CN111411067A - 一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法 - Google Patents

一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产2,5‑二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，在一种高产L‑苏氨酸的大肠杆菌K‑12中过表达L‑苏氨酸脱氢酶TDH并异源表达来源于乳球菌属微生物的NADH氧化酶NoxE和来源于链球菌属微生物的氨基丙酮氧化酶AAOSO，同时敲除2‑氨基‑3‑酮丁酸CoA连接酶KBL和伯胺氧化酶TynA。从而构建出新的、高效的2,5‑二甲基吡嗪合成途径，并解决重组菌中辅因子不平衡问题。以大肠杆菌E.coli THR为例，重组菌经36h摇瓶发酵实验，2,5‑二甲基吡嗪积累量达1.2±0.2g/L。此发明以L‑苏氨酸高产菌为出发菌，成功重建了大肠杆菌中2,5‑二甲基吡嗪合成途径，改善了胞内辅因子不平衡的缺点，为选育2,5‑二甲基吡嗪提供了新的思路。

Description

一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
2,5-二甲基吡嗪，呈刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油气味，是一种重要的香味化合物和药物中间体。其存在于咖啡、花生等50多种天然食品中。作为食品香料时，只添加1-2ppm，就可起到明显的增香作用，是国标GB2760-86规定为允许使用的香精。同时，其还是合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪、新一代长效降血脂药阿昔莫司(Acipimox)以及治疗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(PAE)等一系列药物的原料或药物中间体。因此，摸索新的2,5-二甲基吡嗪经济高效的生产方法无疑是非常重要的。
2,5-二甲基吡嗪的生产方法主要有化学合成法，添加前体物质发酵法，直接发酵法等。原本由于2,5-二甲基吡嗪的生物合成机制未完全明晰，难以通过人工定向手段选育可用于大规模生产的高产菌株，使得目前化学合成法仍是2,5-二甲基吡嗪的主要生产方法。但近年来，随着其在部分微生物中代谢途径的完全解析，人工定向选育2,5-二甲基吡嗪高产菌株已成为可能。加之生物发酵法相对于化学合成法有着反应条件温和，环境友好等优点，其已成为替代2,5-二甲基吡嗪化学合成生产方法的候补选项。而在已有文献报道的生物发酵法中，多为在液体或固体培养基中添加前体物质L-苏氨酸进行发酵的生物转化法，未见以廉价碳源为底物的直接发酵法，不仅成本高，而且转化率低。
近年来的文献报道明确揭示出了2,5-二甲基吡嗪在枯草芽孢杆菌中的合成机制：代谢途径从L-苏氨酸开始，经L-苏氨酸脱氢酶TDH催化生成L-2氨基乙酰乙酸；再经自发脱羧反应，形成相对稳定的α-氨基丙酮；每两个α-氨基丙酮再经过脱水缩合成环状的3,6-二氢-2,5-二甲基吡嗪，进而被氧化脱氢，生成2,5-二甲基吡嗪。其中，L-苏氨酸脱氢酶TDH是整个生化反应的关键限速酶，之后的反应都是可自发完成的。因而筛选一种高活性的L-苏氨酸脱氢酶对于2,5-二甲基吡嗪的生产极为重要。另外，α-氨基丙酮虽然会发生自发的关环反应，但过程中存在其他副反应，生成二级胺HN(CH2COCH3)2、三级胺N(CH2COCH3)3以及2,6-二甲基吡嗪等副产物，影响下游分离和产品纯度。
除了主代谢通路，2,5-二甲基吡嗪代谢途径中还存在着其他支路。在大肠杆菌K-12中主要存在两条：(1)2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶KBL会催化L-2氨基乙酰乙酸向甘氨酸反应。(2)伯胺氧化酶会催化α-氨基丙酮脱氨向丙酮醛反应。两条支路的分流都会影响2,5-二甲基吡嗪的合成，降低产率和产量。
另外辅因子循环也是影响2,5-二甲基吡嗪合成的关键因素之一。每合成1mol 2,5-二甲基吡嗪，L-苏氨酸脱氢酶都会消耗2mol NADP+/NAD+产生2mol NADPH/NADH。NADP+/NAD+在2,5-二甲基吡嗪发酵过程中发挥多种生理功能，如调节胞内氧化还原水平，影响众多基因表达，细胞功能，代谢途径和物质跨膜运输等。所以NADP+/NAD+不仅要满足菌体的生长还要满足2,5-二甲基吡嗪合成需求。而胞内NADP+/NAD+供应与消耗的不平衡，将会影响2,5-二甲基吡嗪合成。
发明内容
为解决上述问题，本发明以高产苏氨酸的大肠杆菌K-12为出发菌，通过构建L-苏氨酸脱氢酶种间进化树，挑选并检测不同种L-苏氨酸脱氢酶活性，筛选得更高活性的酶并在出发菌中表达，提高关键限速步骤的反应速率。其次异源表达了来源于乳球菌属微生物的NADH氧化酶，改善了重组菌中辅因子不平衡的缺点。接着，为减少副产物产量并加快α-氨基丙酮正确闭环反应，异源表达了来源于链球菌属微生物的氨基丙酮氧化酶。同时，敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA以聚拢碳流。最终，获得了高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌株。首次实现了以葡萄糖为底物直接发酵生产2,5-二甲基吡嗪。
本发明的第一个目的是提供一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌，所述的重组菌以大肠杆菌K-12为宿主，过表达了L-苏氨酸脱氢酶，并异源表达了NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶，同时敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA。
进一步地，所述的大肠杆菌K-12包括E.coli THR、E.coli THR1、E.coli THR2、E.coli THR3、E.coli THR4、E.coli THR5或E.coli THR6。
其中，E.coli THR、E.coli THR1、E.coli THR2、E.coli THR3、E.coli THR4、E.coli THR5和E.coli THR6记载在已发表的文献中，已发表的文献为《产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能》魏佳等，微生物学通报；并保藏于江南大学工业生物技术教育部重点实验室中。
进一步地，所述的L-苏氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌K-12，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸脱氢酶；
(2)具有L-苏氨酸脱氢酶活性的同工酶。
进一步地，所述NADH氧化酶来源于乳球菌属微生物，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的NADH氧化酶；
(2)具有NADH氧化酶活性的同工酶。
进一步地，所述的氨基丙酮氧化酶来源于链球菌属微生物，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基丙酮氧化酶；
(2)具有氨基丙酮氧化酶活性的同工酶。
