CN113755477A - 腈水解酶突变体及其在制备苯乙酮酸类化合物中的应用 - Google Patents

腈水解酶突变体及其在制备苯乙酮酸类化合物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在苯乙酮酸类化合物合成中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第144位色氨酸或第191位酪氨酸进行单突变或双突变获得的。本发明所述的腈水解酶突变体较未突变的野生型腈水解酶酶活(1.2U/L)显著提高，达到达到了162.5U/L；催化苯甲酰腈水解生产苯乙酮酸，原料转化率最高可达96％，具有非常大的工业应用前景。

Description

腈水解酶突变体及其在制备苯乙酮酸类化合物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种腈水解酶，特别涉及腈水解酶及其突变体在合成苯乙酮酸类化合物中的应用。
背景技术
α-酮酸类化合物是化学合成中重要的中间体，经过氧化和氨化可以制备一系列非天然α-氨基酸，进而用于合成多种重要的医药中间体。苯乙酮酸(Phenylglyoxylic acid，PGA)又名苯甲酰甲酸，属于α-酮酸类化合物，是一种重要的合成砌块，以苯乙酮酸为原料可直接合成50多种化学原药。例如治疗胃酸胃溃疡用药胃长宁(Glycopyrronium Bromide)、治疗脑血管病抗栓用药环扁桃酯(Cyclandelate)、治疗尿多尿频的解痉药尿多灵(Oxybutynin)、抗胆碱药阿托品(Atropine)等；这些药物是苯乙酮酸先与相应的醇成酯，再与格氏试剂反应制备。另一类则是苯乙酮酸先与相应的胺反应成酰胺，然后再环合制备，例如中枢神经兴奋药匹莫林(Pemo1ine)、抗抑郁药米氮平(Mirtazapine)等。苯乙酮酸还可以作为农药中间体，主要是合成三嗪酮类除草剂。例如苯嗪草酮(Metamitron)和苯嗪净(Aglypt)等。
由于苯乙酮酸容易氧化、脱羧和脱羰，因而它的合成较为困难，已报道的合成方法主要有苯甲酰腈水解法、苯乙烯氧化法、扁桃酸氧化法、傅克酰化法和生物催化合成法。化学合成法目前并没有能实现大规模工业化生产，是由于其反应条件苛刻、使用高毒催化剂、三废排放高、过程收率底等问题。生物催化法与传统的化学催化法相比，具有选择性强、反应条件温和、环境友好及对设备要求低等优势，随着环境问题日益突出，绿色、环保的生物催化法更具开发潜力。中国专利CN107513525B公开了一种利用D-扁桃酸脱氢酶、以R-扁桃酸为原料制备苯乙酮酸的方法，原料转化率达到98％以上，产品纯度达到99％以上。但此方法的缺点是原料R-扁桃酸本身价格高昂，而且D-扁桃酸脱氢酶的催化需要消耗辅酶NAD+，这导致此方法生产苯乙酮酸成本较高，与化学法相比没有显著的竞争优势。
腈水解酶(EC 3.5.5.1)是腈转化酶家族中一类重要的工业用酶，其主要功能在于水解腈类化合物生成相应的羧酸，是合成苯乙酮酸及其衍生物的潜在生物催化剂，具有反应条件温和、无需添加昂贵的辅酶、工艺操作便捷、过程绿色环保等优势。腈水解酶已被广泛应用，但能够催化苯甲酰腈生成相应的苯乙酮酸的腈水解酶还未见报导。为解决这一问题，现主要是利用以下几种方法，筛选新的腈水解酶，并通过蛋白质工程改变腈水解酶的底物特异性和催化活性，从而获得腈水解酶突变体，以适应更广泛的应用。
发明内容
本发明目的是定向进化的方法对腈水解酶基因进行改造，使改造后的腈水解酶针对苯甲酰腈的酶活性有所提高，使其符合在催化生产苯乙酮酸工业化应用的需求。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将来源于粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)的野生型腈水解酶(AfNLase)氨基酸序列(SEQ ID NO.2所示)的第144位色氨酸或第191位酪氨酸进行单突变或双突变获得的。
具体的，所述突变体之一是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第144位色氨酸突变为丙氨酸，突变体腈水解酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述另一突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第191位酪氨酸突变为丙氨酸，突变体腈水解酶氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
进一步，将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第191酪氨酸突变为丙氨酸，获得两点组合突变体，突变体腈水解酶氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还涉及一种由所述腈水解酶突变体构建的重组载体。
本发明提供一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
此外，本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在水解苯甲酰腈类化合物制备苯乙酮酸类化合物中的应用，以含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱培养获得的湿菌体为酶源，以外苯甲酰腈类化合物为底物，以pH为7.5的PB缓冲液为反应介质，在水浴控温、磁力搅拌条件下进行水解反应(反应过程中优选流加4M NaOH维持反应液pH为7.5)。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含有相关基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.5mM，28℃下诱导培养16-18h。培养结束后，将培养液4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。
单点突变的腈水解酶AfNLase-W144A(氨基酸序列为SEQ ID NO.3)和AfNLase-Y191A(氨基酸序列为SEQ ID NO.4)的催化活力较野生型的酶活(1.2U/L)均有显著提高，分别达到了59.7U/L和48.9U/L；两点组合突变的腈水解酶AfNLase-W144A/Y191A(氨基酸序列为SEQ ID NO.5)酶活更是较野生型提高了135倍，达到了162.5U/L。
