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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
1,3-Propandiol, ausgehend von einer kohlenstoffhaltigen Substanz,
wobei das Verfahren eine Stufe der Kultur eines rekombinanten Mikroorganismus,
der kein Produzent von Co-Enzym B12 ist, in Abwesenheit eines Zusatzes
von Co-Enzym B12 oder einem seiner Vorläufer umfasst.
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Die
Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, die für eine Glycerindehydratase
codiert, deren katalytische Aktivität vom Vorliegen von Co-Enzym
B12 oder einem seiner Vorläufer
unabhängig
ist, sowie eine Nucleinsäure,
die für
eine 1,3-Propanoldehydrogenase codiert, die in die Synthese des
1,3-Propandiols eingreift.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und Wirtszellen,
die solche Nucleinsäuren
enthalten, sowie Polypeptide, die durch diese letztgenannten codiert
werden.
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1,3-Propandiol
ist eine Verbindung mit großem
industriellem Interesse, die hauptsächlich in der Industrie der
Detergenzien und in der der Polymeren verwendet wird.
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So
wird 1,3-Propandiol in flüssigen
Laugen als Stabilisierungsmittel für Lipasen, Amylasen und Proteasen
sowie als "linderndes
Schutzmittel" in
flüssigen
Detergenzien zum Geschirrspülen
von Hand verwendet.
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Im Übrigen wird
1,3-Propandiol in zunehmendem Maße in der Industrie der Polymeren,
insbesondere als Monomer bei der Synthese von Polyestern, Polyethern
oder Polyurethanen, eingesetzt.
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Derzeit
wird die Herstellung von 1,3-Propandiol hauptsächlich durch chemische Synthese
durch Hydratisierung (in saurem Medium) von Acrolein zu 3-Hydroxypropionaldehyd,
welches dann durch katalytische Hydrierung zu 1,3-Propandiol reduziert
wird, durchgeführt.
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Ein
derartiges Verfahren ist teuer und verwendet ein toxisches Produkt,
Acrolein. Darüber
hinaus ist diese Synthese wenig selektiv und erzeugt eine große Anzahl
von nicht verwendbaren Nebenprodukten.
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Ein
anderer Syntheseweg besteht in der Hydrocarbonylierung von Ethylenoxid
durch Kohlenmonoxid und Wasserstoff unter hohem Druck in Gegenwart
von Katalysatoren und Lösungsmitteln.
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Eine
solche Reaktion produziert ein Dioxan, das dann zu 1,3-Propandiol
hydriert wird. Dieses zweite Verfahren der chemischen Synthese ist
ebenfalls sehr teuer.
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Seit
einigen Jahren ist eine Alternative zur Herstellung von 1,3-Propandiol
durch chemische Synthese Gegenstand verschiedener Arbeiten: es handelt
sich um die Bioumwandlung von Glycerin in 1,3-Propandiol durch bestimmte
Bakterienstämme
wie Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Klebsiella, Lactobacillus
und Pelobacter.
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Insbesondere
die Umwandlung von Glycerin in 1,3-Propandiol bei fakultativen anaeroben
Bakterien wie den Bakterien der Gattung Klebsiella, der Gattung
Citrobacter oder auch Enterobacter agglomerans wurde untersucht.
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So
wurden Klonierungsversuche mit Genen unternommen, die für Enzyme
codieren, welche für
die Umwandlung von Glycerin in 1,3-Propandiol verantwortlich sind,
ausgehend von dem Bakterium Klebsiella pneumoniae, unternommen.
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Die
Klonierung der Gene, die für
zwei Enzyme codieren, wurde besonders untersucht, nämlich für Glycerindehydratase,
die die Umwandlung von Glycerin in 3-Hydroxypropionaldehyd katalysiert,
und für
eine 1,3-Propandioldehydrogenase, die die Umwandlung von Glycerin
in 3-Hydroxypropionaldehyd, dann in 1,3-Propandiol katalysiert.
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Die
US-Patente 5,633,362 und 5,821,092 beschrieben die Klonierung eines
Genomfragments mit etwa 35 kb des Bakteriums Klebsiella pneumoniae,
wobei dieses DNA-Fragment
eine Sequenz enthält,
die für eine
aktive Dioldehydratase codiert. Ein derartiges Genomfragment wurde
durch Durchmusterung verschiedener Banken von Cosmiden der Bakterienarten
Klebsiella pneumoniae und Klebsiella aerogenes erhalten.
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In
diesen Patenten wurde beschrieben, dass die Stämme von E. coli DH5α mit diesen
Cosmiden transformiert wurden und die transformierten Bakterien
auf ihrer Fähigkeit,
Glycerin in 1,3-Propandiol umzuwandeln, durchgemustert wurden. Es
wurde eine schwache Produktion von 1,3-Propandiol bei bestimmten
transformierten Bakterienklonen beobachtet. Daraus wurde abgeleitet,
dass die Dioldehydratase, die durch die ausgewählten Cosmide codiert wird,
für die
beobachtete Umwandlung von Glycerin in l,3-Propandiol verantwortlich
sein könnte.
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Dennoch
benötigt
die Produkt von 1,3-Propandiol durch die Stämme von E. coli DH5α, die durch
die ausgewählten
Cosmide transformiert sind, obligatorisch das Vorliegen von Vitamin
B12 oder eines seiner Vorläufer
in dem Bakterienkulturmedium.
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Darüber hinaus
war die Fermentationsdauer, die für die Detektion einer Produktion
von 1,3-Propandiol notwendig war, sehr lang (78 bis 132 Stunden),
und der Produktionslevel des 1,3-Propandiols war sehr schwach.
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Das
US-Patent Nr. 5,686,276 von DU PONT DE NEMOURS & COMPANY beschreibt ein Verfahren, das
die Biokonversion von D-Glucose in 1,3-Propandiol durch einen E.
coli-Stamm ermöglicht,
welcher durch die Cosmid-DNA aus Klebsiella pneumoniae transformiert
worden war. Auch hier erfordert die Produktion von 1,3-Propandiol
die Verwendung von Kulturmedien, die an Zellen von E. coli angepasst
wurden, welche durch ein Cosmid von Klebsiella pneumoniae transformiert
wurde, wobei sie das Vitamin B12 beispielsweise in einer Konzentration
von 800 μg/ml
enthalten.
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Die
beobachteten Produktionslevel für
1,3-Propandiol waren sehr schwach, nämlich in der Größenordnung
von 0,5 g/l bis 10 g/l.
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Das
Vorliegen von Vitamin B12 im Kulturmedium der Zellen, die mit der
DNA von Klebsiella pneumoniae transformiert waren, gemäß den oben
genannten US-Patenten ist aufgrund der Tatsache obligatorisch, dass
das Co-Enzym B12 ein Co-Faktor ist, der für die katalytische Aktivität der Glycerindehydratase
von Klebsiella pneumoniae erforderlich ist.
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Das
Co-Enzym B12 oder einer seiner Vorläufer, wie z.B. Vitamin B12,
ist eine Verbindung, die übermäßig teuer
und wenig stabil ist, was die Umstellung der Verfahren der Umwandlung
von Glucose oder Glycerin in 1,3-Propandiol durch bakterielle Fermentation
mit Hilfe solcher Stämme
auf den industriellen Maßstab schwierig,
sogar unmöglich
macht.
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Außerdem passieren
das Co-Enzym B12 und seine Vorläufer
die Membranwände
bestimmter Mikroorganismen, z.B. der Hefen, nur schwer, was das
Vorliegen sehr hoher Konzentrationen dieser Verbindungen im Kulturmedium
notwendig macht, damit sie für
die intrazellulären
Enzyme, von denen Co-Enzym B12 der Co-Faktor ist, zugänglich sind.
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Darüber hinaus
würde eine
Alternative, die in der Einführung
der DNA, die für
die bekannten Glycerindehydratasen codiert, die in die Umwandlung
von Glycerin in 1,3-Propandiol eingreifen, in Bakterien, die Vitamin
B12 synthetisieren, besteht, auf beachtliche technische Hindernisse
treffen.
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In
der Tat synthetisieren einzelne bestimmte Bakterienarten natürlicher
Weise Vitamin B12, wie z.B. die Bakterien Pseudomonas oder auch
die Propionibakterien, deren Genetik sehr wenig bekannt ist und
die demnach wenig geeignet sind, genetischen Modifikationen unterworfen
zu werden.
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Andere
Bakterien, die natürlicher
Weise Vitamin B12 synthetisieren und deren Genetik besser bekannt ist,
z.B. Klebsiella pneumoniae, zeigen bedeutende Toxizitätsprobleme,
was sie für
eine Verwendung in der Industrie weniger geeignet macht.
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Außer diesem
ersten Nachteil konnte nur eine schwache Produktion an 1,3-Propandiol
nach Transformation von Klebsiella pneumoniae erhalten werden. So
beschreibt die PCT-Anmeldung WO 98/21339 rekombinante Klebsiella
pneumoniae, die gleichzeitig die Gene des Metabolismus von Glucose
in Glycerin und die Gene des Metabolismus von Glycerin in 1,3-Propandiol
exprimieren. Die Produktion von 1,3-Propandiol, die aus Glucose
beobachtet wurde, war schwach, in der Größenordnung von 10 g/l.
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Die
oben genannten technischen Hindernisse bei der Entwicklung eines
Verfahrens der Bioumwandlung einer kohlenstoffhaltigen Substanz
in 1,3-Propandiol wurden durch die vorliegende Erfindung überwunden.
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Die
Anmelderin hat in der Tat eine Nucleinsäure isoliert und charakterisiert,
die für
eine Glycerindehydratase codiert, deren katalytische Aktivität vom Vorliegen
von Co-Enzym B12 oder einem seiner Vorläufer unabhängig ist.
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Die
Gene, die für
die Glycerindehydratase codieren, die von Co-Enzym B12 unabhängig ist,
wurden von der Anmelderin aus dem Genom des Bakteriums Clostridium
butyricum VPI 1718 isoliert. Sie codieren für ein dimeres Protein, das
aus zwei Proteinuntereinheiten, den Polypeptiden ORF11 und ORF12,
besteht.
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Gemäß der Erfindung
wurde gezeigt, dass die Sequenzen, die für die Polypeptide ORF11 und
ORF12 codieren, auf einem einzigen Operon im Genom vom Clostridium
butyricum lokalisiert sind, wobei das Operon stromabwärts der
Nucleotidsequenz, die für
die Untereinheit ORF12 codiert, eine Region enthält, die für eine 1,3-Propandioldehydrogenase
codiert.
