CN101463358B

CN101463358B - 一种腈水合酶基因簇及其应用

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Publication number: CN101463358B
Application number: CN2009100767101A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 潘雯宇; 马玉超; 罗晖; 沈忠耀
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2009-01-15
Filing date: 2009-01-15
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2029-01-15
Also published as: CN101463358A

Abstract

本发明公开了一种腈水合酶基因簇及其应用，该腈水合酶基因簇具有nhtC、nhtD、nhtE、nhtB、nhtA和nhtG共6个编码基因。本发明还公开了含有该腈水合酶基因簇工程菌的构建方法。本发明腈水合酶基因簇的编码基因能够在基因工程菌中高效表达，所得的腈水合酶活性高，因而催化所得丙烯酰胺的产量高。

Description

一种腈水合酶基因簇及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说涉及一种腈水合酶基因簇及其在丙烯酰胺生产中的应用。

背景技术

腈代谢酶系主要包括腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。在腈代谢酶系的参与下，含腈代谢酶系的菌株可将毒性很强且难以降解的腈类转变为酰胺或羧酸加以利用。其中，腈水合酶(Nitrile Hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)可以催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺，酰胺酶则进一步将丙烯酰胺催化水解生产丙烯酸。由于腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺的生物催化过程反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，环境污染小、生产成本低，而且具有区域选择性、立体选择性和光激活性，近年来广泛用于生产丙烯酰胺，并将进一步应用于其它多种氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。

能产生腈水合酶的微生物的分布相当广泛，如红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌或短杆菌等。在细菌以及高等的真核生物的遗传图谱中，普遍存在着许多基因在染色体上成簇排列。基因簇的定义就是编码不同蛋白的多个基因片段按照一定的顺序首尾相连的排列在一起，由一个启动子启动他们的表达，表达的蛋白大多能相互调控，相互协作完成一系列的代谢功能。而腈水合酶和酰胺酶通常就位于这样一个典型的基因簇上。

绿针假单胞菌B23的腈类化合物代谢基因编码五种蛋白的开放阅读框，依次为酰胺酶基因、NHaseα亚基基因、β亚基基因、p47K基因和OrfE基因(Nishiyama等，J.Bacteriol.，1991，173：2465~2472)。在被称为生产丙烯酰胺的第三代生物催化剂的玫瑰红球菌J1(Rhodococcus rhodochrous J1)中不仅含有2种不同的腈水合酶，分别为高分子量腈水合酶(H-NHase，520kDa(千道尔顿))和低分子量腈水合酶(L-NHase，130kDa)，而且两种腈水合酶基因也都是以基因簇的形式出现(Komeda等，Biol.Chem.，1996，271(26)：15796~15802；Komeda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(9)：4267~4272)。编码L-NHase的α、β亚基的下游1.9kb(千碱基对)为编码酰胺酶的基因，而上游3.5kb区域内分别是负调控子和正调控子基因。编码H-NHase的α、β亚基的上游4.6kb区域至少还存在5个开放阅读框(ORF1~5)。其中ORF1和ORF2是腈水合酶表达的正调控基因，ORF4(即基因簇中的插入序列IS1164)则参与金属离子的转运过程。在红球菌N-774中，也发现了酰胺酶-腈水合酶基因簇，他们在同一个启动子的调控下启动(Hashimoto，等，BiosciBiotechnol Biochem，1994，58(10)：1859~1865)。红球菌N-771的腈水合酶基因簇包含6个基因，依次编码腈水合酶调控子2、腈水合酶调控子1、酰胺酶、腈水合酶α亚基、腈水合酶β亚基和腈水合酶激活子(Nojiri等，J.Biochem.(Tokyo)，1999，125(4)：696~704)。玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous M8的腈水合酶基因簇依次编码腈水合酶正调控子1、腈水合酶调控子2、腈水合酶β、α亚基和腈水合酶激活子(Veiko等，Biotekhnologiia(Mosc.)，1995，5，3-5)。芽孢杆菌BR449的腈水合酶基因和酰胺酶基因同样是以基因簇的形式存在，核苷酸测序发现6个开放阅读框，它们依次编码2个推定的未知蛋白、酰胺酶、腈水合酶β与α亚基和1个推定的由101个氨基酸残基组成的小蛋白p12K；从编码区的间隔和方向上可以判断，酰胺酶、β亚基、α亚基和p12K的基因共转录(Kim等，Enzyme and Microb Technol，2000，27(7)：492~501)。红球菌Rhodococcus sp.RHA1中的酰胺酶基因和腈水合酶基因也位于同一个大基因簇上，且被质粒pRHL2携带(Okamoto et al.Molecular Microbiology，2007，65(3)，828-838)。

