。从另一方面而言，生物催化因具有催化效率高、选择性好、副产物少、反应条件温和同时廉价易制备等优点而成为绿色化学合成的优选途径。这其中，醛缩酶作为一类能够天然催化羟醛缩合反应的催化剂，具有很高的催化效率和立体选择性，且来源广、易于制备和操作，因此可作为首选催化剂。
在具有催化不对称直接羟醛缩合反应能力的醛缩酶中，D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)能够以非磷酸化的羟基丙酮(HA)、二羟基丙酮(DHA)和羟基丁酮(HB)作为底物，而非相对昂贵且制备较为繁琐的磷酸二羟基丙酮(DHAP)，后者是DHAP依赖型醛缩酶的催化底物。此外，FSAA催化产物具有很高的光学纯度，因此该酶一经报道便获得了广泛的关注。
发明人所在课题组前期以野生型FSAA(WT)催化噻吩-2-甲醛及类似物(1)和HA的羟醛缩合反应，发现催化效率低下，WT的活力远不能满足工业化生产要求，因此，有必要通过理性设计的手段提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。
发明内容
本发明的目的是首次以酶分子作为生物催化剂的噻吩-2-甲醛及其类似物与HA间的羟醛缩合反应，此外为这些反应提供强有力的生物催化剂，即酶活提高的FSAA的突变体及其重组大肠杆菌。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种催化活性显著提高的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)的突变体。这些突变体是在SEQ ID No:2所示醛缩酶FSAA氨基酸序列基础上进行构建，该醛缩酶核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
具体的，所述突变体选自a或b：
a.在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下单个位点突变:31位异亮氨酸、163位亮氨酸及195位异亮氨酸；
b.在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下两个或两个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。
所述突变体是分别在FSAA的Ile31、Gln59、Leu163和Ile195四个位点上进行取代，且上述三个优选位点(Ile31、Gln59和Ile195)同时进行取代时具有更优的催化活性。
优选地，所述FSAA的突变体分别为：将31位异亮氨酸突变为苏氨酸(Ile31Thr，即I31T)，其是由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成；将59位谷氨酰胺突变为苏氨酸(Gln59Thr，即Q59T)，其是由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成；将163位亮氨酸突变为缬氨酸(Leu163Val，即L163V)，其是由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成；将195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺(Ile195Gln，即I195Q)，其是由SEQ ID No.10所示的氨基酸序列组成；上述四个优选单点突变体的三个双点组合突变，分别为：I31T/Q59T，其是由SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成；Q59T/L163V，其是由SEQ ID No.14所示的氨基酸序列组成；Q59T/I195Q，其是由SEQ ID No.16所示的氨基酸序列组成；上述四个优选单点突变体的二个三点组合突变，分别为I31T/Q59T/L163V,其是由SEQ ID No.18所示的氨基酸序列组成；I31T/Q59T/I195Q，其是由SEQ ID No.20所示的氨基酸序列组成。
任何对上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有醛缩酶活性的，仍属于本发明的保护范围。
本发明的第二方面提供上述FSAA突变体的核苷酸序列。突变体I31T核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；突变体Q59T核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示；突变体L163V核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.8所示；突变体I195Q核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示；突变体I31T/Q59T核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.11所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；突变体Q59T/L163V核苷酸序列如序列表中SEQID No.13所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示；突变体Q59T/I195Q核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.15所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；突变体I31T/Q59T/L163V核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.17所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示；突变体I31T/Q59T/I195Q核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.19所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示。
如本领域技术人员所知，本发明的FSAA突变体的核苷酸序列也可以是编码序列表中所示氨基酸组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。
任何对所示突变体核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明的第三方面提供一种包含本发明的FSAA突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的FSAA突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。
本发明的第四方面提供一种表达重组FSAA突变体的基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的FSAA突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
