JP2009504172A - 向上したメチオニン合成効率を有する微生物 - Google Patents

Abstract

本発明は、向上したメチオニン合成効率を有する微生物の作製のための方法に関する。本発明はまた、向上したメチオニン合成効率を有する微生物にも関する。さらに、本発明はメチオニン合成に関して生物にとって最適な代謝流量を決定するための方法に関する。
【選択図】なし

Description

発明の属する分野
本発明は、生物によって生産される精製化学製品の分野に存する。特に、本発明は、向上したメチオニン合成効率を有する微生物の作製のための方法に関する。本発明はまた、向上したメチオニン合成効率を有する微生物に関する。さらに、本発明はメチオニン合成に関して生物にとって最適な代謝流量を決定するための方法に関する。

技術的背景
アミノ酸は種々の目的で使用され、一適用分野は、ヒトおよび動物の食物中の食品添加物としての使用である。メチオニンは、食物とともに摂取する必要がある必須アミノ酸である。タンパク質生合成に必須であることに加えて、メチオニンは、種々の代謝産物、例えばグルタチオン、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびビオチン（biotine）の前駆体として働く。メチオニンはさらに、種々の細胞プロセスにおけるメチル基供与体として機能する。

現在、世界中のメチオニンの年間生産量は約５００，０００トンである。メチオニンは、家畜または養鶏飼料（livestock of poultry feed）の第一の制限アミノ酸であり、それゆえに、飼料の補充物質として主に適用される。他の工業用アミノ酸とは対照的に、メチオニンは、ほぼ例外なく、化学合成によって製造されたラセミ化合物として適用される（DE 190 64 05）。動物はメチオニンの両立体異性体を代謝できるので、化学的に製造されたラセミ混合物の直接摂食が可能である（D'Mello and Lewis (1978) Effect of Nutrition Deficiencies in Animals: Amino Acids, Rechgigl (Ed.) CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490）。

しかし、既存の化学製造を生物工学的プロセスによって置き換えることに、依然として大きな関心がある。このことは、低レベルの補充では、Ｄ−メチオニンよりＬ−メチオニンが硫黄アミノ酸の良好な供給源であるという事実に起因する（Katz & Baker, (1975) Poult. Sci., 545, 1667-74）。さらに、化学的プロセスは、やや危険な化学物質を使用し、実質的な廃棄物の流れを生じさせる。効率的な生物工学的プロセスであれば、化学製造のすべての前記不都合を回避することができる。

他のアミノ酸、例えばグルタミン酸、リシン、スレオニンおよびトリプトファン（tryptophane）では、発酵法を使用してそれらを製造することが知られている。これらの目的では、特定の微生物、例えば大腸菌（Escherichia coli（E.coli））およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum（C.glutamicum））が特に好適であることが判明している。発酵によるアミノ酸の製造はまた、Ｌ−アミノ酸しか生産されず、かつ、化学合成に使用される環境的に問題がある化学物質、例えば溶媒、等が回避されるという具体的利点を有する。しかし、微生物の発酵によるメチオニンの製造は、化学製造に匹敵する価格で商業規模でメチオニンの製造を可能にする場合にしか、化学合成の代替法にならない。

従来、一般に精製化学製品としても指定される硫黄含有化合物の製造に微生物、例えば大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカムを使用する試みが行われている。これらの方法には、従来の突然変異誘発による株選択、ならびに培養条件、例えばステアリング、酸素の提供、培養培地の組成、等の最適化が含まれた（Kumar et al. (2005) Biotechnology Advances, 23, 41-61）。

微生物の発酵によるメチオニンの製造が未だ経済的に関心を引き起こすものになっていない理由の１つは、おそらく、メチオニンを導く生合成および代謝経路の特殊性に起因する。概して、生物、例えば大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム中でメチオニン合成を導く基本的な代謝経路は周知である（例えばVoet and Voet (1995) Biochemistry, 2^nd edition, Jon Wiley &Sons, Inc and http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html）。しかし、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌中のメチオニン生合成の詳細は集中的な研究対象であり、最近、Rueckert et al.（Rueckert et al. (2003), J. of Biotechnology, 104, 213-228）およびLee et al.（Lee et al. (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 459-467）でレビューされている。

メチオニンの生合成における重要なステップは、炭素主鎖中への硫黄の取り込みである。硫黄供給源は通常スルフェートであり、それは微生物によって摂取される必要がある。そして微生物は、スルフェートを活性化し、還元する必要がある。前記ステップは分子メチオニンあたり７ｍｏｌ ＡＴＰおよび８ｍｏｌ ＮＡＤＰＨのエネルギー入力を必要とする（Neidhardt et al. (1990) Physiology of the bacterial cell: a molecular approach, Sunderland, Massachusetts, USA, Sinauer Associates, Inc.）。ゆえに、メチオニンは、細胞が最も多量のエネルギーを提供しなければならない１つのアミノ酸である。