总之，在上述已经发现报道的腈水合酶和酰胺酶基因簇中，以玫瑰红球菌J1的低分子量腈水合酶基因簇、红球菌N-774的腈水合酶基因簇和芽孢杆菌BR449为代表，酰胺酶基因和腈水合酶基因位于同一个基因簇上。而在玫瑰红球菌J1的高分子量腈水合酶基因簇和玫瑰红球菌M8中，腈水合酶基因和酰胺酶基因不在同一个基因簇上。

发明内容

本发明目的在于提供一种腈水合酶基因簇。

本发明另一目的是提供含有上述腈水合酶基因簇工程菌的构建方法。

本发明的还一目的是提供上述腈水合酶基因簇在丙烯酰胺生产中的应用。

实现本发明的技术方案如下：

本发明一种腈水合酶基因簇nhtCDEBAG，具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，共7935个碱基对。所述的腈水合酶基因簇来自红色红球菌Rhodococcus ruber TH。

上述腈水合酶基因簇，具有nhtC、nhtD、nhtE、nhtB、nhtA和nhtG共6个编码基因：

nhtC位于基因簇核苷酸序列的第1025-2110位碱基处，长度为1086个碱基对，编码腈水合酶调控蛋白NhtC，共361个氨基酸(SEQ ID NO：2)；

nhtD位于基因簇核苷酸序列的第2161-2607位碱基处，长度为447个碱基对，编码腈水合酶调控蛋白NhtD，共148个氨基酸(SEQ ID NO：3)；

nhtE位于基因簇核苷酸序列的第2898-3188位碱基处，长度为291个碱基对，编码腈水合酶调控蛋白NhtE，共96个氨基酸(SEQ ID NO：4)；

nhtB位于基因簇核苷酸序列的第4755-5444位碱基处，长度为690个碱基对，编码腈水合酶β亚基NhtB，共229个氨基酸(SEQ ID NO：5)；

nhtA位于基因簇核苷酸序列的第5458-6069位碱基处，长度为612个碱基对，编码腈水合酶α亚基NhtA，共203个氨基酸(SEQ ID NO：6)；

nhtG位于基因簇核苷酸序列的第6066-6380位碱基处，长度为315个碱基对，编码腈水合酶调控蛋白NhtG，共104个氨基酸(SEQ ID NO：7)。

上述腈水合酶基因簇中所述的基因nhtC、nhtD、nhtE、nhtB、nhtA和nhtG共用一个启动子，其中nhtB和nhtA分别表达腈水合酶(nhbBA)的β亚基和α亚基，而nhtC、nhtD、nhtE和nhtG分别表达腈水合酶NhtBA的正调控蛋白NhtC、NhtD、NhtE或NhtG。调控蛋白与腈水合酶的共表达可以显著提高腈水合酶的表达活性。

上述腈水合酶基因簇中所述的腈水合酶NhtBA由β亚基NhtB和α亚基NhtA组成，其中β亚基NhtB具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，α亚基NhtA具有SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。

含有本发明腈水合酶基因簇的表达载体或基因工程菌均属于本发明的保护范围。

含有上述腈水合酶基因簇工程菌的构建方法，就是将含有上述腈水合酶基因簇的重组表达载体导入宿主；或者直接将上述腈水合酶编码基因或基因簇插入表达宿主的染色体即可。

所述的宿主是指大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、乳酸棒杆菌或酵母菌等之一种，优选宿主为红球菌或大肠杆菌。

上述用于插入所述的腈水合酶基因簇的表达载体是指能在在所述宿主中表达的质粒载体，如可在红球菌中表达的穿梭质粒载体pNV18，或可在大肠杆菌中表达的pET，或可在毕赤酵母菌中表达的pPIC9K等。含有上述腈水合酶基因簇的重组表达载体可按照常规方法构建。