本发明的第五方面提供一种重组FSAA突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组FSAA突变体蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的FSAA突变体蛋白的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生FSAA突变体蛋白即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素和氯霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和终浓度为1mg/mL的L-阿拉伯糖的诱导下，即可高效表达本发明的重组FSAA突变体蛋白。
本发明的第六方面提供所述FSAA突变体或其重组细胞在不对称催化噻吩-2-甲醛(1a)/噻吩-3-甲醛(1b)/苯并噻吩-2-甲醛(1c)/糠醛(1d)/吡啶-2-甲醛(1e)和HA的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。
具体的，所述的应用为：以噻吩-2-甲醛(1a)/噻吩-3-甲醛(1b)/苯并噻吩-2-甲醛(1c)/糠醛(1d)/吡啶-2-甲醛(1e)和HA为底物，所述FSAA突变体或其重组细胞为催化剂，30℃下，于pH 6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。
Scheme 1:FSAA突变体或其重组细胞不对称催化羟醛缩合反应
所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。
进一步，所述转化体系中醛底物初始浓度为10～500mmol/L，羟基丙酮初始浓度为50～2500mmol/L。
进一步，所述转化体系中FSAA突变体纯酶在反应液中较佳的浓度为0.3～0.6mg/mL。所述转化体系中菌体的质量用量以菌体湿重计为80g/L。
进一步，所述反应在pH 6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行。
进一步，反应体系还可添加1％的二硫苏糖醇(DTT)。
进一步，反应体系中的助溶剂可为DMSO或DMF。
进一步，反应体系中DMSO或DMF的浓度为10～20％。
进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，纯酶催化体系中加入3倍体积的甲醇冰浴3h后离心/全细胞催化体系直接离心，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，有机层即为含相应产物的粗品，将粗品提纯即获得相应产物。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、硅胶柱分离和薄层层析等。
本发明的有益效果主要体现在：提供了催化活性显著提高的FSAA突变体及其核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，通过这些FSAA突变体或含有相应突变体蛋白的重组细胞不对称催化噻吩-2-甲醛(1a)/噻吩-3-甲醛(1b)/苯并噻吩-2-甲醛(1c)/糠醛(1d)/吡啶-2-甲醛(1e)和HA的羟醛缩合反应可制备高光学纯度的手性产物3a-3e，后者可作为有价值的手性砌块，在医药领域具有重要的潜在应用价值。
本发明中所述FSAA突变体或含有突变体蛋白的重组细胞具有高催化活性，能够合成高光学纯度产物(ee>99％，dr>93：7)。而且相比于之前本课题组申请的其中一个位点的突变来说，组合突变其催化活性更强。
催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，且其重组细胞能够在较高底物浓度下高效催化不对称直接羟醛缩合反应，具有很好的工业化应用开发前景。
附图说明
图1为FSAA及其突变体分离纯化后SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：突变体的构建
以含有突变点的寡核苷酸片段为引物(表1)，采用QuickChangeTM方法(Stratagene,La Jolla,CA)扩增含有FSAA基因的pET-30a重组质粒。
表1突变体构建引物
a下划线标示为突变位点
PCR反应体系：5×PrimerSTAR buffer(Mg2+plus)，5μL；dNTPs(各2.5mM)，2.0μL；上游引物(10μM)，1.0μL；下游引物(10μM)，1.0μL；重组质粒模板，15ng；PrimerSTARpolymeraseTM HS(2.5U/μL)，0.5μL；加ddH2O至总体积为25μL。
PCR程序：(1)98℃，1min；(2)98°，C，10s；(3)55℃，10s；(4)72℃，7min。步骤(2)-(4)循环20次后冷却至4℃。
PCR产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnI进行消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0μL 10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnI，37℃保温1h。
将上述经酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有FSAA突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中,利用质粒提取试剂盒抽提相应的质粒，转化至含有分子伴侣pGro7质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中用于辅助突变体蛋白正确折叠，最终获得突变体I31T、Q59T、L163V、I195Q、I31T/Q59T、Q59T/L163V、Q59T/I195Q、I31T/Q59T/L163V和I31T/Q59T/I195Q。核苷酸序列测序结果和相应编码蛋白质氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No.3-SEQ ID No.20所示。
实施例2：FSAA突变体的诱导表达
实施例1构建的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素和20μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以2％接种量(v/v)转接至含50μg/mL卡那霉素和20μg/mL的100mLLB培养基中，37℃，220rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG和1mg/mL的L-阿拉伯糖，26℃诱导培养7h后，4℃、4000rpm离心10min收集菌体，于-80℃贮存备用。
实施例3：FSAA突变体的分离纯化
实施例2收集的菌体细胞悬浮于20mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(100mM，pH 8.0)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(有效时间8min)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的后续的分离纯化。纯化柱为HisTrap(GE Healthcare)亲和层析柱，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH7.4)平衡Ni-NTA柱，以5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠(100mM,pH 6.5)缓冲液，所得纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图1，结果表明经HisTrap亲和层析，得到电泳纯的重组FSAA及其突变体。