进一步地，所述的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
进一步地，所述的伯胺氧化酶基因tynA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述的苏氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶是以pEC-XK99E质粒作为表达载体。
本发明的第二个目的是提供所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA的敲除：以大肠杆菌K-12为宿主，采用λ-red同源重组系统将基因kbl替换为两端带有FRT的标记基因后，利用FLP重组酶消除标记基因，再用同样的方法敲除基因tynA；
(2)重组质粒构建：tdh基因、noxE基因和aaoso基因的前端分别加上SD结合序列TAAGGAGGAAAAAAAA，再依次酶切连接至质粒pEC-XK99E的启动子后得到重组质粒；
(3)重组菌构建：将重组质粒导入敲除基因kbl和基因tynA的大肠杆菌宿主中，筛选得到所述的重组菌。
本发明的第三个目的是提供所述的重组菌发酵生产2,5-二甲基吡嗪的方法，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，35～38℃，50～200r·min-1培养8-10h；以8～12％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35～38℃，50～200r·min-1培养至5～7h时加IPTG，再培养25～35h结束发酵。
进一步地，所述的种子培养基为：蛋白胨8～12g/L，酵母膏4～6g/L。
进一步地，所述的发酵培养基为：葡萄糖25～35g/L，(NH4)2SO4 10～20g/L，KH2PO41～3g/L，MgSO4·4H2O 0.3～0.5g/L，KCl 0.5～0.7g/L，FeSO4·7H2O 40～60mg/L，MnSO4·4H2O 40～60mg/L，玉米浆/玉米浆干粉0.4～0.6g/L，甜菜糖蜜15～20ml/L，甜菜碱0.5～1.5g/L，消泡剂0.4～0.6ml/L，CaCO3 8～12g/L，用NaOH调至pH＝7.0～7.5。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌在医药工业或食品工业中的应用。
本发明的有益效果：
本发明以一株苏氨酸高产的大肠杆菌K-12为出发菌，通过过表达L-苏氨酸脱氢酶TDH，延长其代谢途径，实现了2,5-二甲基吡嗪的合成。又异源表达来源于乳球菌属微生物(如L.lactis)的NADH氧化酶NoxE和来源于链球菌属微生物(如S.oligofermentans)的氨基丙酮氧化酶AAOSO，从而改善了新构建的2,5-二甲基吡嗪合成途径中辅因子不平衡的缺点，减少了代谢副产物并促进代谢流通畅。然后敲除了出发菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶KBL和伯胺氧化酶TynA，聚拢碳流。最终，获得了一株能以葡萄糖为底物高产2,5-二甲基吡嗪的重组菌株。
附图说明
图1：由葡萄糖生成2,5-二甲基吡嗪代谢途径及其关键酶基因
缩写说明：TDH，L-苏氨酸脱氢酶；NoxE，NADH氧化酶；AAOSO，氨基丙酮氧化酶；KBL，2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶；TynA，伯胺氧化酶。
图2：出发菌株和重组菌株发酵生产2,5-二甲基吡嗪发酵过程曲线
图形说明：空心图形均为出发菌E.coli THR,实心图形均为重组菌E.coli THR△kbl△tynA/pEC-XK99E-tdh-noxE-aaoso。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中以大肠杆菌E.coli THR为例。
底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：发酵液中葡萄糖实时检测通过SBA-40B生物传感分析仪测定。2,5-二甲基吡嗪产物实时监测采用高效液相色谱仪(HLPC)测定，采用高效液相色谱仪测定标准样品和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中待测物质进行定性与定量检测。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD600nm。
表1：实施例中所用到的引物(下划线为酶切位点)
Figure BDA0002446183970000061
实施例1：重组质粒pEC-XK99E-tdh-noxE-aaoso的构建
根据GenBank中E.coli K-12tdh基因序列(GenBank accession number U00096REGION:3790320..3791345)。在其基因上下游分别加入限制性内切酶EcoR I和Kpn I酶切位点序列，同时在其上游加入大肠杆菌SD识别序列TAAGGAGGAAAAAAAA后，用以设计引物tdh-F和tdh-R。用引物tdh-F和tdh-R以大肠杆菌K-12基因组为模板进行PCR，并胶回收获得目的基因片段。随后，采用限制性内切酶EcoR I和Kpn I酶切质粒pEC-XK99E和目的基因tdh片段，并采用产物纯化试剂盒纯化线性pEC-XK99E和tdh片段。将回收后的线性pEC-XK99E和tdh片段用T4DNA连接酶酶连后，化转至JM109中，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证。验证正确后的质粒命名为pEC-XK99E-tdh。
根据GenBank中Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363 noxE基因序列(GenBank accession number AM406671REGION:401822..403162)，在其上游加入大肠杆菌SD识别序列TAAGGAGGAAAAAAAA，将组合好的序列提交给苏州金唯智生物科技有限公司根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。基因合成并连接至质粒pEC-XK99E-tdh的酶切位点KpnI和BamHI间获得重组质粒pEC-XK99E-tdh-noxE。
根据GenBank中Streptococcus oligofermentans aaoso基因序列(GenBankaccession number EU495328)，在其上游加入大肠杆菌SD识别序列TAAGGAGGAAAAAAAA，将组合好的序列提交给苏州金唯智生物科技有限公司根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。基因合成并连接至质粒pEC-XK99E-tdh-noxE的酶切位点BamHI和Xba I间获得重组质粒pEC-XK99E-tdh-noxE-aaoso。
实施例2：出发菌E.coli THR 2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA的敲除
