KR102616750B1 - 유전자 조작 박테리아 및 단삼소 생산에서 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 조작 박테리아, 및 단삼소 및 알라닌의 연합 생산에서 이의 응용에 관한 것으로서, 생체공학 기술 분야에 속한다. 본 발명은 삼중 효소 공동-발현 유전자 조작 박테리아를 구축하여 단삼소 및 알라닌의 연합 생산을 실현한다. 나아가, 대장균 게놈에서 관련 유전자를 녹아웃시키거나 이의 발현을 강화시켜 기질의 운반을 촉진시키고 생성물의 분해를 감소시킨다. 본 발명의 유전자 조작 박테리아는 광학적으로 순수한 D-단삼소 및 L-단삼소를 생산할 수 있는 동시에 피루브산을 연합 생산한다. 상기 생산 과정이 간단하고, 원료를 쉽게 얻을 수 있고, 불순물이 적어 우수한 산업적 응용 전망을 갖는다.
Description
본 발명은 유전자 조작 박테리아 및 단삼소 생산에서 이의 응용에 관한 것으로서, 생체공학 기술 분야에 속한다.
단삼(Salvia miltiorrhiza)에서 추출한 단삼소의 학명은 R-(+)-3-(3,4-디히드록시페닐)-2-히드록시프로판산 및 D-(+)-β-(3,4-디히드록시페닐)락트산이고, 영문명은 Danshensu, D-DSS, R-DSS, (R)-(+)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-lactic acid, (R)-(+)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoic acid이고, 덱스트로페놀산 화합물이다. 현재, 천연적인 좌선성 단삼소는 존재하지 않는다.
단삼소는 단삼 추출액의 중요한 유효 성분으로 중국에서 1980년에 단삼 추출액에서 구조를 얻고 감식하였다(문헌[단삼 수용성 유효 성분의 연구, Ⅱ. D(+)β(3,4-디히드록시페닐)락트산의 구조, 상해 제1 의학원 학보, 1980, 05(7), 384-385]). 다양한 연구에 근거하여 단삼소는 중요한 약리학적 효과를 갖고 심혈관 및 뇌혈관 질환의 치료에 독특한 치료 효과를 갖는다.
현재, 단삼소는 주로 단삼에서 추출된다(특허 CN200810038853.9). 단삼소는 단삼에서 함량이 낮고 단삼 재배 비용이 높고 수율이 제한되므로, 현재 단삼소는 가격이 높을 뿐만 아니라 시장의 요구를 만족시킬 수 없다. 특허 CN201310559498.0은 대장균(Escherichia coli) 유전자 조작 균주를 구축하여 포도당을 발효시켜 단삼소를 생산하는 방법을 제안한다. 합성 대사 경로가 수산화효소를 사용하기 때문에, 상기 효소는 대사 과정의 생성물을 쉽게 산화시켜 단삼소의 수율에 영향을 미친다. 동시에, 대장균 발효가 산소 소모량이 많은 과정이기에 단삼소를 또한 산화시킬 수 있다. 따라서, 현재 방법의 수율은 낮고 비용은 식물 추출 과정보다 높다. 특허 CN201210190171.6은 살비아놀산 B를 가수분해하여 단삼소를 생산하는 방법을 제안한다. 살비아놀산 B는 단삼으로부터 추출하여야 하고, 화학적 가수분해 과정에는 대량의 부반응이 있어 대규모 생산에 마찬가지로 적합하지 않다. 단삼소의 키랄 합성을 위한 촉매(특허 CN201210420488.4)는 매우 비싸고 현재 실험실 수준에만 유지된다.
1988년에 로스(Roth) 등은 먼저 레보도파를 화학적 방법으로 처리하여 대응되는 3,4-디히드록시페닐피루브산을 수득하고 다시 S-(+)-3-(3,4-디히드록시페닐)-2-히드록시프로판산(S-DSS, L-DSS)을 효소적 방법으로 합성하는 방법을 제안하였다(문헌[Enzymatic Synthesis of (S)-(-)-3-(3,4-dihydroxyphenyl) Lactic acid, Arch. Pharm. (Weinheim) 321, 179-180 (1988)]). 지 핀드릭(Z. Findrik) 등은 뱀독 아미노산 산화효소를 사용하여 레보도파를 3,4-디히드록시페닐피루브산으로 전환한 다음 D-락트산 탈수소효소를 사용하여 환원시켜 D-(3,4-디히드록시페닐)락트산을 생성한다(문헌[Modelling and Optimization of the (R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyl Lactic acid Production Catalyzed with D-lactate Dehydrogenase from Lactobacillus leishmannii Using Genetic Algorithm, Chem. Biochem. Eng. Q. 19 (4) 351-358 (2005)]). 이 두 가지 방법으로 3,4-디히드록시페닐피루브산 중간체를 제조하는 비용은 높고 작업은 복잡하다.
현재 다양한 방법의 흠결을 기반으로, 본 발명은 트랜스아미나제를 기반으로 한 광학적으로 순수한 단삼소 생산 방법을 제공하고, 다중 효소 공동-발현한 유전자 조작 박테리아를 구축하여 단삼소의 고효율 생산을 실현한다. 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 단삼소를 저비용으로 생산할 수 있는 재조합 박테리아를 제공하는 것이다. 동시에, 본 발명은 상기 박테리아의 구축 및 응용에서의 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명의 첫 번째 목적은 광학적으로 순수한 단삼소를 저비용으로 생산할 수 있는 재조합 박테리아를 제공하는 것이다. 상기 재조합 박테리아는 α-히드록시카르복실산 탈수소효소 및 L-α-아미노산 트랜스아미나제, 및 포도당 탈수소효소, L-락트산 탈수소효소 및 L-글루탐산 탈수소효소 중 어느 하나를 동시에 발현하고, 숙주 대장균을 기반으로 페놀 화합물의 분해와 관련된 유전자를 녹아웃(knock out)시킨다.
하나의 실시형태에서, 상기 α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 D-α-히드록시카르복실산 탈수소효소이고, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) ATCC 14917, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC 35038 또는 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) ATCC 14931에서 유래된다.
하나의 실시형태에서, 상기 α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 L-α-히드록시카르복실산 탈수소효소이고, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) DSM 1, 와이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 균주 DSM 20196 또는 락토바실루스 페르멘툼 ATCC 14931에서 유래된다.
