CN107299072B

CN107299072B - 一种工程菌及其应用

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Publication number: CN107299072B
Application number: CN201710652387.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡宇杰; 熊天真; 刘金彬; 丁彦蕊; 白亚军; 郑晓晖
Original assignee: Jiangnan University; Northwestern University
Current assignee: Jiangnan University; Northwestern University
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2037-08-02
Also published as: WO2019024220A1; CN107299072A

Abstract

本发明公开了一种三酶共表达的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：它导入了L‑氨基酸氧化酶基因、(D/L)‑α‑羟基羧酸脱氢酶基因和可以还原NAD(P)的基因。本发明还公开了上述重组大肠杆菌的构建方法和应用。本发明方法应用于生物合成光学纯α‑羟基羧酸，具有操作简单，成本低，产物合成效率高，光学纯度高的特点，具有良好的产业化前景。

Description

一种工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种共表达三酶的大肠杆菌基因工程菌的构建，以及该工程菌在生产α-羟基羧酸中的应用。

背景技术

α-羟基羧酸(α-羟酸，2-羟酸，α-hydroxy-carboxylic acid，2-hydroxy-carboxylic acid)在自然界广泛存在，其结构特点是羧基侧C位有一个羟基。光学纯α-羟基羧酸是重要的精细化工中间体和手性药物前体。

通常可以把α-酮基羧酸(α-keto carboxylic acids)用作底物，进行化学手性加氢合成α-羟基羧酸，或者酶法合成(中国专利201410818165.X)α-羟基羧酸，但α-酮基羧酸及手性催化剂价格昂贵，产业化较难。

也有通过酯酶水解α-羟基羧酸酯的方法制备光学纯α-羟基羧酸(中国专利200910049768.7)，但酯酶手性选择性差，而且最高只有50％的收率。

另有通过野生菌直接转化L-氨基酸生成α-羟基羧酸，但与基因工程菌相比，效率较低(中国专利201610853578.0)。

中国专利201610080101.3公开了一种通过多酶作用处理外消旋α-羟羧酸生成光学纯2-羟酸的方法，但化学合成的外消旋α-羟基羧酸成本较高。

早在1988年Roth等人提出了先以化学法处理L-二羟苯丙氨酸(L-多巴)得到对应的α-酮基羧酸，再酶法合成(S)-3,4-二羟基苯基乳酸的方法(Enzymatic Synthesis of(S)-(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid,Arch.Pharm.(Weinheim)321,179-180(1988))。WO专利WO2002033110公开了一种通过廉价L-氨基酸为底物，转化生产α-羟基羧酸的方法，该方法首先用氨基酸氧化酶(或表达氨基酸氧化酶的大肠杆菌全细胞)脱掉氨基酸的α-氨基生成对应的α-酮酸，然后将菌体去除(也可不去除)，再加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，羟基羧酸脱氢酶，甲酸脱氢酶等反应一定时间后生成α-羟基羧酸。该方法中NAD价格昂贵，而且反应一定时间后会分解失效，另外羟酸脱氢酶和甲酸脱氢酶都是由不同的菌种培养得到，极大地增加了反应成本。

Wolfgang等综述了氧化-还原串联反应，全细胞(一锅法)实现对底物经济有效的转化(Recent biocatalytic oxidation–reduction cascades,Current Opinion inChemical Biology 2011,15:249–256)。当前多酶串联的全细胞催化简单前体生成高副加值产物已经被广泛应用(Constructing Biocatalytic Cascades:In Vitro and in VivoApproaches to de Novo Multi-Enzyme Pathways,ACS Catal.,2017,7(1),710–724)。例如苏氨酸脱氨酶-羟酸脱氢酶-甲酶脱氢酶共表达系统用于转化L-苏氨酸生成2-羟基丁酸，苏氨酸脱氨酶也称为苏氨酸脱水酶具有高度的底物专一性，此酶会脱掉苏氨酸的3-羟基和2-氨基，催化苏氨酸脱水分解生成氨和α-酮丁酸(Efficient Biosynthesis of(R)-or(S)-2-Hydroxybutyrate from l-Threonine through a Synthetic Biology Approach,ACSCatal.,2016,358(18),2923–2928)。Rantwijka综述了通过羟基腈裂解酶-腈转换酶-酰胺水解酶串联反应生产(S)-α-羟基羧酸和(S)-α-羟基羧酸酰胺(Enzymatic cascadesynthesis of(S)-2-hydroxycarboxylic amides and acids:Cascade reactionsemploying a hydroxynitrile lyase,nitrile-converting enzymes and an amidase,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2015，114,25-30)，但这类方法的底物较为昂贵。

基于目前各种方法的缺陷，本发明构建了一种多酶共表达的大肠杆菌，实现了对L-α-氨基酸的全细胞催化转化，催化过程过程中保持化合物上其它基团不发生改变，仅α-氨基转化成α-羟基，实现了对应的光学纯α-羟基羧酸的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产α-羟基羧酸的大肠杆菌重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。

上述大肠杆菌的功能核心在于可以同时表达3种酶，分别为L-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和可将NAD(P)还成NAD(P)H的酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-氨基酸氧化酶将L-α-氨基酸氧化成对应的α-酮酸；另外两种酶构成NAD辅酶循环再生体系，由α-羟基羧酸脱氢酶将α-酮酸还原成α-羟基羧酸。实现了全细胞三酶串联一步法将L-α-氨基酸转化成光学纯α-羟基羧酸。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

1.本发明所涉及的菌株及质粒

购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 8041、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931、Proteusmirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692、Morganella morganiiATCC 8019、Komagataella phaffii ATCC 76273、Bacillus subtilis ATCC 13952和Pseudomonas abietaniphila ATCC 700689。购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ的Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusa strain DSM 20196、Providenciarettgeri DSM 1131和Ignatzschineria larvae DSM 13226。购自Qiagen公司的pQLinkN质粒和Escherichia coli M15。