第一步用kan基因置换待敲除靶基因：使用pKD13作为PCR模板，将引物Δkbl-F和Δkbl-R扩增获得DNA片段(包括kbl的上游和下游同源臂序列、kan基因和2个FRT位点)，用1mm电击杯，在1800V电压下转化入E.coli/pKD46感受态细胞中。电击后，将细胞在37℃复育2h后涂布在LBK25平板上。pKD46在阿拉伯糖的诱导下表达重组蛋白，介导敲除框同源臂基因和大肠杆菌基因组发生重组。培养12h后挑取单个菌落，使用引物kbl-F和kbl-R进行PCR扩增，这对引物设计在kbl基因内部，若PCR得不到kbl基因片段，则判定kbl敲除成功。
第二步消除kan基因和pCP20质粒：为了达到消除kan基因的目的，需要温敏型质粒pCP20携带并编码的FLP重组酶，该酶可以介导2个FRT位点之间的切除。电转pCP20质粒进入E.coli THRΔkbl:kan菌株中，在42℃培养12h后稀释并涂布在LB固体培养基上。挑取单个菌落，分别点种在LBK25平板和LB平板，37℃培养12h，挑取仅能在LB平板上生长的单菌落用引物Δkbl-YF和Δkbl-YR进行PCR验证，片段大小正确即为E.coli THRΔkbl。
用同样的方法敲除tynA。由于tynA基因大小与kan基因相差较大，第一步可以省去引物tynA-F和tynA-R，直接使用引物ΔtynA-YF和ΔtynA-YR PCR第一步得到的单菌落，若得到的PCR产物经过凝胶电泳大小与基因tynA不同，且符合kan基因大小，则敲除成功。
实施例3：重组菌和出发菌株中的苏氨酸脱氢酶TDH、NADH氧化酶NoxE、氨基丙酮氧化酶AAOSO酶活力测定
TDH的测定：取冷冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡培养10h，按1％接种量放大培养至100ml含卡纳霉素(50μg/ml)的LB三角瓶(500ml)中，并于37℃、100rpm条件下诱导培养16h，4℃、8000rpm离心收集菌体。收集的菌体用0.85％生理盐水洗涤2次。随后，将菌体悬浮于含150mmol/L NaCl的Tris-HCI缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)中并超声波破碎制备粗酶液。TDH酶活测定:NADH在340nm处有最大吸光值，TDH活力通过检测反应过程中NADH在340nm处吸光值的变化计算。酶反应体系：总体系200μl，其中50mmol/L Tris-HCI缓冲液(pH10.0)，100μl；20mmol/L NAD+溶液，20μl；100mmol/L苏氨酸溶液，20μl，37℃恒温10min，加入60μl粗酶液；于37℃、100rpm反应4h。酶活单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量。经测定，重组菌具有TDH酶活力，而出发菌株不具有TDH酶活力，结果如表2所示。
NoxE的测定：取冷冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡培养10h，按1％接种量放大培养至100ml含卡纳霉素(50μg/ml)的LB三角瓶(500ml)中，并于37℃、100rpm条件下诱导培养16h，4℃、8000rpm离心收集菌体。收集的菌体用10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗涤2次。随后，将菌体悬浮于含有2mmol/L MgCl2和1mmol/L二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH 7.5)中并超声波破碎制备粗酶液。NoxE酶活测定:NADH在340nm处有最大吸光值，NoxE活力通过检测反应过程中NADH在340nm处吸光值的变化计算。酶反应体系：1ml含有0.3mmol/L NADH和0.3mmol/L EDTA的50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，25℃恒温10min，加入10μl粗酶液；于25℃、100rpm反应10min。酶活单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量。经测定，重组菌具有NoxE酶活力，而出发菌株不具有NoxE酶活力，结果如表2所示。
AAOSO的测定：取冷冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡培养10h，按1％接种量放大培养至100ml含卡纳霉素(50μg/ml)的LB三角瓶(500ml)中，并于37℃、100rpm条件下诱导培养16h，4℃、8000rpm离心收集菌体。收集的菌体用50mmol/L Tris-HCI缓冲液(pH 8.0)洗涤2次。随后，将菌体悬浮于50mmol/L Tris-HCI缓冲液(pH 8.0)中并超声波破碎制备粗酶液。NoxE酶活测定:AAOSO催化α-氨基丙酮成环的同时会产生过氧化氢，每消耗2分子的α-氨基丙酮就会生成2分子的过氧化氢生成一分子的3,6-二甲基-二氢吡嗪。而过氧化氢会和4-氨基-安替比林以及苯酚在HRP(辣根过氧化物酶)的催化下生成红色的亚醌类化合物，该物质在505nm下有最大吸收峰。酶反应体系：总反应体系1.5ml，含133μg蛋白，12.5mmolα-氨基丙酮，Tris-HCI缓冲液终浓度20mmol/L，pH8.0。于37℃，100rpm反应30min。每650μl反应液加入600ul含有1.5mmol/L 4-氨基-安替比林和苯酚的溶液，室温反应4min后加入终浓度5U/ml的HRP，室温孵育4min后于505nm检测吸光度值。经测定，重组菌具有AAOSO酶活力，而出发菌株不具有AAOSO酶活力，结果如表2所示。
表2：出发菌株和重组菌株TDH、NoxE和AAOSO酶活力测定
Figure BDA0002446183970000091
实施例4：重组菌E.coli THR△kbl△tynA/pEC-XK99E-tdh-noxE-aaoso和出发菌E.coli THR发酵产2,5-二甲基吡嗪情况
培养基：①种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，121℃20min。②发酵培养基葡萄糖30g/L，(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·4H2O 0.4g/L，KCl 0.6g/L，FeSO4·7H2O50mg/L，MnSO4·4H2O 50mg/L，玉米浆/玉米浆干粉0.5g/L，甜菜糖蜜18ml/L，甜菜碱1g/L，消泡剂0.5ml/L，CaCO3 10g/L，pH 7.3-7.5，115℃10min；
将上述经验证的重组菌E.coli△kbl△tynA/pEC-XK99E-tdh-noxE-aaoso和出发菌株分别进行摇瓶发酵实验。从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环大肠杆菌(出发菌和重组菌)接种到50mL装液量250mL液体种子培养基，4层纱布封口，37℃，100r·min-1培养8-10h；以10％接种量将种子培养液转接至50/250mL发酵培养基，37℃，100r·min-1培养至6h时加IPTG，再培养30h结束发酵。
分时间段测定2,5-二甲基吡嗪，残糖及其生物量，结果与出发菌株相比，结果如图2所示。
重组菌经摇瓶发酵实验，2,5-二甲基吡嗪积累量达1.2±0.2g/L，而出发菌株未检测到2,5-二甲基吡嗪，野生型大肠杆菌K-12中2,5-二甲基吡嗪的产量也极微量。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 341
<212> PRT