その結果、メチオニン産生微生物は、メチオニン合成の速度および量に関して厳格なコントロール下にある代謝経路を発達させている（Neidhardt F.C. (1996) E. coli and S. typhimurium, ASM Press Washington）。これらの調節メカニズムには、例えばフィードバックコントロールメカニズムが含まれ、すなわち、細胞が十分な量のメチオニンを生産すると、メチオニン産生代謝経路はその活性に関して下方制御される。微生物による工業規模のメチオニン製造に使用できる微生物を取得するための先行技術のアプローチは、主に、メチオニンの生合成に関与する遺伝子を特定することによって前述のコントロールメカニズムを克服することに重点的に取り組んだ。そしてメチオニンの生産量を増大させる最終目標を有して、これらの遺伝子が、それぞれの機能に応じて過剰発現されるか、あるいは抑制された。この関連で、メチオニンの量は細胞集団量あたりの取得メチオニン量または時間および容量あたりの取得メチオニン量（空時収量）または細胞集団および空時収量の両因子の組み合わせとして規定されている。

例えば、WO 02/10209では、特定の遺伝子を過剰発現または抑制して、メチオニンの生産量を増大させることが記載されている。最近、Reyら（Rey et al. (2003), J. Biotechnol., 103, 51-65, ）は転写リプレッサーＭｃｂＲを特定した。ＭｃｂＲは、メチオニンの生合成に関与する遺伝子、例えばｍｅｔＹ（Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする）、ｍｅｔＫ（Ｓ−アデノシル−メチオニンシンセターゼをコードする）、ｈｏｍ（ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする）、ｃｙｓＫ（Ｌ−システインシンターゼをコードする）、ｃｙｓＩ（ＮＡＤＰＨ依存性亜硫酸レダクターゼ（sulphite reductase）をコードする）およびｓｓｕＤ（アルカンスルホナートモノオキシゲナーゼをコードする）の発現をコントロールする。

前記アプローチは、野生型と比較して多量のメチオニンを生産する（メチオニン量は細胞集団あたり、あるいは時間および容量あたり（空時収量）で算出される）微生物株の構築を可能にしたが、それでもなお、現在まで、工業的に競合するメチオニン過剰産生生物は報告されていない（Mondal et al. (1996) Folia Microbiol. (Praha), 416, 465-72,（Kumar et al. (2005) Biotechnology Advances, 23, 41-61）。

発明の要旨
１ｋｇの細胞集団あたり、あるいは時間および容量あたりのメチオニンの量として典型的に算出される、生物によるメチオニンの生産量が、メチオニン産生生物が経済的に関心を引き起こし、かつこのアミノ酸の化学製造に対する商業的に実現可能な代替法であるとみなされるかどうかの十分な指標ではないことが発見された。むしろ、経済的に関心を引き起こす化学合成法の代替法であるために、高い効率を有するメチオニン産生生物が必要とされる。すなわち、メチオニンの生産に消費される炭素供給源、例えばグルコースの量または入力によって示される産生系のエネルギー入力に基づいてメチオニンの高い空時収量を提供する生物である。

ゆえに、メチオニン産生生物が化学合成の代替法であるとみなされるかどうかを決定する場合、重要なパラメータは、細胞集団の重量あたりのメチオニンの生産量ではなく、効率、すなわち系によって消費される、例えばグルコース形式のエネルギー入力量あたりのメチオニンのモル生産量であるものとする。

この関連で、微生物において高い効率でメチオニンを生産するために、直接または間接的にメチオニン合成に寄与する生物の代謝経路をメチオニン合成に関して最適な方法で使用する必要があることがさらに発見された。ゆえに、生物による効率的なメチオニン生産のために、代謝経路を通る代謝流量を改変する必要がある。改変は、メチオニン主鎖の合成に直接関与する経路に必要なだけでなく、追加の基質、例えば種々の酸化状態の硫黄原子、還元状態の窒素、例えばアンモニア、追加の炭素前駆体、例えばＣ１炭素供給源、例えばセリン、グリシンおよびギ酸（formate）、メチオニンの前駆体およびテトラヒドロ葉酸（tetrathydrofolate）（Ｎ５およびまたはＮ１０位が炭素で置換されている）の種々の代謝産物を提供する経路の改変も必要とされるかもしれない。さらに、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２等の還元相当物（reduction equivalents）の形式のエネルギーはメチオニンを導く経路に関与しうる。ゆえに、非常に効率的にメチオニンを生産する微生物は、メチオニンの構築を導く経路およびその前駆体を提供する経路を通る高い代謝流量を必要とするが、例えば他のアミノ酸の生合成経路を通る低い代謝流量しか必要としないかもしれない。

