CN108949649B - 一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用 - Google Patents

一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的能低成本生产纯多左旋巴的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源L‑乳酸脱氢酶、NADH氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了芳香化合物降解基因；进一步地，本发明的4、重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因、氨根离子转运基因、邻苯二酚转运基因、NAD合成基因、磷酸吡多醛合成基因一种或者多种。本发明的菌可应用于左旋多巴的生产，生产过程简单、杂质少且原料易得，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
左旋多巴(左旋多巴、L-DOPA、3-羟基-L-酪氨酸)，是用于治疗金森氏病的重要化合物。目前左旋多巴的来源有猫豆提取法、化学合成法、酶法、基因工程菌。猫豆中左旋多收的含量可达9％以上，但受种植面积、气候等影响较大，产量有限(猫豆荚壳中L-DOPA的提取及含量测定，天然产物研究与开发，1992,4(4):27-30。化学合成法需要使用大量的金属催化剂，会产生较大的污染(美国专利US4716246)。大肠杆菌工程菌利用葡萄糖为原料重头合成左旋多巴的产率较低(Genome Engineering Escherichia Coli for L-DopaOverproduction from Glucose.Scientific Reports,2016.6:30080)，目前无法与化学合成及猫豆提取竞争。
酶法生产左旋多巴是最为吸引人的一个方法，已有多种方案被设计(Overview onthe biotechnological production of L-DOPA.Appl Microbiol Biotechnol.2015,99(2):575-84)，其中以丙酮酸和邻苯二酚为底物的转化方法已在工业上实施(DOPAproduction with Enterobacter cloacae NB320by transamination Reaction,Arg.biol.chem,1973.587-591)。丙酮酸是较为昂贵的一种中间体，因此专利201310289373.0采用未提纯的丙酮酸料液直接进行转化，或者先用乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸，然后再进一步催化生产左旋多巴(或酪氨酸)(多酶偶联生物合成丙酮酸和L--酪氨酸研究，2014，南京大学硕士论文)，但丙酮酸易分解，这种方案效率并不高。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了不生成氧化氢的转化乳酸和邻苯二酚产左旋多巴的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了三酶共表达的工程菌，实现了左旋多巴的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能生产左旋多巴并减少杂质生成的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明的第一个目的是提供能低成本生产纯多左旋巴的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了芳香化合物降解基因。
在一种实施方式中，所述外源L-乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的L-乳酸脱氢酶。外源的NADH氧化酶为乳酸菌来源的NADH氧化酶。
在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来自于Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus plantarum ATCC 14917。
在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1(llldh)、KRL33571.1(lpldh)的序列。
在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509、AZEJ01000016REGION:16296..17249的序列。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451、Lactobacillus brevis ATCC 14869。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1、WP_056958268.1、ERK43827.1序列。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000002REGION:complement(39571..40911)、NZ_AYYM01000013REGION:complement(15875..17233)、AWVK01000048REGION:complement(50022..51416)的序列。
在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来源于草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacter intermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)、嗜热菌Symbiobacterium thermophilum或者Symbiobacteriumtoebii。
在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来源于Citrobacter freundii ATCC8090，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003837154.1的序列。
在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶、酪氨酸酚裂解酶是通过pETDuet-1共表达的。
在一种实施方式中，所述芳香化合物降解基因包括左旋多巴分解基因、邻苯二酚分解基因中的任意一种或者两种组合。
在一种实施方式中，所述左旋多巴分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。
在一种实施方式中，所述邻苯二酚分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。
在一种实施方式中，所述左旋多巴分解基因和邻苯二酚分解基因的核苷酸序列是NCBI上,NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还强化表达了将底物转运至细胞内的乳酸转运蛋白基因、邻苯二酚转运相关基因、氨根离子转运基因中的任意一种或者多种。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还进一步强化表达了NAD合成基因、磷酸吡多醛合成相关基因中的任意一种或者多种。
