BR112012016274B1

BR112012016274B1 - Aumento da produção de metionina pela superexpressão da succinato desidrogenase

Info

Publication number: BR112012016274B1
Application number: BR112012016274-8A
Authority: BR
Inventors: Rainer Figge
Original assignee: Evonik Degussa Gmbh
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2019-08-20
Also published as: EP2519643B1; CN102712941A; BR112012016274A2; US20120288903A1; AR079764A1; JP2013516167A; BR112012016274A8; JP5819316B2; KR101770123B1; PL2519643T3; KR20120106999A; EP2519643A1; US9267160B2; WO2011080542A1; MX2012007718A; ES2654659T3

Abstract

patente de invenção para: "aumento da produção de metionina pela superexpressão da succinato desidrogenase". a presente invençãqo se refere a um processo para melhorar a produção de metionina -por cultura de um microorganismo modificado para aumentar a expressão de genes envolvidos na síntese da succinato desidrogenase. os microorganismos foram modificados de forma que o rendimento de metionina/ fonte de carbono é aumentado. o isolamento de metionina a partir do meio de fermentação é também reivindicado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: AUMENTO DA PRODUÇÃO DE METIONINA PELA SUPEREXPRESSÃO DA SUCCINATO DESIDROGENASE

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo para melhorar a produção de metionina pela cultura de um microrganismo modificado para aumentar a expressão de genes envolvidos na síntese da succinato desidrogenase. Os microrganismos foram modificados de forma gue o rendimento de metionina/fonte de carbono seja aumentado. O isolamento de metionina a partir do meio de fermentação é também reivindicado.

ESTADO DA TÉCNICA

A succinato desidrogenase (succinatooxidoredutase , SQR) é um membro funcional tanto do ciclo de Krebs guanto da cadeia respiratória aeróbica. A SQR catalisa a oxidação de succinato a fumarato no citoplasma bacteriano com a redução concomitante de ubiquinona na membrana. Em E. coli e outras bactérias, a enzima é constituída por quatro subunidades. As duas subunidades hidrofóbicas, SdhC eSdhD , ancoram duas subunidades hidrofílicas e catalíticas, SdhA eSdhB, para a superfície da membrana interna. Cinco cofatores únicos estão envolvidos na oxidação de succinato a fumarato. Em SdhA uma molécula flavina adenina dinucleotídeo (FAD) covalentemente ligada está presente para catalisar a oxidação de succinato por um mecanismo de transferência de hidreto. Os elétrons são, então, transferidos individualmente através da subunidade de transferência de elétrons (SdhB), que contém grupos [2Fe2S], [4Fe-4S] e [3Fe-4S]. Um sitio de ligação de guinona é formado por residuos de SdhC, SdhDeSdhB, que permitem a redução da ubiquinona a ubiquinol. A enzima também contém uma molécula de heme b, aprisionada entre SdhC e SdhD, que

não	é es	sencial para	a função da	enzima (Yankovskaya e
col.	2003,	Science 299,	700; Cheng e	col.2008 Biochemistry
47,	6107)	•
		0 aminoácido	L-metionina é	um aditivo importante

em alimentos que é produzido em grandes guantidades (600000 t/a) . A sua produção baseia-se exclusivamente na biossintese química e requer precursores derivados do petróleo bruto. Com a crescente pressão sobre o preço desses recursos não-renováveis, a procura por um processo sustentável recebe interesse crescente. A produção fermentativa de metionina tornou-se, assim, uma alternativa economicamente viável ao processo químico.

A produção de metionina por fermentação exige a modificação de vários caminhos propiciados por precursores. Três principais vias contribuem para a biossintese de metionina. 0 aspartato serve como o precursor do esqueleto de carbono, a cisteína como doador de enxofre e o metilenoTHF age como doador do grupo metila terminal. Além disso, a ativação homoserina derivada de aspartato por succinil-CoA é necessária para a primeira etapa na biossintese de metionina. A succinil-CoA é produzida no ciclo de Krebs e, assim, um aumento na expressão de enzimas do ciclo de Krebs pode aumentar a produção de metionina. No entanto, uma atividade elevada do ciclo de Krebs tem se mostrado como uma desvantagem para a produção de aminoácidos e uma redução da atividade das enzimas do ciclo de Krebs, tais como isocitrato desidrogenase, pode ser benéfica para a produção de aminoácidos (documentos W02007017710 Metabolic Explorer, WO2009133063 Evonik Industries).