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Das
Operon gemäß der Erfindung
umfasst vom 5'-Ende
zum 3-Ende einen Transkriptionspromotor, die Sequenz orf11 , die
für ORF11
codiert, die erste Untereinheit der Glycerindehydratase, die von
Co-Enzym B12 unabhängig
ist, die Sequenz orf12, die für
ORF12 codiert, die zweite Untereinheit der Glycerindehydratase,
und eine Sequenz dhaT, die für
eine neue 1,3-Propandioldehydrogenase (DHAT) codiert.
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So
sind die Nucleinsäuresequenzen,
die für
die zwei Proteinuntereinheiten der Glycerindehydratase und für die 1,3-Propandioldehydrogenase
codieren, Teil eines einzigen Operons, wobei die drei codierenden Sequenzen
durch eine einzige Promotorsequenz co-reguliert werden, welche an
der 5'-Seite der
Sequenz liegt, die für
die Untereinheit ORF11 codiert.
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Erfindungsgemäß wurde
außerdem
gezeigt, dass die Transformation einer Bakterienwirtszelle mit einer
Sequenz, die die Regionen enthält,
die für
ORF11, ORF12 bzw. DHAT codieren, der Art ist, dass sie der transformierten
Wirtszelle die Fähigkeit
verleiht, 1,3-Propandiol aus Glucose oder Glycerin in Abwesenheit
des Co-Enzyms B12 oder einer seiner Vorläufer zu produzieren, wenn diese
Sequenzen unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt
sind, der in dem Zellwirt, in der die Expression dieser Sequenzen
gesucht ist, funktionell ist.
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Die
Anmelderin hat auch gezeigt, dass die Transformation einer Bakterienwirtszelle,
die natürlicher Weise
1,3-Propandiol erzeugt, durch die Sequenzen, die für die zwei
Untereinheiten der Glycerindehydratase codieren, gemäß der Erfindung
der Art war, dass eine deutliche Erhöhung der Produktion von Propandiol
bei den erhaltenen rekombinanten bakteriellen Wirten induziert wurde.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des 1,3-Propandiols
aus einer kohlenstoffhaltigen Substanz, wobei das Verfahren wenigstens
eine Stufe der Kultur eines rekombinanten Mikroorganismus umfasst,
in den wenigstens eine Nucleinsäure
eingeführt
ist, die für
die zwei Untereinheiten einer Glycerindehydratase codiert, deren
katalytische Aktivität
vom Vorliegen von Co-Enzym B12 oder einem seiner Vorläufer unabhängig ist.
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Vorteilhafter
Weise stammt die Glycerindehydratase, deren katalytische Aktivität vom Vorliegen
des Co-Enzyms B12 unabhängig
ist, vom Bakterium Clostridium butyricum.
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Die
Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym B12 unabhängig ist, ist ein dimeres Protein,
das aus einem primären
Polypeptid, das wenigstens 50 % Identität der Aminosäuren mit
dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 6 hat, und aus einem zweiten
Polypeptid, das wenigstens 50 % Identität der Aminosäuren mit
dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 7 hat, besteht. In ganz vorteilhafter
Weise besteht die Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym B12 unabhängig ist,
aus einem ersten und einem zweiten Polypeptid mit wenigstens 60
%, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder auch 99 % Identität der Aminosäuren mit
dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 6 bzw. dem Polypeptid der
Sequenz SEQ ID NO: 7.
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Der "Prozentwert der Identität" der Nucleotide oder
Aminosäuren
zwischen zwei Sequenzen kann im Sinn der vorliegenden Erfindung
bestimmt werden, indem zwei Sequenzen, die in optimaler Weise angeordnet sind,
durch ein Vergleichsfenster verglichen werden.
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Der
Teil der Nucleotid- oder Peptid-Sequenz im Vergleichsfenster kann
somit Additionen oder Deletionen (z.B. "Gaps" bzw. "Lücken") im Vergleich zur Referenzsequenz (die diese
Additionen oder diese Deletionen nicht umfasst) enthalten, so dass
eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen erhalten wird.
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Der
Prozentwert der Identität
wird errechnet, indem die Zahl der Positionen bestimmt wird, in
denen eine identische Nucleotidbase oder Aminosäure für die zwei verglichenen Sequenzen
beobachtet wird und dann die Anzahl der Positionen, in denen es
Identität
zwischen den zwei Basen oder den zwei Aminosäuren gibt, durch die Gesamtzahl
der Positionen im Vergleichsfenster geteilt wird und dann das Resultat
mit 100 multipliziert wird, um den Prozentwert der Identität der Sequenzen
zu erhalten.
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Die
optimale Anordnung der Sequenzen für den Vergleich kann mittels
Computer durch bekannte Algorithmen durchgeführt werden (z.B. mit der Software
FASTA der Firma WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER
GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN).
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Beispielsweise
kann der Prozentwert der Sequenzidentität mit Hilfe der vorgenannten
Software FASTA errechnet werden, wobei ausschließlich die Defaut-Parameter
verwendet werden.
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Besonders
bevorzugt wird der Prozentwert der Identität der Nucleinsäuren oder
Aminosäuren
zwischen zwei Nucleinsäure-
oder Aminosäuresequenzen
mit Hilfe der Software BLAST (Version 2.06 vom September 1998) errechnet,
wobei ausschließlich
Defaut-Parameter
verwendet werden.
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Die
Unterschiede in den Aminosäuren,
die ein Polypeptid gemäß der Erfindung
bezüglich
der Referenz-Aminosäuresequenz
enthalten kann, wie sie in dem am Ende der vorliegenden Beschreibung
präsentierten
Sequenzprotokoll definiert ist, kann in Substitutionen, Deletionen
oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäuren, die fortlaufend sind
oder nicht, resultieren.
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Nach
einem anderen Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst der
rekombinante Organismus außerdem
eine Nucleinsäure,
die für
eine 1,3-Propandioldehydrogenase, vorzugsweise eine 1,3-Propandioldehydrogenase
von Clostridium butyricum codiert.
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In
bevorzugter Weise ist die 1,3-Propandioldehydrogenase ein Polypeptid,
das wenigstens 90 % Identität
der Aminosäuren
mit dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 8 hat.
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In
ganz vorteilhafter Weise betrifft die Erfindung auch ein Polypeptid,
das wenigstens 95 %, 97 %, 98 % oder 99 % Identität der Aminosäuren mit
dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 8 hat.
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Ein
wesentliches Charakteristikum des Verfahrens gemäß der Erfindung ist, dass die
Stufe der Kultur des rekombinanten Mikroorganismus in Abwesenheit
von Co-Enzym B12 oder einem seiner Vorläufer durchgeführt wird.
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Nach
noch einem anderen Aspekt ist das Verfahren außerdem dadurch gekennzeichnet,
dass die Kohlenstoffquelle unter den Osiden und den Polyolen ausgewählt ist.
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Das
Osid kann z.B. Glucose sein.
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Das
Polyol kann z.B. Glycerin sein.
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Vorzugsweise
wird das Verfahren gemäß der Erfindung
mit einem Mikroorganismus durchgeführt, der unter den Mikroorganismen
ausgewählt
wird, die natürlicherweise
kein Co-Enzym B12 oder einen seiner Vorläufer produzieren.
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Ein
solcher Mikroorganismus kann ein Bakterium sein, das zur Gattung
Clostridium oder Escherichia gehört.
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Es
kann sich auch um eine Hefe der Art Saccharomyces cerevisiae handeln.
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Nach
einer besonderen Ausführungsform
ist das Verfahren außerdem
dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Mikroorganismus auch
Nucleinsäuren
enthält,
die für
eine Glycerin-3-phosphatdehydrogenase bzw. eine Glycerin-3-phosphatase
codieren, wobei in diesem Fall der rekornbinante Mikroorganismus
fähig ist,
eine kohlenstoffhaltige Quelle wie Glucose in hoher Ausbeute in
1,3-Propandiol umzuwandeln.
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Gegenstand
der Erfindung ist außerdem
eine Nucleinsäure,
umfassend wenigstens 30 fortlaufende Nucleotide eines Polynucleotids,
das für
wenigstens eine Untereinheit einer Glycerindehydratase codiert,
deren katalytische Aktivität
vom Vorliegen von Co-Enzym B12 oder einem seiner Vorläufer unabhängig ist,
wobei die Nucleinsäure
ein Polynucleotid ganz oder teilweise umfasst, das wenigstens 50
% Identität
der Nucleotide mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder
SEQ ID NO: 2 hat.
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Vorzugsweise
präsentiert
sich eine Nucleinsäure
gemäß der Erfindung
in gereinigter oder isolierter Form.
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Ein
Polynucleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu den Polynucleotiden der
Sequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 ist, bildet ebenfalls einen
Gegenstand der Erfindung.
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Teil
der Erfindung sind auch Nucleinsäuren,
die ein Polynucleotid ganz oder teilweise umfassen, das wenigstens
60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % oder
auch 99,8 % Identität
der Nucleotide mit der Nucleotidsequenz einer der Nucleinsäuren, deren
Sequenzen in der vorliegenden Beschreibung definiert sind, oder
einer Nucleinsäure
mit komplementärer
Sequenz besitzen.
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Der
Ausdruck "isoliert" bezeichnet im Sinn
der vorliegenden Erfindung ein biologisches Material, das seiner
ursprünglichen
Umgebung entzogen wurde (die Umgebung, in der es sich natürlicherweise
befindet).
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Beispielsweise
ist ein Polynucleotid, das sich im natürlichen Zustand in einer Pflanze
oder einem Tier befindet, nicht isoliert.
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Dasselbe
Polynucleotid, das von benachbarten Nucleinsäuren, innerhalb derer es natürlicherweise
im Genom der Pflanze oder des Tiers insertiert ist, abgetrennt ist,
ist isoliert.
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Ein
solches Polynucleotid kann in einem Vektor enthalten sein und/oder
ein solches Polynucleotid kann in einer Zusammensetzung enthalten
sein und bleibt dennoch aufgrund der Tatsache, dass der Vektor oder
die Zusammensetzung nicht seine natürliche Umgebung bildet, isoliert.