附图说明
图1为本发明腈水解酶在催化苯甲酰腈类化合物水合反应生成苯乙酮酸类化合物的反应式；
图2为野生型和突变型腈水解酶摇瓶培养生物量和酶活测定结果。
具体实施方式
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。本发明所涉及表达酶基因的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，以及所用载体为pET-28a(+)购自TAKARA公司。下游催化工艺所用试剂：苯甲酰腈、苯乙酮酸，购自阿拉丁化学试剂有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。
采用高效液相色谱(HPLC)检测过程中苯乙酮酸的生成，色谱仪：安捷伦1260；色谱柱型号：
Figure BDA0003237456920000031
QS-C18,5μm,4.6mm×250mm；流动相：0.5％乙酸:乙腈＝12:88；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。
实施例1
一、构建野生型腈水解酶重组表达菌株
委托北京擎科新业生物技术有限公司提供密码子优化和基因合成服务，来源于粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)的野生型腈水解酶(AfNLase)基因，基因序列如SEQ IDNO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将这一基因克隆于pET-28a(+)质粒上的酶切位点EcoRI和HindIII之间，获得pET-28a(+)-AfNLase重组质粒。将重组质粒pET-28a(+)-AfNLase转染到宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase。
使用LB培养基对基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase进行活化与培养。LB培养基的具体配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％的琼脂。活化与培养方案为：将保存有工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase的甘油管划线至LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)平皿上，37℃静置培养12h。从平皿上挑取单菌落接入含50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃、200rpm培养12h。在获得培养液后，根据质粒提取试剂盒的操作说明书进行质粒的提取。
二、构建腈水解酶突变体表达菌株
以步骤一中提取的pET-28a(+)-AfNLase质粒为模版，通过全质粒PCR向AfNLase基因引入定点突变，所用引物及PCR反应体系分别见表1、表2。
表1 PCR所用引物
引物 序列(5’-3’)
W144A-F AAGCTGACGCAGGCCAACGGTG
W144A-R GTTGGCTGCGGTCAGCTTTTCAGC
Y191A-F GTTGCCAGCGCAATTGCCTTGCCCG
Y191A-R GGCAATTGCGCTGGCAACGTGGAC
表2 PCR扩增体系
Figure BDA0003237456920000051
以pET-28a(+)-AfNLase质粒为模板，用表1所示引物进行点突变PCR，PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件：
1)预变性：98℃5min；
2)变性：98℃10s；退火：60℃15s；延伸：72℃1min 30s；共循环35次；
3)延伸：72℃10min；
4)4℃保存2.0h。
PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，目标条带用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收。回收得到的PCR产物用DPN I消化，去除模板。消化体系如表3所示。
表3消化体系
试剂 体积(μL)
PCR扩增产物/质粒 8.5
DPNI 0.5
10×Buffer 1.0
消化条件：
1)37℃：1h；
2)75℃：15min；
3)4℃保存2.0h。
消化后产物化转导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，然后，由北京擎科新业生物技术有限公司测序，将测序结果正确的质粒进行表达，获得重组菌株。最终得到单点突变的腈水解酶突变体AfNLase-W144A(氨基酸序列为SEQ ID NO.3)和AfNLase-Y191A(氨基酸序列为SEQ ID NO.4)，其表达菌株分别为E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A和E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-Y191A。
然后提取质粒pET-28a(+)-AfNLase-W144A，并以其为模版、以Y191A-F和Y191A-R为引物进行全质粒PCR，向AfNLase-W144A基因引入定点突变，操作方法与之前单点突变一致。最终得到两点组合突变的腈水解酶突变体AfNLase-W144A/Y191A，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，其表达菌株为E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A/Y191A。
实施例2
一、工程菌的培养
将含有相关基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mLKan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.5mM，28℃下诱导培养16-18h。培养结束后，将培养液4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。
二、酶活力的测定
