DE102013223176A1

DE102013223176A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme

Info

Publication number: DE102013223176A1
Application number: DE102013223176.8A
Authority: DE
Inventors: Rupert Pfaller
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-05-21

Abstract

Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen werden mittels eines Mikrorganismenstammes der Art Raoultella terrigena enthaltend eine durch ein pflB Gen kodierte Pyruvat-Formiatlyase dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, der Zucker Xylose ist und die Pyruvat-Formiatlyase in einer nicht funktionsfähigen, enzymatisch inaktiven Form vorliegt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine oder auch Plattformchemikalien genannt) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein), Glycerin, 1,3-Propandiol, 1,2-Propandiol, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure (C3-Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4-Butandiol, Acetoin, Diacetyl oder auch 2,3-Butandiol (C4-Bausteine). Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Für die Wirtschaftlichkeit dieser fermentativen Verfahren ist dabei entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen die billigsten verfügbaren Rohstoffe effizient in das gewünschte Produkt umsetzen können.
2,3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3-Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK). Ausserdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure ( US2012288908 AA ) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2,3-Butandiol sind auch C8-Verbindungen denkbar, die Verwendung z. B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2,3-Butandiol ist bekannt (siehe z. B. Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2,3-Butandiol: Reaktion der Acetolactatsynthase: Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von CO₂.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase: Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2,3-Butandioldehydrogenase): NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2,3-Butandiol.
Die meisten bakteriellen Produzenten von 2,3-Butandiol sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwendige und kostenintensive technische Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe” und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z. B. in „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), Herausgeber: U.S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN-10: 0160850428.
Für eine kosteneffiziente großtechnische Produktion von C4-Produkten sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen Produktausbeuten beschrieben. Bekannte 2,3-Butandiol Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 sind Stämme der Arten Raoultella terrigena, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Paenibacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis.
In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden verschiedene, ursprünglich der Gattung Klebsiella zugeordnete Bakterienspezies genetisch analysiert. Aufgrund der gefundenen Heterogenität (siehe in Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden Stämme der ursprünglich Klebsiella terrigena benannten Art taxonomisch neu eingeordnet und innerhalb der neu geschaffenen Gattung Raoultella in die Art Raoultella terrigena umbenannt. Bakterienstämme der Arten Klebsiella terrigena und Raoultella terrigena bezeichnen somit Stämme der gleichen Art, sind aber verschieden von anderen Stämmen der Gattung Klebsiella.
Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol, die hauptsächlich auf der Verwendung von Glucose als Fermentationsrohstoff (C-Quelle) beruhen (siehe z. B. WO 12104234 A1 ). Glucose ist eines der Basisprodukte in der Nahrungsmittelindustrie und wird mittlerweile auch im großen Stil zur Bioethanol Herstellung eingesetzt.
Großtechnische, auf Glucose als Fermentationsrohstoff beruhende Fermentationsverfahren stellen eine unerwünschte Konkurrenz zu dessen Verwendung als Nahrungsmittel dar und führen aufgrund der steigenden Nachfrage zu einer stetigen Verteuerung des Rohstoffs Glucose. Da der Fermentationsrohstoff einer der kostenbestimmenden Faktoren bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien ist, wird verstärkt nach Alternativen gesucht. Neben den wirtschaftlichen gibt es jedoch auch gewichtige sozialpolitisch motivierte Gründe für die Suche nach alternativen Fermentationsrohstoffen. Die eigentlich für Nahrungsmittelzwecke bestimmte Glucose ist somit nicht der bevorzugte Fermentationsrohstoff, um 2,3-Butandiol und auch andere C4- und C2-Plattformchemikalien wie Acetoin, Ethanol und Essigsäure wirtschaftlich, d. h. konkurrenzfähig zur Produktion aus petrochemischen Rohstoffen, herzustellen.
Als alternativem Fermentationsrohstoff fällt lignozellulosehaltiger Biomasse eine zentrale Bedeutung zu. Sie fällt in der Land- oder Forstwirtschaft als Stroh, Bagasse oder als Abfall der Holzverarbeitung in großen Mengen ohne entsprechende Verwertungsmöglichkeiten an. Entsprechend gibt es große Anstrengungen, wertsteigernde Verwendungsmöglichkeiten für Bestandteile der Lignozellulose zu finden.
Lignozellulosehaltige Biomasse besteht aus den drei Hauptkomponenten Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Für Fermentationszwecke werthaltige Bestandteile sind die in der Cellulose enthaltene Glucose sowie die Zuckerbestandteile der Hemicellulose, v. a. Pentosen wie Xylose und Arbinose.
Verschiedene Verfahren der Extraktion von Zuckern aus Lignozellulose sind dem Fachmann bekannt, darunter solche, die auf hydrothermal, thermisch bei saurem oder alkalischem pH oder enzymatisch mit Cellulasen und Xylanasen durchgeführter Hydrolyse der Lignozellulose beruhen (Blanch et al., Biotechnol. J. (2011) 6: 1086–1102; Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291). Dabei ist auch die beliebige Kombination verschiedener der vorgenannten Verfahren bekannt, immer mit dem Ziel, fermentierbare Zucker mit höchster Ausbeute auf kostengünstigste Weise aus der Lignozellulose zu gewinnen.
Die in Lignozellulose enthaltenen Zucker, darunter bevorzugt Glucose und Xylose, stellen somit einen attraktiven Fermentationsrohstoff bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien dar, besonders bei der fermentativen Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol oder Acetoin und hier insbesondere bei der Verwendung des fermentativ hergestellten 2,3-Butandiols oder Acetoins zur Gewinnung von Essigsäure durch Gasphasenoxidation. Es sind nur wenige Beispiele 2,3-Butandiol produzierender Mikroorganismen bekannt, bei denen neben Glucose auch Xylose als Fermentationsrohstoff untersucht wurde. Für ein wirtschaftliches Verfahren ist es jedoch erforderlich, dass beide aus Lignozellulose gewonnene Zucker effizient als Fermentationsrohstoff eingesetzt werden können.
Auf Basis der Stöchiometrie der biochemischen Stoffwechselwege, Glykolyse im Falle von Glucose, Pentosphosphatweg im Falle von Xylose, beträgt die maximal erzielbare Ausbeute jeweils 0,5 g 2,3-Butandiol je g Glucose, bzw. Xylose (Jansen et al., Biotechnol. Bioeng. (1984) 26: 362–369). Unabhängig vom Fermentationszucker sollte die 2,3-Butandiol Ausbeute somit vergleichbar sein. Dies scheint jedoch nicht der Fall zu sein. Für Klebsiella pneumoniae, einem Mikroorganismus der biologischen Sicherheitsstufe S2, wurde die fermentative Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin aus den C-Quellen Xylose und Glucose verglichen (Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Die dabei erzielten C4-Produkt-Ausbeuten betrugen 88 g/l für Xylose als C-Quelle und 112 g/l für Glucose als C-Quelle. Dabei war die Fermentationsdauer zur Erlangung der maximalen C4-Produkt-Ausbeute mit 6–8 Tagen ungewöhnlich lange, entsprechend einer vor allem für Xylose vergleichsweise niedrigen Raum-Zeitausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin von ca. 0,6 gl^–1h^–1 (siehe 3 und 4 in Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Auch für Raoultella terrigena wurden unter optimierten Bedingungen ( DE 10 2013 205 986 , DE 10 2013 204 728 , DE 10 2013 216 658 ) mit Xylose niedrigere 2,3-Butandiol Ausbeuten erzielt als mit Glucose. Offensichtlich führt die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentosephosphatweg nicht so effizient zu den C4-Produkten Acetoin und 2,3-Butandiol wie die Verstoffwechslung von Glucose über die Glykolyse.
