CN108291243A

CN108291243A - 生产l-甲硫氨酸的方法

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Publication number: CN108291243A
Application number: CN201680068472.8A
Authority: CN
Inventors: I·奥克尤贝尔; D·菲舍尔; B·巴特; M·哈塞尔迈尔; M·汉佩尔; J·佩达尔
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2018-07-17
Also published as: KR20180086240A; MX2018006434A; PL3380627T3; EP3380627A1; RU2018123145A3; US11034985B2; WO2017089077A1; AR106834A1; RU2729012C2; EP3380627B1; RU2018123145A; US20180346946A1; BR112018010747A8; BR112018010747A2; ES2748226T3; MY186059A

Abstract

本发明涉及一种生产L‑甲硫氨酸的方法，其中在存在L‑高丝氨酸以及甲硫醇、甲硫醇的盐或二甲基二硫化物的条件下培养微生物，从而在培养基中积累L‑甲硫氨酸。

Description

生产L-甲硫氨酸的方法

本发明涉及一种生产L-甲硫氨酸的方法，其中在存在L-高丝氨酸和甲硫醇、甲硫醇的盐或二甲基二硫化物的条件下培养微生物，从而在培养基中积累L-甲硫氨酸。

目前，氨基酸甲硫氨酸在世界范围内被大量地工业化生产，并且具有相当的商业重要性。甲硫氨酸可用于许多领域，例如制药、健康和健身产品，但特别是作为饲料添加剂用于各种牲畜的许多饲料中，其中外消旋体和纯的对映体形式的甲硫氨酸均可使用。

在工业规模上，甲硫氨酸是通过Bucherer-Bergs反应化学生成的，它是Strecker合成的变体。在这种情况下，起始物质甲基巯基丙醛(由丙烯醛和甲硫醇制备)、氰化氢、氨和二氧化碳反应得到5-(2-甲基巯乙基)乙内酰脲(甲硫氨酸乙内酰脲)，随后通过碱水解以提供碱金属甲硫氨酸盐，并且然后通过用酸中和来释放甲硫氨酸(EP 0 780 370A2)。还可使用各种其他方法来制备甲硫氨酸，例如酰胺羰基化反应、蛋白质水解或微生物发酵产生甲硫氨酸。在化学合成中，甲硫氨酸作为D-和L-甲硫氨酸的外消旋混合物产生，其中例如L-甲硫氨酸、或其L-构型的前体、或L-高丝氨酸可通过合适的微生物发酵而产生。

L-高丝氨酸是L-甲硫氨酸潜在的前体(HJ Teas等人,J.Biol.Chem.1948,172：651-658)，可通过化学方式产生(MD Armstrong，J.Am.Chem.Soc.,Vol.70,1756-1759,1948)以及微生物的方式发酵产生(参见例如US 3,598,701，US 6,303,348B1，EP0994190A2，EP 1149911A2，WO 2004/067757A1)。

Hateley等人公开了通过从L-高丝氨酸开始的化学途径获得L-甲硫氨酸的方法(WO 2007/085514 A2)。

Lievense能够证明缺乏高半胱氨酸甲基化酶活性的微生物菌株，与原始菌株(大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或黄色芽孢杆菌)相比，通过转化编码L-高丝氨酸乙酰转移酶和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶)的质粒，在甲硫醇存在下产生了超过其自身需要的L-甲硫氨酸，其L-高丝氨酸产量上调(WO 93/17112 A1)。

Bolten等人(J.Microbiol.Biotechnol.(2010),20(8),1196-1203)能够证明(野生型)谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)能够在甲硫醇和其二聚体(二甲基二硫化物)作为唯一的硫源的情况下生长而无需硫酸盐(其是培养微生物最常見的硫源)，并且研究了潜在的通路和酶。他们证明，MetY(O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶)负责用甲硫醇或二甲基二硫化物的巯基取代O-乙酰-L-高丝氨酸的乙酰基基团以直接产生L-甲硫氨酸。为了增加L-甲硫氨酸的产量，作者建议不仅要扩增MetY，而且还要扩增L-甲硫氨酸生物合成的其他酶。

Zelder等人(WO 2007/011939 A2)证明，L-甲硫氨酸可在微生物中通过在甲基封端的硫化合物(如二甲基二硫化物、或二甲基三硫化物)的存在下培养具有解除调控的O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶、或O-琥珀酰-L高丝氨酸硫化氢解酶和/或L-高丝氨酸乙酰转移酶、或L-高丝氨酸琥珀酰转移酶的微生物(例如大肠杆菌(E.coli)和谷氨酸棒杆菌)来产生。

Kim等人(WO 2008/013432 A1)提出了用于制备L-甲硫氨酸的两阶段生物技术方法。在第一步反应中，L-甲硫氨酸前体、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、或O-乙酰-L-高丝氨酸最初通过重组微生物的方法获得，它们被积累在培养液中。在接下来的第二步中，在具有O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性或O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质的存在下，或在表达这些蛋白质的微生物或该微生物的细胞消化物的存在下，L-甲硫氨酸前体与甲硫醇反应以提供L-甲硫氨酸和相应的羧酸(即乙酸或琥珀酸)。

然而，在该酶促反应中，除了L-甲硫氨酸以外，还形成了等摩尔量的乙酸或琥珀酸。例如，在选择O-乙酰-L-高丝氨酸作为L-甲硫氨酸前体时，在反应过程中(特别是在工业化的规模上)导致高乙酸浓度。在外部低pH值下，未解离的乙酸分子可穿过膜进入细胞并在其中被去质子化，这导致细胞质内部的pH下降并扰乱细胞pH稳态(IRBooth，Microbiological Reviews 49，No(1985)，359-378)。此外，很难将乙酸以可接受的代价(effort)从L-甲硫氨酸产物中完全除去。因此，Hong等人(WO 2012/091479 A2)提出了许多方法来从L-甲硫氨酸产物中去除并再利用在L-甲硫氨酸产生过程中的第二阶段中产生的相对大量的乙酸。

