EP2670838A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol

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Publication number
EP2670838A1
EP2670838A1 EP12701748.1A EP12701748A EP2670838A1 EP 2670838 A1 EP2670838 A1 EP 2670838A1 EP 12701748 A EP12701748 A EP 12701748A EP 2670838 A1 EP2670838 A1 EP 2670838A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
production
butanediol
klebsiella
raoultella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12701748.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie AG filed Critical Wacker Chemie AG
Publication of EP2670838A1 publication Critical patent/EP2670838A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the invention relates to a process for the fermentative production of 2,3-butanediol (2,3-BDL) by means of an improved microorganism strain having a 2 to 12.8 times increased acetolactate decarboxylase activity compared to the non-improved starting strain.
  • a C4 building block accessible by fermentation is 2,3-butanediol.
  • the state of the art for fermentative 2,3-butanediol production is summarized in Celinska and Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725).
  • 2, 3 Butanediol is a possible starting material for petrochemical products with four carbon atoms (C4 building blocks) such as acetoin, diacetyl, 1,3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, MEK).
  • products with two C atoms (C2 units) such as acetic acid (DE 102010001399) and derived therefrom, acetaldehyde, ethanol and also ethylene are available.
  • dimerization of 2, 3-butanediol and C8 compounds are conceivable, the use, for example, as a fuel in the aviation sector.
  • acetoin reductase (2, 3-butanediol dehydrogenase): NADH-dependent reduction of acetoin ⁇ . 2, 3-butanediol.
  • 2,3-butanediol Various natural producers of 2,3-butanediol are known, e.g. B. from the genera Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus etc.
  • yeasts are known as producers (eg bakers yeast) .Most bacterial producers are microorganisms of biological safety.
  • stage S2 can not be used on a large scale without elaborate and expensive technical safety measures (for this and for other microbial 2, 3-butanediol producers, see the review by Celinska and Grajek, Biotechnol Advances (2009) 27: 715-725)
  • 3-BDL production strains from the biological safety level Sl are strains of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, strains of the genus Bacillus (resp.
  • Paenibacillus such as Bacillus polymyxa or Bacillus licheniformis.
  • the species Klebsiella terrigena and Klebsiella planticola are also synonymously referred to as Raoultella terrigena and Raoultella planticola as a result of a taxonomic renaming , These are strains of the same species.
  • 2,3-butanediol yields of not more than 57 g / l (637 mM, production time 60 h) have so far been reported for these strains classified in safety level Sl (Nakashimada et al., J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661- These yields are far too low for economic production, and the minimum fermentation yield for economical production is> 80 g / l 2, 3-butanediol (fermentation time maximum 72 h), preferably> 100 g / l 2, 3-butanediol viewed.
  • biosafety level and the division into different security levels can be found for example in "Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratorie n, p 9ff. (Table 1), Centers for Disease Control and Prevention (US) ( Editor), Public Health Service (US) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
  • acetolactate decarboxylase ALD
  • Klebsiella terrigena and Enterobacter aerogenes in brewing yeast The heterologous expression of acetolactate decarboxylase (ALD) genes from Klebsiella terrigena and Enterobacter aerogenes in brewing yeast is described in Blomqvist et al. , Ap l. Environ. Microbiol. (1991) 57: 2796-2803. The aim of these investigations, however, was not the production of 2, 3-butanediol, but the reduction of occurring during brewing as tasting by-product diacetyl.
  • ALD acetolactate decarboxylase
  • Diacetyl by-produced in brewing yeast from acetolactate, is degraded during beer maturation, and increased ALD expression is expected to reduce intracellular levels of acetolactate and prevent the formation of diacetyl by directing acetolactate directly to aceto-2,3 ' Butanediol precursor is decarboxylated.
  • the object of the invention was to provide production strains for the production of 2,3-butanediol, which enable significantly higher 2,3-butanediol yields than the parent strain.
  • the problem was solved by a production strain which can be produced from an initial strain, characterized in that the production strain has a minimum of 2 to 12.8-fold over acetolactate decarboxylase activity exhibited by the parent strain.
  • the parent strain may be a wild-type strain that is not further optimized but capable of generating 2,3-butanediol or an already optimized wild-type strain. However, in an already further optimized wild type strain (e.g., by genetic engineering), the acetolactate decarboxylase activity is not affected by the optimization.
  • a production strain is to be understood as meaning a starting strain which has been optimized with respect to the production of 2,3-butanediol and which is characterized by an increased activity of the enzyme acetolactate decarboxylase (ALD) in comparison to the starting strain.
  • ALD acetolactate decarboxylase
  • the production strain is made from the parent strain. If an already optimized starting stamina is to be improved even further by an increase in the acetolactate decarboxylase activity, then it is of course also possible first to increase the acetolactate decarboxylase activity in an unimpaired strain and then to introduce further improvements.
  • the increase in acetolactate decarboxylase activity in the production strain can be caused by any mutation in the genome of the parent strain (eg a promoter activity-enhancing mutation), an enzyme activity-enhancing mutation in the acetolactate decarboxylase gene or by expression of a homologous or heterologous acetolactate decarboxylase gene in the starting strain.
  • the overexpression of a homologous or heterologous acetolactate decarboxylase gene in the parent strain is preferably, the overexpression of a homologous or heterologous acetolactate decarboxylase gene in the parent strain.
  • the acetolactate decarboxylase activity is increased by a factor of 2 to 10 and more preferably by a factor of 2 to 5.
  • This increased acetolactate decarboxylase activity is particularly preferably achieved by increased expression of a homologous or heterologous gene coding for an acetolactate-decarboxylase enzyme compared with the starting strain.
  • the parent strain may be any 2,3-butanediol-producing strain. It is preferably a strain of the genus Klebsiella (Raoultella) or Bacillus (Paenibacillus) or Lactobacillus.
  • a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa or Bacillus licheniformis with a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticola is again preferred.
  • the increased ALD activity is achieved by recombinant overexpression of an acetolactate decarboxylase (EC 4.1.1.5) in a production strain.
  • an acetolactate decarboxylase EC 4.1.1.5
  • overexpression of the acetolactate decarboxylase by a factor of 2 to 12.8 is suitable for the 2,3-butanediol yield (determined as the volume yield of 2,3-butanediol in g / l ) in the fermentation by more than 20%, preferably more than 30% and most preferably by more than 40% increase.
  • Acetolactate decarboxylase (ALD) is an enzyme from the enzyme class EC 4.1.1.5.
  • the gene of the acetolactate decarboxylase originates from a bacterium of the genus Klebsiella (Raultella) or Bacillus.
  • the gene of Acetolactatdecarboxylase derived from a strain of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Bacillus polymyxa or Bacillus licheniformis and in particular from a strain of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola or Bacillus licheniformis.
  • These strains are all commercially available, e.g. at the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (Braunschweig).
  • the strain according to the invention thus makes it possible to increase the fermentative production of acetoin.
  • the invention not only enables the production of 2,3-butanediol but also the production of other metabolites which can be derived from acetoin, such as 2,3-butanediol. These metabolic products include diacetyl, ethanol and acetic acid.