<213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655
<400> 1
Met Lys Ala Leu Ser Lys Leu Lys Ala Glu Glu Gly Ile Trp Met Thr
1 5 10 15
Asp Val Pro Val Pro Glu Leu Gly His Asn Asp Leu Leu Ile Lys Ile
20 25 30
Arg Lys Thr Ala Ile Cys Gly Thr Asp Val His Ile Tyr Asn Trp Asp
35 40 45
Glu Trp Ser Gln Lys Thr Ile Pro Val Pro Met Val Val Gly His Glu
50 55 60
Tyr Val Gly Glu Val Val Gly Ile Gly Gln Glu Val Lys Gly Phe Lys
65 70 75 80
Ile Gly Asp Arg Val Ser Gly Glu Gly His Ile Thr Cys Gly His Cys
85 90 95
Arg Asn Cys Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Cys Arg Asn Thr Ile Gly
100 105 110
Val Gly Val Asn Arg Pro Gly Cys Phe Ala Glu Tyr Leu Val Ile Pro
115 120 125
Ala Phe Asn Ala Phe Lys Ile Pro Asp Asn Ile Ser Asp Asp Leu Ala
130 135 140
Ala Ile Phe Asp Pro Phe Gly Asn Ala Val His Thr Ala Leu Ser Phe
145 150 155 160
Asp Leu Val Gly Glu Asp Val Leu Val Ser Gly Ala Gly Pro Ile Gly
165 170 175
Ile Met Ala Ala Ala Val Ala Lys His Val Gly Ala Arg Asn Val Val
180 185 190
Ile Thr Asp Val Asn Glu Tyr Arg Leu Glu Leu Ala Arg Lys Met Gly
195 200 205
Ile Thr Arg Ala Val Asn Val Ala Lys Glu Asn Leu Asn Asp Val Met
210 215 220
Ala Glu Leu Gly Met Thr Glu Gly Phe Asp Val Gly Leu Glu Met Ser
225 230 235 240
Gly Ala Pro Pro Ala Phe Arg Thr Met Leu Asp Thr Met Asn His Gly
245 250 255
Gly Arg Ile Ala Met Leu Gly Ile Pro Pro Ser Asp Met Ser Ile Asp
260 265 270
Trp Thr Lys Val Ile Phe Lys Gly Leu Phe Ile Lys Gly Ile Tyr Gly
275 280 285
Arg Glu Met Phe Glu Thr Trp Tyr Lys Met Ala Ala Leu Ile Gln Ser
290 295 300
Gly Leu Asp Leu Ser Pro Ile Ile Thr His Arg Phe Ser Ile Asp Asp
305 310 315 320
Phe Gln Lys Gly Phe Asp Ala Met Arg Ser Gly Gln Ser Gly Lys Val
325 330 335
Ile Leu Ser Trp Asp
340
<210> 2
<211> 446
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363
<400> 2
Met Lys Ile Val Val Ile Gly Thr Asn His Ala Gly Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Asn Thr Leu Leu Glu Gln Tyr Pro Gly His Glu Ile Val Met Ile Asp
20 25 30
Arg Asn Ser Asn Met Ser Tyr Leu Gly Cys Gly Thr Ala Ile Trp Val
35 40 45
Gly Arg Gln Ile Glu Lys Pro Asp Glu Leu Phe Tyr Ala Lys Ala Glu
50 55 60
Asp Phe Glu Ala Lys Gly Val Lys Ile Leu Thr Glu Thr Glu Val Ser
65 70 75 80
Glu Ile Asp Phe Ala Asn Lys Lys Val Tyr Ala Lys Thr Lys Ser Asp
85 90 95
Asp Glu Ile Ile Glu Ala Tyr Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Ser
100 105 110
Arg Pro Ile Ile Pro Asn Leu Pro Gly Lys Asp Leu Lys Gly Ile His
115 120 125
Phe Leu Lys Leu Phe Gln Glu Gly Gln Ala Ile Asp Ala Glu Phe Ala
130 135 140
Lys Glu Lys Val Lys Arg Ile Ala Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly
145 150 155 160
Thr Glu Ile Ala Glu Ala Ala Lys Arg Arg Gly Lys Glu Val Leu Leu
165 170 175
Phe Asp Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ala Ser Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe
180 185 190
Ala Lys Gly Met Asp Glu Asn Leu Ala Gln His Gly Ile Glu Leu His
195 200 205
Phe Gly Glu Leu Ala Lys Glu Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Val
210 215 220
Ser Gln Ile Val Thr Asn Lys Ala Thr Tyr Asp Val Asp Leu Val Ile
225 230 235 240
Asn Cys Ile Gly Phe Thr Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ser Asp Lys Leu
245 250 255
Ala Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val Asp Lys His Gln Gln Ser
260 265 270