하나의 실시형태에서, 상기 α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 D-α-히드록시카르복실산 탈수소효소이고, 이의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_003643296.1, WP_002335374.1 또는 EEI22188.1의 수탁번호를 갖고, α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 L-α-히드록시카르복실산 탈수소효소이고, 이의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_013858488.1, WP_003607654.1 또는 WP_035430779.1의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, D-α-히드록시카르복실산 탈수소효소의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NZ_GL379761 REGION: 보체(533562..534560), NZ_KB944641 REGION: 161892..162830 또는 ACGI01000078 REGION: 20793..21791의 수탁번호를 갖고; L-α-히드록시카르복실산 탈수소효소의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NZ_ATUM01000014 REGION: 39316..4025, NZ_JQAY01000006 REGION: 69708..70640 또는 NZ_GG669901 REGION: 45517..46470의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 L-α-아미노산 트랜스아미나제는 대장균 BL21, 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 또는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ATCC 334에서 유래된다.
하나의 실시형태에서, L-α-아미노산 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_000462687.1, WP_000486988.1, WP_003643296.1 또는 YP_806114.1의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, L-α-아미노산 트랜스아미나제의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NC_012892 REGION: 보체(989603..990793), NC_012892 REGION: 4174517..4175710, NZ_GL379768 REGION: 보체(121900..123087) 또는 NC_008526 REGION: 보체(840419..841594)의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 포도당 탈수소효소는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 13952에서 유래된다.
하나의 실시형태에서, 상기 포도당 탈수소효소의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_013351020.1의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 포도당 탈수소효소의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NZ_CP009748 REGION: 386154..38693의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 L-락트산 탈수소효소는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) ATCC 19257에서 유래된다.
하나의 실시형태에서, 상기 L-락트산 탈수소효소의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_003131075.1의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 L-락트산 탈수소효소의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NZ_JXJZ01000017 REGION: 18532..19509의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 L-글루탐산 탈수소효소는 대장균 BL21, 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) ATCC BAA-808, 클로스트리듐 심비오숨(Clostridium symbiosum) ATCC 14940 또는 바실러스 서브틸리스 168에서 유래된다.
하나의 실시형태에서, L-글루탐산 탈수소효소의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_000373021.1, WP_011338202.1, WP_003497202.1 또는 WP_010886557.1의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, L-글루탐산 탈수소효소의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NC_012892 REGION: 1786741..1788084, NC_007493 REGION: 보체(2129131..2130558), NZ_KE992901 REGION: 보체(17603..18955) 또는 NC_000964 REGION: 보체(2402067..2403350)의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 재조합 박테리아는 L-α-아미노산 트랜스아미나제, α-히드록시카르복실산 탈수소효소, 및 포도당 탈수소효소, L-락트산 탈수소효소 및 L-글루탐산 탈수소효소 중 어느 하나를 코딩하는 유전자를 플라스미드에 결찰시켜 삼중 유전자 공동-발현 재조합 플라스미드를 구축한 다음, 재조합 플라스미드를 상응하는 박테리아로 형질전환시켜 재조합 유전자 조작 박테리아를 수득한다.
하나의 실시형태에서, 상기 재조합 박테리아는 대장균 BL21(DE3)을 숙주로서 사용하여 구축된다.
하나의 실시형태에서, 상기 페놀 화합물의 분해와 관련된 유전자는 hpaD, mhpB 또는 이들의 조합이다.
하나의 실시형태에서, 상기 페놀계 물질 분해 유전자의 뉴클레오티드 서열은 NCBI에서 NC_012892 REGION: 보체(4505585..4506436) 또는 NC_012892 REGION: 339806..340750의 수탁번호를 갖는다.
하나의 실시형태에서, 상기 재조합 박테리아는 피루브산 운반체 유전자, L-락트산 운반체 유전자, 글루탐산 운반체 유전자, NAD 합성 유전자 및 인산피리독살 합성 유전자 중 1종 이상의 유전자의 발현을 더 강화시키고, 이때 피루브산 운반체 유전자, L-락트산 운반체 유전자 및 글루탐산 운반체 유전자는 동시에 발현되지 않는다.
하나의 실시형태에서, 강화된 발현은 대장균 BL21(DE3) 게놈에서 발현이 강화되는 유전자 앞에 구성형 프로모터를 부가한다.
하나의 실시형태에서, 발현이 강화되는 유전자는 피루브산 운반 관련 유전자, lldP(락트산 운반체 유전자), gltS(글루탐산 운반체 유전자), nadA(NAD 합성 유전자) 및 pdxJ(인산피리독살 합성 유전자) 중 1 종 이상의 유전자이고, 이때 상기 피루브산 운반 관련 유전자는 btsT 및 ybdD(피루브산을 세포로 운반하는 유전자)를 포함한다.
하나의 실시형태에서, NCBI에서 btsT 및 ybdD의 수탁번호는, nadA의 경우, NC_012892 REGION: 740487..741530이고, pdxJ의 경우, NC_012892 REGION: 보체(2567591..2568322)이다.
하나의 실시형태에서, NCBI에서 lldP의 수탁번호는 NC_012892 REGION: 3646638..3648293이고, nadA의 경우, NC_012892 REGION: 740487..741530이고, pdxJ의 경우, NC_012892 REGION: 보체(2567591..2568322)이다.
하나의 실시형태에서, NCBI에서 gltS의 수탁번호는 NC_012892 REGION: 보체(3694931..3696136)이고, nadA의 경우, NC_012892 REGION: 740487..741530이고, pdxJ의 경우, NC_012892 REGION: 보체(2567591..2568322)이다.
본 발명의 두 번째 목적은 본 발명의 재조합 박테리아를 사용하여 단삼소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 단삼소를 생산하는 방법은 전세포 형질전환 생산에 의해 수행된다.
하나의 실시형태에서, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템에서, 세포 습윤 중량은 1 내지 200g/L이고, 레보도파 농도는 1 내지 200g/L이다.
상기 재조합 박테리아가 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 포도당 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템에서, 피루브산 농도는 1 내지 200g/L이고, 포도당 농도는 1 내지 200g/L이다.
상기 재조합 박테리아가 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-락트산 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템은 1 내지 200g/L의 L-락트산을 더 포함한다.
상기 재조합 박테리아가 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-글루탐산 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템은 1 내지 200g/L의 L-글루탐산을 더 포함한다.
상기 전세포 형질전환 생산의 시스템은 6.0 내지 9.0의 pH를 갖고, 15 내지 40℃에서 1 내지 48시간 동안 반응한다.
본 발명의 유리한 효과
본 발명은 새로운 다중 효소 공동-발현 유전자 조작 박테리아를 구축하고 단삼소의 저비용 생산을 실현한다. 나아가, 대장균 게놈에서 관련 유전자를 녹아웃시키거나 이의 발현을 강화시켜 기질의 운반을 촉진시키고, 생성물의 분해를 감소시킨다. 본 발명에서 선택한 (D/L)-α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 불량한 기질 특이성 및 강한 광학 특이성의 특징을 갖고, 광학적으로 순수한 D-단삼소 및 L-단삼소를 생산할 수 있다. 상기 생산 과정은 간단하고, 원료를 쉽게 얻을 수 있어 우수한 산업적 응용 전망을 갖는다.