  • a production strain according to the invention in a preferred embodiment is also characterized in that it was prepared from a starting strain as defined in the application and comprises an acetolactate decarboxylase in recombinant form.
  • the production strain according to the invention is preferably prepared by introducing a gene construct into one of the said starting strains.
  • the gene construct in its simplest form is defined as consisting of the acetolactate decarboxylase structural gene operatively linked to a promoter upstream.
  • the gene construct may also comprise a terminator downstream of the acetolactate decarboxylase structural gene.
  • Preferred is a strong promoter, which leads to a strong transcription.
  • Preferred among the strong promoters is the so-called "Tac promoter" which is familiar to the person skilled in the art from the molecular biology of E. coli.
  • the gene construct can be present in a manner known per se in the form of an autonomously replicating plasmid, it being possible for the copy number of the plasmid to vary.
  • a variety of plasmids are known to those skilled in the art, depending on their genetic
  • Structure in a given production strain can autonomously replicate.
  • the gene construct can also be integrated in the genome of the production strain, with each gene locus along the genome being suitable as an integration site.
  • the gene construct is introduced into the production strain in a manner known per se by genetic transformation.
  • Various methods of genetic transformation are known to the person skilled in the art (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. nol. (2010) 85: 1301-1313), including, for example, the
  • the gene construct contains, likewise in a known manner, a so-called selection marker for the selection of transformants with the desired gene construct.
  • selection markers are selected from so-called antibiotic resistance markers or from the auxotrophy complementing selection markers.
  • antibiotic resistance markers Preference is given to antibiotic resistance markers, more preferably those which confer resistance to antibiotics selected from ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol or zeocin.
  • a production strain according to the invention contains the gene construct, either in plasmid form or integrated into the genome, and produces an acetolactate decarboxylase enzyme in recombinant form.
  • the recombinant acetolactate decarboxylase enzyme is capable of producing acetoin with elimination of C0 2 from acetolactate.
  • the parent strain may be a non-optimized wild type strain.
  • the starting strain may have already been optimized beforehand, or it may be further optimized as a production strain producing acetolactate decarboxylase according to the invention.
  • the optimization of a production strain according to the invention which comprises acetolactate decarboxylase according to the invention can on the one hand be achieved by mutagenesis and selection of mutants with improved production properties.
  • the optimization can also be carried out by genetic engineering by additional expression of one or more genes which are suitable for improving the production properties. Examples of such genes are the already mentioned 2, 3-butanediol Biosynthetic genes acetolactate synthase and acetoin reductase.
  • genes can be expressed in a manner known per se as separate gene constructs or in combination as an expression unit (as a so-called operon) in the production strain. It is known, for example, that in Klebsiella terrigena all three biosynthesis genes of 2,3-butanediol (so-called BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. ⁇ 1993 ⁇ 175: 1392-1404), or in strains of the genus Bacillus genes of acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase are organized in an operon (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863-3875).
  • the production strain can be optimized by inactivating one or more genes whose gene products adversely affect the 2,3-butanediol production.
  • genes whose gene products are responsible for by-product formation include z. B. the lactate dehydrogenase (lactic acid formation), the acetaldehyde dehydrogenase (ethanol formation) or else the phosphotransacetylase, or the acetate kinase (acetate formation).
  • the invention comprises a process for the production of 2,3-butanediol with the aid of a production strain according to the invention.
  • the method is characterized in that cells of a production strain according to the invention which produces acetolactate decarboxylase are cultured in a growth medium.
  • biomass of the production strain and on the other hand the product 2,3-BDL are formed.
  • the formation of biomass and 2,3-BDL can be time correlated or temporally decoupled from each other.
  • the cultivation takes place in a manner familiar to the person skilled in the art. This can be done in shake flasks (laboratory scale) or by fermentation (production scale).
  • Seed media are familiar to those skilled in the practice of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source), and additives such as vitamins, salts, and trace elements that optimize cell growth and 2,3-BDL product formation.
  • C sources are those that can be used by the production strain for 2,3-BDL product formation. These include all forms of monosaccharides, including C6 ⁇ sugars such as. Glucoses, mannose or fructose, and C5 sugars, e.g. Xylose, arabinose, ribose or galactose.
  • the production process according to the invention also comprises all C sources in the form of disaccharides, in particular sucrose, lactose, maltose or cellobiose.
  • the production process of the invention further comprises all C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units such.
  • C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units such.
  • the hydrolysis of the higher C sources may precede the production process according to the invention or take place in situ during the production process according to the invention.
  • C sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or acetate salts derived therefrom), ethanol, glycerol, citric acid (and its salts), lactic acid (and salts thereof) or pyruvate (and its salts).
  • gaseous carbon sources such as carbon dioxide or carbon monoxide are also conceivable.
  • the C sources which are affected by the production process according to the invention comprise both the isolated pure substances or else, for the sake of economic efficiency, not further specified.
  • C sources can also be waste products from the digestion of vegetable raw materials, such as molasses (sugar beet) or bagasse (sugar cane).
  • Preferred C sources for the production of the production strains are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, arabinose and vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
  • a particularly preferred C source is glucose, either in isolated form or as part of a vegetable hydrolyzate.
  • N sources are those that can be used by the production strain for biomass production. These include ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 0H or else its salts such. As ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate. Furthermore, suitable N-source are the known nitrate salts such. B. KN0 3 , NaN0 3 , ammonium nitrate, Ca ⁇ N0 3 ) 2 , Mg (N0 3 ) 2 and other N sources such as urea.
  • the N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base.
  • the cultivation can take place in the so-called batch mode, wherein the culture medium is inoculated with a starter culture of the production strain and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources. Cultivation can also take place in the so-called fed-batch mode, with additional nutrient sources being fed in after an initial phase of growth in batch mode (feed) in order to compensate for their consumption.
  • the feed can consist of the C source, the N source, one or more important for the production of vitamins, or trace elements or a combination of the aforementioned.
  • the feed components can be used together as a mixture or else separately
  • Feed lines are added.
  • other media components as well as specific 2,3-BDL production enhancing additives may be added to the feed.
  • the feed can be fed continuously or in portions (batchwise) or else in a combination of continuous and discontinuous feed. Preference is given to the cultivation according to the fed-batch mode.
  • Preferred C sources in the feed are glucose, sucrose, molasses, or vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
  • N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NHOH and its salts aramonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, KN0 3 , NaN0 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids, corn steep liquor (Com Steep Liquor) as well as NZ-Amine and Yeast Nitrogen Base.
  • Particularly preferred N sources in the feed are ammonia, or ammonium salts, urea, yeast extract, soya peptone, malt extract or corn steep liquor (in liquid or in dried form).
  • the cultivation takes place under pH and temperature conditions which favor the growth and the 2,3-BDL production of the production strain.
  • the useful pH range is from pH 5 to pH 8.
  • Preferred is a pH range of pH 5.5 to pH 7.5.
  • Particularly preferred is a pH range of pH 6.0 to pH 7.
  • the preferred temperature range for the growth of the production strain is 20 ° C to 40 ° C.
  • Particularly preferred is the temperature range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the growth of the production strain can optionally take place without oxygen supply (anaerobic cultivation) or else with oxygen supply (aerobic cultivation) .