Ser Asp Pro Asp Val Tyr Ala Val Gly Asp Val Ala Thr Ile Tyr Ser
275 280 285
Asn Ala Leu Gln Asp Phe Thr Tyr Ile Ala Leu Ala Ser Asn Ala Val
290 295 300
Arg Ser Gly Ile Val Ala Gly His Asn Ile Gly Gly Lys Glu Leu Glu
305 310 315 320
Ser Val Gly Val Gln Gly Ser Asn Gly Ile Ser Ile Phe Gly Tyr Asn
325 330 335
Met Thr Ser Thr Gly Leu Ser Val Lys Ala Ala Lys Lys Leu Gly Leu
340 345 350
Glu Val Ser Phe Ser Asp Phe Glu Asp Lys Gln Lys Ala Trp Phe Leu
355 360 365
His Glu Asn Asn Asp Ser Val Lys Ile Arg Ile Val Tyr Glu Thr Lys
370 375 380
Ser Arg Arg Ile Ile Gly Ala Gln Leu Ala Ser Lys Ser Glu Ile Ile
385 390 395 400
Ala Gly Asn Ile Asn Met Phe Ser Leu Ala Ile Gln Glu Lys Lys Thr
405 410 415
Ile Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asp Leu Phe Phe Leu Pro His Phe Asn
420 425 430
Ser Pro Tyr Asn Tyr Met Thr Val Ala Ala Leu Asn Ala Lys
435 440 445
<210> 3
<211> 391
<212> PRT
<213> Streptococcus oligofermentans
<400> 3
Met Asn His Phe Asp Thr Ile Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Met
1 5 10 15
Met Ala Thr Ile Ser Ser Ser Phe Tyr Gly Gln Lys Thr Leu Leu Leu
20 25 30
Glu Lys Asn Lys Arg Leu Gly Lys Lys Leu Ala Gly Thr Gly Gly Gly
35 40 45
Arg Cys Asn Val Thr Asn Asn Gly Asn Leu Asp Asp Leu Met Ala Gly
50 55 60
Ile Pro Gly Asn Gly Arg Phe Leu Tyr Ser Val Phe Ser Gln Phe Asp
65 70 75 80
Asn His Asp Ile Ile Asn Phe Phe Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Lys
85 90 95
Val Glu Asp His Gly Arg Val Phe Pro Val Thr Asp Lys Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Ile Glu Ala Leu Glu Lys Lys Ile Ala Glu Leu Gly Gly Thr Val
115 120 125
Ile Thr Asn Thr Glu Ile Val Ser Val Lys Lys Thr Asp Glu Leu Phe
130 135 140
Thr Val Arg Ser Ser Asp Gln Ala Trp Thr Cys Gln Lys Leu Ile Val
145 150 155 160
Thr Thr Gly Gly Lys Ser Tyr Pro Ser Thr Gly Ser Thr Gly Phe Gly
165 170 175
His Asp Ile Ala Arg His Phe Lys His Thr Val Thr Asp Leu Glu Ala
180 185 190
Ala Glu Ser Pro Leu Leu Thr Asp Phe Pro His Lys Ala Leu Gln Gly
195 200 205
Ile Ser Leu Asp Asp Val Thr Leu Ser Tyr Gly Lys His Ile Ile Thr
210 215 220
His Asp Leu Leu Phe Thr His Phe Gly Leu Ser Gly Pro Ala Ala Leu
225 230 235 240
Arg Leu Ser Ser Phe Val Lys Gly Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Asp Val
245 250 255
Leu Pro Gln Met Ser Gln Gln Asp Leu Ala Asp Phe Leu Glu Glu His
260 265 270
Arg Glu Lys Ser Leu Lys Asn Cys Leu Lys Ile Leu Leu Pro Glu Arg
275 280 285
Ile Ala Asp Phe Phe Thr Gln Pro Phe Pro Glu Lys Val Lys Gln Leu
290 295 300
Asn Leu Ser Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys Gln Ile Lys Glu Leu Pro
305 310 315 320
Ile Ser Val Thr Gly Lys Met Ser Leu Ala Lys Ser Phe Val Thr Lys
325 330 335
Gly Gly Val Ser Leu Lys Glu Ile Asn Pro Lys Thr Leu Glu Ser Lys
340 345 350
Leu Val Pro Gly Leu His Phe Ala Gly Glu Val Leu Asp Ile Asn Ala
355 360 365
His Thr Gly Gly Phe Asn Ile Thr Ser Ala Leu Cys Thr Gly Trp Val
370 375 380
Ala Gly Ser Leu His Tyr Asp
385 390
<210> 4
<211> 1197
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
tcaggcgata acgcccagtt gtttaccaat acgcgtaaat gcttctactg cacgcgtaat 60
ttgctcaggg gtatgcgccg cagacatctg ggtacgaata cgcgcctgac ctttcggaac 120
gaccggatag aagaaaccgg taacgtaaat gccctctttt tgcagctcac gggcaaattt 180
ctgcgccact accgcatcac caagcatgac cggaataatg gcgtgatcgg ctcccgccag 240