含有上述腈水合酶编码基因簇的重组细胞可按常规同源重组方法构建。

本发明腈水合酶基因簇(SEQ ID NO：1，7935bp)，不包含酰胺酶基因。与同源性最高的玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous J1的高分子量腈水合酶基因簇(6555bp)相比，本发明所述的腈水合酶基因簇不存在nhhF阅读框，同时外延1380bp，二者的序列一致性为66.7％。与Rhodococcus rhodochrous M8的腈水合酶基因簇相比(4540bp)相比，本发明腈水合酶基因簇多含有一个nhtE阅读框，二者的序列一致性为56.2％。

本发明具有的优点：本发明腈水合酶基因簇能够在工程菌中高效表达。如单独过表达腈水合酶基因的工程菌中腈水合酶的比活性是野生玫瑰红球菌R.rhodochrousATCC 33278的7倍；过表达整个腈水合酶基因簇的工程菌中，腈水合酶的比活性是野生玫瑰红球菌菌R.rhodochrous ATCC 33278的70多倍。以丙烯腈为底物，每毫克细胞(干重)每分钟可以催化生成大约220微摩尔丙烯酰胺。

附图说明

图1.红色红球菌腈水合酶基因簇nhtCDEBAG的结构组成示意图。

图2.红色红球菌腈水合酶5’端侧翼序列一次热不对称基因扩增(TAIL-PCR)的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA分子量标准，I、II、III分别代表引物SP1、SP2、SP3参与的3轮PCR产物；AD1、AD2、AD3和AD4分别代表由相应简并引物完成的TAIL-PCR。

具体实施方式

实施例1腈水合酶基因簇nhtCDEBAG的克隆

(1)红色红球菌(Rhodococcus ruberTH)的培养并提取菌体的染色体DNA。用无菌的接种环挑取自土壤中筛选的红色红球菌(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No.2380)单菌落接种于装有50mL的LB液体发酵培养基(LB液体发酵培养基的组成及其比例为：葡萄糖10g/L；酵母膏5g/L；蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L，其余为水)的三角瓶中；然后在温度为28℃、转速为200rpm的摇床中培养72小时，再在10000rpm下离心5min，收集菌体沉淀，10ml无菌水重悬，10000rpm下离心5min，收集菌体，酚/氯仿法提取菌体的总DNA，用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification Kit提取和纯化红色红球菌总DNA，备用。

(2)腈水合酶基因nhtBA的PCR扩增和测序

根据腈水合酶基因的保守序列设计并合成腈水合酶基因的上游与下游引物，其中上游引物P1为：5’-CAGAATTCACGTCCCCGTAGTGT-3’(下划线部分为EcoRI酶切位点)(SEQ ID NO：9)；

下游引物P2为：5’-AAGGATCCGAAAGCGCGATG-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)(SEQ ID NO：10)，引物由北京赛百盛生物工程公司合成；然后用无菌水溶解引物至浓度为50μmol/L。PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由宝生物工程(大连)有限公司购得。以步骤(1)所得红色红球菌Rhodococcus ruber TH的总DNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增

PCR反应体系为：

扩增缓冲液 5μL

四种脱氧核苷酸 5μL

引物P1 1μL

引物P2 1μL

总DNA溶液 8μL

EX Taq DNA聚合酶 0.5μL

无菌水 29.5μL

总体积 50μL；

反应条件为：94℃，5min；94℃1min、50℃1.5min、72℃1min，循环30次；最后72℃10min。扩增得到腈水合酶基因片断。将扩增得到的腈水合酶基因片段和质粒pUC18分别用限制性核酸内切酶EcoR I和BamHI(宝生物工程(大连)有限公司)在37℃下进行酶切反应4h；将所得酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化(天根生化科技(北京)有限公司)，然后用T4DNA连接酶(Promega公司)在4℃进行连接反应16h；再将连接反应产物转化宿主菌E.coli JM109的感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，采用氨苄青霉素抗性(Amp)LB平板挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有腈水合酶基因片断的重组质粒pUC18-nhtBA。将重组质粒进行DNA测序，测序结果表明所得基因nhtBA具有序列表中SEQ ID NO：8所示的多核苷酸序列。

(3)采用TAIL-PCR(热不对称PCR)方法反向扩增获得腈水合酶基因簇nhtCDEBAG基因序列并测序。根据已经获得的腈水合酶基因nhtBA，在5’末端分别设计三个嵌套引物N5SP1-N5SP3。所述的引物分别为：

N5SP1：5’-CCTTGAGATGCATCCAGGTCAGAAT-3’；(SEQ ID NO：11)