  • oxygen supply being ensured by introduction of compressed air or pure oxygen the aerobic cultivation by entry of compressed air.
  • the cultivation time for 2,3-BDL production is between 10 h and 200 h. Preferred is a cultivation period of 20 h to 120 h. Particularly preferred is a cultivation time of 30 h to 100 h.
  • Cultivation batches obtained by the method described above contain the 2,3-BDL product, preferably in the culture supernatant.
  • the 2,3-BDL product contained in the cultivation mixtures can either be used further directly without further work-up or else be isolated from the cultivation batch.
  • known process steps are available, including centrifugation, decantation, filtration, extraction, distillation or crystallization, or precipitation. These process steps can be combined in any desired form in order to isolate the 2,3-BDL product in the desired purity. The degree of purity to be achieved depends on the further use of the 2,3-BDL product.
  • FIG. 1 shows the 3.65 kb acetolactate decarboxylase epitope pBudAkt prepared in Example 1.
  • Figure 2 shows the 3.64 kb acetolactate decarboxylase epitope pALDbl prepared in Example 1.
  • Fig. 3 shows the plasmid pACYC184 used in Example 1.
  • FIG. 4 shows the 5.1 kb acetolactate decarboxylase expression vector pBudAkt-tet prepared in Example 1.
  • FIG. 5 shows the 5.1 kb acetolactate decarboxylase expansion vector pALDbl-tet prepared in Example 1.
  • the acetolactate decarboxylase genes were used. terrigena and B. licheniformis.
  • the DNA sequence of the acetolactate decarboxylase gene from K. terrigena is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number L04507, bp 179-958. It was obtained in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic K. terrigena DNA (strain DSM 2687, commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) with the primers BUD3 f and BUD4r as a DNA fragment of 0.78 kb size isolated.
  • licheniformis is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number NC_006270, under which the entire genome sequence of B. licheniformis is disclosed
  • the acetolactate decarboxylase gene is found there in a complementary form from bp 3674476-3675237 and was isolated in a PCR reaction ( Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic B. licheniformis DNA (strain DSM 13, commercially available from DSMZ GmbH) with the primers BLALD-lf and BLALD-2r as a DNA fragment of 0.76 kb size isolated.
  • the genomic DNA used for the PCR reactions was previously isolated in a manner known per se with a DNA isolation kit (Qi agen) from cells of the culture of K. terrigena DSM 2687 and B. licheniformis DSM 13 in LB medium (10 g / l). 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl).
  • the expression vector pKKj is a derivative of the expression vector pKK223-3.
  • the DNA sequence of pKK223-3 is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number M77749.1, and approximately 1.7 kb were removed from the 4.6 kb plasmid (bp 262).
  • the expression vectors pBudAkt and pALDbl were modified by incorporation of an expression cassette for the tetracycline resistance gene.
  • the tetracycline resistance gene was first isolated from the plasmid pACYC184 (FIG. 3).
  • the DNA sequence of pACYC184 is available in the "Genbank” gene database under accession number X06403.1.)
  • PCR Transcription DNA polymerase, Qiagen
  • Bgl II cleavage contained in the primers tetlf and tet2r
  • the tetracycline expression cassette was isolated as a 1.45 kb fragment from pACYC184 and then cloned into the pBudAkt and pALDbl vectors respectively cut with Bam HI, resulting in the respectively 6 kb expression vectors pBudAct- tet ( Figure 4) and pALDbl-
  • a clone was selected in each case, in which the Te tracyclin- and the Acetolactatdecarboxylase expression cassettes were oriented in each case in the same direction.
  • Primer tetlf (SEQ ID NO: 5) and tet2r (SEQ ID NO: 6) had the following DNA sequences:
  • E. coli plasmid DNA of the expression vectors pBudAkt-tet and pALDbl-tet was transformed into E. coli strain JM105 by methods known per se.
  • One clone each was selected and cultured in a shake flask culture. From the E. coli strains a preculture was prepared in LBtet medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl, 15 pg / ml tetracycline) (cultivation at 37 ° C and 120 rpm Night).
  • each preculture was inoculum of a main culture of 100 ml LBtet medium (300 ml Erlenmeyer flask) was used and the main cultures were shaken at 30 ° C. and 180 rpm until a cell density OD 600 of 2.0 was reached, then the inducer IPTG (isopropyl- ⁇ -thiogalactoside, 0.4 mM final concentration) was used. added and shaken overnight at 30 ° C and 180 rpm.
  • inducer IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactoside, 0.4 mM final concentration
  • acetolactate decarboxylase expression 50 ml of the E. coli cells were centrifuged ⁇ 10 min 15000 rpm, Sorvall centrifuge RC5C equipped with a SS34 rotor), the cell pellet in 2 ml of Pi buffer (0.1 M potassium phosphate, 0 , 1 M NaCl, pH 7.0), in a conventional manner with a so-called.
  • Pi buffer 0.1 M potassium phosphate, 0 , 1 M NaCl, pH 7.0
  • Acetolactatdecarboxylase activity was carried out in a conventional manner (US 4617273).
  • 1 U acetolactate decarboxylase activity is defined as the amount of enzyme which produces 1 ⁇ acetoin / min under test conditions.
  • Acetolactate diester mixed with 240 ⁇ H20 and 330 ⁇ IM NaOH and incubated on ice for 15 min. Subsequently, 5.4 ml H 2 O was added and the acetolactate substrate kept on ice for testing.
  • the amount of acetoin formed was determined from a standard curve previously prepared with acetoin.
  • the protein concentration of the cell extracts was determined in a manner known per se using the so-called “BioRad protein assay” from BioRad.
  • the control strain used was the untransformed wild-type strain Klebsiella terrigena DSM 2687. Transformants were isolated and tested for acetolactate decarboxylase activity by shake flask culture. For this purpose, in each case 50 ml of FM2tet medium (without tetracycline in the K. terrigena wild-type control strain) were inoculated with a transformant and incubated for 24 h at 30 ° C. and 140 rpm (Infors shaker).
  • FM2tet medium contained glucose 60 g / l; 10 g / l yeast extract (Oxoid) 2.5 g / 1; Ammonium sulfate 5 g / 1; NaCl 0.5 g / 1; FeS0 4 x 7 H 2 O 75 mg / l; Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / 1; CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O 14.7 mg / 1; MgS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / 1; H 2 PO 4 1.5 g / 1; Trace element mix 10 ml / 1 and tetracycline 15 mg / 1.
  • the pH of the FM2tet medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
  • the trace element mix had the composition H 3 B0 3 2.5 g / l; CoCl 2 x 6 H 2 O 0.7 g / 1; CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O 0.25 g / 1; MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 1.6 g / 1; ZnS0 4 x. 7 H 2 0 0.3 g / 1 and Na 2 Mo0 4 x 2 H 2 0 0.15 g / 1.
  • the cells were analyzed as described in Example 2 for E. coli. Klebsiella cells were digested with the " French® Press" and the cell extracts were analyzed for acetolactate decarboxylase activity
  • the specific acetolactate decarboxylase activity in crude extracts of the various strains is shown in Table 1.