ggtaaagccc gccgccgaca tttgctcacg gaactgacgc gcgttcgccc acagacggtc 300
acgcagttcg ctgcccgctt cgaccatctc cagtactttg atggacgcgg caacaatggc 360
cggtgccagc gagttggaga acaggtacgg acgagaacgc tggcgcagcc actcaaccac 420
ttctttgcgc gccgcggtat aaccaccaga agccccgccc agcgctttac caagcgtacc 480
ggtgataata tcgacccggc ccatcacatc gcagtattca tgggaaccac gaccattttc 540
accgacaaaa ccgaccgcgt gggagtcgtc taccatcacc agggcatcat atttatctgc 600
cagatcgcaa acgcccttca ggttggcaat cacgccgtcc attgagaaca caccatcggt 660
ggcgatcagc acatgacgcg caccggcttc acgcgcttct ttcagacgtg cttccagctc 720
ctgcatatcg ttgttggcat agcgatagcg tttagctttg cacagacgca caccatcaat 780
aatagacgcg tggttcagtg cgtcggagat aatggcgtct tccgcaccca gaagcgtttc 840
aaacaggcca ccgttagcat caaagcagga agagtagaga atcgcatctt ccatccccag 900
gaaggccgcc agtttttgtt caagctcttt atggctgtcc tgagtgccgc aaataaaacg 960
caccgaagcc atgccgaaac cgtgagaatc cattcccgcc tttgccgccg caatcagatc 1020
aggatgattc gccagcccga gatagttgtt ggcacaaaag ttaatgacgt ggcttccatc 1080
agccacagtg atatctgctt gctgcgcaga cgtaataatg cgctcttctt taaacaaccc 1140
ttccgcccgt gcggtttcca gatcgttggt taactgctga taaaattctc cacgcat 1197
<210> 5
<211> 2274
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
tcacttatct ttcttcagcg cccctagcgt tggcgtttcg tcaaagaagt tccatggttt 60
cagcagagta tgtacccatt cggtcggcat aatcggccac tcttcggcgc gggccacatg 120
tgtggtgccg gtggtcatcc agacaacggc gtcggtgttg tccagcgact cgttatcctt 180
actgtattgt ccaagaccgg tgtcatgagt agaacggttc ggatatttgc cttccgggaa 240
acgctcgcca ggatgataac gcgttaccca gagctgcttg tccataaagc ttaaacgatg 300
atagatccac tcgtccggcg cgaactgggc accttttgct accgggtgag taccacctgc 360
ataaggaata atttgatagg aaaccggatt gcccatgcgg ttctctttgt tcgggttact 420
caacagacga atcgtgcccg gatcaaattt ctgtgcggca tcctgttcat tgccgatgtt 480
gtactgatta acttgcatgg tactggtgcg tgggccaccg gcagtattcg gttttaccac 540
tgggtccatc gccaccaggc tgttattctc gccatctaca tccagatcga ggcggaaatt 600
ataaatatgt tggtgtgtag tacccacgat attgtgatcg ataagcgtgc cgtagcgcgt 660
gtcatctttc gccgtctcat cgtgcatggt tttcgcttta acacctttca ccgcttcgat 720
gcccgtagca ccggcatcga tgccaatagt gccgttttca tggaagatcc agtcaaaaat 780
gtagtcatag ttacccactg tactgatcca gcgcaccact aactcccggc gttcggtact 840
gacgttgggc tggcccattt cctgatgctt atactccggc ccggcataac gttcaaatac 900
cgcgatagcg cgagggatct ccatcggcac gccagtgtag tcggcgatgg tttcattaag 960
gagcactgcg ttagacgggg catctttacc acgagcaatt ggtgaggtta gcgtgcccat 1020
accgtagtca ccagagtcca gatacgcttt aaagtaccag ccaatatcag gatcaccgta 1080
aggcacaatc atgccgccga gagaaccttc gtacatgact ttgcgtttgg tgccattgtc 1140
gttataagtc acggtggaga tcatcggccc gacgcgagag ttcatgctga ggtgaaaatc 1200
ccagttccgc cagtgaatca tatcgccagt aatggtgtaa tttttacctt caggctcaat 1260
gatttgcata ggcttaactg ccggagcaac gcggtcacgg ccatcaaatg ggcgtgcggt 1320
cattggcacc ggaactaccg gaccttcttc aatcttaacg atttttttct gttctaaatc 1380
aacgaccgcc accaggtttt cgatgggatg tgcccagtag ttgccatcac cgacatcaag 1440
atagctgatg actttgagca accgggcatc ttgtttcagg ccatctttac catcgaaata 1500
acctacggtc agcggcgtgg taatcacttt tttcgcatca gtaataccgc gtttcttcac 1560
ggcagcggca aattcttcac tgttgttaat aatgttctgc acactggcga aatcatccag 1620
caacaccata ccgtgggcgt ctttaatggg ttgccaggag agcagtttgt tgttttgcag 1680
atccaccacc gcttcgatga tatgtttgcc gtcgagcata atgacgtcgg ctttgcgcgg 1740
ctggtcaacc ggtttgtttt ccagcgcaaa cgcccagaca gcttctttat ctggcggtag 1800