WO 2010/037114 beschreibt die 2,3-Butandiol Produktion in rekombinanten Stämmen des Milchsäurebakteriums Lactobacillus plantarum unter anaeroben Bedingungen. Die 2,3-Butandiol produzierenden L. plantarum Stämme weisen keine Lactatdehydrogenase Aktivität auf und enthalten ein Gen kodierend für ein heterologes Polipeptid mit Butandioldehydrogenase Aktivität. Als C-Quelle wird Glucose verwendet. Der Wildtypstamm von L. plantarum produziert unter diesen Bedingungen fast ausschließlich Milchsäure (Lactat) und nur Spuren anderer Produkte wie Acetoin oder Ameisensäure (Formiat). 2,3-Butandiol wird nicht produziert. Eine Doppelmutante, in der zwei Gene der Lactatdehydrogenase (LDH) inaktiviert worden waren, führte zur Produktion von Acetoin und, für eine anaerobe Standkultur, signifikante Mengen Formiat (31 mM, entspricht 1,4 g/l). D. h., das unerwünschte Nebenprodukt Formiat wurde im Zuge der Stammoptimierung neu gebildet. Es wurde dabei jedoch kein 2,3-Butandiol gebildet. Es war die rekombinante Expression einer heterologen 2,3-Butandioldehydrogenase (Acetoinreduktase) erforderlich, um das Acetoin der LDH-Mutanten in 2,3-Butandiol umzuwandeln. Dabei wurde unter anderem immer noch Formiat als Nebenprodukt gebildet, im Gegensatz zum Wildtypstamm unter Bedingungen der Lactatproduktion.
Wie in 2 und 3 von WO 2010/037114 gezeigt, wurde die Formiatproduktion erst durch die Maßnahmen der Stammoptimierung induziert und es bedurfte eines weiteren Optimierungsschrittes, nämlich der Inaktivierung des Gens der Pyruvat-Formiatlyase (pflB2), zur Unterdrückung der Nebenproduktbildung. Wie in Beispiel 9 von WO 2010/037114 offenbart, wurde im Zuge der Inaktivierung des pfl-Gens das heterologe Gen der Acetolactatsynthase aus B. subitilis, entsprechend Gleichung (I) des Gens für den ersten Schritt der 2,3-Butandiol Biosynthese, neu in L. plantarum eingefügt. Da L. plantarum bereits über ein homologes Gen für die Acetolactatsynthase verfügt, wurde das heterologe Acetolactatsynthase Gen vermutlich eingeführt um die 2,3-Butandiol Produktion weiter zu stärken. Der positive Effekt der Überexpression von Acetolactatsynthase auf die 2,3-Butandiolproduktion ist auch aus DE 10 2011 003 394 bekannt.
Durch die beiden Maßnahmen, Inaktivierung des pfl-Gens und zusätzliche Expression des Acetolactatsynthase Gens aus B. subtilis, wurde geringfügig mehr 2,3-Butandiol gebildet (92 mM 2,3-Butandiol gegenüber 82 mM im Ausgangsstamm, entsprechend einer Ausbeute von 8,3 g/l gegenüber 7,4 g/l). Da die Ausbeutesteigerung durch zwei gleichzeitig eingeführte genetische Veränderungen bewirkt wurde, nämlich der Inaktivierung des pfl-Gens und Überexpression des Acetolactatsynthase Gens, ist es für den Fachmann nicht erkennbar, dass eine alleinige Inaktivierung des pfl-Gens die 2,3-Butandiolproduktion verbessert, insbesondere weil die zweite Maßnahme, Überexpression der Acetolactatsynthase, für sich genommen bereits zur Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion führt ( DE 10 2011 003 394 ). Darüber hinaus sind die Ausbeutesteigerung und eine 2,3-Butandiol Produktion von 7 bis 8 g/l in optimierten Stämmen viel zu gering, um für eine technische Anwendung geeignet zu sein.
Die vielfältigen in WO 2010/037114 beschriebenen Maßnahmen, um das Milchsäurebakterium L. plantarum von einem Lactat produzierenden zu einem 2,3-Butandiol produzierenden Mikroorganismus umzuwandeln, offenbart einen Stand der Technik, bei dem der Fachmann bei einfacher Inaktivierung des pflB-Gens keine signifikante Ausbeuteerhöhung der 2,3-Butandiol Ausbeute erwarten würde, vor allem deshalb, weil der L. plantarum Wildtypstamm überhaupt kein 2,3-Butandiol produziert ( WO 2010/037114 , 2).
Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066, offenbaren ein Klebsiella oxytoca Stamm, in dem ähnlich wie in WO 2010/037114 wegen der hohen Lactat- und auch Formiat Nebenproduktbildung (siehe Tabelle 1 in Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066) sowohl das LDH-Gen wie das pflB-Gen inaktiviert worden waren. Der Wildtypstamm produzierte dabei 3,88 g/l Formiat, die LDH-Mutante 8,01 g/l.
Unter Verwendung von Glucose als C-Quelle der Fermentation führte also wiederum die Inaktivierung des LDH-Gens zur Erhöhung des Formiat Nebenproduktes, die durch Einführung einer zweiten Mutation des pfl-Gens unterdrückt werden konnte (siehe Tabelle 1 in Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066). Dabei wurde auch eine Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion beobachtet, jedoch auch eine starke Verringerung der 2,3-Butandiol Produktivität von 1,07 g/lh in der LDH-Mutante auf nur noch die Hälfte von 0,51 gl^–1h^–1. Für den Fachmann bedeutet dies, dass die um ca. 25% verbesserte 2,3-Butandiolausbeute durch eine drastisch verringerte Raum-Zeitausbeute erkauft wurde, was sich negativ auf die Wirtschaftlichkeit des Prozesses auswirkt.
Durch Optimierung des Fermentationsverfahrens wurde schließlich eine Raum-Zeitausbeute für 2,3-Butandiol von 2,1 gl^–1h^–1 (Volumenproduktion 113 g/l) erreicht. Inwieweit die Inaktivierung des pflB-Gens in der Fermentation für die 2,3-Butandiol Produktion eine Verbesserung gegenüber dem Ausgangsstamm bedeutet, wurde nicht offenbart. Ebenso wurde nicht offenbart, ob sich diese Maßnahmen zur Stammverbesserung auf ein Verfahren mit Xylose als C-Quelle der Fermentation übertragen lassen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Glucose und Xylose über verschiedene Stoffwechselwege verwertet werden, Glucose in der Glykolyse, Xylose über den Pentose Phosphatweg. Daher lässt sich eine für die C-Quelle Glucose erarbeitete Verbesserung nicht offensichtlich auf die C-Quelle Xylose übertragen.
Feldmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1989) 31: 152–157 untersuchen die Verwertung von Xylose in einer pfl-Mutante von Klebsiella planticola, einem mit R. terrigena eng verwandten gram-negativen Bakterium (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001) 51: 925–932), unter anaeroben Bedingungen. Während der Wildtypstamm unter diesen Bedingungen noch 2,3-Butandiol produziert (siehe Tabelle 2 in Feldmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1989) 31: 152–157), kann in der pfl-Mutante kein 2,3-Butandiol mehr nachgewiesen werden. Dieser Befund für die C-Quelle Xylose steht im Gegensatz zur in den Beispielen offenbarten vorliegenden Erfindung eines aeroben Verfahrens sowie zu WO 2010/037114 und Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066, wo mit Glucose als C-Quelle in einer mehrstufigen Stammoptimierung, darunter auch der Inaktivierung des pfl-Gens, eine Steigerung der 2,3-Butandiol Produktion beobachtet wurde. Für den Fachmann bedeutet dies, dass die Lehre aus WO 2010/037114 und Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066 nicht als allgemein gültig betrachtet werden kann und eine Inaktivierung des pfl-Gens vor allem bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle eines Fermentationsverfahrens nicht zu einer Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion führt.
Insgesamt offenbaren WO 2010/037114 und Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066) Stämme mit inaktiviertem pfl-Gen, die für die 2,3-Butandiol Produktion mit der C-Quelle Glucose unter entweder anaeroben oder aeroben Bedingungen eingesetzt wurden. In beiden Fällen wurden neben dem pfl-Gen auch mindestens ein LDH-Gen inaktiviert. Beide Maßnahmen, Inaktivierung sowohl des LDH- wie des pfl-Gens waren erforderlich, weil das Produktspektrum der Ausgangsstämme jeweils einen hohen Anteil an Lactat enthielt und die Inaktivierung des LDH-Gens jeweils zu einer erhöhten Bildung des Formiat Nebenprodukts führte. Zur Unterdrückung des Formiat Nebenprodukts musste daher das pfl-Gen inaktiviert werden. Für den Fachmann ergibt sich daraus, dass die alleinige Inaktivierung des pfl-Gens im Wildtypstamm keinen signifikanten Einfluss auf die 2,3-Butandiol Produktion hat. In beiden Fällen war Lactat das Hauptprodukt der Fermentation.
Die Lehre aus WO 2010/037114 und Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066) offenbart dem Fachmann, dass es unter Bedingungen einer hohen Lactatproduktion von Vorteil ist, gleichzeitig die Gene für die Lactatproduktion (LDH) und für die Formiatproduktion (PFL) zu inaktivieren, um den Verlauf des Stoffwechsels von Glucose in Richtung 2,3-Butandiol zu lenken. Wie weiterhin in Feldmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1989) 31: 152–157 offenbart, kann die Lehre aus WO 2010/037114 und Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2013) 40: 1057–1066) nicht auf die C-Quelle Xylose angewendet werden. Dort wurde in der pfl-Mutante unter anaeroben Bedingungen und der C-Quelle Xylose kein 2,3-Butandiol mehr nachgewiesen. Nach dem Stand der Technik war also nicht zu erwarten, durch Inaktivierung der Pyruvat-Formiatlyase in einem aeroben fermentativen Verfahren mit Xylose als C-Quelle die 2,3-Butandiolausbeute zu verbessern.
Aufgabe der Erfindung ist es ein fermentatives Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches eine erhöhte Effizienz bei der Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen werden, aufweist.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass in der Fermentation als Produktionsstamm ein Mikroorganismenstamm der Art Raoultella terrigena verwendet wird, enthaltend eine durch ein pflB Gen kodierte Pyruvat-Formiatlyase dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, der Zucker, der aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen wurde, Xylose ist und die Pyruvat-Formiatlyase in einer nicht funktionsfähigen, enzymatisch inaktiven Form vorliegt.
Bevorzugt ist die Xylose aus der in der Biomasse enthaltenen Hemicellulose gewonnen.
Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3-Butandiol.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine verbesserte fermentative Verstoffwechslung von Xylose zu C4-Produkten, darunter bevorzugt zu 2,3-Butandiol. Die Ausbeute an C4-Produkten beträgt im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mindestens 100 g/l, besonders bevorzugt mindestens 120 g/l.
Der Mikroorganismenstamm der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, enthält das Pyruvat Formiatlyase Enzym in inaktiver Form. Dabei kann die Inaktivierung genetisch bedingt sein durch die Inaktivierung des für die Pyruvat Formiatlyase kodierenden Gens pflB oder aber biochemisch durch Abwesenheit eines für die Aktivierung des pflB Genprodukts erforderlichen Faktors. Solche Faktoren sind z. B. das Genprodukt des pflA Gens, genannt Pyruvat-Formiatlyase-aktivierendes Enzym (PFL-Aktivase) oder aber auch der für die Aktivierung erforderliche Cofaktor S-Adenosylmethionin.
Bevorzugt ist eine genetisch bedingte Inaktivierung, besonders bevorzugt durch die Inaktivierung des für die Pyruvat Formiatlyase kodierenden Gens pflB.
Das pflB Gen kodiert für das Enzym Pyruvat-Formiatlyase (EC 2.3.1.54, auch bezeichnet als Formiat-Acetyltransferase). Pyruvat-Formiatlyase katalysiert die Spaltung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und Ameisensäure (Formiat) nach der Gleichung (IV): Pyruvat + CoA → Acetyl-CoA + Formiat (IV)
Es handelt sich um jedes Gen, welches für ein Enzym kodiert, das entsprechend der Gleichung (IV) Pyruvat zu Acetyl-CoA und Formiat umwandelt. Die Bestimmung der Pyruvat-Formiatlyase Aktivität in einem enzymatischen Test ist beispielsweise beschrieben in Knappe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1332–1335.
Im Mikroorganismenstamm der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, ist das pflB Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass es nicht mehr für ein Protein mit einer Pyruvat-Formiatlyase Enzymaktivität kodiert.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das pflB Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das pflB Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das pflB Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1, bp 1 bis 2283, offenbart, kodierend für ein Protein mit Pyruvat-Formiatlyase Aktivität, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 offenbart.
Es ist bekannt, dass die Pyruvat-Formiatlyase ein aktivierendes Enzym (sog. PFL-Aktivase) benötigt, welches durch das pflA Gen kodiert wird (Knappe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1332–1335). Die Überführung in die aktive Form durch das Pyruvat-Formiatlyase-aktivierende Enzym, welches durch das pflA Gen kodiert wird, erfolgt unter Mithilfe des Cofaktors S-Adenosylmethionin. Das pflB Gen und das pflA Gen sind auf dem R. terrigena Genom benachbart angeordnet, wie in SEQ ID NO: 1 offenbart (pflB Gen: bp 1 bis 2283, pflA Gen: bp 2489 bis 3229).
Im Mikroorganismenstamm, der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, ist das pflA Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass es nicht mehr für ein Protein kodiert, das zur Aktivierung der Pyruvat-Formiatlyase befähigt ist. In einer bevorzugten Ausführung stammt das pflA Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella. In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das pflA Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das pflA Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1, bp 2489 bis 3229, offenbart kodierend für ein Protein mit SEQ ID NO: 3.
Die durch das pflB Gen kodierte Pyruvat-Formiatlyase liegt erfindungsgemäß auch dann in einer nicht funktionsfähigen, enzymatisch inaktiven Form vor, wenn nur das pflA Gen, kodierend das Pyruvat-Formiatlyase-aktivierende Enzym, inaktiviert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist also auch mit Mikroorganismenstämmen durchführbar, in denen das pflA Gen inaktiviert ist.
Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismenstamm mit inaktiviertem pflB Gen verwendet.