  • Aeration supply of compressed air in vvm, volume of compressed air per volume of fermentation medium per minute
  • p0 2 oxygen partial pressure, to an initial value of 100% calibrated relative oxygen content
  • pH and fermentation temperature were controlled and recorded via a computer program provided by the fermentor manufacturer Medium (74% glucose, w / v) was entspr the glucose consumption is metered in via a peristaltic pump.
  • a vegetable based alkoxylated fatty acid ester commercially available under the name Struktol J673 from Schill & Seilacher (diluted 20-25% v / v in water) was used.
  • Strains used in the fermentation were the Klebsiella terrigena wild type strain (control strain from Example 3) and the acetolactate decarboxylase overproducing strains Klebsiella terrigena pBudAkt-tet and Klebsiella terrigena-pALDbl-tet (see Example 4).
  • Batch fermentation medium was FM2tet medium (see 3rd example, medium without tetracycline for the K. terrigena wild-type control strain).
  • the cell density OD600 as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm (Bio ad photometer SmartSpec TM 3000).
  • the glucose content was determined as described in Example 4.
  • the 2, 3-BDL content was determined by NMR as described in Example 4.
  • An inoculum of Klebsiella terrigena-pBudAkt-tet in LBtet medium ⁇ see Example 2) was prepared by mixing 2 x 100 ml of LBtet medium, depending ⁇ wells in a 1 1 Erlenmeyer flasks, each with 0.25 ml of a glycerol culture (overnight culture of the strain in LBtet medium, mixed with glycerol in a final concentration of 20% v / v and stored at -20 ° C) were inoculated.
  • the cultivation was carried out for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on an infus orbital shaker (cell density OD SO o / ml of 0.5 - 2.5). 100 ml of the preculture were used to inoculate 8 liters of fermentation medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium. Prefermenters: The fermentation was performed three fermenters the company Sartorius BBI Systems GmbH in two Biostat ® C-DCU. Fermentation medium was FM2tet (see 3rd example). The fermentation took place in the so-called batch mode. 2 x 8 1 F 2tet were inoculated with 100 ml of inoculum. Fermentation temperature was 30 ° C.
  • pH of the fermentation was 6.0 and was kept constant with the correction agents 25% NHOH, or 6 NH 3 P0 4 .
  • Aeration was carried out with compressed air at a constant flow rate of 1 vvm.
  • the oxygen partial pressure pO 2 was set at 50% saturation.
  • the regulation of the oxygen partial pressure was carried out via the stirring speed (stirrer speed 450-1,000 rpm).
  • Struktol J673 (20-25% v / v in water) was used.
  • the two pre-fermenters were used as inoculum for the main fermenter.
  • Main fermenter The fermentation was a Biostat ® in D 500 fermenter (working volume 330 1, boiler volume 500 1 ⁇ of the company Sartorius BBI Systems GmbH carried out the fermentation medium was FM2tet ⁇ see 3rd example.). The fermentation took place in the so-called fed-batch mode. 180 l of FM2tet were inoculated with 16 l of inoculum. Fermentation temperature was 30 ° C. pH of the fermentation was 6.0 and was kept constant with the correction agents 25% NH 4 OH, or 6 NH 3 P0 4 . The ventilation was carried out with compressed air at a constant flow rate of 1 vvm (see 4th example, based on the initial volume). The oxygen partial pressure pO 2 was set at 50% saturation.
  • the regulation of the oxygen partial pressure was carried out via the stirring speed ⁇ stirrer speed 200-500 rpm).
  • Struktol J673 (20-25% v / v in water) was used.
  • glucose consumption was reduced by off-line glucose

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Description

Verfahren zur fermentati en Herstellung von 2 , 3-Butandiol
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2, 3-Butandiol (2,3-BDL) mittels eines verbesserten 5 Mikroorganismenstammes, der eine 2 bis 12,8 fach erhöhte Aceto- lactatdecarboxylase Aktivität gegenüber dem nicht verbesserten Ausgangsstamm aufweist.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstell e lungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
15 Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2- Baustein) , Glycerin, 1, 3 -Propandiol , 1 , 2 -Propandiol (C3~
Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 1 , 4-Butandiol oder auch 2 , 3-Butandiol (C -Bausteine) . Diese chemischen Bausteine
20 sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kosten aktoren sind einerseits die
25 Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Dabei ist entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen das gewünschte Produkt in hoher Kon-
30 zentration und unter geringer Nebenproduktbildung aus dem biogenen Rohstoff herstellen. Die Optimierung der als Produktionsstämme bezeichneten Mikroorganismen in Bezug auf Produktivität und Wirtschaftlichkeit wird beispielsweise erreicht durch Metabolie Engineering.
35
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4 -Baustein ist 2,3- Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3- Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725). 2 , 3 -Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3- Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK) . Außerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2 -Bausteine) wie Essigsäure (DE 102010001399) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2 , 3-Butandiol sind auch C8 -Verbindungen denkbar, die Verwendung z.B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2 , 3-Butandiol ist bekannt (siehe Review von Celins- ka und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725) und führt vom zentralen Stoff echselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2 , 3-Butandiol :
Reaktion der Acetolactatsynthase : Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von C02.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase : Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2 , 3 -Butandioldehydrogenase) : NADH-abhängige Reduktion von Acetoin ζυ. 2 , 3 -Butandiol . Verschiedene natürliche Produzenten von 2 , 3 -Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacil- lus, Lactobacillus, Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z.B. Bäckerhefe}. Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheits- stufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwändige und teuere technische Sicherheitsmassnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2, 3-Butandiolproduzenten siehe Re- view von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725) . Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten. Für eine kosteneffiziente großtechnische 2,3-BDL Produktion sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe Sl bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen 2,3-BDL Ausbeuten beschrieben. Bekannte 2 , 3 -BDL-Produktions- Stämme aus der biologischen Sicherheitsstufe Sl sind Stämme der Arten Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Bacillus polymyxa o- der Bacillus licheniformis . In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol . Microbiol . (2001), 51: 925-932) werden infolge einer taxonomischen Umbenennung die Arten Klebsiella terrigena und Klebsiella planticola synonym auch als Raoultella terrigena und Raoultella planticola bezeichnet. Es handelt sich dabei um Stämme der gleichen Art.
Für diese in der Sicherheitsstufe Sl eingestuften Stämme wurden bisher 2 , 3 -Butandiolausbeuten von nicht mehr als 57 g/1 (637 mM, Produktionsdauer 60 h} berichtet (Nakashimada et al . , J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661-664). Diese Ausbeuten sind für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem zu gering. Als minimale Fermentationsausbeute für eine wirtschaft- liehe Produktion werden >80 g/1 2 , 3-Butandiol (Fermentationsdauer maximal 72 h) , bevorzugt >100 g/1 2 , 3 -Butandiol angesehen . Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe" und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z.B. in „Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratorie n, S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
Herausgeber: U.S. Dept . of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010) ; ISBN- 10: 0160850428.