2.酶的选择

(1)L-氨基酸氧化酶的选择

L-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far？Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:9323-41)。L-氨基酸氧化酶将α氨基和C^α上的氢转移到FAD上，绝大部份利用分子氧直接氧化还原型FAD，再生氧化型FAD，同时生成过氧化氢。例如Poljanac等采用东部菱背响尾蛇毒L-氨基酸氧化酶氧化多巴生成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再加乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生成成3,4-二羟基苯乳酸，在此过程中另外必须添加过氧化氢酶以消除过氧化氢的毒性(Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-Dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed,Chem.Biochem.Eng.Q.2005,19(4)351–358)。另外还有一类L-氨基酸氧化酶与细胞膜上电子传递链相关，电子经过呼吸链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，从而不生成过氧化氢，这种酶类主要存在于变形杆菌属(Proteus sp.)、普罗威登菌属(Providencia sp.)、摩根菌属(Morganella sp.)等细菌中(Crystal structure of a membrane-bound l-amino acid deaminase fromProteus vulgaris.J.Struct.Biol.2016,195:306-15)。本发明选择了5种不产过氧化氢的L-氧基酸氧化酶，从Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC19692、Morganella morganii ATCC 8019、Providencia rettgeri DSM 1131、Ignatzschineria larvae DSM 13226中分别克隆得到L-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、mmaao、praao、ilaao，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11所示，这些酶都具有底物广泛和活性强的特点。

(2)α-羟基羧酸脱氢酶的选择

根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对多种α-酮酸均有强活性的酶，用于各类光学纯的α-羟基羧酸生产。从Lactobacillus plantarum ATCC 8041、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到D型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。从Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusastrain DSM 20196、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到L型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

(3)可还原NAD(P)的酶的选择

在生物转化反应中，α-羟基羧酸脱氢酶需要以NADH和/或NADPH为辅酶，本发明从Komagataella phaffii ATCC 76273中得到甲酸脱氢酶基因kpfdh(核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示)、从Bacillus subtilis ATCC 13952得到葡萄糖脱氢酶基因bsgdh(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、从Pseudomonas abietaniphila ATCC 700689中得到亚磷酸脱氢酶基因papdh(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)。

3.三酶共表达体系的构建

将以上选择的L-氨基酸氧化酶、(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶、可还原NAD(P)的酶中每类任选一个酶，进行三酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用LIC(ligation independent cloning)衔接子来实现多个基因的定位连接的方法，将三个基因放入Addgene的pQLinkN质粒。基因操作根据相关协议完成(Vectors for co-expressionof an unrestricted number of proteins.Nucleic Acids Research.2007；35(6):e43)，首先将以上所有的酶单独连接到pQLinkN质粒上，然后通过LINK克隆技术实现多基因连接。

得到三基因共表达重组质粒后，将该质粒转化大肠杆菌Escherichia coli M15，利用氨苄青霉素(Ampicillin)平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。

4.全细胞转化生产光学纯α-羟基羧酸

细胞的准备：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)中，当细胞OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。

全细胞转化体系为：根据不同底物的溶解性，底物浓度控制在0.1-10g/L，并根据构建的不同质粒的性质加入供氢体浓度为1-10g/L，调节pH在4.0-8.0之间,新鲜湿菌体量为10-200g/L。然后于15-40℃，转化0.5-24小时。转化结束后液相色谱测定产量及旋光性。当构建的三酶共表达质粒中含有葡萄糖脱氢酶时，供氢体为葡萄糖。当构建的三酶共表达质粒中含有甲酸脱氢酶时，供氢体为甲酸钠。当构建的三酶共表达质粒中含有亚磷酸脱氢酶时，供氢体为亚磷酸。

全细胞转化体系中的底物为下列之一：L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天门冬氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-组氨酸。

这些底物经相应的全细胞转化，可对应生成光学纯的R或S型α-羟基羧酸，分别为：吲哚-3-乳酸(indole-3-lactic acid)，3-苯基乳酸(phenyllactic acid)，4-羟基苯乳酸(4-hydroxyphenyllactic acid)，3,4-二羟基苯基乳酸(3,4-dihydroxyphenyllacticacid)，乳酸(lactic acid)，2-羟基异戊酸(2-hydroxyisovalerate)，2-羟基-3-甲基戊酸(2-hydroxy-3-methylpentanoic acid)，2-羟基-4-甲基戊酸(2-hydroxy-4-methylpentanoic acid)，2-羟基戊二酸(2-hydroxypentanedioic acid)，2-羟基-4-甲硫基丁酸(2-hydroxy-4-(methylsulfanyl)butanoic acid)，2,3-二羟基丙酸(2,3-dihydroxypropanoic acid)，2,3-二羟基丁酸(2,3-dihydroxybutanoic acid)，2-羟基-3-巯基丙酸(2-hydroxy-3-sulfanylpropanoic acid)，2-羟基丁二酸(2-hydroxybutanedioic acid)，5-胍基-2-羟基戊酸(5-carbamimidamido-2-hydroxypentanoic acid)，6-氨基-2-羟基己酸(6-amino-2-hydroxyhexanoic acid)，5-氨基-2-羟基-5-氧代戊酸(5-amino-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid)，4-氨基-2-羟基-4-氧代丁酸(4-amino-2-hydroxy-4-oxobutanoic acid)，2-羟基-3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(2-hydroxy-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoic acid)。

5.样品的检测分析

定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。

手性分析：PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器，Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，进样量20μL。

α-羟基羧酸的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。

当生产(R)-α-羟基羧酸时，

对映体过量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

当生产(S)-α-羟基羧酸时,

对映体过量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_R+S_S)]×100％

式中S_S为转化液中(S)-对映体的峰面积，S_R为转化液中(R)-对映体的液相色谱峰面积。

本发明的有益效果是构建了一种新型的三酶共表达大肠杆菌工程菌，该菌可应用于光学纯的α-羟基羧酸的生产。本发明选择的L-氨基酸氧化酶和(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，因此同一株工程菌在改变不同底物的情况下可生产出多种产物，该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

三基因共表达体系的构建。

(1)引物设计

设计引物，引物序列如表1所示

表1扩增基因所用的引物

(2)PCR扩增

按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara)抽提处于对数生长期的菌株的基因组DNA，用表1中的引物从各自对应的菌株中进行PCR扩增。扩增体系为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.55U/μL)0.5μL、10×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、模板DNA 1μL、Up引物(20μM)1μL、Down引物(20μM)1μL、ddH₂O补足到50μL。扩增程序为：94℃，10min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环；72℃，10min。PCR产物送华大基因测序确证。

从Lactobacillus plantarum ATCC 8041、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931分别得到D-α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd；从Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusa strain DSM 20196、Lactobacillus fermentum ATCC 14931分别得到L-α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、lfldhl、wcldhl；从Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC19692、Morganella morganii ATCC 8019、Providencia rettgeri DSM 1131、Ignatzschineria larvae DSM 13226分别得到L-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、mmaao、praao、ilaao；从Komagataella phaffii ATCC 7627、Bacillus subtilis ATCC 13952、Pseudomonas abietaniphila ATCC 70068分别得到可还原NAD(P)的酶基因kpfdh、bsgdh、papdh。

