CN112626056A

CN112626056A - 一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112626056A
Application number: CN202011598638.1A
Authority: CN
Inventors: 郑仁朝; 闻鹏飞; 汤晓玲; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112626056B

Abstract

本发明公开了一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位进行单突变或多突变获得的。本发明构建的突变体R224S/V226R/I136Q/A87M催化苯乙腈时，反应主产物为苯乙酰胺，酰胺的含量达到91.2％，腈水合活力为OsNIT的113.3％。野生型腈水解酶OsNIT催化苯乙腈时，苯乙酰胺含量为50.6％，同时将OsNIT腈水合活力记为100％。R224S/V226R/I136Q/A87M酰胺含量和水合活力分别为野生型的1.53倍和1.13倍。对腈水解酶的反应专一性调控使其能够应用于酰胺绿色工业催化合成，具有重要意义。

Description

一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的应用。

(二)背景技术

腈化合物是一类含氰基的有机化工原料，广泛用于化工、医药、农药和材料工业。腈水解酶能够催化腈化合物水解生成羧酸，具有独特的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优势，在腈化合物转化中发挥重要作用。一些腈水解酶除催化腈化合物水解生成羧酸外，同时具有腈水合活性。如Piotrowski等发现拟南芥腈水解酶同时具有腈水解和腈水合活性，能够催化β-氰基-L-丙氨酸转化为天冬酰胺和天冬氨酸，天冬酰胺的含量高达60％以上(J.Biol.Chem.,2001,276,2616-2621)。此外，Bradyrhizobium japonicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高达33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113-118)。

腈水解酶同时具有腈水解和水合活力的特性使其在生物有机合成中具有巨大潜力。提高腈水解酶的水合活性，可创制新型“腈水合酶”，开辟高效合成β-氨(羟)基酰胺的全新途径。因此，腈水解酶反应专一性的调控对开发腈水解酶生物催化新功能具有重要意义。

随着基因工程技术的迅猛发展，通过分子改造可显著提高腈水解酶的活性、稳定性及底物特异性等催化性能。近年来，腈水解酶反应专一性的调控也成为研究热点。Pseudomonas fluorescensEBC191腈水解酶突变体C163Q明显提高了催化产物中酰胺的比例，并且降低了对(R)-扁桃腈的水解活力(Appl.Environ.Microbiol.,2010,76,3668-3674)。姜水琴等改造Synechocystissp.PCC6803腈水解酶，获得了酰胺比例达73％的突变体F193N，其酰胺合成能力达野生型的35倍，但催化活力为野生型的50％(Catal.Sci.Technol.,2017,7,1122-1128)。张焱等改造水稻(Oryza sativa)腈水解酶OsNIT，突变体Y77E/R224S/V226R以苯乙腈为底物时，酰胺含量达到94.8％(CN111321132A)。进一步研究发现，Y77E/R224S/V226R水合活性仅为野生型的74.35％。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体、编辑基因、工程菌及在合成苯乙酰胺中的应用，对OsNIT进行合成酰胺方向(提高产物中酰胺含量)反应专一性调控，在保持水合活力的同时，提高酰胺含量，降低羧酸含量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQID NO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位进行单突变或多突变获得的。所述突变体可采用易错PCR、定点饱和突变及组合突变构建获得。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位丙氨酸突变为蛋氨酸(A87M，SEQ ID NO.4)；(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第136位异亮氨酸突变为谷氨酰胺(L136Q，SEQ ID NO.5)；(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位丙氨酸突变为蛋氨酸，第136位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，第224位精氨酸突变为色氨酸且第226位缬氨酸突变为精氨酸(/R224W/V226R/A87M/L136Q，SEQ ID NO.6)。

本发明还提供一种腈水解酶突变体编码基因，由编码基因构建的重组载体，及重组基因工程菌，所述重组载体按如下方法构建：将腈水解酶突变体基因插入pET-28b载体的BamH I与Hind III位点，构建含腈水解酶突变体基因的重组质粒。所述工程菌按如下方法制备：将构建的重组质粒转入宿主菌得到重组工程菌。所述工程菌的宿主细胞可采用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明提供所述腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的应用，所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以甲醇为助剂，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～60℃、150～500rpm/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酰胺。