N5SP2：5’-CCATTTCCTCATTCCTTTCATCGG-3’；(SEQ ID NO：12)

N5SP3：5’-GAATCCTTCACAGCACAACAATCG-3’(SEQ ID NO：13)

根据TAIL-PCR方法原理设计四个简并引物AD1-AD4，所述的引物序列分别为：

AD1：5’-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3’；(SEQ ID NO：14)

AD2：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’；(SEQ ID NO：15)

AD3：5’-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3’；(SEQ ID NO：16)

AD4：5’-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3’(SEQ ID NO：17)

上述引物序列中所述的n可以为a或c或g或t；其中的I为次黄嘌呤核苷。

第一轮以质粒pUC18-nhtBA为模板，以N5SP1和四个简并引物AD1、AD2、AD3和AD4的混合物为上、下游引物，进行如下TAIL-PCR变温循环：95℃，2min；5个循环(94℃，30s，60℃，1min，72℃，2min 30s)；94℃，30s，25℃，1min，72℃，2min 30s；10个循环(94℃，30s，44℃，1min，72℃，2min 30s)；15个循环(94℃，15s，62℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，15s，62℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，15s，44℃，1min，72℃，2min 30s)；72℃，10min。将所得PCR产物纯化后作为下一轮TAIL-PCR的模板。依次类推，第二轮TAIL-PCR的引物分别为N5SP2和四个简并引物AD1、AD2、AD3和AD4的混合物；第三轮TAIL-PCR的引物分别为N5SP3和四个简并引物AD1、AD2、AD3和AD4的混合物。第二轮和第三轮TAIL-PCR的条件为：15个循环(94℃，30s，58℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，30s，58℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，30s，44℃，2min30s，72℃，1min 30s)，72℃(10min)。三轮TAIL-PCR结束后，用1％的琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物的大小分布，结果(如图2所示)简并引物AD1与3个嵌套引物SP1、SP2、SP3进行TAIL-PCR时，第II轮和第III轮产物都有一条清晰的扩增带，约为2000bp，而且第III轮的条带比第II轮略小，与嵌套引物在DNA序列上结合位置的差别相一致。按凝胶回收试剂盒方法回收第三轮PCR目标产物，并按连接试剂盒说明方法将其分别克隆至pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)上。连接产物转化DH5α感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，最后在含有IPTG和X-gal的LB/Amp抗性平板上蓝白筛选阳性克隆，挑取白色菌落作为模板，分别以pMD18-T载体上的通用RV-M和M13-47为引物，进行菌落PCR扩增筛选。筛选出的目的菌株用LB/Amp液体培养基培养过夜，送菌液给北方诺赛基因组研究中心测序。根据测序结果，进一步设计新一轮5’端TAIL-PCR上游引物，分别为

N5-2SP1：ATCTCAGTCATCCATTCCAGGCAG；(SEQ ID NO：18)

N5-2SP2：TAGACTGCGGTGTAGACATACGGAA；(SEQ ID NO：19)

N5-2SP3：TCAACGAAGACCGGCGTAACCT。(SEQ ID NO：20)

同样采用简并引物AD1、AD2、AD3和AD4为下游引物，采用同上方法进行三轮TAIL-PCR。回收测序获得SEQ ID No：1中所示nhtBA基因5’端上游自第1位到第4754位的侧翼片断，长度为4754bp。

与此类似，在腈水合酶基因nhtBA的3’端设计TAIL-PCR嵌套引物如下：

N3SP1：5’-CGAAATCCGCTACATCGTCATCC-3’；(SEQ ID No：21)

N3SP2：5’-CTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG-3’；(SEQ ID No：22)

N3SP3：5’-GAAGACACACTCACTGATCGGCT-3’。(SEQ ID No：23)

采用相同的AD1、AD2、AD3和AD4简并引物，第一轮扩增以质粒pUC18-nhtBA为模板，第二轮和第三轮扩增分别以前一轮扩增产物为模板。参照TAIL-PCR方法的标准变温循环，扩增获得腈水合酶基因3’端的基因大片断。用1％的琼脂糖凝胶电泳验证后采用同上方法切凝回收、连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞、筛选阳性克隆并测序。最终获得SEQ ID No：1中nhtBA基因3’端下游自第6070位到7935位碱基的侧翼片断，长度为1866bp。