本发明的目的是提供一种在微生物中产生L-甲硫氨酸的方法，其中在O-乙酰-L-高丝氨酸转化成L-甲硫氨酸中形成的乙酸基本上被相同的微生物再利用。

该目的可通过以下产生L-甲硫氨酸的方法来实现，其中在包含L-高丝氨酸和硫源的培养基中培养具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的微生物，所述硫源选自：甲硫醇(MC)、甲硫醇的盐和二甲基二硫化物(DMDS)，由此在培养基中积累L-甲硫氨酸。

微生物中的酶活性通常通过编码相应酶的相应基因的表达来实现。所谓的启动子位于基因的上游。启动子是由约40至50个碱基对组成的DNA序列，且其构成RNA聚合酶全酶的结合位点和转录起始点(M.Pátek等人,Microbial Biotechnology,6(2013),103-117)，由此可影响受控的多核苷酸或基因的表达强度。“功能性连接”，意指启动子与基因的连续排列，其导致所述基因的转录。

微生物也可以是重组的，并具有增强的L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性和增强的O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性。

通过例如相应内源基因的突变可实现在微生物中增强的酶活性。酶活性也可通过增加相应基因的表达，例如，通过增加基因拷贝数和/或通过增强基因调控因子来增强酶活性。对基因表达有正向影响的这些调控因子的增强，可通过例如修饰结构基因上游的启动子序列以增强启动子的效力或通过用更有效的启动子完全替换所述启动子来实现。

在根据本发明的方法中，L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性均优选地通过增强编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质，或具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质的基因的表达而增强。增强的基因表达优选通过增加编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质或具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质的基因的拷贝数来实现，和/或通过在各自情况下功能性连接编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质或具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质的基因至强启动子上实现。

合适的强启动子或产生这种启动子以增加表达的方法，在文献中是已知的(例如S.Lisser and H.Margalit,Nucleic Acid Research,1993,Vol.21,No.7,1507-1516；M.Pátekand J.Nesvera in H.Yukawa and M Inui(eds.),Corynebacterium glutamicum,Microbiology Monographs 23,Springer Verlag Berlin Heidelberg 2013,51-88；B.J.Eikmanns et al.,Gene,102(1991)93-98)。例如，就增加与这些启动子功能性连接的基因表达而言，可通过在已知共有序列的方向上改变启动子序列来优化天然启动子(M.Patek et al.,Microbiology(1996),142,1297-1309；M.Patek et al.,MicrobialBiotechnology 6(2013),103-117)。为了增加编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质的基因(metX)、或编码具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质的基因(metY)的表达，例如tacI启动子(PtacI)是适用的(H.A.deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.80,21-25,January 1983,Biochemistry)。序列号5(SEQ IDNo.5)显示了PtacI的序列。

组成型启动子也适用于过表达，其中编码酶活性的基因在启动子控制下可连续表达，例如葡萄糖依赖性deo启动子。化学诱导型的启动子也是适用的，例如tac、lac或trp。用于诱导型启动子的最普遍的系统是大肠杆菌的lac操纵子。在这种情况下，使用乳糖或异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)作为诱导剂。同样地，使用阿拉伯糖(例如pBAD系统)或鼠李糖(例如大肠杆菌KRX)作为诱导剂的系统是常见的。用于物理诱导型的系统，例如基于来自Takara或Lambda PL的大肠杆菌cspA启动子的温度诱导型的冷休克启动子系统，以及渗透诱导型启动子，例如osmB(例如WO 95/25785A1)。

在根据本发明的方法中，重组微生物选自：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)，例如大肠杆菌(E.coli)菌株，例如非病原性大肠杆菌K-12菌株MG1655(DSM 18039)，或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium.glutamicum)菌株，例如ATCC13032或Corynebacterium humireducens(C.humireducens)菌株，例如DSM 45392。

在根据本发明的方法中，L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性是例如MetX酶，其源自谷氨酸棒杆菌或来自C.humireducens。Kim等人(EP 2 657 345 A1；EP 2 657 250 A2)或Ochrombel等人(WO 2015/165746 A1)公开了具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的合适的酶的实例。下述实验性实施例中使用的MetX酶具有序列号2(SEQ ID No.2)的氨基酸序列。序列号1(SEQ ID No.1)显示了基因metX的相应核苷酸序列。所述序列来源于谷氨酸棒杆菌(ATTC13032)NC_003450。

适用于根据本发明方法的O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性，例如是源自谷氨酸棒杆菌或C.humireducens的MetY酶。等人(WO 02/18613A1)、等人(WO2007/024933 A2)或Kim等人(EP 2 657 345 A1)公开了根据本发明的具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的实例。下述实验性实施例中使用的MetY酶具有根据序列号4(SEQ ID No.4)的氨基酸序列。序列号3(SEQ ID No.3)显示了metY基因的相应核苷酸序列。所述序列来源于谷氨酸棒杆菌(ATTC13032)NC_003450。

L-高丝氨酸通过支链氨基酸的输入蛋白(importer)转运到微生物中，例如，大肠杆菌中的LIV系统(B.A.Temptonton和M.A.Savageau，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Vol.117，No.3，1974年3月，第1002-1009页)。在谷氨酸棒杆菌中，还有由cgl2310的BrnQ编码的同源转运系统(A.Tauch等，Arch Microbiol 169(1998)：303-312)。

在细胞内，通过乙酰辅酶A(乙酰-CoA)的乙酰基转移以通过(异源)高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)将L-高丝氨酸的羟基活化提供O-乙酰-L-高丝氨酸。然后O-乙酰-L-高丝氨酸在还原硫源(如甲硫醇(MC)和5′-磷酸吡哆醛(PLP))的存在下通过(异源)硫化氢解酶(MetY)转化成L-甲硫氨酸和乙酸。尽管O-乙酰-L-高丝氨酸是棒杆菌中甲硫氨酸生物合成的天然中间体之一，但甲硫氨酸在肠杆菌科中的生物合成与通过O-琥珀酰-L-高丝氨酸中间体进行类似(例如参见Figge R(2007)Methionine biosynthesis in Escherichia coliand Corynebacterium glutamicum.In:Wendisch VF(ed)Amino acid biosynthesis-pathways，regulation and metabolic engineering.Microbiology Monographs，第5卷，Springer，Berlin，第163-193页)。因此，首先必须将L-高丝氨酸O-乙酰转移酶和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性异源地引入肠杆菌科(如大肠杆菌)中，而这些酶活性已天然存在于棒杆菌(如谷氨酸棒杆菌)中。编码相应酶的相应同源或异源基因各自可通过开头所述的方法(例如增加两种基因的拷贝数和/或使用强启动子)来增强。