Die Erfindung betrifft damit auch die Verwendung eines Mikroorganismenstammes der Gattung Raoultella, bevorzugt der Art Raoultella terrigena, mit inaktiver Pyruvat-Formiatlyase zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Xylose, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnen wurde. Die bevorzugten Merkmale des im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mikroorganismenstammes gelten ebenso für die erfindungsgemäße Verwendung.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits die C4-Produkte gebildet. Die Bildung von Biomasse und der C4-Produkte kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmaßstab).
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 l besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 300 l insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die C4-Produktbildung, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, optimiert werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird als C-Quelle zur Anzucht eines Produktionsstammes Xylose sowie Xylose enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die v. a. aus Lignozellulose und der darin enthaltenen Hemicellulose gewonnen werden, aber auch bei der Verarbeitung von Zuckerrohr oder Zuckerrübe anfallen können eingesetzt.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N-Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO₃, NaNO₃, Ammoniumnitrat, Ca(NO₃)₂, Mg(NO₃)₂ sowie andere N-Quellen wie z. B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z. B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die C4-Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bei der Anzucht wird, abhängig vom Maßstab des Kulturvolumens, zwischen Labormaßstab, Pilotmaßstab und technischem Maßstab unterschieden. Der Labormaßstab entspricht einer apparativ einfachen Kultivierung in einem Schüttelkolben unter Verwendung eines Schüttlers, um die Durchmischung des Ansatzes zu gewährleisten. Es wird nur die Schüttlerdrehzahl und die Anzuchtstemperatur kontrolliert (siehe Beispiel 2). Maximales Kulturvolumen ist 1 l. Der Pilotmaßstab verwendet eine, üblicherweise kommerziell erhältliche, Fermentationsanlage (siehe Beispiele 3 bis 5), bestehend aus einem temperierbaren Rührkesselreaktor mit Sonden und Zulaufstrecken zur kontrollierten Versorgung mit Luft, Säure, Lauge, Schaumbekämpfungsmittel und Feedlösungen. Wesentliche Merkmale, die den Schüttelkolben (Labormaßstab) vorn Fermenter (Pilotmaßstab und darüber) unterscheiden, sind die Beibehaltung definierter Bedingungen bezüglich pH (Zudosierung von Lauge oder Säure), Sauerstoffeintrag (Kombination aus Rührerdrehzahl und Belüftungsrate), Versorgung mit Nährstoffen (Dosierung des Feeds) und Schaumentwicklung (Zudosierung eines Schaumbekämpfungsmittels bei verstärkter Schaumbildung). Das Kulturvolumen im Pilotmaßstab beträgt mindestens 1 l bis zu 300 l. Kulturvolumina über 300 l betreffen den technischen Maßstab.
Bevorzugt sind der Pilotmaßstab mit einem Kulturvolumen von 1 l bis 300 l und der technische Maßstab über 300 l.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Pentosen sowie Pentosen enthaltende pflanzliche Hydrolysate sowie Mischungen der bevorzugten C-Quellen in beliebigem Mischungsverhältnis.
Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Xylose.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO₃, NaNO₃ und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die C4-Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr. Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Der nützliche Bereich der Pressluftzufuhr bei der aeroben Kultivierung beträgt 0,0 vvm bis 5 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermentationsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentationsvolumen pro Minute). Bevorzugt ist ein Presslufteintrag von 0,05 vvm bis 2,5 vvm, besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 vvm und insbesondere bevorzugt von 0,3 bis 1 vvm. Dabei ist ein Presslufteintrag von 0,0 vvm nicht gleichbedeutend mit einer anaeroben Fermentation, sondern der Sauerstoffeintrag erfolgt durch den Rührer in einem offenen System.
Der Presslufteintrag kann darüber hinaus im Verlauf der Fermentation, den Erfordernissen entsprechend, innerhalb der bevorzugten Grenzen variiert werden.
Die Kultivierungsdauer zur C4-Produkt-Herstellung beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das C4-Produkt vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene C4-Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des C4-Produkts stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion (siehe z. B. DE 10 2011 004 915 ), Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebigen Form kombiniert werden, um das C4-Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades der C4-Produkte sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Die Erfindung betrifft ferner verbesserte Mikroorganismenstämme, die in der Lage sind bei der fermentativen Herstellung von C4-Produkten als C-Quelle bei der Fermentation Zucker zu verwerten, die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen.
Ein derartiger Stamm ist ein Mikroorganismenstamm der Gattung Raoultella, bevorzugt der Art R. terrigena, enthaltend ein pflB und ein pflA Gen, dadurch gekennzeichnet, dass das pflB oder das pflA Gen, derart inaktiviert sind, dass sie nicht für ein enzymatisch aktives Protein kodieren.
Bevorzugt ist ein Mikroorganismenstamm mit inaktiviertem pflB Gen.
Im erfindungsgemäßen Mikroorganismenstamm ist das pflB Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass aufgrund fehlender Pyruvat-Formiatlyase Enzymaktivität kein Formiat (Ameisensäure) mehr gebildet wird.
In einer bevorzugten Ausführung stammen das pflB- und das pflA Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das pflB- und das pflA Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das pflB Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1, bp 1–2283 offenbart, kodierend für ein Protein mit Pyruvat-Formiatlyase Aktivität, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 offenbart.
Insbesondere bevorzugt ist das pflA Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1, bp 2489–3229 offenbart, kodierend für ein Protein mit Pyruvat-Formiatlyase aktivierender Aktivität (PFL-Aktivase), gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 3 offenbart.
Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3-Butandiol.
Bei den aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen Zuckern handelt es sich um Xylose.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschreiben, produziert Raoultella terrigena im Gegensatz zu L. plantarum, K. oxytoca und K. planticola sowohl bei Verwendung von Glucose wie Xylose als C-Quelle nur geringe Mengen Formiat und Lactat. Nach dem Stand der Technik war daher ein Einfluss der Inaktivierung der Pyruvat-Formiatlyase auf die Produktion von 2,3-Butandiol nicht zu erwarten, da offensichtlich nur wenig Pyruvat vom 2,3-Butandiol Stoffwechselweg (Gleichungen (I) bis (III)) zum Formiat Stoffwechselweg (Gleichung (IV)) abgeleitet wurde. Dies wurde in Schüttelkolbenversuchen (Glucose und Xylose, Beispiel 2) und bei Verwendung von Glucose als C-Quelle der Fed-Batch Fermentation auch beobachtet (Beispiel 3). Es war daher völlig unerwartet, dass in einem R. terrigena Stamm mit inaktivierter Pyruvat-Formiatlyase bei Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fed-Batch Fermentation im Pilotmaßstab die 2,3-Butandiol Ausbeute signifikant gesteigert werden konnte (Beispiel 4).
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist die Inaktivierung des pflB Gens in einem Mikroorganismenstamm der Gattung Raoultella dazu geeignet, in einem aeroben fermentativen Verfahren bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation die Ausbeute der C4-Produkte und insbesondere von 2,3-Butandiol um mehr als 10%, bevorzugt mehr als 15% und insbesondere bevorzugt um mehr als 20% zu steigern. Zur Inaktivierung des pflB Gens wurde der in DE 10 2013 216 658 offenbarte R. terrigena Stamm R.t.ΔcpdA-1 verwendet, der für die fermentative Herstellung von 2,3-Butandiol unter Verwendung der C-Quelle Xylose bereits stark verbesserte Eigenschaften aufwies. Durch Inaktivierung der Pyruvat-Formiat Lyase konnte das in DE 10 2013 216 658 offenbarte Verfahren zur 2,3-Butandiol Herstellung in nicht erwarteter Weise noch weiter verbessert werden.
Ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneter Mikroorganismenstamm, auch Produktionsstamm genannt, wird vorzugsweise aus einem Ausgangsstamm hergestellt. Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen Wildtypstamm der Gattung Raoultella, bevorzugt der Art R. terrigena, bzw. eine davon abgeleitete genetische Variante mit verbesserten Eigenschaften, wie z. B. in DE 10 2013 216 658 offenbart.
Zur Inaktivierung des pflB Gens sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt. Diese Methoden sind natürlich auch auf das pflA Gen anwendbar, um einen Produktionsstamm mit reduzierter, bzw. ohne Aktivität eines Pyruvat-Formiatlyase Enzyms herzustellen.
Bevorzugt wird das pflB Gen durch den bekannten Mechanismus der homologen Rekombination gezielt inaktiviert. Kloniersysteme zur gezielten Geninaktivierung mittels homologer Rekombination sind kommerziell erhältlich, wie z. B. basierend auf Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 6640–6645 und auch weiterhin offenbart im Anwenderhandbuch „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat, No. K006, Version 2.3, Juni 2012" der Fa. Gene Bridges GmbH).
Dem Stand der Technik entsprechend wird das pflB Gen oder ein Teil des Gens isoliert und eine Fremd-DNS in das pflB Gen kloniert, wodurch der das Protein definierende Leserahmen des pflB Gens unterbrochen wird. Ein für die gezielte Inaktivierung des pfl Gens geeignetes DNS-Konstrukt besteht also aus einem 5'-DNS-Abschnitt, der zum genomischen pflB Gen homolog ist, gefolgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genabschnitt und daran angeschlossen einem 3'-DNS-Abschnitt, der wiederum zum genomischen pflB Gen homolog ist.
Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des pflB Gens umfasst dabei nicht nur den für die Pyruvat-Formiatlyase kodierenden Bereich. Der in Frage kommende Bereich umfasst auch das pflB Gen flankierende DNS-Sequenzen, nämlich im 5'-Bereich vor Beginn des kodierenden Bereichs (Promotor der Gentranskription) sowie im 3'-Bereich nach dem Ende des kodierenden Bereichs (Terminator der Gentranskription), deren Veränderung durch homologe Rekombination ebenso wie die Veränderung des kodierenden Bereichs zur Inaktivierung des pflB Gens führen kann.
Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektionsmarker-Expressionskassette. Diese besteht aus einem Promotor der Gentranskription, der funktionell verbunden ist mit dem eigentlichen Selektionsmarkergen und gegebenenfalls gefolgt von einem Terminator der Gentranskription. Vorzugsweise enthält der Selektionsmarker 5'- und 3'-flankierende homologe Sequenzen des pflB Gens von jeweils mindestens 30 bp Länge, bevorzugt jeweils mindestens 50 bp Länge.
Das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des pflB Gens besteht also, beginnend vom 5'-Ende, aus einer zum pflB Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers sowie gefolgt von einer weiteren, zum pflB Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge.
Bei den Selektionsmarkergenen handelt es sich im Allgemeinen um Gene, deren Genprodukt dem Ausgangsstamm das Wachstum unter selektiven Bedingungen ermöglicht, unter denen der ursprüngliche Ausgangsstamm nicht wachsen kann.
Bevorzugte Selektionsmarkergene sind ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotika-Resistenzgene wie z. B. das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen oder aber auch das Neomycin-Resistenzgen. Andere bevorzugte Selektionsmarkergene ermöglichen Ausgangsstämmen mit einem Stoffwechseldefekt (z. B. Aminosäureauxotrophien) das Wachstum unter selektiven Bedingungen, indem ihre Expression den Stoffwechseldefekt korrigiert. Schließlich sind auch Selektionsmarkergene möglich, deren Genprodukt eine an sich für den Ausgangsstamm toxische Verbindung chemisch verändert und somit inaktiviert (z. B. das Gen des Enzyms Acetamidase, welches die für viele Mikroorganismen toxische Verbindung Acetamid in die ungiftigen Produkte Acetat und Ammoniak spaltet).
Unter den Selektionsmarkergenen besonders bevorzugt sind das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen. Insbesondere bevorzugt sind das Tetracyclin-Resistenzgen und das Kanamycin-Resistenzgen.
Auf Basis der homologen Rekombination gibt es käuflich erwerbliche Systeme, die zusätzlich zur gezielten Geninaktivierung auch die Möglichkeit bieten, den Selektionsmarker wieder aus dem Genom zu entfernen, womit die Möglichkeit der Herstellung von Doppel- und Mehrfachmutanten gegeben ist. Ein solches System ist z. B. der käuflich erhältliche „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", basierend auf Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 6640–6645 und auch weiterhin offenbart im Anwenderhandbuch „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" der Fa. Gene Bridges GmbH).
Bevorzugt ist ein Verfahren zur gezielten Geninaktivierung des pflB Gens auf Basis der Red^®/ET^®-Technologie.
Bei dem Ausgangsstamm handelt es sich um einen Stamm der Art Raoultella terrigena. Diese Stämme sind käuflich erhältlich z. B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (Braunschweig). Auch der in den Beispielen verwendete Stamm Raoultella terrigena DSM 2687 ist bei der DSMZ GmbH erhältlich.
Besonders bevorzugt ist ein Produktionsstamm, in dem das inaktivierte pflB Gen aus Raoultella terrigena stammt.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Produktionsstamm kann darüberhinaus noch weiter optimiert werden, um die C4-Produkt Herstellung noch zusätzlich zu verbessern.
Die Optimierung kann gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind z. B. 2,3-Butandiol Biosynthesegene wie Acetolactatsynthase ( DE 10 2011 003 394 ), Acetolactatdecarboxylase ( DE 10 2011 003 383 ) und Acetoinreduktase ( DE 10 2011 003 387 ). Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Raoultella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2,3-Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392–1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863–3875).
Der Produktionsstamm kann darüber hinaus dadurch optimiert werden, dass neben dem pflB Gen noch weitere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die C4-Produkt Herstellung auswirken. Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactatdehydrogenase (Milchsäurebildung) oder die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung).
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide.
1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 3,4 kb großen Vektor pKD13.
2 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 6,3 kb großen Vektor pKD46.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
1. Beispiel: Herstellung von pflB Knock out Mutanten in Raoultella terrigena
Als Ausgangsstamm für die Genisolierung wurde Raoultella terrigena DSM 2687 verwendet (käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, bezeichnet als R.t.-WT). Ausgangsstamm für die Stammentwicklung war der von Raoultella terrigena DSM 2687 abgeleitete und in DE 10 2013 216 658 offenbarte Stamm R.t.ΔcpdA-1.
Ziel der Geninaktivierung war das pflB Gen aus R. terrigena. Die DNS-Sequenz des pflB Gens aus R. terrigena ist offenbart in SEQ ID NO: 1, bp 1 bis 2283, kodierend für ein Pyruvat-Formiatlyase Protein mit SEQ ID NO: 2. Benachbart zum pflB Gen liegt das ebenfalls in SEQ ID NO: 1, bp 2489 bis 3229, offenbarte pflA Gen, kodierend für das Pyruvat-Formiatlyase-aktivierende Enzym mit SEQ ID NO: 3.