Die heterologe Expression von Acetolactatdecarboxylase (ALD) Genen aus Klebsiella terrigena und Enterobacter aerogenes in Brauhefe ist in Blomqvist et al . , Ap l . Environ. Microbiol. (1991) 57: 2796 - 2803 beschrieben. Ziel dieser Untersuchungen war jedoch nicht die Produktion von 2 , 3-Butandiol, sondern die Reduzierung des beim Bierbrauen als geschmacksstörendes Nebenprodukt auftretenden Diacetyls. Diacetyl, in der Brauhefe aus Acetolactat als Nebenprodukt gebildet, wird während der Reifung des Bieres abgebaut und eine verstärkte ALD-Expression soll den intrazellulären Acetolactatspiegel reduzieren und die Bildung von Diacetyl verhindern, indem das Acetolactat direkt zu Aceto- in, der 2 , 3 -Butandiol Vorstufe decarboxyliert wird. In
Blomqvist et al . , Appl. Environ. Microbiol. (1991) 57: 2796 - 2803 wurde die ALD-Aktivität und das Produktspektrum ALD- überexpri-mierender Stämme ausführlich untersucht, darunter verschiedene Ester, Alkohole und Diketone. Während Acetolactat in rekombinanten ALD-Stämmen effizient zu Acetoin decarboxyliert wurde, findet sich jedoch kein Hinweis darauf, dass eine verstärkte ALD-Expression förderlich für die Produktion von 2 , 3 -Butandiol gewesen wäre.
Aufgabe der Erfindung war es, Produktionsstämme zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol bereitzustellen, die deutlich höhere 2,3- Butandiolausbeuten ermöglichen als der Ausgangs tamm.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm eine mindestens 2 bis 12,8-fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetolactatdecarboxylase Aktivität au weist .
In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten, aber zur 2,3- Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm oder einen bereits weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Bei einem bereits weiter optimierten Wildtypstamm (z.B. durch einen gentechnischen Eingriff erfolgt) ist jedoch nicht die Acetolactatdecarboxylase Aktivität von der Optimierung betroffen.
Unter einem Produktionsstamm im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein bezüglich der 2 , 3~Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der durch eine erhöhte Aktivität des Enzyms Acetolactatdecarboxylase (ALD) im Vergleich zum Ausgangsstamm gekennzeichnet ist. Vorzugsweise ist der Produktionsstamm aus dem Ausgangsstamm hergestellt. Wenn ein bereits optimierter Ausgangsstaram durch eine Erhöhung der Acetolactat- decarboxylase Aktivität nochmals verbessert werden soll, so ist es natürlich ebenso möglich zunächst in einem unverbesserten Stamm die Acetolactatdecarboxylase Aktivität zu erhöhen und anschließend weitere Verbesserungen einzubringen. Die Erhöhung der Acetolactatdecarboxylase Aktivität im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangestammes (z.B. eine die Promotoraktivität steigernde Mutation) , eine die Enzymaktivität steigernde Mutation im Acetolactatdecarboxylasegen oder durch über- expression eines homologen oder aber auch heterologen Aceto- lactatdecarboxylasegens im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist die Überexpression eines homologen oder eines heterologen Acetolactatdecarboxylasegens im Ausgangs tamm .
Bevorzugt ist die Acetolactatdecarboxylase Aktivität um den Faktor 2 bis 10 und besonders bevorzugt um den Faktor 2 bis 5 erhöht . Besonders bevorzugt wird diese erhöhte Acetolactatdecarboxylase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines homologen oder heterologen, für ein Acetolactat- decarboxylaseenzym kodierendes Gen erreicht.
Bei dem Ausgangsstamm kann es sich um einen beliebigen 2,3- Butandiol produ ierenden Stamm handeln. Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus (Paenibacillus) oder Lactobacillus .
Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola nochmals bevorzugt ist . Insbesondere bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe Sl und von diesen, darüber hinaus bevorzugt, Stämme der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola.
Nachdem in den aus Blomqvist et al . , Ap l . Environ. Microbiol . (1991) 57: 2796 - 2803 bekannten Acetolactatdecarboxylase- überexprimierenden Brauhefestämmen kein 2 , 3-Butandiol nachgewiesen werden konnte, ging der Fachmann davon aus, dass die Überexpression der Acetolactatdecarboxylase keine Verbesserung der 2 , 3-Butandiol Produktion in einem Produktionsstamm bewirken kann. Im Rahmen von Versuchen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurde überraschend gefunden, dass durch eine begrenzt erhöhte ALD Aktivität (2 bis 12,8 fach) in einem Produktions- stamm die Ausbeute an 2 , 3-Butandiol signifikant gesteigert werden kann. Vorzugsweise wird die erhöhte ALD Aktivität durch re- kombinante Überexpression einer Acetolactatdecarboxylase (EC 4.1.1.5) in einem Produktionsstamm erreicht. Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist eine Überexpression der Acetolactatdecarboxylase um den Faktor 2 bis 12,8 (siehe 3. Beispiel) dazu geeignet, die 2,3- Butandiolausbeute (bestimmt als Volumenausbeute 2 , 3 -Butandiol in g/1) in der Fermentation um mehr als 20 %, bevorzugt mehr als 30 % und insbesondere bevorzugt um mehr als 40 % zu steigern. Bei der Acetolactatdecarboxylase (ALD) handelt es sich um ein Enzym aus der Enzymklasse EC 4.1.1.5. Es kann sich um jedes genkodierte Enzym handeln, das nach Formel (II) durch Abspaltung von C02 die Synthese von Acetoin aus Acetolactat bewirkt. In einer bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetolactatdecarboxylase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Ra- oultella) oder Bacillus.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das Gen der Acetolactatdecarboxylase aus einem Stamm der Art Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Bacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis und insbesondere aus einem Stamm der Art Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola oder Bacillus licheniformis . Diese Stämme sind alle käuflich erhältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig) .
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht somit die Steigerung der fermentativen Produktion von Acetoin. Die Erfindung ermöglicht somit nicht nur die Produktion von 2 , 3 -Butandiol sondern auch die Produktion anderer StoffWechselprodukte , die sich wie 2,3- Butandiol von Acetoin ableiten lassen. Zu diesen StoffWechsel - Produkten gehören Diacetyl, Ethanol und Essigsäure. Ein erfindungsgemäßer Produktions tamm ist in einer bevorzugten Ausführungsform auch dadurch charakterisiert, dass er aus einem Ausgangsstamm, wie in der Anmeldung definiert, hergestellt wurde und eine Acetolactatdecarboxylase in rekombinanter Form pro- duziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion ausgedrückt in g/1 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 20 , bevorzugt 30 %, besonders bevorzugt 40 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2 , 3-Butandiol Ausbeute des Ausgangsstammes mindestens 80 g/1 beträgt.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstruktes in einen der ge- nannten Ausgangs tämme .
Das Genkonstrukt in seiner einfachsten Form ist definiert als bestehend aus dem Acetolactatdecarboxylase Strukturgen, dem operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenen- falls kann das Genkonstrukt auch einen Terminator umfassen, der dem Acetolactatdecarboxylase Strukturgen nachgeschaltet ist. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription führt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der sog. dem Fachmann aus der Molekularbiologie von E. coli geläu- fige „Tac-Promotor" .
Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom replizierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen
Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können.
Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstam- mes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist.
Das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder mit dem Ziel der genomischen Integration, wird in an sich bekannter Weise durch genetische Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotech- nol. (2010) 85: 1301 - 1313), darunter beispielsweise die
Elektroporation.
