JP5774493B2 - ジオールの生産方法 - Google Patents
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Description
ジオールを産生する微生物を培養することによるジオールの発酵生産は、ジオールの改良生産のために遺伝的に改変された微生物の発酵生産をはじめとして、当技術分野で公知である。このようなジオールの生産は、とりわけ以下の文献:WO1996/035796、WO2001/012833、WO2004/033646、US7267972に記載されている。特に、1,3−プロパンジオールの生産がすでに記載されているが、ビタミンB12依存性酵素を含み、それにより生産プロセスが極めて高価である。
本発明は、脂肪族ジオールの生物生産のために遺伝的に改変された微生物に関し、該微生物は、2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなり、該脱炭酸工程から得られた産物は、さらに、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を用いて対応する脂肪族ジオールへ還元され、その微生物は該ヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物の生産が改良されるように遺伝的に改変されている。
上記および下記のような本発明の微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地上で培養する工程と、
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、脂肪族ジオールの生物生産のための方法に関する。
微生物
本発明の微生物は、遺伝的に改変されているか、または遺伝的に操作されている微生物である。これは、これらの用語の通常の意味によれば、本発明の微生物は天然には見られず、新たな遺伝子エレメントの導入または欠失のいずれかによって改変されている。それはまた、指定突然変異誘発と特定の選択圧下での進化を組み合わせることにおいて新たな代謝経路の発達と進化を課すことによって形質転換させることもできる(例えば、WO2004/076659参照)。
本発明の記載において、酵素活性はこのような活性を有する酵素をコードする遺伝子を参照して表される。特に断りのない限り、遺伝子およびタンパク質は一般に大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて特定される。しかしながら、これらの名称の使用は、本発明によればより一般的な意味を持ち、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総て、該遺伝子およびタンパク質の機能的ホモログ、機能的変異体および機能的断片を包含する。
・小さな脂肪族、非極性またはやや極性のある残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
・極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln
・極性、正電荷を有する残基:His、Arg、Lys
・大きな脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys
・大きな芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
のうちの1つの中での交換と定義される。
本発明はまた、
微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養する工程と
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、脂肪族ジオールの発酵生産に関する。
本発明の一態様では、回収された脂肪族ジオールはさらに精製される。
本発明の他の実施形態を以下に記載する。これらの微生物は、ヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物の生産と、同じヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物の脱炭酸工程から得られる産物の対応する脂肪族ジオールへの変換の双方に都合のよいように改変される。
本発明によるエチレングリコールの生産のための生合成経路は、3−ホスホヒドロキシピルビン酸前駆体(セリンの前駆体)の変換に始まる3つの酵素反応を含んでなる。まず、ホスファターゼ活性により、ホスホヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸の変換が可能となる。次に、ヒドロキシピルビン酸は、2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性によりグリコールアルデヒドへ変換される。最後に、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性により、グリコールアルデヒドからエチレングリコールへの変換が可能となる。エチレングリコールの生産の別の経路は前駆体としてのL−セリンから始まる。まず、トランスアミナーゼまたはアミノ酸オキシダーゼ活性により、セリンからヒドロキシピルビン酸への変換が可能となる。次の2つの段階は上記の第一経路と同様である。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地からエチレングリコールを回収することを含んでなる、エチレングリコール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
本発明による1,3−プロパンジオールの生産のための生合成経路は、L−ホモセリン前駆体(L−アスパラギン酸から得られる)の変換に始まる3つの酵素反応を含んでなる。まず、ホモセリントランスアミナーゼまたはホモセリンオキシダーゼ活性により、L−ホモセリンから4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸への変換が可能となる。次の2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性により、4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸から3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換が可能となる。その後、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドはヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性により1,3−プロパンジオールに変換される。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地から1,3−プロパンジオールを回収することを含んでなる1,3−プロパンジオール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