Das R. terrigena pflB Gen wurde mit der aus der E. coli Molekularbiologie bekannten Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH inaktiviert. Dazu wurden die Plasmide pKD13 (1), pKD46 (2), und pCP20 verwendet.
Das 3,4 kb große Plasmid pKD13 (1) ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048744.1.
Das 6,3 kb große Plasmid pKD46 (2) ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1.
Das 9,4 kb große Plasmid pCP20 ist offenbart in Cherepanov and Wackernagel, Gene (1995) 158: 9–14.
Zur Geninaktivierung wurden die Primer pfl-2f (SEQ ID NO: 4) und pfl-3r (SEQ ID NO: 5) verwendet. Zum Nachweis des pflB Gens wurden die Primer pfl-1f (SEQ ID NO: 6) und pfl-4r (SEQ ID NO: 7) verwendet. Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen:
Primer pfl-1f enthielt das 5'-Ende (bp 1–26 in SEQ ID NO: 1), Primer pfl-4r das 3'-Ende des pflB Gens (bp 2259–2283 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form). Primer pfl-2f enthielt 50 bp aus dem 5'-Bereich des pflB Gens (bp 101–150 in SEQ ID NO: 1) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 1” in 1). Primer pfl-3r enthielt 50 bp aus dem 3'-Bereich des pflB Gens (bp 2051–2100 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 2” in 1).
Zur Inaktivierung des pflB Gens in R. terrigena durch homologe Rekombination mit dem Lambda Red System wurden, in an sich bekannter Weise (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 6640–6645 sowie darauf basierend auch beschrieben im Anwenderhandbuch „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" der Fa. Gene Bridges GmbH), folgende Schritte durchgeführt:
Der R. terrigena Stamm R.t.ΔcpdA-1 wurde mit dem Plasmid pKD46 (sog. „Red Recombinase” Plasmid, 2) transformiert und ein Ampicillin-resistenter Klon isoliert (bezeichnet als R.t.ΔcpdA-pKD46). Die Transformation von R. terrigena R.t.ΔcpdA-1 erfolgte wie in DE 10 2011 003 394 beschrieben.
Ein pflB-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS-Fragment wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit DNS des Plasmids pKD13 (1) hergestellt. DNS des Plasmids pKD13 wurde verwendet, um mit den Primern pfl-2f (SEQ ID NO: 4) und pfl-3r (SEQ ID NO: 5) ein 1,3 kb PCR-Produkt herzustellen, das am 5'- und am 3'-Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 50 bp enthielt, der spezifisch für das pflB Gen aus R. terrigena war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressionskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5'- und 3'-Ende der Kanamycin Expressionskassette, sog. „FRT direct repeats” (bezeichnet als „natural FRT site” und „distal 35 nt of natural FRT site” in 1), kurze DNS-Abschnitte, die in einem späteren Arbeitsschritt zur Entfernung des Kanamycin Antibiotikamarkers als Erkennungssequenz für die „FLP Rekombinase” (enthalten auf dem Plasmid pCP20) dienten.
Das 1,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert und mit der, dem Fachmann geläufigen, nur methylierte DNS schneidenden Restrikitonsendonuclease DpnI behandelt, um restliche pKD13 Plasmid DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR-Reaktion wird dabei nicht abgebaut.
Das 1,3 kb große, für das pflB Gen spezifische und eine Expressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR-Produkt wurde in bekannter Weise ( DE 10 2011 003 394 ) in R.t.ΔcpdA-pKD46 transformiert und auf LBkan Platten bei 30°C Kanamycin-resistente Klone isoliert. LBkan Platten enthielten LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl), 1,5% Agar und 15 mg/l Kanamycin.
Vier der erhaltenen Kanamycin-resistenten Klone wurden auf LBkan Platten gereinigt und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kanamycin-Resistenz Kassette korrekt im pflB Gen integriert worden war.
Die für die PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von R.t.ΔcpdA-pKD46 in LBkan-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 mg/l Kanamycin) gewonnen worden. Dabei diente genomische DNS von R.t.-WT als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren pfl-1f (SEQ ID NO: 6) und pfl-4r (SEQ ID NO: 7).
R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 2,3 kb, wie für das intakte Gen erwartet. Von den vier Kanamycin-resistenten Klonen enthielten zwei Klone ein unverändertes pflB Gen (2,3 kb PCR-Produkt). Die beiden anderen Klone ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 1,7 kb, wie für den Fall erwartet, dass das 1,3 kb PCR-Produkt an den durch die Primer pfl-2f (SEQ ID NO: 4) und pfl-3r (SEQ ID NO: 5) definierten Stellen im pfl-Gen integriert worden war. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des pflB Gens erfolgreich das Kanamycin Resistenzgen integriert werden konnte und somit das pflB Gen inaktiviert worden war. Die beiden Klone mit inaktiviertem pflB Gen erhielten die Bezeichnung R.t.ΔcpdAΔpfl::kan-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl::kan-3.
Zur Eliminierung des Kanamycin Selektionsmarkers wurden die Mutanten R.t.ΔcpdAΔpfl::kan-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl::kan-3 mit dem Plasmid pCP20 transformiert und Transformanten bei 30°C selektiert. Der 9,4 kb Vektor pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel, Gene (1995) 158: 9–14. Auf dem Vektor pCP20 ist das Gen der FLP Recombinase enthalten. Die FLP Recombinase erkennt die FRT Sequenzen, welche die Expressionskassette des Kanamycin Resistenzgens flankieren und bewirkt die Entfernung der Kanamycin Expressionskassette. Dazu wurden die bei 30°C erhaltenen Klone bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde zum einen die Expression der FLP Recombinase induziert und zum zweiten die Replikation des pCP20 Vektors unterbunden.
Das Resultat dieses Schrittes waren Klone, in denen zum einen das pflB Gen inaktiviert worden war und die zum anderen wieder sensitiv gegen Kanamycin waren (sog. „Curing” des Antibiotika Selektionsmarkers). Die Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom der R.t.ΔcpdAΔpfl Mutanten ermöglicht die Einführung weiterer Mutationen, um Doppel- oder auch Mehrfachmutanten herzustellen. Die Mutanten R.t.ΔcpdAΔpfl::kan-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl::kan-3 waren nach der Behandlung mit dem pCP20 Plasmid beide Kanamycin-sensitiv, was durch plattieren auf LB- und LBkan-Platten nachgewiesen wurde. Während die Stämme auf LB-Platten wuchsen, konnte auf LBkan-Platten kein Wachstum mehr beobachtet werden, was auf die erfolgreiche Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom hindeutete.
Die Entfernung der Kanamycin-Kassette wurde zusätzlich in einer PCR-Reaktion verifiziert. Dazu wurde von den Kanamycin-sensitiven Klonen genomische DNS isoliert (Qiagen DNS-Isolierungskit) und in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern pfl-1f (SEQ ID NO: 6, umfasst das 5'-Ende des pfl Gens) und pfl-4r (SEQ ID NO: 7, umfasst das 3'-Ende des pfl Gens) eingesetzt. DNS des Kontrollstammes R.t.ΔcpdA-1 ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 2,3 kb, wie für das intakte pflB Gen erwartet. Die Kanamycin-sensitiven Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 380 bp, was der erwarteten Größe der nach der homologen Rekombination verbliebenen 5'- und 3'-Fragmente des inaktivierten pflB Gens entsprach.