在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、amtB(氨根离子转运基因)、hpaX(邻苯二酚转运基因)、mhpT(邻苯二酚转运基因)、icsA(NAD合成基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。
在一种实施方式中，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；amtB为NC_012892REGION:442006..443292；hpaX为；NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)；mhpT为NC_012892REGION:344788..345999；icsA为NC_012892REGION:complement(2526116..2527330)；nadA为NC_012892REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。
本发明的第二个目的是提供一种生产光学纯左旋多巴的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。
在一种实施方式中，所述生产左旋多巴，是进行全细胞转化生产。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/L，L-乳酸1-200g/L，邻苯二酚浓度1-200g/L，pH 7.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。
本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种新型的三酶共表达基因工程菌，该菌可应用于左旋多巴的生产。本发明选择方案不产过氧化氢，细胞不易分解左旋多巴，并且细胞内有较高的NAD含量。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方案
本发明的大肠杆菌工程菌的功能核心是可以共表达三种酶，分别为L-乳酸脱氢酶(L-Lactate dehydrogenase)、NADH氧化酶(NADH oxidase)、酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase)。其原理为：在工程菌全细胞内，L-乳酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-乳酸脱氢生成丙酮酸和NADH；NADH氧化酶将NADH氧化生成NAD，实现了辅酶NAD的再生。然后在酪氨酸酚裂解酶的作用下丙酮酸、氨根离子、邻苯二酚合成为左旋多巴，同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1.本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus brevis ATCC 14869、Citrobacterfreundii ATCC 8090购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ。pCasRed、pCRISPR-gDNA购自镇江爱必梦生物科技有限公司。
2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达
(1)大肠杆菌芳香化合物降解基因的敲除
本发明中的邻苯二酚和左旋多巴都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(Biodegradation of Aromatic Compounds by Escherichia coli，Microbiol Mol BiolRev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpaD和mhpB,NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。
(2)大肠杆菌乳酸、邻苯二酚、氨根离子转运基因的组成型强化表达
在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择乳酸转运相关的基因是lldP，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:3646638..3648293。邻苯二酚转运相关的基因是hpaX和mhpT，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)和NC_012892REGION:344788..345999。氨根离子转运相关的基因是amtB，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:442006..443292。
(3)大肠杆菌NAD合成相关基因的过表达
在乳酸脱氢过程中需要以NAD为辅酶，强化表达大肠杆菌NAD合成途径的关键酶，可以提高菌体内的NAD水平，从而有利于丙酮酸的生成。选择的基因有icsA、nadA。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(2526116..2527330)、NC_012892REGION:740487..741530。
(4)磷酸吡多醛(Pyridoxal phosphate)合成相关基因的表达
磷酸吡多醛(胺)是酪氨酸酚裂解酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxJ,有利于左旋多巴的合成。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。
3.乳酸转化生成丙酮酸相关酶的选择
(1)L-乳酸脱氢酶的选择
L-乳酸是最为廉价的有机酸，目前主要以L-乳酸氧化酶氧化L-乳酸生产丙酮酸，在此过程中产生过氧化氢，过氧化氢会氧化丙酮酸生成乙酸。L-乳酸脱氢酶广泛存在多种微生物中，通常以NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶更趋向于以丙酮酸为底物合成乳酸，但当乳酸过量或碳源只有乳酸时一些乳酸脱氢酶会脱掉乳酸的氢生成丙酮酸，以L-乳酸为底物将L-乳酸上生成的氢传递给辅酶NAD或NADP，从而生成NADH或NADPH。
本发明从Lactococcus lactis ATCC 19257和Lactobacillus plantarum ATCC14917中分别得到L-乳酸脱氢酶基因llldh(氨基酸序列是WP_003131075.1)和lpldh(氨基酸序列是KRL33571.1)，表达产物用于乳酸的脱氢。
(2)NADH氧化酶的选择
乳酸脱氢酶从乳酸上脱氢生成丙酮酸NADH。NADH需要被NAD氧化酶氧化重新生成NAD,从而实现反应的持续进行。NADH氧化酶有产水型和产过氧化氢型两种，产水型的NADH氧化酶不会产生过氧化氢毒性。本发明分别从Lactobacillus sanfranciscensisDSM20451、Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus brevis中得到产水型NADH氧化酶基因lsnox(氨基酸序列是WP_056958268.1)、llnox(氨基酸序列是WP_003131075.1)、lbnox(氨基酸序列是ERK43827)，表达产物用于NAD的再生。.