进一步，转化体系中底物的加入终浓度以缓冲液体积计为20-100mM，催化剂的用量以湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为5-20g/L，其中湿菌体含水质量为88-92％；所述甲醇体积加入量为缓冲液体积的2-8％，优选4.5％。

进一步，底物浓度优选为100mM。

进一步，湿菌体加入量优选为5g/L。

进一步，缓冲液为pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。

进一步，反应条件优选为30℃、180rpm下反应30min。

进一步，所述湿菌体的制备方法为：含腈水解酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养8-10h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃、180rpm条件下诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体细胞，即为湿菌体。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明通过非理性及理性设计对反应非专一性腈水解酶OsNIT进行分子改造，获得反应专一性显著提高的突变体，有利于定向生成目的产物。本发明构建的突变体R224S/V226R/I136Q/A87M催化苯乙腈时，反应主产物为苯乙酰胺，酰胺的含量达到91.2％，腈水合活力为OsNIT的113.3％。野生型腈水解酶OsNIT催化苯乙腈时，苯乙酰胺含量为50.6％，同时将OsNIT腈水合活力记为100％。R224S/V226R/I136Q/A87M酰胺含量和水合活力分别为野生型的1.53倍和1.13倍。对腈水解酶的反应专一性调控使其能够应用于酰胺绿色工业催化合成，具有重要意义。

(四)附图说明

图1野生型OsNIT、突变体R224S/V226R/I136Q/A87M催化苯乙腈性能比较。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB液体培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取粉，溶剂为去离子水，pH值自然。蛋白胨及酵母提取粉购自赛默飞世尔科技公司，NaCl购自于国药集团试剂有限公司。灭菌条件：使用高压蒸汽灭菌锅于121℃高温灭菌20min。灭菌后的培养基加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素方可用于菌体培养。

LB平板培养基组成：固体培养基是在上述LB液体培养基组成成分基础上加入20g/L琼脂粉，灭菌条件同上。

实施例1腈水解酶突变体重组菌的构建

1、突变体的构建

水稻腈水解酶(OsNIT，GenBank登录号：AB027054，氨基酸序列SEQ ID NO.1)催化苯乙腈反应时，产物中酰胺与羧酸的比例接近1:1。通过生物信息学分析，确定其催化三联体为196Cys-71Glu-162Lys，然后通过理性设计分析，选取第87位丙氨酸、第136位异亮氨酸、第224位精氨酸、第226位缬氨酸进行定点饱和突变，构建了酰胺含量显著提高的突变体，具体为：

(1)单位点突变：将水稻腈水解酶(OsNIT，GenBank登录号：AB027054)基因(氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2)插入pET-28b载体的BamH I与Hind III位点，构建重组质粒。以重组质粒为模板，采用表1引物，在表2反应体系下进行全质粒PCR扩增，在该基因第87位、第136位、第224位、第226位进行单位点定点饱和突变。

表1、引物

注：N＝A/G/C/T,K＝G/T,M＝A/C。

表2、反应体系

PCR程序设定：95℃预变性5min；95℃变性30s，Tm+3℃退火30s，72℃延伸4.5min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

PCR产物经过0.9％琼脂糖凝胶电泳分析确定PCR结果为阳性后，向PCR产物内加入限制性内切酶Dpn I，于37℃酶切0.5-1h去除模板质粒DNA，65℃灭活15min，获得消除模板后的PCR产物，即为含突变体基因的质粒。

往E.coli BL21(DE3)感受态细胞100μL加入20μL消除模板后的PCR产物，置于冰上30min，42℃热击90s，加入600μL LB液体培养基，37℃复苏1h后涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，每个平板获得约200个克隆的突变体库。挑取单菌落接种于含终浓度50mg/L卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养8小时后，提取质粒测序，得到每个位点含20种不同氨基酸的饱和突变体文库，即含突变体基因的工程菌，进行下一步活力测定及筛选过程。

2、含腈水解酶突变体大肠杆菌制备

将测序正确的含突变体基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养8-10h，以2％(v/v)接种量转接至新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至菌体OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG，28℃、180rpm诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体细胞，-20℃保藏备用(即为静息细胞，用于催化反应及活力测定)。

4、活力测定

反应体系组成为：20mL Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(苯乙腈先溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。