Zur Selektion transformierter Produktionsstamme enthält das Genkonstrukt , ebenfalls in bekannter Weise, einen sog. Selekti- onsmarker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus sog. Antibiotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie komplementierenden Selektionsmarkern .
Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Zeocin verleihen.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder in das Genom integriert und produziert ein Aceto- lactatdecarboxylase Enzym in rekombinanter Form. Das rekombi- nante Acetolactatdecarboxylase Enzym ist in der Lage, unter Abspaltung von C02 aus Acetolactat Acetoin zu produzieren. Nun wurde überraschend gefunden, dass durch geeignete rekombinante Überexpression des Acetolactatdecarboxylase Enzyms im Produktionsstamm die 2, 3-Butandiol Ausbeute gegenüber dem Ausgangsstamm in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Der Ausgangsstamm kann jedoch bereits vorher optimiert worden sein, bzw. als erfindungsgemäßer Aceto- lactatdecarboxylase produzierender Produktionsstamm weiter optimiert werden. Die von der Erfindung umfasste Optimierung eines erfindungsgemäßen Acetolactatdecarboxylase produzierenden Produktionsstammes kann einerseits durch Mutagenese und Selektion von Mutanten mit verbesserten Produktionseigenschaften er- folgen. Die Optimierung kann jedoch auch gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind die bereits genannten 2, 3 -Butandiol Biosynthesegene Acetolactatsynthase und Acetoinreduktase . Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Gen- konstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Klebsiella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2, 3-Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al . , J. Bacteriol . {1993} 175: 1392 - 1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al . , J. Bacteriol (1993) 175: 3863 - 3875).
Weiterhin kann der Produktionsstamm dadurch optimiert werden, dass ein oder mehrere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die 2 , 3 -Butandiol Produktion auswirken. Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactat- dehydrogenase (Milchsäurebildung) , die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung) oder aber auch die Phosphotransacetylase , bzw. die Acetatkinase (Acetatbildung) .
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von 2 , 3 -Butandiol mit Hilfe eines er indungsgemäßen Produktionsstammes . Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellen eines erfindungsgemäßen, Acetolactatdecarboxylase produzierenden Produktionsstammes in einem Anzuchtmedium kultiviert werden. Dabei wird einerseits Biomasse des ProduktionsStammes und andererseits das Produkt 2,3-BDL gebildet. Die Bildung von Biomasse und 2,3-BDL kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmaßstab) .
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen größer 10 1 besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen größer 300 1 insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobieilen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle) , einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die, das Zellwachstum und die 2,3-BDL Produktbildung optimiert werden. C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur 2,3-BDL Produktbildung genützt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6~ Zucker wie z. B. Glu~ cose, Mannose oder Fructose sowie C5-Zucker wie z.B. Xylose, Arabinose, Ribose oder Galactose. Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst jedoch auch alle C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose.
Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Malto- dextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C- Quellen dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens erfolgen.
Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze) , Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) , Milchsäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze) . Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmo- noxid denkbar.
Die vom erfindungsgemäßen Produktionsverfahren betroffenen C- Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufge- reinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydroly- sate durch chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören z, B.
Hydrolysate der Stärke (Monosaccharid Glucose) , der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose} , des Zuckerrohrs (Disaccharid Saccharose) , des Pektins (Monosaccharid Ga- lacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glucose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den ohlehydra- ten gehörende Lignin} . Weiterhin können als C-Quellen auch Abfallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z. B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr).
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstamme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Glucose, entweder in isolier- ter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehören Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH40H oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsul at, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KN03, NaN03, Ammoniumnitrat, Ca{N03)2, Mg(N03)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Amino- säuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base. Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtmedium mit einer Starterkultur des ProduktionsStammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt. Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed) , um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen
Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die 2,3-BDL Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose, Melasse, oder pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NHOH und dessen Salze Aramoniumsulfat , Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KN03, NaN03 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Com Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base . Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) .
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7. Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20 °C bis 40 °C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des ProduktionsStammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung} oder aber auch mit Sauerstof zuf hr (aerobe Kultivierung) . Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoff ersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das 2,3-BDL Produkt, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene 2,3-BDL Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des 2,3-BDL Produkts stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zent- rifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion, Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das 2,3-BDL Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung des 2,3-BDL Produkts.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des 2,3-BDL Pro- duktes sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden. Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide. Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,65 kb großen Acetolactatdecarboxylase Expessionsvektor pBudAkt .
Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,64 kb großen Acetolactatdecarboxylase Expessionsvektor pALDbl .
Fig. 3 zeigt das in Beispiel 1 genutzte Plasmid pACYC184.
Fig. 4 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5,1 kb großen Acetolactatdecarboxylase Expressionsvektor pBudAkt-tet.
Fig. 5 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5,1 kb großen Ace- tolactatdecarboxylase Expessionsvektor pALDbl-tet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert : 1. Beispiel:
Herstellung von Acetolactatdecarboxylase Expressionsvektoren
Verwendet wurden die Acetolactatdecarboxylase Gene aus . ter- rigena und B. licheniformis . Die DNS-Sequenz des Acetolactatde- carboxylasegens aus K. terrigena ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer L04507, bp 179 - 958. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase, Qiagen) aus genomischer K. terrigena DNA (Stamm DSM 2687, käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) mit den Primern BUD3 f und BUD4r als DNS- Fragment von 0,78 kb Größe isoliert.
Die DNS-Sequenz des Acetolactatdecarboxylase Gens aus B.
licheniformis ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer NC_006270, unter der die gesamte Genomsequenz von B. licheniformis offenbart ist. Das Acetolactatdecarboxylase Gen ist dort in komplementärer Form von bp 3674476 - 3675237 zu finden. Es wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase, Qiagen) aus genomischer B. licheniformis DNA (Stamm DSM 13, käuflich erhältlich bei der DSMZ GmbH) mit den Primern BLALD-lf und BLALD-2r als DNS-Fragment von 0,76 kb Größe isoliert. Die für die PCR-Reaktionen verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qi- agen) aus Zellen der Anzucht von K. terrigena DSM 2687 und B. licheniformis DSM 13 in LB-Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefe- extrakt, 5 g/1 NaCl) gewonnen worden.
Primer BUD3f (SEQ ID NO: 1} und BUD4r (SEQ ID NO: 2) hatten folgende DNS-Sequenzen: SEQ ID NO: 1:
5'-GAA TTC ATG AAT CAT TAT CCT GAA TGC ACC-3Y
SEQ ID NO: 2:
5'-AAG CTT AGT TTT CTA CCG CAC GAA TAG C-34
Primer BLALD-lf (SEQ ID NO: 3) und BLALD- 2r {SEQ ID NO: 4) hatten folgende DNS-Sequenzen :
SEQ ID NO : 3 :
5' -GAA TTC ATG AAA AGT GCA AGC AAA CAA AAA AT-3* SEQ ID NO: 4:
5'-AAG CTT TTA CTC GGG ATT GCC TTC GGC CG-3 Die PCR-Produkte wurden mit Eco RI (in Primer BUD3f und BLALD- lf enthalten) und Hind III (in Primer B0D4r und BLALD2r enthalten) , nachverdaut und in den Expressionsvektor p Kj kloniert. Dabei entstanden die jeweils 4,9 kb großen Acetolactatdecar- boxylase Expessionsvektoren pBudAkt (Fig. 1) und pALDbl (Fig. 2) .