Die aus diesem Schritt isolierten Stämme erhielten die Bezeichnung R.t.ΔcpdAΔpfl-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl-3. Diese Stämme zeichnen sich dadurch aus, dass in ihnen neben dem cpdA Gen auch das pflB Gen inaktiviert war und dass diese Stämme wieder sensitiv gegen das Antibiotikum Kanamycin waren.
2. Beispiel: Vergleichende Schüttelkolbenanzucht der R.t.ΔcpdAΔpfl Mutanten mit Glucose und Xylose als C-Quelle
Ausgangsstamm war Raoultella terrigena R.t.ΔcpdA-1, in dem das cpdA Gen inaktiviert worden war ( DE 10 2013 216 658 ). Knock out Mutanten des pflB Gens wurden hergestellt wie im 1. Beispiel beschrieben. Die verwendeten Mutanten hatten die Bezeichnung R.t.ΔcpdAΔpfl-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl-3.
Die Stämme wurden durch Schüttelkolbenanzucht auf Produktion der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin sowie der C2-Produkte Acetat und Ethanol getestet. Außerdem wurden die Nebenprodukte Formiat, Lactat und Succinat bestimmt. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2-G, bzw. FM2-X Medium beimpft und bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.
FM2-G Medium enthielt Glucose 40 g/l; CSD (Corn Steep Liquor getrocknet) 10 g/l; Ammoniumsulfat 5 g/l; NaCl 0,5 g/l; FeSO₄ × 7H₂O 75 mg/l; Na₃Citrat × 2H₂O 1 g/l; CaCl₂ × 2H₂O 14,7 mg/l; MgSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l; KH₂PO₄ 1,5 g/l; Spurenelementemix 10 ml/l. Der pH des FM2-G Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
FM2-X Medium enthielt die gleiche Zusammensetzung wie FM2-G Medium. Jedoch wurde die Glucose durch Xylose (40 g/l) ersetzt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H₃BO₃ 2,5 g/l; CoCl₂ × 6H₂O 0,7 g/l; CuSO₄ × 5H₂O 0,25 g/l; MnCl₂ × 4H₂O 1,6 g/l; ZnSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l und Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,15 g/l.
Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Der Glucose-, bzw. Xylosegehalt von Proben der Anzucht wurde in Abständen von 24 h bestimmt mit dem Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose. Bei Bedarf wurden Glucose, bzw. Xylose aus 40% (w/v) Stocklösungen nachgefüttert.
In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2-Produkten untersucht. Die Bestimmung des Gehalts an C4-Produkten (2,3-Butandiol und Acetoin) sowie an C2-Produkten (Acetat und Ethanol) in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ¹H-NMR (siehe z. B. DE 10 2011 003 394 ). Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d₄ Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/l) in D₂O gemischt. Die ¹H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:

TSP: 0,140–0,145 ppm (9H)

2,3-Butandiol: 1,155–1,110 ppm (6H)

Ethanol: 1,205–1,157 ppm (3H)

Essigsäure: 2,000–1,965 ppm (3H)

Acetoin: 2,238–2,200 ppm (3H)
Die Analyse der Nebenprodukte Formiat, Lactat und Succinat erfolgte durch Ionenaustauschchromatographie (IEC). Verwendet wurde ein Dionex DX320 IEC-Gerät, ausgestattet mit einer IEC-AS6 Säule (Thermo Fischer Dionex) und einem Leitfähigkeitsdetektor. Laufmittel war 1,2 mM Heptafluorbuttersäure in H₂O (Flussrate 1 ml/min). Zur Quantifizierung wurde das Analyseverfahren mit den Reinsubstanzen kalibriert.
Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Glucose sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Xylose sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 1: Produktionsverlauf in Raoultella terrigena Stämmen mit Glucose als C-Quelle (R.t.ΔcpdA-1: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdAΔpfl-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl-3 erfindungsgemäß)

Tabelle 2: Produktionsverlauf in Raoultella terrigena Stämmen mit Xylose als C-Quelle (R.t.ΔcpdA-1: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdAΔpfl-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl-3 erfindungsgemäß)
Bei der Anzucht in Schüttelkolben wurde sowohl bei Verwendung von Glucose (Tabelle 1) wie von Xylose als C-Quelle (Tabelle 2) für den Ausgangsstamm R.t.ΔcpdA-1 und die erfindungsgemäßen Stämme R.t.ΔcpdAΔpfl-1 und R.t.ΔcpdAΔpfl-3 jeweils ein Produktspektrum mit geringen Unterschieden erhalten. Speziell bei der Verwendung von Glucose scheinen die pflB-Mutanten sogar tendenziell weniger 2,3-Butandiol zu produzieren als im Vergleichsstamm. Formiat wie auch Lactat und Succinat konnte in den Schüttelkolbenansätzen entweder nicht oder nur in geringen Mengen nachgewiesen werden.
Aus den in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefassten Ergebnissen geht hervor, dass im Labormaßstab (Anzucht im Schüttelkolben) durch Inaktivierung der Pyruvat-Formiatlyase keine verbesserten Ausbeuten von C4-Produkten, insbesondere 2,3-Butandiol erzielt werden können. Dies gilt sowohl für Glucose wie auch für Xylose als C-Quelle. Es stellte sich die Frage, ob diese Ergebnisse auch für die Fed-Batch Fermentation (Pilotmaßstab) gelten.
3. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit dem pflB Knock out Stamm R.t.ΔcpdAΔpfl-1 durch Fed-Batch Fermentation mit Glucose als C-Quelle (Vergleichsbeispiel)
In der Fermentation eingesetzte Stämme waren R.t.ΔcpdA-1 (Kontrollstamm) und R.t.ΔcpdAΔpfl-1 (erfindungsgemäß, siehe 1. Beispiel). Die Fermentationen wurden parallel unter gleichen Bedingungen durchgeführt.
Verwendet wurden „Labfors II” Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 l (3 l Fermentervolumen). Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des pO₂ und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlösung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm), Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute), pO₂ (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100% kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt), pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenterhersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (73% Glucose, w/v) wurde entsprechend dem Verbrauch an Glucose über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20–25% v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-G Medium. 1,35 l des FM2-G Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt (siehe 2. Beispiel).
Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 600 rpm, Belüftung mit 0,4 vvm, pH 6,3.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD₆₀₀ als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec^TM 3000).
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert, das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucosegehalt, der Gehalt an C4- und C2-Produkten sowie der Nebenprodukte Formiat, Lactat und Succinat wurde bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 73% (w/v) Glucose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt. 55 h nach Start der Fermentation wurde die Belüftung ausgeschaltet und die Fermentation ohne aktive Zufuhr von Luft weiter geführt.
Tabelle 3 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten sowie von Formiat im R. terrigena Kontrollstamm R.t.ΔcpdA-1 und in dem erfindungsgemäßen Stamm R.t.ΔcpdAΔpfl-1. Tabelle 3: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Glucose als C-Quelle (R.t.ΔcpdA-1: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdAΔpfl-1: erfindungsgemäß)
Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, führte die Fermentation der beiden Stämme bei Verwendung der C-Quelle Glucose zu einem vergleichbaren Produktspektrum. Auffällig war, dass der Acetoingehalt im Stamm R.t.ΔcpdAΔpfl-1 höher war als im Vergleichsstamm und in der Anfangsphase der Fermentation entsprechend der 2,3-Butandiolgehalt niedriger. Am Ende der Fermentation war der Unterschied des 2,3-Butandiol Gehalts mit 2% deutlich unter der üblichen Schwankungsbreite (mind. 5%). Weiterhin enthielten beide Stämme zum Fermentationsende kein nachweisbares Formiat.