腈水合细胞活力定义为标准反应条件即30℃，180rpm中，每分钟生成1μmol的苯乙酰胺所需要的细胞量定义为一个酶活力单位(1U)。

液相色谱分析采用C18柱，柱温40℃，检测波长210nm，流动相为甲醇：水＝30:70(含0.1％H₃PO₄)，流速1ml/min。

将87位和136位饱和突变体文库按如上方法进行活力测定，除A87Q、I136K、I136P、I136R无活力外，其余氨基酸突变体活力如表3及表4所示。从中得出优势突变体A87M，其在提高酰胺含量的同时提高了水合活力，降低了水解活力；突变体I136Q大幅度提高酰胺比例的同时保留住了水合活力，极大降低了水解活力。同时，将224位精氨酸突变为色氨酸，第226位缬氨酸突变为精氨酸，分别获得含腈水解酶突变体A87M、I136Q、R224S、V226R的质粒，并制备相应的工程菌湿菌体。

表3野生型OsNIT与第87位点突变体反应专一性及活力比较

表4野生型OsNIT与第136位点突变体反应专一性及活力比较

实施例2腈水解酶突变体A87M、I136Q酰胺含量和活力测定

反应体系组成为：20mL Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，采用实施例1方法制备的腈水解酶突变体A87M、I136Q湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(苯乙腈先溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经实施例1所述高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。同样条件下测试腈水解酶突变体湿菌体的酶活。

其中，A87M(SEQ ID NO.4)突变体在水合活力为亲本的107％的同时，水解活力降低至亲本的77％，I136Q(SEQ ID NO.5)突变体酰胺含量为达到82％，水解活力降至亲本的8.5％，但水合活力也降至亲本的43.65％。

表5野生型与A87M、I136Q突变体反应专一性和活力比较

实施例3腈水解酶多重突变体R224S/V226R/I136Q/A87M构建

利用上述方法对单点突变结果进行分析，发现第136位点、第87位点的突变可以改变反应专一性使其趋于生成酰胺，水合活力有较好的保留，水解活力被抑制，R224S、V226R基础上进行进一步突变改造，具体步骤如下：

以R224S突变体质粒为模板，采用V226R定点突变引物(表1Val226-For和Val226-Rev)进行全质粒PCR扩增，PCR体系与扩增条件同步骤1，采用是实施例1方法构建含腈水解酶突变体R224S/V226R质粒(氨基酸序列SEQ ID NO.3)；再以突变体R224S/V226R质粒为模板，采用I136Q定点突变引物(表1Ile136-For和Ile136-Rev)进行全质粒PCR扩增，PCR体系与扩增条件同步骤1，采用实施例1方法构建含腈水解酶突变体R224S/V226R/I136Q质粒；最后以突变体R224S/V226R/I136Q质粒为模板，采用A87M为定点突变引物(表1Ala87-For和Ala87-Rev)进行全质粒PCR扩增，PCR体系与扩增条件同步骤1，采用实施例1方法构建含腈水解酶多重突变体R224S/V226R/I136Q/A87M(SEQ ID NO.6)质粒。

按实施例1方法培养获得能进行酰胺比例和活力测定的湿菌体细胞。

实施例4腈水解酶组合突变体R224S/V226R/I136Q/A87M反应专一性和活力测定

反应体系组成为：20mLTris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，实施例2方法制备的腈水解酶组合突变体R224S/V226R/I136Q/A87M湿菌体0.1g，甲醇0.9mL、苯乙腈100mM(溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经实施例1所述高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。同样条件下，以突变体R224S/V226R湿菌体为对照。

如表6所示，突变体R224S/V226R/I136Q/A87M(SEQ ID NO.6)产物中酰胺的含量达到91.2％，水合活力为亲本的113.3％，水解活力为亲本的12.0％。

表6野生型与R224S/V226R/I136Q突变体反应专一性和活力比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 370