본 발명의 유전자 조작 박테리아의 기능적 핵심은 3개의 효소를 동시에 발현할 수 있는 것이다: 각각 L-α-아미노산 트랜스아미나제, α-히드록시카르복실산 탈수소효소, 및 포도당 탈수소효소, L-락트산 탈수소효소, L-글루탐산 탈수소효소 중 어느 하나. 이의 원리는, 유전자 조작 박테리아의 전세포에서, 포도당 탈수소효소 또는 L-락트산 탈수소효소 또는 L-글루탐산 탈수소효소가 세포의 NAD를 보조 효소로서 사용하여 대응되는 포도당을 탈수소화시키거나, L-락트산 탈수소효소 또는 L-글루탐산 탈수소효소가 NADH 및 대응되는 글루콘산 또는 피루브산 또는 α-케토글루타르산을 생성하고, 레보도파는 L-α-아미노산 트랜스아미나제에 의해 탈아미노화되어 3,4-디히드록시페닐피루브산을 생성하고, 피루브산는 암모니아에 의해 알라닌으로 전환되고, α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 포도당의 탈수소 과정에서 생성된 NADH를 사용하여 3,4-디히드록시페닐피루브산을 단삼소로 환원시키는 동시에 보조 효소 NAD를 재생시킨다. 나아가, 대장균 게놈에서 관련 유전자를 녹아웃시키거나 이의 발현을 강화시켜 기질의 운반을 촉진시키고 생성물의 분해를 감소시킨다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서 채택된 기술적 해결수단은 다음과 같다.
1. 본 발명의 균주 및 플라스미드
락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917, 엔테로코커스 파에칼리스 ATCC 35038, 락토바실루스 페르멘툼 ATCC 14931, 락토바실러스 파라카세이 ATCC 334, 바실러스 서브틸리스 ATCC 13952, 대장균 BL21(DE3) 및 락토코커스 락티스 ATCC 19257을 미국 균종 수탁 센터(ATCC)에서 구매한다. 바실루스 코아굴란스 DSM 1 및 와이셀라 콘푸사 균주 DSM 20196을 독일 미생물 수탁 센터(DSMZ)에서 구매한다. pETDuet-1, pACYCDue-1, pCOLADuet-1, pRSFDuet-1 플라스미드 및 대장균 BL21(DE3)을 노바겐(Novagen)에서 구매한다.
2. 대장균에서 관련 유전자의 녹아웃 및 구성형 강화 발현
(1) 대장균 페놀계 화합물에서 분해와 관련된 유전자의 녹아웃
본 발명에서 페놀계 물질은 대장균에서 효소에 의해 매우 쉽게 분해된다. 문헌[Biodegradation of Aromatic Compounds by E. coli, Microbiol Mol Biol Rev. 2001, 65(4): 523-569]에 근거하여 관련 유전자를 녹아웃시켜 생성물 및 기질의 분해를 방지한다. 선택된 유전자는 hpaD 및 mhpB이고, NCBI에서 NC_012892 REGION: 보체(4505585..4506436) 및 NC_012892 REGION: 339806..340750의 수탁번호를 갖는다.
(2) 대장균 피루브산 운반체 유전자의 구성형 강화 발현
전세포 형질전환 과정에서, 기질을 세포로 운반하여 반응을 수행하여야 한다. 피루브산 운반체 유전자 단백질을 강화시키면 세포 내의 기질의 고농도를 신속하고 장시간 동안 유지하는 데 도움이 되어, 반응의 진행에 유리하다. 선택된 피루브산 운반 관련 유전자는 btsT 및 ybdD이고, NCBI에서 NC_012892 REGION: 보체(4496239..4498389) 및 NC_012892 REGION: 592652..592849의 수탁번호를 갖는다. 도파는 방향족 아미노산과 유사하고 세포 배양 과정에서 아미노산 등을 흡수하여야 한다. 세포 자체가 대량의 아미노산 운반 단백질을 발현할 수 있으므로 발현을 강화시킬 필요가 없다.
(3) 대장균 보조 효소 합성과 관련된 중요한 유전자의 구성형 강화 발현
α-히드록시카르복실산 탈수소효소의 환원 과정에서, NADH가 보조 효소로서 사용되어야 한다. 대장균 NAD 합성 경로의 핵심 효소의 강화 발현은 세포의 NAD 수준을 향상시킴으로써 단삼소의 생성에 유리할 수 있다. 선택된 유전자는 nadA이다. NCBI에서 NC_012892 REGION: 740487..741530의 수탁번호를 갖는다.
인산피리독살(아민)은 L-α-아미노산 트랜스아미나제의 보조 효소이고, 상기 보조 효소 경로의 핵심 유전자 pdxJ의 과발현은 레보도파의 합성에 유리하다. NCBI에서 NC_012892 REGION: 보체(2567591..2568322)의 수탁번호를 갖는다.
3. 효소의 선택
(1) L-α-아미노산 트랜스아미나제의 선택
L-α-아미노산 트랜스아미나제는 박테리아, 진균, 포유동물 세포에 널리 존재한다. 일반적으로, 활성이 가장 높은 것은 α-케토글루타르산 또는 옥살로아세트산을 암모니아 수용체로 사용하는 트랜스아미나제이다. 이 과정에서, α-케토글루타르산 또는 옥살로아세트산은 가격이 비싸지만, 대응되어 생성되는 글루탐산 또는 아스파르트산의 가치는 대응되는 전구체보다 훨씬 낮다. 20개의 천연적인 L-아미노산에 대응되는 α-케톤산을 종합적으로 관찰한 결과, 피루브산 및 알라닌의 가격이 유사한 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명은 피루브산을 암모니아 수용체로 선택함으로써 알라닌과 단삼소의 연합 생산을 실현한다. L-α-아미노산 트랜스아미나제 유전자 lpt 및 lct를 각각 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 및 락토바실러스 파라카세이 ATCC 334에서 클로닝하고, 이들의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_003643296.1 및 YP_806114.1의 수탁번호를 갖는다. 2개의 L-α-아미노산 트랜스아미나제 유전자 ect1 및 ect2를 대장균 BL1(DE3)에서 클로닝하고, 이들의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_000462687.1 및 WP_000486988.1의 수탁번호를 갖는다.