将nhtBA基因5’端上游的侧翼片断、nhtBA基因以及nhtBA基因3’端下游的侧翼片断的DNA序列测序后拼接起来，获得序列表中SEQ ID NO：1所示的腈水合酶基因簇全DNA序列，长度为7935bp。

实施例2.携带腈水合酶基因nhtBA的重组穿梭质粒和工程菌株的构建

根据序列表中SEQ ID NO：1所示的腈水合酶基因簇序列设计引物：

上游引物PBA1：CAGGATCCAATGGATGGTATCCACGA(下划线部分为BamHI酶切位点)；(SEQ ID NO：24)

下游引物PBA2：CGAAGCTTCACTCATACGATCACTT(下划线部分为HindIII酶切位点)(SEQ ID NO：25)。以红色红球菌R.ruber TH基因组DNA为模板，采用常规PCR方法克隆nhtBA基因。以携带tac启动子的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒pNV18-Ptac为载体(一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用.于慧敏，等，CN 101186911A)，用BamHI和HindIII双酶切腈水合酶基因nhtBA和穿梭质粒pNV18-Ptac，37℃反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，然后采用T4DNA连接酶在4℃进行连接反应14h；将连接反应产物转化宿主菌E.coli JM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有腈水合酶基因nhtBA的穿梭质粒pNV-Ptac-nhtBA。

采用革兰氏阳性菌电穿孔感受态细胞的标准制备方法(《分子克隆指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔著)，制备玫瑰红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 33278(购自美国ATCC菌种保藏中心)的感受态细胞。取1μl纯化后的穿梭质粒pNV-Ptac-nhtBA于一个1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电转杯一起置于冰上预冷；将50μl制备好的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min；打开电转仪，调节电压为1250V；将穿梭质粒和感受态细胞的混合物转移至已预冷的电转杯中，放入电转化仪，按下电击键，听到蜂鸣声后，向杯中迅速加入800μl的SOC液体培养基(配方见《分子克隆指南》)。重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。置于28℃、220rpm摇床培养2h；取200μl菌液涂布于含有20μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板，放入28℃培养箱培养60～72小时后出现重组红球菌的单菌落，得基因重组玫瑰红球菌R.rhodochrous ATCC 33278/pNV-Ptac-nhtBA。

实施例3携带腈水合酶基因簇nhtCDEBAG的重组质粒和工程菌株的构建

上游引物Pclusterl：GCTCTAGAACTGGCAAGCTCCTTT(下划线部分为XbaI酶切位点)；(SEQ ID NO：26)

下游引物Pcluster2：CGAAGCTTGGAGAAGCATAGGTCGT(下划线部分为HindIII酶切位点)(SEQ ID NO：27)；

以红色红球菌R.ruber TH基因组DNA为模板，采用常规PCR方法克隆腈水合酶基因簇基因nhtCDEBAG。同实施例2所述的方法，以穿梭质粒pNV18-Ptac为载体，用XbaI和HindIII分别酶切穿梭质粒pNV18-Ptac和腈水合酶基因簇nhtCDEBAG，37℃反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，然后采用T4 DNA连接酶在4℃进行连接反应14h；将连接反应产物转化宿主菌E.coliJM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，验证正确的穿梭质粒即为含有腈水合酶基因簇的穿梭质粒pNV-Ptac-nhtCDEBAG。

同实施例2所述的方法，采用电穿孔转化法将重组穿梭·质粒pNV-Ptac-nhtCDEBAG转入玫瑰红球菌R.rhodochrous ATCC 33278感受态细胞，得到玫瑰红球菌工程菌R.rhodochrous ATCC 33278/pNV-Ptac-nh tCDEBAG。

实施例4腈水合酶基因和腈水合酶基因簇在红球菌工程菌中的表达试验

(1)玫瑰红球菌工程菌的发酵培养

将实施例3所得分别携带外源腈水合酶基因或腈水合酶基因簇全序列的玫瑰红球菌工程菌R.rhodochrous/pNV-Ptac-nhtBA(Rh-nhtBA)或R.rhodochrous/pNV-Ptac-nhtCDEBAG(Rh-nh tCDEBAG)进行摇瓶平行培养，并以原始野生菌株R.rhodochrous ATCC 33278为对照，在28℃、摇床转速200转/min条件下培养72小时，然后将发酵菌液分别离心，收集菌体；培养基的组成及比例为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨7g/L，KH₂PO₄0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH7.5，诱导剂甲基丙烯酰胺0.2g/L，其余为水。