本発明による1,4−ブタンジオールの生産のための生合成経路は、2−ケトグルタル酸前駆体(クレブス回路の代謝産物)の変換に始まる5つの酵素反応を含んでなる。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地から1,4−ブタンジオールを回収することを含んでなる、1,4−ブタンジオール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
2−ケト酸デカルボキシラーゼコード遺伝子およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼコード遺伝子を発現する株の構築:MG1655(pME101−kivDll−yqhD−TT07)
1.1 α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌のkivDの過剰発現のためのプラスミドpM−Ptrc01−kivDll−TT07の構築
α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌kivDの合成遺伝子はGeneart (Germany)により作製された。この遺伝子のコドン使用およびGC含量は供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。この合成遺伝子の発現は構成的Ptrcプロモーターにより駆動した。転写ターミネーターを遺伝子の下流に付加した。この構築物を供給者のpMベクターにクローニングし、配列決定により確認した。必要に応じて、この合成遺伝子をpME101ベクター(このプラスミドはプラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)に由来する)にクローニングした後に、大腸菌株を形質転換させた。
制限部位(BamHI、HindIII、EcoRV)(配列番号1):
pME101F(配列番号6):
pME101ベクターおよびkivDll遺伝子を担持するベクターをSnaBIおよびBglIIで制限酵素処理し、yqhD含有断片をベクターpME101にクローニングし、得られたプラスミドをpME101−kivDll−yqhD−TT07と呼んだ。
yqhD F(配列番号8)
・3153357〜3153385の大腸菌MG1655 yqhD領域と相同な領域(小文字)
yqhD R(配列番号9)
・BglII制限部位の付加のための領域(斜体太字の小文字)
を用いてPCR増幅した。
PCR増幅した断片を制限酵素SnaBIおよびBglIIで切断し、ベクターpME101−kivDll−TT07のSnaBI−BglII部位にクローニングし、ベクターpME101−kivDll−yqhD−TT07を得た。
エチレングリコール経路フラックスが増強された株:MG1655 ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF Ptrc18−gpmA Ptrc18−gpmB(pME101−kivDll−yqhD−TT07)の構築
2.1 MG1655 ΔsdaA ΔsdaB株の構築
sdaA遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能であった。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔsdaAF(配列番号10)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔsdaAR(配列番号11)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
sdaAF(配列番号12):
sdaAR(配列番号13):
ΔsdaBF(配列番号14)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔsdaBR(配列番号15)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
とともに用いて構築した。
sdaBF(配列番号16):
sdaBR(配列番号17):
ΔsdaB::Cmを移入するために、ファージP1形質導入の方法を用いた。MG1655 ΔsdaA::Km株への形質導入のために、MG1655 ΔsdaB::Cm株のファージ溶解液の調製物を用いた。
pykF遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能であった。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔpykFF(配列番号18)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔpykFR(配列番号19)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
pykFF(配列番号20):
pykFR(配列番号21):
ΔpykF::Kmを移入するために、ファージP1形質導入の方法を用いた。MG1655 ΔsdaA ΔsdaB株に形質導入するために、MG1655 ΔpykF::Km株のファージ溶解液の調製物を用いた。
3−ホスホグリセル酸のレベルを高めるために、突然変異体Ptrc18−gpmAおよびPtrc18−gpmBを構築する。まず、ホスホグリセル酸ムターゼgpmA遺伝子の発現を低減するために、プロモーターを活性の弱い改変型の構成的trcプロモーターに置き換える。このPtrc18−gpmAを形質導入によりMG1655 ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF株に導入する。
Ptrc18−gpmAF(配列番号22)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
・trcプロモーター配列(−35および−10ボックスが下線で示される)の領域(斜体の大文字)
Ptrc18−gpmAR(配列番号23)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
とともに用いて構築する。
gpmAF(配列番号24):
gpmAR(配列番号25):