したがって、本発明の目的は、メチオニン合成に直接または間接的に関与する経路を通る最適な代謝流量を特定して、メチオニン合成が非常に効率的である潜在的な生物を特定することである。

別の本発明の目的は、効率的メチオニン生合成を達成するために、メチオニン合成に関して、生物の種々の代謝経路を通る理想的な代謝流量を予測することを可能にする方法を提供することである。

別の本発明の目的は、向上したメチオニン合成効率を有する生物を取得するための方法を提供することである。

本発明はまた、メチオニン合成に関して、より効率的な生物を目的にする。

前記および他の目的は、後の説明から明らかになるように、独立請求項で規定される対象発明によって解決される。従属請求項は、本発明によって意図されるいくつかの実施形態に関する。

本発明の取得時には、エレメンタリー・フラックスモード（elementary flux mode）解析またはエクストリーム経路（extreme pathway）解析とも称される代謝経路解析を使用して、メチオニン合成に関する生物の代謝特性を研究した。上記代謝経路解析は先行技術において他の細胞系に関して報告されている（Papin et al. (2004) Trends Biotechnol. 228, 400-405; Schilling et al. (2000) J. Theor. Biol., 2033, 229-248; Schuster et al. (1999) Trends Biotechnol. 172, 53-60）が、このタイプの解析は、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌等の生物中のメチオニン生産の効率に関して検討されていない。代謝経路解析は、一般に、代謝経路ネットワークのすべての可能な定常状態流量分布を含有する溶液空間（solution space）の算出を可能にする。これによって、研究対象の代謝経路ネットワークの化学量論、例えばエネルギー、前駆体ならびに補助因子要求性が完全に考慮に入る。

本発明では、このエレメンタリー・フラックスモード解析は、主要な工業用アミノ酸生産者、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌の代謝経路ネットワークを比較することによってメチオニン生産の効率に関して初めて実行された。この目的で、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌に関して生化学反応モデルが構築された（下記参照のこと）。該モデルは、硫黄代謝のすべての関連経路を含んでいた。それには、メチオニン生産に関連しているすべての経路が含まれる。前記モデルは、調査対象の生物についての現在の生化学的知識から構築された（下記参照のこと）。これらのモデルに基づいて、メチオニン生産の効率を高めるためにどの経路がより高い集中度で、あるいはより低い集中度で（more or less intensively）使用されるべきであるかを予測するために、種々の経路を通る最適な代謝流量が算出された。

これらのモデルを計算することによって、外因的な代謝産物、例えば炭素供給源および硫黄供給源の存在を含めた一定セットの条件に関して、メチオニン生産に最適なモデル生物が取得された。

ゆえに本発明は、向上したメチオニン合成効率を有する生物を設計するための方法に関する。この方法は、メチオニン合成に関与する既知の代謝経路に基づいて取得された、これらの経路の反応を通る代謝流量に関する複数のパラメータを用いて、当初のメチオニン合成生物を表現またはパラメータ表現するステップ、および次いで、当初のメチオニン合成生物のメチオニン合成の効率と比較してメチオニン合成効率が向上するように、前記複数のパラメータのうちの少なくとも１つを変更することにより、かつ／またはそのような少なくとも１つのさらなるパラメータを導入することにより、向上したメチオニン合成効率を有する生物を決定するステップを含む。ゆえに、この方法を使用して、効率的メチオニン合成を可能にするはずであろう理論上の生物を予測することが可能である。該方法の詳細な実行は追って記載される。

本発明の目的で、これらのパラメータは、検討対象の代謝経路ネットワークの単一反応に関して規定された。ゆえに、最適化に関するパラメータは、使用される生物中の反応の存在、反応の化学量論および反応の可逆性に関して規定された。結果として、該パラメータは該ネットワークの種々の反応を通る代謝流量に関する。

本発明はまた、向上したメチオニン合成効率を有する当初の生物を設計するためのデバイスであって、向上したメチオニン合成を有する生物に関する最適化された経路を予測するための前述の方法ステップを実行するようにつくられたプロセッサを含むデバイスに関する。

本発明はさらに、向上したメチオニン合成効率を有する生物を設計するためのコンピュータプログラムが格納されたコンピュータ読み込み可能な媒体に関する。該コンピュータ読み込み可能な媒体は、プロセッサによって実行された場合に、向上したメチオニン合成効率を有する理論的に最適化された生物を設計するための前述の方法ステップを実行するようにつくられている。

本発明はさらに、向上したメチオニン合成効率を有する生物を設計するプログラム要素であって、プロセッサによって実行された場合に、前述の方法ステップを実行するようにつくられているプログラム要素に関する。