(2)玫瑰红球菌工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺试验

用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)在50mL三角瓶中重悬步骤(1)中所得菌体，加入终浓度为0.5％丙烯腈液体，在28℃、200rpm条件下摇床反应10min，再加入1ml盐酸中止反应，利用GC-9AM气相色谱仪检测反应产物丙烯酰胺，测定所得工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺的活性。结果野生玫瑰红球菌的腈水合酶活性为3.0U/mg干菌；单独过表达腈水合酶的玫瑰红球菌工程菌Rh-nhtBA的总酶活为21.0U/mg干菌，是野生菌的7倍；过表达整个基因簇的玫瑰红球菌工程菌Rh-nhtCDEBAG的总酶活为220U/mg干菌，是腈水合酶单独过表达时的10.5倍。说明本发明腈水合酶基因簇的腈水合酶的活性高，表达量高。其中，酶活的单位定义为：每单位质量干菌细胞每分钟催化生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量；1μmol丙烯酰胺/(min·mg干菌)＝1U/mg干菌。

序列表

<110>清华大学

<120>一种腈水合酶基因簇及其应用

<160>27

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>7935

<212>DNA

<213>Rhodococcus ruber

<400>1

actggcaagc tcctttccag cggagtctga gaactcgcgc tcccaagagg ccggccgacc 60

agggggcgaa cggcgctaaa cgtggactgt ccgattgaac gtctacaacc ttgcgaatct 120

atgaccgccg ctgctcggtg tgggggctgt tcctgcgtcg gcatcgatcg tgcatcagtg 180

gcaaaccccc tcccatgcct cggttcgtgc caccgccacg taggcggctc gtagttcata 240

cctgcacatc ccttgagaca gaccgctgta cagagccgac tcgcccgtcc gtcgccggtg 300

gtacacgcac ggctgtgggg ttgtgtgctc tcagggtaga ccagatactg tcattgtgta 360

gtagagtttc gtaagattct tgtaacgcgc cgaacaggca gggtcgtgcg agtcctcccg 420

tcgacggtag cccgacatgg gtcccaggcc cgaaggcgtg cacagcgaac attagttaca 480

gaacgcaatt ttcagagaga gatgaacccg tacgaccagc tgaccgaatg tgggtttggc 540

acggacccgg agaatcgtgc tgcggttgcc cagctggtgc acctccggcg gaatttccca 600

agccctaggt gtctccaggc ttcacgtgcc ggctacgtta ccgagcgcag aatcactggc 660

cgacgggaat gcccgtgaac gtcgattccc cgtgagaccg gtaacgacgt gacccgccgg 720

ccctggggcg aggcccctct ttggcccctg tccggcgcgc acctgcacga tctccggctt 780

cgacacattc gccccgaccg ctcgctcaag agatcccagg ctccacagca ggttgggacc 840

gtgcggccga tcggtccgcc gtttcgaacg acacgaatgt gcggttctcc acctccatga 900

tttggttgag gccgtcgatc gagcacacgt taaccgtcgc gaaacacccg gtcatggaca 960

gagcaatgtg aacgggttca tactccggag agcatgttgc ctagatcccc gcaaggagac 1020

cgctgtgccc cttggccgac cgaacctggg cttggtgcta cctcagagtg gaccgtccgg 1080

cattttcggt ccgtcatgcc aggcgagcgc cgagtacgcc atcgatgagc tcaacgcggg 1140

cggcggaatc ctgggccgag aggttacgcc ggtcttcgtt gacgggggcg cggacccgtc 1200

cgccgtagca gcatgcatcg ccgaccagac gaaacgtcgg gaattggacg ccgtagtcgg 1260

gtggcacacg tctgctgttc gtcgacgcat cgtgagcgcc atcggcggac gtattccgta 1320

tgtctacacc gcagtctacg agggcggcga gaactccgac ggcgtgttca tgacgggaga 1380

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attcctggcg tcgaaccagc gaccgagtcg aggccgcagc gacgttcgac tggcgtcgtg 1560

cgagttcttg tcactaggca catccgattt cacttcaacg ctcgaggcaa ttgagatgtc 1620

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ccagctgtga cagccatgtg acagccaaca gtcgtggcgg ttcccttccg tactaggggc 3060