cagggagatc tcagtaaaac gggtattggg tttgaagtcc gcggaagctt taacaatttc 1860
aacggcctgt ttaatttcgt ccgcagttag cgcattaagt gggtgagggc gcttttctac 1920
ctgaaaggtt tgatccagcc cggactggaa aacatcgtta ataaaggtgt cagaaaccca 1980
ggctttattg tctttcatca ctaccggtac ttgcagtgcc agaggctgac cattaacaat 2040
tgctgtttgc gcaccaggct tcactttcac gtacgcgcca tctttaatca gggtaaagag 2100
ctgggcgtag tcgtcccact gcacatcggc accaaattct ttaagcgttt tatccattgg 2160
caccatatgc gcttcaccac cgtgggcaaa taccggcgct tgccaggcga aacttaaggc 2220
gactgccaac gccagggttg ttttacgggc agaatacaga gaggggcttc ccat 2274
<210> 6
<211> 1341
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atgaagatag tagtgattgg caccaaccat gcgggcattg cgaccgcgaa caccctgctg 60
gaacagtatc cgggccatga aattgtgatg attgatcgca acagcaacat gagctatctg 120
ggctgcggca ccgcgatttg ggtgggccgc cagattgaga agcctgacga actgttctac 180
gcaaaggcag aggatttcga ggccaaaggt gtaaagattc ttacagaaac cgaagtgagc 240
gaaattgatt tcgccaataa gaaggtctac gcgaagacaa agtccgatga tgaaattatt 300
gaagcgtatg ataaactggt gctggcgacc ggcagccgcc cgattattcc gaacctgccg 360
ggcaaagatc tgaaaggcat tcatttcctt aagctgtttc aggaaggcca ggcgattgat 420
gcggagttcg cgaaagagaa ggtcaagcgc attgcggtga ttggcgcggg ctatattggc 480
accgaaattg cggaggcagc taagcgacga ggcaaagaag tgctgctgtt tgatgcggag 540
aatacgagcc tggcgagcta ttatgatgaa gagttcgcga aaggtatgga tgagaatctc 600
gcgcagcatg gcattgaact gcatttcgga gaacttgcga aagaatttaa agcgaacgaa 660
gaaggctatg tgagccagat tgtgaccaac aaagcgacct atgatgtgga tctggtgatt 720
aactgcattg gctttaccgc gaacagcgct ttggcatcag acaagctggc gacctttaag 780
aatggtgcga ttaaagtgga taaacatcag cagagcagcg atccggatgt gtatgcggtg 840
ggcgatgtgg cgaccattta tagcaacgcg ttacaggatt tcacatacat tgccttagcg 900
tcgaacgcag tgcgcagcgg cattgtggcg ggccataaca ttggcggcaa agaactggaa 960
agcgtgggcg tgcagggcag caacggcatt agcatattcg gatacaacat gaccagcacc 1020
ggcctgagcg tgaaggctgc aaagaagtta ggcctggaag tgagctttag cgatttcgag 1080
gacaaacaga aagcgtggtt tctgcatgag aataatgatt cagtcaagat tcgcatcgtg 1140
tatgaaacca agtcacggcg cattattggc gcgcagttgg cttcgaagag tgaaattatt 1200
gcgggcaaca ttaacatgtt tagcctggcg attcaggaga agaagacaat agatgaactg 1260
gcgctgctgg atctgttctt ccttcctcac tttaattctc cgtataacta tatgaccgtg 1320
gcggcgctga acgcgaaata a 1341
<210> 7
<211> 1176
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
atgaaccatt tcgacacgat tattattggc ggcggccctg ctggcatgat ggctacaatt 60
tcatcatcat tctacggaca gaagacgcta cttctcgaga agaataagcg ccttggcaag 120
aagctcgccg gcacaggcgg cggccgctgt aacgttacaa acaacggcaa ccttgatgat 180
cttatggctg gcattcctgg caacggccgt ttcctctact cggtcttctc acaattcgac 240
aatcacgaca tcataaattt cttcacggag aatggtgtta aacttaaagt tgaagatcat 300
ggccgcgtct tcccggtaac agataaatca cgcacaatta ttgaagcttt ggagaagaag 360
atagctgaac ttggcggcac agttattaca aacacagaaa ttgtttcagt taagaagacg 420
gacgaactct tcactgtacg ctcatcagat caggcttgga catgtcagaa acttattgtt 480
acaacaggcg gcaaatcata tccttcaaca ggctcaacag gctttggcca tgatattgct 540
cgccatttca agcacacagt tacagatctt gaagctgctg aatcacctct tcttacagat 600
ttcccgcata aggctcttca gggcatatct ttggacgacg tcactctctc ctacggaaag 660
cacataatca cccatgattt actgtttacg cacttcggac tgtcaggccc tgctgctctt 720
cgcctttcat catttgttaa aggcggcgaa acaatttatc ttgatgttct tcctcagatg 780
tcacagcagg atcttgctga tttcctcgag gaacatcgcg agaagagtct gaagaattgc 840