Os documentos WO 2009078973 (Glycos Biotechnology) e EP1106684 (Evonik Industries) revelam que a supressão dos genes sdh aumenta a produção de aminoácidos e outros metabólitos de interesse industrial. Entende-se, a partir destes ensinamentos, que a diminuição da expressão de genes sdh irá diminuir a atividade do ciclo de Krebs e, assim, a produção de CO₂, que por sua vez deve ter um impacto positivo sobre o rendimento do produto.

Existe uma necessidade de se aumentar o rendimento de produção de metionina a partir de uma fonte de carbono renovável. Contrariamente aos ensinamentos do estado da técnica, de que a diminuição da atividade da succinato desidrogenase aumenta o rendimento do produto, verificou-se que a expressão aumentada da enzima succinato desidrogenase aumenta o rendimento de metionina/glicose.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um método para aumentar a produção de metionina em um processo de fermentação compreendendo as etapas de cultura de um microrganismo modificado para uma produção melhorada de metionina em um meio de cultura apropriado, que compreende uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre, e de recuperar a metionina a partir do meio de cultura, em que o microrganismo é ainda modificado pela expressão aumentada de um ou mais genes que codificam uma enzima succinato desidrogenase (sdh).

A expressão desse(s) gene(s) é reforçada pela inserção, no microrganismo, de pelo menos uma cópia complementar do(s) referido(s) gene(s) que codifica(m) a succinato desidrogenase.

Em outra modalidade da invenção, a metionina é ainda isolada a partir do meio de cultura.

A invenção também se refere a um microrganismo, preferencialmente Enterobacteriaceae, bactérias corineformes, leveduras ou fungos, que é otimizado para a produção de metionina por superexpressão da succinato desidrogenase. Este microrganismo utilizado no processo da invenção permite que haja um aumento no rendimento de metionina/fonte de carbono.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Microrganismo produtor de metionina , A invenção está relacionada com um método para a produção de metionina em um processo de fermentação por cultura de um microrganismo modificado. De acordo com a invenção, os termos cultura, fermentação ou processo fermentativo são utilizados indistintamente para denotar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples. Esta fonte de carbono simples é metabolizada pelo microrganismo para a produção de metionina.

Outro objeto da invenção é um microrganismo modificado para utilização no referido método, para a produção de metionina em um processo de fermentação. De acordo com a invenção, o termo microrganismo designa uma bactéria, levedura ou fungo. Preferencialmente, a bactéria é selecionada dentre Enterobacteriaceae e Corynebacteriaceae. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma espécie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella ou Corynebacterium. Na modalidade mais preferida, a bactéria é selecionada dentre o grupo de Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum. .

Os microrganismos da invenção compreendem preferencialmente gene(s) endógeno(s) que codifica(m) uma enzimasdh.

O termo microrganismo modificado para uma produção melhorada de metionina se refere a um microrganismo que tenha sido geneticamente modificado para melhorar a produção de metionina por metabolizar uma fonte de carbono simples, em comparação com o microrganismo não modificado. Tais modificações podem corresponder a uma expressão aumentada, modulada ou diminuída de genes envolvidos na via de biossíntese de metionina. O técnico no assunto sabe como modular a expressão de genes específicos. Modificações usuais incluem microrganismos transformadores com elementos genéticos, incluindo substituições de genes, modificação de promotores e introdução de vetores para a expressão de genes heterólogos ou endógenos.

O microrganismo modificado, de acordo com a invenção, é modificado através do aumento da expressão de pelo menos um gene que codifica uma das subunidades da enzima succinato desidrogenase. De preferência, todos os genes que codificam as subunidades diferentes da enzima succinato desidrogenase são superexpressos. A succinato desidrogenase é geralmente um complexo de enzima contendo pelo menos três subunidades. Cada subunidade é codificada por um gene. Por exemplo, as espécies de Corynebacterium contêm três genes sdhA, sdhB e sdhC que codificam a succinato desidrogenase (Bussmanne col., 2009, J.

Biotechnol, 143(3),

173) enquanto que outros microrganismos tais como E.

coli ou S.

cerevisiae têm quatro genes para quatro subunidades de succinato desidrogenase

Estes genes sdh são organizados em operon. O termo operon descreve uma unidade de transcrição, em que vários genes são transcritos em um RNA mensageiro policistrônico. (Números de acesso de E. coli para sdhA: P0AC41, sdhB: P07014, sdhC: P69054, sdhD P0AC44).