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Der
Ausdruck "gereinigt" verlangt nicht,
dass das Material in Form mit absoluter Reinheit ohne Vorliegen
anderer Verbindungen vorliegt. Es handelt sich vielmehr um eine
relative Definition.
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Ein
Polynucleotid ist in einem gereinigten Zustand nach Aufreinigung
des Ausgangsmaterials oder des natürlichen Materials um wenigstens
eine Größenordnung,
vorzugsweise um zwei oder drei Größenordnungen und bevorzugter
vier oder fünf
Größenordnungen.
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Zum
Zweck der vorliegenden Beschreibung kann der Ausdruck "Nucleotidsequenz" verwendet werden,
um unterschiedslos ein Polynucleotid oder eine Nucleinsäure zu bezeichnen.
Der Ausdruck "Nucleotidsequenz" umfasst das genetische
Material selbst und ist demnach nicht auf die Information, die seine
Sequenz betrifft, beschränkt.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf eine Nucleinsäure, die für die zwei Proteinuntereinheiten
der Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym B12 unabhängig ist,
aus Clostridium butyricum codiert.
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Vorzugsweise
ist eine solche Nucleinsäure
dadurch gekennzeichnet, dass sie ein erstes Polynucleotid, das wenigstens
50 % Identität
der Nucleotide mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 1 hat,
und ein zweites Polynucleotid, das wenigstens 50 % Identität der Nucleotide
mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 2 hat, umfasst.
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Nach
einer besonderen Ausführungsform
wird eine solche Nucleinsäure,
die für
die zwei Proteinuntereinheiten der Glycerindehydratase, welche vom
Co-Enzym B12 unabhängig ist,
codiert, außerdem
eine Sequenz mit Promotorfunktion enthalten, die in der Wirtszelle
funktionell ist, in der die Expression der Nucleotide, die für die zwei
Untereinheiten dieses Enzyms codieren, untersucht wird.
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Eine
solche Promotor-Nucleotidsequenz der Transkription kann die Promotorsequenz
SEQ ID NO: 3 oder eine Sequenz, die wenigstens 80 % Identität der Nucleotide
mit dieser letztgenannten hat, sein.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch eine bakterielle Nucleinsäure mit Promotorfunktion, insbesondere bei
Clostridium butyricum, die ein Polynucleotid, das wenigstens 80
% Identität
der Nucleotide mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 hat, oder ein Polynucleotid
mit komplementärer
Sequenz enthält.
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Wie
bereits weiter oben erwähnt
wurde, erlaubt eine einzige Operon-Organisation bei dem Bakterium Clostridium
butyricum die Synthese eines Transkriptionsproduktes (Messenger-RNA),
das gleichzeitig die Sequenzen, die für die zwei Proteinuntereinheiten
der Glycerindehydratase, die von Co-Enzym B12 unabhängig ist,
die die Transformation von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd (3-HPA)
katalysiert, und der 1,3-Propandioldehydrogenase (DHAT), die die
Transformation von 3-HPA in 1,3-Propandiol katalysiert, codieren,
umfasst.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid
ganz oder teilweise, das für
eine 1,3-Propandioldehydrogenase codiert, das wenigstens 90 % Identität der Nucleotide
mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 4 hat, oder eine komplementäre Polynucleotidsequenz
umfasst.
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In
einer besonderen Ausführungsform
einer gereinigten oder isolierten Nucleinsäure gemäß der Erfindung kann es vorteilhaft
sein, in dieselbe Sequenz die Nucleinsäuren einzuschließen, die
für die
zwei Proteinuntereinheiten der Glycerindehydrogenase und für die 1,3-Propandioldehydrogenase
codieren, wobei eine solche Nucleinsäure demnach für die zwei
Enzyme codiert, die fähig
sind, die Gesamtheit der Stufen der Bioumwandlung von Glycerin in
1,3-Propandiol zu katalysieren.
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Als
Folge betrifft die Erfindung auch eine Nucleinsäure, die vom 5'-Ende zum 3'-Ende umfasst:
- a) eine erste Nucleinsäure, die dadurch gekennzeichnet
ist, dass sie ein erstes Polynucleotid, das wenigstens 50 % Identität der Nucleotide
mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 1 hat, und ein zweites Polynucleotid,
das wenigstens 50 % Identität
der Nucleotide mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 2 hat,
umfasst;
- b) eine zweite Nucleinsäure,
die ein Polynucleotid, das für
eine 1,3-Propandioldehydrogenase codiert, das wenigstens 90 % Identität der Nucleotide
mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 4 hat, umfasst.
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Die
Nucleotidsequenzen, die für
die Glycerindehydratase und die 1,3-Propandioldehydrogenase codieren
und die oben beschriebene Nucleinsäure enthalten, können vorteilhafter
Weise unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz, wie
z.B. der Sequenz SEQ ID NO: 3, oder jeder anderen Promotorsequenz,
die in der Wirtszelle funktionell ist, in der ihre Expression gesucht
ist, gestellt werden.
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Eine
Nucleinsäure,
die der oben gegebenen Definition entspricht, ist z.B. das Polynucleotid
der Sequenz SEQ ID NO: 5 oder auch ein Polynucleotid, das wenigstens
50 % Identität
der Nucleotide mit dem Polynucleotid der Sequenz SEQ ID NO: 5 hat.
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Die
Nucleinsäure
der Sequenz SEQ ID NO: 5 umfasst die folgenden charakteristischen
funktionellen Elemente:
- a) einen Transkriptionsterminator
einer codierenden Region, die stromaufwärts des Operons 1,3-Propandiol
in Genom von Clostridium butyricum lokalisiert ist.
Dieses
Transkriptionsterminationsmotiv besitzt eine Haarnadelstruktur,
die auf das Nucleotid in Position 27 der Sequenz SEQ ID NO: 5 zentriert
ist (ΔG
= –25,2
kcal/mol), die einen 19 bp-Stab umfasst, wobei die zwei Stränge des
Stabes aus den Nucleotiden der Positionen 5 bis 23 bzw. den Nucleotiden
der Positionen 30 bis 48 der Sequenz SEQ ID NO: 5 bestehen, wobei
die Schleife der Haarnadelstruktur durch die Nucleotide in Positionen
24 bis 29 der Sequenz SEQ ID NO: 25 gebildet wird.
Auf dieses
Transkriptionsterminationsmotiv folgt die Sequenz ATTTT.
- b) Promotor des 1,3-Propandiol-Operons
Der Promotor des
1,3-Propandiol-Operons ist vom Nucleotid in Position 100 bis zum
Nucleotid in Position 200 der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert.
Dieser
Promotor umfasst eine Box (–35)
der Sequenz TAGATA, die vom Nucleotid in Position 142 bis zum Nucleotid
in Position 147 der Sequenz SEQ ID NO: 5 reicht. Dieser Promotor
umfasst auch eine Box (–10) der
Sequenz TATTAT, die vom Nucleotid in Position 164 zum Nucleotid
in Position 169 der Sequenz SEQ ID NO: 5 reicht, wobei der Abstand
zwischen den Boxen –30
und den Boxen –10
16 bp ist.
- c) orf11 (Sequenz, die für
die erste Untereinheit der Glycerindehydrogenase codiert).
Es
handelt sich um ein einziges offenes Leseraster mit 2.361 bp, die
für das
Polypeptid ORF11 mit 787 Aminosäuren
der Sequenz SEQ ID NO: 6 codieren.
Das Initiationscodon ATG
ist von Nucleotid in Position 313 bis Nucleotid in Position 315
in der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert. Das offene Leseraster wird
durch ein Stopp-Codon der Sequenz TAA terminiert, das vom Nucleotid
in Position 2674 bis zum Nucleotid in Position 2676 der Sequenz
SEQ ID NO: 5 lokalisiert ist.
Außerdem geht dem Initiationscodon
eine Fixierungsstelle am Ribosom mit der Sequenz GAGGAG voraus und
ist vom Nucleotid in Position 302 bis zum Nucleotid in Position
307 der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert.
- d) orf12 (Sequenz, die für
die zweite Untereinheit der Glycerindehydrogenase codiert)
Es
handelt sich um ein einziges offenes Leseraster mit 912 bp, die
für ein
Polypeptid mit 304 Aminosäuren der
Sequenz SEQ ID NO: 7 codieren. Das Initiationscodon der Sequenz
ATG ist vom Nucleotid in Position 2704 bis zum Nucleotid in Position
2706 der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert. Das offene Leseraster
wird durch ein Stoppcodon der Sequenz TAA vollendet, das sich zwischen
dem Nucleotid in Position 3616 und dem Nucleotid in Position 3618
der Sequenz SEQ ID NO: 5 befindet.
Außerdem geht eine Fixierungsstelle
des Ribosoms mit der Sequenz AAGGGGA dem Initiationscodon voraus
und befindet sich von Nucleotid in Position 2689 bis zum Nucleotid
in Position 2695 der Sequenz SEQ ID NO: 5.
- e) dhat (Sequenz, die für
die 1,3-Propandioldehydrogenase codiert}.
Es handelt sich um
ein einziges offenes Leseraster mit 1155 bp, das für ein Polypeptid
mit 385 Aminosäuren der
Sequenz SEQ ID NO: 8 codiert.
Das Initiationscodon der Sequenz
ATG ist vom Nucleotid in Position 3678 bis zum Nucleotid in Position 3680
der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert.
Das offene Leseraster
wird durch ein Stopp-Codon der Sequenz TAA beendet, das vom Nucleotid
in Position 4833 bis zum Nucleotid in Position 4835 der Sequenz
SEQ ID NO: 5 lokalisiert ist.
Außerdem geht eine Fixierungsstelle
des Ribosoms mit der Sequenz AGGAGA dem Initiationscodon voraus
und ist vom Nucleotid in Position 3663 bis zum Nucleotid in Position
3668 der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert.
- f) Terminator der Transkription des l,3-Propandiol-Operons.
Der
Terminator der Transkription des 1,3-Propandiol-Operons besitzt
eine Haarnadelstruktur, die auf das Nucleotid in Position 4933 der
Sequenz SEQ ID NO: 5 konzentriert ist (ΔG = –27,4 kcal/mol) und umfasst einen
Stab mit 22 bp, der aus den Nucleotiden in Positionen 4909 bis 4930
der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert sind, bzw. den Nucleotiden,
die in der Position 4936 bis 4957 der Sequenz SEQ ID NO: 5 lokalisiert
sind.