Der Expressionsvektor pKKj ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugriffnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 -
1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequen ) , wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj entstand. Die Expressionsvektoren pBudAkt und pALDbl wurden durch Einbau einer Expressionskassette für das Tetracyclin Resistenzgen modifiziert. Dazu wurde das Tetracyclin Resistenzgen zuerst aus dem Plasmid pACYC184 (Fig. 3) isoliert. Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist zugänglich in der „Genbank" Gendatenbank unter der Zugangnummer X06403.1) . Durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern tetlf und tet2r und anschließendem Verdau mit Bgl II (Schnittstellen enthalten in den Primern tetlf und tet2r) wurde die Tetracyclin Expressionskassette als 1,45 kb Fragment aus pACYC184 isoliert und dann in die jeweils mit Bam HI geschnittenen Vektoren pBudAkt und pALDbl kloniert . Dadurch entstanden die jeweils 6 kb großen Expressionsvektoren pBudAkt- tet (Fig. 4) und pALDbl-tet (Fig. 5) . Wie in Fig. 4 und Fig. 5 dargestellt, wurde jeweils ein Klon ausgewählt, bei dem die Te- tracyclin- und die Acetolactatdecarboxylase Expressionskassetten jeweils in der gleichen Richtung orientiert waren.
Primer tetlf (SEQ ID NO: 5) und tet2r (SEQ ID NO: 6) hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO: 5:
5'-TCA TGA GAT CTC AGT GCA ATT TAT CTC TTC-3^ SEQ ID NO: 6:
5'~TCA TGA GAT CTG CCA AGG GTT GGT TTG CGC ATT C-3' 2. Beispiel:
Expressionsanalyse in E. coli Plasmid-DNS der Expressionsvektoren pBudAkt-tet und pALDbl-tet wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm JM105 transformiert. Als Kontrolle diente Ξ. coli JM105, transformiert mit dem Vektor pACYC184. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht kultiviert. Von den E. coli-Stämmen wurde in LBtet-Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 pg/ml Tetracyclin) eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht) . Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml LBtet Medium (300 ml Erlenmeyerkolben} verwendet. Die Hauptkulturen wurden bei 30°C und 180 rpm geschüttelt, bis eine Zelldichte OD600 von 2,0 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid, 0,4 mM Endkonzentration) zu- gegeben und über Nacht bei 30°C und 180 rpm geschüttelt.
Zur Analyse der Acetolactatdecarboxylase Expression wurden 50 ml der E. coli Zellen zentrif giert {10 min 15000 rpm, Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor) , das Zell- pellet in 2 ml Pi- Puffer (0,1 M Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog.
„French®Press" Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der Acetolactatdecarboxylase Aktivität verwendet. Während im Kontrollstamm keine Aktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische Aceto¬ lactatdecarboxylase Aktivität in Zellextrakten, abhängig vom jeweiligen Kon trukt, zwischen 5 und 20 U/mg Protein,
Spektralphotometrische Bestimmung der Acetolactatdecarboxylase Aktivität :
Die Bestimmung der Acetolactatdecarboxylase Aktivität wurde in an sich bekannter Weise (US 4617273) durchgeführt. Dabei ist 1 U Acetolactatdecarboxylase Aktivität definiert als die Enzymmenge, die 1 μτηοΐ Acetoin/min unter Testbedingungen produziert.
Eine geeignete Menge Enzymextrakt wurde zusammen mit Testpuffer (30 mM NaCitrat, pH 6,0) auf ein Volumen von 10 ml eingestellt, mit 0,4 ml Acetolactat Substrat gemischt und bei 25°C inkubiert. Das chemisch instabile Acetolactat Substrat war zuvor frisch aus der Ausgangsverbindung 2-Acetoxy-2-Methyl- Acetessigsäure-Ethylester ( "Acetolactatdiester" , SigmaAldrich) durch alkalische Verseifung hergestellt worden, indem 30 μΐ
Acetolactatdiester mit 240 μΐ H20 und 330 μΐ I M NaOH gemischt und 15 min auf Eis inkubiert wurden. Anschließend wurden 5,4 ml H20 zugegeben und das Acetolactat Substrat für die Tests auf Eis aufbewahrt.
Mach 0', 10', 30' und 60' Inkubationsdauer wurden jeweils 1 ml des Ansatzes in 0,2 ml 1 M NaOH pipettiert und auf Eis aufbewahrt, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurden die Proben (1,2 ml Volumen} mit 0,2 ml 0,5 % Creatin und 0,2 ml 5 % alpha-Naphtol in 2,5 M NaOH gemischt und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Extinktion bei 524 nm bestimmt. Dabei erfolgte der Nullabgleich des Photometers durch einen Testansatz nur mit Puffer, ohne Enzym.
Die Menge des gebildeten Acetoins wurde aus einer zuvor mit Acetoin erstellten Standardkurve ermittelt.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt. 3. Beispiel:
Expression von Acetolactatdecarboxylase in Klebsiella terrigena
Ausgangsstamm war Klebsiella terrigena DSM 2687 (käuflich erhältlich bei der DSMZ GmbH) . Die Transformation mit den Plasmi- den pBudAkt-tet und pALDbl-tet erfolgte in an sich bekannter
Weise analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E . coli. Als Kontrollstamm wurde der nicht transformierte Wildtyp Stamm Klebsiella terrigena DSM 2687 verwendet. Trans formanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf Acetolactatdecarboxylase Aktivität getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2tet-Medium (ohne Tetracyclin beim K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm) mit einer Transformante beimpft und 24 h bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.
FM2tet Medium enthielt Glucose 60 g/1; 10 g/1 Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/1; Ammoniumsulfat 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS04 x 7 H20 75 mg/1; Na3Citrat x 2 H20 1 g/1; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1; MgS04 x 7 H20 0,3 g/1; H2P04 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1 und Tetracyclin 15 mg/1. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt, Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3B03 2,5 g/1; CoCl2 x 6 H20 0,7 g/1; CuS04 x 5 H20 0,25 g/1; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/1; ZnS04 x. 7 H20 0,3 g/1 und Na2Mo04 x 2 H20 0,15 g/1.
Die Zellen wurden, wie im 2. Beispiel für E. coli beschrieben, analysiert. Klebsiella Zellen wurden mit der „French®Press" aufgeschlossen und die Zellextrakte auf Acetolactatdecarboxyla- se Aktivität untersucht. Die spezifische Acetolactatdecar- boxylase Aktivität in Rohextrakten der verschiedenen Stämme (bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben) ist in Tabelle 1 auf- geführt.