(2) α-히드록시카르복실산 탈수소효소의 선택
가장 적합한 기질에 근거하여, α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 락트산 탈수소효소, α-히드록시산 이소헥산산 탈수소효소, 만델산 탈수소효소, 글리옥실레이트 환원효소 등을 함유한다. 이러한 효소는 다양한 기질에 널리 작용하여 α-히드록시카르복실산을 생성하고, 일반적으로 작용하기 가장 적합한 기질에 근거하여 명명한다. 본 발명은 광학적인 특성이 강하고 3,4-디히드록시페닐피루브산에 대해 강한 활성을 갖는 효소를 선택하여 D- 또는 L-단삼소를 생산한다. D-α-히드록시카르복실산 탈수소효소 유전자 lpldhd, efmdhd 및 lfldhd를 각각 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917, 엔테로코커스 파에칼리스 ATCC 35038 및 락토바실루스 페르멘툼 ATCC 14931에서 클로닝하고, 이들의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_003643296.1, WP_002335374.1 및 EEI22188.1의 수탁번호를 갖는다. L-α-히드록시카르복실산 탈수소효소 유전자 bcldhl, wcldhl 및 lfldhl을 각각 바실루스 코아굴란스 DSM 1, 와이셀라 콘푸사 균주 DSM 20196 및 락토바실루스 페르멘툼 ATCC 14931에서 각각 클로닝하고, 이들의 아미노산 서열은 NCBI에서 WP_013858488.1, WP_003607654.1 및 WP_035430779.1의 수탁번호를 갖는다.
(3) 포도당 탈수소효소의 선택
생체 형질전환 반응에서, α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 보조 효소로서 NADH 및/또는 NADPH, 일반적으로 포름산 탈수소효소, 포도당 탈수소효소, 포스파이트 탈수소효소 등을 사용한다. 포도당 탈수소효소가 다른 효소에 비해 활성이 가장 높으므로, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 ATCC 13952에서 포도당 탈수소효소 유전자 bsgdh(아미노산 서열은 WP_013351020.1임)를 수득한다.
(4) L-락트산 탈수소효소의 선택
L-락트산은 가장 저렴한 유기산이고, 탈수소화 후 생성된 피루브산의 트랜스아민화 반응에 의해 생성된 알라닌은 높은 부가가치를 갖는다. L-락트산 탈수소효소는 다양한 미생물에 널리 존재한다. L-락트산을 기질로 사용하여 L-락트산에서 생성된 수소를 보조 효소 NAD 또는 NADP로 전달함으로써 NADH 또는 NADPH를 생성한다. NADH 또는 NADPH는 전술한 α-히드록시카르복실산 탈수소효소의 수소 공여체로서 사용될 수 있다. 일반적으로, NAD(NADP)를 보조 효소로 하는 락트산 탈수소효소는 피루브산을 기질로 사용하여 락트산을 합성하는 경향이 있다. 그러나, 락트산이 과량인 경우, 락트산 탈수소효소는 락트산의 수소를 제거하여 피루브산을 생성한다. 본 발명은 락토코커스 락티스 ATCC 19257에서 L-락트산 탈수소효소 유전자 llldh(아미노산 서열은 WP_003131075.1임)를 수득한다.
(5) L-글루탐산 탈수소효소의 선택
L-글루탐산은 가장 저렴한 아미노산이고, 탈수소화 후 생성된 α-케토글루타르산은 레보도파 트랜스아민화 및 탈아민화를 위한 암모니아 수용체로 사용할 수 있다. L-글루탐산 탈수소효소는 거의 모든 유기체에 널리 존재한다. L-글루탐산을 기질로 사용하여 L-글루탐산에서 생성된 수소를 보조 효소 NAD 또는 NADP로 전달함으로써 NADH 또는 NADPH를 생성한다. NADH 또는 NADPH는 전술한 히드록시카르복실산 탈수소효소의 수소 공여체로서 사용될 수 있다. 본 발명은 대장균 BL21, 로도박터 스파에로이데스 ATCC BAA-808, 클로스트리듐 심비오숨 ATCC 14940 및 바실러스 서브틸리스 168에서 각각 L-글루탐산 유전자 ecgdh(아미노산 서열은 WP_000373021.1임), rsgdh(아미노산 서열은 WP_011338202.1임), csgdh(아미노산 서열은 WP_003497202.1임) 및 bsgdh(아미노산 서열은 WP_010886557.1임)를 수득한다.
4. 삼중 효소 공동-발현 시스템 및 세포 배양물의 구축
현재, 대장균 다중 유전자 공동-발현은 다양한 방법이 있다(문헌[대장균 다중 유전자 공동-발현 전략, 중국 생체공학 잡지, 2012, 32(4):117-122]). 본 발명은 류 시앙레이(문헌[합성 생체학 기술에 의한 대장균의 형질전환에 의한 시킴산 및 레스베라트롤의 생산, 2016, 상해의학산업연구원, 박사 논문])에 설명된 방법을 채택한다. 각각의 유전자는 앞에 T7 프로모터 및 RBS 결합 부위를 포함하고, 각각의 유전자는 뒤에 하나의 T7 종결자를 갖는다. 이론적으로, 각각의 유전자가 앞에 T7 및 RBS를 가지므로, 유전자의 발현 강도는 배열 순서의 영향을 덜 받는다. 각각의 플라스미드는 3개의 유전자(L-α-아미노산 트랜스아미나제, (D/L)-α-히드록시카르복실산 탈수소효소, 및 포도당 탈수소효소 또는 L-락트산 탈수소효소 또는 L-글루탐산 탈수소효소에 대응되는 유전자)를 함유한다. 구축된 플라스미드는 대장균 적격 세포로 열-전달되고, 항생제 고체 플레이트에 도포된다. 선별하여 양성 형질전환체, 즉 재조합 대장균을 수득한다. 세포는 전형적인 재조합 대장균 배양 및 유도 발현 프로그램에 근거하여 배양된다. 재조합 대장균은 2%의 체적비로 LB 발효 배지(10g/L의 펩톤, 5g/L의 효모 분말 및 10g/L의 NaCl을 함유함)로 전달된다. 세포 OD600이 0.6 내지 0.8에 도달한 후, 최종 농도가 0.4mM인 IPTG를 첨가하고, 20℃에서 8시간 동안 유도 발현 및 배양을 수행한다. 유도 발현이 종료된 후, 20℃에서, 8,000rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 세포를 수집한다.
5. 전세포 형질전환에 의한 순수한 단삼소의 생산
세포 형질전환 생산의 시스템에서, 세포 습윤 중량은 1 내지 200g/L이고, 레보도파 농도는 1 내지 200g/L이다.
상기 재조합 박테리아가 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 포도당 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템에서, 피루브산 농도는 1 내지 200g/L이고, 포도당 농도는 1 내지 200g/L이다.
