CN108949651B

CN108949651B - 一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用

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Publication number: CN108949651B
Application number: CN201810352685.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡宇杰; 熊天真; 蒋静; 丁彦蕊; 白亚军; 郑晓晖
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Zhuohong Chaoyuan Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-04-19
Also published as: CN108949651A

Abstract

本发明公开了一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用，属于生物工程技术领域。本发明构建的工程菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L‑氨基酸氧化酶、α‑羟基羧酸脱氢酶和L‑乳酸脱氢酶。进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。该方法过程简单、杂质少，具有重要的工业应用价值。

Description

一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用

技术领域

本发明涉及一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

4-羟基苯乳酸，又名对羟基苯乳酸，学名为3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸，英文名为：4-hydroxyphenyllactic acid、p-Hydroxyphenyllactic acid，2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid。

4-羟基苯乳酸是乳酸菌发酵过程中产生的除苯乳酸外的另一种广谱、低毒的生物防腐剂，当前主要通过乳酸菌生成(中国专利CN200810244053.2)。4-羟基苯乳酸是乳酸菌发酵过程中产生的除苯乳酸外的另一种广谱、低毒的生物防腐剂，当前主要通过乳酸菌生成(中国专利CN200810244053.2)。有也文献表明，普通变形杆菌(Proteus vulgaris)可将L-酪氨酸转化成D-4-羟基苯乳酸(The influence of conditions of bacterialcleavage of proteins on the cleavage products,1917,J.Biol.Chem.527-532)。但这些方法产率低成本高。

发明内容

基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了一种新型的对羟基苯乳酸的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了对羟基苯乳酸的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产对羟基苯乳酸的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。

本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯对羟基苯乳酸的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶。

在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来自于Erwinia herbicola ATCC214344。

在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2。

在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038或者Lactobacillus fermentum ATCC 14931。

在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为L型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusa strain DSM 20196或者Lactobacillusfermentum ATCC 14931。

在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_003643296.1、WP_002335374.1、或EEI22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为L-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013858488.1、WP_003607654.1或WP_035430779.1的序列。

在一种实施方式中，D-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_GL379761REGION:COMPLEMENT(533562..534560)、NZ_KB944641REGION:161892..162830、ACGI01000078REGION:20793..21791的序列；L-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_ATUM01000014REGION:39316..40254、NZ_JQAY01000006REGION:69708..70640、NZ_GG669901REGION:45517..46470的序列。

在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257。

在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列。

在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509的序列。

在一种实施方式中，所述L-氨基酸氧化酶为的来自Proteus mirabilis ATCC29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692、Morganella morganii ATCC 49993、Providencia rettgeri DSM 1131或Ignatzschineria larvae DSM 13226中的不产过氧化氢的L-氨基酸氧化酶。

在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_004244224.1、OAT30925.1、EFE55026.1、WP_036414800.1或WP_026879504.1的序列。

在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：NZ_GG668576REGION:1350390..1351805、LXEN01000066REGION:20563..21963、ACCI02000030REGION:21025..22443、NZ_LAGC01000006REGION:309569..310993、NZ_KI783332REGION:35799..37217。

在一种实施方式中，所述重组菌，包括将编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和L-乳酸脱氢的酶的基因，连接到2个质粒上，然后将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组工程菌。

在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶基因和L-乳酸脱氢酶基因是连接到质粒pETDuet-1后表达、L-氨基酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶基因是连接到质粒pACYCDue-1后表达。

在一种实施方式中，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。

在一种实施方式中，所述敲除的酚类物质分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。

在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。

在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。

在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。

在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、hpaX(苯酚转运基因)、mhpT(苯酚转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)、ribF(FAD合成基因)中的任意一种或多种。

在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；hpaX为；NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)；mhpT为NC_012892REGION:344788..345999；nadA为NC_012892REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)；ribF为NC_012892REGION:25479..26420。

在一种实施方式中，所述重组菌是在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ和ribF，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶。

本发明的第二个目的是提供一种生产对羟基苯乳酸的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。

在一种实施方式中，所述生产对羟基苯乳酸，是进行全细胞转化生产。

在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定对羟基苯乳酸产量及构型。

本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明构建了一种新型的四酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯对羟基苯乳酸的生产。本发明选择的(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的D-对羟基苯乳酸和L-对羟基苯乳酸。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。

具体实施方案

本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-乳酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-乳酸脱氢生成丙酮酸和NADH；酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨根离子、苯酚生成L-酪氨酸；L-酪氨酸则被L-氨基酸氧化酶脱氨生成3,4-二羟基苯丙酮酸；α-羟基羧酸脱氢酶利用乳酸脱氢过程生成的NADH将3,4-二羟基苯丙酮酸还原成对羟基苯乳酸、同时实现了辅酶NAD的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