实施例4：FSAA及其突变体的酶活测试
筛选阶段，反应体系为(0.3mL):100mM醛底物，500mM羟基丙酮，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM,pH 6.5)和适量的纯酶。底物分别为噻吩-2-甲醛(1a)、噻吩-3-甲醛(1b)、苯并噻吩-2-甲醛(1c)、糠醛(1d)和吡啶-2-甲醛(1e)。野生型FSAA及其突变体催化相应底物初速度(v0,nmol min-1mg-1)和转化率如表2所示。
表2野生型FSAA及其突变体催化相应受体(1a-1e)与HA羟醛缩合反应的初速度和转化率
实施例5：FSAA及其突变体的动力学参数
在标准条件下，通过分别改变反应体系中两个底物的浓度进行酶活力测定，根据双倒数作图法计算相应的动力学常数。动力学常数计算中所用底物及其浓度如下(总体积为0.3mL)：
1.200mM的HA溶解在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(100mM,pH 6.5)，并保持HA浓度不变。加入不同浓度的噻吩-2-甲醛于反应体系中(5～200mM),然后加入FSAA，FSAA I31T，FSAA Q59T，FSAA I195Q和FSAA I31T/Q59T/I195Q以启动反应，并控制转化率低于5％。反应结束时加入0.9mL的甲醇终止反应，离心后以HPLC进行分析；
2.100mM的噻吩-2-甲醛溶解在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(100mM,pH 6.5)，并保持肉桂醛浓度不变。加入不同浓度的HA于反应体系中(20～250mM),然后加入FSAA，FSAAI31T，FSAA Q59T，FSAA I195Q和FSAA I31T/Q59T/I195Q以启动反应，并控制转化率低于5％。反应结束时加入0.9mL的甲醇终止反应，离心后以HPLC进行分析；
野生型FSAA及其突变体催化相应底物的表观动力学参数如表3所示。
表3 FSAA及其突变体不对称催化反应表观动力学参数
实施例5：FSAA及其突变体FSAA I31T/Q59T/I195Q转化高浓度受体(1)和HA
反应体系(0.3mL)：80g/L湿菌体细胞，醛受体1a-1e的浓度分别为400mM,350mM,300mM,500mM和500mM，HA浓度分别为相应的醛受体的浓度的5倍，以100mM,pH 6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液补齐至0.3mL。于30℃，220rpm条件下反应。针对所有的醛底物，突变体FSAA I31T/Q59T/I195Q的转化率均高于野生型。其中，针对醛底物1a-1d，突变体的转化率达到70％-92％，而野生型的转化率仅为18％-50％。针对受体1e，野生型转化率最终达到91％且耗时为11小时，而突变体仅在40分钟内即可达到95％的最终转化率。
综上，突变体FSAA I31T/Q59T/I195Q全细胞能够在较高底物浓度下有效催化噻吩-2-甲醛及类似物(1a-1e)与HA的不催称直接羟醛缩合反应，并保持良好的立体选择性，表明该全细胞生物催化剂具有广阔的工业化应用前景。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 高催化活性的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用
<130> 2017
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggaactgt atctggatac ttcagacgtt gttgcggtga aggcgctgtc acgtattttt 60
ccgctggcgg gtgtgaccac taacccaagc attatcgccg cgggtaaaaa accgctggat 120
gttgtgcttc cgcaacttca tgaagcgatg ggcggtcagg ggcgtctgtt tgcccaggta 180
atggctacca ctgccgaagg gatggttaat gacgcgctta agctgcgttc tattattgcg 240
gatatcgtgg tgaaagttcc ggtgaccgcc gaggggctgg cagctattaa gatgttaaaa 300
gcggaaggga ttccgacgct gggaaccgcg gtatatggcg cagcacaagg gctgctgtcg 360
gcgctggcag gtgcggaata tgttgcgcct tacgttaatc gtattgatgc tcagggcggt 420
agcggcattc agactgtgac cgacttacac cagttattga aaatgcatgc gccgcaggcg 480
aaagtgctgg cagcgagttt caaaaccccg cgtcaggcgc tggactgctt actggcagga 540
tgtgaatcaa ttactctgcc actggatgtg gcacaacaga tgattagcta tccggcggtt 600
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taa 663
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
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1 5 10 15
Ser Arg Ile Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Ile Ile
20 25 30
Ala Ala Gly Lys Lys Pro Leu Asp Val Val Leu Pro Gln Leu His Glu
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Ala Met Gly Gly Gln Gly Arg Leu Phe Ala Gln Val Met Ala Thr Thr
50 55 60
Ala Glu Gly Met Val Asn Asp Ala Leu Lys Leu Arg Ser Ile Ile Ala
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Asp Ile Val Val Lys Val Pro Val Thr Ala Glu Gly Leu Ala Ala Ile
85 90 95
Lys Met Leu Lys Ala Glu Gly Ile Pro Thr Leu Gly Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Gly Ala Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Leu Ala Gly Ala Glu Tyr Val