상기 재조합 박테리아가 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-락트산 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템은 1 내지 200g/L의 L-락트산을 더 포함한다.
상기 재조합 박테리아가 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-글루탐산 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 전세포 형질전환 생산의 시스템은 1 내지 200g/L의 L-글루탐산을 더 포함한다.
상기 전세포 형질전환 생산의 시스템은 6.0 내지 9.0의 pH를 갖고, 15 내지 40℃에서 1 내지 48시간 동안 반응한다.
형질전환이 종료된 후, 단삼소의 수율 및 배열을 액체 크로마토그래피로 측정한다. 레보도파는 낮은 용해도를 갖고, 고농도로 물체를 함유하는 불용성 현탁액이다.
6. 샘플의 검출 및 분석
단삼소 정량 분석: 형질전환액을 시차 굴절 검출기가 장착된 퍼킨엘머 시리즈(PerkinElmer Series) 200 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 검출 및 분석한다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: 이동상은 메탄올-0.1%의 포름산수(40:60)이고, 한본 메그레스(Hanbon Megres) C18 크로마토그래피 컬럼(4.6x250mm, 5μm)이 사용되고, 유량은 1mL/분이고, 컬럼 온도는 30℃이고, 주입 체적은 20μL이다.
키랄 분석: 자외선 검출기가 장착된 퍼킨엘머 시리즈 200 고성능 액체 크로마토그래피를 검출 및 분석에 사용하고, 키랄셀(Chiralcel) OD-H 키랄 컬럼(4.6x250mm)을 사용하고, n-헥산:이소프로판올:트리플루오로아세트산의 이동상의 체적비는 80:20:0.1이고, 유량은 0.5 mL/분이고, 컬럼 온도는 25℃이고, 주입 체적은 20μL이고, 검출 파장은 280nm이다.
단삼소는 비교적 낮은 용해도를 갖고, 형질전환 과정에서 결정이 석출되면, 희석한 후 측정된다.
단삼소의 광학 순도는 거울상 이성질체 과량값(%e.e)으로 평가된다.
R-단삼소를 생산할 경우, 거울상 이성질체 과량값 %e.e는 [(SR-SS)/(SR+SS)x100%]이다.
S-단삼소를 생산할 경우, 거울상 이성질체 과량값 %e.e는 [(SS-SR)/(SR+SS)x100%]이다.
상기 식에서, SS는 형질전환액의 S-단삼소의 피크 면적이고, SR은 형질전환액의 R-단삼소의 액체 크로마토그래피 피크 면적이다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제, 기술적 해결수단 및 유리한 효과를 보다 명확하게 하기 위하여, 하기 실시예와 결부하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본원에 설명되는 구체적인 실시예는 단지 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님에 유의하여야 한다.
실시예 1
문헌[Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in E. coli. Microbial Cell Factories, 2017, 16(1):68]에 설명된 방법에 근거하여 대장균 BL21(DE3)의 hpaD 및 mhpB를 단일 또는 이중 녹아웃시킨다. 본 발명에 사용된 유전자 녹아웃된 플라스미드는 상동성 아암(hpaD 공여체)와 함께 대장균 BL21(DE3)에 도입된 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(hpaD sgRNA)이다. Cas9/sgRNA는 숙주의 hpaD 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 hpaD 공여체를 hpaD 유전자에 통합시켜 유전자의 녹아웃을 실현하고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다. hpaD sgRNA, hpaD 공여체, mhpB sgRNA 및 mhpB 공여체는 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12에 제시된다. mhpB는 동일한 방식으로 녹아웃된다.
pH가 7인 용액을 4g/L의 레보도파 또는 D-단삼소에 의해 제조하고, 습윤 세포의 양은 200g/L이고, 용액을 35℃에서 10시간 동안 방치한 후, 농도를 측정한다. 표 1은 반응 시스템에서 레보도파 및 D-단삼소의 잔류량을 나타낸다.
[표 1]
명백하게, 대장균 BL21(△hpaD△mhpB, DE3)이 가장 우수한 효과를 갖고, 이를 대장균 HM이라고 명명한다.
실시예 2
L-α-아미노산 트랜스아미나제의 선별에 있어서, 각각 대장균 및 락토바실러스로부터 다양한 L-α-아미노산 트랜스아미나제 유전자를 클로닝하고, 대장균 BL21(DE3)에서 발현시킨다. 세포를 파괴하여 조질 효소 활성을 측정하고, 다양한 효소의 활성을 수용체인 피루브산과 비교한다. 문헌[방향족 L-아미노산의 트랜스아미나제-촉매화된 비대칭 합성. 중국 생체공학 잡지, 2012, 28(11):1346-1358]에 설명된 방법에 근거하여 L-α-아미노산 트랜스아미나제의 활성을 측정한다. 결과는 표 2에 제시된다. 따라서, 대장균에서 유래된 L-α-아미노산 트랜스아미나제 ect1을 레보도파의 트랜스아민화 및 탈아민화를 위해 선택하는 것이 가장 바람직하다.
수용체로서 α-케토글루타르산을 사용하는 경우, 다양한 효소의 활성을 비교하다. 문헌[방향족 L-아미노산의 트랜스아미나제-촉매화된 비대칭 합성. 중국 생체공학 잡지, 2012, 28(11):1346-1358]에 설명된 방법에 근거하여 L-α-아미노산 트랜스아미나제의 활성을 측정한다. 결과는 표 3에 제시된다. 따라서, 락토바실러스 파라카세이 ATCC 334에서 유래된 L-α-아미노산 트랜스아미나제 lct를 레보도파의 트랜스아민화 및 탈아민화에 사용하는 것이 바람직하다.
유도 발현 방법: 재조합 대장균을 2%의 체적비로 LB 발효 배지(10g/L의 펩톤, 5g/L의 효모 분말 및 10g/L의 NaCl을 함유함)에 전달한다. 세포 OD600이 0.6 내지 0.8에 도달한 후, 0.4mM의 최종 농도를 갖는 IPTG를 첨가하고, 20℃에서 8시간 동안 유도 발현 및 배양을 수행한다. 유도 발현이 종료된 후, 20℃에서 8,000rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 세포를 수집한다.
[표 2]
[표 3]
실시예 3
α-히드록시카르복실산 탈수소효소의 효소적 특성을 비교한다. 일반적으로, 이러한 효소는 또한 피루브산을 환원시켜 락트산을 생성하는 능력을 가질 수 있으므로, 피루브산을 환원시킬 수 없거나 매우 약하게 환원시키는 효소가 바람직하다. 피루브산을 기질로 사용하여, 상이한 효소의 환원 능력을 비교한다. 문헌[세라티아 마르세센스 H3010 발효형 D-락트산 탈수소효소 유전자의 클로닝 발현, 정제 및 효소적 특성 연구. 공학 미생물, 2012, 42(04):30-37]에 설명된 방법에 근거하여 피루브산을 환원시키는 보조 효소로서 NAD의 활성을 측정하고, 실험 결과는 표 4에 제시된다.