-
Die
Schleife der Haarnadelstruktur besteht aus der Sequenz, die vom
Nucleotid in Position 4931 zum Nucleotid in Position 4935 der Sequenz
SEQ ID NO: 5 geht.
-
Auf
die Haarnadelstruktur folgt die Sequenz TATTTTAATT.
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Jede
der funktionellen Sequenzen, die im 1,3-Propandiol-Operon der Sequenz
SEQ ID NO: 5, wie sie oben beschrieben ist, enthalten ist, kann
einzeln verwendet werden, z.B. durch Insertion in einen Klonierungs- und/oder
Expressionsvektor, wenn es sich um eine der Regionen handelt, die
für ein
Polypeptid der Erfindung oder auch eine regulatorische Region (Transkriptionspromotor
oder Transkriptionsterminator) codieren.
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Solche
Nucleotidsequenzen von Interesse können nach Techniken erhalten
werden, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. Verwendung von Restriktionsenzymen,
deren Verwendung detailliert in dem Werk von SAMBROOK et al. (1989)
beschrieben ist, oder auch durch selektive Amplifikation der Zielsequenz
von Interesse, z.B. durch PCR, erhalten werden.
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Teil
der Erfindung sind auch die Nucleinsäuren, die unter Hybridisierungsbedingungen
starker Stringenz mit einer Nucleinsäure hybridisieren, die unter
den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 5 ausgewählt ist.
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Unter "Hybridisierungsbedingungen
mit starker Stringenz" versteht
man im Sinne der vorliegenden Erfindung die folgenden Hybridisierungsbedingungen:
- – Vorhybridisierung
der Filter während
8 Stunden bei 65°C
in einem Puffer, der aus 6 × SSC,
50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02 % FICOLL, 0,02
% SAB und 500 μg/ml
denaturierter Lachssperma-DNA besteht;
- – Hybridisierung
der Filter während
48 Stunden bei 65°C
in Gegenwart von Puffer 1 × SSC,
der 0,15 M NaCl und 0,05 M Natriumcitrat entspricht;
- – dreimaliges
Waschen der Filter in einer Lösung,
die 2 × SSC-Puffer
und 0,1 % SDS enthält,
bei 68°C
während
15'.
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Die
oben definierten Bedingungen starker Stringenz sind für die Hybridisierung
eines Nucleinsäuremoleküls einer
Länge von
20 Nucleotiden angepasst.
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Es
ist selbstverständlich,
dass diese Hybridisierungsbedingungen als Funktion der Länge der
Nucleinsäure,
deren Hybridisierung gesucht wird, nach Techniken, die dem Fachmann
gut bekannt sind, angepasst werden müssen.
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Die
zweckmäßigen Hybridisierungsbedingungen
können
z.B. nach der Lehre angepasst werden, die in dem Werk von HAMES & HIGGINS (1985)
oder auch in dem Werk von SAMBROOK et al. (1989) enthalten ist.
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Teil
der Erfindung sind auch die Nucleinsäuren, die wenigstens 20 fortlaufende
Nucleotide eines Polynucleotids umfassen, das unter den Nucleotidsequenzen
SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 5 ausgewählt ist.
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Solche
Nucleinsäuren
umfassen vorteilhafter Weise 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200
bis 250, 300, 400, 500 aufeinanderfolgende Nucleotide eines Polynucleotids,
das unter den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 5 ausgewählt ist.
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Solche
Nucleinsäuren
können
z.B. 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 oder 500
fortlaufende Nucleotide eines Polynucleotids umfassen, das unter
den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 5 ausgewählt ist.
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Solche
Nucleinsäuren
können
besonders als Nucleotidsonden oder Nucleotidprimer nützlich sein,
um das Vorliegen von einer der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO:
1 bis SEQ ID NO: 5 in einer Probe zu detektieren.
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Solche
Nucleotidsonden oder -primer können
besonders nützlich
sein, um die Expression irgendeines der Transkriptionsprodukte der
codierenden Regionen orf11, orf12 oder dhat nach Techniken, die
dem Fachmann gut bekannt sind, zu messen.
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Um
auch die Kapazität
der Zellwirte, die mit einer Nucleinsäure gemäß der Erfindung transformiert sind,
1,3-Propandiol aus Glucose zu produzieren, zu verbessern, kann ein
solcher rekombinanter Zellwirt außerdem mit einem oder mehreren
Genen transformiert werden, das/die für ein oder mehrere Enzyme codieren, die
geeignet sind, die Transformation von Glucose in Glycerin zu katalysieren.
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Ein
Enzympaar, das fähig
ist, die Transformation der Glucose in Glycerin durchzuführen, ist
z.B. eine Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und eine Glycerin-3-phosphatase.
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So
kann eine Nucleinsäure
gemäß der Erfindung
außer
den Sequenzen, die für
die Glycerindehydratase, welche vom Co-Enzym B12 unabhängig ist,
bzw. die 1,3-Propandioldehydrogenase (dhaT) codieren, eine dritte
Nucleinsäure,
die für
eine Glycerin-3- phosphatdehydrogenase
codiert, und eine vierte Nucleinsäure, die für eine Glycerin-3-phosphatase codiert,
umfassen.
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Es
können
insbesondere eine Nucleinsäure,
die für
die gpd1-Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, und eine vierte
Nucleinsäure,
die für
die gpp2-Glycerin-3-phosphatase codiert, eingesetzt werden.
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Die
gpd1 wird z.B. in LARSSON et al. (1993). Mol. Microbiol., 10, 1101-1111
beschrieben.
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Die
gpd2 wird z.B. in HIRAYAMA et al. (1995). Mol. Gen. Genet., 249,
127-138 beschrieben.
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Nach
noch einem weiteren anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen
rekombinanten Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, der eine
Nucleinsäure
gemäß der Erfindung
umfasst, die für
eine Glycerindehydratase, welche von Co-Enzym B12 unabhängig ist,
oder eine 1,3-Propandioldehydrogenase codiert.
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Ein
solcher rekombinanter Vektor wird vorteilhafter Weise eine konstitutive
oder induzierbare Promotorsequenz, die fähig ist, die Expression der
Glycerindehydratase, die von Coenzym B12 unabhängig ist, und/oder der 1,3-Propandioldehydrogenase
zu steuern, und einen Rho-unabhängigen
Transkriptionsterminator umfassen.
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Es
kann sich z.B. um einen Schaukelvektor handeln, der fähig ist,
sich in verschiedenen Zellwirten zu replizieren.
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Ein
erster bevorzugter rekombinanter Vektor gemäß der Erfindung ist das Plasmid
pSPD5, das im Stamm Escherichia coli enthalten ist, welcher bei
der Collection National de Cultures de Microorganismes (CNCM) am
24. Juni 1999 unter der Eingangsnummer I-2243 hinterlegt wurde.
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Andere
bevorzugte Vektoren gemäß der Erfindung
sind z.B. die folgenden:
- • Die Vektoren pTPG(–) und pOPG,
die in den 3 und 4 dargestellt
sind;
- • die
Vektoren pSGD und pPPF2, die in den 5 und 6 dargestellt
sind;
- • Vektoren,
die das Replikon des pCB101 besitzen, z.B. der Vektor pCTC511 (WILLIAMS
et al., 1990) oder auch der Vektor pSYSL2 (LEE et al., 1992);
- • ein
Schaukelvektor, der das Replikon pAMß1 von Enterococcus faecalis
DS-5 trägt,
wie der Vektor pCTC41 (WILLIAMS et al., 1990);
- • die
Schaukelvektoren E. coli B. subtilis/C. acetobutylicum, bezeichnet
als pKNT11 und pKNT14 (Truffaut et al., 1989).
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Die
Erfindung betrifft auch eine rekombinante Wirtszelle, die eine Nucleinsäure oder
einen rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung
umfasst.
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Eine
solche rekombinante Wirtszelle umfasst vorteilhafter Weise eine
Nucleinsäure,
die für
die Glycerindehydratase, die von Co-Enzym B12 unabhängig ist,
codiert, oder auch einen Vektor, der eine solche Nucleinsäure enthält.
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Vorteilhafterweise
wird eine solche rekombinante Wirtszelle eine Nucleinsäure enthalten,
die gleichzeitig für
die zwei Proteinuntereinheiten der Glycerindehydratase, die von
Co-Enzym B12 unabhängig ist,
sowie für
DHAT codiert.
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Es
kann sich gleichermaßen
um ein Bakterium, einen Pilz oder eine Hefe handeln.
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Eine
rekombinante Bakterienwirtszelle wird vorzugsweise unter Escherichia
coli, Clostridium oder auch Bacillus, Lactobacillus und Lactococcus
ausgewählt.
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Eine
rekombinante Hefezelle gemäß der Erfindung
wird vorzugsweise vom Stamm Saccharomyces cerevisiae sein.
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Eine
bevorzugte rekombinante Wirtszelle gemäß der Erfindung ist der Stamm
von Escherichia coli, der bei der Collection Nationale de Cultures
de Microorganismes (CNCM) am 24. Juni 1999 unter der Eingangsnummer
I-2243 hinterlegt wurde.
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Gegenstand
der Erfindung sind auch die Polypeptide, die die eine oder die andere
der zwei Proteinbestandteilsuntereinheiten der dimeren Glycerindehydratase,
die vom Co-Enzym B12 unabhängig
ist, gemäß der Erfindung
bilden.
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Vorzugsweise
präsentiert
sich ein Polypeptid gemäß der Erfindung
in einer isolierten oder gereinigten Form.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf ein Polypeptid, das das Enzym 1,3-Popandioldehydrogenase
von Clostridium butyricum bildet.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz
ganz oder teilweise umfasst, die wenigstens 50 % Identität der Aminosäuren mit
der Sequenz SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 hat.
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Die
Erfindung betrifft auch ein dimeres Protein, bestehend aus einem
ersten Polypeptid, das wenigstens 50 % Identität der Aminosäuren mit
dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 6 hat, und einem zweiten Polypeptid,
das wenigstens 50 % Identität
der Aminosäuren
mit dem Polypeptid der Sequenz SEQ ID NO: 7 hat.
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In
ganz bevorzugter Art weist ein solches Polypeptid eine katalytische
Glycerindehydratase-Aktivität auf,
die kein Vorliegen von Co-Enzym B12 erfordert, wobei eine solche
katalytische Aktivität
gemäß den Beispielen
gemessen werden kann.