・10mlのLB+Km 50μg/ml+グルコース0.2%+CaCl2 5mMにMG1655 Ptrc18−gpmA::Km株の一晩培養物100μlを接種する。振盪しながら37℃で30分間インキュベートする。
・MG1655株に100μlのファージ溶解液P1を加える(約1.109ファージ/ml)。
・37℃で3時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・4500gで10分間遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、200μlのクロロホルムを加える。
・溶解液を4℃で保存する。
・LB培地中、MG1655 ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF株の一晩培養物5mlを1500gで10分間遠心分離する。
・2.5mlの10mM MgSO4、5mM CaCl2に細胞ペレットを懸濁させる。対照試験管:細胞100μl
・MG1655 Ptrc18−gpmA::Km株のファージP1 100μl−供試試験管:細胞100μl+MG1655 Ptrc18−gpmA::Km株のファージP1 100μl
・振盪せずに300Cで30分間インキュベートする。各試験間に1Mクエン酸ナトリウム100μlを加え、ボルテックスにかける。
・1mlのLBを加える。
・振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。
・試験管を7000rpmで3分間遠心分離した後、LB+Km50μg/mlのディッシュ上に拡げる。
・37℃で一晩インキュベートする。
次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、プロモーターPtrc18−gpmA::Kmの改変を、従前に記載したオリゴヌクレオチドgpmAFおよびgpmARを用いるPCR分析により確認する。保有株をMG1655 ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF Ptrc18−gpmA::Kmと呼ぶ。次に、Ptrc18−gpmBを形質導入によりMG1655 ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF Ptrc18−gpmA::Km株に移入する。まず、従前に記載したものと同じ方法を以下のオリゴヌクレオチド:
Ptrc18−gpmBR(配列番号26)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
・trcプロモーター配列(−35および−10ボックスが下線で示される)の領域(斜体の大文字)
Ptrc18−gpmBF(配列番号27)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
とともに用いて構築する。
gpmBF(配列番号28):
gpmBR(配列番号29):
次に、pME101−kivDll−yqhD−TT07プラスミドをMG1655 ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF Ptrc18−gpmA Ptrc18−gpmB株に導入する。
1,3−プロパンジオール経路フラックスが増強された株:MG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC::TT07−Ptrc−thrA*1(pME101−kivDll−yqhD−TT07)(pMA−aaoro)の構築
3.1 MG1655 ΔmetA株の構築
metA遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔmetAF(配列番号30):
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔmetAR(配列番号31):
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
metAF(配列番号32):
metAR(配列番号33):
ΔpykF::Kmを移入するために、ファージP1形質導入を用いた。MG1655 ΔmetA株への形質導入のためにMG1655 ΔpykF::Km株のファージ溶解液の調製物(上記)を用いた。
アスパルトキナーゼ/ホモセリンデヒドロゲナーゼのフィードバック耐性対立遺伝子thrA*1の発現を増強するために、以下のプラスミドを構築した:thrA*1を得るためのpSB1およびthrLABCオペロンをPtrc−thrA*1対立遺伝子により置き換えるためのpSB2。
プラスミドpSB1はプラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)に由来し、プロモーターPtrcから発現されたトレオニンに対するフィードバック耐性が低減された(Lee et al. 2003 J. Bacteriol. 185, 18 pp. 5442-5451)アスパルトキナーゼ/ホモセリンthrA*対立遺伝子を担持する。pSB1の構築のため、thrAを、以下のオリゴヌクレオチド:
BspHIthrA(配列番号34):
・BspHI制限部位および余分な塩基のための領域(大文字)
SmaIthrA(配列番号35):
・SmaI制限部位および余分な塩基のための領域(大文字)
を用いてゲノムDNAからPCR増幅した。
PME101F(配列番号36)
HpaIupthrLF(配列番号40)
・HpaIおよびEcoRI制限部位と余分な塩基のための領域(大文字)
BstZ17IupthrLR(配列番号41)
・T7te転写ターミネーター配列のための領域(太字の大文字)(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・BstZ17I、BamHI、SfoIおよびSmaI制限部位からなる多重クローニング部位のための領域(大文字)
BamHIdownthrCF(配列番号42)
・T7te転写ターミネーター配列のための領域(太字の大文字)(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・BstZ17I、BamHI、SfoIおよびSmaI制限部位からなる多重クローニング部位のための領域(大文字)
HpaIdownthrCR(配列番号43)
・HpaIおよびEcoRI制限部位と余分な塩基のための領域(大文字)
を用い、ゲノムDNAからPCR増幅した。
BstZ17CmF(配列番号44)
・BstZ17I制限部位および余分な塩基のための領域(大文字)
BamHICmR(配列番号45)
・BamHI制限部位および余分な塩基のための領域(大文字)
を用い、pKD3ベクターからPCR増幅した。
thrA*1F(配列番号46):
thrA*1R(配列番号47)