1.本发明所涉及的菌株及质粒

购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931、Escherichia coli BL21(DE3)、Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciensATCC 19692、Morganella morganii ATCC 49993、Lactococcus lactis ATCC 19257、Erwinia herbicola ATCC 214344、Aeromonas phenologenes ATCC 7966。购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ的Weissella confusa strain DSM 20196、Providencia rettgeri DSM1131、Ignatzschineria larvae DSM 13226。购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。pCasRed、pCRISPR-gDNA购自镇江爱必梦生物科技有限公司。

2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达

(1)大肠杆菌芳香化合物降解基因的敲除

本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(Biodegradationof Aromatic Compounds by Escherichia coli，Microbiol Mol Biol Rev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpaD和mhpB,NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。

(2)大肠杆菌乳酸、苯酚转运基因的组成型强化表达

在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择乳酸转运相关的基因是lldP，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:3646638..3648293。苯酚转运相关的基因是hpaX和mhpT，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)和NC_012892REGION:344788..345999。

(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达

在α-羟基羧酸脱氢酶还原过程中需要以NADH为辅酶，强化表达大肠杆菌NAD合成途径的关键酶，可以提高菌体内的NAD水平，从而有利于对羟基苯乳酸的生成。选择的基因有nadA。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:740487..741530。

磷酸吡多醛(胺)是酪氨酸酚裂解酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxJ,有利于L-酪氨酸的合成。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。

FAD是L-氨基酸氧化酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的重要基因ribF，有利于强化L-氨基酸氧化酶活性。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:25479..26420。

3.四酶偶联催化反应中酶的选择

(1)L-乳酸脱氢酶的选择

L-乳酸是最为廉价的有机酸，脱氢后成的丙酮酸具有较高的附加值。目前主要以L-乳酸氧化酶氧化L-乳酸生产丙酮酸，在此过程中L-乳酸上脱下的氢被浪费了。也有以酵母发酵生产酮酸的方法。L-乳酸脱氢酶广泛存在多种微生物中，以L-乳酸为底物将L-乳酸上生成的氢传递给辅酶NAD或NADP，从而生成NADH或NADPH。NADH或者NADPH可以作为前述的α-羟基酸脱氢酶的供氢体。通常来讲以NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶更趋向于以丙酮酸为底物合成乳酸，但当乳酸过量等情况下乳酸脱氢酶会脱掉乳酸的氢生成丙酮酸。

本发明从Lactococcus lactis ATCC 19257中得到L-乳酸脱氢酶基因llldh(氨基酸序列是WP_003131075.1)。

(2)酪氨酸酚裂解酶的选择

酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase,TPL,E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，酪氨酸酚裂解酶可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨，也可催化多巴发生β-消去反应生成邻苯二酚、丙酮酸和氨。该反应是可逆的，苯酚、丙酮酸和氨可在酪氨酸酚裂解酶催化下生成L-酪氨酸。本发明从Erwinia herbicola ATCC 214344中分别克隆得到酪氨酸酚裂解酶基因ehtpl，其氨基酸序列是P31011.2。

(3)L-氨基酸氧化酶的选择

L-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far.Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:9323-41)。L-氨基酸氧化酶将α氨基和C^α上的氢转移到FAD上，绝大部份利用分子氧直接氧化还原型FAD，再生氧化型FAD，同时生成过氧化氢。例如Poljanac等采用东部菱背响尾蛇毒L-氨基酸氧化酶氧化多巴生成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再加乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生成成3,4-二羟基苯乳酸，在此过程中另外必须添加过氧化氢酶以消除过氧化氢的毒性(Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-DihydroxyphenyllacticAcid Production Catalyzed,Chem.Biochem.Eng.Q.2005,19(4)351–358)。另外还有一类L-氨基酸氧化酶与细胞膜上电子传递链相关，电子经过呼吸链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，从而不生成过氧化氢，这种酶类主要存在于变形杆菌属(Proteus sp.)、普罗威登菌属(Providencia sp.)、摩根菌属(Morganella sp.)等细菌中(Crystalstructure of a membrane-bound l-amino acid deaminase from Proteusvulgaris.J.Struct.Biol.2016,195:306-15)。本发明选择了5种不产过氧化氢的L-氨基酸氧化酶，从Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692、Providencia rettgeri DSM 1131、Morganella morganii ATCC 49993、Ignatzschinerialarvae DSM 13226中分别克隆得到L-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、praao、mmaao、ilaao，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_004244224.1、OAT30925.1、EFE55026.1、WP_036414800.1或WP_026879504.1的序列，这些酶都具有底物广泛和活性强的特点。