115 120 125
Ala Pro Tyr Val Asn Arg Ile Asp Ala Gln Gly Gly Ser Gly Ile Gln
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Thr Val Thr Asp Leu His Gln Leu Leu Lys Met His Ala Pro Gln Ala
145 150 155 160
Lys Val Leu Ala Ala Ser Phe Lys Thr Pro Arg Gln Ala Leu Asp Cys
165 170 175
Leu Leu Ala Gly Cys Glu Ser Ile Thr Leu Pro Leu Asp Val Ala Gln
180 185 190
Gln Met Ile Ser Tyr Pro Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Lys Phe Glu
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Lys Val Leu Ala Ala Ser Phe Lys Thr Pro Arg Gln Ala Leu Asp Cys
165 170 175
Leu Leu Ala Gly Cys Glu Ser Ile Thr Leu Pro Leu Asp Val Ala Gln
180 185 190
Gln Met Gln Ser Tyr Pro Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Lys Phe Glu
195 200 205
Gln Asp Trp Gln Gly Ala Phe Gly Arg Thr Ser Ile
210 215 220

Claims (10)

1.D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于：所述突变体选自a或b：
a.在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下单个位点突变:31位异亮氨酸、163位亮氨酸及195位异亮氨酸；
b.在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下两个或两个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，所述突变体在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下三个或三个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。
3.根据权利要求1所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，所述D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的氨基酸序列选自下列突变序列：
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸；
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，第163位亮氨酸突变为缬氨酸；
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，第195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺；
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸且第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸；
SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，第163位亮氨酸突变为缬氨酸且第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸；
SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，第195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺且第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸；
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸，第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸且第163位亮氨酸突变为缬氨酸；
SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸，第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸且第195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺。
4.根据权利要求2所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，编码D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的核苷酸序列选自下列序列：
SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
5.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码权利要求1-3任意一项所述的氨基酸序列。
6.基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求5所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主微生物为大肠杆菌。
8.D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的制备方法，其特征在于，培养权利要求6或7所述的基因工程菌，诱导获D-果糖-6-磷酸醛缩酶A重组蛋白。
9.如权利要求1-3任意一项所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体或如权利要求6-7任意一项所述的基因工程菌在不对称催化噻吩-2-甲醛、噻吩-3-甲醛、苯并噻吩-2-甲醛、糠醛、吡啶-2-甲醛中任意一种和羟基丙酮的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，噻吩-2-甲醛、噻吩-3-甲醛、苯并噻吩-2-甲醛、糠醛、吡啶-2-甲醛中任意一种和羟基丙酮为底物，所述D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体或基因工程菌为催化剂，进行反应，其中醛底物初始浓度为10～500mmol/L，羟基丙酮初始浓度为50～2500mmol/L。
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