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht in einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz
ganz oder teilweise umfasst, die wenigstens 80 % Identität der Aminosäuren mit
der Sequenz SEQ ID NO: 8 hat.
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In
besonders bevorzugter Weise weist ein solches Polypeptid katalytische
Aktivität
von 1,3-Propandioldehydrogenase auf.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids
gemäß der Erfindung,
dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst:
- a) Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors
gemäß der Erfindung;
- b) Einführung
des rekombinanten Expressionsvektors der Stufe a) in eine geeignete
Wirtszelle;
- c) Kultur der rekombinanten Wirtszelle der Stufe b) in einem
geeigneten Kulturmedium;
- d) Gewinnung des produzierten rekombinanten Polypeptids im Kulturüberstand
oder im Zelllysat;
- e) gegebenenfalls Reinigung des gewonnenen Polypeptids.
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Die
Polypeptide gemäß der Erfindung
können
z.B. durch Leiten über
eine Chromatographiesäule
mit Nickel- oder Kupferionen-Affinität gereinigt werden.
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Diese
Polypeptide können
außerdem
durch ihre enzymatische Glycerindehydratase- oder 1,3-Propandioldehydrogenase-Aktivität charakterisiert
werden, wie dies in den Beispielen angegeben wird.
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Die
Polypeptide gemäß der Erfindung
können
auch z.B. durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie, z.B.
HPLC-Umkehrphasenchromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie
gereinigt werden.
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Teil
der Erfindung sind auch die Polypeptide, die Modifikationen von
Aminosäuren
umfassen, welche von 1, 2, 3, 4, 5, 10 bis 20 Substitutionen, Additionen
oder Deletionen einer Aminosäure
bezüglich
der Sequenz der einen oder der anderen der zwei Proteinuntereinheiten
der Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym B12 unabhängig ist,
oder der 1,3-Propandioldehydrogenase reichen. In besonders bevorzugter
Weise induzieren die Modifikationen an Aminosäuren im Polypeptid der Erfindung
bezüglich
der Referenzpolypeptide keine bedeu tende Änderung ihrer biologischen
Aktivität.
So werden die Modifikationen in der Aminosäuresequenz der Proteinuntereinheiten
der Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym B12 unabhängig ist,
gemäß der Erfindung so
sein, dass die katalytische Aktivität wenigstens 50 % der katalytischen
Anfangsaktivität
beträgt
und wird vorzugsweise bezüglich
der katalytischen Anfangsaktivität
verbessert sein.
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Das
Gleiche gilt für
die Aminosäuremodifikationen
in der Proteinsequenz der 1,3-Propandioldehydrogenase gemäß der Erfindung.
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Ein
beliebiges der Polypeptide gemäß der Erfindung
oder auch ein Peptidfragment dieser können in spezifischer Weise
für die
Herstellung von Antikörpern,
das spezifisch gegen dieses gerichtet ist, eingesetzt werden.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein Polypeptid, das wenigstens
20 aufeinanderfolgende Aminosäuren
einer Sequenz von Aminosäuren
umfasst, die unter den Sequenzen SEQ ID NO: 6 bis SEQ ID NO: 8 ausgewählt ist.
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Vorteilhafterweise
wird ein derartiges Polypeptid 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 bis
100, 125, 150 oder 200 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines
Polypeptids enthalten, das unter den Sequenzen SEQ ID NO: 6 bis
SEQ ID NO: 8 ausgewählt
ist.
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Vorzugsweise
wird ein derartiges Polypeptid 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70,
80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 oder 300 aufeinanderfolgende
Aminosäuren
eines Polypeptids enthalten, die aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 6 bis
SEQ ID NO: 8 ausgewählt
sind.
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Derartige
spezifische Antikörper
können
in Immundetektionstests verwendet werden, die es ermöglichen,
das Vorliegen einer Glycerindehydratase, die von Co-Enzym B12 unabhängig ist,
oder einer 1,3-Propandioldehydrogenase in einer Probe zu bestimmen.
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Ein
derartiger Immundetektionstest stellt eine Alternative zur Bestimmung
der Glycerindehydratase- oder 1,3-Propandioldehyrogenase-Aktivität in einer
Probe dar, von der angenommen wird, dass sie diese Enzyme enthält.
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Unter "Antikörper" versteht man im
Sinne der Erfindung die polyklonalen Antikörper, aber auch die monoklonalen
Antikörper,
wie sie aus Hybridomen gemäß der Technik
hergestellt werden, die von KOHLER & MILSTEIN (1975) beschrieben wurde.
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Antikörper im
Sinne der vorliegenden Erfindung bilden auch Fragmente von Antikörpern (Fab', F(ab')2 sowie
Fragmente von Einzelkettenantikörpern
Fv (US-Patent Nr. 4,946,778; MARTINEAU et al., (1998)) oder auch
humanisierte Antikörper
(REINMANN et al., 1997; LEGER et al., 1997).
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Die
Erfindung wird außerdem
durch die folgenden Figuren und die folgenden Beispiele erläutert, ohne sie
jedoch zu beschränken.
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1 stellt
ein Schema des metabolischen Wegs der Bioumwandlung von Glycerin
in 1,3-Propandiol beim Bakterium Clostridium butyricum dar.
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2 stellt
den Aufbau des Vektors pSPD5 dar.
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3 stellt
den Aufbau des Vektors pTPG(–)
dar.
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4 stellt
den Aufbau des Vektors pOPG dar.
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5 stellt
den Aufbau des Vektors pSGD dar.
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6 stellt
den Aufbau des Vektors pPPD2 dar.
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7 stellt
die Produktion von 1,3-Propandiol aus Glycerin durch den Clostridium
acetobutylicum-Stamm DG1 dar (pSPD5).
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8 stellt
die Produktion von 1,3-Propandiol aus Glycerin durch den Stamm E.
coli DH5α dar,
der mit dem Vektor pSPD5 transformiert ist und anaerob kultiviert
wird.
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9 stellt
die Produktion von 1,3-Propandiol aus Glycerin durch den nicht rekombinanten
Stamm Clostridium butyricum VPI 1718 dar.
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10 stellt
die Produktion von 1,3-Propandiol aus Glucose durch den Stamm C.
acetobutylicum DG1 [pSPD5] dar.
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MATERIALIEN UND VERFAHREN
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I. Kultur von Stämmen
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1. Verwendeter
Stamm
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Der
Clostridium butyricum-Stamm, aus dem die verschiedenen Nucleinsäuresequenzen
gemäß der Erfindung
isoliert und charakterisiert wurden, ist der Stamm VPI 1718.
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Der
Stamm von Clostridium acetobutylicum, der für die Transformation mit den
verschiedenen Vektoren, die in den Beispielen beschrieben werden,
verwendet wurde, ist der Stamm, der bei der American Type Culture
Collection unter der Eingangsnummer ATCC 824 verfügbar ist.
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Der
Escherichia coli DH5α-Stamm,
der für
die Transfektion mit den verschiedenen Plasmiden, die in den Beispielen
beschrieben werden, verwendet wurde, ist der Stamm, der von LIFE
TECHNOLOGIES Inc. verfügbar
ist.
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2. Plasmide
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Das
Plasmid pUC18 mit einer Größe von 2,7
kb ist von YANNISCH-PERRON et al. (1985) beschrieben.
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Das
Plasmid pIMPI mit einer Größe von 4,9
kb ist von MERMELSTEIN (1992) beschrieben.
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Das
Plasmid pSOS95 mit einer Größe von 7
kb ist von SOUCAILLE und PAPOUTSAKIS (1996) beschrieben.
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3. Kulturmedium
und -bedingungen
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Für die Kultur
des Escherichia coli-Stamms wird das LB-Medium (beschrieben von
SAMBROOK et al., 1989) mit Antibiotika supplementiert (Ampicillin
mit 100 μg/ml,
Erythromycin mit 300 μg/ml,
Chloramphenicol mit 35 μg/ml).
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Die
Kultur der Clostridium-Stämme,
insbesondere der Clostridium butyricum- oder der Clostridium acetobutylicum
DGI-Stämme,
transformiert mit dem Vektor pSPD5, wurde in dem folgenden Medium
durchgeführt,
dessen Zusammensetzung pro 1 Liter Kulturmedium angegeben ist:
| Hefeextrakt | 4
g |
| Glycerin | 60
g |
| KH2PO4 | 0,5
g |
| K2HPO4 | 0,5
g |
| MgSO4 | 0,2
g |
| NH4Cl | 1,5
g |
| FeSO4 | 10
mg |
| Biotin | 0,04
mg |
| para-Aminobenzoesäure | 8
mg |
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Der
pH wird durch Ammoniumzusatz auf 6 eingestellt, und die Wachstumstemperatur
ist 37°C.
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Clarithromycin
wird in einer Konzentration von 40 mg/l bei der Kultur des Stamms
C. acetobutylicum d61 (pSPP5) zugesetzt.
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II. Analysetechniken
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1. Analyse der Substrate
und der Produkte
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Die
Gesamtheit der Substrate (Glucose und Glycerin) und der Produkte
(Acetat, Butyrat, Lactat, 1,3-Propandiol) werden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) bestimmt.
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Das
HPLC-Gerät
(Pumpe Modell 5810, Waters) ist mit einem automatischen Probenwechsler
(SP 8775, Spectra Physic.), der eine Injektionsschleife mit 20 μl besitzt,
einem Rechner (Intersmat ICR 1B, Shimadzu) und einem Refraktometer
(HP 1047A) ausgestattet.
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Die
Trennung wird durch Durchleiten über
eine Ionenausschlusssäule
(Aminex R HPX-87H, 300 mm × 7,8
mm, Biorad) erreicht, die mit einer Vorsäule (Micro-Guard, Biorad),
welche mit demselben ionischen H+-Harz gefüllt ist,
ausgestattet ist.
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Die
mobile Phase besteht aus 0,031 mM Schwefelsäure, der Durchfluss ist 0,7
ml pro Minute, und die Trennung wird bei Umgebungstemperatur erreicht.
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2. Bestimmung der Aktivitäten
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a) Bestimmung der 1,3-Propandioldehydrogenase
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Die
Bestimmung der 1,3-Propandioldehydrogenase wurde in einem Volumen
von 1 ml des folgenden Reaktionsmediums durchgeführt:
| 1,3-Propandiol | 100
mM |
| NAD+ | 2
mM |
| DTT | 2
mM |
| (NH4)2SO4 | 30
mM |
| K2CO3 | 100
mM |
Zellextrakt, Analysen mit
5 μl, 10 μl, 50 μl, mit H
2O ergänzt
auf 1 ml
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Die
Reduktion des NAD+ wird durch Messung der
optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt.