[표 4]
실시예 4
α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 포도당 탈수소효소를 동시에 발현하는 재조합 대장균을 구축한다: 먼저, L-α-아미노산 트랜스아미나제, α-히드록시카르복실산 탈수소효소 및 포도당 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 플라스미드에 결찰시킨다. 삼중 유전자 공동-발현 재조합 플라스미드를 수득한다. 플라스미드를 대장균 HM으로 형질전환시키고, 항생제 플레이트를 사용하여 선별하여 양성 형질전환체, 즉 재조합 대장균을 수득한다.
재조합 대장균의 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 100mL의 반응 체적, 40g/L의 세포 습윤 중량, 40g/L의 레보도파, 30g/L의 피루브산, 30g/L의 포도당 및 pH 8.0으로 35℃에서 12시간 동안 반응을 수행한다. 형질전환이 종료된 후, 액체 크로마토그래피로 단삼소의 수율 및 배열을 측정하고, 결과는 표 5에 제시된다.
[표 5]
실시예 5
α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-락트산 탈수소효소를 동시에 발현하는 재조합 대장균을 구축한다: 먼저, L-락트산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 α-히드록시카르복실산 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 플라스미드에 결찰시켜 삼중 유전자 공동-발현 재조합 플라스미드를 수득한다. 플라스미드를 대장균 HM으로 형질전환시키고, 항생제 플레이트에 의해 선별하여 양성 형질전환체, 즉 재조합 대장균을 수득한다.
재조합 대장균의 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 100mL의 반응 체적, 40g/L의 세포 습윤 중량, 40g/L의 레보도파 농도, 30g/L의 피루브산 농도 및 pH 8.0으로 35℃에서 12시간 동안 반응을 수행한다. 형질전환이 종료된 후, 액체 크로마토그래피로 단삼소의 수율 및 배열을 측정하고, 결과는 표 6에 제시된다.
[표 6]
실시예 6
α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-글루탐산 탈수소효소를 동시에 발현하는 재조합 대장균을 구축한다: 먼저, L-α-아미노산 트랜스아미나제, α-히드록시카르복실산 탈수소효소 및 L-글루탐산 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 플라스미드에 결찰시켜 삼중 유전자 공동-발현 재조합 플라스미드를 수득한다. 플라스미드를 대장균 HM으로 형질전환시키고, 항생제 플레이트에 의해 선별하여 양성 형질전환체, 즉 재조합 대장균을 수득한다.
재조합 대장균의 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 100mL의 반응 체적, 40g/L의 세포 습윤 중량, 40g/L의 레보도파 농도, 30g/L의 L-글루탐산 농도 및 pH 8.0으로 35℃에서 12시간 동안 반응을 수행한다. 형질전환이 종료된 후, 액체 크로마토그래피로 단삼소의 수율 및 배열을 측정하고, 결과는 표 7에 제시된다.
[표 7]
실시예 7
문헌[Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in E. coli. Microbial Cell Factories, 2017, 16(1):68]에 설명된 방법에 근거하여 대장균 HM 게놈의 대응되는 유전자 앞에 대장균 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 유전자(gpdA) 앞의 중간 발현 강도의 구성형 프로모터(PG)를 부가하고, 서열은 서열번호 8에 제시된다.
유전자 btsT의 발현을 강화할 경우, 대장균 HM 게놈을 주형으로 사용하고, btsT-FF/btsT-FR, btsT-gpdA-F/btsT-gpdA-R 및 btsT-RF/btsT-RR을 프라이머로 사용하고, 업스트림 서열, 프로모터 및 다운스트림 서열을 증폭하고, btsT-FF 및 btsT-RR을 프라이머로 사용하여 gpdA 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 융합한다. 이어서, 발현 카세트를 플라스미드 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(btsT sgRNA를 함유함)와 함께 대장균 HM에 도입시킨 후, Cas9/sgRNA는 숙주의 btsT 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 gpdA 프로모터를 btsT 유전자 앞에 통합시키고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다.
유전자 ybdD의 발현을 강화할 경우, 대장균 HM 게놈을 주형으로 사용하고, ybdD-FF/ybdD-FR, ybdD-gpdA-F/ybdD-gpdA-R 및 ybdD-RF/ybdD-RR을 프라이머로 사용하고, 업스트림 서열, 프로모터 및 다운스트림 서열을 증폭하고, ybdD-FF 및 ybdD-RR을 프라이머로 사용하여 gpdA 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 융합한다. 이어서, 발현 카세트를 플라스미드 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(ybdD sgRNA를 함유함)와 함께 대장균 HM에 도입시킨 후, Cas9/sgRNA는 숙주의 ybdD 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 gpdA 프로모터를 ybdD 유전자 앞에 통합시키고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다.
하기 표 8은 프라이머 명칭과 서열번호에 대응되는 인덱스이다.
[표 8]
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 다양한 유형의 세포를 형질전환 분석을 위해 수집하고, 결과는 표 9에 제시된다. 5g/L의 세포 습윤 중량, 50g/L의 피루브산, 20g/L의 레보도파, 50g/L의 포도당, pH 8.0, 40℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 전세포 형질전환 시스템에서, 형질전환 시간은 12시간이다.
[표 9]
효과가 가장 우수한 대장균 HM (PG-btsT, PG-ybdD)를 대장균 HMBY라고 명명한다.
유전자 lldP의 발현을 강화할 경우, 대장균 HM 게놈을 주형으로 사용하고, 업스트림 서열, 프로모터 및 다운스트림 서열을 증폭하고, gpdA 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 수득한다. 이어서, 발현 카세트를 플라스미드 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(lldP sgRNA를 함유함)와 함께 대장균 HM에 도입시킨 후, Cas9/sgRNA는 숙주의 lldP 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 gpdA 프로모터를 lldP 유전자 앞에 통합시키고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다.
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 다양한 유형의 세포를 형질전환 분석을 위해 수집하고, 결과는 표 10에 제시된다. 5g/L의 세포 습윤 중량, 50g/L의 L-락트산, 20g/L의 레보도파, pH 8.0, 40℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 전세포 형질전환 시스템에서, 형질전환 시간은 12시간이다.
[표 10]
효과가 가장 우수한 대장균 HM (PG-lldP)를 대장균 HML이라고 명명한다.