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tcccctatca gaaggacgag cccttcttcc actacgagtg ggagggtcgg accctgtcga 4860

ttctgacctg gatgcatctc aagggcatgt cgtggtggga caagtcgcgg ttcttccggg 4920

agtcgatggg gaacgaaaac tacgtcaacg agattcgcaa ctcgtactac acccactggc 4980

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accgtgtgca ggagatcctc gagggtcggt acacggacag gaacccgtcg cggaagttcg 5100

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gacctatgct tctcc 7935

<210>2

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<212>PRT

<213>Rhodococcus ruber

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Val Pro Leu Gly Arg Pro Asn Leu Gly Leu Val Leu Pro Gln Ser Gly

1 5 10 15

Pro Ser Gly Ile Phe Gly Pro Ser Cys Gln Ala Ser Ala Glu Tyr Ala

20 25 30

Ile Asp Glu Leu Asn Ala Gly Gly Gly Ile Leu Gly Arg Glu Val Thr

35 40 45

Pro Val Phe Val Asp Gly Gly Ala Asp Pro Ser Ala Val Ala Ala Cys

50 55 60

Ile Ala Asp Gln Thr Lys Arg Arg Glu Leu Asp Ala Val Val Gly Trp

65 70 75 80

His Thr Ser Ala Val Arg Arg Arg Ile Val Ser Ala Ile Gly Gly Arg

85 90 95

Ile Pro Tyr Val Tyr Thr Ala Val Tyr Glu Gly Gly Glu Asn Ser Asp

100 105 110

Gly Val Phe Met Thr Gly Glu Val Pro Thr Asn Gln Ile Leu Pro Ala

115 120 125

Leu Glu Trp Met Thr Glu Ile Gly Val Arg Lys Trp Tyr Val Ile Gly

130 135 140

Ser Asp Tyr Val Trp Pro Arg Lys Thr Val Ser Val Ile Arg Glu Phe

145 150 155 160

Leu Ala Ser Asn Gln Arg Pro Ser Arg Gly Arg Ser Asp Val Arg Leu

165 170 175

Ala Ser Cys Glu Phe Leu Ser Leu Gly Thr Ser Asp Phe Thr Ser Thr

180 185 190

Leu Glu Ala Ile Glu Met Ser Gly Ala Asp Gly Val Leu Val Leu Leu

195 200 205

Leu Gly Gln Asp Ala Val Gln Phe Asn Arg Ser Phe Ser Arg Lys Gly

210 215 220

Leu His Arg Asp Ile Val Arg Leu Ser Pro Leu Met Asp Glu Asn Met

225 230 235 240

Leu Leu Ala Ser Gly Ala His Ala Ala His Gly Leu Tyr Ser Val Ser

245 250 255

Gly Phe Phe Glu Cys Leu Val Thr Gly His Ser Met Asp Phe Glu Ser

260 265 270

Arg Tyr Ile Lys His Phe Gly Pro Thr Ala Ser Pro Ile Thr Ser Pro

275 280 285

Gly Glu Ser Cys Tyr Glu Gly Ile Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ala Asp

290 295 300

Arg Ala Gly Asp Leu Asp Pro Met Ser Leu Ser Tyr His Ala Asp Arg

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Thr Leu Asp Tyr Asp Ser Pro Arg Gly His Val Arg Phe Asp Gly Arg

325 330 335

His Leu Ala Gln Asp Met Tyr Ile Ala Arg Ala Asp Gly Val Glu Phe

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Asp Ile Leu Ala Gln Val Ser His Val

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<210>3

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<212>PRT

<213>Rhodococcus ruber

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Met Ile Glu Ser Glu Ala Val Ala Glu Ser Gly Asn Val Val Arg Ser

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Pro Leu Val Gly Gly Ala Leu Glu Ala Val Ser Arg Ser Leu Ser Arg

20 25 30

Arg Ile His Asn Val Val Asp Gln Glu Lys Leu Thr Ala Asp Gln Trp

35 40 45

Tyr Val Leu Asp Ile Ile Val Arg Asn Asp Gly Ile Ala Met Thr Glu

50 55 60

Ile Ala Arg Ser Leu Gly Ser Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys His Val