組換えプラスミドをDNA配列決定により確認した。
アミノ酸オキシダーゼをコードするロドコッカス・オパカスaao遺伝子の合成遺伝子はGeneart (Germany)により作製された。この遺伝子のコドン使用およびGC含量は供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。この合成遺伝子の発現は構成的Ptrcプロモーターにより駆動した。この構築物を供給者のpMAベクターにクローニングし、配列決定により確認した。
Ptrc01−aaoro:
制限部位(KpnI、EcoRI、SmaI)(配列番号48):
次に、pME101−kivDll−yqhD−TT07およびpMA−aaoroプラスミドをMG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC::TT07−Ptrc−thrA*1株に導入する。
実施例4
1,4−ブタンジオール経路フラックスが増強された株:MG1655 ΔsucCD ΔaceBAK ΔarcA ΔgdhA(pUC19−Ptrc01/OP01/RBS01−adhE2ca−prpE−TT02)(pME101−kivDll−yqhD−TT07)の構築
4.1 MG1655 ΔaceBAK ΔsucCD株の構築
ΔaceBAKF(配列番号52):
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔaceBAKR(配列番号53):
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
aceBAKF(配列番号54):
aceBAKR(配列番号55):
ΔsucCDF(配列番号56):
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔsucCDR(配列番号57):
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
sucCDF(配列番号58):
sucCDR(配列番号59):
ΔaceBAK::Kmを移入するため、ファージP1形質導入の方法を用いる。MG1655 ΔsucCD::Cm株への形質導入のためにMG1655 DaceBAK::Km株のファージ溶解液の調製物を用いる。
arcA遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔarcAF(配列番号60):
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔarcAR(配列番号61):
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
arcAF(配列番号62):
arcAR(配列番号63):
ΔarcA::Kmを移入するため、ファージP1形質導入を用いる。MG1655 ΔsucCD ΔaceBAK株への形質導入のためにMG1655 DarcA::Km株のファージ溶解液を用いる。
gdhA遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。オリゴヌクレオチドΔgdhAFおよびΔgdhARを用いてプラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する。
ΔgdhAF(配列番号64):
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔgdhAR(配列番号65):
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
得られたPCR産物を次にエレクトロポレーションによりMG1655(pKD46)株に導入する。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドPtrc−gdhAverFおよびgdhA Rを用いるPCR分析により確認する。
Ptrc−gdhAverF(配列番号66):
gdhA R(配列番号67):
ΔgdhA::Cmを移入するために、ファージP1形質導入を用いる。MG1655 ΔsucCD ΔaceBAK ΔarcA::Km株への形質導入のためにMG1655 ΔgdhA::Cm株のファージ溶解液を用いる。
二官能性アセトアルデヒド−CoA/アルコールデヒドロゲナーゼをコードするクロストリジウム・アセトブチリカム由来のadhE2遺伝子をプラスミドpUC19にクローニングした。プロピオニル−CoAシンセターゼをコードするprpE遺伝子をadhE2の上流にクローニングした。オリゴヌクレオチドadhE2Ca FおよびadhE2Ca Rを用い、adhE2遺伝子をクロストリジウム・アセトブチリカムATCC824株のメガプラスミドpSol1からPCR増幅した(33722〜36298番)。
adhE2Ca F(配列番号68):
・プロモーターPtrc01の付加のための領域(下線の小文字)
・オペレーター配列OP01の付加のための領域(斜体の小文字)
・SnaBI制限部位の付加のための領域(太字の大文字)
・RBS01配列の付加のための領域(小文字)
・C.アセトブチリカムadhE2領域33722〜33752と相同な領域(下線の大文字)
adhE2Ca R(配列番号69):
・ターミネーターTT02の付加のための領域(下線太字の小文字)
・PacI、XbaI、NheI、AvrII制限部位の付加のための領域(斜体文字)
・C.アセトブチリカムadhE2領域36264〜36298と相同な領域(下線の大文字)
prpE遺伝子を増幅するために、鋳型としての大腸菌の染色体DNAとプライマーprpE FおよびprpE Rを用いてPCRを行う。
prep F(配列番号70):
・351910〜351932の領域(http://www.ecogene.org/blast.php)と相同な領域(小文字)
prep R(配列番号71):
・353816〜353797の領域(http://www.ecogene.org/blast.php)と相同な領域(小文字)
次にpUC19−Ptrc01/OP01/RBS01−adhE2ca−prpE−TT02およびpME101−kivDll−yqhD−TT07プラスミドをMG1655 ΔsucCD ΔaceBAK ΔarcA ΔgdhA株に導入する。
実施例5
エルレンマイヤーフラスコにおけるエチレングリコール生産株の発酵
エチレングリコール経路フラックスが増強された株:MG1655 ΔpykF(pME101−kivDll−yqhD−yeaB−TTOT)(pCC1BAC−serA)の構築
