DE112018007299T5 - Verfahren zur Herstellung von Danshensu - Google Patents

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Abstract

Es handelt sich um ein genetisch manipuliertes Bakterium. Das rekombinante E. coli exprimiert sowohl α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase als auch L-Aminosäureoxidase und eine der folgenden Substanzen: exogene L-Glutamatdehydrogenase, exogene L-Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase und Tyrosinphenollyase, wobei Gene ausgeschaltet werden, die mit der Zersetzung von Phenolverbindungen zusammenhängen. Das Bakterium kann zur Herstellung von optisch reiner 3-(3,4-Dihydroxyphenyl) -2-Hydroxypropionsäure verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Danshensu unter Verwendung der rekombinanten Bakterien.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Bei dieser Erfindung handelt es sich um ein Herstellungsverfahren von Danshensu, das zum Gebiet der Biotechnologie gehört.
  • Stand der Technik
  • Danshensu extrahiert aus Salvia Miltiorrhiza, wissenschaftlicher Name: R-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-Hydroxypropionsäure, D-(+)-β-(3,4-Dihydroxyphenyl), englischer Name: Danshensu, D-DSS, R-DSS, (R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-lactic acid, (R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydro-xypropanoic acid, ist eine Dextrophenolsäureverbindung. Bislang gibt es noch kein natürliches L-Danshensu.
  • Danshensu ist ein wichtiger wirksamer Bestandteil im wässrigen Extrakt von Salvia Miltiorrhiza, er wurde 1980 in China im wässrigen Extrakt von Salvia Miltiorrhiza gewonnen und die Struktur von Danshensu identifiziert (Studie über wasserlösliche wirksame Komponenten von Salvia Miltiorrhiza, Struktur der II-D (+) β (3,4-Dihydroxyphenyl)-Milchsäure, Journal of Shanghai First Medical College, 1980, 05(7), 384-385) und verschiedene Studien haben gezeigt, dass Danshensu wichtige pharmakologische Wirkungen besitzt und bei der Behandlung von kardiovaskulären und zerebrovaskulären Erkrankungen eine einzigartige therapeutische Wirkung hat.
  • Derzeit wird Danshensu überwiegend aus Salvia Miltiorrhiza gewonnen (Patent CN200810038853.9 ). Da Salvia Miltiorrhiza einen relativ niedrigen Gehalt an Danshensu hat, die Anbaukosten für Salvia Miltiorrhiza hoch sind und der Ertrag begrenzt ist, ist der aktuelle Preis für Danshensu hoch und der Bedarf an Danshensu auf dem Markt bei weiterem nicht gedeckt werden kann. Das Patent CN201310559498.0 legt ein Verfahren ein Verfahren zum Aufbau gentechnisch veränderter E. coli-Bakterien zur Herstellung von Danshensu durch Fermentation von Glucose offen, wobei der synthetische Stoffwechselprozess Hydroxylase beinhaltet, so dass dieses Enzym das Produkt des Stoffwechselprozesses leicht oxidieren und den Ertrag an Danshensu beeinträchtigen kann, wobei gleichzeitig die Fermentation von E. coli ein Prozess mit hohem Sauerstoffverbrauch ist und somit auch Danshensu oxidiert, so dass das derzeitige Verfahren einen geringeren Ertrag aufweist auf und die Kosten sind höher als bei der Extraktion aus Pflanzen. Das Patent CN201210190171.6 stellt ein Verfahren zur Herstellung von Danshensu mittels Hydrolyse von Salvianolsäure B bereit, wobei Salvianolsäure B aus Salvia Miltiorrhiza extrahiert werden muss und das chemische Hydrolyseverfahren eine große Anzahl von Nebenreaktionen aufweist, weshalb dieses Verfahren auch nicht für eine Massenproduktion von Salvia Miltiorrhiza ist. Der Katalysator für die chirale Synthese von Danshensu (Patent CN201210420488.4 ) ist extrem teuer und die Synthese erfolgt derzeit nur auf Laborebene.
  • Bereits 1988 schlugen Roth et al. vor, Levodopa chemisch zu behandeln, um das entsprechende 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat zu erhalten und im Anschluss S-(+)-3-3,4-DihydroxyphenylMilchsäure enzymatisch zu synthetisieren (Enzymatic Synthesis of (S)-(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid, Arch. Pharm. (Weinheim) 321, 179-180 (1988)). Z. Findrik et al. verwendeten Schlangengift-Aminosäureoxidase, um Levodopa in 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat umzuwandeln und reduzierten es danach mit D-Lactatdehydrogenase, um D-(3,4-Dihydroxyphenyl)-Milchsäure herzustellen (Modelling and Optimization of the (R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed with D-lactateDehydrogenase from Lactobacillus leishmannii Using Genetic Algorithm, Chem. Biochem. Eng. Q. 19 (4) 351-358 (2005)). Diese beiden Verfahren verursachen relativ hohe Kosten für die Erzeugung von 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat-Zwischenprodukten und weisen komplexe Vorgänge auf.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Basierend auf den Mängeln verschiedener gegenwärtiger Verfahren stellt die vorliegende Erfindung ein Produktionsverfahren für optisch reines Danshensu bereit und konstruiert einen technisch hergestellten Stamm mit Koexpression mehrerer Enzyme, um eine effiziente Produktion von Danshensu zu verwirklichen. Das durch die vorliegende Erfindung zu lösende technische Problem besteht darin, ein rekombinantes Bakterium zur kostengünstigen Produktion von Danshensu bereitzustellen. Gleichzeitig zielt diese Erfindung darauf ab, die technischen Probleme der Konstruktion und der Anwendung dieses Bakterienstamms zu lösen.
  • Das erste Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein rekombinantes Bakterium zur kostengünstigen Produktion von optisch reinem Danshensu bereitzustellen; das rekombinante Bakterium exprimiert gleichzeitig sowohl α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase als auch L-Aminosäureoxidase und eine der nachfolgenden Arten: exogene L-Glutamatdehydrogenase, exogene L-Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase und Tyrosinphenollyase, wobei bei der Expression von Tyrosinphenollyase auch L-Lactatdehydrogenase exprimiert wird und Gene ausgeschaltet werden, die mit der Zersetzung von Phenolverbindungen auf der Basis des Wirts E.coli zusammenhängen.
  • In einer Ausführungsform ist die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase eine α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase vom Typ D, die aus dem Lactobacillus plantarum ATCC 14917, Enterococcus faecalis ATCC 35038 oder Lactobacillus fermentum ATCC 14931 stammt.
  • In einer Ausführungsform ist die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase vom Typ L, die aus dem Bacillus coagulans DSM 1, Weissella confusa strain DSM 20196 oder Lactobacillus fermentum ATCC 14931 stammt.
  • In einer Ausführungsform ist die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase eine D-α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, wobei ihre Aminosäuresequenz die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer WP_003643296.1, WP_002335374.1 oder EEI22188 ist; die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase ist L-α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, wobei ihre Aminosäuresequenz die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer WP_013858488.1, WP_003607654.1 oder WP_035430779.1 ist.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der D-α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer NZ_GL379761 REGION: COMPLEMENT(533562..534560), NZ_KB944641 REGION: 161892..162830, ACGI01000078 REGION: 20793..21791; Die Nukleotidsequenz der L-α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase ist die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer NZ_ATUM01000014 REGION: 39316..40254, NZ_JQAY01000006 REGION: 69708..70640, NZ_GG669901 REGION: 45517..46470.
  • In einer Ausführungsform stammt die L-Glutamatdehydrogenase von Escherichia coli BL21, Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808, Clostridium symbiosum ATCC 14940 oder Bacillus subtilis 168.
  • In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz der L-Glutamatdehydrogenase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: WP_000373021.1, WP_011338202.1, WP_003497202.1, WP_010886557.1.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der L-Glutamatdehydrogenase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NC_012892 REGION: 1786741..1788084, NC_007493 REGION: complement (2129131..2130558), NZ_ KE992901 REGION: complement (17603..18955), NC_000964 REGION: complement (2402067..2403350).
  • In einer Ausführungsform stammt die L-Aminosäureoxidase aus Proteus mirabilis ATCC 29906, Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692, Morganella morganii ATCC 49993, Providencia rettgeri DSM 1131 oder der kein Wasserstoffperoxid produzierenden L-Oxysäureoxidase der Ignatzschineria larvae DSM 13226.
  • In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz der L-Aminosäureoxidase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer WP_004244224.1, OAT30925.1, EFE55026.1, WP_036414800.1 oder WP_026879504.1.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der L-Aminosäureoxidase wie in der Sequenzliste: NZ_GG668576 REGION: 1350390..1351805, LXEN01000066 REGION: 20563..21963, ACCI02000030 REGION: 21025..22443, NZ_LAGC01000006 REGION: 309569..310993, NZ_KI783332 REGION: 35799..37217.
  • In einer Ausführungsform stammt die L-Lactatdehydrogenase aus Lactococcus lactis ATCC 19257.
  • In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz der L-Lactatdehydrogenase die Sequenz mit der Zugangsnummer bei NCBI WP_003131075.1.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der L-Lactatdehydrogenase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NZ_JXJZ01000017 REGION: 18532..19509.
  • In einer Ausführungsform stammt die Tyrosinphenollyase aus Erwinia herbicola ATCC 214344.
  • In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz der Tyrosinphenollyase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer P31011.2.
  • In einer Ausführungsform stammt die Glucosehydrogenase von Bacillus sbutilis ATCC 13952.