将培养结束后收集到的菌体细胞，用0.25M PB缓冲液(pH 7.5)洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于2倍发酵液体积的0.25M PB缓冲液(pH 7.5)中，超声破胞，得到粗酶液用于后续测定。
酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
腈水解酶酶活测定体系：总体系为5mL，反应介质为pH 7.5的0.25M磷酸盐缓冲液，底物为4320μL 10g/L苯甲酰腈，加入430μL粗酶液，40℃下反应5min后，加入250μL4 mol/L盐酸终止反应。取反应液1mL，12000rpm离心3min，取上清液进高效液相色谱仪分析。
野生型和突变型腈水解酶菌株生长和酶活测定结果如附图2所示，结果表明，单点突变的腈水解酶AfNLase-W144A和AfNLase-Y191A酶活较野生型的酶活(1.2U/L)均有显著提高，分别达到了59.7U/L和48.9U/L；两点组合突变的腈水解酶AfNLase-W144A/Y191A酶活更是较野生型提高了将近135倍，达到了162.5U/L。
实施例3基因工程菌催化苯甲酰腈生成苯乙酮酸
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取0.5g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；称取2.0g苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度40℃进行水解反应，用4M NaOH控制反应pH＝7.5。反应8h之后用液相色谱检测反应体系中苯甲酰腈和苯乙酮酸的含量。底物转化率93％，苯乙酮酸浓度为10.6g/L。
实施例4基因工程菌催化苯甲酰腈生成苯乙酮酸
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-Y191A的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取0.5g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；称取2.0g苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应，用4M NaOH控制反应pH＝7.5。反应17h之后用液相色谱检测反应体系中苯甲酰腈和苯乙酮酸的含量。底物转化率大于91％，苯乙酮酸浓度为10.4g/L。
实施例5基因工程菌催化苯甲酰腈生成苯乙酮酸
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A/Y191A的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取0.5g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；称取10.0g苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度30℃进行水解反应，用4M NaOH控制反应pH＝7.5。反应24h之后用液相色谱检测反应体系中苯甲酰腈和苯乙酮酸的含量。底物转化率96％，苯乙酮酸浓度为55.0g/L。
实施例6基因工程菌催化2-氯苯甲酰腈生成2-氯苯乙酮酸
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A/Y191A的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取2.0g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；称取1.0g 2-氯苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应。反应24h之后用液相色谱检测反应体系中2-氯苯甲酰腈和2-氯苯乙酮酸的含量。底物转化率7.8％，2-氯苯乙酮酸浓度为0.43g/L。
实施例7基因工程菌催化3-甲基苯甲酰腈生成3-甲基苯乙酮酸
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A/Y191A的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取1.0g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；称取0.5g 3-甲基苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应。反应24h之后用液相色谱检测反应体系中3-甲基苯甲酰腈和3-甲基苯乙酮酸的含量。底物转化率16％，3-甲基苯乙酮酸浓度为0.45g/L。
实施例8基因工程菌催化4-羟基苯甲酰腈生成4-羟基苯乙酮酸
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase-W144A/Y191A的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，称取5.0g湿菌体用200mL 0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；称取0.5g 4-羟基苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应。反应24h之后用液相色谱检测反应体系中4-羟基苯甲酰腈和4-羟基苯乙酮酸的含量。底物转化率32％，4-羟基苯乙酮酸浓度为0.90g/L。
对比例
取实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-AfNLase的发酵液，4000rpm，10min离心收集菌体，分别称取5.0g湿菌体用200mL0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬破胞，获得粗酶液加入到250mL圆底烧瓶中；分别称取0.5g的2-氯苯甲酰腈、3-甲基苯甲酰腈、4-羟基苯甲酰腈加进烧瓶，开启磁力搅拌，水浴控制反应温度35℃进行水解反应。反应48h之后，用液相色谱检测反应体系中对应产物的含量，未检测到对应产物的生成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海晖胧生物医药有限公司