6.1 乳酸連鎖球菌のヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼkivD、大腸菌のヒドロキシアルデヒドレダクターゼyqhDおよびホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼyeaB遺伝子の過剰発現のためのプラスミド:pME101−kivDll−yqhD−yeaB−TT07プラスミドの構築
yeaB含有断片をXbaIおよびBglIIで制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターpME101−kivDll−yqhDにクローニングし、得られたプラスミドをpME101−kivDll−yqhO−yeaB−TT07と呼んだ。
yeaB遺伝子を、オリゴヌクレオチドyeaB FおよびyeaB Rを用い、大腸菌MG1655株のゲノムDNAからPCR増幅した。
yeaB F(配列番号72)
・リボソーム結合部位の付加のための領域(下線の小文字)
・大腸菌MG1655 yeaB領域1894195〜1894215(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列)と相同な領域(大文字)
yeaB R(配列番号73)
・ターミネーター配列T7Te(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24参照)と相同な領域(下線の大文字)
・PsiI、PvuII、XbaI、BstZ17I、XmnI、PacI、SacIおよびAvrII制限部位の付加のための領域(斜体の大文字)
serA遺伝子の発現を増強するために、この遺伝子を、その適切なプロモーターを用い、コピーコントロールベクターpCC1BAC(Epicentre)から発現させた。
このため、serA遺伝子を、オリゴヌクレオチドserA FおよびserA Rを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。PCR産物を酵素XbaIおよびSmaIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターpUC18(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターをpUC18−serAと呼んだ。
serA F(配列番号74):
・XbaI部位を担持する領域(太字の文字)
serA R(配列番号75):
・SmaIおよびHindIII部位を担持する領域(太字の文字)
遺伝子serAをコピーコントロールベクターpCC1BACに移入するため、ベクターpUC18−serAを酵素HindIIIで制限酵素処理し、HindIIIクローニングレディーpCC1BAC(Epicentre)にクローニングした。
得られた構築物を確認し、pCC1BAC−serAと呼んだ。
MG1655 ΔpykF株の構築は従前に詳説されている(パート2.2)。次にpCC1BAC−serAプラスミドおよびpME101−kivDll−yqhD−yeaB−TT07プラスミドをMG1655 ΔpykF株に導入した。
乳酸連鎖球菌の遺伝子kivDによりコードされているヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性の証明
7.1 KivDの特性決定のための株:BL21(pPAL7−kivDll)の構築
KivDタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターpPAL7(Bio-rad)から発現させた。
このために、kivD遺伝子を、オリゴヌクレオチドpPAL7−kivDll FおよびpPAL7−kivDll Rを用い、乳酸連鎖球菌ゲノムから増幅した。PCR産物を酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターpPAL7にクローニングした。得られたベクターをpPAL7−kivDllと呼んだ。
pPAL7−kivDll F(配列番号76):
・精製に好都合とするために短いN末端アミノ酸延長部を含むタグ無しタンパク質を生じるのに必要なヌクレオチドを担持する領域(太字の文字)
・HindIII制限部位を担持する領域(下線の文字)
pPAL7−kivDll R(配列番号77):
・EcoRI制限部位を担持する領域(下線の文字)
次にpPAL7−kivDllプラスミドをBL21(DE3)コンピテント細胞株(Invitrogen)に導入した。
タンパク質KivDの過剰生産を、2lエルレンマイヤーフラスコにて、2.5g/lのグルコースおよび100mg/lのアンピシリンを添加したLB培養液(Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300)を用いて行った。一晩前培養物を用い、500ml培養系にOD600nmが約0.15となるように接種した。この前培養は、2.5g/lのグルコースおよび100mg/lのアンピシリンを添加したLB培養液50mlを入れた500mlエルレンマイヤーフラスコで行った。培養をまずシェーカー上、37℃、200rpmでOD600nmが約0.5となるまで維持し、その後、培養物を25℃、200rpmの第二のシェーカーにOD600nmが0.6〜0.8となるまで(約1時間)移した後、500μMのIPTGで誘導を行った。培養を25℃、200rpmで、OD600nmが4前後となるまで維持した後に止めた。細胞を4℃にて7000rpmで5分遠心分離した後、−20℃で保存した。
7.3.1 工程1:細胞不含抽出物の調製
約188mgの大腸菌バイオマスを30mlの100mMリン酸カリウムpH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。この細胞懸濁液(15ml/コニカル試験管)を50mlコニカル試験管中、氷上で、30秒間隔で30秒8回音波処理した(Bandelin sonoplus、70W)。音波処理後、細胞を室温で30分、5mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともにインキュベートした。4℃、12000gで30分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
生産者が推奨するプロトコールに従い、Profinityカラム(BIORAD、Bio−Scale Mini Profinity exactカートリッジ5ml)での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を100mMリン酸カリウムpH7.6で平衡化した5ml Profinity exactカートリッジにのせた。このカラムを10カラム容量の同じバッファーで洗浄し、4℃にて、100mMリン酸カリウムpH7.6、100mMフッ化物とともに一晩インキュベートした。2カラム容量の100mMリン酸カリウムpH7.6で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、100mMリン酸カリウム、150mM NaClおよび10%グリセロールpH8に対して透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