(3)pQLinkN单功能基因质粒构建

酶切体系为：10×cut buffer 5μL，DNA 10μL，限性内切酶1和限制性内切酶2各1μL，无菌水33μL。将pQLinkN质粒和步骤(2)中的PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。

由于各基因的限制性内切酶位置的不同，有如下4种情况。

pQLinkN、lpldhd、lfldhl、bcldhl、pmaao、papdh、kpfdh用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切。

pQLinkN、efmdhd、wcldhl用EcoRⅠ和BsrGⅠ双酶切。

pQLinkN、lfldhd、cmaao、mmaao、ilaao用HindⅢ和BsrGⅠ双酶切。

pQLinkN、bsgdh、praao用HindⅢ和SphI双酶切。

然后分别回收上述4种情况下的酶切产物，并于16℃水浴下连接12-16h。连接体系为：10×DNA ligase buffer 2.5μL，DNA片段8μL，载体DNA 2μL，T4DNA ligase 1μL，无菌水11.5μL共25μL。随后在连接体系中加入100μL DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将菌体均匀涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，培养24h，然后提取质粒，双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性，最后保存正确转化子，得到如下质粒：

含有D-α-羟基羧酸脱氢酶基因的pQLinkN-lpldhd、pQLinkN-efmdhd、pQLinkN-lfldhd；含有L-α-羟基羧酸脱氢酶基因的pQLinkN-lfldhl、pQLinkN-bcldhl、pQLinkN-wcldhl。以下将这些质粒称为pQLinkN-a质粒，a代表一种羟基羧酸脱氢酶基因。

含有可还原NAD(P)的酶基因的pQLinkN-kpfdh、pQLinkN-bsgdh、pQLinkN-papdh。以下将这些质粒称为pQLinkN-b质粒，b代表一种可还原NAD(P)的酶基因。

含有L-氨基酸氧化酶基因的pQLinkN-pmaao、pQLinkN-cmaao、pQLinkN-praao、pQLinkN-mmaao、pQLinkN-ilaao。以下将这些质粒称为pQLinkN-c质粒，c代表一种L-氨基酸氧化酶基因。

(4)氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶基因、可还原NAD(P)酶基因，三基因pQLinkN共表达质粒的构建。

pQLink-a质粒中任选一个用SwaI，于25℃进行酶切(10×cut buffer 3μL，质粒4μL，SwaI 1μL,无菌水22μL)，pQLink-b质粒中任选一个用PacI，于37℃进行酶切(10×cutbuffer 3μL，质粒4μL，PacI 1μL，无菌水22μL)，酶切之后分别回收得到含a基因和b基因的片段。分别用LIC qualified T4DNA聚合酶对回收的片段进行处理，处理pQLink-a质粒缓冲液成分为50mM Tris-HCL，pH 8.0，10mM MgCl₂，5μg/ml BSA，5mM DTT，2.5mM dGTP，处理pQLink-b质粒缓冲液成分为50mM Tris-HCL，pH 8.0，10mM MgCl₂，5μg/ml BSA，5mM DTT，2.5mM dCTP。于25℃水浴30min，然后在65℃水浴20min进行LIC qualified T4DNA聚合酶的热灭活。分别取经T4DNA聚合酶处理过的基因a和基因b各5μL进行混合。在65℃条件下水浴5min，然后在25℃的条件水浴30min进行低温退火。加入2μL EDTA(25mM/L)，得到连接质粒。随后在连接体系中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将菌体均匀涂布在含氨苄青霉的LB平板上，培养24h，然后提取质粒，双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性，保存正确转化子，得到质粒pQLinkN-a-b。

最后pQLinkN-c质粒用pQLinkN-a的处理方法进行处理，pQLinkN-a-b用pQLinkN-b的处理方法进行处理，重复上述过程，得到pQLinkN-c-a-b质粒，将重组质粒导入大肠杆菌M15感受态中，保存备用。

本实施例最终构建了如下12株工程菌：大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lpldhd-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-pmaao-lpldhd-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-wcldhl-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-pmaao-wcldhl-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-praao-lfldhd-papdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-ilaao-wcldhl-papdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-mmaao-efmdhd-kpfdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-mmaao-bcldhl-kpfdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lfldhd-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lfldhl-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-bcldhl-bsgdh、大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-efmdhd-bsgdh。

实施例2

实施例1中获得的基因工程菌的诱导表达。

挑取构建好的基因工程菌单菌落接种于10mL LB培养基中(含0.1g/L氨苄青霉素)，37℃培养12小时，2％的体积比接种于LB培养基中(1000mL摇瓶装液200mL，含0.1g/L氨苄青霉素)，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期(OD₆₀₀达0.6-0.8)，加IPTG到浓度为0.4mM，20℃，200rmp条件下培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。根据转化所需菌体量，可增加摇瓶数量以获得充足的菌体。

实施例3

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lpldhd-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，考察不同底物分别与全细胞混合后的转化情况，底物终浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，各类底物的反应情况如下表所示。

表2大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lpldhd-bsgdhcf对不同底物的转化情况

实施例4

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-pmaao-lpldhd-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，考察不同底物分别与全细胞混合后的转化情况，底物终浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，各类底物的反应情况如下表所示。

表3大肠杆菌M15/pQLinkN-pmaao-lpldhd-bsgdh对不同底物的转化情况

实施例5

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-wcldhl-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，考察不同底物分别与全细胞混合后的转化情况，底物终浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，各类底物的反应情况如下表所示。

表4大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-wcldhl-bsgdh对不同底物的转化情况

实施例6

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-pmaao-wcldhl-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，考察不同底物分别与全细胞混合后的转化情况，底物终浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，各类底物的反应情况如下表所示。

表5大肠杆菌M15/pQLinkN-pmaao-wcldhl-bsgdh对不同底物的转化情况

实施例7

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-praao-lfldhd-papdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-半胱氨酸浓度为0.1g/L，亚磷酸浓度为1g/L，调节pH为4.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度20℃，转化12小时后测定结果，生成(2R)-2-羟基-3-巯基丙酸，浓度为51mg/L，％e.e.>99。

实施例8

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-ilaao-wcldhl-papdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-半胱氨酸浓度为0.1g/L，亚磷酸浓度为1g/L，调节pH为4.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度20℃，转化12小时后测定结果，生成(2S)-2-羟基-3-巯基丙酸，浓度为77mg/L，％e.e.>99。

