DE10129711B4

DE10129711B4 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat

Info

Publication number: DE10129711B4
Application number: DE2001129711
Authority: DE
Inventors: Michael Prof.Dr. Bott; Tanja Dipl.-Biol. Gerharz; Ralf Dr. Takors; Bruno Dipl.-Ing. Zelic
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-06-23
Also published as: DE10129711A1; WO2003000913A3; WO2003000913A2

Abstract

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli-Zellen, eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, Pyruvat-Formiat-Lyase, Phosphoenolpyruvat-Synthetase und Pyruvat-Oxidase kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat.

Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d.h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwermetalle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995). Weiterhin sind folgende mikrobielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat bekannt: Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabilisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris, die das Gen für die (S)-Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R.; Eisenberg, A.; Seip, J.E.; Gavagan J. E.; Payne, M. S.; Anton D. L. (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223-232; US-Patent 5538875). Das bei der Lactat-Oxidation gebildete H₂O₂ wird durch endogene Katalase zu H₂O und O₂ umgesetzt. Mit diesem Prozeß konnte eine 1 M Lösung von Natrium- oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobilisierter (S)-Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B.A.; Schaeffer, J. R. (1987): Co-immobilized coupled enzyme systems on nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production. Biotechnol. Lett. 9: 253-258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H.; Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvate from (R)-lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191-203). Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat-Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt werden. Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzell-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie beschrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzierten (Yonehara, T.; Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155-159). Die mit diesen Stämmen maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed-Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M). Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von Enterobacter aerogenes (Yokota A. (1989): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53: 705-711) und Escherichia coli beschrieben (Yokota A.; Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 638-643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterobacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/Mol Glucose (Yokata A. Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994a): Pyruvic acid production by an F1-ATPasedefective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 2164-2167; Yokota, A.; Henmi, M.; Takaoka, N.; Hayashi, C.; Takezawa Y.; Fukumori, Y.; Tomita, F. (1997): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132-138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure: ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Substrat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der entscheidende Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant unter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute liegen.

Die Veröffentlichung „Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coliW1485" aus Appl. Micobiol. Biotechnol. (1994) 41: 638-643 von A. Yokota, H. Shimizu, Y. Terasawa, N. Takaoka und F. Tomita offenbart die Pyruvatsäureproduktion durch Escherichia coli. Die Pyruvatproduktion erfolgt unter Abschwächung der Aktivität der Pyruvatdehydrogenase mit einer Ausbeute von ca. 50 %.

In Chemical Abstracts 131: 72762 wird offenbart, dass die Thiaminkonzentration die Aktivität der Pyruvatdehydrogenase und Pyruvatdecarboxylase beeinflusst. Aus der Schrift US 5,869,301 ist bekannt, dass durch Delektion von Nucleotidsequenzen die pyruvatabbauende Enzyme kodieren, zur Akumulation von Pyruvat führen. Aus der WO 98/07843 A1 ist bekannt, dass bei Milchsäurebakterien Pyruvat angehäuft wird, wenn Enzymsysteme, die am Pyruvatverbrauch beteiligt sind, defekt sind.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, mit dem es möglich ist, Pyruvat mit nahezu maximal erreichbaren Produktausbeuten mikrobiell zu gewinnen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden heraus, daß bei Verwendung von Mikroorganismen mit keiner oder reduzierter Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme: Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, Pyruvat-Decarboxylase, Pyruvat:Feredoxin-Oxidoreductase, Pyruvat:Flavodoxin-Oxidoreductase, Pyruvat-Formiat-Lyase, die Pyruvat-Oxidase und/oder die Phosphoenolpyruvat-Synthetase, in verbesserter Weise Pyruvat produziert werden konnte. Diese Reduzierung der Enzymaktivität bzw. komplette Inaktivierung der Enzyme kann beispielsweise durch genetische Veränderungen, z. B. nach Mutation, Deletion oder Reduzierung der Expression der Gene, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Pyruvat-Oxidase und die Phosphoenolpyruvat-Synthetase kodieren, erreicht werden. Es konnte eine nahezu stöchiometrische Umsetzung der Kohlenstoffquelle in Pyruvat erreicht werden, d. h. beispielsweise: C₆H₁₂O₆ (Glucose) + O₂ → 2C₃H₄O₃ (Brenztraubensäure) + 2H₂O

Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat aus Kohlenhydraten wie beispielsweise Glucose, Saccha rose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus organischen Säuren wie z.B. Lactat oder auch aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Es werden Escherichia coli-Zellen eingesetzt. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC202, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14335, erwiesen. Dieser Organismus ist in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y.; Cronan, J.E. (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 151: 1279-1289; Chang, Y-Y.; Cronan, J.E. (1983): Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5): 756-762; Georgiou, D. Ch.; Fang, H.; Gennis, R.B. (1987): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107-2112).

Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermentationen können sowohl aerob als auch anaerob durchgeführt werden.

Der im folgenden verwendete Begriff „geringer exprimiert" beinhaltet die Abschwächung der Synthese bzw. die vollständige Deletion der für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase und die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gene oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme.

Der im folgenden verwendete Begriff „natürlich" soll dabei solche Nukleotidsequenzen umfassen, die aus genetisch nicht veränderten Mikroorganismen, den Wildtypstämmen, isoliert werden können.

Folgender Mikroorganismus wurde am 01.06. 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
Escherichia coli YYC202 als DSM 14335

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoffwechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Es zeigt:

1: Übersicht Pyruvat-Stoffwechselweg in E. coli YYC 202

2: Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202 in M9-Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat.

3: Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit ruhenden Zellen von E. coli YYC202 bei pH 7

4: Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben Fed-batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202

5: CO₂-Bildungsrate (CTR) und Acetataufnahmerate (ACR) während einer aeroben Fed-batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202

1 zeigt schematisch die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat im Stoffwechsel von E. coli YYC 202. Dabei bezeichnet

PTS:: Phosphotransferase-System
Glucose-6-P:: Glucose-6-Phosphat
PEP:: Phosphoenolpyruvat
pps:: Gensequenz codierend für Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PPS)
aceEF:: Gensequenz codierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
pflB:: Gensequenz codierend für Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL)
poxB:: Gensequenz codierend für Pyruvat-Oxidase (POX)

Die Glucose wird über das Phosphotransferase-System (PTS) durch die Cytoplasmamembran (1) in das Innere der Zelle transportiert und anschließend über Glucose-6-Phosphat und Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat umgesetzt. Pyruvat kann mit Hilfe der Pyruvat-Oxidase (POX), kodiert durch die Gensequenz poxB, zu Acetat umgesetzt werden. Mit Hilfe des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, welcher ein Multienzymkomplex ist, der aus mehreren Untereinheiten (E1, E2) besteht, die durch die Gensequenz aceEF kodiert werden, wird die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert, welches dann zur weiteren Umsetzung in den Citrat-Zyklus eingeschleust werden kann. Unter anaeroben Bedingungen kann Pyruvat mit Hilfe der Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL), kodiert durch die Gensequenz pflB, zu Acetyl-CoA umgesetzt werden. Weiterhin kann Pyruvat mit Hilfe der Phosphoenol-Pyruvat-Synthetase (PPS), kodiert durch die Gensequenz poxB, wieder zu Phosphoenolpyruvat (PEP) umgesetzt werden.

2 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben batch Fermentation mit E, coli YYC202. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y₁ zeigt die optische Dichte (OD₆₀₀) Die Ordinate Y₂ gibt die Konzentration von Glucose bzw. Pyruvat in mM an. Der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD₆₀₀, wird durch die Symbole (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (•) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol

dargestellt.

3 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben batch Fermentation mit ruhenden Zellen von E. coli YYC202. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y₁ zeigt die optische Dichte (OD 600). Die Ordinate Y₂ gibt die Konzentration von Glucose bzw. Pyruvat in mM an. Der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD₆₀₀, wird durch die Symbole (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (•) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol

dargestellt.

4 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben Fed-batch Fermentation mit E. coli YYC202 als Funktion der Zeit (X). Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y₁ zeigt die optische Dichte (OD₆₀₀). Die Ordinate Y₂ gibt die Konzentration der Glucose bzw. des Pyruvats in mM an. Der Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD₆₀₀ wird durch das Symbol (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol

dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol (•) dargestellt.

5 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben Fed-batch Fermentation mit E. coli YYC202 als Funktion der Zeit. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y₁ bzw. Y₂ gibt die CO₂-Bildungsrate CTR (mmol/L·h) bzw. die Acetat-Aufnahmerate ACR (mmol/L·h) an. Der zeitliche Verlauf der CO₂-Bildungsrate CTR wird durch das Symbol (o) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Acetat-Aufnahmerate ACR wird durch das Symbol

dargestellt.

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.

Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme durch Veränderung der für diese Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte eine erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Diese Enzyme können den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Decarboxylase, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase, die Pyruvat:Ferredoxinoxidoreductase oder die Pyruvat:Flavodoxin-Oxidoreductase umfassen. Als Mikroorganismen haben sich Escherichia coli-Zellen als geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Organismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist bekannt, daß folgende Gensequenzen so verändert wurden, daß keine bzw. nur eine geringe Aktivität der von diesen Sequenzen kodierten Enzyme nachweisbar war: aceEF – kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, poxB – kodierend für die Pyruvat-Oxidase (POX); pps – kodierend für die Phosphoenol-Pyruvat-Synthetase (PPS); pflB – kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL). Die höchste Pyruvat-Ausbeute wird durch die Inaktivierung/Hemmung aller genannten Enzyme erreicht. Die Inaktivierung eines einzelnen Enzyms, z. B. durch Deletion der aceEF-Gene führt jedoch ebenfalls zu einer deutlich erhöhten Pyruvat-Produktion.

Es konnte sowohl mit ruhenden Zellen als auch mit wachsenden Zellen eine Umsetzung des Substrates in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag. Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und Produktbildung durch die Dosierung des essentiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. In Anwesenheit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zellteilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthe se neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyruvat-Ausbeute nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. „ruhende" Zellen. Diese Zellen werden zunächst in ein Medium gegeben, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, welches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Unter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruvatausbeute erreicht werden. Auf Grund der Stoffwechseleigenschaften der Organismen können sowohl aerobe als auch anaerobe Fermentationen durchgeführt werden.