7.4.1 5−ヒドロキシ−2−ケトペンタン酸の化学合成
5−ヒドロキシ−2−ケトペンタン酸の化学合成は刊行物:Friedhelm Korte, Karl Heinz Buchel, α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung, X. α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung in waβriger Salzsaure Chemische Berichte, Volume 92 Issue 4, Pages 877-883 (1959)に記載されている。
4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸の化学合成は刊行物:R S Lane; EE Dekker; (1969).2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8(7), 2958-2966に記載されている。
ヒドロキシケト酸の脱炭酸は、結合酵素アッセイを用いて30℃で測定した。ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性アッセイは、総容量1ml中、50mMリン酸カリウムバッファーpH6、0.2mM NADH、1mM MgSO4、0.5mMチアミン二リン酸、72単位/mlのサッカロミセス・セレビシエ由来アルコールデヒドロゲナーゼ、10mMの中和ヒドロキシケト酸(ヒドロキシピルビン酸または4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸または5−ヒドロキシ−2−ケトペンタン酸)および約40μgの精製タンパク質を用いて行った。分光光度計にて340nmでNADHの消費をモニタリングした。基質を欠いた対照アッセイにおいて検出された活性を、基質を含むアッセイにおいて検出された活性から差し引いた。1単位のヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性は、30℃で1分間に1μmolのヒドロキシケト酸の脱炭酸を触媒するのに必要な酵素量である(ε340nm=6290M−1cm−1)。
大腸菌の遺伝子yqhDによりコードされているヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性の証明
8.1 YqhDの特性決定のための株:MG1655 ΔpykF::Km(pTRC99A−yqhD)の構築
8.1.1 MG1655 ΔyqhD::Km株の構築
yqhD遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔyqhDF(配列番号78)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
ΔyqhDR(配列番号79)
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
yqhDF(配列番号80):
yqhDR(配列番号81):
YqhDタンパク質の特性決定を行うために、対応する遺伝子をベクターpTRC99A(Amersham)から発現させた。このために、yqhD遺伝子を、オリゴヌクレオチドyqhD F pTRC99A FおよびyqhD R pTRC99A Rを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。PCR産物を、酵素HindIIIおよびBspHIを用いて制限酵素処理し、NcoI−HindIII制限酵素で処理したベクターpTRC99Aにクローニングした。得られたベクターをpTRC99A−yqhDと呼んだ。
yqhD F pTRC99A F(配列番号82):
・BspHI制限部位(太字の文字)
yqhD R pTRC99A R(配列番号83):
・HindIII制限部位(太字の文字)
次にpTRC99A−yqhDプラスミドをMG1655 ΔyqhD::Km株に導入した。
タンパク質YqhDを37℃、好気性条件下、2.5g/lのグルコースおよび50mg/lのアンピシリンおよび50mg/lのカナマイシンを含む500ml LB培地の入った2lバッフル付きエルレンマイヤーフラスコで過剰産生した。これらのフラスコをオービタルシェーカーにて200rpmで振盪した。550nmで測定した光学密度が0.5単位に達した際に、フラスコを25でインキュベートした。光学密度が1.2単位に達した際に、IPTGを終濃度500μMとなるように加えることによりYqhDタンパク質の生産を誘導した。培養物が3.5単位を超える光学密度に達した際に遠心分離によりバイオマスを採取した。上清を廃棄し、ペレットを−20℃で保存した。
8.3.1 工程1:細胞不含抽出物の調製
400mgの大腸菌バイオマスを70mlの50mM Hepes pH7.5およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞をRosettセルRZ3中、氷上で、30秒間隔で30秒8回音波処理した。音波処理後、細胞を室温で1時間、1mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともにインキュベートした。4℃、12000gで30分の遠心分離により細胞残渣を除去した。上清を粗抽出物として維持した。
粗抽出物を50%濃度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、固体の硫酸アンモニウム(300g/l)を氷上で粗抽出物に加えた。4℃で15分のインキュベーションの後、混合物を4℃、12000gにて15分遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿を50mlの50mM Hepes pH7.5、1 M硫酸アンモニウムに溶解させた。
8.3.3 工程3:疎水性クロマトグラフィー
8.4.1 4−ヒドロキシブチルアルデヒドの化学合成
4−ヒドロキシブチルアルデヒドの化学合成は刊行物:N°158 Transposition des dihydro-2.5 furannes en dihydro-2.3 furannes. - Application a la preparation de l'hydroxy-4 butanal; par R. PAUL, M. FLUCHAIRE et G. GOLLARDEAU.
Bulletin de la Societe Chimique de France, 668-671, 1950に記載されている。
グリコールアルデヒドおよび4−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ活性は、分光光度計にて波長340nmおよび30℃の一定温度でNADPH酸化の初速を測定することによりアッセイした。グリコールアルデヒドまたは4−ヒドロキシブチルアルデヒドを基質として用いた反応混合物は、20mM Hepes pH7.5、0.1mM硫酸亜鉛、0.2mM NADPH、2μgの精製酵素を最終容量1mlで実施した。反応混合物を30℃で5分インキュベートした後、基質(グリコールアルデヒドまたは4−ヒドロキシブチルアルデヒド)を終濃度10mMで加えることにより反応を開始させた。基質を欠いた対照アッセイ(ブランク)を並行して測定し、NADPHの非特異的酸化(ε340nm=6290M−1cm−1)を考慮に入れるため、対照に対して測定された値をアッセイに対して測定された値から差し引いた。1単位の酵素活性は、このアッセイ条件下で1分間に1μmolの基質を消費した酵素の量と定義した。特異的酵素活性はタンパク質1mg当たりの単位として表した。
基質3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3−HPA)に対するYqhDの活性は刊行物:Hongmei Li; Jia Chen; Hao Li; Yinghua Li; Ying Li; (2008). Enhanced activity of yqhD oxidoreductase in synthesis of 1,3-propanediol by error-prone PCR Prog Nat Sci., 18 (12), 1519-1524に記載されている。これらの筆者は3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼアッセイに5mM塩化亜鉛、1mM EDTAおよび1mM β−メルカプトエタノールを使用した。
大腸菌の遺伝子serCによりコードされているL−セリントランスアミナーゼ活性の証明
9.1 SerCの特性決定のための株:BL21(pPAL7−serC)株の構築
SerCタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターpPAL7(Bio-rad)から発現させた。
このために、serC遺伝子を、オリゴヌクレオチドpPAL7−serC FおよびpPAL7−serC Rを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。PCR産物を、酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターpPAL7にクローニングした。得られたベクターをpPAL7−serCと呼んだ。
pPAL7−serC F(配列番号84):
・HindIII制限部位を担持する領域(下線の文字)
pPAL7−serC R(配列番号85):
・EcoRI制限部位を担持する領域(下線の文字)
次にpPAL7−serCプラスミドをコンピテントBL21(DE3)細胞(Invitrogen)に導入した。
実施例7.2と同じプロトコールを適用し、タンパク質SerCの過剰生産を行った。
9.3.1 工程1:細胞不含抽出物の調製
約280mgの大腸菌バイオマスを45mlの100mMリン酸カリウムpH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液(15ml/コニカル試験管)を50mlコニカル試験管中、氷上で、30秒間隔で30秒8回音波処理した(Bandelin sonoplus、70W)。音波処理後、細胞を室温で30分、5mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともにインキュベートした。4℃、12000gで30分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
製造者が推奨するプロトコールに従い、Profinityカラム(BIORAD、Bio−Scale Mini Profinity exactカートリッジ5ml)での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を100mMリン酸カリウムpH7.6で平衡化した5ml Profinity exactカートリッジにのせた。このカラムを10カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温にて、100mMリン酸カリウムpH7.6、100mMフッ化物とともに30分インキュベートした。2カラム容量の100mMリン酸カリウムpH7.6で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、100mM Tris HCl、150mM NaClおよび10%グリセロールpH8に対して透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
L−セリントランスアミナーゼ活性アッセイのため、約30μgの精製酵素を、総容量300μl中、50mM Tris−HClバッファーpH8.2、3mM L−セリン、1mM α−ケトグルタル酸を含有するバッファーに加えた。この反応物を30℃で60分インキュベートした。反応生成物(ヒドロキシピルビン酸)をLC−MS/MSにより直接測定した。
サッカロミセス・セレビシエの遺伝子GPP2によりコードされている3−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性の証明
10.1 GPP2scの特性決定のための株:BL21(pFAL7−gpp2sc)の構築
GPPタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターpPAL7(Bio-rad)から発現させた。
このために、gpp遺伝子を、オリゴヌクレオチドpPAL7−gpp2sc FおよびpPAL7−gpp2sc Rを用い、サッカロミセス・セレビシエゲノムから増幅した。PCR産物を、酵素HindIIIおよびBamHIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素により処理したベクターpPAL7にクローニングした。得られたベクターをpPAL7−gpp2scと呼んだ。
pPAL7−gpp2sc F(配列番号86):
・HindIII制限部位を担持する領域(下線の文字)
pPAL7−kivDll R(配列番号87):
・BamHI制限部位を担持する領域(下線の文字)
次にpPAL7−gpp2scプラスミドをコンピテントBL21(DE3)細胞(Invitrogen)に導入する。
実施例7.2と同じプロトコールを適用し、タンパク質GPP2scの過剰生産を行った。
10.3.1 工程1:細胞不含抽出物の調製
約294mgの大腸菌バイオマスを45mlの100mMリン酸カリウムpH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁した。細胞懸濁液(15ml/コニカル試験管)を50mlコニカル試験管中、氷上で、30秒間隔で30秒8回音波処理した(Bandelin sonoplus、70W)。音波処理後、細胞を室温で30分、5mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともにインキュベートした。4℃、12000gで30分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
製造者が推奨するプロトコールに従い、Profinityカラム(BIORAD、Bio−Scale Mini Profinity exactカートリッジ5ml)での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を100mMリン酸カリウムpH7.6で平衡化した5ml Profinity exactカートリッジにのせた。このカラムを10カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温にて、100mMリン酸カリウムpH7.6、100mMフッ化物とともに一晩インキュベートした。2カラム容量の100mMリン酸カリウムpH7.6で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、100mMリン酸カリウム、150mM NaClおよび10%グリセロールpH8に対して透析し、0.22μg/μlの濃度まで濃縮した。
タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
10.4.1 3−ホスホヒドロキシピルビン酸の化学合成
3−ホスホヒドロキシピルビン酸の化学合成は刊行物:CE Ballou; H Hesse; R Hesse; (1956).The Synthesis and Properties of Hydroxypyruvic Acid Phosphate J Am Chem Soc, 78 (15), 3718-3720に記載されている。
10.4.2 3−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性アッセイ
エチレングリコール、1,3−プロパンジオールおよび1,4−ブタンジオール生産の最大収量のシミュレーション
11.1 シミュレーションに用いるパラメーター
シミュレーションは、本発明者らのMETEX専売ソフトウエアMETOPT(商標)を用いて行った。中枢代謝ネットワーク、あらゆるバイオマス前駆体の代謝経路および上記のような特定の生産経路を含む、大腸菌の簡略化された代謝ネットワークを用いた。大腸菌で慣例のバイオマス組成を用いた。各特異的ジオールにつき2つのシミュレーションを行った。第一のシミュレーションは理論的最大収量を計算するものであり(増殖も維持エネルギーも考えずにモデルの化学量論だけを考慮する)、第二のシミュレーションは、増殖速度0.1h−1および維持エネルギー5mmolATP・gDW −1h−1を考慮して実際の最大収量を計算するものである。シミュレーションは総て、グルコースの特異的取り込み率3mmol・gDW−1h−1で行った。エチレングリコールおよび1,3−プロパンジオールに関しては、好気性条件でシミュレーションを行った。特に1,4−ブタンジオールでは、好気性条件と嫌気性条件の双方でシミュレーションを行った。嫌気性条件では、増殖速度は0.1h−1とすることができなかった。増殖速度は利用可能なATPに応じて達成可能な最大増殖速度である。
11.2 シミュレーション結果
Claims (7)
- エチレン−グリコール、1,3−プロパンジオール、および1,4−ブタンジオールから選択される脂肪族ジオールの生物生産のために遺伝的に改変された微生物であって、
乳酸連鎖球菌由来のkivD遺伝子によりコードされる2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなり、該脱炭酸工程から得られた産物が、さらに、大腸菌由来のyqhD遺伝子によりコードされるヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を用いて対応する脂肪族ジオールへ還元されるものであり、
該ヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物が、
− 該脂肪族ジオールがエチレン−グリコールである場合にはヒドロキシピルビン酸であり、あるいは
− 該脂肪族ジオールが1,3−プロパンジオールである場合には4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸であり、あるいは
− 該脂肪族ジオールが1,4−ブタンジオールである場合には5−ヒドロキシ−2−ケトペンタン酸であり、かつ
該ヒドロキシ−2−ケト−脂肪酸代謝産物の生産が改良されるように遺伝的に改変されている、微生物。 - 細菌、酵母および真菌からなる群から選択される、請求項1に記載の微生物。
- 腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バシラス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)から選択される、請求項1または2に記載の微生物。
- エチレン−グリコール、1,3−プロパンジオール、および1,4−ブタンジオールから選択される脂肪族ジオールの発酵生産のための方法であって、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地上で培養する工程と、
その培養培地から対応する脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、方法。 - ジオールがさらに精製される、請求項4に記載の方法。
- 炭素源が、六炭糖、五炭糖、単糖、二糖、オリゴ糖、糖蜜、デンプンおよびその組合せから選択される、請求項4または5に記載の方法。
- 炭素源が、グルコースおよびスクロースから選択される、請求項6に記載の方法。
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