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Der
Extinktionskoeffizient ε (NADH)
ist 6,22 mM–1 × cm–1.
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b) Bestimmung der Glycerindehydratase
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Die
Bestimmung der Glycerindehydratase wird an einem Zellextrakt durchgeführt, der
vorher durch eine Entsalzungssäule
geleitet wurde. Diese Bestimmung wird in einem Volumen von 1 ml
des folgenden Reaktionsmediums durchgeführt:
| KCl | 0,05
M |
| 1,2-Propandiol | 0,06
M |
| Puffer
KPO4, pH 7 | 0,035
M |
Zellextrakt, Analysen mit
5 μl, 10 μl, 20 μl, 30 μl, mit H
2O ergänzt
auf 1 ml
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Die
Reaktion wird nach 10 Minuten bei 37°C mittels 1 ml 100 mM Citratpuffer,
pH 3,6, und 500 μl
0,1 % MBTH gestoppt.
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Nach
15 Minuten bei 37°C
wird 1 ml Wasser zugesetzt und der Gehalt an gebildeten Propionaldehyd wird
durch Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von
305 nm bestimmt.
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Der
molare Extinktionskoeffizient für
das gebildete Produkt ist 13,3 × 103 M–1 × cm–1.
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c) Messung der Biomasse
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Das
Bakterienwachstum wird in Fraktionsaliquots, die zu bestimmten Zeiten
entnommen werden, durch Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von
620 nm bei ei nem Strahlengang von 1 cm verfolgt. Es wird angenommen,
dass eine Einheit der optischen Dichte etwa 3 × 108 Bakterien/ml
entspricht.
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III. Transformation der
Bakterien mit rekombinanten Vektoren gemäß der Erfindung
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III.1. Transformation
von E. coli DH5α
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Der
E. coli DH5α-Stamm
wird nach dem Protokoll, das von INOUE et al. (1990) entwickelt
wurde, kompetent gemacht. Dieses Protokoll erlaubt es, Transformationswirksamkeiten
in der Größenordnung
von 108 bis 109 Transformanten/mg
pUC18 zu erhalten. Die kompetent gemachten Zellen werden dann bei –80°C konserviert.
Die Transformation der kompetenten Zellen durch ein Plasmid wird
durch thermischen Schock durchgeführt (SAMBROOK et al., 1989).
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III.2. Transformation
von C. acetobutylicum
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Das
Plasmid zur Einführung
in C. acetobutylicum (ATCC 824 oder DG1) muss vorher auf der Ebene der
Stellen Cac8241 (= Bsof1) methyliert werden. Die in vivo-Methylierung
wird durchgeführt,
indem das zu methylierende Plasmid in den Stamm E. coli ER 2275
eingeführt
wird, der das Plasmid pAN1 trägt
(welches das Gen trägt,
das für
die Methylase des Phagen f3TI von Bacillus subtilis codiert). Die
Präparation
der Plasmid-DNA, die zum Transformieren von C. acetobutylicum verwendet
wird, muss sehr rein sein, durch Ultrazentrifugation an Cäsiumchloridgradienten
(SAMBROOK et al., 1989) gereinigt sein oder durch Verwendung des Quiafilter
Plasmid Midiprep (QIAGEN)-Kits gereinigt sein.
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Die
Transformationen werden unter strenger Anaerobiose nach dem folgenden
Protokoll, das an das von MEMMERLSTEIN (1992) angepasst ist, durchgeführt. Die
Wirksamkeiten sind noch sehr schwach, nämlich in der Größenordnung
von 102 Transformanten pro mg DNA.
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Ausgehend
von einer Vorkultur in CGM-Medium (10 ml) mit 37°C über Nacht wird mit 10 % 50
ml 2YTG-Medium inokuliert.
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Die
Kultur wird bei einer OD 600 von 1,0 bis 1,2 angehalten.
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Ab
diesem Zeitpunkt wird die Gesamtheit der Manipulationen unter der
Anaerobiehaube und in Eis durchgeführt.
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Die
Zellen werden 10 Minuten bei 4.000 g zentrifugiert.
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Der
Zellrückstand
wird in 10 ml Elektroporationspuffer gewaschen.
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Es
wird 10 Minuten mit 3.000 bis 4.000 g zentrifugiert.
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Die
Zellen werden in 500 ml Elektroporationspuffer resuspendiert.
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Die
Suspension der Zellen wird mit dem Plasmid (5 bis 10 mg Plasmid-DNA,
gelöst
in 5 bis 50 ml TE-Puffer), das vorher in die Elektroporationsküvette (0,4
cm Dicke) eingeführt
worden war, in Kontakt gebracht. Das Ganze wird im Eis konserviert.
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Das
Gemisch wird unverzüglich
einer elektrischen Entladung mit den folgenden Parametern V = 2500 V,
C = 25 mF und R Unendlich (BioRad Gene Pulser II und Gene Controller
II) unterworfen. Unter diesen Bedingungen variiert die angewendete
Entladungszeit von 7 bis 12 ms.
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Die
Zellen werden dann in 10 ml 2YTG-Puffer transferiert und bei 37°C bis zur
Wiederaufnahme des Metabolismus (Bildung von Kohlendioxid- und Wasserstoff-Bläschen) inkubiert.
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Die
Kultur wird dann zentrifugiert und der Zellrückstand wird in einem minimalen
Volumen desselben Mediums wieder aufgenommen. Die Suspension wird
dann auf RCA-Medium
mit Antibiotikum ausgebreitet. Zusammensetzung
des Elektroporationspuffers:
| Saccharose | 270
mM |
| Phosphatpuffer
(Na2HPO4/NaH2PO4), pH 7,4 | 3
mM |
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BEISPIEL 1: Konstruktion
des Expressionsvektors pSPD5
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Die
folgenden Nucleotidprimer wurden synthetisiert, um eine Nucleotidsequenz
zu amplifizieren, die gleichzeitig orf11, orf12 und dhaT enthält, d.h.
die Gesamtheit der Sequenzen enthält, die auf einmal für die zwei
Proteinuntereinheiten der Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym
B12 unabhängig
ist, und der 1,3-Propandioldehydrogenase von Clostridium butyricum
codieren.
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Der
Primer PDH3 (SEQ ID NO: 9) enthielt die BamHI-Stelle, die Ribosomenbindungsstelle
und den Anfang des orf11.
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Der
Primer PDH4 (SEQ ID NO: 10) hybridisiert mit dem komplementären Strang
und umfasst die SmaI-Stelle und das Ende des Gens dhaT.
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Eine
Amplifikationsreaktion mit den Primern pDH3 und pDH4 wurde mit genomischer
DNA von Clostridium butyricum bei den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- • Annealing-Temperatur
der Primer: 55°C;
- • Dauer
der Verlängerung:
4 Minuten;
- • Anzahl
der Zyklen: 15 Zyklen.
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Die
Amplifikationsreaktion wurde mit dem Expand Long Template PCR-Kit
(im Handel von Boehringer) durchgeführt.
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Mit
dieser Reaktion konnte ein Fragment mit der erwarteten Größe von 4,6
kb amplifiziert werden.
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Dieses
amplifizierte Fragment wurde an Agarosegel gereinigt, dann durch
die Enzyme BamHI und SmaI verdaut.
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Parallel
dazu wurden das Fragment BamHI-EheI mit 4970 bp des E. coli/C. acetobutylicum-Schaukelvektors
pSOS95 an Agarosegel gereinigt, dann mit dem PCR-Produkt mit 4,6
kb ligiert. Der so konstruierte rekombinante Vektor, pSPD5 genannt
(2), ermöglicht
die konstitutive Expression der Gene orf11, orfl2 und dhaT unter
der Kontrolle des Promotors des Gens der Thiolase von C. acetobutylicum.
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BEISPIEL 2: Konstruktion
der Expressionsvektoren pTPG(–)
und pOPG
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Die
Vektoren pTPG(–)
und pOPG sind Vektoren, die vom E. coli-Clostridium pTLH1-Schaukelvektor abgeleitet
sind (HARRIS et al., 1999), die es ermöglichen, in einer adäquaten Wirtszelle
die direkte Umwandlung der Glucose in 1,3-Propandiol durchzuführen. Im
Wesentlichen erlauben sie die Expression der Gene ora11, orf12 und
dhaT von C. butyricum (1,3-Propandiol-Operon) sowie die der Gene
GPD1 und GPD2 von S. cerevisae, die für die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase
bzw. die Glycerin-3-phosphatase codieren (künstliches Operon gly, getragen
vom Plasmid pS2 (GELIS et al., 1999), abgeleitet vom Plasmid pSOS95,
das bei E. coli und C. acetobutylicum die Umwandlung von Glucose
in Glycerin ermöglicht)
codieren. Diese zwei Plasmide unterscheiden sich durch die Organisation
dieser Gene in zwei Operone (1,3-Propandiol und gly) in pTPG(–) und auf
einem selben Operon in pOPG.
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2.1. Konstruktion von
pTPG(–)
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Zuerst
wurde das SalI-Fragment mit 4,9 kbp des Plasmid pSPD5, das das gesamte
1,3-Propandiol-Operon enthielt, an Agarosegel gereinigt, dann an
den Schaukelvektor pTLH1, der durch SalI verdaut worden war, ligiert,
um das Plasmid pTLP mit 10,6 kbp zu erhalten.
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Parallel
dazu wurden die Nucleotidprimer OPGLY-D und OPGLY-R synthetisiert,
um die Gesamtheit des künstlichen
Operons gly zu amplifizieren.
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Der
Primer OPGLY-D enthielt die SmaI-Stelle sowie den Anfang des künstlichen
Operons gly. Seine Sequenz ist die folgende:
5'-GTTACCCGGGGCTCCTGCAGCTCGACTTTTTAAC-3'
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Der
Primer OPGLY-R hybridisiert mit dem komplementären Strang und enthält die SmaI-Stelle
sowie das Ende des künstlichen
Operons gly. Seine Sequenz ist die folgende:
5'-TTTCACCCGGGAAACAGCTATGACCATGATTACG-3'
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Mit
dem Plasmid pS2 wurde eine Amplifikationsreaktion mit den Primern
OPGLY-D und OPGLY-R bei den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- – Annealing-Temperatur
der Primer: 48°C
- – Verlängerungsdauer:
3,5 min
- - Anzahl der Zyklen: 10
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Die
Reaktion ermöglichte
es, ein Fragment mit der erwarteten Größe von 2,2 kbp zu amplifizieren.