  • In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz der Glucosedehydrogenase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer WP_013351020.1.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der Glucosedehydrogenase die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NZ_CP009748 REGION dar. 386154..38693.
  • In einer Ausführungsform werden das Gen, das die Enzyme der L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und L-Glutamatdehydrogenase kodiert, mit einem Plasmid verbunden, um ein rekombinantes Plasmid mit drei Gen-Coexpressionen zu konstruieren, und dann das rekombinante Plasmid in den entsprechenden Stamm zu transformieren, um ein rekombinantes technisch erzeugtes Bakterium zu erhalten.
  • In einer Ausführungsform wird ein rekombinantes Bakterium, bei dem die Gene die L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und L-Lactatdehydrogenase kodieren, mit einem Plasmid verbunden, um ein rekombinantes Plasmid mit drei Gen-Coexpressionen zu konstruieren, und dann das rekombinante Plasmid in den entsprechenden Stamm zu transformieren, um ein rekombinantes technisch erzeugtes Bakterium zu erhalten.
  • In einer Ausführungsform wird ein rekombinantes Bakterium konstruiert, bei dem die Gene die L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und L-Lactatdehydrogenase kodieren, mit zwei Plasmiden verbunden und danach werden die rekombinantem Plasmide in E. coli als Wirt transformiert, um ein rekombinantes technisch erzeugtes Bakterium zu erhalten.
  • In einer Ausführungsform werden das α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase-Gen und das L-Lactatdehydrogenase-Gen nach Verbindung mit dem Plasmid pETDuet-1 exprimiert und das L-Aminosäureoxidase- und Tyrosinphenollyase-Gen nach der Verbindung mit Plasmid pACYCDue-1 exprimiert.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein rekombinantes Bakterium Gene, die die L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und Glucosedehydrogenase kodieren, die alle mit dem Plasmid verbunden sind, um ein rekombinantes Plasmid mit drei Gen-Coexpressionen zu konstruieren, und dann das rekombinante Plasmid in entsprechende Stämme zu transformieren, um ein rekombinantes technisch erzeugtes Bakterium zu erhalten.
  • In einer Ausführungsform wird das rekombinante Bakterium unter Verwendung von Escherichia coli BL21 (DE3) als Wirt konstruiert.
  • In einer Ausführungsform ist das Gen, das mit der Zersetzung von Phenolverbindungen zusammenhängt, eines oder eine Kombination von hpaD und mhpB.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz des Gens, das mit der Zersetzung von Phenolverbindungen zusammenhängt, die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NC_012892 REGION: Complement (4505585..4506436) oder NC_012892 REGION: 339806..340750.
  • In einer Ausführungsform verstärkt das E. coli noch die Expression eines oder mehrerer Gene der Glutamattransportgene, des Lactattransportgens, des Katecholtransportgens, NAD-Synthesegens und FAD-Synthesegens, wobei das Lactattransportgen gleichzeitig mit dem Catecholtransportgen exprimiert wird und das Glutamattransportgen und das Lactattransportgen nicht gleichzeitig exprimiert werden.
  • In einer Ausführungsform wird die verstärkte Expression durch Zugabe eines konstitutiven Promotors vor dem verstärkt zu exprimierenden Gen im Genom des Escherichia coli BL21 (DE3) erreicht.
  • In einer Ausführungsform ist das die Expression verstärkende Gen eines oder mehrere von gltS (Glutamattransportergen), nadA (NAD-Synthesegen) und ribF (FAD-Synthesegen).
  • In einer Ausführungsform ist gltS die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NC_012892 REGION: Complement (3694931..3696136) und nadA die Sequenz NC_012892 REGION: 740487..741530; ribF die Sequenz NC_012892 REGION: 25479..26420.
  • In einer Ausführungsform ist das die Expression verstärkende Gen eines oder mehrere von 11dP (Lactattransportgen), nadA (NAD-Synthesegen) und ribF (FAD-Synthesegen).
  • In einer Ausführungsform ist IIdP die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NC_012892 REGION: 3646638..3648293, nadA die Sequenz NC_012892 REGION: 740487..741530; ribF die Sequenz NC_012892 REGION: 25479..26420.
  • In einer Ausführungsform ist das die Expression verstärkende Gen eines oder mehrere von IIdP (Lactattransfergen), hpaX (Catecholtransfergen), mhpT (Catecholtransfergen), nadA (NAD-Synthesegen), pdxJ (Pyridoxinphosphatsynthesegen), ribF (FAD-Synthesegen).
  • In einer Ausführungsform ist IIdP die Sequenz mit der NCBI-Zugangsnummer: NC_012892 REGION: 3646638..3648293; hpaX die Sequenz NC_012892 REGION: complement (4502025..4503401); mhpT die Sequenz NC_012892 REGION: 344788..345999; nadA die Sequenz NC_012892 REGION: 740487..741530; pdxJ die Sequenz NC_012892 REGION: complement (2567591..2568322); ribF die Sequenz NC_012892 REGION: 25479..26420.
  • In einer Ausführungsform basieren die rekombinanten Bakterien auf dem E. coli-Wirt, der hpaD und mhpB ausschloss, und verstärkten die Expression von IIdP, hpaX, mhpT, nadA, pdxJ und ribF. und exprimieren gleichzeitig Tyrosinphenollyase, L-Aminosäureoxidase, L-Lactatdehydrogenase und α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase.
  • Das zweite Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Danshensu bereitzustellen, bei die die rekombinanten Bakterien dieser Erfindung verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Herstellung von Danshensu um eine Transformationsproduktion der gesamten Zellen.
  • In einer Ausführungsform umfasst, wenn die rekombinante E. coli gleichzeitig α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und exogene L-Glutamatdehydrogenase exprimiert, das gesamte Zelltransformations-Produktionssystem ein Nasszellgewicht von 1-200 g / l, Levodopa 1-200 g / l, L-Glutaminsäure 1-200 g / l, pH 6,0-9,0 bei 15-40 °C, wobei die Reaktionszeit 1-48 Stunden beträgt.
  • In einer Ausführungsform umfasst, wenn die rekombinante E. coli gleichzeitig α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und exogene L-Lactat-Dehydrogenase exprimiert, das gesamte Zelltransformations-Produktionssystem ein Nasszellgewicht von 1-200 g / l, wobei die Konzentration von Levodopa 1-200 g / l, die Konzentration von L-Milchsäure beträgt 1-200 g / l, und der pH-Wert 4,0-9,0 beträgt, wobei die Reaktionszeit 1-48 Stunden bei 15-40 °C beträgt.
  • In einer Ausführungsform beträgt, wenn die rekombinante E. coli gleichzeitig α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und Tyrosinphenollyase und L-Lactatdehydrogenase exprimiert, in dem gesamten Zelltransformations-Produktionssystem das Nasszellengewicht 1-200 g / l, die Katecholkonzentration 1-200 g / l, die L-Milchsäurekonzentration 1-200 g / l, der pH-Wert 6,0-9,0 und die Ammoniakionenkonzentration 1 -30 g / l, wobei die Reaktionszeit 1-48 Stunden bei 15-40 °C beträgt. Nach der Transformation wird Flüssigchromatographie verwendet, um Ertrag und Konfiguration von Danshensu zu bestimmen.
  • In einer Ausführungsform beträgt, wenn die rekombinante E. coli gleichzeitig α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und Glucosedehydrogenase exprimiert, in dem gesamten Zelltransformations-Produktionssystem das Nasszellengewicht 1-200 g / l, die Levodopakonzentration 1-200 g / l, die Glukosekonzentration 1-200 g / l, der pH-Wert 6,0-9,0 und die Ammoniakionenkonzentration 1 -30 g / l, wobei die Reaktionszeit 1-48 Stunden bei 15-40 °C beträgt.
  • Das dritte Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Anwendungsmöglichkeiten des rekombinanten Bakteriums der vorliegenden Erfindung oder des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf den Gebieten der chemischen Industrie, der Lebensmittel, der Medizin und dergleichen bereitzustellen.
  • Vorteilhafte Wirkung der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung konstruiert ein neues gentechnisches Bakterium mit drei exprimierten Enzymen, das zur Herstellung von optisch reiner 3-(3,4-Dihydroxyphenyl) -2-Hydroxypropionsäure verwendet werden kann. Die in der vorliegenden Erfindung ausgewählte (D/L)-α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase weist die Eigenschaften einer schlechten Substratspezifität und einer starken optischen Spezifität auf und kann optisch reines D-Danshensu und L-Danshensu erzeugen. Ferner werden durch Ausschluss oder Verstärken der Expression verwandter Gene auf dem E. coli-Genom, durch Fördern des Substrattransfers und Reduzieren der Zersetzung von Produkten, wird Produktionseffizienz von rekombinanten Bakterien verbessert. Das Verfahren zur Transformation und Herstellung von Danshensu und α-Ketoglutarat unter Verwendung der rekombinanten Bakterien der vorliegenden Erfindung ist einfach und die Rohmaterialien sind leicht zu erhalten, was eine gute industrielle Anwendungsperspektive zeigt.