(3)酪氨酸酚裂解酶的选择
来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacterintermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)以及嗜热菌Symbiobacteriumthermophilum和Symbiobacterium toebii等的酪氨酸酚裂解酶是最常研究。本发明从中选择活性较高的来源于弗氏柠檬酸细菌的酶，从Citrobacter freundii ATCC 8090中得到酪氨酸酚裂解酶基因cftpl(氨基酸序列是WP_003837154.1)。
4.共表达体系的构建及细胞的培养
目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，基因后带有T7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含三个基因，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
5.全细胞转化生产左旋多巴
全细胞转化体系为：细胞湿重为1-200g/L，L-乳酸1-200g/L，邻苯二酚1-200g/L，pH 7.0-9.0，温度20-50℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。
6.样品的检测分析
左旋多巴的定量分析采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
根据文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法将Escherichia coli BL21(DE3)上的hpaD和mhpB进行单或双敲除，其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(hpaD sgRNA)与同源臂(hpaDdonor)一起导入Escherichia coli BL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaD基因位点发生双链断裂，重组酶Red将hpaD donor整合到hpaD基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpaD sgRNA、hpaD donor、mhpB sgRNA、mhpB donor分别如序列表SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。mhpB以同样的方式敲除。
配置pH为8的溶液，邻苯二酚或左旋多巴2g/L，湿菌体量100g/L，35℃放置10小时后测定浓度。表1中显示了反应体系中，邻苯二酚或左旋多巴的剩余量。
表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度
菌株 邻苯二酚g/L 左旋多巴g/L
Escherichia coli BL21(DE3) 0.6 0.7
Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3) 1.7 1.8
Escherichia coli BL21(ΔhpaD,DE3) 1.3 1.5
Escherichia coli BL21(ΔmhpB,DE3) 1.4 1.2
很显然Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)效果最好，将之命名为Escherichia coli HM。
实施例2
重组大肠杆菌构建：首先将编码乳酸脱氢酶、NADH氧化酶、酪氨酸酚酸裂解酶的基因，分别连接到质粒pETDuet-1上。得到各种三基因共表达重组质粒后，将质粒转化大肠杆菌Escherichia coli HM，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
收集到的细胞进行转化分析，结果如表2所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重100g/L，L-乳酸50g/L，邻苯二酚50g/L，pH 8.0，温度为35℃，摇床转速250转/分钟；转化时间10小时。
表2共表达大肠杆菌生成左旋多巴的效率比较
菌株 左旋多巴g/L
Escherichia coli HM/pETDuet-1-lsnox-llldh-cftpl 39.2
Escherichia coli HM/pETDuet-1-lsnox-lpldh-cftpl 53.1
Escherichia coli HM/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 61.3
Escherichia coli HM/pETDuet-1-llnox-lpldh-cftpl 53.6
Escherichia coli HM/pETDuet-1-lbnox-llldh-cftpl 38.1
Escherichia coli HM/pETDuet-1-lbnoxl-pldh-cftpl 50.2
由上表可以看出Escherichia coli HM/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl结果最好。
实施例3
根据实例2所述的菌株构建方法(各类质粒根据说明明书采用不同的抗性平板筛选阳性转化子)及诱导表达方法，收集各类细胞进行转化分析，结果如表3所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重50g/L，L-乳酸10g/L，邻苯二酚10g/L，pH 7.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间10小时。
表3各种表达质粒对于生产左旋多巴的比较
Figure BDA0001633796680000071
Figure BDA0001633796680000081
由上表可以看出采用pETDuet-1共表达时效果最好。
实施例4
采用文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法，将Escherichia coli HM基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:10所示。
强化基因lldP表达时，以Escherichia coli HM基因组为模板，以引物lldP-FF/lldP-FR、lldP-gpdA-F/lldP-gpdA-R、lldP-RF/lldP-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以lldP-FF和lldP-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含lldP sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在lldP基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到lldP基因之前，并测序验证。
强化基因hpaX表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含hpaX sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaX基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到hpaX基因之前，并测序验证
强化基因mhpT表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含mhpT sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在mhpT基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到mhpT之前，并测序验证
强化基因amtB表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含amtB sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在amtB基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到amtB基因之前，并测序验证
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表4引物名称与序列表序号对照
Figure BDA0001633796680000082
Figure BDA0001633796680000091
根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重10g/L，L-乳酸50g/L，邻苯二酚10g/L，pH 8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。
表5转化结果比较
菌株 左旋多巴g/L
Escherichia coli HM(PG-lldP)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 7.8
Escherichia coli HM(PG-hpaX)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 7.3
Escherichia coli HM(PG-mhpT)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 6.5
Escherichia coli HM(PG-amtB)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 6.2
Escherichia coli HM(PG-hpaX，PG-mhpT)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 8.4
Escherichia coli HM(PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 9.2
Escherichia coli HM(PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT,PG-amtB)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 8.9
Escherichia coli HM/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 6.2
将效果最好的Escherichia coli HM(PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT)命名为Escherichia coli HMLHM。
实施例5
根据实例4的方法将Escherichia coli HMLHM中icsA、nadA、pdxJ基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQID NO:10所示。然后再将质粒导入。
强化基因icsA表达时，采用实施例4中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含icsA-gRNA)一起转入Escherichia coli HMLHM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在icsA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到icsA基因之前，并测序验证
强化基因nadA表达时，采用实施例4中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含nadA-gRNA)一起转入Escherichia coli HMLHM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在nadA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到nadA基因之前，并测序验证