实施例9

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-mmaao-efmdhd-kpfdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-苯氨酸浓度为10g/L，甲酸钠浓度为10g/L，调节pH为8.0，添加新鲜全细胞重量为10g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，生成(R)-3-苯基乳酸，浓度为9.8g/L，％e.e.>99。

实施例10

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-mmaao-bcldhl-kpfdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-苯氨酸浓度为10g/L，甲酸钠浓度为10g/L，调节pH为8.0，添加新鲜全细胞重量为10g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，生成(S)-3-苯基乳酸，浓度为9.6g/L，％e.e.>99。

实施例11

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lfldhd-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-多巴为1g/L，葡萄糖浓度为1g/L，调节pH为6.0，添加新鲜全细胞重量为1g(湿重)，温度25℃，转化24小时后测定结果，生成(R)-3,4-二羟基苯基乳酸，浓度为280mg/L，％e.e.>99。

实施例12

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-lfldhl-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-苯氨酸浓度为1g/L，葡萄糖浓度为5g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为15g(湿重)，温度35℃，转化24小时后测定结果，生成(S)-3-苯基乳酸，浓度为920mg/L，％e.e.>99。

实施例13

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-bcldhl-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-苯氨酸浓度为1g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为4.0，添加新鲜全细胞重量为10g(湿重)，温度15℃，转化8小时后测定结果，生成(S)-3-苯基乳酸，浓度为220mg/L，％e.e.>99。

实施例14

根据实施例2所述诱导表达方法，将重组大肠杆菌M15/pQLinkN-cmaao-efmdhd-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-亮氨酸终浓度为1g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为6.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度40℃，转化0.5小时后测定结果，生成(2R)-2-羟基-4-甲基戊酸，浓度为181mg/L，％e.e.>99。

以上所述的L-氨基酸氧化酶、(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶、可还原NAD(P)的酶及其共表达基因工程菌的构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均就包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

西北大学

<120> 一种工程菌及其应用

<130> 2017.8.1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum ATCC 8041

<400> 1

atgaaaatta ttgcatatgc tgtacgtgat gacgaacgtc cattcttcga tacttggatg 60

aaagaaaacc cagatgttga agtaaaatta gttccagaat tacttactga agacaacgtt 120

gacttagcta aaggtttcga cggtgccgat gtataccaac aaaaggacta tactgctgaa 180

gtattaaaca agttagccga cgaaggggtt aagaacatct ctcttcgtaa cgttggtgtt 240

gataacttgg acgttcctac tgttaaagca cgtggcttaa acatttctaa cgtacctgca 300

tactcaccaa atgcgattgc tgaattatca gtaacgcaat tgatgcaatt attacgtcaa 360

accccaatgt tcaacaagaa gttagctaag caagacttcc gttgggctcc agacatcgct 420

aaagaattaa acacgatgac tgttggtgtt attggtactg gccgtatcgg tcgcgcagcc 480

attgatatct tcaaaggttt cggtgctaag gttatcggtt acgatgttta ccggaatgct 540

gaacttgaaa aagaaggtat gtacgttgat actttggacg aattatacgc ccaagctgat 600

gttatcacgt tacacgttcc tgcattgaag gataactacc acatgttaaa tgcggatgcc 660

ttcagcaaga tgaaagatgg cgcctacatc ttaaacttcg ctcgtgggac actcatcgac 720

tcagaagact tgatcaaagc cttggacagt ggcaaagttg ccggtgctgc cctcgttacc 780

tacgaatacg aaactaagat cttcaacaag gatcttgaag gtcaaacgat tgatgacaag 840

gtcttcatga acttgttcaa ccgtgacaac gttttgatta caccacatac ggctttctac 900

actgaaactg ccgttcacaa catggtgcac gtttcaatga acagcaacaa gcaattcatc 960

gaaactggta aagctgacac gcaagttaag tttgactaa 999

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> Enterococcus faecalis ATCC 35038