<120> 腈水解酶突变体及其在制备苯乙酮酸类化合物中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1032
<212> DNA
<213> 粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)
<400> 1
atgatgctgg aattgcgtca gttcaaggcc gccgccgttc aggcagcgcc tgtgttcctg 60
gacacgaatg cgaccatcga gaaagtatgt cgtctgatca atgaagcagc cgacaacggt 120
gccgagctga tcgcctttcc cgaggtgttc gtctccggtt acccctactg gagctgggtg 180
atgaacccga tcgagggcag cccgtggttc gagcgcctgt gcaaatcggc catcgaagtg 240
cccggtcccg agatccagaa ggttgcgcag gtttgccgcc agcgcaaggt caatgtggtg 300
ttgggtgtga acgagcgcag tcccgttggc atcggcacca tttacaacac gctggtcacc 360
atcggtgccg atggccgcat tctgggtcgt caccgcaaac tggttccaac ctgggctgaa 420
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cgttttgacg tgtttgacct gcgtgtgaat cgcaaggcgc tgacccctgc ccgcttttac 960
gaaggcgatg ccgcgtccca gccagacctg aatcctgccg agttctccgt tctggacgac 1020
aaggaagtgt aa 1032
<210> 2
<211> 343
<212> PRT
<213> 粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)
<400> 2
Met Met Leu Gly Leu Ala Gly Pro Leu Ala Ala Ala Val Gly Ala Ala
1 5 10 15
Pro Val Pro Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ile Gly Leu Val Cys Ala Leu
20 25 30
Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ile Ala Pro Pro Gly
35 40 45
Val Pro Val Ser Gly Thr Pro Thr Thr Ser Thr Val Met Ala Pro Ile
50 55 60
Gly Gly Ser Pro Thr Pro Gly Ala Leu Cys Leu Ser Ala Ile Gly Val
65 70 75 80
Pro Gly Pro Gly Ile Gly Leu Val Ala Gly Val Cys Ala Gly Ala Leu
85 90 95
Val Ala Val Val Leu Gly Val Ala Gly Ala Ser Pro Val Gly Ile Gly
100 105 110
Thr Ile Thr Ala Thr Leu Val Thr Ile Gly Ala Ala Gly Ala Ile Leu
115 120 125
Gly Ala His Ala Leu Leu Val Pro Thr Thr Ala Gly Leu Leu Thr Thr
130 135 140
Ala Ala Gly Ala Ala Ser Ser Met Ala Val His Ala Thr Thr Ile Gly
145 150 155 160
Pro Leu Gly Ala Leu Ala Cys Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu Ala Ala
165 170 175
Pro Ser Leu Leu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Val Ala Ser Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Pro Val Ala Pro Leu Ala Thr Ala Met Ala Gly Ala Ile Ala
195 200 205
Leu Ala Ala Ala Ala His Cys Pro Gly Gly Leu Val Pro Thr Val Val
210 215 220
Ala Cys Ser Thr Val Ser Gly Gly Ile Ile Gly Ala Met Ser Ala Ser
225 230 235 240
His Pro Gly Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser
245 250 255
Gly Ile Ile Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Gly Gly Ala Leu Ile Ala
260 265 270
Leu Gly Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ile Ala Leu Ser Ala Cys Ile Gly
275 280 285
Pro Ala Gly Met His Ala Ile Thr Gly His Thr Ala Ala Pro Ala Val
290 295 300
Pro Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Thr Pro Ala Ala Pro Thr
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Ala Ser Gly Pro Ala Leu Ala Pro Ala Gly Pro Ser
325 330 335
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<211> 343
<212> PRT