强化基因pdxJ表达时，采用实施例4中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pdxJ-gRNA)一起转入Escherichia coli HMLHM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在pdxJ基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到pdxJ基因之前，并测序验证
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表6引物名称与序列表序号对照
名称 序列表中编号
icsA sgRNA SEQ ID NO:2
nadA sgRNA SEQ ID NO:3
pdxJ sgRNA SEQ ID NO:16
基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/L，L-乳酸200g/L，邻苯二酚200g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。
表7转化结果比较
菌株 左旋多巴g/L
Escherichia coli HMLHM(PG-icsA、PG-nadA)pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 78.6
Escherichia coli HMLHM(PG-icsA)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 52.2
Escherichia coli HMLHM(PG-nadA)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 81.2
Escherichia coli HMLHM(PG-nadA,PG-pdxJ)/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 90.2
Escherichia coli HMLHM/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl 53.1
将最好的Escherichia coli HMLHM(PG-nadA,PG-pdxJ)命名为Escherichia coliHP
实施例6
根据实施例2所述诱导表达方法，将Escherichia coli HP/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，L-乳酸1g/L，邻苯二酚1g/L，pH 7.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，左旋多巴浓度为31mg/L。
实施例7
根据实施例2所述诱导表达方法，将Escherichia coli HP/pETDuet-1-llnox-llldh-cftpl诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/L，L-乳酸200g/L，邻苯二酚200g/L，pH 8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。测定结果，左旋多巴浓度为321g/L。左旋多巴难溶于水，高浓度下会析出，此结果为稀释后测定的结果。同样条件下Escherichia coli BL21(DE3)/pCOLADuet-1-llnox-llldh的左旋多巴浓度为212g/L。
以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用
<130> 2018.3.15
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattgccacc gtccacgagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggctggcag gctgaagaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttaacggcgt cggcttcggg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatacaatc tctgtaggtt cttct 25
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcggccactc atcaacatga ttcatgagtc tgttgctcat ctccttgtca 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgacaaggag atgagcaaca gactcatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtagttttg ttgccagaga ttcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgaa tctctggcaa caaaactacg 50
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taacacctga cccgcagtgt aaccg 25
<210> 10
<211> 1100
<212> DNA
<213> Escherichia coli BL21(DE3)
<400> 10
atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60
gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120
atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180
ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240
tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300
aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360
tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420
tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480
agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540
agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600
tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660
gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720
gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780
cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840
gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900
aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960
taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020
ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080
gttcctgaca ggagaaaacc 1100
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tatgcccgtc gatcgcgccc 20
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccaagatcac gcacgtaccg tcgatgtatc tctctgaact gccagggaaa aaccacggtt 60
agatcagcaa gcgttgccgg gaaatgggcg tcgataccat tatcgttttc gacacccact 120
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcatcgagta cctcttgcgc 20
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tagcctgata tgcacgctta tcttcactgt ctttcccact cgccgctggt gggatatgtc 60
aatggcgtga ttgccagcgc ccgcgagcgt attgcggctt tctcccctga actggtggtg 120
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgaacagaaa gacgatcagg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgtcgcggtc agtaatgtga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggtaatggct gcacctgcgg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcgggatgaa gatgatgaag 20

Claims (6)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了芳香化合物降解基因；所述芳香化合物降解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合；所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因、氨根离子转运基因、邻苯二酚转运基因、NAD合成基因、磷酸吡多醛合成基因一种或者多种；所述L-乳酸脱氢酶为氨基酸序列是WP_003131075.1的L-乳酸脱氢酶Llldh，或氨基酸序列是KRL33571.1的L-乳酸脱氢酶Llpldh；所述NADH氧化酶为氨基酸序列是WP_056958268.1的NADH氧化酶lsnox，或氨基酸序列是ERK43827.1的NADH氧化酶lbnox；所述酪氨酸酚裂解酶为氨基酸序列是WP_003837154.1的酪氨酸酚裂解酶cftpl；所敲除的基因hpaD的NCBI accession NO为NC_012892 REGION: 4505585..4506436；所敲除的基因mhpB的NCBI accession NO为NC_012892 REGION: 339806..340750。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了L-乳酸脱氢酶Llldh、NADH氧化酶llnox和酪氨酸酚裂解酶cftpl，敲除了芳香化合物降解基因hpaD和mhpB，并且强化表达了乳酸转运基因lldP、邻苯二酚转运基因hpaX、邻苯二酚转运基因mhpT、NAD合成基因nadA、磷酸吡多醛合成基因pdxJ。
4.一种生产光学纯左旋多巴的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/L，L-乳酸1-200g/L，邻苯二酚浓度1-200g/L，pH 7.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。
6.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌或者权利要求5所述的方法在左旋多巴生产中的应用。
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