유전자 gltS의 발현을 강화할 경우, 대장균 HM 게놈을 주형으로 사용하고, 업스트림 서열, 프로모터 및 다운스트림 서열을 증폭하고, gpdA 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 수득한다. 이어서, 발현 카세트를 플라스미드 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(gltS sgRNA를 함유함)와 함께 대장균 HM에 도입시킨 후, Cas9/sgRNA는 숙주의 gltS 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 gpdA 프로모터를 gltS 유전자 앞에 통합시키고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다.
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 다양한 유형의 세포를 형질전환 분석을 위해 수집하고, 결과는 표 11에 제시된다. 5g/L의 세포 습윤 중량, 1g/L의 L-글루탐산, 20g/L의 레보도파, pH 8.0, 40℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 전세포 형질전환 시스템에서, 형질전환 시간은 12시간이다.
[표 11]
효과가 가장 우수한 대장균 HM (PG-gltS)를 대장균 HMG라고 명명한다.
실시예 8
실시예 7의 방법에 근거하여 대장균 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 유전자(gpdA) 앞의 중간 발현 강도의 구성형 프로모터(PG)를 대장균 HMBY의 nadA 및 pdxJ 유전자 앞에 부가하고, 서열은 서열번호 8에 제시된다. 이어서, 플라스미드를 도입시킨다.
유전자 nadA의 발현을 강화할 경우, 대장균 HMBY 게놈을 주형으로 사용하고, nadA-FF/nadA-FR, nadA-gpdA-F/nadA-gpdA-R 및 nadA-RF/nadA-RR을 프라이머로 사용하고, 업스트림 서열, 프로모터 및 다운스트림 서열을 증폭하고, nadA-FF 및 nadA-RR을 프라이머로 사용하여 gpdA 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 융합한다. 이어서, 발현 카세트를 플라스미드 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(nadA sgRNA를 함유함)와 함께 대장균 HMBY에 도입시킨 후, Cas9/sgRNA는 숙주의 nadA 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 gpdA 프로모터를 nadA 유전자 앞에 통합시키고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다.
유전자 pdxJ의 발현을 강화할 경우, 대장균 HMBY 게놈을 주형으로 사용하고, pdxJ-FF/pdxJ-FR, pdxJ-gpdA-F/pdxJ-gpdA-R 및 pdxJ-RF/pdxJ-RR을 프라이머로 사용하고, 업스트림 서열, 프로모터 및 다운스트림 서열을 증폭하고, pdxJ-FF 및 pdxJ-RR을 프라이머로 사용하여 gpdA 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 융합한다. 이어서, 발현 카세트를 플라스미드 pCasRed 및 pCRISPR-gDNA(pdxJ sgRNA를 함유함)와 함께 대장균 HMBY에 도입시킨 후, Cas9/sgRNA는 숙주의 pdxJ 유전자좌에서 이중-가닥 절단을 유도하고, 재조합효소 Red는 gpdA 프로모터를 pdxJ 유전자 앞에 통합시키고, 유전자를 서열분석에 의해 검증한다.
하기 표 12는 프라이머 명칭과 서열번호에 대응되는 인덱스이다.
[표 12]
유전자 변형이 완료된 후, 공동-발현된 플라스미드를 도입시킨다. 실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 다양한 유형의 세포를 형질전환 분석을 위해 수집하고, 결과는 표 13에 제시된다. 20g/L의 세포 습윤 중량, 100g/L의 피루브산, 120g/L의 레보도파, 200g/L의 포도당, pH 9.0, 30℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 전세포 형질전환 시스템에서, 형질전환 시간은 24시간이다.
[표 13]
가장 우수한 대장균 HMBY (PG-nadA, PG-pdxJ)를 대장균 NP라고 명명한다.
유전자 변형이 종료된 후, 공동-발현된 플라스미드를 도입시킨다. 실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 다양한 유형의 세포를 형질전환 분석을 위해 수집하고, 결과는 표 14에 제시된다. 20g/L의 세포 습윤 중량, 100g/L의 L-락트산, 120g/L의 레보도파, pH 9.0, 30℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 전세포 형질전환 시스템에서, 형질전환 시간은 24시간이다.
[표 14]
가장 우수한 대장균 HML(PG-nadA, PG-pdxJ)를 대장균 NL이라고 명명한다.
유전자 변형이 종료된 후, 공동-발현된 플라스미드를 도입시킨다. 실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 다양한 유형의 세포를 형질전환 분석을 위해 수집하고, 결과는 표 15에 제시된다. 20g/L의 세포 습윤 중량, 200g/L의 L-글루탐산, 20g/L의 레보도파, pH 9.0, 30℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 전세포 형질전환 시스템에서, 형질전환 시간은 24시간이다.
[표 15]
가장 우수한 대장균 HMG (PG-nadA, PG-pdxJ)를 대장균 HNP라고 명명한다.
실시예 9
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 대장균 NP/pCOLADuet-1-lfldhd-ect1-bsgdh의 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 1g/L의 세포 습윤 중량, 1g/L의 피루브산, 1g/L의 레보도파, 1g/L의 포도당, pH 6.0, 15℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 100mL의 반응 시스템에서, 형질전환 시간은 1시간이다. 측정 결과, R-단삼소의 농도는 77mg/L이고, %e.e는 99.9 초과이다.
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 대장균 NL/pCOLADuet-1-lfldhd-ect1-llldh의 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 1g/L의 세포 습윤 중량, 1g/L의 L-락트산, 1g/L의 레보도파, pH 6.0, 15℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 100mL의 반응 시스템에서, 형질전환 시간은 1시간이다. 측정 결과, R-단삼소의 농도는 77mg/L이고 %e.e는 99.9 초과이다.
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 대장균 HNP/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-lct의 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 1g/L의 세포 습윤 중량, 1g/L의 L-글루탐산, 1g/L의 레보도파, pH 6.0, 15℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 100mL의 반응 시스템에서, 형질전환 시간은 1시간이다. 측정 결과, S-단삼소의 농도는 93mg/L이고 %e.e는 99.9 초과이다.
실시예 10
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 표 16의 박테리아 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 200g/L의 세포 습윤 중량, 200g/L의 피루브산, 200g/L의 레보도파, 200g/L의 포도당, pH 8.5, 40℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 100mL의 반응 시스템에서, 형질전환 시간은 48시간이다. 침전물을 완전히 희석 및 용해시킨 후, 결과를 측정한다.
[표 16]
실시예 2에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 표 17의 박테리아 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 200g/L의 세포 습윤 중량, 200g/L의 L-락트산, 200g/L의 레보도파, pH 8.5, 40℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 100mL의 반응 시스템에서, 형질전환 시간은 48시간이다. 침전물을 완전히 희석 및 용해시킨 후, 결과를 측정한다.