<213> 粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)
<400> 3
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1 5 10 15
Pro Val Pro Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ile Gly Leu Val Cys Ala Leu
20 25 30
Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ile Ala Pro Pro Gly
35 40 45
Val Pro Val Ser Gly Thr Pro Thr Thr Ser Thr Val Met Ala Pro Ile
50 55 60
Gly Gly Ser Pro Thr Pro Gly Ala Leu Cys Leu Ser Ala Ile Gly Val
65 70 75 80
Pro Gly Pro Gly Ile Gly Leu Val Ala Gly Val Cys Ala Gly Ala Leu
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Val Ala Val Val Leu Gly Val Ala Gly Ala Ser Pro Val Gly Ile Gly
100 105 110
Thr Ile Thr Ala Thr Leu Val Thr Ile Gly Ala Ala Gly Ala Ile Leu
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Gly Ala His Ala Leu Leu Val Pro Thr Thr Ala Gly Leu Leu Thr Ala
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Ala Ala Gly Ala Ala Ser Ser Met Ala Val His Ala Thr Thr Ile Gly
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165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
His Pro Gly Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser
245 250 255
Gly Ile Ile Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Gly Gly Ala Leu Ile Ala
260 265 270
Leu Gly Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ile Ala Leu Ser Ala Cys Ile Gly
275 280 285
Pro Ala Gly Met His Ala Ile Thr Gly His Thr Ala Ala Pro Ala Val
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Pro Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Thr Pro Ala Ala Pro Thr
305 310 315 320
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<213> 粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)
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Val Pro Val Ser Gly Thr Pro Thr Thr Ser Thr Val Met Ala Pro Ile
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130 135 140
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145 150 155 160
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245 250 255
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcaattgcg ctggcaacgt ggac 24

Claims (6)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第144位色氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；(2)将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第191位酪氨酸突变为丙氨酸氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示；(3)将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第191位酪氨酸突变为丙氨酸氨酸，氨基酸序列为SEQID NO.5所示。
2.一种由权利要求1所述腈水解酶突变体构建的重组载体。
3.一种由权利要求2所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在水解苯甲酰腈类化合物制备苯乙酮酸类化合物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的苯甲酰腈类化合物的化学式如式I所示；所述苯乙酮酸类化合物的化学式如式II所示；
Figure FDA0003237456910000011
式I和式II中：R选自H，CH3，Cl或者OH。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的苯甲酰腈类化合物的化学包括苯甲酰腈，2-氯苯甲酰腈，3-甲基苯甲酰腈，4-羟基苯甲酰腈。
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