Os termos reforço ou reforçado ou superexpresso ou expressão aumentada, expressão reforçada ou superexpressão são usados indistintamente no texto e têm um significado similar. Estes termos, neste contexto, descrevem o aumento da atividade intracelular de uma atividade enzimática que é codificada pelo DNA correspondente, por exemplo, aumentando o número de cópias do gene, utilizando um promotor mais forte ou usando um alelo com maior atividade e possivelmente combinando estas medidas. Estes promotores podem ser indutiveis, e eles podem ser homólogos ou heterólogos. O técnico no assunto sabe quais promotores são os mais convenientes, por exemplo, promotores Ptrc, Ptac, Plac (Dicksone col., 1975, Science 187(4171), 27; de Boere col., 1983, Proc Natl Acad Sei USA, 80(1), 21; Brosius e col., 1985, J Biol Chem, 260(6), 3539) ou o promotor lambda cl (Ptashne M, 1986, Blackwell Scientific, Cambridge, MA; Ptashne M, 2004, Cold Spring Harbor Lab Press; Little J, 2004, Richard Calendar. ed. Oxford University Press) são amplamente utilizados.

Quando os genes são organizados em um operon, é possível aumentar a sua expressão por adição de uma cópia complementar destes genes sob o controle de um único promotor. A expressão pode também ser melhorada através da substituição do promotor cromossômico de tipo selvagem com um promotor artificial mais forte do que o promotor de tipo selvagem. 0 técnico no assunto sabe como determinar a força do promotor.

Para se aumentar a expressão de um gene, este pode ser codificado cromossomicamente ou extracromossomicamente. Cópias de genes podem ser adicionadas cromossomicamente ou extracromossomicamente. Cromossomicamente, pode haver uma ou várias cópias extras sobre o genoma, gue podem ser introduzidas por métodos de recombinação conhecidos do técnico no assunto. A introdução extracromossômica de genes pode ser realizada por diversos tipos de plasmideos ou cromossomos artificiais bacterianos, que diferem no que diz respeito à sua origem de replicação e, portanto, no seu número de cópias na célula. Eles podem estar presentes como de 1 a 5 cópias, cerca de 20 ou até 500 cópias, correspondentes a plasmideos de baixo número de cópias com replicação controlada (por exemplo, pSClOl, RK2), plasmideos com baixo número de cópias (por exemplo pACYC, pRSFlOlO) ou plasmideos com elevado número de cópias (por exemplo, pSK bluescript II). Numa modalidade preferida da invenção, os genes sdh podem ser superexpressos usando expressão extracromossomal. Nesta modalidade da invenção, genes sdh são transportados por um Cromossomo Bacteriano Artificial.

A expressão das enzimas pode ser impulsionada ou reduzida por elementos estabilizadores ou desestabilizadores do RNA mensageiro correspondente (Carrier and Keasling, 1998, Biotechnol. Prog. 15, 58) ou as proteínas (por exemplo, etiquetas de GST, Amersham Biosciences).

Os microrganismos, de acordo com a presente invenção, contêm um ou vários alelos dos genes serem reforçados de acordo com a invenção. Preferivelmente, de acordo com a invenção, o microrganismo transporta uma cópia complementar de genes que codificam a enzima succinato desidrogenase. Numa modalidade preferida da invenção, estes genes são clonados num Cromossoma Bacteriano Artificial pCClBAC.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo contém uma cópia complementar dos quatro genes sdhA, sdhB, sdhC e sdhD de E. coli. Os genes na referida cópia complementar podem ser organizados em um operon. Numa modalidade particular da invenção, omicrorganismo compreende pelo menos uma cópia adicional dos genes que codificam a succinato desidrogenase de E. coli.

Na descrição da presente invenção, os genes e proteínas são identificados usando-se as denominações dos genes correspondentes em E. coli. No entanto, e a menos que especificado de outro modo, o uso dessas denominações tem um significado mais geral, de acordo com a invenção e abrange todos os genes e proteínas correspondentes em outros organismos, mais particularmente microrganismos.

O banco PFAM (banco de dados de famílias de proteínas, de alinhamentos e modelos ocultos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteína. Cada PFAM torna possível a visualização de alinhamentos múltiplos, a visualização de domínios da proteína, avaliação da distribuição entre os organismos, acesso a outras bases de dados e visualização de estruturas de proteínas conhecidas.

COGs (bancos de dados de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos comparando-se sequências de proteínas de 66 genomas totalmente sequenciados representando 30 principais linhagens filogenéticas. Cada COG é definido por pelo menos três linhagens, o que permite a identificação de domínios ancestrais conservados.

Os meios para se identificar sequências homólogas e seus percentuais de homologias são bem conhecidos dos técnicos no assunto, e incluem, em particular, os programas BLAST, que podem ser utilizados a partir da página eletrônica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros padrão indicados no site. As sequências obtidas podem, então, ser exploradas (por exemplo, alinhadas) utilizando-se, por exemplo, (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) os programas CLUSTALW ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/ multalin.pl), com os parâmetros padrão indicados nestas páginas eletrônicas.

Usando-se as referências dadas no GenBank para os genes conhecidos os técnicos no assunto são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos linhagens de bactérias, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando-se sequências de consenso que podem ser determinadas através da realização de alinhamentos de sequência com genes derivados de outros microrganismos, e concepção de sondas degeneradas para clonar o gene correspondente no outro organismo. Estes métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos dos técnicos no assunto, e são revelados, por exemplo, em Sambrooke col. (1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd ed. Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

O microrganismo modificado de acordo com a invenção pode ainda compreender outras modificações para aumentar a produção de metionina. Preferivelmente, o microrganismo da invenção compreende, além de uma maior expressão do gene que codifica uma enzimasdh, modificações adicionais para aumentar a produção de metionina. Modificações para aumentar a produção de metionina são bem conhecidas no estado da técnica. Estas modificações são, por exemplo, descritas nos documentos W02009/043803, W02007/077041 e W02005/111202, que são aqui incorporados por referência. Para melhorar a produção de metionina, o microrganismo pode apresentar um aumento da expressão de, pelo menos, um gene selecionado do grupo constituído por:

• cysP que codifica uma proteína de ligação de sulfato periplasmático, como descrito no documento W02009/043803 e em, • cysU que codifica um componente de transportador de sulfato ABC, tal como descrito no documento W02009/043803, • cysW que codifica uma proteína de transporte de sulfato ligada à membrana, tal como descrito no documento W02009/043803, • cysA que codifica uma permease sulfato, tal como descrito no documento W02009/043803, • cysM que codifica uma O-acetil serino sulfidralase, tal como descrito no documento W02009/043803, • cysl e cysJ codificados, respectivamente, pelas subunidades alfa e beta de uma sulfito redutase, como descrito no documento W02009/043803. Preferencialmente cysl e cysJ são, juntos, superexpressos, • cysl que codifica uma sulfito redutase, subunidade alfa, como descrito no documento W02009/043803, • cysH que codifica uma adenililsulfato redutase, tal como descrito no documento W02009/043803, • cysE que codifica uma serino aciltransferase, tal como descrito no documento W02007/077041, • gcvT que codifica uma aminometil transferase tetrahidrofolato dependente, tal como descrito no W02009/043803, • gcvH que está envolvido na divagem de glicina por codificação de um transportador de grupo aminoetila, tal como descrito no documento W02009/043803, • gcvP que codifica uma glicino desidrogenase, tal como descrito no documento W02009/043803, • lpd que codifica uma lipoamido desidroqenase, tal como descrito no documento W02009/043803, • serA que codifica uma fosfoglicerato desidrogenase, tal como descrito no pedido de patente W02009/043803, • serB que codifica uma fosfoserino fosfatase, tal como descrito no pedido de patente W02009/043803,

•	serC	que	codifica	uma	fosfoserino
aminotransferase, tal	como	descrito no	pedido	de patente
W02009/043803,
•	glyA	que	codifica	uma	enzima

hidroximetiltransferase, tal como descrito no documento

W02009/043803, • metF que codifica uma 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase, tal como descrito no W02007/077 041, •Alelos metA, que codificam uma homoserino succiniltransferase com sensibilidade de feed-back reduzida para S-adenosilmetionina e/ou metionina como descrito no documento W02005/111202, • thrA ou alelos thrA que codificam aspartoquinases / homoserino desidrogenase com a inibição de feed-back reduzida para treonina, tal como descrito no documento W02009/043803, •metH que codifica uma homocisteina-N5metiltetrahidrofolato transmetilase B12-dependente como descrito no documento W02007/077041.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo pode apresentar uma inibição da expressão de pelo menos um dos seguintes genes:

• pykA que codifica uma piruvato-quinase, tal como descrito no documento W02009/043803, • pykF que codifica uma piruvato-quinase, tal como descrito no documento W02009/043803, • purU que codifica uma formiltetrahidrofolato deformilase, tal como descrito no documento W02009/043803, • metJ que codifica o repressor de metionina, como descrito no documento JP 2000/157267.

Em outra modalidade da invenção, os seguintes genes modificados que codificam enzimas com propriedades de inibição de feed-back modificadaspodem ser utilizados:

• mutantes metA que codificam enzimas com sensibilidade reduzida de feed-back para metionina e Sadenosilmetionina, conforme descrito no documento

W02005108561

• mutantes thrA	com	sensibilidade	de	feed-back
reduzida para treonina,	como descrito	no	documento
W02005108561.
Microrganismos,	de	acordo com	a	presente

invenção, podem ser ainda modificados para aumentar a produção de metionina usando um alelo metB alterado que utiliza preferencialmente ou exclusivamente H2S para a produção de homocisteina a partir de O-succinil-homoserina, tal como descrito no pedido de patente W02004/076659, que é aqui incorporado por referência.

Todas as patentes e pedidos de patente listados acima e relacionados com a produção de metionina são aqui incorporados por referência.

Os termos: expressão atenuada, expressão reprimida ou atenuação da inibição são usados indistintamente no texto e têm um significado similar. Neste contexto, o termo indica a supressão parcial ou completa da expressão de um gene, que é então dito como atenuada. Esta supressão da expressão pode ser tanto uma inibição da expressão do gene quanto uma deleção de toda ou parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem por um promotor natural mais fraco ou sintético. Preferencialmente, a atenuação de um gene é essencialmente a supressão completa de tal gene, que pode ser substituído por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das linhagens.

Numa modalidade específica da invenção, o microrganismo modificado superexpressa pelo menos um gene selecionado no grupo que consiste de cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysl, cysH, cysE, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, ser A, serB, serC, glyA, metF, metA (com sensibilidade reduzida de feed-back), thrA e metH.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo modificado tem uma expressão atenuada de, pelo menos, um gene selecionado no grupo que consiste de pykA, pykF, metJ e purU.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo modificado superexpressa pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste de cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysl, cysH, cysE, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, glyA, metF, metA (com sensibilidade reduzida de feed-back), thrA (preferencialmente com sensibilidade reduzida de feedback) e metH e reprime, pelo menos, um gene selecionado do grupo que consiste de pykA, pykF, metJ e purU.

Numa modalidade preferida da invenção, o microrganismo superexpressa os genes cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysl, cysH, cysE gcvT, gcvH, gcvP, metF metA (com sensibilidade reduzida de feed-back), thrA (preferencialmente com sensibilidade reduzida de feed-back) e iaetH, serA, serB, serC, glyA e reprime os genes pykA, pykF, metJ e purU.

O técnico no assunto saberá que outros genes podem requerer modificações para otimizar a produção de metionina. Estes genes foram identificados particularmente nos documentos W02007/077041 e W02007/020295, aqui incorporados por referência.

Meio de cultura

No método da invenção, o microrganismo modificado é cultivado em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre. Um 'meio de cultura apropriado' é um meio apropriado para a cultura e para o crescimento do microrganismo. Tais meios são bem conhecidos dos técnicos no assunto em fermentação de microrganismos, dependendo do microrganismo a ser cultivado.

O termo fonte de carbono, de acordo com a presente invenção, se refere a qualquer fonte de carbono que pode ser usada por aqueles técnicos no assunto para suportar o crescimento normal de um microrganismo, que pode ser de hexoses (tais como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarideos, dissacarideos, oligossacarideos (tais como a sacarose, celobiose ou maltose), melaço, amido ou os seus derivados, hemicelulose, glicerol e suas combinações. Uma fonte de carbono simples especialmente

preferida é	a glicose. Outra	fonte de	carbono	simples
preferida é	a sacarose.
A	fonte de enxofre	utilizada	para a	produção
fermentativa	de L-metionina	pode ser	qualquer	um dos

seguintes reagentes: sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, dimetildisulfeto ou uma combinação destes.

Numa modalidade preferida da invenção, a fonte de enxofre é o sulfato e/ou tiossulfato.

A fonte de nitrogênio pode ser um sal de amônio ou de gás amoníaco.

Produção melhorada de metionina

Na invenção, o rendimento de metionina/fonte de carbono é aumentado através da melhora da expressão dos genes que codificam a succinato desidrogenase. O termo rendimento de metionina/fonte de carbono define a quantidade de metionina obtida durante a fermentação dividida pela quantidade da fonte de carbono que tenha sido consumido. Ele pode ser expresso em porcentagem de gramas de metionina/g da fonte de carbono ou por mol metionina/mol de fonte de carbono. O termo melhorado, neste contexto, descreve um aumento mensurável em comparação com o microrganismo sem as modificações especificadas e/ou o meio de cultura sem modificações. Em modalidades preferidas, o aumento é de pelo menos 1% g/g, preferencialmente de pelo menos 2% g/g, mais preferencialmente 4%.

Para se medir este aumento, a quantidade de glicose consumida e de metionina produzida precisa de ser determinada. A quantidade da fonte de carbono que tenha sido consumida é calculada pela determinação da concentração de glicose no meio de crescimento por HPLC ref ratométrica ou de acordo com o método de Brix para soluções alimentadas em batelada. Para culturas de lote, a glicose consumida corresponde à guantidade de glicose residual no início da experiência a partir da qual a quantidade de a glicose residual no final da experiência é subtraída. Para fermentação alimentada em batelada, a quantidade de glicose consumida corresponde à soma de glicose na cultura de lote, da glicose adicionada no inoculo e da quantidade de glicose injetada durante a fase de alimentação em batelada a partir da qual a quantidade de glicose residual no final da experiência é subtraída.

O termo metionina obtida inclui L-metionina e o derivado NAM facilmente recuperável de metionina. A quantidade de metionina obtida no meio é medida por HPLC após derivatização OPA/Fmoc usando a L-metionina (Fluka, Ref. 64319) como um padrão. A quantidade de NAM é determinada utilizando-se HPLC refratométrico, usando NAM (Sigma, Ref. 01310) como um padrão.

Recuperação da metionina

Após a fermentação de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados tais como N-acetilmetionina, são recuperados e eventualmente purificados. Os métodos para a recuperação e purificação dos compostos produzidos são bem conhecidos do técnico no assunto. (WO 2005/007862, WO 2005/059155).

EXEMPLOS

Exemplo 1: MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF DmetJ DpykF DpykA Dpurü (pME101-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC) e MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36ARNmstl7-metF DmetJ DpykF DpykA Dpurü (pME101-thrA*l-cysEPgapA-metA*ll) (pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC)

Linhagens produtoras de metionina foram descritas nos pedidos de patente W02009043803, W02007/077041 e

PCT/FR2009/052520, que são incorporados por referência.

1. Construção do vetor pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serBglyA-serA-serC

Para aumentar o nível de succinato desidrogenase, SdhCDAB, na linhagem produtora de metionina, os quatro genes sdhCDAB foram clonados com o seu próprio promotor no vetor de controle da cópia pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC (com o vetor pCCIBAC, de Epicentre) previamente descrito no pedido de patente W02009043803) .

Para tanto, a região sdhCDAB-TT02 foi amplificada a partir do genoma de E. coli MG1655 utilizando-se os oligonucleotídeos sdhCDAB-F e sdhCDAB-TT02-R (sequência de referência na página eletrônica http://ecogene.org/) , com TT02, que é o finalizador transcricional TI do gene rrnB de E. coli (Orosz e col., 1991, Eur. J. Biochem. 201, 653) . O produto de PCR resultante foi clonado no vetor JCSP (Stratagene), verificado por sequenciamento e o vetor foi denominado PSCB-sdhCDAB-TT02.

sdhCDAB-F at gcgtGCATGCat ctGGCGCCGAATTGGTCAATACTTCCACACTGTTAC com

- Uma região (em minúsculas) com bases extras,

- Uma região (maiusculas sublinhadas) abrigando os sítios Sphl e SfoI,

- Uma região (maiusculas em negrito) homóloga à região sdhCDAB (753931-753958) sdhCDAB-TT02-R aagcgctGCNIGCAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTT

CGTTTTATTTGATGTTTACGCATTACGTTGCAACAACATCG com

- Uma região (em minúsculas) com bases extras,

- Uma região (maiúsculas sublinhadas) de alojamento do sítio Sphl,

- Uma região (maiúsculas em itálico) para sequência TT02 que corresponde à sequência finalizadora transcricional T1 do gene rrnB de E. coli,

- Uma região (maiúsculas em negrito) homóloga à região sdhCDAB (757603-757629).

Para transferir os genes sdhCDAB-TT02 no vetor pCCIBAC, o vetor pSCB-sdhCDAB-TT02 foi restringido com a enzima de Sphl e a região sdhCDAB-TT02 foi clonada dentro do vetor pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC restringida pela mesma enzima. 0 vetor resultante foi denominado pCClBAC-sdhCDABTT02-serB-glyA-SerA-serC.

2. Construção da linhagem MG1655 metA*ll PtrcmetH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36ARNmstl7-metF AmetJ ApykF DpykA ApurU (pME101-thrA*l-cysE24

PgapA-metA*11) (pCClBAC-sdhCDAB-TTO2-serB-glyA-serA-serC)

Subsequentemente, os plasmídeos pME101-thrA*lcysE-PgapA-metA*ll (previamente descritos nos pedidos de patente W02007/077041 e PCT/FR2009/052520) e pCClBACsdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC foram introduzidos por eletroporação na linhagem MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF AmetJ ApykF OpykA ApurU fornecendo a linhagem MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF AmetJ ApykF OpykA ApurU (pMElOlthrA*l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyAserA-serC)

3. Construção da linhagem MG1655 metA*ll PtrcmetH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36ARNmstl7-metF AmetJ ApykF DpykA ApurU (pME101-thrA*l-cysEPgapA-metA* 11) (pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC)

Os plasmídeos pME101-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll (previamente descrito nos pedidos de patente W02007/077041 e PCT/FR2009/052520) e pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC (anteriormente descrito no pedido de patente W02009043803) foram introduzidos por eletroporação na linhagem MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF AmetJ ApykF UpykA ApurU dando a linhagem MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF cysJIH PtrcO9-grcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF AmetJ ApykF DpykA ApurU (pMElOl-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCClBAC-serB-glyAserA-serC).

Exemplo 2. Avaliação das linhagens

Linhagem 1: MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH

PtrcO 9-gcvTHP Ptrc3 6-ARNmstl7-metF

DmetJ DpykF DpykA DpurU (pME101-thrA*l-cysE-PgapAmetA*ll)(pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-TT07-glyA-serA-serC).

Linhagem 2:

cysPUWAM PtrcF-cysJIH

DmetJ DpykF DpykA

MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcFPtrcO 9-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF

DpurU (pME101-thrA*l-cysE-PgapA metA*ll)(pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC).

A produção de linhagens foi avaliada em frascos pequenos de tipo Erlenmeyer. Um pré-cultura de 5,5 ml foi cultivada a 37°C durante 16 horas em um meio misto (meio LB a 10% (Sigma 25%) com 2,5 g.L^-1 de glicose e 90% de meio mínimo PC1) . Esta foi utilizada para inocular uma cultura de 50 mL a um OD₆oo de 0,2, em meio PC1. Quando necessário, espectinomicina e canamicina foram adicionadas a uma concentração final de 50 mg.L¹ e cloranfenicol a 30 mg.L¹. A temperatura das culturas foi de 37°C. Quando a cultura antingiu um OD₆₀₀ de 5 a 7, aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC após derivatização OPA/Fmoc e outros metabólitos relevantes foram analisados utilizando HPLC com detecção refratométrica (ácidos orgânicos e glicose) e por GC-MS após sililação. Três repetições foram feitas para cada linhagem.

Tabela 1: composição do meio mínimo (PC1).

Composto	Concentração (g.L ^X)
ZnSO₄.7H₂O	0,0040
CuC1₂.2H₂O	0,0020
MnSO₄.H₂O	0,0200
CoCl₂, 6H₂O	0,0080
H3BO3	0,0010
Na₂Mo0₄.2H₂ 0	0,0004
MgSO₄.7H₂O	1, 00
Ácido cítrico	6, 00
CaCl₂.2H₂O	0,04
K₂HPO₄.3H₂O	10,50
Na₂HPO₄	2,00
(NH₄) ₂hpo₄	8,00
nh₄ci	0,13

NaOH 4M	Ajustado a pH 6,8
FeSO₄.7H₂O	0, 04
Tiamina	0,01
Glicose	10,00
Tiossulfat o de amônio	5, 60
Vitamina B12	0,01
MOPS	10,00
IPTG	0,0024

Tabela 1: rendimento de metionina (Y_met) ^em %g d® metionina/g de glicose produzida em cultura de lote de 10 diferentes linhagens. Para a definição exata do rendimento de metionina/glicose, veja abaixo. SD indica o desvio padrão para o rendimento que foi calculado com base nas três repetições.

Linhagem	Y met	S D
Linhagem 1: (pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB- TT07-glyA-serA-serC)	1 2,85	0 ,24
Linhagem 2: (pCClBAC-serB-TT07-glyA-serA- serC)	1 1,51	0 , 25

A concentração de metionina extracelular foi quantificada por HPLC após derivatização OPA/FMOC. A concentração de glicose residual foi analisada utilizandose HPLC com detecção refratométrica. O rendimento de metionina foi expresso como segue:

Y_met =_____metionina (g) * 10 0 glicose consumida (g)

Como pode ser visto na tabela 1, o rendimento de metionina/glicose (Ymet) θ aumentado quando ocorre superexpressão de sdhCDAB.

REFERÊNCIAS:

1. Yankovskaya V, Horsefield R, Tõrnroth S, LunaChavez C, Miyoshi H, Léger C, Byrne B, Cecchini G, Iwata S, 2003, Science, 299, 700-704.

2. Cheng VW, Johnson A, Rothery RA, Weiner JH, 2008, Biochemistry, 47, 9107-9116.

3. Bussmann M, Emer D, Hasenbein S, Degraf S, Eikmanns BJ, Bott M, 2009, J. Biotechnol, 143(3), 173-182.

4. Dickson RC, Abelson J, Barnes WM, Reznikoff WS, 1975, 187(4171), 27-35.

5. Brosius J, Erfle M, Storella J, J Biol Chem, 260(6), 3539-41.

6. Ptashne M, 1986; A genetic switch. Blackwell Scientific, Cambridge, MA.

·,

7. Ptashne Μ, 2004; Ά genetic switch: Phage lambda revisited. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY.

8. Little J, 2004; The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8. Gene regulatory circuitry of phage λ. 2nd edition 2004. Richard Calendar.ed. Oxford University Press.

9. Carrier and Keasling, 1998, Biotechnol. Prog, 15, 58-64.

10. Orosz A., Boras I., Venetianer P, 1991, European Journal of Biochemistry, 201, 653-659.

Claims

1. Método para a produção de metionina em um processo de fermentação caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

cultivar um microorganismo modificado selecionado de bactérias Enterobacteríaceae e Coryneform com um aumento de expressão de genes envolvidos na via de biossintese de metionina em comparação com os microorganismo não modificados, num meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre, e

- recuperar metionina do meio de cultura, em que o microrganismo é ainda modificado aumentando a expressão dos genes que codificam uma enzima succinato desidrogenase conseguida inserindo no microrganismo pelo menos uma cópia suplementar dos quatro genes sdhA, sdhB, sdhC e sdhD de E. coli.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre no meio de cultura é sulfato, tiossulfato, sulfureto de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito ou uma combinação de diferentes fontes.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é glicose ou sacarose.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de isolamento de metionina a partir do meio de cultura.

Petição 870180012259, de 15/02/2018, pág. 16/18

2/2

5. Microorganismo modificado para uma produção de metionina em um meio de cultura apropriado caracterizado pelo fato de que o microorganismo é selecionado de bactérias Enterobacteríaceae e Coryneform modificadas com uma expressão aumentada de genes envolvidos na via de biossintese de metionina em comparação com o microrganismo não modificado, em um meio de cultura apropriado em que o microorganismo é ainda modificado pela ampliação da expressão de codificação de genes para a enzima succinato desidrogenase conseguida inserindo no microorganismo pelo menos uma cópia suplementar dos quatro genes sdhA, sdhB, sdhC e sdhD de E. Colí.

6. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma cópia adicional do operon sdh a partir de E. colí.

7. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 5 a 6, caracterizado pelo fato de que este é selecionado dentre o grupo consistindo de E. colí e C. glutamicum.