<400> 2

atgaaaattg caattgcagg ggccggcgcg atgggttccc ggttcggact gatgttgaaa 60

caaggtggta acgatgtttt gctaatcgac ggctggcagg agcatatcaa tgccatcaaa 120

gaaaacggat tgaaggctaa ttataatggc gaagaaatta ctgttaaagt cccaattgtt 180

aatcagaatg aggtgcccac tggtgagcaa tttgatttga ttatcttatt cacgaaggca 240

atgcagttgg aaaaaatgct gcaggatgtt aaaccattaa ttgctgatca cacagaagtt 300

ttgtgtcttt taaacggtat cggtcatgaa gacgtaatcg aaaaattcgt accgatggaa 360

aaaatcttta tcggcaacac catgtggact gctggtctag aaggtcccgg caaggctaaa 420

ttatttggca gcgggtctgt tgaattgcaa aatctaggta ttggccaaga agaatcagcg 480

aaaaaattgg cggaaacttt gtccgcgtct ggtttaaatg ccaaatattc cgacaacatt 540

cattattcaa tttatcgtaa agcttgtgtc aatggtacga tgaatggctt atgcacgatt 600

ttagacgtca atatggcggg gcttggtgca accaaacctg ctcatgacat ggtagtgact 660

attgttaacg aatttgcagc tgttgctgcc aaagaaaacg tcaacttaga cattcccgaa 720

gtaatcgaac atgtagaaac ttgttttgac ccgactacga ttggtatgca tttcccatcg 780

atgcaccaag acttgataaa aaataaccgt ttgaccgaga ttgactacat caacggagcc 840

atttctcgta aaggtaaaaa atatggagta gtaactcctt actgtgattt cttaacgcaa 900

ctggttcata gtaaagaaga aattctagga gcaaaatag 939

<210> 3

<211> 999

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum ATCC 14931

<400> 3

atggcaaaaa tttacgcata cggaatccgc aaggacgaag aaccttactt gaacgaatgg 60

gcaaagaacc acgctgacgt gacggtcgac tacacggccg aactgttgac gccggaaacg 120

gccgctcaag cagctggtgc tgatggggta gttgtttacc aacaactcga ctacaccgct 180

gaaacgctcc aagccctcgc cgaccagggc gttactaaga tgtccttgcg taacgtgggg 240

atcgacaaca tcgacatggc caaggctaag gaactgggct ttgaaatcac caacgttccg 300

gtttactctc cgaacgccat cgctgaacac gccgctatcc aaacggcccg catccttcgt 360

caatccaaga agttagacga aaagatcgaa aacggggacc tccgttgggc accaaccatc 420

ggccgcgaag ttcgtgacca agtggttggg gttgttggta cgggtcacat cggtcaagtc 480

ttcatgcaaa tcatggaagg cttcggcgct aaggtgatcg cctacgacgt ctttaaggat 540

ccggaactgg aaaagaaggg ctactacgtt tccttggacg aaatctacgc ccaagctgac 600

gttatttccc tccacgtacc ggccctggaa agcacgatcc acatgatcaa tgacgaaacg 660

atcgccaaga tgaaggacga cgccgtactg gttaacgttt ctcgtggtcc gttggttgac 720

accgacgccg ttatccgtgc cctggactcc ggcaagctgt tcggttttgt catggatact 780

tacgaagacg aagtggggat cttcaacgaa gactggcaag gtaaggaatt ccctgacgcc 840

cgccttaacg acttgatcca ccgcgacaac gtcttggtaa cgcctcacac tgccttctac 900

accacgcacg cagttcgcaa catggtatta aaggccttcg acaacaacct ggccctggtt 960

aagggtgaag aacctgaaac cccagttaag gttggttaa 999

<210> 4

<211> 954

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum ATCC 14931

<400> 4

gtgtctaaga ctcatcaaaa agttgtttta atcggtgacg gagccgttgg ttctagttac 60

gcttttgcca tggttcaaca agggttggcc caagaatttg ccatcattga cttgaacaag 120

aagcgcacgg aaggggacgc cctcgacctc gaagacgcta ccccgttcac ggccccaaag 180

ctggtttacg gcgccgatta cgacacgtgc aaggacgccg acctggttgt gatcacggcc 240

ggtgccccac aaaagccggg tgaaacccgt ctggacctcg ttgacaagaa cttgaagatc 300

atcaagtccg ttgttgaacc ggttgttaag tctggtttcc aagggatctt cttagtcgct 360

gctaacccag ttgacatctt aacttacgcc gtacaaaagt tctccggctt cccacgcaac 420

aaggtggttg gttccgggac ctccctggac tccgctcgtc tgcgggttgg tttgtccaag 480

ctgttcaacg ttagcccggt tgacgtgaac gccaacatga tggctgaaca cggtgacacg 540

gaatttgccg ccttctcctc tgcaacgatc ggtggtttac cactgtacga tctggcagaa 600

gccaagggca tttccaagga cgacctttac aagttagaag acgatgttcg taacaaggct 660

tacgccatca tcaactccaa gggtgcgacc ttctacggtg tggccactgc cctgatgcgg 720

atttcccgtg ccatcctgcg cgacgaaaac gccgtcttgc cagttggtgc cccaatgagc 780

ggcgaatacg gcttaaagga catctacatt ggtaccccgg ccgtgatcaa cgctaacggg 840

atcgccgaag tcctcgaagt tccgctggac gaacgcgaag ccaaggcgat ggccgactcc 900

gctaagaccc tgaaagaaat cgctaagaac gggatggcta agattcaagg ctaa 954

<210> 5

<211> 939

<212> DNA

<213> Bacillus coagulans DSM 1

<400> 5

atgaaaaaag tcaatcgtat tgcagtggtt ggaacgggtg cagttggtac aagttactgc 60

tacgccatga ttaatcaggg tgttgcagaa gagcttgttt taatcgatat taacgaagca 120

aaagcagaag gggaagccat ggacctgaac cacggcctgc catttgcgcc tacgccgacc 180

cgcgtttgga aaggcgatta ttccgattgc ggcactgccg atcttgttgt cattacagca 240

ggttccccgc aaaaaccggg cgaaacaagg cttgatcttg tttccaaaaa cgcaaaaatt 300

tttaaaggca tgattaagag catcatggac agcggcttta acgggatttt tcttgttgcc 360

agcaacccgg ttgacatttt gacatatgta acttggaaag agtccggcct gccgaaagaa 420

catgttatcg gttcgggcac agtgcttgac tccgcgcgtc tccgcaactc tttgagcgcc 480

caatttggaa ttgacccgcg caatgtgcat gctgcgatta tcggcgaaca cggcgatacg 540

gaacttccgg tatggagcca tacaaatatc ggttacgata cgattgaaag ctatctacaa 600

aaaggaatta ttgacgaaaa gacgttagat gacatttttg tcaatacgag agatgcggct 660

tatcatatta ttgaacgaaa aggggccaca ttttacggca tcgggatgtc cctgacccgg 720

attacaaggg caatcctgaa caatgaaaac agcgtattga cggtctctgc atttcttgaa 780

ggccaatacg gaaacagcga tgtgtacgtt ggcgttccgg ccatcatcaa tcgccagggc 840

atccgtgaag tggttgaaat caaactgaac gaaaaagaac aggaacagtt caatcattct 900