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala

1 5 10 15

Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg

20 25 30

Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr

35 40 45

Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser

50 55 60

Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly

65 70 75 80

Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp

85 90 95

Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val

100 105 110

Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys

115 120 125

Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr

130 135 140

Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His

145 150 155 160

Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly

165 170 175

Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly

180 185 190

Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu

195 200 205

Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg

210 215 220

Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys

225 230 235 240

Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro

245 250 255

Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp

260 265 270

Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu

275 280 285

Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp

290 295 300

Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val

305 310 315 320

Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln

325 330 335

Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala

340 345 350

Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr Leu Glu His His His His

355 360 365

His His

370

<210> 2

<211> 1113

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atggctatgg ttccgtctgg ttctggtggt ggtccgccgg ttatcgctga agttgaaatg 60

aacggtggtg ctacctctgg tgctgctacc gttcgtgcta ccgttgttca ggcttctacc 120

gttttctacg acaccccggc taccctggac aaagctgaac gtctgatcga agaagctgct 180

ggttacggtt ctcagctggt tgttttcccg gaagctttcg ttggtggtta cccgcgtggt 240

tctaccttcg gtttcggtgc taacatctct atcggtaacc cgaaagacaa aggtaaagaa 300

gaattccgta aataccacgc tgctgctatc gaagttccgg gtccggaagt tacccgtctg 360

gctgctatgg ctggtaaata caaagttttc ctggttatgg gtgttatcga acgtgaaggt 420

tacaccctgt actgctctgt tctgttcttc gacccgctgg gtcgttacct gggtaaacac 480

cgtaaactga tgccgaccgc tctggaacgt atcatctggg gtttcggtga cggttcgact 540

atcccggtgt acgacacgcc gctgggtaaa atcggtgctc tgatctgctg ggaaaacaaa 600

atgccgctgc tgcgtaccgc tctgtacggt aaaggtatcg aaatctactg cgctccgacc 660

gcggattctc gtcaggtatg gcaggcatct atgacccaca tcgctctgga aggtggttgc 720

ttcgttctgt ctgctaacca gttctgccgt cgtaaagact acccgccgcc gccggaatac 780

gttttcaccg gtctgggtga agaaccgtct ccggacaccg ttgtttgccc gggtggttct 840

gttatcatct ctccgtctgg tgaagttctg gctggtccga actacgaagg tgaagctctg 900

atcaccgctg acctggacct gggtgaaatc gttcgtgcta aattcgactt cgacgttgtt 960

ggtcactacg ctcgtccgga agttctgtct ctggttgtta acgaccagcc gcacctccca 1020

gttagcttca cctctgctgc ggaaaaaacc accgctgcta aatctgactc taccgctaaa 1080

ccgtacctcg agcaccacca ccaccaccac tga 1113

<210> 3

<211> 370

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala

1 5 10 15

Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg

20 25 30

Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr

35 40 45

Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser

50 55 60

Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Glu Pro Arg Gly

65 70 75 80

Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp

85 90 95

Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val

100 105 110

Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys

115 120 125

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130 135 140

Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His

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Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly

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Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly

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Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp

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Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu

275 280 285

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Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val

305 310 315 320

Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln

325 330 335

Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala

340 345 350

Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr Leu Glu His His His His

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His His

370

<210> 4

<211> 370

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala

1 5 10 15

Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg

20 25 30

Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr

35 40 45

Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser

50 55 60

Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly

65 70 75 80

Ser Thr Phe Gly Phe Gly Met Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp

85 90 95

Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val

100 105 110

Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys

115 120 125

Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr

130 135 140

Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His

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Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly

165 170 175

Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly

180 185 190

Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu

195 200 205

Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg

210 215 220

Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys

225 230 235 240

Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro

245 250 255

Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp

260 265 270

Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu

275 280 285

Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp

290 295 300

Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val

305 310 315 320

Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln

325 330 335

Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala

340 345 350

Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr Leu Glu His His His His

355 360 365

His His

370

<210> 5

<211> 370

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala

1 5 10 15

Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg

20 25 30

Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr

35 40 45

Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser

50 55 60

Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly

65 70 75 80

Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp

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Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val

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Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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340 345 350

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355 360 365

His His

370

Claims

1.一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQID NO.1所示氨基酸序列第87位丙氨酸突变为蛋氨酸；(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第136位异亮氨酸突变为谷氨酰胺；(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位丙氨酸突变为蛋氨酸，第136位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，第224位精氨酸突变为色氨酸且第226位缬氨酸突变为精氨酸。

3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。

4.一种权利要求3所述编码基因构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以甲醇为助剂，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～60℃、150～500rpm/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酰胺。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于转化体系中底物的加入终浓度以缓冲液体积计为20-100mM，催化剂的用量以湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为5-20g/L；所述甲醇体积加入量为缓冲液体积的2-8％。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于缓冲液为pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：含腈水解酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养8-10h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃、180rpm条件下诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体细胞，即为湿菌体。