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Dieses
amplifizierte Fragment wurde an Agarosegel gereinigt und durch das
Enzym SmaI verdaut, dann an das Plasmid pTLP ligiert, welches durch
SmaI linearisiert worden war, wodurch das Plasmid pTPG(–) mit 12,8
kbp geliefert wurde (3).
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2.2. Konstruktion von
pOPG
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Zuerst
wurde das PvuII-PstI-Fragment mit 2,2 kbp des Plasmids pS2, das
das gesamte Glycerin-Operon enthielt, an Agarosegel gereinigt, dann
an das SmaI-PstI-Fragment mit 5,7 kbp des Schaukelvektors pTLH1
ligiert, um das Plasmid pTLG1 mit 7,9 kbp zu erhalten. Parallel
wurden die Nucleotidprimer dhaT-F und dhaT-R synthetisiert, um das
5'-Ende des Gens
dhaT zu amplifizieren.
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Der
DHAT-F-Primer enthielt die BamHI-Stelle sowie die zentrale Region
des Gens dhaT. Seine Sequenz ist die folgende:
5'-TTGGATCCAGTATCTATAAATGATCCAATGC-3'
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Der
Primer DHAT-R hybridisiert mit dem komplementären Strang und enthält die BglII-Stelle
sowie das Ende des Gens dhaT. Seine Sequenz ist die folgende:
5'-TTAGATCTTTTAAATAGTATTAATTAATAAGCAGCC-3'
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Eine
Amplifikationsreaktion mit den Primern dhaT-F und dhaT-R wurde mit
dem Plasmid pSPD5 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- – Annealingtemperatur
der Primer: 48°C
- – Verlängerungsdauer:
1 min
- - Anzahl der Zyklen: 10
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Die
Reaktion ermöglichte
es, ein Fragment mit der erwarteten Größe von 0,65 kbp zu amplifizieren.
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Dieses
amplifizierte Fragment wurde an Agarosegel gereinigt und durch die
Enzyme BamHI und BglII verdaut, dann mit dem Plasmid pTLG1 ligiert,
welches durch BamHI linearisiert worden war, wodurch das Plasmid
pTPG mit 8,55 kbp erhalten wurde.
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Zuerst
wurde das Fragment BamHI-SbfI mit 4,0 kbp des Plasmids pSPD5 an
Agarosegel gereinigt, dann mit dem Fragment BamHI-SbfI mit 8,55
kbp des Plasmids pTPG ligiert, wodurch das Plasmid pOPG mit 12,55
kbp erhalten wurde (4).
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BEISPIEL 3: Konstruktion
des Expressionsvektors pSGD
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Der
Vektor pSGD ist vom Plasmid pSPD5 abgeleitet.
-
Im
Wesentlichen exprimierte der Vektor pSGD orf11 und orf12 (funktionell
codierend für
die erste bzw. die zweite Proteinuntereinheit der Glycerindehydratase)
und enthält
eine Deletion in der Regian, die für DHAT (1,3-Propandioldehydrogenase)
codiert.
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Der
Vektor pSPD5 wurde einem Verdau durch das Restriktionsenzym SbfI
unterworfen und das Fragment mit 4082 bp wurde Agarosegel gereinigt.
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Es
wurde dann ein Verdau des Vektors pSOS95 durch das Restriktionsenzym
PstI durchgeführt
und das Fragment mit 4858 bp wurde an Agarosegel gereinigt.
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Diese
zwei Fragmente wurden dann ligiert, um das Plasmid pSGD zu erhalten.
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BEISPIEL 4: Konstruktion
des Expressionsvektors pPPD2
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Der
Vektor pPPD2 ist ein Vektor, der vom Plasmid pSPD5 abgeleitet ist,
der fähig
ist, das Gen dhat (codiert für
die 1,3-Propandioldehydrogenase) zu exprimieren, und in dem orf11
(codiert für
die erste Untereinheit der Glycerindehydratase) vollständig deletiert
ist, ebenso wie 100 bp am 5'-Ende
von orf12 (codiert für die
zweite Untereinheit der Glycerindehydratase).
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Der
Vektor pSPD5 wurde zunächst
gleichzeitig durch die Enzyme BamHI und MfeI verdaut.
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Das
BamHI-MfeI-Fragment mit 6326 bp, das durch zweifachen Verdau mit
Hilfe der entsprechenden Restriktionsendonucleasen erhalten wurde,
wurde einer Behandlung in Gegenwart der DNA-Polymerase T4 unterworfen,
um stumpfe Enden zu erhalten.
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Das
Fragment wurde dann einer Selbstreligation unterworfen, um das Plasmid
pPPD2 zu erhalten.
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BEISPIEL 5: Expression
des 1,3-Propandiol-Operons in Clostridium acetobutylicum DG1, das
auf Glycerin kultiviert wurde.
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Der
Stamm Clostridium acetobutylicum DGI, der mit dem Plasmid pSPD5
transformiert worden war, wie es oben im Teil "Materialien und Verfahren" beschrieben wurde,
wurde in Gegenwart von Glycerin während bestimmter Zeiten kultiviert,
und es wurden verschiedene Parameter im Verlauf der Fermentation überwacht:
- – Das
bakterielle Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei
einer Wellenlänge
von 620 nm verfolgt und ist in 6 durch
nicht ausgefüllte
Kreise dargestellt;
- – die
Glycerinkonzentration wurde im Verlauf der Fermentation überwacht
und ist in 7 durch ausgefüllte Quadrate
dargestellt;
- – die
Synthese von 1,3-Propandiol wurde ebenfalls im Verlauf der Fermentation
verfolgt und ist durch ausgefüllte
Kreise dargestellt;
- – gleichfalls
wurde die Konzentration an Acetat und Butyrat im Verlauf der Fermentation
gemessen und ist in 7 durch nicht ausgefüllte Dreiecke
mit der Spitze nach oben oder der Spitze nach unten dargestellt.
-
Die
in 7 dargestellten Resultate zeigen, dass eine beachtliche
Menge an 1,3-Propandiol durch den Stamm Clostridium acetobutylicum
DGI, der durch das Plasmid pSPD5 transformiert worden war, nach den
ersten 4 Stunden der Kultur synthetisiert wird. Nach 20 Stunden
Fermentation kann eine Produktion von 38 g/l 1,3-Propandiol beobachtet
werden. Die Produktion von 1,3-Propandiol erreicht bei etwa 18 Stunden nach
Beginn der Fermentation eine Ebene, wobei diese Produktionsebene
im Wesentlichen aus der Tatsache resultiert, dass fast die Gesamtzahl
des Anfangsglycerins durch das transformierte Bakterium verbraucht
ist.
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Es
ist wichtig, zu betonen, dass der Stamm C. acetobutylicum DGI, der
durch das Kontrollplasmid pIMP1 transformiert worden war, das nicht
die Regionen enthält,
die für
die Glycerindehydratase und die 1,3-Propandioldehydrogenase codieren
(Memmerlstein, 1992), sich auf dem Kulturmedium mit Glycerin als einziger
Kohlenstoffquelle nicht entwickelt und demnach kein 1,3-Propandiol
produziert (Tabelle 1).
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BEISPIEL 6: Expression
des 1,3-Propandiol-Operons in Escherichia coli DH5α, das auf
Glycerin kultiviert wird.
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Ein
Stamm Escherichia coli DH5α wurde
mit dem Vektor pSPD5 tranformiert, wie es in dem Teil "Materialien und Verfahren" beschrieben ist.
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Der
Stamm Escherichia coli, der mit dem Plasmid pSPD5 transformiert
worden war, wurde in einer Anaerobiose-Kultur auf LB-Medium, das
mit Glycerin (40 g/l) und Erythromycin (300 μg/ml) supplementiert war, verwendet;
die Produktion an 1,3-Propandiol wurde zu bestimmten Zeiten gemessen.
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Die
Resultate sind in 8 zusammengefasst.
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Die
Resultate der 8 zeigen, dass eine deutliche
Produktion an 1,3-Propandiol ab den ersten Stunden der Fermentation
erhalten wird. Nach 80 Stunden Fermentation kann eine Produktion
von etwa 4,5 g/l 1,3-Propandiol beobachtet werden.
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Der
Kontrollstamm E. coli DH5α [pIMP1],
der in demselben Medium kultiviert wurde, führt nicht zur Produktion von
1,3-Propandiol (Tabelle 1). TABELLE
1 Produktion
von 1,3-Propandiol durch rekombinante Stämme, die bei pH 6,5 in Gegenwart
von Glycerin unter Anaerobie-Bedingungen kultiviert wurden
-
Die
Resultate der Tabelle 1 zeigen, dass eine beachtliche Produktion
an 1,3-Propandiol (etwa 5 g/l) mit dem Stamm von Escherichia coli
DH5α erhalten
wurde, der durch das Plasmid pSPD5 transformiert werden kann, während der
Stamm von E. coli, der mit dem Vergleichsplasmid pIMP1 transfiziert
worden war, keine detektierbare Menge an 1,3-Propandiol produziert.
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Mit
der Konstruktion pSPD5 wird mit dem Stamm Clostridium acetobutylicum
im Vergleich zu dem Stamm Escherichia coli DH5α eine 1,3-Propandiolmenge beobachtet,
die etwa 7,6 mal höher
ist. Dies basiert hauptsächlich
auf der Tatsache, dass die Regulationssig nale des Plasmids pSPD5
durch die Expression des 1,3-Propandiol-Operons in Clostridium acetobutylicum
optimiert wurden.
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Regulationssignale
wie ein Promotor, der bei Escherichia coli sehr aktiv ist, sind
geeignet, bei Escherichia coli eine ebenso bedeutende Menge an 1,3-Propandiol
zu erhalten wie die, die bei Clostridium acetobutylicum beobachtet
wird.
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BEISPIEL 7: Expression
des 1,3-Propandiol-Operons in Clostridium butyricum-Wildtyp, das
auf Glycerin kultiviert wird.