gtaaaagtgc taaaagaaac aatggcaccg atattgtaa 939

<210> 6

<211> 933

<212> DNA

<213> Weissella confusa DSM 20196

<400> 6

atggcacgta agattggaat tatcggcctt ggaaacgttg gggctgcagt agcgcacgga 60

ttgattgcac aaggtgtagc cgacgactac gtctttattg atgcaaacga agcaaaggtg 120

aaggctgatc aaattgattt ccaagacgca atggcgaact tggaagcgca cggtaacatt 180

gtgattaacg attgggcagc cttggctgat gctgatgttg tgatttcaac actggggaac 240

atcaagttgc aacaagacaa cccaaccggt gaccgttttg ctgagttgaa gtttaccagc 300

agcatggtgc aatcagtcgg cacaaacttg aaggaatctg gtttccacgg cgtattggtc 360

gtgatttcaa acccggtcga cgtgattacg gccttgttcc aacacgtgac tggtttccca 420

gctcacaagg ttatcggaac cggtactttg cttgacacgg cgcgtatgca acgtgcagtt 480

ggtgaggcgt ttgatttgga tccacgttct gtttcaggtt acaacttggg tgagcacggt 540

aactcacaat tcgtagcttg gtcaacggtg cgcgtgatgg gtcaaccaat cgtgacgttg 600

gctgatgccg gcgatattga cttggcggcc atcgaagagg aagcacgtaa gggtggcttc 660

acggtcttga atggtaaggg ctacacgagt tatggtgttg caacgtcagc aatccgcatt 720

gccaaggctg ttatggctga cgcgcatgct gaattggttg tctcaaatcg tcgcgatgac 780

atgggaatgt acttgtcata cccagcgatt attggtcgcg atggtgtctt ggcagaaacg 840

acgcttgatt tgacgacgga tgagcaagaa aagcttttgc aatcacgtga ctacatccaa 900

caacgtttcg acgaaattgt ggatacactc taa 933

<210> 7

<211> 1416

<212> DNA

<213> Proteus mirabilis ATCC 29906

<400> 7

atggcaataa gtagaagaaa atttattctt ggtggcacag tggttgctgt tgctgcaggc 60

gctggggttt taacacctat gttaacgcga gaagggcgtt ttgttcctgg tacgccgaga 120

catggttttg ttgagggaac tggcggtcca ttaccgaaac aagatgatgt tgttgtaatt 180

ggtgcgggta ttttaggtat catgaccgcg attaaccttg ctgagcgtgg cttatctgtc 240

acaatcgttg aaaaaggaaa tattgccggc gaacaatcat ctcgattcta tggtcaagct 300

attagctata aaatgccaga tgaaaccttc ttattacatc acctcgggaa gcaccgctgg 360

cgtgagatga acgctaaagt tggtattgat accacttatc gtacacaagg tcgtgtagaa 420

gttcctttag atgaagaaga tttagaaaac gtaagaaaat ggattgatgc taaaagcaaa 480

gatgttggct cagacattcc atttagaaca aaaatgattg aaggcgctga gttaaaacag 540

cgtttacgtg gcgctaccac tgattggaaa attgctggtt tcgaagaaga ctcaggaagt 600

ttcgatcctg aagttgcgac ttttgtgatg gcagaatatg ccaaaaaaat gggtatcaaa 660

attttcacaa actgtgcagc ccgtggttta gaaacgcaag ctggtgttat ttctgatgtt 720

gtaacagaaa aaggaccaat taaaacctct cgtgttgttg tcgccggtgg tgtttggtca 780

cgtttattta tgcagaacct aaatgttgat gtaccaacat tacctgctta tcaatcacag 840

caattaatta gcgcagcacc aaatgcgcca ggtggaaacg ttgctttacc cggcggaatt 900

ttctttcgtg aacaagcgga tggaacgtat gcaacttctc ctcgtgtcat tgttgctccg 960

gtagtaaaag aatcatttac ttacggctat aaatatttac ctctgctggc tttacctgat 1020

ttcccagtac atatttcgtt aaatgagcag ttgattaatt cctttatgca atcaacacat 1080

tgggatctta atgaagagtc gccatttgaa aaatatcgtg atatgaccgc tctgcctgat 1140

ctgccagaat taaatgcctc actggaaaaa ctgaaaaaag agttcccagc atttaaagaa 1200

tcaacgttaa ttgatcagtg gagtggtgcg atggcgattg caccagatga aaacccaatt 1260

atctctgatg ttaaagagta tccaggtcta gttattaata ctgcaacagg ttggggaatg 1320

actgaaagcc ctgtatcagc agaaattaca gcagatttat tattaggcaa aaaaccagta 1380

ttagatgcca aaccatttag tctgtatcgt ttctaa 1416

<210> 8

<211> 1401

<212> DNA

<213> Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692

<400> 8

ttgctaggca ttggtgctgc tggcgtactt gctggtggtg cggccacttt agttccaatg 60

gttcgccgtg atggtaaatt tgttgaatct aaatcaagag ctttatttgt tgaaagtact 120

gagggtgccc tgccatcaga atctgatgtg gtcattattg gaggtggtat tcaaggtatc 180

atgacagcga ttaatttagc tgaacgtggt atgagtgtca ccattttaga aaaaggcgag 240

gttgctggag agcaatcagg ccgcgcatac agccaaatca ttagctacca aacgtcaccc 300

gaaattttcc cattgcatca ttacggaaaa attttatggc gtggtatgaa cgaaaaaatt 360

ggtgctgata ccagctatcg cacacaaggt cgagttgaag cgcttgctga tgaaaaagca 420

ttagatagag cgcaagaatg gatcaaaaca gccaaagaaa cagcaggatt tgatgtacct 480

ttaaatactc gtattattaa gggtgaagag ttatcaaata gattagtagg tgcacaaaca 540

ccttggactg ttgctgcttt tgaagaagat tctggttctg tcgatcctga aacgggtaca 600

ccaacattag cgcgttatgc taaacaaatt ggtgttaaaa tctatactca ttgcgcagta 660

agaggtattg aaacagcagg tggtaaaatt tctgatgttg tcactgaaaa aggtgcaata 720

agaacatcta acgttgttct tgctgggggt atttggtcac gtttattcat ggggaatatg 780

ggggttgatc ttccaacctt gaatgtttac ttatcacaac aacgtgtatc cggtgttcca 840

ggcgcaccac gtggtaatgt gcatttacca aatggtatcc actttcgaga acaagctgac 900

ggcacttatg ctgtagcccc acgtatcttc acaagctcca ttgttaaaga tagtttccta 960

ttagggccta aatttatgca cttattaggt ggtggtgagc taccattaga attctctatt 1020

ggtgaagact tgtttaattc attcaaaatg cctacatcat ggaaattaga cgaaaaatca 1080

ccttttgagc aatatcgcat cgcgactgca acacaaaata ctgagcattt agatgctgta 1140

ttccaaagaa tgaaaacaga attcccagta tttgaaaaat cacaaattgt tgaacgttgg 1200

ggtgcagttg taagtccaac atttgatgaa ttaccgatta tttcagaagt aaaagagtac 1260

ccaggtcttg ttatcaatac agcgacagtg tggggaatga cagaaggtcc tgctgccggt 1320

gaagttaccg cagatattgt gacgggtaaa aaacccgtca ttgatccaac gccatttagt 1380