Da der Ausgangsstamm R.t.ΔcpdA-1 mit 0,15 g/l nur zu Beginn der Fermentation eine geringe Menge Formiat produzierte, ist es für den Fachmann nicht überraschend, dass für die pfl-Mutante bei der Fermentation mit der C-Quelle Glucose kein Einfluss auf die 2,3-Butandiolproduktion zu beobachten war. R. terrigena verhält sich hier völlig anders als von Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066 für K. oxytoca und WO 2010/037114 für L. plantarum beobachtet. Dort wurde eine vergleichsweise hohe Formiatproduktion beobachtet, welche durch Einführung einer LDH-Mutation noch verstärkt wurde. Die Lehre aus Park et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol (2013) 40: 1057–1066 für K. oxytoca und WO 2010/037114 für L. plantarum, durch Inaktivierung der Pyruvat-Formiat Lyase die 2,3-Butandiol Produktion zu verbessern, ist daher nicht auf Raoultella terrigena zu übertragen. Weiterhin wurde nach Beendigung der Fermentation (71 h) der Gehalt der Nebenprodukte Lactat und Succinat bestimmt (Tabelle 3), der für beide Stämme im Vergleich zum 2,3-Butandiol gering war.
4. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit dem pflB Knock out Stamm R.t.ΔcpdAΔpfl-1 durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle (erfindungsgemäß)
Die Fermentation wurde durchgeführt, wie im 3. Beispiel beschrieben. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren R.t.ΔcpdA-1 (Kontrollstamm) und R.t.ΔcpdAΔpfl-1 (erfindungsgemäß, siehe 1. Beispiel). Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-X Medium.
1,35 l des FM2-X Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt (siehe 2. Beispiel).
Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 600 rpm, Belüftung mit 0,4 vvm, pH 6,3.
Der Xylosegehalt, der Gehalt an C4- und C2-Produkten sowie der Nebenprodukte Formiat, Lactat und Succinat wurde bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Xylose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 75% (w/v) Xylose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Xylose Verbrauchsrate bestimmt. 55 h nach Start der Fermentation wurde die Belüftung ausgeschaltet und die Fermentation ohne aktive Zufuhr von Luft weiter geführt. Tabelle 4: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle (R.t.ΔcpdA-1: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdAΔpfl-1 erfindungsgemäß)
In Tabelle 4 ist der Produktionsverlauf von C2- und C4-Produkten sowie von Nebenprodukten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.ΔcpdA-1 und in der erfindungsgemäßen pfl-Mutante R.t.ΔcpdAΔpfl-1 zusammengefasst.
Anders als bei der Anzucht im Schüttelkolben (2. Beispiel, Glucose und Xylose) und unerwartet auch verschieden vom Ergebnis bei der Fermentation mit Glucose als C-Quelle (3. Beispiel), führte bei Verwendung von Xylose als C-Quelle die Inaktivierung des pflB Gens im Stamm R.t.ΔcpdAΔpfl-1 zu einer signifikanten Steigerung der Produktion von 2,3-Butandiol und auch der C4-Produkte insgesamt um 25%. Die Acetat- und Ethanol Bildung wurde jeweils stark reduziert, und zwar um mehr als 36%, bzw. 22%, so dass ein insgesamt homogeneres Produktspektrum resultierte, wo der Anteil von 2,3-Butandiol an der Gesamtmenge C2- und C4-Produkte 88% betrug.
Formiat konnte während der Fermentation mit Xylose als C-Quelle weder im Ausgangsstamm R.t.ΔcpdA-1 noch im erfindungsgemäßen Stamm R.t.ΔcpdAΔpfl-1 nachgewiesen werden. Die Formiat-Nebenproduktbildung war also sowohl für Glucose (3. Beispiel) wie für Xylose als C-Quelle der Fermentation schon im Ausgangsstamm gering und die Inaktivierung der Pyruvat-Formiatlyase hatte entsprechend für Glucose als C-Quelle keine signifikante Veränderung des Produktspektrums zur Folge. Die Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion mit Xylose als C-Quelle der Fermentation war daher völlig unerwartet.
Weiterhin wurde nach Beendigung der Fermentation (71 h) der Gehalt der Nebenprodukte Lactat und Succinat bestimmt (Tabelle 4), der für beide Stämme im Vergleich zum 2,3-Butandiol gering war.
5. Beispiel: Fermentation mit der C-Quelle Xylose im 330 l Maßstab
Fermentiert wurde die Raoultella terrigena pfl-Mutante R.t.ΔcpdAΔpfl-1, in der neben dem cpdA Gen das pfl Gen inaktiviert worden war.
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von R.t.ΔcpdAΔpfl-1 in LB Medium (siehe 1. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 × 100 ml LB Medium, jeweils in einem 1 l Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LB Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20% v/v versetzt und bei –20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 0,5–2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 l Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 l Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat^® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G (siehe 2. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 × 8 l FM2-G wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck pO₂ wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450–1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 30–40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet.
Hauptfermenter: Die Fermentation wurde in einem Biostat^® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 l, Kesselvolumen 500 l) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-X mit Xylose als C-Quelle (siehe 2. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus.
180 l FM2-X wurden mit 16 l Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 0,4 vvm, bezogen auf das Anfangsvolumen. Der Sauerstoffpartialdruck pO2 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200–500 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Xyloseverbrauch durch off-line Xylose-Messung mit einem Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 2. Beispiel). Sobald die Xylosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/l betrug (8–10 h nach Inokulation), wurde die Zudosierung einer 75% w/v Xylose Feedlösung gestartet. Die Flussrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Xylosekonzentration von 10–20 g/l eingehalten werden konnte. 55 h nach Start der Fermentation wurde die Belüftung ausgeschaltet. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 290 l.
Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Produktion von 2,3-Butandiol durch Fed-Batch Fermentation im 330 l Maßstab
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Claims

Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen werden mittels eines Mikrorganismenstammes der Art Raoultella terrigena enthaltend eine durch ein pflB Gen kodierte Pyruvat-Formiatlyase dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, der Zucker Xylose ist und die Pyruvat-Formiatlyase in einer nicht funktionsfähigen, enzymatisch inaktiven Form vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den C4-Produkten um 2,3-Butandiol oder Acetoin bevorzugt um 2,3-Butandiol handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die nicht funktionsfähige, enzymatisch inaktive Form der Pyruvat-Formiatlyase durch eine genetische Inaktivierung bedingt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Inaktivierung das Gen pflB betrifft.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und bei einer Temperatur von 20°C bis 40°C unter aeroben Bedingungen über einen Zeitraum von 10 bis 100 h durchgeführt wird.
Verwendung eines Mikroorganismenstammes der Art Raoultella terrigena mit inaktiver Pyruvat-Formiatlyase zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Xylose, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnen wird.
Mikroorganismenstamm der Art R. terrigena, enthaltend ein pflB und ein pflA Gen, dadurch gekennzeichnet, dass das pflB oder das pflA Gen, derart inaktiviert sind, dass sie nicht für ein enzymatisch aktives Protein kodieren.