在肠杆菌科如大肠杆菌中，L-高丝氨酸O-乙酰转移酶和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的增强可通过转化合适的载体的方式引入，所述合适的载体包含基因序列metX(例如SEQ ID No.1)和metY(例如SEQ ID No.3)，其在各自情况下位于强启动子(例如PtacI)的上游。这种构建体的实例是根据序列号6(SEQ ID No.6)的序列。

在甲硫醇(MC)和5′-磷酸吡哆醛(PLP)以及(异源)硫化氢解酶(MetY)的存在下，通过将O-乙酰-L-高丝氨酸至L-甲硫氨酸的转化而释放的乙酸然后再次被用于通过乙酸诱导型乙酰-CoA合成酶(Acs)在大肠杆菌(枯草芽孢杆菌也同样)的细胞质中消耗ATP合成乙酰-CoA，所述乙酰-CoA合成酶特别在稳定期或在厌氧条件下被调节物CsrA激活(S.Kumari etal.,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Vol.177,No.10,May 1995,p.2878–2886)。

相比于大肠杆菌，在谷氨酸棒杆菌中的过量乙酸通过醋酸激酶(AK)在ATP依赖性反应中被特定地转换为乙酰磷酸，其最后通过磷酸转乙酰酶(phophotransacetylase，PTA)在CoA存在下反应提供乙酰-CoA。在谷氨酸棒杆菌中，相应的基因、ack和pta被安排在一个在转录水平上由乙酸调节的操纵子中(R.Gerstmeir et al.Journal of Biotechnology104(103)99-122)。

通过YjeH输出蛋白(exporter)将L-甲硫氨酸从大肠杆菌细胞中排出(Q.Liu etal.,Appl Environ Microbiol 81(2015)p.7753–7766)。此外，大肠杆菌中的基因ygaZH编码甲硫氨酸的输出蛋白(WO 2015/028675A1)。借助于BrnFE输出蛋白将L-甲硫氨酸从谷氨酸棒杆菌的细胞中排出到培养基中(C.et al.,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,June2005,p.3786–3794)。

图1：显示了pMW218质粒图谱。

图2：显示pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY质粒图谱。

图3：显示MG1655/pMW218或MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY的细胞匀浆对L-高丝氨酸和乙酰-CoA的催化转化。

图4：显示在O-乙酰高丝氨酸和5′-磷酸吡哆醛(PLP)的存在下通过O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)催化转化甲基硫醇钠。显示了MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY的细胞匀浆在所使用的相应总蛋白质浓度下的比较。

实施例

1)制备异源表达棒杆菌物种的L-高丝氨酸O-乙酰转移酶和硫化氢解酶的基因的肠杆菌

基于谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)NC_003450的基因组序列，合成编码分别具有SEQID No.2氨基酸序列的L-高丝氨酸O-乙酰转移酶和具有SEQ ID No.4氨基酸序列的O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶的基因序列metX(SEQ ID No.1)和metY(SEQ ID No.3)，两者都具有来自Life Technologies Invitrogen GeneArt(德国)的上游启动子PtacI(SEQ ID No.5)(H.A.deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第80卷，第21-25页，1983年1月，生物化学)(SEQID No.6)。

在该SEQ ID No.6中，PtacI启动子为碱基对407-447、metX的基因序列为502-1638、又是PtacI启动子为1645-1685以及metY的基因序列为1742-3055。

随后，通过载体序列pMW218(登录号：AB005477)(Nippon Gene，Toyama，Japan)中的限制性位点BssHII和BglI进行该合成序列的克隆(图1)。质粒pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY由其形成(图2)。为了分析pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY质粒，通过Eurofins MWGOperon另外进行DNA测序。使用克隆管理(Clone Manager)软件对获得的DNA序列进行正确性检查，以确认核苷酸序列为SEQ ID No.6。

分别将质粒pMW218和pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY转化入大肠杆菌K-12菌株MG1655(DSM No.18039)中。随后将转化体在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基琼脂平板上培养，从而可产生MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株。分别选择一个菌落，将其分别接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，并在37℃200rpm下培养6小时。随后，将200μl生长细胞培养物接种到10ml培养基A[25g/l硫酸铵；1g/l七水合硫酸镁；2g/l磷酸二氢钾；0.03g/l七水合铁；0.02g/l一水合硫酸锰；20g/l一水合葡萄糖；30g/l碳酸钙；0.05g/l卡那霉素；0.025g/l 5′-磷酸吡哆醛(PLP)；0.0024g/l异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)]，并在37℃200rpm下温育16小时。在100ml烧瓶中用10ml新鲜培养基A将这些细胞培养物稀释至OD为2，并在相同条件下进一步培养直至达到OD值为约5(大约3-4小时)。随后，处于指数生长期、并具有高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)和硫化氢解酶(MetY)活性的这些细胞可被用于生物转化。生物转化被理解为物质转化，其中使用完整的活细胞、固定的细胞、或分离的游离酶、或与载体连接的酶、或上述的组合。

2)检测L-高丝氨酸O-乙酰转移酶和乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶的酶活性

用MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株的单菌落分别接种10ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，并在37℃200rpm下培养6小时。随后，用200μl生长细菌培养物接种到10ml培养基A(参见实施例1)，并在37℃200rpm下温育16小时。然后分别收获细胞培养物(8ml，标准化至OD＝1)，通过离心(20分钟，4000rpm，4℃)除去上清液，并将沉淀的细胞用800μl 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)清洗两次，并溶解在1ml缓冲液中。在FastPrep FP120仪器(QBiogene，Heidelberg)中进行机械细胞破碎，其中将细胞在具有300mg玻璃珠的消化容器中分以6.5m/s摇动三次，每次20秒。然后将粗提物以12000rpm在4℃下离心20分钟，以除去未消化的细胞和细胞碎片。使用Bio-Rad蛋白质定量测定法(Bio-Rad，USA)测定蛋白质的总量。然后将细胞匀浆用于细胞质L-高丝氨酸O-乙酰转移酶和乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶法检测。

2a)检测细胞质中的MetX(L-高丝氨酸O-乙酰转移酶)活性

L-高丝氨酸O-乙酰基转移酶(MetX)[EC2.3.1.31]催化的反应是通过L-高丝氨酸和乙酰-CoA转化为O-乙酰-L-高丝氨酸和CoA。借助DTNB溶液(5,5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸，“Ellmans试剂”，Sigma Aldrich，德国)，该反应的进程可通过测量在412nm处的吸光度来记录，因为DTNB与辅酶A(CoA)的SH基团可形成黄色物质(S.Yamagata Journal ofBacteriology 169，No.8(1987)3458-3463)。MetX酶的吸光度测定是在37℃下进行的，预先使用在0-200μM之间浓度的CoA进行校准。每种制剂在含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、0.65mM DNTB[100μl 1.3mM DTNB原液]、0.13mM乙酰辅酶A[30μl 0.886mM乙酰辅酶A原液，Sigma Aldrich，德国]、10mM L-高丝氨酸[20μl的100mM L-高丝氨酸原液，Sigma Aldrich，德国]和各细胞匀浆的特定蛋白质浓度0.012mg/ml或0.024mg/ml的0.2ml反应体系中进行。

由于乙酰辅酶A在细胞内被用于各种生物合成，所以在细胞质中存在多种酶，其催化乙酰辅酶A切割成辅酶A，这样就需要考虑具有和不具有MetX的细胞匀浆之间的差异。

对于酶测定结果的观察显示，MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY的细胞匀浆的DNTB吸收增加在整个时间进程中始终高于MG1655/pMW218(图3)。这证实了这里的MetX作为额外的酶是具有催化活性的。所记录曲线的初始线性区域的斜率比较显示，MG1655/pMW218的细胞匀浆中每克总蛋白质的活性为约580μmol/min，而MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY中每克总蛋白质的活性为约730μmol/min。因此，该差异是L-高丝氨酸O-乙酰基转移酶(MetX)的比活性(specific activity)，约为150单位/g总蛋白质(1单位＝1μmol底物转化/分钟)。

2b)检测细胞质中的MetY(O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶)活性

O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)[EC 2.5.1.49]催化的反应是在5′-磷酸吡哆醛(PLP)的存在下转化O-乙酰-L-高丝氨酸与甲硫醇(MC)以提供L-甲硫氨酸和乙酸。如实施例2a中所述，由于DTNB与未反应的甲硫醇的SH基团反应而产生黄色物质，因此可通过在412nm处的DTNB吸收平均值测量的方法来测定该反应的进展。为此目的，将两菌株MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY按如上所述制作细胞匀浆物，并在随后的酶测定中测量底物甲基硫醇钠的减少或转化。

每种制备在37℃下的1ml反应混合物中进行，所述1ml反应混合物含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、2mM甲基硫醇钠(NaMC)[10μl的200mM NaMC原液]、3mM OAHHCl[30μl的100mM OAH HCl原液]和0.01mM PLP[10μl的1mM PLP原液]与相应的细胞匀浆(其总蛋白质浓度分别为0.012g/l、0.024g/l或0.048g/l)。在限时酶反应之后，通过DTNB对NaMC含量进行光度测量，其中使用0-200μM之间浓度的MC预先进行校准。为此目的，将180μl的DTNB溶液(4mg/ml)加入到每份20μl酶促反应混合物中，并随后在412nm下测量。

由于MetY的酶活性，取决于总蛋白质浓度，MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株的细胞匀浆的存在导致被催化的NaMC的降低显著快于在MG1655/pMW218菌株的细胞匀浆的存在下的NaMC的降低(图4)。在MG1655/pMW218的细胞匀浆制备物中，同样发生的但更弱的NaMC减少与所用蛋白质的量无关。在没有细胞匀浆的制备物中也可观察到相同的降低，且这是由于从溶液产生的甲硫醇的化学依赖性排放。根据线性范围内的斜率差异，可计算出MetY硫化氢解酶的比活性约为1500单位/g总蛋白质(1单位＝1μmol底物转化/分钟)，其与MetX酶处于相同水平。

3)检测L-高丝氨酸和甲基硫醇钠的胞内生物转化以提供L-甲硫氨酸。

如实施例1中所述培养MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株，并然后在各自制备物的指数期将OD600调节至约7。

然后在100ml摇瓶中，于37℃200rpm下进行生物转化，时间为0、2、4和24小时。每种制备在10ml培养基A中进行，培养基A含有6.5g/l L-高丝氨酸[500μl的100g/l高丝氨酸原液](Sigma Aldrich，Germany)、3g/l NaMC[500μl的6％NaMC原液]和12g/l KH₂PO₄[600μl的200g/l KH₂PO₄原液]。

使用MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株进行L-高丝氨酸与甲硫醇的转化以产生L-甲硫氨酸，而使用MG1655/pMW218菌株不合成L-甲硫氨酸(表1)。基于初始加入的NaMC的量和基于消耗的L-高丝氨酸的量的各种产率是基于开始时两种底物的存在但随后甲硫醇的自然发生的蒸发的等化学计量(equal stoicjiometry)。

表1：使用MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株，比较6.5g/l合成的L-高丝氨酸和3g/l甲硫醇钠的生物转化。显示了基于NaMC在反应开始时脉冲的量和L-高丝氨酸(L-HS)消耗的量，随时间过程获得的L-甲硫氨酸滴度和相关产率。

此外，使用MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株进行了生物转化，其中使用氘化NaMC(D₃CSNa)代替来自Sigma Aldrich的NaMC原液。这是通过将CD₃SD(Sigma-Aldrich，98原子％D)引入等摩尔量的氢氧化钠水溶液来制备的。(或者，可根据J.Voss等人，Phosphorous，Sulfur and Silicon and the Related Elements，2012,187,382，用硫脲和CD₃I来制备)。通过LC-MS分析24小时反应后的溶液，显示甲硫氨酸与甲硫氨酸-d-3的比例为1：200。因此可检测到，生物转化中形成的甲硫氨酸大部分是通过并入外部供应的甲硫醇所形成的。

4)通过生物转化将由发酵产生的L-高丝氨酸转化为L-甲硫氨酸

基于实施例3a进行合成的L-高丝氨酸向L-甲硫氨酸的生物转化，还研究了通过发酵产生的L-高丝氨酸的生物转化。发酵产生的L-高丝氨酸培养基的浓度为10g/l。按照实施例1培养MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株，并在发酵产生的5g/l L-高丝氨酸的存在下在指数期OD值为5时进行生物转化并如实施例3a所示进行2、4和24小时。如表2所示，在生物转化2小时后约7％、在生物转化4小时后约12％以及在生物转化24小时后约45％的底物L-高丝氨酸或NaMC被转化为L-甲硫氨酸，这反映了最大滴度约为2.9g/l L-甲硫氨酸。

表2：由MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株通过将发酵产生的5g/l L-高丝氨酸和3g/l甲基硫醇钠进行生物转化形成的L-甲硫氨酸和相关产量。

Time(h)	0	2	4	24
					L-Met(g/l)	<0.005	0.45	0.79	2.87
发酵产生的L-高丝氨酸(g/l)	5.26	4.74	4.24	2.15
					L-Met/初始投入的NaMC(mol/mol)	0％	7％	12％	45％
L-Met/消耗的L-高丝氨酸(mol/mol)	0％	69％	62％	74％

5)生物转化期间乙酸的细胞回收

为了研究由L-高丝氨酸和甲硫醇的生物转化而形成的乙酸的量，在5g/l L-高丝氨酸和3g/l甲基硫醇钠和12g/l KH₂PO₄[600μl的200g/l KH₂PO₄原液]的存在下，使用MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株进行制备，针对它们的乙酸含量记录所述制备4小时。

如实施例1中所述制备MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株，因此如实施例3b所述，分别将起始OD值约为3的指数期培养物用于在100ml烧瓶中的10ml制备物。

在表3中记录了通过MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株生物转化5g/l L-高丝氨酸和3g/l甲基硫醇钠期间形成的乙酸浓度。L-甲硫氨酸仅在具有异源表达metX和metY基因的菌株的制备物中形成，而在对照菌株MG1655/pMW218的制备物中不能检测到L-甲硫氨酸。

在前四个小时内，由于对照制备物中的实验参数，形成约11mM乙酸，而在生物转化中形成了约17mM乙酸和7mM L-甲硫氨酸。因此在生物转化制备物中测量到的乙酸的过量导致6mM的差异。由于乙酸和甲硫氨酸的等摩尔产生合成了额外的甲硫氨酸，其在非细胞系统没有描述过(WO 2008/013432A1)，该数值为7mM。因此，可检测在生物转化中，L-甲硫氨酸合成中形成的乙酸的细胞内再循环。所以，由生物转化产生的额外的乙酸，显然通过乙酰-CoA合成酶(Acs)部分地再循环至乙酰-CoA。

表3：在5g/l L-高丝氨酸和3g/l甲基硫醇钠的存在下，用MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株在生物转化制备物中形成和再循环乙酸。

6)外部添加L-高丝氨酸

如实施例1中所述的方法制备MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株，因此如实施例3b所述，分别将起始OD值约为3的指数期培养物用于在100ml烧瓶中的10ml制备物。在0h时间点(最初无添加)之后，在各自的制备物中添加5g/l的L-高丝氨酸、添加3g/l甲基硫醇钠与12g/lKH₂PO₄[600μl的200g/l KH₂PO₄原液]并添加5g/l L-高丝氨酸与3g/l甲基硫醇钠和12g/lKH₂PO₄[600μl的200g/l KH₂PO₄原液]。

在0、2、4和6小时这几个时间点测定制备物中L-甲硫氨酸和L-高丝氨酸的效价。

表4：在含有和不含3g/l甲基硫醇钠(Na-MC)时，向使用MG1655/pMW218和MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株生物转化制备物外部添加5g/l L-高丝氨酸(L-HS)之后的L-甲硫氨酸和L-高丝氨酸的滴度。

7)L-高丝氨酸和二甲基二硫化物(DMDS)的生物转化或L-高丝氨酸和甲基硫醇钠(NaMC)的生物转化以提供L-甲硫氨酸

如实施例1中所述培养MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY菌株，然后在每种制备物的指数期中将OD600调节至约10。

然后在37℃下在0、24和48小时的时间段内以200rpm在100ml摇瓶中进行生物转化。每种制备物在含有5.0g/l L-高丝氨酸和12g/l KH₂PO₄[600μl的200g/l KH₂PO₄原液]以及如表5中所提供的量的硫源(即NaMC或DMDS)(参见实施例1)的10ml培养基A中进行。对照不含任何硫源(即不含NaMC和不含DMDS)。

表5：不同浓度和反应时间段的NaMC、对照(无硫源)和DMDS的生物转化结果比较

序列

序列表

<110> 赢创德固赛有限公司

<120> WHCB

<130> .

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1137

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1137)

<223> metX

<400> 1

atg ccc acc ctc gcg cct tca ggt caa ctt gaa atc caa gcg atc ggt 48

Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly

1 5 10 15

gat gtc tcc acc gaa gcc gga gca atc att aca aac gct gaa atc gcc 96

Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala

20 25 30

tat cac cgc tgg ggt gaa tac cgc gta gat aaa gaa gga cgc agc aat 144

Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn

35 40 45

gtc gtt ctc atc gaa cac gcc ctc act gga gat tcc aac gca gcc gat 192

Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp

50 55 60

tgg tgg gct gac ttg ctc ggt ccc ggc aaa gcc atc aac act gat att 240

Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile

65 70 75 80

tac tgc gtg atc tgt acc aac gtc atc ggt ggt tgc aac ggt tcc acc 288

Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr

85 90 95

gga cct ggc tcc atg cat cca gat gga aat ttc tgg ggt aat cgc ttc 336

Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe

100 105 110

ccc gcc acg tcc att cgt gat cag gta aac gcc gaa aaa caa ttc ctc 384

Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu

115 120 125

gac gca ctc ggc atc acc acg gtc gcc gca gta ctt ggt ggt tcc atg 432

Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met

130 135 140

ggt ggt gcc cgc acc cta gag tgg gcc gca atg tac cca gaa act gtt 480

Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val

145 150 155 160

ggc gca gct gct gtt ctt gca gtt tct gca cgc gcc agc gcc tgg caa 528

Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln

165 170 175

atc ggc att caa tcc gcc caa att aag gcg att gaa aac gac cac cac 576

Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His

180 185 190

tgg cac gaa ggc aac tac tac gaa tcc ggc tgc aac cca gcc acc gga 624

Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly

195 200 205

ctc ggc gcc gcc cga cgc atc gcc cac ctc acc tac cgt ggc gaa cta 672

Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu

210 215 220

gaa atc gac gaa cgc ttc ggc acc aaa gcc caa aag aac gaa aac cca 720

Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro

225 230 235 240

ctc ggt ccc tac cgc aag ccc gac cag cgc ttc gcc gtg gaa tcc tac 768

Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr

245 250 255

ttg gac tac caa gca gac aag cta gta cag cgt ttc gac gcc ggc tcc 816

Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser

260 265 270

tac gtc ttg ctc acc gac gcc ctc aac cgc cac gac att ggt cgc gac 864

Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp

275 280 285

cgc gga ggc ctc aac aag gca ctc gaa tcc atc aaa gtt cca gtc ctt 912

Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu

290 295 300

gtc gca ggc gta gat acc gat att ttg tac ccc tac cac cag caa gaa 960

Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Leu Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu

305 310 315 320

cac ctc tcc aga aac ctg gga aat cta ctg gca atg gca aaa atc gta 1008

His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val

325 330 335

tcc cct gtc ggc cac gat gct ttc ctc acc gaa agc cgc caa atg gat 1056

Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp

340 345 350

cgc atc gtg agg aac ttc ttc agc ctc atc tcc cca gac gaa gac aac 1104

Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn

355 360 365

cct tcg acc tac atc gag ttc tac atc taa tag 1137

Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile

370 375

<210> 2

<211> 377

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly

1 5 10 15

Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala

20 25 30

Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn

35 40 45

Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp

50 55 60

Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile

65 70 75 80

Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr

85 90 95

Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe

100 105 110

Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu

115 120 125

Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met

130 135 140

Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val

145 150 155 160

Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln

165 170 175

Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His

180 185 190

Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly

195 200 205

Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu

210 215 220

Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro

225 230 235 240

Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr

245 250 255

Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser

260 265 270

Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp

275 280 285

Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu

290 295 300

Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Leu Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu

305 310 315 320

His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val

325 330 335

Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp

340 345 350

Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn

355 360 365

Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile

370 375

<210> 3

<211> 1314

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1314)

<223> metY

<400> 3

atg cca aag tac gac aat tcc aat gct gac cag tgg ggc ttt gaa acc 48

Met Pro Lys Tyr Asp Asn Ser Asn Ala Asp Gln Trp Gly Phe Glu Thr

1 5 10 15

cgc tcc att cac gca ggc cag tca gta gac gca cag acc agc gca cga 96

Arg Ser Ile His Ala Gly Gln Ser Val Asp Ala Gln Thr Ser Ala Arg

20 25 30

aac ctt ccg atc tac caa tcc acc gct ttc gtg ttc gac tcc gct gag 144

Asn Leu Pro Ile Tyr Gln Ser Thr Ala Phe Val Phe Asp Ser Ala Glu

35 40 45

cac gcc aag cag cgt ttc gca ctt gag gat cta ggc cct gtt tac tcc 192

His Ala Lys Gln Arg Phe Ala Leu Glu Asp Leu Gly Pro Val Tyr Ser

50 55 60

cgc ctc acc aac cca acc gtt gag gct ttg gaa aac cgc atc gct tcc 240

Arg Leu Thr Asn Pro Thr Val Glu Ala Leu Glu Asn Arg Ile Ala Ser

65 70 75 80

ctc gaa ggt ggc gtc cac gct gta gcg ttc tcc tcc gga cag gcc gca 288

Leu Glu Gly Gly Val His Ala Val Ala Phe Ser Ser Gly Gln Ala Ala

85 90 95

acc acc aac gcc att ttg aac ctg gca gga gcg ggc gac cac atc gtc 336

Thr Thr Asn Ala Ile Leu Asn Leu Ala Gly Ala Gly Asp His Ile Val

100 105 110

acc tcc cca cgc ctc tac ggt ggc acc gag act cta ttc ctt atc act 384

Thr Ser Pro Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Glu Thr Leu Phe Leu Ile Thr

115 120 125

ctt aac cgc ctg ggt atc gat gtt tcc ttc gtg gaa aac ccc gac gac 432

Leu Asn Arg Leu Gly Ile Asp Val Ser Phe Val Glu Asn Pro Asp Asp

130 135 140

cct gag tcc tgg cag gca gcc gtt cag cca aac acc aaa gca ttc ttc 480

Pro Glu Ser Trp Gln Ala Ala Val Gln Pro Asn Thr Lys Ala Phe Phe

145 150 155 160

ggc gag act ttc gcc aac cca cag gca gac gtc ctg gat att cct gcg 528

Gly Glu Thr Phe Ala Asn Pro Gln Ala Asp Val Leu Asp Ile Pro Ala

165 170 175

gtg gct gaa gtt gcg cac cgc aac agc gtt cca ctg atc atc gac aac 576

Val Ala Glu Val Ala His Arg Asn Ser Val Pro Leu Ile Ile Asp Asn

180 185 190

acc atc gct acc gca gcg ctc gtg cgc ccg ctc gag ctc ggc gca gac 624

Thr Ile Ala Thr Ala Ala Leu Val Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp

195 200 205

gtt gtc gtc gct tcc ctc acc aag ttc tac acc ggc aac ggc tcc gga 672

Val Val Val Ala Ser Leu Thr Lys Phe Tyr Thr Gly Asn Gly Ser Gly

210 215 220

ctg ggc ggc gtg ctt atc gac ggc gga aag ttc gat tgg act gtc gaa 720

Leu Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Gly Lys Phe Asp Trp Thr Val Glu

225 230 235 240

aag gat gga aag cca gta ttc ccc tac ttc gtc act cca gat gct gct 768

Lys Asp Gly Lys Pro Val Phe Pro Tyr Phe Val Thr Pro Asp Ala Ala

245 250 255

tac cac gga ttg aag tac gca gac ctt ggt gca cca gcc ttc ggc ctc 816

Tyr His Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Pro Ala Phe Gly Leu

260 265 270

aag gtt cgc gtt ggc ctt cta cgc gac acc ggc tcc acc ctc tcc gca 864

Lys Val Arg Val Gly Leu Leu Arg Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser Ala

275 280 285

ttc aac gca tgg gct gca gtc cag ggc atc gac acc ctt tcc ctg cgc 912

Phe Asn Ala Trp Ala Ala Val Gln Gly Ile Asp Thr Leu Ser Leu Arg

290 295 300

ctg gag cgc cac aac gaa aac gcc atc aag gtt gca gaa ttc ctc aac 960

Leu Glu Arg His Asn Glu Asn Ala Ile Lys Val Ala Glu Phe Leu Asn

305 310 315 320

aac cac gag aag gtg gaa aag gtt aac ttc gca ggc ctg aag gat tcc 1008

Asn His Glu Lys Val Glu Lys Val Asn Phe Ala Gly Leu Lys Asp Ser

325 330 335

cct tgg tac gca acc aag gaa aag ctt ggc ctg aag tac acc ggc tcc 1056

Pro Trp Tyr Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Thr Gly Ser

340 345 350

gtt ctc acc ttc gag atc aag ggc ggc aag gat gag gct tgg gca ttt 1104

Val Leu Thr Phe Glu Ile Lys Gly Gly Lys Asp Glu Ala Trp Ala Phe

355 360 365

atc gac gcc ctg aag cta cac tcc aac ctt gca aac atc ggc gat gtt 1152

Ile Asp Ala Leu Lys Leu His Ser Asn Leu Ala Asn Ile Gly Asp Val

370 375 380

cgc tcc ctc gtt gtt cac cca gca acc acc acc cat tca cag tcc gac 1200

Arg Ser Leu Val Val His Pro Ala Thr Thr Thr His Ser Gln Ser Asp

385 390 395 400

gaa gct ggc ctg gca cgc gcg ggc gtt acc cag tcc acc gtc cgc ctg 1248

Glu Ala Gly Leu Ala Arg Ala Gly Val Thr Gln Ser Thr Val Arg Leu

405 410 415

tcc gtt ggc atc gag acc att gat gat atc atc gct gac ctc gaa ggc 1296

Ser Val Gly Ile Glu Thr Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Leu Glu Gly

420 425 430

ggc ttt gct gca atc tag 1314

Gly Phe Ala Ala Ile

435

<210> 4

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

Met Pro Lys Tyr Asp Asn Ser Asn Ala Asp Gln Trp Gly Phe Glu Thr

1 5 10 15

Arg Ser Ile His Ala Gly Gln Ser Val Asp Ala Gln Thr Ser Ala Arg

20 25 30

Asn Leu Pro Ile Tyr Gln Ser Thr Ala Phe Val Phe Asp Ser Ala Glu

35 40 45

His Ala Lys Gln Arg Phe Ala Leu Glu Asp Leu Gly Pro Val Tyr Ser

50 55 60

Arg Leu Thr Asn Pro Thr Val Glu Ala Leu Glu Asn Arg Ile Ala Ser

65 70 75 80

Leu Glu Gly Gly Val His Ala Val Ala Phe Ser Ser Gly Gln Ala Ala

85 90 95

Thr Thr Asn Ala Ile Leu Asn Leu Ala Gly Ala Gly Asp His Ile Val

100 105 110

Thr Ser Pro Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Glu Thr Leu Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Leu Asn Arg Leu Gly Ile Asp Val Ser Phe Val Glu Asn Pro Asp Asp

130 135 140

Pro Glu Ser Trp Gln Ala Ala Val Gln Pro Asn Thr Lys Ala Phe Phe

145 150 155 160

Gly Glu Thr Phe Ala Asn Pro Gln Ala Asp Val Leu Asp Ile Pro Ala

165 170 175

Val Ala Glu Val Ala His Arg Asn Ser Val Pro Leu Ile Ile Asp Asn

180 185 190

Thr Ile Ala Thr Ala Ala Leu Val Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp

195 200 205

Val Val Val Ala Ser Leu Thr Lys Phe Tyr Thr Gly Asn Gly Ser Gly

210 215 220

Leu Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Gly Lys Phe Asp Trp Thr Val Glu

225 230 235 240

Lys Asp Gly Lys Pro Val Phe Pro Tyr Phe Val Thr Pro Asp Ala Ala

245 250 255

Tyr His Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Pro Ala Phe Gly Leu

260 265 270

Lys Val Arg Val Gly Leu Leu Arg Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser Ala

275 280 285

Phe Asn Ala Trp Ala Ala Val Gln Gly Ile Asp Thr Leu Ser Leu Arg

290 295 300

Leu Glu Arg His Asn Glu Asn Ala Ile Lys Val Ala Glu Phe Leu Asn

305 310 315 320

Asn His Glu Lys Val Glu Lys Val Asn Phe Ala Gly Leu Lys Asp Ser

325 330 335

Pro Trp Tyr Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Thr Gly Ser

340 345 350

Val Leu Thr Phe Glu Ile Lys Gly Gly Lys Asp Glu Ala Trp Ala Phe

355 360 365

Ile Asp Ala Leu Lys Leu His Ser Asn Leu Ala Asn Ile Gly Asp Val

370 375 380

Arg Ser Leu Val Val His Pro Ala Thr Thr Thr His Ser Gln Ser Asp

385 390 395 400

Glu Ala Gly Leu Ala Arg Ala Gly Val Thr Gln Ser Thr Val Arg Leu

405 410 415

Ser Val Gly Ile Glu Thr Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Leu Glu Gly

420 425 430

Gly Phe Ala Ala Ile

435

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Hybrid promoter

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(41)

<223> PtacI

<400> 5

gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg a 41

<210> 6

<211> 3255

<212> DNA

<213> synthesized sequence

<400> 6

cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 60

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 120

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 180

gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 240

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcggca cacagcccag 300

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 360

ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attatggagc tgttgacaat 420

taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 480

agaattcaaa ggaggacaac catgcccacc ctcgcgcctt caggtcaact tgaaatccaa 540

gcgatcggtg atgtctccac cgaagccgga gcaatcatta caaacgctga aatcgcctat 600

caccgctggg gtgaataccg cgtagataaa gaaggacgca gcaatgtcgt tctcatcgaa 660

cacgccctca ctggagattc caacgcagcc gattggtggg ctgacttgct cggtcccggc 720

aaagccatca acactgatat ttactgcgtg atctgtacca acgtcatcgg tggttgcaac 780

ggttccaccg gacctggctc catgcatcca gatggaaatt tctggggtaa tcgcttcccc 840

gccacgtcca ttcgtgatca ggtaaacgcc gaaaaacaat tcctcgacgc actcggcatc 900

accacggtcg ccgcagtact tggtggttcc atgggtggtg cccgcaccct agagtgggcc 960

gcaatgtacc cagaaactgt tggcgcagct gctgttcttg cagtttctgc acgcgccagc 1020

gcctggcaaa tcggcattca atccgcccaa attaaggcga ttgaaaacga ccaccactgg 1080

cacgaaggca actactacga atccggctgc aacccagcca ccggactcgg cgccgcccga 1140

cgcatcgccc acctcaccta ccgtggcgaa ctagaaatcg acgaacgctt cggcaccaaa 1200

gcccaaaaga acgaaaaccc actcggtccc taccgcaagc ccgaccagcg cttcgccgtg 1260

gaatcctact tggactacca agcagacaag ctagtacagc gtttcgacgc cggctcctac 1320

gtcttgctca ccgacgccct caaccgccac gacattggtc gcgaccgcgg aggcctcaac 1380

aaggcactcg aatccatcaa agttccagtc cttgtcgcag gcgtagatac cgatattttg 1440

tacccctacc accagcaaga acacctctcc agaaacctgg gaaatctact ggcaatggca 1500

aaaatcgtat cccctgtcgg ccacgatgct ttcctcaccg aaagccgcca aatggatcgc 1560

atcgtgagga acttcttcag cctcatctcc ccagacgaag acaacccttc gacctacatc 1620

gagttctaca tctaatagac gcgtgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt 1680

gtggaattgt gagcggataa caatttcacg cgtttaatta acacgagtac tggaaaacta 1740

aatgccaaag tacgacaatt ccaatgctga ccagtggggc tttgaaaccc gctccattca 1800

cgcaggccag tcagtagacg cacagaccag cgcacgaaac cttccgatct accaatccac 1860

cgctttcgtg ttcgactccg ctgagcacgc caagcagcgt ttcgcacttg aggatctagg 1920

ccctgtttac tcccgcctca ccaacccaac cgttgaggct ttggaaaacc gcatcgcttc 1980

cctcgaaggt ggcgtccacg ctgtagcgtt ctcctccgga caggccgcaa ccaccaacgc 2040

cattttgaac ctggcaggag cgggcgacca catcgtcacc tccccacgcc tctacggtgg 2100

caccgagact ctattcctta tcactcttaa ccgcctgggt atcgatgttt ccttcgtgga 2160

aaaccccgac gaccctgagt cctggcaggc agccgttcag ccaaacacca aagcattctt 2220

cggcgagact ttcgccaacc cacaggcaga cgtcctggat attcctgcgg tggctgaagt 2280

tgcgcaccgc aacagcgttc cactgatcat cgacaacacc atcgctaccg cagcgctcgt 2340

gcgcccgctc gagctcggcg cagacgttgt cgtcgcttcc ctcaccaagt tctacaccgg 2400

caacggctcc ggactgggcg gcgtgcttat cgacggcgga aagttcgatt ggactgtcga 2460

aaaggatgga aagccagtat tcccctactt cgtcactcca gatgctgctt accacggatt 2520

gaagtacgca gaccttggtg caccagcctt cggcctcaag gttcgcgttg gccttctacg 2580

cgacaccggc tccaccctct ccgcattcaa cgcatgggct gcagtccagg gcatcgacac 2640

cctttccctg cgcctggagc gccacaacga aaacgccatc aaggttgcag aattcctcaa 2700

caaccacgag aaggtggaaa aggttaactt cgcaggcctg aaggattccc cttggtacgc 2760

aaccaaggaa aagcttggcc tgaagtacac cggctccgtt ctcaccttcg agatcaaggg 2820

cggcaaggat gaggcttggg catttatcga cgccctgaag ctacactcca accttgcaaa 2880

catcggcgat gttcgctccc tcgttgttca cccagcaacc accacccatt cacagtccga 2940

cgaagctggc ctggcacgcg cgggcgttac ccagtccacc gtccgcctgt ccgttggcat 3000

cgagaccatt gatgatatca tcgctgacct cgaaggcggc tttgctgcaa tctagggccg 3060

gccgtttaaa ccctgcaggt ccgggacctg caggcatgca agcttggcac tggccgtcgt 3120

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 3180

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 3240

gttgcgcagc ctgaa 3255

201500228 A 2

Claims

1.生产L-甲硫氨酸的方法，其中在包含L-高丝氨酸和硫源的培养基中培养具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的微生物，所述硫源选自甲硫醇、甲硫醇的盐和二甲基二硫化物，由此在培养基中积累L-甲硫氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是重组的，并且L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性是增强的。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性均通过增加的基因表达而增强，其中所述基因编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质或编码具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质。

4.根据权利要求3的方法，其中所述增加的基因表达通过增加所述基因的拷贝数而实现，其中所述基因编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质和/或编码具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述增加的基因表达通过将所述基因与强启动子功能性连接而实现，其中所述基因编码具有L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的蛋白质和/或编码具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微生物选自肠杆菌科和棒杆菌科。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述L-高丝氨酸O-乙酰转移酶活性是源自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的MetX酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性是源自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的MetY酶。