ttggatcgct ttaagtcgta a 1401

<210> 9

<211> 1419

<212> DNA

<213> Providencia rettgeri DSM 1131

<400> 9

atggctataa ctagaagaaa atttttgatt ggcggtggtg ttgttgccgt tgctgcaggg 60

gctggaattt taactccaat gttaacgcgt gaaggtcgat ttgttcctgg taagccacga 120

catggctttg ttgcaggaac tgaaggccct ctaccacagc aagctgacgt cgttgttatt 180

ggtgctggaa ttctggggat catgaccgca attgagctgg ttggacgtgg tttagatgtt 240

gttattgttg aaaaaggtaa catcgcaggc gagcaatcat cccgcttcta cggccaagtt 300

atcacttata aaatgccaga tgaaaccttc ttactccacc acttaggcaa acaacgttgg 360

agagagatga acgcgaaagt cggtgcagat acaagctatc gtactcaagg ccgcgttgaa 420

gtgccattcg atgaagaaga tcttgtcaat gttagagagt ggattgatac tcgcagtaaa 480

aatgtcggtt cagatattcc attcaaaaca cgcattatcg aaggtgctga actcaaccaa 540

cgtttaaacg gtgcgcagtc taaatggacc attgcagggt ttgaagaaga ctctggtagc 600

ttagatgctg aaattgcaac cttcgtcatg gctgattacg cgaaaaaatt aggaataaaa 660

atttatacta actgtgcagc aagaggttta gaaactcaag caggcgtaat ttctgatgtc 720

gtcaccgaga aagggcctat caagacctca cgtgttgttg tggcaggtgg cgtctggtca 780

aggctgttta tgcaaaactt aggtgtggat gtcccaacat taccagctta tcaatctcaa 840

caactgatca ccggttcacc aactgcaccg gggggtaacg ttgctttacc ggggaatatt 900

ttcttccgtg aacaagcaga tggtacctat gcaacatctc ctcgtgtgat tgttgcaccg 960

gttgttaaag actccttcgt ctatggctat aaatacattc cactgctatc tatgcctgat 1020

ttccctgtgc atatttcatt aaatgaacaa ttaattaatt catttactga gccaacaagc 1080

tggaaactgg atgaagtttc accatttgaa aaacacagaa atatgacggc attacctgat 1140

ttaccagagc tgaatgcatc atttgagaaa ttaaaaacag aattccctgc atttaaggat 1200

tctaaactga ttgaccaatg gagtggtgct atggccatcg caccagatga gcacccaatc 1260

atttctcaag tcaatgaata tcctggtcta gttatcaata ctgccacagg ctgggggatg 1320

accgaaagcc cagtttcttc cgagctcaca gctgacttgc tattaggcaa agaaccctca 1380

ctgaatgtga aaccatttag tctgtacaga tttagttaa 1419

<210> 10

<211> 1425

<212> DNA

<213> Morganella morganii ATCC 8019

<400> 10

atgaaaatct cacgcagaaa gttaatttta ggggttggtg ctgccggcgt tctggcaggt 60

ggtgcttcag tattagttcc tatggttcgc cgtgacggta aatttgtgga atcggcttca 120

cgcgcaaaac atgtcgacgg caccgaaggt gcattaccga aagagtccga tgccgtcatt 180

atcggcggcg gtatgatggg gatcatgaca gcgattaacc tggcggaaag aggcatgagc 240

gtcaccgtcc tggaaaaagg tgaaatcgcc ggtgagcaat ccggacgtgc ttacagccag 300

atcatcagct acaaaacatc caaagaaatt ttcccgctgc accattacgg caaaatctta 360

tggcgcggta tgaatgaaaa aatcggggcg gataccagct atcgtaccca gggccgtgtt 420

gaggtgccgt caagtgcaga agatctcgaa aaatcacagg cctgggttga gaacgccaaa 480

gagtgggccg ctgattttga agcgccgctc aacacccgct ttattcaggg tgacgagctg 540

aaaaaacgtc tggttgatgc caaaacagac tggccggttg ccggttttga agaagattca 600

ggcagtgttg atccggaaac cggtgtaccg gttctggcac agtatgccaa atccctgggt 660

gttaaaatct acactaactg cgcggtccgt ggtatcgaaa ctgccggtgg taaagtctct 720

gatgtggtca cagaaaaggg cgcaatcaaa acctctcatg tggtgctgac cggcggtatc 780

tggtcacgcc tgtttatggg taacctggga attgatatcc cgacactcaa cgtttacctg 840

tcacaacagc gtgtttccgg cgttccgggt gcaccacgcg gtaacgtgca tctgccgagc 900

ggcattcact tccgcgagca ggctgacggt acttatgccg tggcaccgcg tatcttcacc 960

agttcagtgg taaaagacag cttcctgctg ggacctaagt ttatgcatct gctgggcggc 1020

ggtgaattac cgctggaatt ctctgtcggt gaagatctgt tcaactcctt caaaatggcc 1080

acatcctgga atctggatga agccacgccg ttcgagactt accgtatcgc gacagccacg 1140

cagaataccg aacatctgga tgcggtattt gcccgcatga aagcggaatt ccctgtattt 1200

gaacaatcga aagtcgttga acgctggggc gcggttgtcg caccaaccta cgatgaactg 1260

ccgattattt ccgaagtgaa agagtatccg ggtctggtaa tcaataccgc gaccgtctgg 1320

ggtatgacgg aaggtcctgc atccggtgaa attaccgcgg acatcgtcac cggtaaaaaa 1380

ccggttattg acccggctcc gtttagtctt tcacgtttta gttaa 1425

<210> 11

<211> 1419

<212> DNA

<213> Ignatzschineria larvae DSM 13226

<400> 11

atgaaaattt cacgacgaaa attccttatc ggagctggtg cagtgggtgc attaggtgca 60

ggagctgtag ttacccctat gatgcgtaga gaaggaacgt tgattcaaac tcaatctcgg 120

gcgcaacatg ttgtggggac tgaaggccct ttgccgaagc aatctgacgt tgtgattatc 180

ggtgctggta ttcaaggaat tatgactgcg attaatctta gagagcgcgg tttaagcgtc 240

accatctgtg agaaaggtga agtcggtggt gagcaatcag gtcgtgctta tagccaaatt 300

atcagctata aaacctcccc tgaaattttc cctctacatc attatggcaa aaaattgtgg 360

cgtgaaatga atgcgcgtgt caatgatgat acaagctatc gtacacaagg tcgagtggaa 420

gccattgcaa cagataaaga acttgcaaca gtgagagaat ggattgcgtt gaatagcgaa 480

gatccaggct ttgatacacc ccttaaaaca cgtattattc atggtgaaga gctagcagct 540

cgtcttccgg atgcacaaac caattgggag attgctgggt ttgaagaaga tgcaggttct 600

gttgatcctg aaaccggtac gcctgtgtta gcgcgttatg cccaaagaat cggtgtaaaa 660

atctttacta attgtgcagt gcgaggcatt gaaactgaag gtggcaaaat tgctgatgtg 720

gtcactgaaa ggggcaatat caagacttca tcagtggtgt tagccggcgg tatttggtca 780

cgtcttttca tggggaactt aggcgttgat cttccaacac tcaatgttta cctttcacaa 840

caacgtgttt caggcgttcc tggcgcacca aaaggcaatg ttcatttgcc aaatggcatc 900