(4)α-羟基羧酸脱氢酶的选择

根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对3，4-二羟基苯丙酮酸具有较强活性的酶，用于D或L对羟基苯乳酸的生产。从Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到D型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为WP_003643296.1、WP_002335374.1、EEI22188.1的序列。从Bacillus coagulans DSM1、Weissella confusa strain DSM 20196、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到L型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013858488.1、WP_003607654.1、WP_035430779.1的序列。

4.共表达体系的构建及细胞的培养

将以上选择的L-氨基酸氧化酶、(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶、酪氨酸酚裂解酶中每任选一个与L-乳酸脱氢酶进行四酶组合共表达。

目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，基因后带有T7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。采用pACYCDue-1和pETDuet-1两种质粒，每个质粒上包含两个基因，将构建好的质粒同时热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于双抗(Kan与Cm)的固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。

5.全细胞转化生产光学纯对羟基苯乳酸

细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定对羟基苯乳酸产量及构型。

6.样品的检测分析

对羟基苯乳酸的定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配紫外检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长280nm。

手性分析：PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示紫外检测器，Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，进样量20μL，检测波长280nm。

对羟基苯乳酸溶解度较低，转化过程如有结晶析出，则稀释后测定。

对羟基苯乳酸的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。

当生产R-对羟基苯乳酸时，

对映体过量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)×100％]

当生产S-对羟基苯乳酸时，

对映体过量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_R+S_S)×100％]

式中S_S为转化液中S-对羟基苯乳酸的峰面积，S_R为转化液中R-对羟基苯乳酸的液相色谱峰面积。

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

根据文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法将Escherichia coli BL21(DE3)上的hpaD和mhpB进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(hpaD sgRNA)与同源臂(hpaDdonor)一起导入Escherichia coli BL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaD基因位点发生双链断裂，重组酶Red将hpaD donor整合到hpaD基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpaD sgRNA、hpaD donor、mhpB sgRNA、mhpB donor分别如序列表SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示。mhpB以同样的方式敲除。

配置pH为8的溶液，苯酚或D-对羟基苯乳酸2g/L，湿菌体量100g/L，35℃放置10小时后测定浓度，表1中显示了反应体系中苯酚和D-对羟基苯乳酸的剩余量。。

表1表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度

	苯酚g/L	D-对羟基苯乳酸g/L
			Escherichia coli BL21(DE3)	0.7	0.7
Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)	1.8	2.0
			Escherichia coli BL21(ΔhpaD,DE3)	1.3	1.7
Escherichia coli BL21(ΔmhpB,DE3)	1.4	1.4

很显然Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)效果最好，将之命名为Escherichia coli HM。

实施例2

α-羟基羧酸脱氢酶酶学性质的比较。通常这种酶类也可能具有还原丙酮酸生成乳酸的能力，因此不能还原或极微弱还原丙酮酸的酶是比较好的。以丙酮酸为底物，比较了不同酶的还原能力，根据文献(粘质沙雷氏菌H3010发酵型D-乳酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质研究.工业微生物,2012,42(04):30-37.)所述的方法测定以NAD为辅酶还原丙酮酸的活性，实验结果如表1所示。

诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。

表2各种α-羟基羧酸脱氢酶还原丙酮酸活性比较

重组菌	活性U/ml
		Escherichia coli HM/pETDuet-1-lpldhd	6.5
Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd	0
		Escherichia coli HM/pETDuet-1-lfldhd	0.7
Escherichia coli HM/pETDuet-1-bcldhl	5.1
		Escherichia coli HM/pETDuet-1-wcldhl	0.2
Escherichia coli HM/pETDuet-1-lfldhl	5.9

实施例3

重组大肠杆菌构建：首先将编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶的基因，分别连接到pETDuet-1或pACYCDuet-1质粒上。得到两种双基因共表达重组质粒，将两种质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21，利用氯霉素和氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。

将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为20g/L，苯酚浓度为10g/L，L-乳酸浓度为10g/L，pH 8.0，氨根离子浓度30g/L；于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定对羟基苯乳酸产量及构型。

表3各种重组菌的比较

实施例4

采用文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法，将Escherichia coli HM基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:9所示。

强化基因lldP表达时，以Escherichia coli HM基因组为模板，以引物lldP-FF/lldP-FR、lldP-gpdA-F/lldP-gpdA-R、lldP-RF/lldP-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以lldP-FF和lldP-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含lldP sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在lldP基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到lldP基因之前，并测序验证。

强化基因hpaX表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含hpaX sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaX基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到hpaX基因之前，并测序验证