Tabelle 1: Vergleich der Acetolactatdecarboxylase Aktivität in rekombinanten K. terrigena Stämmen
4. Beispiel:
2 , 3 -BDL-Produktion durch Schüttelkolbenanzucht rekombinanter K. terrigena Stämme Die Kultivierung der mit den Plasmiden pBudAkt-tet und pALDbl- tet transformierten K. terrigena Stämme erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Die Kultivierungsdauer betrug jedoch 96 h. Dabei wurde die Glucosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Glucoseanalysator 7100MBS der Fa. YSI) und Glucose bei Bedarf aus einer 40 % (w/v) Stocklösung nachgefüttert. In Ab- ständen von 48 h wurden Proben auf ihren 2,3-BDL Gehalt untersucht. Das Ergebnis der 2,3-BDL Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt , Tabelle 2: BDL-Produktion in Klebsiella terrigena Transforman- ten
Wie in Tabelle 2 dargestellt, resultierte die Überexpression der Acetolactatdecarboxylase Gene aus K. terrigena, bzw. B. licheniformis in Klebsiella terrigena in einer Steigerung der 2,3-BDL Produktion in der Schüttelkolbenanzucht um 12 - 32 %. Die Steigerung der 2 , 3 -Butandiolproduktion wird offensichtlich durch Überexpression der Acetolactatdecarboxylase bewirkt.
Die Bestimmung des 2 , 3 -Butandiolgehalts in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch 1H-NMR. Dazu wurde ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge} und 0 , 1 ml des KulturüberStandes mit 0 , 6 ml TSP (3 - (Trimethylsilyl) ropionsäure-2 , 2 , 3 , 3 -d4 Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/1) in D20 gemischt. Die 1H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker . Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert :
TSP: 0,140 - - 0,145 ppm (9H)
2 , 3-Butandiol : 1,155 - - 1,110 ppm ( 6H )
Ethanol : 1,205 - - 1,157 ppm (3H)
Essigsäure : 2,000 - - 1,965 PP (3H)
Acetoin: 2, 38 - 2,200 PP™ (3H) 5. Beispiel:
2,3-BDL Produktion mit Acetolactatdecarboxylase überexprimie- renden K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation Verwendet wurden „Labfors II" Fermenter der Fa. Infors . Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 1 (3 1 Fermentervolumen) . Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des pQ2 und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlö- sung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm) , Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute) , p02 (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 % kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt) , pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenter- hersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (74 % Glucose , w/v) wurde entsprechend dem Glucoseverbrauch über eine peristaltxsche Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20-25 % v/v in Wasser verdünnt), verwendet. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren der Klebsiella terrigena Wildtyp Stamm (Kontrollstamm aus dem 3. Beispiel) und die Acetolactatdecarboxylase überproduzierenden Stämme Klebsiella terrigena-pBudAkt-tet und Klebsiella terrigena-pALDbl-tet (siehe 4. Beispiel). Batch-Fermentationsmedium war FM2tet Medi- um (siehe 3. Beispiel, Medium ohne Tetracyclin für den K. terrigena Wildtyp Kontrollstamm} .
1,35 1 des Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüt- telkolbenanzucht in Batch-Fermentationsmedium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,0. In regelmäßigen Abständen wurden dem Permenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD600 als Maß der gebildeten Biomasse wurde pho- tometrisch bei 600 nm bestimmt (Bio ad Photometer SmartSpec™ 3000} .
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer DreifachbeStimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucosegehalt wurde bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben.
Der 2 , 3-BDL-Gehalt wurde durch NMR bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 74 % (w/v) Glucoselösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt. Tabelle 3 zeigt die zeitabhängige 2 , 3 -BDL-Bildung im K. terri™ gena Kontrollstamm und in den Acetolactatdecarboxylase überproduzierenden, rekombinanten Klebsiella terrigena Stämmen.
Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (4. Beispiel} , führt die Überexpression der Acetolactatdecarboxylase mit den Expressionsplasmiden pBudAkt-tet und pALDbl-tet zu einer signifikanten Steigerung der 2 , 3 -Butandiolproduktion um 20 % (heterologes ALD-Gen) - 30 % (homologes ALD-Gen) , bezogen auf die Maximalausbeute bei 72 h Fermentationsdauer. Die Pro- duktionsverläufe sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 Produktion von 2,3-BDL in K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation
6. Beispiel:
2, 3 -BDL Fermentation im 330 1 Maßstab Fermentiert wurde der Stamm Klebsiella terrigena-pBudAkt- tet (siehe 4. und 5. Beispiel) .
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter : Ein Inokulum von Klebsiella terrigena-pBudAkt-tet in LBtet Medium {siehe 2. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet Medium, je¬ weils in einem 1 1 Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte ODSOo/ml von 0,5 - 2,5) . 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium. Vorfermenter : Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus. 2 x 8 1 F 2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NHOH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstan- ten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoff- partialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD60o/^l vo 30 - 40} wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet .
Hauptfermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1} der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet {siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus. 180 1 FM2tet wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentations- temperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (siehe 4. Beispiel, bezogen auf das An fangsvolumen) . Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50 % Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit {Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 {20-25 % v/v in Wasser) verwe d t. Im Verlauf der Fermen- tation wurde der Glucoseverbrauch durch off-line Glucose-
Messung mit einem Glucose-Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 4. Beispiel) . Sobald die Glukosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug {8 - 10 h nach Inokulation) , wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feedlösung gestar- tet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glukosekonzentration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 1. Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 5. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 4 dargestellt. Die mit dem erfindungsgemäßen Stamm Klebsiella terri- gena-pBudAkt-tet erzielte Ausbeute von 126 g/1 2 , 3 -Butandiol war unerwartet hoch und war ca. 40 % höher als die mit einem Klebsiella terrigena Wildtypstamm üblicherweise erzielte Ausbeute von ca. 90 g/1 (siehe 5. Beispiel) . Tabelle 4
Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 1 Maßstab

Claims

Patentansprüche :
1. Produktionsstamm zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol herstellbar aus einem Ausgangsstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm eine 2 bis 12,8 fach über dem Ausgangsstamm liegende Acetolactatdecarboxylase Aktivität aufweist .
2. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er eine um den Faktor 2 bis 10, besonders bevorzugt um den Faktor 2 bis 5 erhöhte Acetolactatdecarboxylase Aktivität aufweist.
3. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetolactatdecarboxylase Aktivität durch eine gegenüber dem Ausgangsstamm erhöhte Expression eines für das Acetolactatdecarboxylaseenzym kodierenden Gens erreicht wird.
4. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm der Gattung Klebsiella (Raoultella) , Bacillus (Paenibacillus) oder Lactobacillus handelt, wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis bevorzugt ist und ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola besonders bevorzugt ist und es sich insbesondere bevorzugt um einen Stamm der Sicherheitsstufe Sl handelt .
5. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass das Gen der Acetolactatdecarboxylase aus einem Bakterium der Gattung Klebsiella (Raoultella) oder Bacillus stammt.
6. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem nicht gentech- nisch optimierten Ausgangsstamm hergestellt wurde und eine Acetolactatdecarboxylase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion, ausgedrückt in g/1 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 20 %, bevorzugt 30 %, besonders bevorzugt 40 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2,3- Butandiol Ausbeute des AusgangsStammes mindestens 80 g/1 beträgt .
7. Verfahren zur Herstellung von 2 , 3-Butandiol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird. 8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C und anaerob oder aerob mit einer Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kul- t vierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion zwischen 10 h und
200 h vorliegt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen größer als 300 1 erfolgt.
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