65 70 75 80

Asp Arg Leu Val Thr Thr Ala Leu Val Phe Arg Leu Pro Asp His Ala

85 90 95

Asp Arg Arg Lys Val Leu Val His Ala Ser Lys Arg Gly Gly Ser Ala

100 105 110

His Ser Arg Leu Leu Pro Leu Val Gln Gln Val Glu Asp Glu Phe Met

115 120 125

Asp Glu Phe Ala Ile Pro Asp Arg Gln Val Leu Arg Thr Val Leu Glu

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Thr Trp Phe Glu

145

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<212>PRT

<213>Rhodococcus ruber

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Val Leu Pro Arg Ser Gln Ser Arg Pro Met Arg Ile Glu Arg Arg Arg

1 5 10 15

Val Arg Ser Val Thr Cys Gly Thr Asp Leu Asp Lys Trp Ser Ala Thr

20 25 30

Ser Ala Leu Ala Gly Val Gly Ala Glu Ser Lys Pro Leu Val Arg Lys

35 40 45

Gly Thr Ala Thr Thr Val Gly Cys His Met Ala Val Thr Ala Gly Leu

50 55 60

Arg Ile Ser Gly Ala Gly Arg Arg Gln Ser Ser Ser Gln Val Arg Asn

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Cys Arg Tyr Gly Val Arg Asp Arg Gly Cys Leu Pro Ala Glu Asp Ala

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<210>5

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<212>PRT

<213>Rhodococcus ruber

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Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val

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Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg

20 25 30

Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp

35 40 45

Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val

50 55 60

Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu

65 70 75 80

Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His

85 90 95

Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser

100 105 110

Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His

115 120 125

Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu

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Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg

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Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His

165 170 175

Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp

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Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly

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Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro

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Tyr Leu Ile Ser Ala

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<212>PRT

<213>Rhodococcus ruber

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Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys

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Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala

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Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly

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Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys

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Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala

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Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr

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His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val

100 105 110

Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg

115 120 125

Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp

130 135 140

Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile

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Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser

165 170 175

Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val

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<212>PRT

<213>Rhodococcus ruber

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Met Ser Glu Asp Thr Leu Thr Asp Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala

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Ala Pro Pro Arg Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu

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Ala Thr Ala Tyr Gly Val Ala Ile Ala Leu Ser Asp Gln Lys Ser Tyr

35 40 45

Glu Trp Glu Ser Phe Arg Gln Arg Leu Ile His Ser Ile Ala Glu Ala

50 55 60

Asn Gly Cys Glu Ala Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala

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<212>DNA

<213>Rhodococcus ruber

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catctcaagg gcatgtcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180

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agtttctccc tcggtgacaa ggtcaaagtg aagaatatga acccgctggg acacacacgg 480

tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctcccacgg ctgccagatc 540

tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcccc gcccgctcta cacggtcgcg 600

ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660

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cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960

aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc 1020

gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080

gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140

cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200

ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggacgag ctggcgaagc tggtgagccg 1260

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<223>n＝a或c或g或t

<400>15

agwgnagwan cawagg 16

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)

<223>w＝a或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(6，11)

<223>n＝i

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)

<223>n＝a或c或g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)

<223>s＝c或g

<400>16

cawcgncnga nasgaa 16

<210>17

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)

<223>s＝c或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(5，11)

<223>n＝i

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)

<223>n＝a或c或g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)

<223>w＝a或t

<400>17

tcstncgnac ntwgga 16

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>18

atctcagtca tccattccag gcag 24

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>19

tagactgcgg tgtagacata cggaa 25

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>20

tcaacgaaga ccggcgtaac ct 22

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套引物

<400>21

cgaaatccgc tacatcgtca tcc 23

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套引物

<400>22

ctcgatgatc ggtgtcagta atgcg 25

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套引物

<400>23

gaagacacac tcactgatcg gct 23

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>24

caggatccaa tggatggtat ccacga 26

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>25

cgaagcttca ctcatacgat cactt 25

<210>26

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>26

gctctagaac tggcaagctc cttt 24

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>27

cgaagcttgg agaagcatag gtcgt 25

Claims

1.一种腈水合酶基因簇，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。

2.含有权利要求1所述的腈水合酶基因簇的表达载体。

3.按照权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是重组质粒。

4.含有权利要求1所述的腈水合酶基因簇的基因工程菌的构建方法，其特征在于将含有权利要求1所述的的腈水合酶基因簇的重组表达载体导入宿主。

5.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述的宿主是指大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、乳酸棒杆菌或酵母菌。

6.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的质粒是指pNV18、pET或pPIC9K。

7.权利要求1所述的腈水合酶基因簇在丙烯酰胺生产中的应用。

8.权利要求2所述的表达载体在在丙烯酰胺生产中的应用。