Als Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlenhydrate (z. B. Tetrosen, Hexosen, Pentosen, Heptosen), organische Säuren sowie auch Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. C₁₃-markierte Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf den weiteren Stoffwechsel des Organismus auswirken, indem zunächst ein hoher Pyruvat-Pool erzeugt wird und im weiteren gezielt Stoffwechselwege verstärkt werden, wie z. B. eine erhöhte Lysinproduktion mit Corynebacterium glutamicum.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
1. Einfluß verschiedener Acetatkonzentrationen auf Wachstum und Pyruvat-Bildung
Um den Einfluß der Acetatkonzentration auf Wachstum und Pyruvat-Bildung von Escherichia coli YYC202 zu untersuchen wurde der Organismus in M9-Minimalmedium (Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989): Molecular cloning, Second Edition, Vol. 3) mit 10 mM Glucose und Acetatkonzentrationen von 0, 1, 2, 6, und 10 mM kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute (Upm) wurde die im Kulturüberstand vorhandene Pyruvat-Konzentration mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Das Wachstum wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) photometrisch bestimmt. In 2 sind Wachstum, Glucose-Verbrauch und Pyruvat-Bildung bei einer initialen Acetat-Konzentration von 2 mM dargestellt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche. In Abwesenheit von Acetat zeigte der Organismus kein Wachstum. Mit steigender Acetatkonzentration stieg die maximale Wachstumsrate und die maximal erreichte OD₆₀₀, während die Pyruvat- Ausbeute kontinuierlich abnahm. Dennoch konnten Pyruvat Ausbeuten erreicht werden, die mit 1,3 bis 1,7 Mol Pyruvat/Mol Glucose höher waren als die der bisher publizierten Verfahren. Tab. 1: Pyruvat-Ausbeute bei unterschiedlicher Acetat-Ausgangskonzentration im Medium
2. Pyruvat-Bildung mit „ruhenden" Zellen von Escherichia coli YYC 202
Bei aerobem Wachstum von E. coli Wildtypstämmen auf Glucose-Minimalmedium werden ca. 50% der verbrauchten Glucose für die Biosynthese von neuem Zellmaterial eingesetzt. Eine maximale Pyruvat-Ausbeute (2 Mol Pyruvat/Mol Glucose) ist daher nur mit „ruhenden", nicht wachsenden Zellen möglich. Zur Charakterisierung der Pyruvat-Bildung durch solche Zellsuspensionen wurden Zellen von E. coli YYC202, die in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat gezüchtet worden waren, abzentrifugiert und die Zellen zweimal mit 1/10 Kulturvolumen 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einem Puffer (50 mM MES, 50 mM MOPS, und 50 mM TRICINE) mit 10 mM Glucose, aber ohne Acetat und weitere Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff- und Schwefelquellen, resuspendiert. Die OD₅₀₀ der Zellsuspension betrug ca. 1,0. Die Pyruvat-Bildung wurde bei pH-Werten von 6, 6,5, 7, 7,5, und 8 untersucht. Das verwendete Puffergemisch wurde dabei auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Nach Inkubation der Zellsuspension für 24 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler bei 140 Upm (Umdrehungen pro Minute) wurde die im Kulturüberstand akkumulierte Pyruvat-Konzentration mittels üblicher Analyseverfahren wie z. B HPLC oder enzymatische Tests bestimmt. In 3 ist die Kinetik des Glucose Verbrauchs und der Pyruvat-Bildung bei einem pH-Wert von 7 dargestellt. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Pyruvat-Ausbeute bei verschiedenen pH-Werten dargestellt. Es zeigte sich, daß die Ausbeute bei einem pH-Wert oberhalb 7 abnahm. Tabelle 2: Pyruvat-Ausbeute mit ruhenden Zellen bei verschiedenen pH-Werten
3. Einfluß der Zellkonzentration ruhender Zellen von E. coli YYC202 auf die Pyruvat-Ausbeute
Zur Untersuchung des Einflusses der Zellkonzentration ruhender Zellen auf die Pyruvat-Ausbeute wurden Fermentationen mit ruhenden Zellen durchgeführt, die in unterschiedlichen Konzentrationen mit einer optischen Dichte OD₆₀₀ von 0,65 bis 5,77 eingesetzt wurden. Mit steigender Zellkonzentration war eine Zunahme der Pyruvat-Bildungsrate zu verzeichnen.
4. Fed-batch Fermentation zur Herstellung von Pyruvat mit E. coli YYC202
Fed-batch Fermentationen zur Pyruvat-Produktion wurden im Labormaßstab (7,5 l Bioreaktor) unter aeroben Bedingungen (pO₂ ≥ 40 %) bei 3 7 ° C und pH 7 unter Verwendung des ,Pan'-Mediums (Pan, J.G.; Rhee, J.S.; Lebeault, J.M. (1987): Physiological Constraints in Increasing Biomass Concentration of Escherichia coli B in Fedbatch Culture, Biotechnol. Letters, Vol 9 (2): 89-94.) durchgeführt. Aufgrund der Acetat-Auxotrophie des eingesetzten Produktionsstammes korreliert die CO₂-Bildungsrate (CTR) des Citrat-Zyklus direkt mit der Acetat-Aufnahmerate (ACR) der Zellen. Unter Wachstumsbedingungen auf Glucose mit Acetat konnte die allgemeine Beziehung
gefunden werden, wobei die Konstante den Wert 1 annimmt. Die 4 und 5 verdeutlichen diese Korrelation anhand eines fed-batch Experimentes, bei dem eine OD₆₀₀ von 22 und eine Pyruvat-Konzentration von ca. 330 mM erreicht wurden. Die Glucose-Konzentration war während des gesamten Experimentes nicht limitierend.
Die Verwendung der Beziehung (1) ermöglicht es, eine gezielte Prozessführung über die on-line Messung des vergleichsweise einfach zugänglichen Signals CTR (z. B. via NIR (Near Infra-Red)-Abgasanalytik) zu realisieren. Soll eine hohe Wachstumsrate eingestellt werden, so kann eine nicht-limitierende Acetatversorgung eingeregelt werden. Ebenso ist es möglich, eine möglichst hoch selektive Pyruvat-Produktion unter Acetat-limitierenden Bedingungen einzustellen. Die Verwendung der Beziehung (1) ermöglicht somit die on-line Regelung des Prozesses über beispielsweise Einsatz eiern CO₂ Meßanalytik hin zu hohen Raum-Zeit-Ausbeuten oder hohen Produkt/Substrat-Selektivitäten oder hohen Produkttitern.

Claims

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli-Zellen, eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, Pyruvat-Formiat-Lyase, Phosphoenolpyruvat-Synthetase und Pyruvat-Oxidase kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat-Decarboxylase kodieren, deletiert, oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreductase kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat:Flavodoxin-Oxidoreductase-kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach eine der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die aceE und aceF-Gene kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die poxB-Gene kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die pps-Gene kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli eingesetzt werden, deren Nukleotidsequenzen, die für die pflB-Gene kodieren, deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Escherichia coli YYC 202, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 14335, eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl anaerobe als auch aerobe Fermentationen durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Acetat bei der Fermentation mit wachsenden Zellen eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass bei Fermentationen mit ruhenden Zellen kein Acetat eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei den Fermentationen eine CO₂-Messanalytik eingesetzt wird.