catttccgcg aacaagctga tggtacttat gctgttgctc ctcgtatttt cacaagctca 960

atcgtgaaag atagcattct cttagggcct aaatttatgc atcttttagg gggcggtgaa 1020

ttaccgcttg agttcaaaat tggccccgat ttcttaagtt cattccaaat tccaacctct 1080

tggaatttag atgaagtcac gccatttgag aaaaatcgta ttgtaacggc aacacaaaat 1140

aatgaacatt tagatgcggt atttaatcgg atgaaacgtg aattcccaca atttgaagcc 1200

tcagaggtgg ttgagcgttg gggtgcaatc gtggcaccga cttacgatga attaccgatt 1260

atctctaaag tgccacaata tccaggttta gtgattaata ctgcaacagt ttggggtatg 1320

acagaaagcc ctgcagcagg tgaattaacg gctgatttag taatggacag aaaacctgtg 1380

attaatccaa caccatttga tgtaacacgt tttagctaa 1419

<210> 12

<211> 1098

<212> DNA

<213> Komagataella phaffii ATCC 76273

<400> 12

atgaaaatcg ttctcgtttt gtactccgct ggtaagcacg ccgccgatga accaaagttg 60

tatggttgta tcgaaaatga attgggtatt agacaatggc ttgagaaggg cggccatgaa 120

ttggttacta catcagacaa agagggtgaa aactctgagt tagaaaagca cattcctgac 180

gctgatgtga ttatttccac tccattccat ccagcctaca tcacgaagga gagaatccaa 240

aaagccaaga agctgaagtt gttggtcgtt gctggtgtcg gttccgacca cattgacttg 300

gactacattg aacaaaatgg cctagatatt tcggtcctag aggttactgg ttccaacgtt 360

gtttcagtgg ctgagcatgt cgttatgact atattgaact tggtgagaaa ctttgttcca 420

gctcacgagc aaattgttaa ccacggctgg gacgttgctg ccatcgccaa ggacgcctac 480

gatatcgaag gtaagaccat cgcaacaatt ggtgctggaa gaattggtta cagagtctta 540

gagagacttg tggctttcaa ccctaaggaa ttgttgtact acgactacca aggtcttcca 600

aaagaggccg aggaaaaagt tggtgccaga agagtcgaca ctgtcgagga gctggttgct 660

caagccgatg ttgttaccgt caatgcccca ctgcacgcag gtactaaggg tttagttaac 720

aaggagcttc tgtccaagtt caagaagggt gcttggttgg ttaacacagc cagaggtgcc 780

atctgcaatg ctcaagatgt cgctgatgcc gttgcatctg gtcaattgag aggttacggt 840

ggtgacgtct ggttccctca gccagctcca aaggaccatc catggagaga tatgagaaac 900

aagtacggat acggaaacgc catgactcct cattactcag gtaccacttt ggacgcccag 960

gtcagatatg ccgaaggtac caagaacatc ttgaactcat tccttaccaa gaagtttgac 1020

tacagacctc aagatgtcat tcttttgaac ggtaagtaca agaccaaggc ttatggtaat 1080

gacaaaaagg tcgcataa 1098

<210> 13

<211> 786

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis ATCC 13952

<400> 13

atgtacacgg atctaaaagg aaaagtcgtt gccattacag gagcatcatc aggattagga 60

agagcgatgg cgatccgctt cgggcaggag caggcgaaag tcgtgattaa ctactacagt 120

aatgaaaaag aggctcaaac cgtaaaagaa gaagttcaaa aagcgggcgg cgaagcggtc 180

attattcaag gtgacgttac aaaagaagag gatgtcaaaa acattgtgca gaccgcggtc 240

aaggaattcg gcacattaga tatcatgatc aacaacgccg gcatggaaaa tccggtcgag 300

tcgcataaaa tgccgctaaa agactggaac aaagtcatca acaccaacct gaccggcgct 360

tttctgggat gccgcgaagc cattaaatat tacgtagaga atgatattca aggaaacgtc 420

attaacatgt cgagcgtaca tgaaatgatt ccgtggccgc tgtttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg gcattaaatt aatgacggaa acattggcgc ttgagtacgc gccgaagcgc 540

atccgtgtta acaatatcgg gccgggcgcc atcaatacgc cgatcaatgc ggaaaagttt 600

gcggatcccg ttcagaaaaa agatgtggaa agcatgattc cgatggggta tatcggtgag 660

ccggaagaaa tcgcggctgt cgccgtctgg cttgcttcaa aggaatcaag ctacgtgacc 720

ggcattacgc tgtttgctga cggcggaatg acacaatatc cgtcattcca ggcaggccgc 780

ggataa 786

<210> 14

<211> 1011

<212> DNA

<213> Pseudomonas abietaniphila ATCC 700689

<400> 14

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctgatgac caaccagacc gacagcacgc tgacgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgcc gcgatgctca ggcgatgatg gcgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcgag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgatcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc caggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggtattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

Claims

1.一种三酶共表达的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，该菌采用pQLinkN质粒共表达三种酶，分别为D-α-羟基羧酸脱氢酶或L-α-羟基羧酸脱氢酶，和L-氨基酸氧化酶，和可还原NAD(P)的酶；该工程菌可应用于转化L-α-氨基酸，生成对应的α-羟基羧酸；所述L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述D-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.3所示；所述L-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述可还原NAD(P)的酶核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2.一种生产二羟基苯基乳酸的方法，其特征在于，所述二羟基苯基乳酸为(R)-3,4-二羟基苯基乳酸或(S)-3,4-二羟基苯基乳酸，以权利要求1所述基因工程菌为生产菌株，以L-多巴为底物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当在权利要求1所述基因工程菌中表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的D型α-羟基羧酸脱氢酶基因时，以L-多巴为底物生成(R)-3,4-二羟基苯基乳酸。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当在权利要求1所述基因工程菌中表达核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的L型α-羟基羧酸脱氢酶时，以L-多巴为底物生成(S)-3,4-二羟基苯基乳酸。

5.如权利要求2~4任一所述的方法，其特征在于，将基因工程菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基中，当细胞OD600达到0.6～0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h；诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞；将收集的细胞加水重悬细胞湿重为1-10g/L，然后添加L-多巴为底物，浓度为0.1-10g/L，并根据构建的不同质粒的性质加入供氢体浓度为1-10g/L，调节pH4.0-8.0，于15-40℃反应，时间0.5-24小时；所述供氢体为葡萄糖。