  • Konkretes Umsetzungsschema
  • Der funktionelle Kern des technischen Bakteriums der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es gleichzeitig mehrere Enzyme exprimieren kann, nämlich L-Aminosäureoxidas, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und eines der folgenden: exogene L-Glutamatdehydrogenase, exogene L-Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Tyrosinhenollyase und L-Lactatdehydrogenase, wobei Tyrosinphenollyase und L-Lactatdehydrogenase gleichzeitig exprimiert werden. Das Funktionsprinzip ist wie folgt: In der ganzen Zelle des technischen Bakteriums verwendet eine beliebige von L-Glutamatdehydrogenase, L-Lactatdehydrogenase und Glucosedehydrogenase NAD im Bakterium als Coenzym, um den jeweils entsprechenden Stoff u. a. L-Glutaminsäure, L-Milchsäure oder Glucose zu dehydrieren, womit jeweils α-Ketoglutarat, Pyruvat, Gluconsäure oder NADH entsprechend erzeugt wird; Tyrosinphenollyase katalysiert Pyruvat, Ammoniumionen und Catechol, wodurch Levodopa erzeugt wird; Levodopa wird durch L-Aminosäureoxidase desaminiert, wodurch 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat erzeugt wird; α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase verwendet NADH, das während des Dehydrierungsprozesses von Glutamat erzeugt wird, um 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat zu Danshensu zu reduzieren und gleichzeitig das Coenzym NAD zu regenerieren. Zugleich werden durch Eliminieren oder verstärkte Expression der relevanten Gene auf dem E. coli-Genom der Substrattransfer gefördert und die Zersetzung von Produkten reduziert, so dass sich der Ertrag des Zielprodukts erhöht.
  • Um die oben genannten technischen Probleme zu lösen, sind die technischen Lösungen, die von der vorliegenden Erfindung angenommen werden, wie folgt:
    1. 1. Die an der vorliegenden Erfindung beteiligten Bakterienstämme und Plasmide Lactobacillus plantarum ATCC 14917, Enterococcus faecalis ATCC 35038, Lactobacillus fermentum ATCC 14931, Bacillus subtilis ATCC 13952, Escherichia coli BL21 (DE3), Proteus mirabilis ATCC 29906, Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692, Morganella morganii ATCC 49993, Lactococcus lactis ATCC 19257, Erwinia herbicola ATCC 214344 und Aeromonas phenologenes ATCC 7966, gekauft von American Type Culture Collection (ATCC). Bacillus coagulans DSM 1, Weissella confusa strain DSM 20196, Providencia rettgeri DSM 1131 und Ignatzschineria larvae DSM 13226, gekauft von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Die Plasmide pETDuet-1, pACYCDue-1, pCOLADuet-1, pRSFDuet-1 und Escherichia coli BL21 (DE3), gekauft von Novagen. pCasRed und pCRISPR-gDNA, gekauft von Applied Biological Materials (abm) Zhenjiang Co., Ltd.
    2. 2. Ausschluss und konstitutiv verstärkte Expression verwandter Gene in E. coli
      • (1) Ausschluss von Genen im Zusammenhang mit der Zersetzung von Phenolverbindungen in E. coli Die phenolischen Substanzen in der vorliegenden Erfindung werden leicht durch Enzyme in E. coli zersetzt. Gemäß der Literatur (Biodegradation of Aromatic Compounds by Escherichia coli, Microbiol Mol Biol Rev. 2001, 65(4): 523-569.) werden verwandte Gene ausgeschlossen, sodass eine Zersetzung von Produkt und Substrat vermieden wird. Die ausgewählten Gene sind hpaD und mhpB, deren NCBI-Zugangsnummern jeweils NC_012892 REGION: complement (4505585..4506436) und NC_012892 REGION: 339806..340750 lauten.
      • (2) Konstitutiv verstärkte Expression des Escherichia coli-Glutamattransportergens Die Ganzzelltransformation kann nur unter der Voraussetzung erfolgen, dass das Substrat in die Zelle transportiert wird. Eine Verstärkung des Glutamattransporters trägt dazu bei, eine hohe Konzentration des intrazellulären Substrats schnell und über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, was dem Fortschreiten der Reaktion förderlich ist. Das ausgewählte Gen im Zusammenhang mit dem Glutamattransporter ist gltS, dessen NCBI-Zugangsnummer lautet: NC_012892 REGION: complement (3694931..3696136). Dopa ähnelt aromatischen Aminosäuren und muss während der Zellkultur Aminosäuren absorbieren. Daher exprimiert die Zelle selbst eine große Anzahl von Aminosäuretransportern und es besteht keine Notwendigkeit, diese Expression zu verstärken.
      • (3) Konstitutiv verstärkte Expression wichtiger Gene im Zusammenhang mit der Coenzymsynthese in E. coli Beim Reduktionsprozess der α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase wird NADH als Coenzym benötigt, um die Expression von Schlüsselenzymen im NAD-Syntheseweg von E. coli zu stärken, wodurch der NAD-Spiegel in den Bakterien erhöht werden kann, was für die Produktion von Danshensu vorteilhaft ist. Das ausgewählte Gen ist nadA, dessen NCBI-Zugangsnummer lautet: NC_012892 REGION: 740487..741530. FAD ist das Coenzym der L-Aminosäureoxidase, wobei die Überexpression von ribF, einem wichtigen Gen im Coenzymweg, vorteilhaft für die Verstärkung der Aktivität der L-Aminosäureoxidase. DieNCBI-Zugangsnummer lautet: NC_012892 REGION: 25479..26420.
    3. 3. Auswahl von Enzymen
      • (1) Auswahl der L-Aminosäureoxidase L-Aminosäureoxidase ist in Bakterien, Pilzen, Säugetierzellen, Schlangengift, Insektentoxinen und Algen weit verbreitet (L-amino acid oxidase as biocatalyst: a dream too far. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013,97:9323-41). L-Aminosäureoxidase überträgt die Wasserstoffionen an der α-Aminogruppe und Cα an FAD und die meisten von ihnen verwenden molekularen Sauerstoff, um das reduktive FAD direkt zu oxidieren, wobei oxidiertes FAD und Wasserstoffperoxid erzeugt werden. Zum Beispiel verwendeten Poljanac et al. L-Aminosäureoxidase des Diamant-Klapperschlangengifts für die Oxidierung von Dopa, um 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat zu erzeugen, und fügten danach Lactatdehydrogenase und Formiatdehydrogenase hinzu, um 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure zu erzeugen. Bei diesem Verfahren muss Katalase zugesetzt werden, um die Toxizität von Wasserstoffperoxid zu beseitigen (Modelling and Optimization of the (R)-(+)-3,4-Dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed, Chem. Biochem. Eng. Q.2005,19 (4) 351-358). Darüber hinaus gibt es auch eine Art von L-Aminosäureoxidase, die für die Elektronentransportkette auf der Zellmembran relevant ist, wobei die Elektronen über die Atmungskette auf die Cytochromoxidase übertragen werden, um molekularen Sauerstoff zu Wasser zu reduzieren, wodurch kein Wasserstoffperoxid erzeugt wird. Dieses Enzym existiert hauptsächlich in Proteus sp., Providencia sp., Morganella sp. Usw. (Crystal structure of a membrane-bound l-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. J. Struct. Biol.2016,195:306-15). Die vorliegende Erfindung selektiert fünf L-Oxysäureoxidasen, die kein Wasserstoffperoxid produzieren und erzeugt durch Klonen von Proteus mirabilis ATCC 29906, Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692, Providencia rettgeri DSM 1131, Morganella morganii ATCC 49993 und Ignatzschineria larvae DSM 13226 jeweils die Gene der L-Aminosäureoxidase pmaao, cmaao, praao, mmaao, ilaao, deren Aminosäuresequenzen jeweils die Sequenzen mit den NCBI-Zugangsnummern WP_004244224.1, OAT30925.1, EFE55026.1, WP_036414800.1 und WP_026879504.1 haben und diese Enzyme alle die Eigenschaften ausgedehnter Substrate und eine starke Aktivität.
      • (2) Auswahl der α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase Gemäß dem jeweils am besten geeigneten Substrat umfasst die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase Lactatdehydrogenase, α-Hydroxysäureisohexanoatdehydrogenase, Mandelsäuredehydrogenase, Glyoxylatreduktase usw., wobei diese Enzyme auf eine Vielzahl von Substraten einwirken können, ums α-Hydroxycarbonsäure herzustellen und sie werden üblicherweise nach ihrem am besten geeigneten Substrat benannt. Die vorliegende Erfindung wählt Enzyme mit starken optischen Eigenschaften und starker Aktivität gegenüber 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat zur Herstellung von D- oder L-Danshensu aus. Durch Klonen von Lactobacillus plantarum ATCC 14917, Enterococcus faecalis ATCC 35038 und Lactobacillus fermentum ATCC 14931 werden jeweils Gene von α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase des Typs D lpldhd, efmdhd und Ifldhd erzeugt, deren Aminosäuresequenzen jeweils die Sequenzen mit der NCBI-Zugangsnummern WP_003643296.1, WP_002335374.1 und EE122188.1 aufweisen. Durch Klonen von Bacillus coagulans DSM 1, Weissella confusa strain DSM 20196 und Lactobacillus fermentum ATCC 14931 werden jeweils Gene von α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase des Typs L bcldhl, wcldhl und Ifldhl erzeugt, deren Aminosäuresequenzen jeweils die Sequenzen mit der NCBI-Zugangsnummern WP_013858488.1, WP_003607654.1 und WP_035430779.1 aufweisen.
      • (3) Auswahl der L-Glutamatdehydrogenase L-Glutaminsäure ist die billigste Art von Aminosäure, wobei das durch Dehydrierung von L-Glutaminsäure hergestellte α-Ketoglutarat einen hohen Mehrwert hat und derzeit hauptsächlich durch Oxidierung von L-Glutaminsäure mittels L-Glutamatoxidase hergestellt wird, wobei die aus L-Glutaminsäure entfernten Wasserstoffionen verschwendet werden. L-Glutamatdehydrogenase ist in fast allen Organismen weit verbreitet, die L-Glutamat als Substrat verwenden, um die auf L-Glutamat erzeugten Wasserstoffionen auf das Coenzym NAD oder NADP zu übertragen, wodurch im Anschluss NADH oder NADPH erzeugt wird. NADH oder NADPH kann als Wasserstoffdonor für die vorgenannte Hydroxyhydroxysäuredehydrogenase verwendet werden. Die vorliegende Erfindung erhält aus Escherichia coli BL21, Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808, Clostridium symbiosum ATCC 14940 und Bacillus subtilis 168 jeweils das L-Glutamat-Gen ecgdh (Aminosäuresequenz WP_000373021.1), rsgdh (Aminosäuresequenz WP_011338202.1), csgdh (Aminosäuresequenz WP_003497202.1) und bsgdh (Aminosäuresequenz WP_010886557.1).
      • (4) Auswahl der L-Lactatdehydrogenase L-Milchsäure ist die billigste organische Säure und das durch Dehydrierung von L-Milchsäure hergestellte Pyruvat hat einen hohen Mehrwert. Gegenwärtig wird Pyruvat hauptsächlich durch Oxidierung von L-Milchsäure mittels L-Lactatoxidase hergestellt, wobei die aus L-Milchsäure entfernten Wasserstoffionen verschwendet werden. Es gibt auch ein Verfahren zur Herstellung von Ketosäuren durch Fermentation mittels Hefe. L-Lactatoxidase ist in vielen Organismen weit verbreitet, die L-Milchsäure als Substrat verwenden, um die auf L-Milchsäure erzeugten Wasserstoffionen auf das Coenzym NAD oder NADP zu übertragen, wodurch im Anschluss NADH oder NADPH erzeugt wird. NADH oder NADPH kann als Wasserstoffdonor für die vorgenannte α-Hydroxyhydroxysäuredehydrogenase verwendet werden. Im Allgemeinen neigt Lactatdehydrogenase mit NAD (NADP) als Coenzym dazu, Pyruvat als Substrat zur Synthese von Milchsäure zu verwenden. Wenn jedoch Milchsäure übermäßig zugesetzt wird, nimmt ein Teil von Lactatdehydrogenase die Wasserstoffionen von Milchsäure ab und erzeugen Pyruvat. Die vorliegende Erfindung erhält aus Lactococcus lactis ATCC 19257 das L-Lactatdehydrogenase-Gen IIIdh (Aminosäuresequenz WP_003131075.1).
      • (5) Auswahl der Tyrosinphenollyase Tyrosinphenollyase (Tyrosine phenol lyase, TPL, EC4.1.99.2), auch als β-Tyrosinase bekannt, kann die β-Eliminierungsreaktion von L-Tyrosin unter Bildung von Phenol, Pyruvat und Ammoniak katalysieren und auch die β-Eliminierungsreaktion von Dopa unter Bildung von Catechol, Pyruvat und Ammoniak katalysieren. Die Reaktion ist reversibel, wobei Catechol, Pyruvat und Ammoniak durch Tyrosinphenollyase unter Bildung von L-Dopa katalysiert werden können. Die vorliegende Erfindung erzeugt durch Klonen von Erwinia herbicola ATCC 214344 das Tyrosinphenollyase-Gen, dessen Aminosäuresequenz P31011.2 lautet.
      • (6) Auswahl der Glucosedehydrogenase Bei der Biotransformationsreaktion benötigt die α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase NADH und/oder NADPH als Coenzyme, es werden aber auch Formiatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Phosphitdehydrogenase usw. häufig verwendet. Im Vergleich zu anderen Enzymen weist Glucosedehydrogenase die höchste Aktivität auf, weshalb die vorliegende Erfindung aus Bacillus subtilis ATCC 13952 das Glucosedehydrogenase-Gen bsgdht gewinnt (Aminosäuresequenz WP_013351020.1).
    4. 4. Konstruieren des Coexpressionssystems und Zellkultur Gegenwärtig gibt es viele Verfahren zur Coexpression von mehreren Genen in E. coli (Strategien zur Coexpression von mehreren Genen in E. coli, Chinese Journal of Bioengineering, 2012, 32 (4):117-122), wobei die vorliegende Erfindung das Verfahren von LIU Xianglei (Synthetische Biologietechnologie zur Transformation von E. coli für Produktion von Shikimisäure und Resveratrol, 2016, Shanghai Pharmaceutical Industry Research Institute, Dissertation) anwendet, wobei bei der Konstruktion des Verfahrens jedes Gen T7-Promotor und RBS-Bindungspunkt enthält und theoretisch die Expressionsintensität des Gens durch die Sequenz nicht stark beeinflusst wird, da jedes Gen T7 und RBS aufweist. Jedes Plasmid enthält drei Gene, wobei das fertig konstruierte Plasmid wird in kompetente E. coli-Zellen wärmetransportiert und auf einer festen Antibiotika-Platte verteilt wird, wobei die positiven Transformanten gescreent werden, um rekombinantem E. coli zu erhalten. Zellkultur: Gemäß dem klassischen Konzept für Kultivierung und induzierte Expression von E. coli wird das rekombinante E. coli mit einem Volumenverhältnis 2 % zum Medium auf das LB-Fermentationsmedium (Pepton 10 g/ I, Hefepulver 5 g/ l, NaCl 10 g/ l) übertragen, wenn der Zell-OD600 d 0,6 bis 0,8 erreicht hat, wird IPTG mit einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben und Expression 8 Stunden bei 20 °C induziert. Nach der Induktion der Expression werden die Zellen durch Zentrifugation bei 20 °C, 8000 U/min und 20 Minuten gesammelt.
    5. 5. Test und Analyse der Probe Quantitative Analyse von Danshensu: Die Transformationslösung wird mit einem Hochleistungsflüssigchromatograph der Serie 200 von PerkinElmer, der mit einem Brechungsindexdetektor ausgestattet ist, erfasst und analysiert. Die chromatographischen Bedingungen sind wie folgt: Die mobile Phase ist Methanol-0,1% Ameisensäurewasser (40:60), Megres C18-Säule (4,6 x 250 mm, 5 µm) von Hanbon, die Fließgeschwindigkeit 1 ml/min, Säulentemperatur 30 ° C und Injektionsvolumen 20 µl.
  • Chirale Analyse: Test und Analyse mit dem Hochleistungsflüssigchromatograph der Serie 200 von PerkinElmer, ausgestattet mit einem Ultraviolettdetektor, Chiralcel OD-H-Chiralsäule (4,6 × 250 mm), Volumenverhältnis der mobilen Phase ist n-Hexan:Isopropanol:Trifluoressigsäure = 80:20:0,1, Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min, Säulentemperatur 25 ° C, Injektionsvolumen 20 µl, Detektionswellenlänge 280 nm.
  • Danshensu hat eine relativ niedrige Löslichkeit. Wenn während des Transformationsprozesses Kristalle ausgefällt werden, ist die Messung nach der Verdünnung vorzunehmen.
  • Die optische Reinheit von Danshensu wird durch den Enantiomerenüberschuss (% e.e) bewertet.
  • Bei der Produktion von R-Danshensu, Enantiomeren u ¨ berschuss %e . e = [ ( S R − S S ) / ( S R + S S ) × 100 % ]
    Figure DE112018007299T5_0001
  • Bei der Produktion von S-Danshensu, Enantiomeren u ¨ berschuss %e . e = [ ( S S − S R ) / ( S R + S S ) × 100 % ]
    Figure DE112018007299T5_0002
  • In der Formel ist SS die Peakfläche von S-Danshensu in der Transformationslösung und SR ist die Peakfläche der Flüssigkeitschromatographie von R-Danshensu in der Transformationslösung.
  • Um die zu lösenden technischen Probleme, die technischen Lösungen und die vorteilhaften Wirkungen der vorliegenden Erfindung klarer und deutlicher zu machen, wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Ausführungsformen genauer beschrieben. Es ist anzumerken, dass die hier beschriebenen spezifischen Beispiele der Implementierung nur dazu dienen, die vorliegende Erfindung zu erklären, aber nicht dazu, die vorliegende Erfindung einzuschränken.
  • Ausführungsform 1
  • Für das Screening von L-Glutamat-Dehydrogenase wurden verschiedene L-Glutamat-Dehydrogenase-Gene aus jedem Stamm kloniert und in Escherichia coli BL21 (DE3) exprimiert. Verfahren der induzierten Expression: das rekombinante E. coli wird auf das LB-Fermentationsmedium (Pepton 10 g/ l, Hefepulver 5 g/ l, NaCl 10 g/ l) gemäß dem Volumenverhältnis von 2 % übertragen, wenn der Zell-OD600 0,6 bis 0,8 erreicht, wird IPTG mit einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben und die Expression 8 Stunden bei 20 °C induziert. Nach der induzierten Expression werden die Zellen durch Zentrifugation bei 20 ° C, 8000 U/min und 20 Minuten gesammelt.
  • Gemäß Literatur (Klonen, Expression und Bestimmung der Enzymaktivität vom Glutamatdehydrogenase-Gens des Bacillus natto. Journal of Shanghai Jiaotong University (Agricultural Science), 2010, 1: 82-86.) werden die Zellen gebrochen, um die Aktivität der rohen Enzymlösung zu bestimmen, und das Verfahren wurde verwendet, um die Aktivität der L-Glutamatdehydrogenase unter Verwendung von NAD als Coenzym zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Daher ist es am besten, die von Bacillus subtilis abgeleitete L-Glutamat-Dehydrogenase bsgdh für die Herstellung von Danshensu zu wählen.. Tabelle 1 Vergleich der Aktivitäten verschiedener L-Aminosäuredehydrogenasen
    rekombinantes Bakterium Aktivität U/ml
    Escherichia coli BL21 (DE3) /pETDuet-1-ecgdh 0,3
    Escherichia coli BL21 (DE3) /pETDuet-1-rsgdh 1,1
    Escherichia coli BL21 (DE3) /pETDuet-1-csgdh 1,6
    Escherichia coli BL21 (DE3) /pETDuet-1-bsgdh 3,5
  • Ausführungsform 2
  • Gemäß dem aufgeführten Verfahren in der Literatur Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in Escherichia coli. Microbial Cell Factories,2017,16(1):68 werden hpaD und mhpB in Escherichia coli BL21(DE3) einseitig oder beidseitig ausgeschlossen. Bei diesem Verfahren werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Gen-Knockout-Plasmide pCasRed und pCRISPR-gDNA (hpaD-sgRNA) und Homologiearm (hpaD-Donor) zusammen in Escherichia coli BL21 (DE3) eingeführt, Cas9/sgRNA induziert, dass der Wirt an der hpaD-Genort einen Doppelstrangbruch aufweist, und die Rekombinase Red integriert den hpaD-Donor in das hpaD-Gen, um ein Knockout des Gens und eine Sequenzverifizierung zu erreichen. hpaD-sgRNA, hpaD-Donor, mhpB-sgRNA und mhpB-Donor sind jeweils in der Sequenzliste SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 gezeigt. mhpB wird mit dem gleichen Verfahren ausgeschlossen.
  • Eine Lösung mit einem pH-Wert von 7 wird vorbereitet, in der Levodopa oder D-Danshensu 4 g/ I ist und das Nasszellgewicht 200 g/ l beträgt. Die Konzentration wird nach 10-stündigem Stehen bei 35 °C gemessen. Tabelle 2 zeigt die verbleibenden Mengen an Levodopa und D-Danshensu im Reaktionssystem. Tabelle 2 Restkonzentration von Substrat und Produkt nach Zersetzung bei verschiedenen Bakterienstämmen
    Levodopa g/ l D-Danshensu g/ l
    Escherichia coli BL21 (DE3) 1,5 1,5
    Escherichia coli BL21 (ΔhpaDΔmhpB,DE3) 3,6 3,6
    Escherichia coli BL21 (ΔhpaD,DE3) 2,1 2,7
    Escherichia coli BL21 (ΔmhpB,DE3) 1,6 1,6
    Escherichia coli BL21 (ΔhpaDΔmhpB, DE3) funktioniert am besten und wird als Escherichia coli HM bezeichnet.
  • Ausführungsform 3
  • Konstruktion von rekombinantem E. coli, das gleichzeitig α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und exogene L-Glutamatdehydrogenase exprimiert: erstens werden die Gene, die Tyrosinphenollyase, L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und L-Glutamatdehydrogenase kodieren, mit dem Plasmid verbunden, das rekombinante Drei-Gen-Coexpressionsplasmid wird erhalten, und das Plasmid wird in Escherichia coli HM transformiert, und durch Verwendung der Antibiotikaplatte für das Screening werden der positive Transformant und rekombinante E. coli erhalten.
  • Nachdem die Expression des rekombinanten E. coli induziert worden war, wurden die Bakterien gesammelt, dabei betrug in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 40 g / l, die Konzentration von Levodopa 40 g / l, die Konzentration von L-Glutaminsäure 30 g / l und der pH betrug 8,0, die Reaktion erfolgte bei 35 ° C für 12 Stunden. Nach der Transformation wird Flüssigchromatographie verwendet, um den Ertrag und die Konfiguration von Danshensu zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Vergleich verschiedener rekombinanter Bakterien
    rekombinantes Bakterium Danshensu α-Ketoglutarat g/ I
    Konzentration g/ I Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 17,7 S > 99,9 18,4
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-bcldhl-bsgdh-cmaao 16,5 S > 99,9 19,4
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-Ifldhl-bsgdh-cmaao 13,4 S > 99,9 14,2
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 19,8 R > 99,9 23,2
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lpldhd-bsgdh-1-cmaao 16,4 R > 99,9 18,0
    Escherichia coli HM/pETDuet-1- Ifldhd-bsgdh-cmaao 20,1 R > 99,9 19,0
    Escherichia coli HM/pETDuet-1- efmdhd-bsgdhpmaao 13,2 R > 99,9 14,6
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-praao 18,4 R >99,9 24,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-mmaao 19,1 R > 99,9 21,3
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-ilaao 17,9 R > 99,9 25,3
    Escherichia coli HM/pACYCDue-1-lfldhd-bsgdh-cmaao 20,4 R > 99,9 27,0
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-lfldhd-bsgdh-cmaao 24,9 R > 99,9 28.6
    Escherichia coli HM/pRSFDuet-1- Ifldhd-bsgdh-cmaao 22,0 R > 99,9 25,8
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-wcldhl-bsgdh-cmaao 23,7 S > 99,9 28,5
  • Konstruktion von rekombinantem E. coli, das α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und exogene L-Lactatdehydrogenase gleichzeitig exprimiert: erstens werden die Gene, die L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und L-Lactatdehydrogenase kodieren, mit Plasmid pETDuet-1 oder pACYCDuet-1 verbunden. Das rekombinante Drei-Gen-Coexpressionsplasmid wird erhalten, und das Plasmid wird in E-scherichia coli HM transformiert, durch Screening von Chloramphenicol- und Ampicillinplatten auf positive Transformanten wird die rekombinante E. coli erhalten.
  • Nachdem die Expression des rekombinanten E. coli induziert worden war, wurden die Bakterien gesammelt, dabei betrug in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 40 g / l, die Konzentration von L-Milchsäure 30 g / l, und der pH-Wert betrug 8,0, die Reaktion erfolgte bei 35 ° C für 12 Stunden. Nach der Transformation wird Flüssigchromatographie verwendet, um den Ertrag und die Konfiguration von Danshensu zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Vergleich verschiedener rekombinanter Bakterien
    rekombinantes Bakterium Danshensu Pyruvat g/ l
    Konzentration g/ I Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-wcldhl-llldh-cmaao 17,9 S > 99,9 9,2
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-bcldhl-llldh-cmaao 8,4 S > 99,9 5,3
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lfldhl-llldh-cmaao 3,7 S > 99,9 2,2
    Escherichia coli HM/pETDuet-1 -efmdhd-llldh-cmaao 19,8 R > 99,9 11,4
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lpldhd-llldh-1-cmaao 3,4 R > 99,9 2,0
    Escherichia coli HM/pETDuet-1 -efmdhd-llldhpmaao 17,6 R > 99,9 9,5
    Escherichia coli HM/pETDuet-1 -efmdhd-llldhpraao 18,2 R > 99,9 12,3
    Escherichia coli HM/pETDuet-1 -efmdhd-llldhmmaao 17,3 R > 99,9 11,6
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-llldh-ilaao 18,7 R > 99,9 13,0
    Escherichia coli HM/pACYCDue-1-efmdhd-llldh-cmaao 19,5 R > 99,9 13,5
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 22,3 R > 99,9 14,3
    Escherichia coli HM/pRSFDuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 20,1 R > 99,9 12,1
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-wcldhl-llldh-cmaao 21,7 S > 99,9 14,8
  • Konstruktion von rekombinantem E. coli, das α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und Tyrosinphenollyase und L-Lactatdehydrogenase gleichzeitig exprimiert: erstens werden die Gene, die L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und Tyrosinphenollyase und L-Lactatdehydrogenase, mit Plasmid pETDuet-1 oder pACYCDuet-1 verbunden. Das rekombinante Zwei-Gen-Coexpressionsplasmid wird erhalten, und das Plasmid wird in E-scherichia coli HM transformiert, durch Screening von Chloramphenicol- und Ampicillinplatten auf positive Transformanten wird die rekombinante E. coli erhalten.
  • Nachdem die Expression des rekombinanten E. coli induziert worden war, wurden die Bakterien gesammelt, dabei betrug in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 20 g / l, die Konzentration von Catechol 10 g/ I, die Konzentration von L-Milchsäure 30 g / l, und der pH-Wert betrug 8,0 und die Konzentration von Ammoniakionen 30 g /l, die Reaktion erfolgte bei 35 ° C für 12 Stunden. Nach der Transformation wird Flüssigchromatographie verwendet, um den Ertrag und die Konfiguration von Danshensu zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Vergleich verschiedener rekombinanter Bakterien
    rekombinantes Bakterium Danshensu
    Konzentration g/ I Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-wcldhl-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 8,5 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-cmaao-cftpl +pACYCDuet-1-wcldhl-llldh 7,2 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-mmaao-ehtpl +pACYCDuet-1-bcldhl-llldh 7,3 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-bcldhl-llldh+pACYCDuet-1-mmaao-ehtpl 4,7 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lfldhl-llldh+pACYCDuet-1-praaoehtpl 2,2 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1 -efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 8,1 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-cmaao-ehtpl+pACYCDuet-1-efmdhd-llldh 6,1 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd -llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 7,7 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lpldhd-llldh+pACYCDuet-1-pmaao-ehtpl 1,4 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lfldhd-llldh+pACYCDuet-1-ilaaoaptpl 5,8 R > 99,9
  • Konstruktion von rekombinantem E. coli, das α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase und exogene L-Lactatdehydrogenase gleichzeitig exprimiert: erstens werden die Gene, die L-Aminosäureoxidase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase und Glucosedehydrogenase kodieren, mit Plasmid pETDuet-1 oder pACYCDuet-1 verbunden. Das rekombinante Drei-Gen-Coexpressionsplasmid wird erhalten, und das Plasmid wird in E-scherichia coli HM transformiert, durch Screening von Chloramphenicol- und Ampicillinplatten auf positive Transformanten wird die rekombinante E. coli erhalten.
  • Verfahren zur induzierten Expression: das rekombinante E. coli wurde auf LB-Fermentationsmedium (Pepton 10 g / l, Hefepulver 5 g / l, NaCl 10 g / l) gemäß dem Volumenverhältnis von 2 % übertragen, nachdem der Zell-OD600 0,6 bis 0,8 erreicht hatte, wurde die 0,4 mM IPTG Endkonzentration zugeben, die Expression induziert und 8 Stunden bei 20 ° C kultiviert. Nach der induzierten Expression wurden die Zellen bei 20 ° C, 8000 U/min und 20 Minuten zentrifugiert und gesammelt.
  • Nach Abschluss der Induktion der Expression von rekombinanten E. coli, werden die Bakterien gesammelt, in einem Reaktionsvolumen von 100 ml beträgt das Nasszellgewicht 40 g/ l, die Konzentration von Levodopa 40 g / l, die Konzentration von Glukose 30 g/ l und der pH-Wert 8,0 und die Reaktion wurde bei 35 ° C 12 Stunden durchgeführt. Nach der Transformation wird Flüssigchromatographie verwendet, um den Ertrag und die Konfiguration von Danshensu zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Vergleich verschiedener rekombinanter Bakterien
    rekombinantes Bakterium Danshensu
    Konzentration g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 25,7 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-bcldhl-bsgdh-cmaao 20,5 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lfldhl-bsgdh-cmaao 24,4 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 26,5 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-lpldhd-bsgdh-1-cmaao 24,6 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-pmaao 19,7 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-praao 24,4 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-mmaao 25,5 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-bsgdh-ilaao 27,3 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pACYCDue-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 24,1 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 20,8 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pRSFDuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 23,8 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-wcldhl-bsgdh-cmaao 20,0 S > 99,9
  • Ausführungsform 4
  • Bei dem in der Literatur genannten Verfahren „Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in Escherichia coli. Microbial Cell Factories,2017,16(1):68“, wird das HM-Genom von Escherichia coli mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Expressionsstärke (PG) vor dem Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Gen (gpdA) von Escherichia coli vor das entsprechende Gen im HM-Genom gesetzt, die Sequenz wird als SEQ ID NO: 15 angezeigt.
  • Bei der verstärkten Expression des Gens gltS wird das HM-Genom von E. coli als Matrize genommen und gltS-FF/gltS-FR, gltS-gpdA-F/gltS-gpdA-R, gltS-RF/gltS-RR als Primer, sodass die Sequenz um Upstream-, Promotor- und Downstream-Sequenzen amplifiziert werden kann. Mit gltS-FF und gltS-RR als Primer wird die amplifizierte Sequenz zu einer Expressionskassette mit gpdA-Promotor fusioniert, die Expressionskassette zusammen mit den Plasmiden pCasRed und pCRlSPRgDNA (mit gltS sgRNA) in Escherichia coli HM eingeführt, anschließend induziert Cas9/sgRNA einen Doppelstrangbruch am gltS-Genort im Wirt, die Rekombinase Red integriert den gpdA-Promotor vor dem gltS-Gen und die Sequenz wird bestimmt.
  • Die folgende Tabelle 7 ist ein Index für Primernamen und die entsprechenden Sequenznummern. Tabelle 7 Index für Primernamen und entsprechende Sequenznummern
    Name Nummer in der Sequenztabelle
    gltS sgRNA SEQ ID NO:1
    gltS-FF SEQ ID NO:3
    gltS-FR SEQ ID NO:4
    gltS-gpdA-F SEQ ID NO:5
    gltS-gpdA-R SEQ ID NO:6
    gltS-RF SEQ ID NO:7
    gltS-RR SEQ ID NO:8
  • Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 5 g / I, L-Glutaminsäure 50 g / I, Levodopa 20 g / l, pH 8,0, Temperatur 40 ° C, Schüttlerdrehzahl 250 U / min, die Transformationszeit beträgt 12 Stunden. Tabelle 8 Vergleich der Transformationsergebnisse
    rekombinantes Bakterium Danshensu g/ l α-Ketoglutarat g/ l
    Konzentration g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM (PG-gltS)/pCOLADuet-1-lfldhd-bsgdh-cmaao 6,8 R > 99,9 7,2
    Escherichia coli HM (PG-gltS)/ pCOLADuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 7,2 S > 99,9 7,8
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-lfldhd-bsgdh-cmaao 5,6 R > 99,9 5,9
    Escherichia coli HM/ pCOLADuet-1-wcldhl -bsgdh-cmaao 5,3 S > 99,9 5.7
  • Das wirkungsvollste Escherichia coli HM (PG-gltS) wird Escherichia coli HML-1 genannt.
  • Bei der verstärkten Expression des Gens IIdP wird das HM-Genom von E. coli als Matrize genommen, sodass die Sequenz um Upstream-, Promotor- und Downstream-Sequenzen amplifiziert und danach eine Expressionskassette mit gpdA-Promotor fusioniert werden kann. Danach wird die Expressionskassette zusammen mit den Plasmiden pCasRed und pCRISPR-gDNA (mit IIdP sgRNA) in Escherichia coli HM eingeführt, anschließend induziert Cas9/sgRNA einen Doppelstrangbruch am IIdP-Genort im Wirt, die Rekombinase Red integriert den gpdA-Promotor vor dem IIdP-Gen und die Sequenz wird bestimmt.
  • Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 2 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 5 g/ I, L-Milchsäure 50 g/ I, Levodopa 20 g/ I, pH 8,0, Temperatur 40 °C, Schüttlerdrehzahl 250 U/min; Transformationszeit 12 Stunden. Tabelle 9 Vergleich der Transformationsergebnisse
    rekombinantes Bakterium Danshensu Pyruvat g/ l
    Konzentration g/ I Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM (PG-lldP)/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 6,4 R > 99,9 5,1
    Escherichia coli HM (PG-lldP)/ pCOLADuet-1-wcldhl-llldh-cmaao 7,2 S > 99,9 4,8
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 4.9 R > 99,9 3,2
    Escherichia coli HM/ pCOLADuet-1-wcldhl-Illdh-cmaao 5,8 S > 99,9 3,9
  • Das wirkungsvollste Escherichia coli HM (PG- lldP) wird Escherichia coli HML-2 genannt.
  • Bei der verstärkten Expression des Gens hpaX wird ein ähnliches Verfahren wie bei der verstärkten Expression des Gens IIdP angewendet. Zuerst wird die Sequenz um Upstream-, Promotor- und Downstream-Sequenzen amplifiziert und danach werden passende Primer ausgewählt, sodass eine Expressionskassette mit gpdA-Promotor fusioniert werden kann. Danach wird die Expressionskassette zusammen mit den Plasmiden pCasRed und pCRISPR-gDNA (mit hpaX sgRNA) in Escherichia coli HM eingeführt, anschließend induziert Cas9/sgRNA einen Doppelstrangbruch am hpaX-Genort im Wirt, die Rekombinase Red integriert den gpdA-Promotor vor dem hpaX-Gen und die Sequenz wird bestimmt.
  • Bei der verstärkten Expression des Gens mhpT wird ein ähnliches Verfahren wie bei der verstärkten Expression des Gens IIdP angewendet. Zuerst wird die Sequenz um Upstream-, Promotor- und Downstream-Sequenzen amplifiziert und danach werden passende Primer ausgewählt, sodass eine Expressionskassette mit gpdA-Promotor fusioniert werden kann. Danach wird die Expressionskassette zusammen mit den Plasmiden pCasRed und pCRISPR-gDNA (mit mhpT sgRNA) in Escherichia coli HM eingeführt, anschließend induziert Cas9/sgRNA einen Doppelstrangbruch am mhpT-Genort im Wirt, die Rekombinase Red integriert den gpdA-Promotor vor dem mhpT-Gen und die Sequenz wird bestimmt.
  • Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 2 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 10 g/ l, L-Milchsäure 200 g/ l, Catechol 10 g/ l, pH 8,0, Temperatur 40 °C, Schüttlerdrehzahl 250 U/min; Transformationszeit 12 Stunden. Tabelle 10 Vergleich der Transformationsergebnisse
    rekombinantes Bakterium Danshensu g/ l
    Konzentration g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HM (PG-lldP)/ pETDuet-1-wcldhlllldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 6,9 S > 99,9
    Escherichia coli HM (PG-hpaX)/ pETDuet-1-wcldhlllldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 5,9 S > 99,9
    Escherichia coli HM (PG-mhpT)/ pETDuet-1-wcldhlllldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 5,3 S > 99,9
    Escherichia coli HM (PG-hpaX, PG-mhpT)/ pETDuet-1-wcldhlllldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 6,8 S > 99,9
    Escherichia coli HM (PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT)/ pETDuet-1-wcldhl-llldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 7,8 S > 99,9
    Escherichia coli HM (PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT)/ pETDuet-1-wcldhl-llldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 8,0 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-wcldhl-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 4,8 S > 99,9
    Escherichia coli HM/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 5,4 R > 99,9
  • Das wirkungsvollste Escherichia coli HM (PG-lldP, PG-hpaX, PG-mhpT) wird Escherichia coli HMLHM genannt.
  • Ausführungsform 5
  • Gemäß dem Verfahren von Ausführungsform 4 wurden die NadA- und ribF-Gene in Escherichia coli HML mit dem konstitutiven Promotor (PG) mittlerer Expressionsstärke vor dem Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Gen (gpdA) von Escherichia coli versetzt, die Sequenz ist in SEQ ID NO: 15 gezeigt. Danach wird das Plasmid eingeführt.
  • Bei der verstärkten Expression des Gens nadA wird das HML-Genom von E. coli als Matrize genommen und nadA-FF/nadA-FR, nadA-gpdA-F/nadA-gpdA-R und nadA-RF/nadA-RR als Primer, sodass die Sequenz um Upstream-, Promotor- und Downstream-Sequenzen amplifiziert werden kann. Mit nadA-FF und nadA-RR als Primer wird die amplifizierte Sequenz zu einer Expressionskassette mit gpdA-Promotor fusioniert. Danach wird die Expressionskassette zusammen mit den Plasmiden pCasRed und pCRISPR-gDNA (mit nadA sgRNA) in Escherichia coli HML eingeführt, anschließend induziert Cas9/sgRNA einen Doppelstrangbruch am nadA -Genort im Wirt, die Rekombinase Red integriert den gpdA-Promotor vor dem nadA -Gen und die Sequenz wird bestimmt.
  • Bei der verstärkten Expression des Gens ribF wird das HML-Genom von E. coli als Matrize genommen und ribF-FF/ribF-FR, ribF-gpdA-F/ribF-gpdA-R, ribF-RF/ribF-RR als Primer, sodass die Sequenz um Upstream-, Promotor- und Downstream-Sequenzen amplifiziert werden kann. Mit ribF-FF und ribF-RR als Primer wird die amplifizierte Sequenz zu einer Expressionskassette mit gpdA-Promotor fusioniert. Danach wird die Expressionskassette zusammen mit den Plasmiden pCasRed und pCRISPR-gDNA (mit ribF sgRNA) in Escherichia coli HML eingeführt, anschließend induziert Cas9/sgRNA einen Doppelstrangbruch am ribF -Genort im Wirt, die Rekombinase Red integriert den gpdA-Promotor vor dem ribF -Gen und die Sequenz wird bestimmt.
  • Die folgende Tabelle 11 zeigt einen Index für Primernamen und die entsprechenden Sequenznummern. Tabelle 11 Index für Primernamen und die entsprechenden Sequenznummern
    Name Nummer in der Sequenztabelle
    ribF sgRNA SEQ ID NO:20
    nadA sgRNA SEQ ID NO:2
    ribF-FF SEQ ID NO:21
    ribF-FR SEQ ID NO:22
    ribF-gpdA-F SEQ ID NO:23
    ribF-gpdA-R SEQ ID NO:24
    ribF-RF SEQ ID NO:25
    ribF-RR SEQ ID NO:26
    nadA-FF SEQ ID NO:9
    nadA-FR SEQ lD NO:10
    nadA-gpdA-F SEQ lD NO:11
    nadA-gpdA-R SEQ lD NO:12
    nadA-RF SEQ lD NO:13
    nadA-RR SEQ lD NO:14
  • Nachdem die genetische Modifikation abgeschlossen ist, wird das Koexpressionsplasmid in eingeführt. Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 20 g/ I, L-Glutaminsäure 120 g/ I, Levodopa 120 g/ I,, pH 9,0, Temperatur 30 °C, Schütt-lerdrehzahl 250 U/min; Transformationszeit 24 Stunden. Tabelle 12 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu g/ l α-Ketoglutarat g/ l
    Konzentration g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HML(PG-ribF, PG-nadA)/pCOLADuet-1 -Ifldhd-bsgdh-cmaao 91,6 R > 99,9 97,2
    Escherichia coli HML(PG-ribF, PG-nadA)/pCOLADuet-1-wcldhl -bsgdh-cmaao 95,0 S > 99,9 96,1
    Escherichia coli HML(PG-ribF)/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 73,3 R > 99,9 77,4
    Escherichia coli HML(PG-nadA)/pCOLADuet-1-Ifldhd-bsgdh-cmaao 81,5 R > 99,9 87,2
    Escherichia coli HML/pCOLADuet-1-lfldhd-bsgdh-cmaao 66,0 R > 99,9 69,1
    Escherichia coli HML/pCOLADuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 69,3 S > 99,9 73,5
  • Das wirkungsvollste Escherichia coli HML (PG-nadA,PG-ribF) wird Escherichia coli HNR-1 genannt.
  • Nachdem die genetische Modifikation abgeschlossen ist, wird das Koexpressionsplasmid in eingeführt. Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 20 g/ I, L-Milchsäure 120 g/ I, Levodopa 120 g/ I, pH 9,0, Temperatur 30 °C, Schüttlerdrehzahl 250 U/min; Transformationszeit 24 Stunden. Der Vergleich der Transformationsergebnisse ist in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu Pyruvat g/l
    Konzentration g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HML(PG-ribF, PG-nadA)/pCOLADuet-1 -efmdhd-llldh-cmaao 92,1 R > 99,9 50,2
    Escherichia coli HML(PG-ribF, PG-nadA)/pCOLADuet-1 -wcldhl-IIIdh-cmaao 94,5 S > 99,9 51,3
    Escherichia coli HML(PG-ribF)/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 74,2 R > 99,9 42,3
    Escherichia coli HML(PG-nadA)/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 83,2 R > 99,9 47,2
    Escherichia coli HML/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 66,7 R > 99,9 39,6
    Escherichia coli HML/pCOLADuet-1-wcldhl-llldh-cmaao 69,3 S > 99,9 37,1
  • Das wirkungsvollste Escherichia coli HML (PG-nadA,PG-ribF) wird Escherichia coli HNR-2 genannt.
  • Nachdem die genetische Modifikation abgeschlossen ist, wird das Koexpressionsplasmid in eingeführt. Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 20 g/ l, L-Milchsäure 200 g/ l, Catechol 200 g/ l, pH 9,0, Temperatur 30 °C, Schüttlerdrehzahl 250 U/min; Transformationszeit 24 Stunden. Tabelle 14 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu
    Konzentration g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HMLHM(PG-ribF, PG-nadA)/pETDuet-1-wcldhl-IIIdh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 87,2 S > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-ribF)/pETDuet-1-wcldhl-IIIdh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 66,9 S > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-nadA)/pETDuet-1-wcldhl-IIIdh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 84,9 S > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-nadA, PG-pdxJ)/pETDuet-1-wcldhl-IIIdh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 91,3 S > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-nadA, PG-ribF, PG-pdxJ)/pETDuet-1-wcldhl-IIIdh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 94,5 S > 99,9
    Escherichia coli HMLHM/pETDuet-1-wcldhl-IIIdh+pACYCDuet-1- cmaao-ehtpl 56,0 S > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-ribF, PG-nadA)/pETDuet-1-efmdhd-IIIdh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 85,7 R > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-ribF)/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 58,5 R > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-nadA)/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 86,4 R > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-nadA, PG-pdxJ)/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1 -cmaao-ehtpl 90,7 R > 99,9
    Escherichia coli HMLHM(PG-nadA, PG-ribF, PG-pdxJ)/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 96,4 R > 99,9
    Escherichia coli HMLHM/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 60,4 R > 99,9
  • Das wirkungsvollste Escherichia coli HMLHM (PG-nadA,PG-ribF,PG-pdxJ) wird Escherichia coli NPR-2 genannt.
  • Nachdem die genetische Modifikation abgeschlossen ist, wird das Koexpressionsplasmid in eingeführt. Die Expression wurde gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen Verfahren induziert und verschiedene Zelltypen wurden zur Transformationsanalyse gesammelt, die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt. Das gesamte Zelltransformationssystem in dem Transformationssystem ist: Nasszellgewicht 20 g/ l, Glukose 100 g/ l, Levodopa 120 g/ l, pH 9,0, Temperatur 30 °C, Schüttlerdrehzahl 250 U/min; Transformationszeit 24 Stunden. Tabelle 15 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu g/ l
    Konzentration g/ l Kon figuration e.e%
    Escherichia coli HM(PG-ribF, PG-nadA)/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 95,6 R > 99,9
    Escherichia coli HM(PG-ribF, PG-nadA)/pCOLADuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 98,3 S > 99,9
    Escherichia coli HM(PG-ribF)/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 86,1 R > 99,9
    Escherichia coli HM(PG-nadA)/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 88,9 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 75,0 R > 99,9
    Escherichia coli HM/pCOLADuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 79,4 S > 99,9
    Escherichia coli HM(PG-nadA,PG-ribF)funktioniert am besten und wird Escherichia coli NR genannt.
  • Ausführungsform 6
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden nach Induktion der Expression von Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao die Bakterien gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 1 g/ l, L-Glutaminsäure 1 g/l, Levodopa 1 g/ l, pH 6,0 beträgt, die Temperatur 15 °C, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 1 Stunde. Als Ergebnis der Bestimmung beträgt die Konzentration von R-Danshensu 93 mg/ l, e.e%> 99,9.
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden nach Induktion der Expression von Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao die Bakterien gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 1 g / l, L-Milchsäure 1 g/ I, Levodopa 1 g/ I, pH 6,0, die Temperatur 15 °C beträgt, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 1 Stunde. Als Ergebnis der Bestimmung beträgt die Konzentration von R-Danshensu 93 mg /l , e.e%> 99,9.
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden nach Induktion der Expression von Escherichia coli NPR/pETDuet-1-wcldhl-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl die Bakterien werden gesammelt wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 1 g/ l, L-Milchsäure 1 g/ l, Catechol 1 g/ l, pH 6,0, beträgt, die Temperatur 15 °C, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 1 Stunde. Als Ergebnis der Bestimmung beträgt die Konzentration von S-Danshensu 78 mg/l.
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden nach Induktion der Expression von Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao die Bakterien werden gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 1 g/ l, Glukose 1 g/ l, Levodopa 1 g/ l, pH 6,0, beträgt, die Temperatur 15 °C, Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 1 Stunde. Als Ergebnis der Bestimmung beträgt die Konzentration von S-Danshensu 93 mg/l, e.e%> 99,9.
  • Ausführungsform 7
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden die Bakterien nach der Induktion und Expression der Stämme von Tabelle 16 gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml das Nasszellgewicht 200 g/ l, L-Glutaminsäure 200g/l, Levodopa 200 g/ I, pH 8,5 beträgt, die Temperatur 40°C, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 48 Stunden. Nachdem der gesamte Niederschlag verdünnt und gelöst worden war, ist das Messergebnis wie in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu Kon α-Ketoglutarat g/ l
    Ertrag g/ l figuration e.e%
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1- Ifldhd-bsgdh-cmaao 183 R > 99,9 184
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 184 S > 99,9 189
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-lfldhd-bsgdhpmaao 131 R > 99,9 130
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1- Ifldhd-bsgdh-praao 159 R > 99,9 171
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-wcldhl -bsgdh-mmaao 140 S > 99,9 152
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-wcldhl -bsgdh-praao 148 S > 99,9 155
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden die Bakterien nach der Induktion und Expression der Stämme von Tabelle 17 gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml, das Nasszellgewicht 200 g/ l, L-Milchsäure 200g/l, Levodopa 200 g/ l, pH 8,5 beträgt, die Temperatur 40 °C, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 48 Stunden. Nachdem der gesamte Niederschlag verdünnt und gelöst worden war, wird das Ergebnis bestimmt. Tabelle 17 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu Pyruvat g/ l
    Ertrag g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-efmdhd-llldh-cmaao 188 R > 99,9 112
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1-wcldhl-llldh-cmaao 186 S > 99,9 108
    Escherichia coli NPR/pCOLADuet-1-efmdhd-llldhpmaao 132 R > 99,9 74
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-l-efmdhd-llldhpraao 162 R > 99,9 93
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1- wcldhl -llldhmmaao 143 S > 99,9 86
    Escherichia coli HNR/pCOLADuet-1- wcldhl -llldhpraao 146 S > 99,9 90
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden die Bakterien nach der Induktion und Expression der Stämme von Tabelle 18 gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml beträgt das Nasszellgewicht 200 g/ I, L-Milchsäure 200g/l, Catechol 200 g/ I, pH 8,5 beträgt, die Temperatur 40 °C, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 48 Stunden. Nachdem der gesamte Niederschlag verdünnt und gelöst worden war, wird das Ergebnis bestimmt. Tabelle 18 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu
    Konzentration g/ l Kon figuration e.e%
    Escherichia coli NPR/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-cmaao-ehtpl 382 R > 99,9
    Escherichia coli NPR/pETDuet-1 -wcldhl-llldh+pACYCDuet-1 - cmaao-ehtpl 378 S > 99,9
    Escherichia coli NPR/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-pmaao-ehtpl 344 R > 99,9
    Escherichia coli NPR/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-ilaaoehtpl 348 R > 99,9
    Escherichia coli NPR/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-mmaao-ehtpl 306 R > 99,9
    Escherichia coli NPR/pETDuet-1-efmdhd-llldh+pACYCDuet-1-praao-ehtpl 333 R > 99,9
  • Gemäß dem in Ausführungsform 1 beschriebenen induzierenden Expressionsverfahren werden die Bakterien nach der Induktion und Expression der Stämme von Tabelle 19 gesammelt, wobei in einem Reaktionsvolumen von 100 ml beträgt das Nasszellgewicht 200 g/ I, Glukose 200g/l, Levodopa 200 g/ l, pH 8,5 beträgt, die Temperatur 40 °C, die Schüttlerdrehzahl 250 U/min, die Transformationszeit 48 Stunden. Nachdem der gesamte Niederschlag verdünnt und gelöst worden war, wird das Ergebnis bestimmt. Tabelle 19 Vergleich der Transformationsergebnisse
    Bakterienstamm Danshensu
    Ertrag g/ l Konfiguration e.e%
    Escherichia coli NR/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao 187,4 R > 99,9
    Escherichia coli NR/pCOLADuet-1-wcldhl-bsgdh-cmaao 192,6 S > 99,9
    Escherichia coli PR/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-pmaao 134,2 R > 99,9
    Escherichia coli NR/pCOLADuet-1-efmdhd-bsgdh-praao 174,7 R > 99,9
    Escherichia coli NR/pCOLADuet-1-wcldhl -bsgdh-mmaao 155,6 S > 99,9
    Escherichia coli NR/pCOLADuet-1- wcldhl -bsgdh-praao 171,0 S > 99,9
  • Die Modifikation und Konstruktion der oben genannten Enzyme und ihrer coexprimierenden gentechnischen Bakterien, die Zusammensetzung des Kulturmediums der Bakterien, das Kulturverfahren sowie die Ganzzell-Biotransformation sind nur bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen die vorliegende Erfindung nicht einschränken, es können theoretisch andere Bakterien, Fadenpilze, Actinomyceten und tierische Zellen genomisch modifiziert werden und für die Ganzzellkatalyse der Koexpression mehrerer Gene verwendet werden. Jede Modifikation oder gleichwertige Ersetzung, die im Rahmen des Geistes und des Prinzips der vorliegenden Erfindung vorgenommen wird, sollte in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • CN 200810038853 [0004]
    • CN 201310559498 [0004]
    • CN 201210190171 [0004]
    • CN 201210420488 [0004]
    • KE 992901 [0014]
    • EE 122188 [0052]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Arch. Pharm. (Weinheim) 321, 179-180 (1988) [0005]
    • Z. Findrik et al. verwendeten Schlangengift-Aminosäureoxidase, um Levodopa in 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat umzuwandeln und reduzierten es danach mit D-Lactatdehydrogenase, um D-(3,4-Dihydroxyphenyl)-Milchsäure herzustellen (Modelling and Optimization of the (R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed with D-lactateDehydrogenase from Lactobacillus leishmannii Using Genetic Algorithm, Chem. Biochem. Eng. Q. 19 (4) 351-358 (2005)) [0005]
    • Poljanac et al. L-Aminosäureoxidase des Diamant-Klapperschlangengifts für die Oxidierung von Dopa, um 3,4-Dihydroxyphenylpyruvat zu erzeugen, und fügten danach Lactatdehydrogenase und Formiatdehydrogenase hinzu, um 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure zu erzeugen. Bei diesem Verfahren muss Katalase zugesetzt werden, um die Toxizität von Wasserstoffperoxid zu beseitigen (Modelling and Optimization of the (R)-(+)-3,4-Dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed, Chem. Biochem. Eng. Q.2005,19 (4) 351-358 [0052]
    • Klonen, Expression und Bestimmung der Enzymaktivität vom Glutamatdehydrogenase-Gens des Bacillus natto. Journal of Shanghai Jiaotong University (Agricultural Science), 2010, 1: 82-86 [0061]

Claims (10)

  1. Rekombinantes Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante E. coli sowohl α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase als auch L-Aminosäureoxidase und eine der folgenden Substanzen exprimiert: exogene L-Glutamatdehydrogenase, exogene L-Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase und Tyrosinphenollyase, wobei Tyrosinphenollyase gleichzeitig mit L-Lactatdehydrogenase exprimiert und Gene ausgeschaltet werden, die mit der Zersetzung von Phenolverbindungen auf der Basis des Wirts E.coli zusammenhängen.
  2. Rekombinantes E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zersetzung von Phenolen eine beliebige oder eine Kombination von hpaD und mhpB ist.
  3. Rekombinantes E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass E. coli die Expression eines oder mehrerer Glutamattransportgene, Lactattransportgene, Catecholtransportgene, NAD-Synthesegene und FAD-Synthesegene verstärkt, wobei bei der Expression des Catecholtransportgens gleichzeitig das Milchsäuretransportgen exprimiert wird und das Glutamattransportgen und das Lactattransportgen nicht gleichzeitig exprimiert werden.
  4. Rekombinantes E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen für eine verstärkte Expression eines oder mehrere von gltS, nadA und ribF ist, wobei das Gen für eine verstärkte die Expression eines oder mehrere von IIdP, nadA und ribF sind, wobei das Gen für die verstärkte Expression eines oder mehrere von IIdP, hpaX, mhpT, nadA, pdxJ und ribF sind.
  5. Rekombinantes E. coli nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verstärkte Expression durch Zugabe eines konstitutiven Promotors vor dem zu verstärkenden Gen erreicht wird, das auf dem Genom des E. coli als Wirt exprimiert wird.
  6. Rekombinantes E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Glutamatdehydrogenase, L-Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Tyrosinphenollyase, L-Lactatdehydrogenase, α-Hydroxycarbonsäuredehydrogenase, L-Aminosäureoxidase durch pCOLADuet coexprimiert werden.
  7. Rekombinantes E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt Escherichia coli Escherichia coli BL21 ist.
  8. Verfahren zur Herstellung von Danshensu, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren rekombinante Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es das Verfahren darin besteht, eine Ganzzelltransformationsproduktion durchzuführen.
  10. Anwendung eines rekombinanten E. coli nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 9 in den Bereichen Chemieindustrie, Lebensmittel und Arzneimittelherstellung.
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