强化基因mhpT表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含mhpT sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在mhpT基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到mhpT之前，并测序验证

下表为引物名称与序列表序号的对应索引。

表4引物名称与序列表序号对照

根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重10g/L，L-乳酸200g/L，苯酚10g/L，pH 8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。

表5转化结果比较

将效果最好的Escherichia coli HM(PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT)命名为Escherichia coli HMLHM。

实施例5

根据实例4的方法将Escherichia coli HMLHM中nadA、pdxJ、ribF基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQID NO:9所示。然后再将质粒导入。

强化基因nadA表达时，以Escherichia coli HMLHM基因组为模板，以引物nadA-FF/nadA-FR、nadA-gpdA-F/nadA-gpdA-R、nadA-RF/nadA-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nadA-FF和nadA-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含nadA sgRNA)一起转入Escherichia coli HMLHM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在nadA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到nadA基因之前，并测序验证。

强化基因pdxJ表达时，采用实施例4中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pdxJ-gRNA)一起转入Escherichia coli HMLHM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在pdxJ基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到pdxJ基因之前，并测序验证

强化基因ribF表达时，采用实施例4中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pdxJ-gRNA)一起转入Escherichia coli HMLHM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在ribF基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到ribF基因之前，并测序验证

下表为引物名称与序列表序号的对应索引。

表6引物名称与序列表序号对照

名称	序列表中编号
		ribF sgRNA	SEQ ID NO:17
nadA sgRNA	SEQ ID NO:2
		pdxJ sgRNA	SEQ ID NO:16

基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/L，L-乳酸200g/L，苯酚200g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。

表7转化结果比较

将最好的Escherichia coli HMLHM(PG-nadA,PG-ribF,PG-pdxJ)命名为Escherichia coli NRP。

实施例6

根据实施例2所述诱导表达方法，将Escherichia coli NRP/pETDuet-1-wcldhl-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，L-乳酸1g/L，苯酚1g/L，pH 6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，S-对羟基苯乳酸浓度为96mg/L。

实施例7

根据实施例2所述诱导表达方法，将表7中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/L，L-乳酸200g/L，苯酚200g/L，pH 8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果。

表8

以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用

<130> 2018.3.15

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gattgccacc gtccacgagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttaacggcgt cggcttcggg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaatacaatc tctgtaggtt cttct 25

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcggccactc atcaacatga ttcatgagtc tgttgctcat ctccttgtca 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgacaaggag atgagcaaca gactcatgaa tcatgttgat gagtggccga 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgtagttttg ttgccagaga ttcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgaa tctctggcaa caaaactacg 50

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taacacctga cccgcagtgt aaccg 25

<210> 9

<211> 1100

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<400> 9

atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60

gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120

atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180

ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240

tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300

aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360

tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420

tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480

agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540

agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600

tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660

gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720

gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780

cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840

gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900

aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960

taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020

ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080

gttcctgaca ggagaaaacc 1100

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tatgcccgtc gatcgcgccc 20

<210> 11

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccaagatcac gcacgtaccg tcgatgtatc tctctgaact gccagggaaa aaccacggtt 60

agatcagcaa gcgttgccgg gaaatgggcg tcgataccat tatcgttttc gacacccact 120

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcatcgagta cctcttgcgc 20

<210> 13

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tagcctgata tgcacgctta tcttcactgt ctttcccact cgccgctggt gggatatgtc 60

aatggcgtga ttgccagcgc ccgcgagcgt attgcggctt tctcccctga actggtggtg 120

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgaacagaaa gacgatcagg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcgggatgaa gatgatgaag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgtcgcggtc agtaatgtga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagcacacac ccttcttgcg 20

Claims

1.一种生产对羟基苯乳酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌同时共表达了酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶，并且还敲除了酚类物质分解基因hpaD和酚类物质分解基因mhpB中的任意一种或者两种组合；所述重组菌为重组大肠杆菌（ E.coli ）。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶来自于草生欧文氏菌（Erwinia herbicola） ATCC 214344。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述α-羟基羧酸脱氢酶为来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 14917、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）ATCC35038或者发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）ATCC 14931的D型α-羟基羧酸脱氢酶，或者来自凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）DSM 1、魏氏菌（Weissella confusa strain）DSM 20196或者发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）ATCC 14931的L型α-羟基羧酸脱氢酶。

4.一种生产对羟基苯乳酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-3任一所述的重组菌来生产对羟基苯乳酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生产对羟基苯乳酸是利用权利要求1-3任一所述的重组菌进行全细胞转化生产。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200 g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组菌还强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ和ribF基因中的任意一种或多种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述强化表达是通过将大肠杆菌BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组菌是在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ和ribF，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶。