JP2007517517A - １，２−プロパンジオールの産生のための発展型微生物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、シンプル炭素源の代謝による１，２−プロパンジオールの産生のための発展型微生物株の新規製造方法に関し、該方法は、初期株において、ＤＨＡＰからメチルグリオキサールへ、次いで１，２−プロパンジオールへと至る生合成経路にかかわる１以上の、遺伝子の改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ活性」を保有する発展型遺伝子への発展を引き起こすために、遺伝子tpiAを欠失し且つメチルグリオキサール（プロパナール）の乳酸への転換にかかわる少なくとも１つの遺伝子を欠失している該初期バクテリア株を、シンプル炭素源を含む適切な増殖培地中で淘汰圧下で増殖させることを含み、次いで得られる改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ活性」を保有する発展型微生物株を選択および単離する。
本発明はまた、このようにして得られた初期微生物および発展型微生物、および該発展型微生物の培養による１，２−プロパンジオールおよびことによるとアセトンの製造方法に関する。
【選択図】なし
本発明はまた、このようにして得られた初期微生物および発展型微生物、および該発展型微生物の培養による１，２−プロパンジオールおよびことによるとアセトンの製造方法に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、１，２−プロパンジオールを製造する発展型（evolue）微生物の新規製造方法、それにより得られる発展型微生物および１，２−プロパンジオールを製造するためのその使用に関する。
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールすなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の徐氷液体の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より有毒であると認識されているエチレン誘導体の代わりとして１９９３−１９９４年以来ますます使用されてきている。
１，２−プロパンジオールは、現在大量の水を消費するプロピレンオキシド水和過程を用いて化学的手段により製造されている。プロピレンオキシドは、２つの過程のどちらかにより生成され得、１つはエピクロロヒドリンを用い、他のものはヒドロペルオキシドを用いる。両経路は、毒性が強い物質を用いる。さらに、ヒドロペルオキシド経路は、ｔｅｒ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールのような副生成物を発生させる。プロピレンの産生を有利にするために、これらの副生成物の用途を見出さなくてはならない。化学的経路は、一般的にラセミ１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールの各々はある適用には興味深いものである。
これらの１，２−プロパンジオールの化学的合成の欠点が、生物学的産生を魅力的な代替手段としている。いくつかの微生物は、生来、グルコースまたはキシロースなどの糖から（解糖経路により代謝される）またはデオキシヘキソースから（（Ｓ）１，２−プロパンジオールを産出する）（Ｓ）または（Ｒ）１，２−プロパンジオールを産生する能力がある (Cameron D. C. et al. (1998) Biotechnol. Prog.)。優良微生物としては、Clostridium sphenoides (Tran Din K. et al. 1986)およびThermoanaerobium thermosaccharolyticum (Altaras N. E. and Cameron D. C. 2001)が挙げられる。後者は、消費したグルコースのグラムあたり産生する１，２−プロパンジオールが０．１３〜０．２８ gの範囲の収量で、数種類の糖を（Ｒ）１，２−プロパンジオールに発酵する能力がある。これらの２つの微生物において、１，２−プロパンジオールの合成に関与する酵素は同定されておらず、それらの性能におけるどんな改良も、利用可能な遺伝的手段の不足により制限されている。さらに、E. coliは生来１，２−プロパンジオールを産生しないが、その産生のために必要な全ての遺伝子を保有している。現在 １，２−プロパンジオールは、低濃度でさえ細胞に対する毒性が強い物質であるメチルグリオキサールから製造されている。また、１，２−プロパンジオールを産生するように遺伝子的に改変されたE. coliの株を用いるプロセスは、特にUS 6 303 352、US 6 087 140およびWO 98/37204に記載されている。これらのプロセスは、特に、プラスミドにそれらの遺伝子をクローニングすることによる代謝１，２−プロパンジオール産生経路にかかわる１以上の酵素の過剰発現を用い、そこで抗生物質を用いる淘汰圧を必要とする。株の性能を改良するために、ある内因性遺伝子もまた、欠失される（例えば、Altaras N. E. and Cameron D. C. (2000) Biotechnol. Prog. 16, 940-946: Altaras N. E. and Cameron D. (1999) Appl. Env. Microb., 65, 1180-1185を参照）。
２つの有用な産物である１，２−プロパンジオールおよびアセトンを共産生する発展型微生物を用いる方法は、今日まで記載されていない。
本発明は、シンプル（simple）炭素源の代謝による１，２−プロパンジオールの産生のための発展型微生物の株の製造方法に関し、該方法は、シンプル炭素源を含む適切な増殖培地において淘汰圧下で、初期バクテリア株を培養することを含み、該初期バクテリア株は、該初期株におけるＤＨＡＰのメチルグリオキサールへの次いで１，２−プロパンジオールへの生物変換に関与する１以上の遺伝子の改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ」活性を有する改変遺伝子への発展（evoluer）を引き起こすために、遺伝子tpiAの欠失およびメチルグリオキサール（プロパナール）の乳酸への転換にかかわる少なくとも１つの遺伝子の欠失を受け、該改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ」活性を有する発展型微生物株が次いで選択および単離されるものである。
遺伝子tpiAは、ＤＨＡＰのグリセルアルデヒド三リン酸への転換を触媒するトリオースリン酸イソメラーゼをコードしている。この遺伝子の欠失の目的は、十分な量のメチルグリオキサールの合成を確保することである。理論的には、遺伝子tpiAの欠失は、細胞により代謝されたグルコースの炭素５０％がジヒドロキシアセトンリン酸からのメチルグリオキサールの製造に割り当てられるのを確実にするはずである。
メチルグリオキサール（プロパナール）の乳酸への転換にかかわる少なくとも１つの遺伝子の欠失の目的は、存在しているならびに初期株および得られた発展型株により産生されたメチルグリオキサールが該株の細胞機構により１，２−プロパンジオールの製造に実質的に用いられるように、メチルグリオキサールの乳酸への転換を阻害することである。
メチルグリオキサールの乳酸への転換にかかわる遺伝子は、グリオキシラーゼＩ（メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒している）をコードしている遺伝子gloAまたはラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（（Ｓ）ラクトアルデヒドからの（Ｓ）乳酸の合成を触媒している）をコードしている遺伝子aldAおよびaldBのいずれかである。全３つの遺伝子gloA、aldAおよびaldBは、初期株において優先的に欠失される。
ＮＡＤＨのような還元当量を消費する天然のグルコース発酵経路を抑制するさらなる改変が、初期株に対して有利になされ、それは１，２−プロパンジオール産生と競合するこれらの代謝経路を除去するためである。
特に、ピルビン酸からの乳酸の合成を触媒している乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子ldhA、およびアセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成を触媒しているアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子adhEを欠失することは有利である。
同様に、微生物がピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を用いて、嫌気的にピルビン酸からアセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＨを産生するようにすることが可能である。これはピルビン酸ギ酸リアーゼをコードしている遺伝子pflAおよびpflBを欠失することにより達成し得る。
したがって、特定の実施態様において、初期株はまた、遺伝子ldhA、pflA、pflBおよびadhEの１以上の欠失を受け、好ましくは４つの遺伝子ldhA、pflA、pflB およびadhEのすべての欠失を受ける。
本発明における初期株は、ピルビン酸の酢酸への嫌気性代謝を促進する酵素をコードしている少なくとも１つの遺伝子をも含むことがいっそう有利であろう。
好ましくは、該酵素は、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＨの産生への嫌気性代謝を促進する。より好ましくは、この酵素はピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体である。
有利には、ピルビン酸の酢酸への嫌気性代謝を促進する酵素をコードしている該遺伝子は、ＮＡＤＨによる阻害に対する感受性が低下している。
この遺伝子は、内因性タンパク質をコードしている内因性遺伝子、または内因性または外因性酵素をコードしている外因性または異種遺伝子であり得る。
内因性遺伝子がＮＡＤＨによる阻害に対して感受性な内因性タンパク質をコードしている場合、本発明における発展プロセスは、ピルビン酸の酢酸への嫌気性代謝を促進する酵素をコードしている該遺伝子がＮＡＤＨによる阻害に対する感受性が低下した発展型酵素をコードする、改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ」活性を有する株を選択することを可能とする。
本発明の別の実施態様において、初期株に異種遺伝子を導入することが可能であり、該遺伝子は、ＮＡＤＨによる阻害に対する感受性が低下した酵素をコードするか、感受性ではあるが本発明における発展プロセスの実施により感受性が低くなっている酵素をコードする。
さらに、エントナー−ドウドロフ経路にかかわる最初の酵素である６−ホスホグルコン酸脱水酵素をコードしている遺伝子eddを欠失させて、グルコースのグリセルアルデヒド三リン酸およびピルビン酸への直接の代謝を妨げ、そしてグルコースの１，２−プロパンジオールおよび酢酸への転換を誘導することもまた有利である。
前もって単離した本発明の発展プロセスにより得られた発展型株に、アセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンへの転換にかかわる１以上の酵素をコードしている１以上の異種遺伝子を導入して改変発展型株を得ることは有利である。
この新規改変は、１，２−プロパンジオールおよび有用な副生成物であるアセトンを産生することを可能とする。この改変は、さらに、１，２−プロパンジオール産生能の改良といった利益をもたらす。酢酸は、低濃度（１５ｇ／ｌ）でバクテリアの増殖の阻害物質であり、そして嫌気的条件下でのケモスタット的に増殖した株の性能の発展を即座に妨害する。
酢酸のアセトンへの転換を触媒する酵素をコードしている遺伝子の発展型株への導入は、ケモスタット増殖の間の残余酢酸濃度の減少をもたらす。アセトンが産生されるが、それは酢酸よりもはるかに増殖阻害をしない。このようにして株の増殖および１，２−プロパンジオールの産生は、促進される。
有利には、アセチル−ＣｏＡおよび酢酸の転換にかかわる１以上の酵素をコードしている１もしくは複数の異種遺伝子は、C. acetobutylicum由来である。アセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンへの転換にかかわる１以上の酵素をコードしている遺伝子は、染色体中でまたは染色体外で発現し得る。染色体中には、１以上のコピーが、当業者に公知の組み換え方法の助けによりゲノムに導入され得る。染色体外には、遺伝子は、複製起点、コピー数および細胞内での安定性が異なる様々なタイプのプラスミドにより運ばれ得る。それらは、低いコピー数およびストリクトな複製タイプのプラスミド(pSC101, RK2)、低いコピー数のプラスミド(pACYC, pRSF1010)または高いコピー数のプラスミド(pSK bluescript II) に対応して、１〜５コピー、または２０コピーまたは５００コピー以上で存在し得る。遺伝子は、誘導型または非誘導型の強さの異なるプロモーターを用いて発現させることができる。これらは、例えばプロモーターPtrc、PtacもしくはPlac、または当業者に公知の他のプロモーターであり得る。ターゲット遺伝子の発現は、メッセンジャーＲＮＡ（Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog., 15, 58-64）またはタンパク質（例えば、GSTtags, Amersham Biosciences）を安定化または不安定化する要素によって増加または減少し得る。
本発明における好ましい実施態様においては、前もって得られた改変発展型株を、シンプル炭素源を含む適切な増殖培地中において淘汰圧下で増殖させ、該改変発展型株においてアセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンへの転換にかかわる１以上の遺伝子の改良された「アセトンシンターゼ活性」への発展を引き起こす。次いで、改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ活性」と改良された「アセトンシンターゼ活性」を保有する第二世代発展型株を、選択および単離する。
本発明はまた、上記、下記および実施例に記載されるような本発明における初期株に関する。
本発明はまた、上記、下記および実施例に記載されるような本発明の方法により得られ得る改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ活性」を保有している発展型株にも関し、「改良されたアセトンシンターゼ活性」をさらに保有する第二世代の発展型株を含む。
最後に、本発明は、本発明における発展型株を、シンプル炭素源を含む適切な増殖培地中において増殖させた後、産生された１，２−プロパンジオールと共産生され得るアセトンを回収、必要であれば、精製することによる、１，２−プロパンジオールの製造方法に関する。
本発明における微生物の初期改変および発展型株は、それらに１，２−プロパンジオールおよびことによるとアセトンも産生させるようにするように転換および増殖し得る原核生物または真核生物であり得る。
当業者は、細胞および分子生物学における一般的な知識に基づき該微生物を選択することができるであろうし、もし必要であれば、上述のE. coliの遺伝子に対応するこれらの微生物の遺伝子を同定することもできる。
本発明における「微生物の株」なる語は、その種の少なくとも１つの微生物を含む同じ種に属する一連の微生物を意味することになる。したがって、株について記載した特性は、その株の各微生物にあてはまる。相互に、株の微生物のうちのいずれか１つについて記載した特性は、その株の全ての微生物にあてはまる。
本発明において改変される微生物は、バクテリア、酵母または真菌、そして特に以下の種のいずれかであり得る: Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
好ましい実施態様において、バクテリアの株は、Escherichia、特にE. coliの株である。別の実施態様において、バクテリアの株は、Corynebacterium、特にC. glutamicumの株である。
別の実施態様において、酵母の株は、Saccharomyces、特にS. cerevisiaeの株である。
本発明は、上記、下記そして実施例においてE. coliに関して記載されている。したがって、本発明における発展型株のために欠失または過剰発現され得る遺伝子は、主にE. coliの遺伝子の呼称を用いて明示されている。しかしながら、この表示は、本発明においてより一般的な意味を持ち、他の微生物における対応遺伝子を包含する。E. coliの遺伝子のGenBankレファレンスを用いて、当業者は、E. coli以外のバクテリアの株における同等遺伝子を決定できる。
相同配列およびそれらの相同性率の同定の手段は、当業者に周知であり、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上でそのウェブサイト上に示されたデフォルトのパラメーターを使って用いることができるＢＬＡＳＴプログラムが挙げられる。得られた配列は、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）またはＭＵＬＴＡＬＩＮ（http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl）を用い、それらのウェブサイト上に示されたデフォルトのパラメーターを使って、活用する(アラインさせる)ことができる。
既知の遺伝子に対してGenBank上で与えられたレファレンスを用いて、当業者は、他の生物、すなわちバクテリアの株、酵母、真菌、哺乳類および植物などにおける同等遺伝子を決定することができる。この定型的作業は、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを用いて決定することができるコンセンサス配列を用いて有利に行われ、それによって縮重プローブを設計することにより他の生物において対応遺伝子をクローン化することができる。これらの分子生物学の定型的手法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)に記載されている。
本発明における「欠失」なる語は、遺伝子の活性の抑制を意味し、それは次いで「欠失した」といわれる。この活性の抑制は、適切な手段による関連遺伝子の発現の産物の不活性化であり得、または関連遺伝子の発現の阻害であり得、またはそれが発現しないような（例えば、その発現に必要なプロモーター領域の全てまたは一部の欠失）、もしくは発現産物がその機能を失うような（例えば、関連遺伝子のコードしている部分における欠失）少なくとも関連遺伝子の一部の欠失であり得る。好ましくは、遺伝子の欠失は、実質的にその遺伝子の抑制であり、その遺伝子は本発明の発展型株の同定、単離および精製を容易にする選択マーカー遺伝子により置換され得る。
遺伝子は、相同組換えにより選択的に不活性化される（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645）。簡単にいえば、不活性化プロトコルは以下の通りであり得る：ＤＮＡの線状フラグメントを細胞に導入する。このフラグメントはインビトロで得、遺伝子を挟む２つの領域、そしてこれらの２つの領域の間にある少なくとも１つの選択遺伝子（一般的に抗生物質耐性遺伝子）を含む。このフラグメントはこのように、不活性化した遺伝子を与える。組換え現象を受け導入したフラグメントを組み込んだ細胞を、選択増殖培地に蒔くことにより選択する。生来の遺伝子が不活性化した遺伝子により置換された二重組換え現象を受けた細胞を、次いで選択する。このプロトコルは、二重組換え現象の検出をスピードアップするためにポジティブおよびネガティブ選択系を用いて改良され得る。
これらの遺伝子を株に導入するのに優先的に用いられる手法は、エレクトロポレーションであり、それは当業者によく知られている。簡単にいえば、エレクトロポレーションプロトコルは以下の通りであり得る：目的の異種遺伝子をプロモーターとターミネーターの間で発現ベクター内にクローン化する。このベクターはまた、それを含む細胞を選択するための抗生物質耐性遺伝子およびそれが維持されるように宿主株において機能的な複製起点を保有する。このプロトコルは、エレクトロコンピテント宿主細胞の製造を必要とし、それは次いでベクターによるエレクトロポレーションにより転換される。
本発明において、エレクトロポレーションにより導入される遺伝子は、好ましくは遺伝子adc、ctfAおよびB、thlであり、それらはアセトンの非常に強力な生物学的産生者として認識されている微生物であるClostridium acetobutylicumの天然のアセトン産生経路の、アセト酢酸カルボキシラーゼ、補酵素Ａトランスフェラーゼおよびチオラーゼをそれぞれコードしている。
本発明における発展プロセスは、それによって代謝経路を改変することができる発展型微生物の製造方法であり、以下の工程を優先的に含む：
ａ）初期微生物の細胞をセット培地（milieu defini）で増殖させる際、そうしなければ他の産生また消費される代謝産物の産生または消費を阻害するように、微生物を改変して初期微生物を得る、
ｂ）上で得られた初期改変微生物に発展を生じさせるために、該微生物を該セット培地で増殖させる、ここで該セット培地はまた、発展に必要な補基質を含み得る、
ｃ）必要であれば補基質を追加して、該セット培地で増殖することができる改変微生物の細胞を選択する。
ａ）初期微生物の細胞をセット培地（milieu defini）で増殖させる際、そうしなければ他の産生また消費される代謝産物の産生または消費を阻害するように、微生物を改変して初期微生物を得る、
ｂ）上で得られた初期改変微生物に発展を生じさせるために、該微生物を該セット培地で増殖させる、ここで該セット培地はまた、発展に必要な補基質を含み得る、
ｃ）必要であれば補基質を追加して、該セット培地で増殖することができる改変微生物の細胞を選択する。
このタイプの発展プロセスは、特に特許出願WO O4/076659に記載されており、その内容は参考のため本明細書に含まれる。
発展型代謝経路は、特に１，２−プロパンジオール合成経路、および適切な場合アセトン合成経路である。
本発明において「セット培地」なる語は、微生物の増殖に適合した既知の分子組成の培地を意味する。セット培地は、実質的に代謝産物がなく、その産生または消費は、該改変により抑制されている。
本発明において「補基質」なる語は、有機物または無機物であり得、そして基質とは異なり、それが基質に１以上のその原子を与えて最終産物を形成する反応に加わる物質を意味する。補基質は、既知の変異原性を有さない。
本発明において「選択」なる語は、連続的であり得、課された希釈速度と同等またはより高い増殖速度を示す微生物のみが増殖培地に保存されるように希釈速度を増加させることにより行われる増殖プロセスを意味する。このようにして保存された微生物は、実施した改変がそれらにとってもはや増殖に影響しないものである。
本発明における「発展型遺伝子」なる語は、同調した開始および終止コドンに境界され、選択の後で、少なくとも１つの核酸により初めの配列と異なる核酸の配列を意味する。
本発明における「発展型タンパク質」なる語は、選択の後で、少なくとも１つのアミノ酸により初めの配列と異なるアミノ酸の配列（タンパク質配列）を意味する。
遺伝子およびタンパク質は、それらの一次配列により、そしてまたタンパク質のグループを定義する配列相同性またはアラインメントにより同定され得る。
ＰＦＡＭデータベース（protein families database of alignments and Hidden Markov Models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列のアラインメントの膨大なコレクションである。各ＰＦＡＭは、多重アラインメントが目に見えるように、タンパク質ドメインが見えるように、生物間の分布が評価できるように、他のデータベースにアクセスできるようにそして既知のタンパク質構造が目に見えるようにする。
ＣＯＧｓ（Clusters of Orthologous Groups of protein http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、３０の主要な系統発生系列を表す４３の完全に配列決定されたゲノム由来のタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系列から定義され、古来の保存されたドメインの同定を可能とする。
本発明における語「培養」、「増殖」および「発酵」は、互換的に用いられ、シンプル炭素源を含む適切な増殖培地上でのバクテリアの増殖を意味する。
本発明における「シンプル炭素源」なる語は、微生物および特にバクテリアの正常な増殖を支えるために当業者により用いられ得るいかなる炭素源をも意味し、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましいシンプル炭素源は、グルコースである。
本発明における微生物の培養条件（発酵）は、当業者により容易に決定され得る。特に、バクテリアは２０℃〜５５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度で発酵され、好ましくはC. glutamicumおよびS．cerevisiaeについては約３０℃そしてE. coliについては約３４℃で発酵される。
発酵は、少なくとも１つのシンプル炭素源および、必要に応じて、代謝産物の産生に必要な補因子を含む、用いるバクテリアに適合した既知のセット組成のミネラル培養培地を含む発酵槽内で一般的に行われる。
特に、E. coli用のミネラル増殖培地は、Ｍ９培地（Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128）、Ｍ６３培地（Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork）またはSchaefer et al.により規定されたような培地（1999, Anal. Biochem. 270: 88-96）と同一または類似の組成のものであり得、そして特に以下の最小培養培地である:
培地のｐＨは、水酸化ナトリウムで７．４に調整する。
＊ 微量元素溶液：クエン酸 ４ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４ ３ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２ ０．１ ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４ ０．１０ ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４ １０ ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３１０ ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４ １０ ｍｇ／Ｌ。
＊ 微量元素溶液：クエン酸 ４ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４ ３ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２ ０．１ ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４ ０．１０ ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４ １０ ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３１０ ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４ １０ ｍｇ／Ｌ。
同じように、C. glutamicum用のミネラル増殖培地はまた、ＢＭＣＧ培地（Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210）またはRiedel et al. により規定されたような培地（2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583）と同一または類似の組成のものであり得る。
発酵は、好ましくは嫌気的およびケモスタット的に行われ、すなわち、固定された希釈速度で固定された濃度の炭素源を含む該最小増殖培地が連続的に供給され、窒素で脱気される。
発酵供給培地における炭素源の濃度は、残余炭素源濃度により限定される恒久的管理が安定に達しそして数日そのままである時点でだけ増加させる。
好ましい培養モードは、ケモスタット培養モードであり、なぜなら増殖の改善および改変株による１，２−プロパンジオール産生能を促進し、発展型微生物の単離を可能にするからである。
本発明における改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ活性」なる語は、ＤＨＡＰの１，２−プロパンジオールへの転換経路にかかわる全ての酵素活性の改良をいう。発展型微生物における改良された酵素活性は、同一の培養条件における対応する初期微生物により産生される量と比較しての、発展型微生物により産生される１，２−プロパンジオールの量の上昇をもたらす。
本発明における改良された「アセトンシンターゼ活性」なる語は、酢酸およびアセチル−ＣｏＡのアセトンへの転換経路にかかわる全ての酵素活性の改良をいう。第二世代発展型微生物における発展型酵素活性は、同一の培養条件における対応する改変発展型微生物と比較しての、第二世代の発展型微生物により産生されるアセトンの量の上昇をもたらす。
本発明はまた、本発明におけるプロセスにより得られた発展型株における発展型遺伝子の単離および特性決定、ならびに該発展型遺伝子によりコードされている発展型タンパク質に関する。これらの発展型遺伝子は、次いで、対応する発展型タンパク質の産生のために該生物におけるその発現に適切な調節要素のコントロール下で宿主生物に導入することができる。
ケモスタット培養の間の発展型微生物、特にE. coli株MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB の性能の改良は、これらの増殖条件により嫌気的条件下で機能的な内因性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を選択することができ、その条件下でＮＡＤＨはふんだんに産生されることを示唆している。ＮＡＤＨの放出と共にピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの転換を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、好気的条件下でのみ機能するが、一方嫌気的条件下では、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡおよびギ酸への転換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼが機能することが公知である（Snoep J． L．， De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993)）。ピルビン酸の脱炭酸反応によりＮＡＤＨを産生するように、１，２−プロパンジオールの産生のために構築したE. coliの改変株で実施した改変の１つは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性をコードしている遺伝子pflAおよびpflBの欠失である。この改変細胞のための唯一の可能性は、ＮＡＤＨ当量の産生を伴うピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によりピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに代謝することである。改変発展型株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、特徴付けられており、野生株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体よりもＮＡＤＨに対する感受性が低い。
本発明は、嫌気的条件下で機能的でありそしてグリセルアルデヒド三リン酸の酢酸への酸化により２ＮＡＤＨ当量を産生するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の選択を可能とする。これらのＮＡＤＨ当量は、ジヒドロキシアセトンリン酸の１，２−プロパンジオールへの還元経路によってのみ再酸化され得る。ＮＡＤＨに対する感受性の低い酵素複合体の選択は、１，２−プロパンジオールの高い産生率を促進する。
本発明は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリポアミドデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子lpd（その野生型配列は公知 http://genolist.pasteur.fr/Colibri）の変異を選択するのに有利につながる。特に、バリンによるアラニン５５の置換を引き起こす点変異の存在が、同定されている。この酵素は、ＮＡＤＨによるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の阻害を担うことが知られている。この改変酵素もまた、本発明の対象である。
本発明は、改変微生物、特にE. coli株MG1655ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの性能の、また、嫌気的ケモスタット培養の間の発展により、ＤＨＡＰの１，２−プロパンジオールへの転換経路にかかわる内因性酵素の改良を可能にする。これらの酵素の発展は、増殖速度の増加および１，２−プロパンジオールのより高い最終濃度をもたらす。
好ましくは、本発明において、発展型株は遺伝子gldAの発展を含まない。特定の実施態様において、遺伝子gldAは、発展型株において欠失されている。
下記の実施態様の例は、本発明の説明を意図し、その範囲を限定するものではない。
実施例１：グルコースの発酵により１，２−プロパンジオールおよび酢酸のみを産生する能力のあるE. coli MG1655ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの改変株の構築:
ａ）改変株E. coli MG1655ΔtpiA:: cmの構築
遺伝子tpiAを、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。用いた手法は、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645により記載されている。
２つのオリゴヌクレオチドを、遺伝子tpiAを置換するのに用いた：
DtpiAr、１００塩基からなる（配列番号１）：
atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子tpiA（配列4108320〜4109087）の配列（4109007-4109087）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/）、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645）。
DtpiAf、１００塩基からなる（配列番号２）：
cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−tpiAの配列（4108320-4108400）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドDtpiArおよびDtpiAfを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現したsystem λ Red (γ、β、exo) が相同組換えを大いに促進する株 MG1655 (pKD46) にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドcdhおよびYIIQを使ってPCR分析により確認した。
cdh（配列番号３）：
ggtgatgatagttatcgccg（配列41 07536〜4107555と相同）
YIIQ（配列番号４）：
cgtgccatcgacagcagtcc（配列4109599〜4109580と相同）
クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を、次いで、エレクトロポレーションにより組み換え株に導入した（Cheperanov P. P. & Wackernagel W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcRand KmR cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, gene, 158, 9-14）。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前述で用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ってPCR分析により確認した。
ｂ）E. coli MG1655ΔplfAB:: cmの改変株の構築
遺伝子plfAおよびpflBを、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。用いた手法は、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)により記載されている。
２つのオリゴヌクレオチドを、遺伝子pflAおよびpflBを置換するのに用いた:
DplfB r、１００塩基からなる（配列番号５）：
ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子plfB（配列950495〜952777)の配列（952235-952315）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）(Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)
DplfAf、１００塩基からなる（配列番号６）：
gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子pflA（配列949563〜950303）の上方に位置する配列（949470-949550）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2を、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現した酵素 Red リコンビナーゼが相同組換えを可能にする株 MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2を使ってPCR分析により確認した。
pflAB 1（配列番号７）：
agacattaaaaatatacgtgcagctacccg（配列948462〜948491と相同）。
pflAB 2（配列番号８）：
gtgaaagctgacaacccttttgatctttta（配列953660〜983689と相同）。
ｃ）E. coli MG1655ΔtpiA, ΔplfABの改変株の構築
株 MG1655 ΔtpiAにおけるクロラムフェニコール耐性カセットによる遺伝子の置換による遺伝子pflAおよびpflbの欠失を、ファージP1を使って形質導入手法により行った。プロトコルには２つの工程がある、株MG1655ΔplfAB::cm のファージ溶解物の製造、およびこのファージ溶解物による株 MG1655ΔtpiAの形質導入。
ファージ溶解物の製造
− １０ ｍlのＬＢ＋Ｃｍ ３０ μｇ／ｍｌ＋グルコース ０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭの１００ μｌの株MG1655（ΔplfAB::cm）の一晩培養物での播種。
− 振盪しながら３７℃で３０分インキュベーション。
− 野生株MG1655において調製した１００ μｌのファージ溶解物P1の添加（およそ１×ｌ０９ ファージ／ｍｌ)。
− 全ての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪。
− ２００ μlのクロロホルムの添加、およびボルテックス。
− 細胞残屑を除去するために４５００ ｇで１０分遠心分離。
− 上清の滅菌試験管内への移動および２００ μlのクロロホルムの添加。
− ４℃での溶解物の保存。
形質導入
− ５ ｍｌのＬＢ培地における株MG1655（ΔtpiA）の一晩培養物の１５００ ｇでの１０分の遠心分離。
− ２．５ ｍｌのＭｇＳＯ４１０ ｍＭ、ＣａＣｌ２ ５ ｍＭ中への細胞ペレットの懸濁。
− − コントロール試験管：１００ μｌ細胞
１００ μｌの株 MG1655（ΔpflAB::cm）のファージP1。
− 試験管試験: １００ μｌの細胞＋１００ μｌの株MG1655(ΔpflAB::cm)のファージP1。
− 振盪せずに３０℃で３０分インキュベーション。
− 各チューブへの１００ μl クエン酸ナトリウム１ Ｍの添加、およびボルテックス。
− １ ｍｌのＬＢの添加。
− 振盪しながら３７℃で１時間インキュベーション。
− 試験管を７０００ ｒｐｍで３分の遠心分離後、ＬＢ＋Ｃｍ ３０ μｇ／ｍｌディッシュへ蒔く。
− ３７℃で一晩インキュベーション。
株の検証
抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、含んでいる領域 (pflAB::cm) の挿入を、そして株ΔpflAB::cmにおける遺伝子tpiAの欠失もまた確認するために、オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2、ならびにcdhおよびYIIQを使ってPCR分析により確認した。 結果として生じた株を、MG1655 Δ (pflAB::cm, ΔtpiA)と名付けた。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555ΔtpiA, ΔpflABと名付けた。
ｄ）E. coli MG1655ΔadhE::cm の改変株の構築
前述のように遺伝子adhEを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
DadhE r、１００塩基からなる（配列番号９）：
atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子adhE（配列1294669〜1297344）の配列（1297263-1297343）と相同な領域（小文字）、サイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)。
DadhEf、１００塩基からなる（配列番号１０）：
caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子adhEの配列（1294694-1294774）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドDadhErおよびDadhEfを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドychGfおよびadhECrを使ってPCR分析により確認した。
ychGf（配列番号１１）：
ggctcattgcaccaccatccag（配列1294357〜1294378と相同）
adhECr（配列番号１２）：
gaaaagacgcgctgacaatacgcc（配列1297772〜1297749と相同）。
ｅ）株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEの構築
株MG1655 ΔtpiA, ΔplfAB における遺伝子adhEの欠失を、前述のようにファージP1を使った形質導入手法を用いて行った（プロトコルｃを参照）。ファージP1の溶解物を、株MG1655 ΔadhE::cmで得、株MG1655 ΔtpiAΔpflABの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子adhEの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドychCfおよびadhECrを用い、また、株ΔadhE::cmにおける遺伝子pflAおよびB、ならびにtpiAの欠失を確認するために、オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2、ならびにcdhおよびYIIQを用いて検証した。
前述のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEと名付けた。
ｆ）E. coli M1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaの改変株の構築
株 MG1655ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEの遺伝子ldhA（座標1439878〜1440867）を、上記のようにファージP1手法（プロトコルｃを参照）を用いて不活性化した。ファージ溶解物を、Clark D. P.により提供された株E. coli K12 NZN11Δplf:: cam, ldhA:: kana（Bunch P. K., Mat-Jan F. and Clark D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli: Microbiology, 143, 187-195.）を使って得た。株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEの形質導入を、株 E. coli K12 NZN11 Δplf:: cam, ldhA:: kanaのファージ溶解物を用いて実施した。形質導入体をカナマイシンで選択し、遺伝子ldhAにおけるカマイシンカセットの挿入をオリゴヌクレオチドhslJCおよびldhAC2を用いて確認した。
hslJC（配列番号１３）：
gccatcagcaggcttagccg（配列1439345〜1439767と相同）
ldhAC2（配列番号１４）：
gggtattgtggcatgtttaaccg（配列1441007〜1441029と相同）
得られた株を、MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaと名付けた。
ｇ）E. coli MG1655 ΔgloA:: cmの改変株の構築
遺伝子gloAを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、上記のようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
GLOAD f、１００塩基からなる（配列番号１５）
atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子gloA（配列1725861〜1726268）の配列（1725861-1725941）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)。
GLOA D R（配列番号１６）：
ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子gloA（1725861-1726268）の配列（1726188-1726268）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドGLOADrおよびGLOADfを、プラスミドpKD3を形成するクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するために用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドNem A C dおよびRnt C rを使ってPCR分析により確認した。
NemAQd（配列番号１７）：
gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg（1725331〜1725361と相同）
Rnt Cr（配列番号１８）：
gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg（配列1726765〜1726795と相同）
ｈ）E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAの改変株の構築
株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaにおける遺伝子gloAを、上記のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1の溶解物を株MG1655 ΔgloA::cmで得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子gloA の変異を確認するためにオリゴヌクレオチドNemAQdおよびRnt Crを用いて、また株ΔgloA:: cmにおける遺伝子pflAおよびB、tpiA、adhE、ならびにldhAの欠失を確認するためにオリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2、cdhおよびYIIQ、ychCfおよびadhECr、ならびにhslJCおよびldhAC2を用いて検証した。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAと名付けた。
ｉ）E. coli MG1655 ΔaldA:: cmの改変株の構築
遺伝子aldAを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)により記載されている手法を用いて、上記のようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
AldA D f、１００塩基からなる（配列番号１９）：
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子aldA（配列1486256〜1487695）の配列（1486256-1486336）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
aldAD r、１００塩基からなる（配列番号２０）：
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG
−aldA（1486256〜1487695）の配列（1487615-1487695）と相同な領域（小文字）。
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドAldA D rおよびaldAD fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、クロラムフェニコール耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドYdc F C fおよびgapCCrを使ったPCR分析により確認した。
Ydc F C f（配列番号２１）：
tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg（1485722〜1485752と相同）
gapCCr（配列番号２２）：
cacgatgacgaccattcatgcctatactggc（配列1488195〜1488225と相同）
ｈ）E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAの改変株の構築
株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAの遺伝子aldAを、上記のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を、株MG1655 ΔaldA:: cmで得、株MG1655ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子aldAの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドYdc F C fおよびgapCCrを用いて、また株ΔaldA:: cmにおける遺伝子gloA、pflAおよびB、tpiA、adhE、それぞれの欠失を確認するためにオリゴヌクレオチドNemAQdおよびRnt Cr、pflAB1およびpflAB2、cdhおよびYIIQ、ychCfおよびadhECr、ならびにhslJCおよびldhAC2を用いて検証した。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAと名付けた。
ｇ）E. coli MG1655ΔaldB:: cmの改変株の構築
遺伝子aldBを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、上記のようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
AldB D f、１００塩基からなる（配列番号２３）
tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子aldB（配列3752603〜3754141）の配列（3752603-3752683）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
aldBD r、１００塩基からなる（配列番号２４）：
atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子aldB（3752603〜3754141）の配列（3754061-3754141）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドAldB D rおよびaldB D fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655(pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、クロラムフェニコール耐性カセットの挿入をオリゴヌクレオチドaldB C fおよびYiaYCrを用いてPCR分析により確認した。
aldB C f（配列番号２５）：
catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc（配列3752057〜3752095と相同）
YiaYCr（配列番号２６）：
tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg（配列3754644〜3754674と相同）
ｈ）E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの改変株の構築
株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, aldAにおける遺伝子aldBを、上記のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を、株MG1655 ΔaldB:: cmで得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子aldBの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドaldB C fおよびYiaYCrを用いて、また、株ΔaldB:: cmにおける遺伝子gloA、pflAおよびB、tpiA、adhE、aldA、それぞれの欠失を確認するためにオリゴヌクレオチドNemAQdおよびRnt Cr、PflAB1およびpflAB2、cdhおよびYIIQ、ychCfおよびadhECr、hslJCおよびldhAC2、ならびにYdc F C fおよびgapCCrを用いて検証した。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、上記で用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBと名付けた。
ａ）改変株E. coli MG1655ΔtpiA:: cmの構築
遺伝子tpiAを、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。用いた手法は、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645により記載されている。
２つのオリゴヌクレオチドを、遺伝子tpiAを置換するのに用いた：
DtpiAr、１００塩基からなる（配列番号１）：
atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子tpiA（配列4108320〜4109087）の配列（4109007-4109087）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/）、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645）。
DtpiAf、１００塩基からなる（配列番号２）：
cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−tpiAの配列（4108320-4108400）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドDtpiArおよびDtpiAfを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現したsystem λ Red (γ、β、exo) が相同組換えを大いに促進する株 MG1655 (pKD46) にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドcdhおよびYIIQを使ってPCR分析により確認した。
cdh（配列番号３）：
ggtgatgatagttatcgccg（配列41 07536〜4107555と相同）
YIIQ（配列番号４）：
cgtgccatcgacagcagtcc（配列4109599〜4109580と相同）
クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を、次いで、エレクトロポレーションにより組み換え株に導入した（Cheperanov P. P. & Wackernagel W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcRand KmR cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, gene, 158, 9-14）。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前述で用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ってPCR分析により確認した。
ｂ）E. coli MG1655ΔplfAB:: cmの改変株の構築
遺伝子plfAおよびpflBを、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。用いた手法は、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)により記載されている。
２つのオリゴヌクレオチドを、遺伝子pflAおよびpflBを置換するのに用いた:
DplfB r、１００塩基からなる（配列番号５）：
ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子plfB（配列950495〜952777)の配列（952235-952315）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）(Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)
DplfAf、１００塩基からなる（配列番号６）：
gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子pflA（配列949563〜950303）の上方に位置する配列（949470-949550）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2を、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現した酵素 Red リコンビナーゼが相同組換えを可能にする株 MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2を使ってPCR分析により確認した。
pflAB 1（配列番号７）：
agacattaaaaatatacgtgcagctacccg（配列948462〜948491と相同）。
pflAB 2（配列番号８）：
gtgaaagctgacaacccttttgatctttta（配列953660〜983689と相同）。
ｃ）E. coli MG1655ΔtpiA, ΔplfABの改変株の構築
株 MG1655 ΔtpiAにおけるクロラムフェニコール耐性カセットによる遺伝子の置換による遺伝子pflAおよびpflbの欠失を、ファージP1を使って形質導入手法により行った。プロトコルには２つの工程がある、株MG1655ΔplfAB::cm のファージ溶解物の製造、およびこのファージ溶解物による株 MG1655ΔtpiAの形質導入。
ファージ溶解物の製造
− １０ ｍlのＬＢ＋Ｃｍ ３０ μｇ／ｍｌ＋グルコース ０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭの１００ μｌの株MG1655（ΔplfAB::cm）の一晩培養物での播種。
− 振盪しながら３７℃で３０分インキュベーション。
− 野生株MG1655において調製した１００ μｌのファージ溶解物P1の添加（およそ１×ｌ０９ ファージ／ｍｌ)。
− 全ての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪。
− ２００ μlのクロロホルムの添加、およびボルテックス。
− 細胞残屑を除去するために４５００ ｇで１０分遠心分離。
− 上清の滅菌試験管内への移動および２００ μlのクロロホルムの添加。
− ４℃での溶解物の保存。
形質導入
− ５ ｍｌのＬＢ培地における株MG1655（ΔtpiA）の一晩培養物の１５００ ｇでの１０分の遠心分離。
− ２．５ ｍｌのＭｇＳＯ４１０ ｍＭ、ＣａＣｌ２ ５ ｍＭ中への細胞ペレットの懸濁。
− − コントロール試験管：１００ μｌ細胞
１００ μｌの株 MG1655（ΔpflAB::cm）のファージP1。
− 試験管試験: １００ μｌの細胞＋１００ μｌの株MG1655(ΔpflAB::cm)のファージP1。
− 振盪せずに３０℃で３０分インキュベーション。
− 各チューブへの１００ μl クエン酸ナトリウム１ Ｍの添加、およびボルテックス。
− １ ｍｌのＬＢの添加。
− 振盪しながら３７℃で１時間インキュベーション。
− 試験管を７０００ ｒｐｍで３分の遠心分離後、ＬＢ＋Ｃｍ ３０ μｇ／ｍｌディッシュへ蒔く。
− ３７℃で一晩インキュベーション。
株の検証
抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、含んでいる領域 (pflAB::cm) の挿入を、そして株ΔpflAB::cmにおける遺伝子tpiAの欠失もまた確認するために、オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2、ならびにcdhおよびYIIQを使ってPCR分析により確認した。 結果として生じた株を、MG1655 Δ (pflAB::cm, ΔtpiA)と名付けた。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555ΔtpiA, ΔpflABと名付けた。
ｄ）E. coli MG1655ΔadhE::cm の改変株の構築
前述のように遺伝子adhEを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
DadhE r、１００塩基からなる（配列番号９）：
atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子adhE（配列1294669〜1297344）の配列（1297263-1297343）と相同な領域（小文字）、サイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)。
DadhEf、１００塩基からなる（配列番号１０）：
caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子adhEの配列（1294694-1294774）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドDadhErおよびDadhEfを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドychGfおよびadhECrを使ってPCR分析により確認した。
ychGf（配列番号１１）：
ggctcattgcaccaccatccag（配列1294357〜1294378と相同）
adhECr（配列番号１２）：
gaaaagacgcgctgacaatacgcc（配列1297772〜1297749と相同）。
ｅ）株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEの構築
株MG1655 ΔtpiA, ΔplfAB における遺伝子adhEの欠失を、前述のようにファージP1を使った形質導入手法を用いて行った（プロトコルｃを参照）。ファージP1の溶解物を、株MG1655 ΔadhE::cmで得、株MG1655 ΔtpiAΔpflABの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子adhEの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドychCfおよびadhECrを用い、また、株ΔadhE::cmにおける遺伝子pflAおよびB、ならびにtpiAの欠失を確認するために、オリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2、ならびにcdhおよびYIIQを用いて検証した。
前述のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEと名付けた。
ｆ）E. coli M1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaの改変株の構築
株 MG1655ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEの遺伝子ldhA（座標1439878〜1440867）を、上記のようにファージP1手法（プロトコルｃを参照）を用いて不活性化した。ファージ溶解物を、Clark D. P.により提供された株E. coli K12 NZN11Δplf:: cam, ldhA:: kana（Bunch P. K., Mat-Jan F. and Clark D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli: Microbiology, 143, 187-195.）を使って得た。株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhEの形質導入を、株 E. coli K12 NZN11 Δplf:: cam, ldhA:: kanaのファージ溶解物を用いて実施した。形質導入体をカナマイシンで選択し、遺伝子ldhAにおけるカマイシンカセットの挿入をオリゴヌクレオチドhslJCおよびldhAC2を用いて確認した。
hslJC（配列番号１３）：
gccatcagcaggcttagccg（配列1439345〜1439767と相同）
ldhAC2（配列番号１４）：
gggtattgtggcatgtttaaccg（配列1441007〜1441029と相同）
得られた株を、MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaと名付けた。
ｇ）E. coli MG1655 ΔgloA:: cmの改変株の構築
遺伝子gloAを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、上記のようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
GLOAD f、１００塩基からなる（配列番号１５）
atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子gloA（配列1725861〜1726268）の配列（1725861-1725941）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)。
GLOA D R（配列番号１６）：
ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子gloA（1725861-1726268）の配列（1726188-1726268）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドGLOADrおよびGLOADfを、プラスミドpKD3を形成するクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するために用いた。得られたPCR産物を、次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドNem A C dおよびRnt C rを使ってPCR分析により確認した。
NemAQd（配列番号１７）：
gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg（1725331〜1725361と相同）
Rnt Cr（配列番号１８）：
gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg（配列1726765〜1726795と相同）
ｈ）E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAの改変株の構築
株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaにおける遺伝子gloAを、上記のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1の溶解物を株MG1655 ΔgloA::cmで得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kanaの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子gloA の変異を確認するためにオリゴヌクレオチドNemAQdおよびRnt Crを用いて、また株ΔgloA:: cmにおける遺伝子pflAおよびB、tpiA、adhE、ならびにldhAの欠失を確認するためにオリゴヌクレオチドpflAB1およびpflAB2、cdhおよびYIIQ、ychCfおよびadhECr、ならびにhslJCおよびldhAC2を用いて検証した。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAと名付けた。
ｉ）E. coli MG1655 ΔaldA:: cmの改変株の構築
遺伝子aldAを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)により記載されている手法を用いて、上記のようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
AldA D f、１００塩基からなる（配列番号１９）：
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子aldA（配列1486256〜1487695）の配列（1486256-1486336）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
aldAD r、１００塩基からなる（配列番号２０）：
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG
−aldA（1486256〜1487695）の配列（1487615-1487695）と相同な領域（小文字）。
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドAldA D rおよびaldAD fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、クロラムフェニコール耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドYdc F C fおよびgapCCrを使ったPCR分析により確認した。
Ydc F C f（配列番号２１）：
tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg（1485722〜1485752と相同）
gapCCr（配列番号２２）：
cacgatgacgaccattcatgcctatactggc（配列1488195〜1488225と相同）
ｈ）E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAの改変株の構築
株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAの遺伝子aldAを、上記のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を、株MG1655 ΔaldA:: cmで得、株MG1655ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloAの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子aldAの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドYdc F C fおよびgapCCrを用いて、また株ΔaldA:: cmにおける遺伝子gloA、pflAおよびB、tpiA、adhE、それぞれの欠失を確認するためにオリゴヌクレオチドNemAQdおよびRnt Cr、pflAB1およびpflAB2、cdhおよびYIIQ、ychCfおよびadhECr、ならびにhslJCおよびldhAC2を用いて検証した。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、前に用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAと名付けた。
ｇ）E. coli MG1655ΔaldB:: cmの改変株の構築
遺伝子aldBを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、上記のようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
AldB D f、１００塩基からなる（配列番号２３）
tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子aldB（配列3752603〜3754141）の配列（3752603-3752683）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
aldBD r、１００塩基からなる（配列番号２４）：
atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATCCTCCTTAG
伴う:
−遺伝子aldB（3752603〜3754141）の配列（3754061-3754141）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドAldB D rおよびaldB D fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655(pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、クロラムフェニコール耐性カセットの挿入をオリゴヌクレオチドaldB C fおよびYiaYCrを用いてPCR分析により確認した。
aldB C f（配列番号２５）：
catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc（配列3752057〜3752095と相同）
YiaYCr（配列番号２６）：
tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg（配列3754644〜3754674と相同）
ｈ）E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの改変株の構築
株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, aldAにおける遺伝子aldBを、上記のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を、株MG1655 ΔaldB:: cmで得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子aldBの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドaldB C fおよびYiaYCrを用いて、また、株ΔaldB:: cmにおける遺伝子gloA、pflAおよびB、tpiA、adhE、aldA、それぞれの欠失を確認するためにオリゴヌクレオチドNemAQdおよびRnt Cr、PflAB1およびpflAB2、cdhおよびYIIQ、ychCfおよびadhECr、hslJCおよびldhAC2、ならびにYdc F C fおよびgapCCrを用いて検証した。
上記のように、クロラムフェニコール耐性カセットを次いで除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位で作用するFLPリコンビナーゼを持っているプラスミドpCP20を次いで、エレクトロポレーションにより組換え株に導入した。４２℃での連続培養の後、抗生物質耐性カセットの損失を、上記で用いたのと同じオリゴヌクレオチドを使ったPCR分析により確認した。得られた株を、MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBと名付けた。
実施例２： ケモスタット培養における改変株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの培養および発展
株E. coli MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBによるグルコースからの１，２−プロパンジオールの産生を最適化するために、硝酸ナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地における株のケモスタット培養を、嫌気的条件下で数週間実施した。
培養開始時に、培養フィードタンク内のグルコースの初期濃度は２０ ｇ／ｌであり、希釈速度は０．０４ ｈ-１であり、嫌気的条件を確保するために連続的な窒素流を維持した。細胞濃度および１，２−プロパンジオールおよび酢酸の産生は、低かった。培養の数週間後、増殖および産物の濃度は上昇し、残余グルコース濃度および産物の一定の濃度により特徴付けられた安定した管理に達した（図２）。
株E. coli MG16555 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBによるグルコースからの１，２−プロパンジオールの産生を最適化するために、硝酸ナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地における株のケモスタット培養を、嫌気的条件下で数週間実施した。
培養開始時に、培養フィードタンク内のグルコースの初期濃度は２０ ｇ／ｌであり、希釈速度は０．０４ ｈ-１であり、嫌気的条件を確保するために連続的な窒素流を維持した。細胞濃度および１，２−プロパンジオールおよび酢酸の産生は、低かった。培養の数週間後、増殖および産物の濃度は上昇し、残余グルコース濃度および産物の一定の濃度により特徴付けられた安定した管理に達した（図２）。
実施例３：NADHに対する感受性の低い発展型ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の特性決定
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（PDHc）のNADHに対する感受性の低いPDHcへの発展を、インビトロでの発展型酵素の活性のアッセイにより、そして発展型PDHcのリポアミドデヒドロゲナーゼをコードしている１つの遺伝子（lpd）の配列と野生型PDHcの遺伝子のそれとの比較により実証した。
ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性のアッセイ
株E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのPDHcのインビトロ酵素活性のアッセイを、Schwartz and Reed（Schwartz E. R. & Reed L. J. (1970) Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli, Biochemistry, 6, 1434-1439）に記載されるプロトコルを用いて行った。
細胞培養物の１００ ｍｌのアリコートを、嫌気的フード（hood）下で扱ってケモスタット培養槽から前もって脱気したビンに回収した。細胞懸濁液を、６０００ ｒｐｍで１０分遠心分離した。ペレットを、約１００ ｍｌの５０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．９、０．５ ｍＭ チアミンピロリン酸に再懸濁し、再び６０００ ｒｐｍで１０分遠心分離した。それを、同条件で２回洗浄した。細胞ペレットを、８００ μｌの緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を、４回の処理サイクルで超音波装置を用いて粉砕し（３０％で３０秒）氷上で２分間静置することにより分離し、細胞残屑を１３，４００ ｒｐｍで5分遠心分離することにより除去した。上清は、粗無細胞抽出液であった。酵素アッセイに干渉するであろう無細胞抽出液中に存在する塩を、該抽出物をリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．９,０．５ ｍＭチアミンピロリン酸で平衡にしたPD10カラムに通すことにより除去した。抽出物を、３．５ ｍｌの上記と同じ緩衝液で抽出した。回収した溶出液は、粗無細胞抽出液であった。
粗無細胞抽出液の酵素活性を、始めにNADHの不在下で、次いで０．１４ ｍＭから２．７ ｍＭに増加する濃度のNADHの存在下で測定した。得られた結果を、図３において文献で報告されているE. coliの野生株のものと比較した（Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azotobactor vinelandii and Escherichia coli: implications for their activity in vivo, FEMS Microbiology Letters, 114, 279-284）。
得られた結果は、発展型改変株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのPDHcは、E. coliの野生株よりNADHに対して感受性が低いことを示している。
の比で、野生株のPDHcの活性の全阻害を観察し、一方発展型PDHcの活性８０％を見出した。
b) 発展型株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリポアミドデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子lpdの配列の決定
株E. coli*MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの染色体DNAを、ＬＢでの一晩培養物の１ ｍｌから抽出した。遠心の後、細胞を滅菌水で洗浄し、９４℃で５分で加えた熱ショックにより粉砕した。染色体DNAを、遠心の後上清中に回収した。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）をコードしている遺伝子lpd（配列127912〜129336）を、以下の２つのオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅した：
AceEf（配列番号２７）：
cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg（配列127504〜127532と相同）
YacH r（配列番号２８）：
aagttcaggagagccgccc（配列127513〜129531と相同）
遺伝子lpdに対応する２０００塩基対のPCR産物を得、配列決定した。得られた結果は、アラニン５５がバリンで置換されている点変異の存在を示している。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（PDHc）のNADHに対する感受性の低いPDHcへの発展を、インビトロでの発展型酵素の活性のアッセイにより、そして発展型PDHcのリポアミドデヒドロゲナーゼをコードしている１つの遺伝子（lpd）の配列と野生型PDHcの遺伝子のそれとの比較により実証した。
ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性のアッセイ
株E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのPDHcのインビトロ酵素活性のアッセイを、Schwartz and Reed（Schwartz E. R. & Reed L. J. (1970) Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli, Biochemistry, 6, 1434-1439）に記載されるプロトコルを用いて行った。
細胞培養物の１００ ｍｌのアリコートを、嫌気的フード（hood）下で扱ってケモスタット培養槽から前もって脱気したビンに回収した。細胞懸濁液を、６０００ ｒｐｍで１０分遠心分離した。ペレットを、約１００ ｍｌの５０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．９、０．５ ｍＭ チアミンピロリン酸に再懸濁し、再び６０００ ｒｐｍで１０分遠心分離した。それを、同条件で２回洗浄した。細胞ペレットを、８００ μｌの緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を、４回の処理サイクルで超音波装置を用いて粉砕し（３０％で３０秒）氷上で２分間静置することにより分離し、細胞残屑を１３，４００ ｒｐｍで5分遠心分離することにより除去した。上清は、粗無細胞抽出液であった。酵素アッセイに干渉するであろう無細胞抽出液中に存在する塩を、該抽出物をリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．９,０．５ ｍＭチアミンピロリン酸で平衡にしたPD10カラムに通すことにより除去した。抽出物を、３．５ ｍｌの上記と同じ緩衝液で抽出した。回収した溶出液は、粗無細胞抽出液であった。
粗無細胞抽出液の酵素活性を、始めにNADHの不在下で、次いで０．１４ ｍＭから２．７ ｍＭに増加する濃度のNADHの存在下で測定した。得られた結果を、図３において文献で報告されているE. coliの野生株のものと比較した（Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azotobactor vinelandii and Escherichia coli: implications for their activity in vivo, FEMS Microbiology Letters, 114, 279-284）。
得られた結果は、発展型改変株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのPDHcは、E. coliの野生株よりNADHに対して感受性が低いことを示している。
b) 発展型株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリポアミドデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子lpdの配列の決定
株E. coli*MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの染色体DNAを、ＬＢでの一晩培養物の１ ｍｌから抽出した。遠心の後、細胞を滅菌水で洗浄し、９４℃で５分で加えた熱ショックにより粉砕した。染色体DNAを、遠心の後上清中に回収した。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）をコードしている遺伝子lpd（配列127912〜129336）を、以下の２つのオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅した：
AceEf（配列番号２７）：
cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg（配列127504〜127532と相同）
YacH r（配列番号２８）：
aagttcaggagagccgccc（配列127513〜129531と相同）