cttaagatcc tccttcctga acgcattgct gatttcttca cccaaccttt cccagagaaa 900
gttaagcagc ttaacctttc agagaaggag gcccttatta aacagattaa agaacttcct 960
atttcagtta caggcaagat gtcccttgct aaatcatttg ttacaaaggg tggagtgagt 1020
cttaaagaaa ttaaccctaa gaccctggaa tcaaagttag tacctggcct tcatttcgcg 1080
ggagaggtgc ttgatattaa cgctcataca ggcggcttta acattacatc agctctttgt 1140
acaggctggg ttgctggctc acttcattat gattaa 1176
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
ggaattctaa ggaggaaaaa aaaatgaaag cgttatccaa act 43
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
ggggtacctt aatcccagct cagaataact 30
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
cagatgccct cttccgcttt cagtttggat aacgctttca tctcacatcc 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
tataagtttg ggtaatatgt gctggaattt gccctgtctg gagaatcgca 50
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
agttgtttac caatacgcgt 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
atgcgtggag aattttatca g 21
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
tgccctcttc cgctttc 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
cctgtctgga gaatcgc 17
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
cgctcataag taaaaaacgg cacctggtgc cgtttttttg tctgaaacaa 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
cccacagagc gcggttgcta acaagaacac aacatctgac gaggttaata 50
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
aagtaaaaaa cggcacct 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
ggttgctaac aagaacac 18

Claims (10)

1.一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌以大肠杆菌K-12为宿主，过表达了L-苏氨酸脱氢酶，并异源表达了NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶，同时敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌K-12包括E.coli THR、E.coli THR1、E.coli THR2、E.coli THR3、E.coli THR4、E.coli THR5或E.coli THR6。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的L-苏氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌K-12，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸脱氢酶；
(2)具有L-苏氨酸脱氢酶活性的同工酶。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述NADH氧化酶来源于乳球菌属微生物，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的NADH氧化酶；
(2)具有NADH氧化酶活性的同工酶。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的氨基丙酮氧化酶来源于链球菌属微生物，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基丙酮氧化酶；
(2)具有氨基丙酮氧化酶活性的同工酶。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种权利要求1～6任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA的敲除：以大肠杆菌K-12为宿主，采用λ-red同源重组系统将基因kbl替换为两端带有FRT的标记基因后，利用FLP重组酶消除标记基因，再用同样的方法敲除基因tynA；
(2)重组质粒构建：tdh基因、noxE基因和aaoso基因的前端分别加上SD结合序列TAAGGAGGAAAAAAAA，再依次酶切连接至质粒pEC-XK99E的启动子后得到重组质粒；
(3)重组菌构建：将重组质粒导入敲除基因kbl和基因tynA的大肠杆菌宿主中，筛选得到所述的重组菌。
8.一种权利要求1～6任一项所述的重组菌发酵生产2,5-二甲基吡嗪的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，35～38℃，50～200r·min-1培养8-10h；以8～12％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35～38℃，50～200r·min-1培养至5～7h时加IPTG，再培养25～35h结束发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为：蛋白胨8～12g/L，酵母膏4～6g/L；所述的发酵培养基为：葡萄糖25～35g/L，(NH4)2SO4 10～20g/L，KH2PO4 1～3g/L，MgSO4·4H2O 0.3～0.5g/L，KCl 0.5～0.7g/L，FeSO4·7H2O 40～60mg/L，MnSO4·4H2O40～60mg/L，玉米浆/玉米浆干粉0.4～0.6g/L，甜菜糖蜜15～20ml/L，甜菜碱0.5～1.5g/L，消泡剂0.4～0.6ml/L，CaCO3 8～12g/L，用NaOH调至pH＝7.0～7.5。
10.权利要求1～6任一项所述的重组菌在医药工业或食品工业中的应用。
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