[표 17]
실시예 1에 설명된 유도 발현 방법에 근거하여 표 18의 박테리아 유도 발현이 종료된 후, 세포를 수집하고, 200g/L의 세포 습윤 중량, 20g/L의 L-글루탐산, 200g/L의 레보도파, pH 8.5, 40℃의 온도 및 250rpm의 진탕기 회전 속도를 갖는 100mL의 반응 시스템에서, 형질전환 시간은 48시간이다. 침전물을 완전히 희석 및 용해시킨 후, 결과를 측정한다.
[표 18]
상기 설명된 효소, 및 이의 공동-발현된 유전자 조작 박테리아의 변형 및 구축, 박테리아 세포의 배지 조성 및 배양 방법, 및 전세포 생체 형질전환은 단지 본 발명의 바람직한 실시형태이고, 본 발명을 한정하려는 것이 아니다. 이론적으로, 다른 박테리아, 사상 진균, 방선균 및 동물 세포는 게놈-변형될 수 있고, 다중 유전자 공동-발현의 전세포 촉매화에 사용될 수 있다. 임의의 변형 및 등가의 치환이 본 발명의 범주에 속하는 본 발명의 원리 및 사상 내에서 수행될 수 있다.
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atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60
gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120
atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180
ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240
tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300
aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360
tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420
tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480
agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540
agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600
tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660
gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720
gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780
cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840
gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900
aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960
taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020
ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080
gttcctgaca ggagaaaacc 1100
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ccaagatcac gcacgtaccg tcgatgtatc tctctgaact gccagggaaa aaccacggtt 60
agatcagcaa gcgttgccgg gaaatgggcg tcgataccat tatcgttttc gacacccact 120
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tagcctgata tgcacgctta tcttcactgt ctttcccact cgccgctggt gggatatgtc 60
aatggcgtga ttgccagcgc ccgcgagcgt attgcggctt tctcccctga actggtggtg 120
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cgtcgcggtc agtaatgtga 20
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gcaggaggtt aagatgcaat tagat 25
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tcggccactc atcaacatga ttcatacctg taagccaaaa gacgacgagt 50
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actcgtcgtc ttttggctta caggtatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
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gcttgaatag ttttttcgta tccatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
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cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgga tacgaaaaaa ctattcaagc 50
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gatacccagc gccaggccga cgata 25
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ggtggggatg gcttacatcc tgcac 25
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ggataaagcg ttcacgccgc atccgatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
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cggcttttgc cagtgaatca aacatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
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cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgtt tgattcactg gcaaaagccg 50
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<223> Synthetic DNA
<400> 33
tataacgatg ccggacaggc gctgc 25
Claims (10)
- (i) α-히드록시카르복실산 탈수소효소;
(ii) L-α-아미노산 트랜스아미나제; 및
(iii) 포도당 탈수소효소, L-락트산 탈수소효소, 및 L-글루탐산 탈수소효소 중 어느 하나
의 효소 (i) 내지 (iii)을 동시에 발현하는 재조합 대장균으로서,
여기서, 상기 α-히드록시카르복실산 탈수소효소는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) ATCC 14917, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC 35038, 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) ATCC 14931, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) DSM 1, 와이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 균주 DSM 20196 또는 락토바실루스 페르멘툼 ATCC 14931에서 유래하고,
상기 L-α-아미노산 트랜스아미나제는 대장균 BL21, 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 또는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ATCC 334에서 유래하고,
상기 포도당 탈수소효소는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 13952에서 유래하고,
상기 L-락트산 탈수소효소는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) ATCC 19257에서 유래하고,
상기 L-글루탐산 탈수소효소는 대장균 BL21, 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) ATCC BAA-808, 클로스트리듐 심비오숨(Clostridium symbiosum) ATCC 14940 또는 바실러스 서브틸리스 168에서 유래하고,
페놀 화합물의 분해와 관련된 유전자가 녹아웃(knock out)되고,
상기 페놀 화합물의 분해와 관련된 유전자가 hpaD (3,4-디히드록시페닐아세테이트 2,3-디옥시게나제) 유전자, mhpB (2,3-디히드록시페닐프로피오네이트 1,2-디옥시게나제) 유전자 또는 이들의 조합인, 재조합 대장균. - 삭제
- 제1항에 있어서,
피루브산 운반체 유전자, L-락트산 운반체 유전자, 글루탐산 운반체 유전자, NAD 합성 유전자 및 인산피리독살 합성 유전자 중 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키고, 피루브산 운반체 유전자, L-락트산 운반체 유전자 및 글루탐산 운반체 유전자가 동시에 발현되지 않는, 재조합 대장균으로서,
상기 피루브산 운반체 유전자가 btsT 및 ybdD로부터 선택되고,
L-락트산 운반체 유전자가 lldP이고,
글루탐산 운반체 유전자가 gltS이고,
NAD 합성 유전자가 nadA이고,
인산피리독살 합성 유전자가 pdxJ인, 재조합 대장균. - 삭제
- 제3항에 있어서,
발현이 증가된 유전자 앞에 구성형 프로모터를 포함하는, 재조합 대장균. - 제1항에 있어서,
동시에 발현하는 것이 pCOLADuet에 의한 것인, 재조합 대장균. - 제1항에 있어서,
숙주 대장균이 대장균 BL21인, 재조합 대장균. - 제1항, 제3항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 대장균을 배양하는 것을 포함하는, 단삼소를 생산하는 방법.
- 삭제
- 제8항에 있어서,
상기 재조합 대장균의 배양에서, 상기 재조합 대장균의 배양 농도가 1 내지 200g/L이고, 레보도파 농도가 1 내지 200g/L이고;
재조합 대장균이 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 포도당 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 재조합 대장균의 배양에서, 피루브산 농도가 1 내지 200g/L이고, 포도당 농도가 1 내지 200g/L이고;
재조합 대장균이 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-락트산 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 재조합 대장균의 배양에서, 1 내지 200g/L의 L-락트산을 더 포함하고;
재조합 대장균이 α-히드록시카르복실산 탈수소효소, L-α-아미노산 트랜스아미나제 및 L-글루탐산 탈수소효소를 동시에 발현할 때, 상기 재조합 대장균의 배양에서, 1 내지 200g/L의 L-글루탐산을 더 포함하고;
상기 재조합 대장균의 배양에서 6.0 내지 9.0의 pH를 갖고, 15 내지 40℃에서 1 내지 48시간 동안 반응하는,
단삼소를 생산하는 방법.
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| Microb. Cell Fact. 2017, 16: 84. |
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