遺伝子lpdに対応する２０００塩基対のPCR産物を得、配列決定した。得られた結果は、アラニン５５がバリンで置換されている点変異の存在を示している。
実施例４：発展型改変株 E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBのメチルグリオキサールの１，２−プロパンジオールへの転換経路はグリセロールデヒドロゲナーゼを含まない
発展型改変株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの改良した性能は遺伝子gldAによりコードされたグリセロールデヒドロゲナーゼの発展によるものではないことを示すために、遺伝子gldAが欠失した発展型株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBを作製した。
ａ）改変株 MG1655 ΔgldA:: cmの構築
遺伝子gldAを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、実施例１に示されるようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
gldA D f、１００塩基からなる（配列番号２９）：
gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子gldA（配列4135512〜4136615）の配列（4135512〜4135592）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
gldA D r、１００塩基からなる（配列番号３０）：
atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子gldA（4135512〜4136615）の配列（4136535-4136615）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドgldA D rおよびgldA D fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、クロラムフェニコール耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドYijF DおよびTalCrを使ったPCR分析により確認した。
YijF D（配列番号３１）：
gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg（配列4135140〜4135174と相同）
TalCr（配列番号３２）：
cacgcatattccccattgccgggg（配列4137216〜4137239と相同）
２１００塩基対のPCR産物を、野生型遺伝子および欠失遺伝子に対し得、クロラムフェニコール耐性遺伝子により置換した。こうして得られたPCR産物を次いで、Sall制限酵素により消化した。約１０００塩基対の２つのフラグメントを、野生型PCR産物に対して得、一方、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むPCR産物は消化されなかった。
ｂ）発展型改変株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA:: cmの構築
発展型株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana,, ΔgloA, ΔaldA ΔaldBの遺伝子gldAを、実施例１のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を株MG1655 ΔgldA:: cmを使って得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子gldAの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドYijF DおよびTalCr を用いて検証した。
ｃ）発展型改変株E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA:: cmおよびE. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの培養
２つの発展型改変株E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA:: cmおよびE. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBを、未調整のｐＨで２０ ｇ／ｌの初期グルコース濃度でナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地内で嫌気的条件下で１０日間培養した。得られた発酵産物のプロフィールは、遺伝子gldAの欠失が１，２−プロパンジオールの産生のいかなる削減も引き起こさなかったことを示している (表１)。
発展型改変株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの改良した性能は遺伝子gldAによりコードされたグリセロールデヒドロゲナーゼの発展によるものではないことを示すために、遺伝子gldAが欠失した発展型株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBを作製した。
ａ）改変株 MG1655 ΔgldA:: cmの構築
遺伝子gldAを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、実施例１に示されるようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
gldA D f、１００塩基からなる（配列番号２９）：
gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子gldA（配列4135512〜4136615）の配列（4135512〜4135592）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
gldA D r、１００塩基からなる（配列番号３０）：
atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子gldA（4135512〜4136615）の配列（4136535-4136615）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドgldA D rおよびgldA D fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を次いで、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、クロラムフェニコール耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドYijF DおよびTalCrを使ったPCR分析により確認した。
YijF D（配列番号３１）：
gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg（配列4135140〜4135174と相同）
TalCr（配列番号３２）：
cacgcatattccccattgccgggg（配列4137216〜4137239と相同）
２１００塩基対のPCR産物を、野生型遺伝子および欠失遺伝子に対し得、クロラムフェニコール耐性遺伝子により置換した。こうして得られたPCR産物を次いで、Sall制限酵素により消化した。約１０００塩基対の２つのフラグメントを、野生型PCR産物に対して得、一方、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むPCR産物は消化されなかった。
ｂ）発展型改変株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA:: cmの構築
発展型株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana,, ΔgloA, ΔaldA ΔaldBの遺伝子gldAを、実施例１のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を株MG1655 ΔgldA:: cmを使って得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldAの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子gldAの変異を確認するためにオリゴヌクレオチドYijF DおよびTalCr を用いて検証した。
ｃ）発展型改変株E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA:: cmおよびE. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの培養
２つの発展型改変株E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB ΔgldA:: cmおよびE. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBを、未調整のｐＨで２０ ｇ／ｌの初期グルコース濃度でナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地内で嫌気的条件下で１０日間培養した。得られた発酵産物のプロフィールは、遺伝子gldAの欠失が１，２−プロパンジオールの産生のいかなる削減も引き起こさなかったことを示している (表１)。
実施例５：発展型株 E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBにおいて６−ホスホグルコン酸脱水酵素をコードしている遺伝子eddの欠失によるグルコースの１，２−プロパンジオールへの転換の産出における改良。
ａ）改変株MG1655 Δedd:: cmの構築
遺伝子eddを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、実施例１に示したようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
edd D f、１００塩基からなる（配列番号３３）
ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子edd（配列1930817〜1932628）の配列（1930817〜4）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
edd D r、１００塩基からなる（配列番号３４）：
atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子edd（配列1930817〜1932628）の配列（1932548-1932628）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドedd D rおよびedd D fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を次いで、オリゴヌクレオチドeda dおよびzwf rを用いたPCR分析により確認した：
Eda d（配列番号３５）：
CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC（配列1930439〜1930462と相同）
Zwf r（配列番号３６）：
GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG（配列1932968〜1932996と相同）
ｂ）発展型改変株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd:: cmの構築
発展型株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana,, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBにおける遺伝子eddを、実施例１のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を株 MG1655 Δedd:: cmを使って得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子eddの変異を検証するためにオリゴヌクレオチドeda dおよびzwf rを用いて検証した。
ｃ）発展型改変株E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmおよびE. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの培養
２つの発展型改変株 E.coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmおよびE.coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB を、未調整のｐＨで２０ ｇ／ｌの初期グルコース濃度で硝酸ナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地内で嫌気的条件下で１０日間培養した。得られた発酵産物のプロフィールは、遺伝子eddの欠失がグルコースの１，２−プロパンジオールへの転換の収量を０．１３ ｇ／ｇから０．３５ ｇ／ｇに増加したことを示す (表２) 。発展型株E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBにおける遺伝子eddの欠失は、このように株の性能を改良した。
ａ）改変株MG1655 Δedd:: cmの構築
遺伝子eddを、Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)に記載される手法を用いて、実施例１に示したようにクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失することにより不活性化した。
２つのオリゴヌクレオチドを、欠失を実施するのに用いた：
edd D f、１００塩基からなる（配列番号３３）
ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
伴う:
−遺伝子edd（配列1930817〜1932628）の配列（1930817〜4）と相同な領域（小文字）、ウェブサイト上の参照配列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)、および
−プラスミドpKD3のクロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K. A. & Wanner, B.L. (2000)
edd D r、１００塩基からなる（配列番号３４）：
atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子edd（配列1930817〜1932628）の配列（1932548-1932628）と相同な領域（小文字）、および
−プラスミドpKD3が持っているクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットの増幅のための領域（大文字）。
オリゴヌクレオチドedd D rおよびedd D fを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを増幅するのに用いた。得られたPCR産物を、そこで発現した酵素Redリコンビナーゼが相同組換えを可能にする株MG1655 (pKD46)にエレクトロポレーションにより導入した。抗生物質耐性形質転換体を次いで選択し、耐性カセットの挿入を次いで、オリゴヌクレオチドeda dおよびzwf rを用いたPCR分析により確認した：
Eda d（配列番号３５）：
CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC（配列1930439〜1930462と相同）
Zwf r（配列番号３６）：
GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG（配列1932968〜1932996と相同）
ｂ）発展型改変株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd:: cmの構築
発展型株 MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana,, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBにおける遺伝子eddを、実施例１のようにファージP1手法を用いて不活性化した（プロトコルｃを参照）。ファージP1溶解物を株 MG1655 Δedd:: cmを使って得、株MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの形質導入をこの溶解物を用いて実施した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を、遺伝子eddの変異を検証するためにオリゴヌクレオチドeda dおよびzwf rを用いて検証した。
ｃ）発展型改変株E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmおよびE. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBの培養
２つの発展型改変株 E.coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmおよびE.coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB を、未調整のｐＨで２０ ｇ／ｌの初期グルコース濃度で硝酸ナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地内で嫌気的条件下で１０日間培養した。得られた発酵産物のプロフィールは、遺伝子eddの欠失がグルコースの１，２−プロパンジオールへの転換の収量を０．１３ ｇ／ｇから０．３５ ｇ／ｇに増加したことを示す (表２) 。発展型株E. coli *MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldBにおける遺伝子eddの欠失は、このように株の性能を改良した。
実施例６：１，２−プロパンジオールおよびアセトンを産生する能力のある改変株E. coli MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cm (pSOS95T)の構築
pSOS95Tと名付けたプラスミドは、チオラーゼプロモーターの依存下でアセト酢酸カルボキシラーゼ、補酵素Ａトランスフェラーゼおよびチオラーゼをそれぞれコードしている４つの遺伝子adc、ctfAB、thlでできているClostridium acetobutylicumのアセトンオペロンを担持しているE. coli/C. acetobutylicumのためのシャトル発現ベクターである。これらの３つの酵素は、アセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンおよび二酸化炭素への転換を触媒する。プラスミドpSOS95Tを、チオラーゼをコードしているC. acetobutylicumの遺伝子thlをプラスミドpSOS95 (Gene bank accession number AY187686)に、チオラーゼプロモーターと遺伝子ctfAの間にある部位BamH1で挿入することによって得た。プラスミドpSOS95Tを、エレクトロポレーションにより発展型株 E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmに導入した。
株E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmのエレクトロコンピテント細胞を、ＬＢでの一晩培養物の１ ｍｌから調製した。コニカルフラスコ内の１０ ｍｌ ＬＢの培養物を蒔いて(１／１００)一晩培養し、３７℃でインキュベートした。５５０ ｎｍでの培養物の吸光度が０．４〜０．６の間の値に達した時に、１ ｍｌの培養物を取り、遠心分離した。細胞を、０．０５ ｍｌの１０％グリセロール溶液に再懸濁する前に、水および１０％グリセロール溶液で洗浄した。細胞を、５ μlのプラスミド製造物pSOS95T (Qiagen, Hilden, Germany) で即座にエレクトロポレーション処理した (２５ μＦ、２００Ω、２．５ ｋＶ)(Gene Pulser, Biorad)。３７℃でＳＯＣ培地中での１時間の表現型発現の後（Sambrook J., Fristch E. F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）、形質転換体を、３７℃で１００ μｇ／ｍｌカルベニシリンを加えた寒天培地上で選択した。
形質転換体を、カルベニシリンの存在下で一晩液体培養に戻し、プラスミドpSOS95Tの存在を確認するためにおよびそれが酵素消化により十分であることを確信するためにプラスミドＤＮＡの抽出 (Qiagen, Hilden Germany)を実施した。
pSOS95Tと名付けたプラスミドは、チオラーゼプロモーターの依存下でアセト酢酸カルボキシラーゼ、補酵素Ａトランスフェラーゼおよびチオラーゼをそれぞれコードしている４つの遺伝子adc、ctfAB、thlでできているClostridium acetobutylicumのアセトンオペロンを担持しているE. coli/C. acetobutylicumのためのシャトル発現ベクターである。これらの３つの酵素は、アセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンおよび二酸化炭素への転換を触媒する。プラスミドpSOS95Tを、チオラーゼをコードしているC. acetobutylicumの遺伝子thlをプラスミドpSOS95 (Gene bank accession number AY187686)に、チオラーゼプロモーターと遺伝子ctfAの間にある部位BamH1で挿入することによって得た。プラスミドpSOS95Tを、エレクトロポレーションにより発展型株 E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmに導入した。
株E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cmのエレクトロコンピテント細胞を、ＬＢでの一晩培養物の１ ｍｌから調製した。コニカルフラスコ内の１０ ｍｌ ＬＢの培養物を蒔いて(１／１００)一晩培養し、３７℃でインキュベートした。５５０ ｎｍでの培養物の吸光度が０．４〜０．６の間の値に達した時に、１ ｍｌの培養物を取り、遠心分離した。細胞を、０．０５ ｍｌの１０％グリセロール溶液に再懸濁する前に、水および１０％グリセロール溶液で洗浄した。細胞を、５ μlのプラスミド製造物pSOS95T (Qiagen, Hilden, Germany) で即座にエレクトロポレーション処理した (２５ μＦ、２００Ω、２．５ ｋＶ)(Gene Pulser, Biorad)。３７℃でＳＯＣ培地中での１時間の表現型発現の後（Sambrook J., Fristch E. F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）、形質転換体を、３７℃で１００ μｇ／ｍｌカルベニシリンを加えた寒天培地上で選択した。
形質転換体を、カルベニシリンの存在下で一晩液体培養に戻し、プラスミドpSOS95Tの存在を確認するためにおよびそれが酵素消化により十分であることを確信するためにプラスミドＤＮＡの抽出 (Qiagen, Hilden Germany)を実施した。
実施例７：１，２−プロパンジオールおよびアセトンを産生する能力のある改変株E. coli *MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd :: cm (pSOS95T)の培養
発展型改変株E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cm (pSOS95T)を、未調整のｐＨで２０ ｇ／ｌの初期グルコース濃度で硝酸ナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地内で嫌気的条件下で培養した (表３)。発酵産物のアッセイは、発展型株E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd:: cm (pSOS95T)が１，２−プロパンジオール、酢酸およびアセトンの混合物を産生したことを示した。
発展型改変株E. coli* MG1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd:: cm (pSOS95T)を、未調整のｐＨで２０ ｇ／ｌの初期グルコース濃度で硝酸ナトリウムおよび酵母エキスを追加した最小培養培地内で嫌気的条件下で培養した (表３)。発酵産物のアッセイは、発展型株E. coli* MG 1655 ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA:: kana, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB Δedd:: cm (pSOS95T)が１，２−プロパンジオール、酢酸およびアセトンの混合物を産生したことを示した。
Claims (20)
- シンプル炭素源の代謝による１，２−プロパンジオールの産生のための発展型微生物株の製造方法であって、該株において、ＤＨＡＰからメチルグリオキサールへ、次いで１，２−プロパンジオールへと至る生合成経路にかかわる１以上の遺伝子の、改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ」活性を保有する発展型遺伝子への発展を引き起こすために、遺伝子tpiAを欠失し且つメチルグリオキサール (プロパナール)の乳酸への転換にかかわる少なくとも１つの遺伝子を欠失している初期バクテリア株を、シンプル炭素源を含む適切な増殖培地中で淘汰圧下で増殖させることを含み、次いで得られる改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ」活性を保有する、１もしくは複数の発展型微生物株を選択および単離する方法。
- メチルグリオキサールの乳酸への転換にかかわる遺伝子がgloA、aldAまたはaldBであることを特徴とする、請求項１の方法。
- 初期株が遺伝子gloA、aldA、aldBおよびtpiAを欠失していることを特徴とする、請求項１または２のどちらかの方法。
- 初期株が遺伝子ldhA、pflA、pflB、adhEおよびeddをも欠失していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの方法。
- 初期株がまた、ピルビン酸の酢酸への代謝を促進する酵素をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの方法。
- ピルビン酸の酢酸への代謝を促進する酵素がＮＡＤＨによる阻害に対して感受性が低いことを特徴とする、請求項５の方法。
- 該酵素がピルビン酸の代謝をアセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＨの産生へと促進することを特徴とする、請求項５または６のどちらかの方法。
- 酵素がピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体であることを特徴とする、請求項７の方法。
- ピルビン酸の酢酸への代謝を促進する酵素が内因性酵素であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかの方法。
- アセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンへの転換にかかわる１以上の酵素をコードしている１以上の異種遺伝子が発展型株に導入されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかの方法。
- アセチル−ＣｏＡおよび酢酸の転換にかかわる１以上の酵素をコードしている１もしくは複数の異種遺伝子がC. acetobutylicum由来であることを特徴とする、請求項１０の方法。
- 請求項１０または１１のどちらかにより得られた発展型改変株において、アセチル−ＣｏＡおよび酢酸のアセトンへの転換にかかわる１以上の遺伝子の、改良された「アセトンシンターゼ」活性への発展を引き起こすために、該発展型改変株をシンプル炭素源を含む適切な増殖培地中で淘汰圧下で増殖させ、次いで得られる改良された「１，２−プロパンジオールシンターゼ」活性および改良された「アセトンシンターゼ」活性を保有する第二世代発展型微生物を選択および単離することを特徴とする、請求項１０または１１のどちらかの方法。
- 株がバクテリア、酵母または真菌であることを特徴とする、前記請求項のいずれかの方法。
- 該株が、Escherichia、特にE. coli、およびCorynebacterium、特にC. glutamicumの株であることを特徴とする、請求項１３の方法。
- 請求項１〜９のいずれかにより定義される初期株。
- 請求項１〜１４のいずれかの方法により得られ得る発展型株。
- 遺伝子lpdがそれによりアラニン５５がバリンで置換される点変異を有する、請求項１６の株。
- 請求項１６または１７のどちらかにより発展型株をシンプル炭素源を含む適切な増殖培地中で増殖させ、産生された１，２−プロパンジオールを回収する、１，２−プロパンジオールの製造方法。
- １，２−プロパンジオールおよびアセトンを回収することを特徴とする、請求項１８の方法。
- １，２−プロパンジオールおよび／またはアセトンを精製することを特徴とする、請求項１８または１９のどちらかの方法。
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