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Der
Stamm Clostridium butyricum VPI 1718 wurde in Gegenwart von Glycerin
kultiviert, und die Synthese an 1,3-Propandiol wurde zu bestimmten
Zeiten im Verlauf der Fermentation gemessen.
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Die
Resultate sind in 9 dargestellt.
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Die
Resultate der 9 zeigen, dass eine Produktion
von 34 g/l 1,3-Propandiol nach 60 Stunden Fermentation beobachtet
wird.
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Wenn
man sich auf die in 7 dargestellten Resultate bezieht,
kann man beobachten, dass die Produktion von 1,3-Propandiol durch
den Stamm Clostridium acetobutylicum DG1, der durch das Plasmid
pSPD5 transformiert wurde, viel schneller (22 Stunden gegenüber 60 Stunden)
im Vergleich zur Produktion von 1,3-Propandiol ist, das durch den
Stamm Clostridium butyricum erhalten wird, der natürlicherweise
die Glycerindehydratase, die vom Co-Enzym B12 unabhängig ist,
und die 1,3-Propandioldehydrogenase gemäß der Erfindung exprimiert,
und damit dieser überlegen
ist.
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Im Übrigen wurden
die Level der katalytischen Aktivität, ausgedrückt in Einheiten pro mg, für Glycerindehydratase
und 1,3-Propandioldehydrogenase gleichzeitig bei Clostridium acetobutylicum
und bei Clostridium butyricum gemessen.
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Die
Resultate sind in Tabelle 2, DG1 [pSPD5], unten dargestellt. TABELLE
2 Level
der Enzyme, die bei der Produktion von 1,3-Propandiol impliziert
sind, in den Stämmen
rekombinantes C. acetobutylicum und C. butyricum
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Die
in Tabelle 2 dargestellten Resultate zeigen, dass die Aktivitätslevel
der Glycerindehydratase und der 1,3-Propandioldehydrogenase, die
in dem Stamm Clostridium acetobutylicum exprimiert werden, welcher durch
das Plasmid pSPD5 transformiert wurde, den Aktivitätsleveln
von Glycerindehydratase und 1,3-Propandioldehydrogenase, die durch
den Stamm Clostridium butyricum exprimiert werden, welcher natürlicherweise diese
Enzyme produziert, weit überlegen
sind (7,8- bzw. 4,3-fach höher).
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Der
Stamm Clostridium acetobutylicum, der mit dem Plasmid pIMPI transformiert
war, das nicht die Regionen enthält,
die für
die Glycerindehydratase und die 1,3-Propandioldehydrogenase codieren,
produziert als Vergleich keine nachweisbare Menge dieser zwei Enzyme,
was klar zeigt, dass die bei dem Stamm, der durch das Plasmid pSPD5
transformiert war, beobachtete Aktivität, einzig auf der Expression
des 1,3-Propandiol-Operons gemäß der Erfindung
basiert.
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Die
in Tabelle 2 gezeigten Resultate beweisen deutlich die Bedeutung
der erfindungsgemäßen Transformation
eines Mikroorganismus-Stamms, der natürlicherweise die Glycerindehydratase
und die 1,3-Propandioldehydrogenase nicht produziert, mit einem
rekombinanten Vektor wie dem Vektor pSPD5, denn in diesem Fall ist
es möglich,
z.B. durch Verwendung geeigneter Promotoren, Expressionsniveaus
zu erhalten, die natürlicherweise
niemals erreicht werden. BEISPIEL
8: Expression der Gene des 1,3-Propandiol-Operons bei Saccharomyces
cerevisiae A.
Materialien und Verfahren A.1
Materialien
| MSL-MEDIUM | |
| Salz | g/l |
| -(NH4)2SO4 | 5 |
| -MgSO47H2O | 0,5 |
| -KH2PO4 | 1 |
| -NaCl | 0,1 |
| -CaCl22H2O | 0,1 |
| | |
| VITAMINE | mg/l |
| -d-Biotin | 0,02 |
| -Ca-D(+)Panthotenat | 0,4 |
| -myo-Inositol | 2,0 |
| -Thiamin
HCl | 0,4 |
| -Pyridoxin
HCl | 0,4 |
| -p-Aminobenzoesäure | 0,2 |
| -Folsäure | 0,02 |
| -Niacin | 0,4 |
| -Riboflavin | 0,2 |
| OLIGO-ELEMENTE | mg/l |
| -ZnSO27H2O | 0,4 |
| -MnSO4 | 0,4 |
| -CuSO45H2O | 0,04 |
| -Na2MoO42H2O | 0,2 |
| -FeCl36H2O | 0,2 |
| -H3BO3 | 0,5 |
| Kl | 0,1 |
| KOHLENSTOFFQUELLE | g/l |
| -Glucose | 10 |
| -Glycerin | 10 |
| AA
(drop-out) | g/l |
| -L-Arg | 0,02 |
| -Thre | 0,05 |
| -L-Tryp | 0,04 |
| -L-Isoleu | 0,06 |
| -Lys | 0,04 |
| -Met | 0,01 |
| -Phe | 0,06 |
| -Tyr | 0,05 |
| -Adenin | 0,01 |
| -Ergosterol | 0,01 |
| -Tween
80 | 0,42 |
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A.2. Verfahren
-
Die
Gene orf11, orf12 und dhat wurden einzeln durch PCR amplifiziert,
indem Dank der Primer eine SmaI-Stelle am 5'-Ende und eine ApaI-Ste11e am 3'-Ende eingeführt wurde.
Jedes Gen wurde dann mit Hilfe dieser Restriktionsstellen in den
Vektor pYGK (CROUX und SOUCAILLE, 1999) eingeführt, was es ermöglicht, eine
Expressionskassette unter der Kontrolle des Promotors PGK und des
Teminators des Gens CYC1 zu konstruieren. Die drei Gene wurden dann
in ihrer Expressionskassette aus jedem der Vektoren, die wie vorstehend erhalten
worden waren (pYGK11, pYGK12 und pYGKT), durch NotI-SacII entfernt,
in drei Mehrfachvektoren der Familie pRS42x eingeführt, die
sich durch die Natur ihres Selektionsmarkers unterscheiden (HIS3
für pRS423,
LEU2 für
pRS425 und URA3 für
pRS426), die vorher durch dieselben Restriktionsenzyme verdaut worden
waren. Jedes der drei erhaltenen Plasmide (pRSGK11, pRSGK12 und
pRSGKT) wurde dann in den Stamm S. cerevisae JF624 (leu2 ura3 lys2
trp1 his3) eingeführt
und durch Komplementierung der drei Auxotrophien dieses Stamms selektioniert.
Der Stamm S. cerevisae JF624 (PRSGK11, pRSGK12, pRSGKT) und der
Kontrollstamm S. cerevisae JF624 (PRS423, PRS425, pRS426) wurden
dann unter Anaerobiose während 36
Stunden in MSL-Medium kultiviert.
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B. RESULTATE
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Die
Resultate der Expression der Gene des 1,3-Propandiol-Operons sind
für die
Stämme
S. cerevisiae JF624, die im Abschnitt A.2. beschrieben wurden, in
Tabelle 3 unten angegeben.
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Die
Resultate der Tabelle 3 zeigen, dass der Stamm S. cerevisiae JF624,
der die Inserts der Gene orf11, orf12 und dhat in die Plasmide pRSGK11,
pRSGK12 und pRSGKT insertiert enthält, fähig ist, 1,3-Propandiol aus
einer Glycerinquelle ohne Zusatz von Vitamin B12 zu produzieren.
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BEISPIEL 9: Expression
des 1,3-Propandiol-Operons in Clostridium acetobutylicum DG1 [pSPD5],
das auf Glucose kultiviert wurde
-
Der
Stamm Clostridium acetobutylicum DG1, der durch das Plasmid pSPD5
transformiert worden war, wie es in dem Teil "Materialien und Verfahren" beschrieben ist,
wurde in Gegenwart von Glucose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert,
und es wurden verschiedene Parameter im Verlauf der Fermentation
verfolgt.
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Die
Resultate sind in 10 dargestellt.
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Die
Resultate der 10 zeigen eine 1,3-Propandiolsynthese,
wenngleich eine schwache (0,3 g/1), obgleich die gesamte Glucose
verbraucht wurde. Diese Produktion beweist durch das Vorliegen einer
schwachen intrazellulären
Glycerinkonzentration bei Clostridium acetobutylicum DG1 [pSPD5]
jedenfalls die Durchführbarkeit
eines direkten Umwandlungsverfahrens der Glucose in 1,3-Propandiol
ohne einen Stamm, der die durch die vorliegende Erfindung beanspruchten
Gene trägt.
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BEISPIEL 10: Expression
des 1,3-Propandiol-Operons in Bacillus subtilis 168 [pSPD5], das
auf Glycerin kultiviert wurde.
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Der
Stamm Bacillus subtilis 168, der durch das Plasmid pSPD5 transformiert
worden war, wie es in dem Teil "Materialien
und Verfahren" beschrieben
ist, wurde auf LB-Medium + 10 g/l Glycerin + 20 mM Nitrat + 2 μg/ml Erythromycin
unter Anaerobiose kultiviert und demselben Stamm, der durch das
Kontrollplasmid pIMP1 transformiert worden war, verglichen.
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Die
Resultate sind in Tabelle 4 unten dargestellt.
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Die
Resultate der Tabelle 3 zeigen, dass die Expression des 1,3-Propandiol-Operons
in B. subtilis die Produktion von 1,3-Propandiol aus Glycerin ohne
Zusatz von Vitamin B12 ermöglicht.
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BEISPIEL 11: Umwandlung
von Glucose in 1,3-Propandiol durch E. coli NZN 111 [pTPG]
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Das
Plasmid pTPG(–)
und das Kontrollplasmid pTLH1 wurden in den Stamm E. coli NZN 111
(pfl: cat ldh: kan), ein Stamm, der unfähig ist, unter Anaerobiose
Formiat und Lactat zu produzieren, eingeführt. Diese zwei rekombinanten
Stämme
wurden dann während
48 Stunden in dem Medium LB + Glucose + 10 μg/ml Tetracyclin ohne pH-Regulierung
kultiviert. Die in Tabelle 5 angegebenen Resultate zeigen, dass
E. coli beachtliche Mengen an 1,3-Propandiol aus Glucose nach Transformation
durch das Plasmid PTPG produzieren kann.
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LITERATURSTELLEN:
-
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publiziert.
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publiziert.
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