本発明はまた、向上したメチオニン合成効率を有する生物を作製するための方法であって、野生型生物を遺伝的に改変し、前述の方法の予測に、より近づくように該生物の代謝流量に影響を与えることによって、前述の予測を利用する方法に関する。これは、特定の反応経路を通る代謝流量が増大および／または低減するように生物を遺伝的に改変することによって達成してよい。遺伝的改変は組換えＤＮＡテクノロジーによって導入してよい。さらに、これは、他の技術によって達成してもよく、該他の技術は、例えば、非限定的に、突然変異および選択プロセス、例えば化学的またはＵＶ突然変異誘発およびその後の、向上した特性を有する耐性株を導く、基質アナログ（substrate analoga）含有培地上での生育による選択である。

本発明はまた、向上したメチオニン合成効率を有する生物を作製するための方法であって、野生型生物でなく、好ましくは増大した量および／または時空収量でメチオニンを生産するように以前にすでに遺伝的に改変されている生物を遺伝的に改変することによって、前述の予測を利用する方法に関する。そのような生物は、メチオニン過剰生産者として知られている生物であってよく、それには、例えば、硫酸固定に関する遺伝子、システイン生合成に関する遺伝子およびメチオニン合成に関する遺伝子ならびにオキサロ酢酸からアスパラギン酸セミアルデヒドへの変換に関する遺伝子が過剰発現されている生物が含まれる。すでに遺伝的に改変されているそのような生物では、向上したメチオニン合成効率に関する前述の予測は、前述の方法の予測に、より近づくように該生物の代謝流量に影響を与えるために実施してよい。これは、特定の反応経路を通る代謝流量が増大および／または低減するように生物を遺伝的に改変することによって達成してよい。遺伝的改変は組換えＤＮＡテクノロジーによって導入してよい。さらに、これは、他の技術によって達成してもよく、該他の技術は、例えば、非限定的に、突然変異および選択プロセス、例えば化学的またはＵＶ突然変異誘発およびその後の、向上した特性を有する耐性株を導く、基質アナログ含有培地上での生育による選択である。

驚くべきことに、野生型生物に関して得られる理論的予測を使用して、例えばメチオニン合成に関する経路または例えばそれに関する副経路にすでに突然変異を保持する生物においてもメチオニン合成効率を高めることができることが発見された。ゆえに、それぞれの出発生物に基づいて理論的予測を算出することは必要でなく、野生型生物に関して得られた理論的予測で十分であると考えられる。しかし、本発明はまた、もちろん、何らかの前述の突然変異をすでに提供している当初の生物に基づいて最適な代謝流量を算出し、該予測を使用して該生物をさらに遺伝的に改変するようにする実施形態を考慮する。

特に、本発明は、向上したメチオニン生産効率を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium）およびエシェリキア属（Escherichia）の微生物を作製するための方法であって、前述のモデルを構築するために使用された経路を通る代謝流量を増大させ、かつ／または導入するステップを含む方法に関する。これらの方法には、さらに、前述の経路を通る代謝流量を少なくとも部分的に低減させるステップを含ませてよい。

本発明はまた、前述の方法のいずれかによって取得できる、向上したメチオニン合成効率を有する生物に関する。

さらに、本発明は、メチオニンを製造するための、そのような生物の使用、ならびに、前述の生物を培養し、メチオニンを単離することによるメチオニンの製造方法のための、そのような生物の使用に関する。

発明の詳細な説明
向上したメチオニン合成効率を有する理論的に最適化された生物を特定するために前述の方法を実行する方法を詳細に説明する前に、以下、定義を挙げる。

用語「微生物の合成効率」とは、メチオニンの炭素収率を説明する。この効率は、系に入った炭素基質の形式のエネルギー入力のパーセンテージとして算出される。本発明の全体を通して、特に指定しない限り、この値は、パーセント値（（メチオニンｍｏｌ）（炭素基質ｍｏｌ）^−１×１００）単位で表記される。

用語「向上したメチオニン合成効率」は、前述の方法によって理論的にモデル化された、パラメータ化に使用された当初のモデル生物と比較して高いメチオニン合成効率を有する生物間の比較に関する。

用語「向上したメチオニン合成効率」とは、例えば遺伝的に改変されている生物がそれぞれの出発生物と比較して向上したメチオニン合成効率を提供する状況を説明することもある。

用語「代謝経路」とは、改善したメチオニン合成を有する生物を設計するための前述の理論モデルで使用される代謝経路ネットワークの部分である一連の反応に関する。

用語「代謝経路」とはまた、現実の生物で生じる一連の反応を説明する。代謝経路は、周知の反応系列、例えば呼吸鎖、グリコシル化、トリカルボン酸回路、等を含む。これらは標準的な教科書から公知のものである。あるいは、本発明の目的で別々に代謝経路が定義されることもある。

用語「代謝流量」とは、例えばグルコース等の炭素供給源の形式で系にフィードされる、生物の代謝経路ネットワークまたは前述の理論モデルの反応を通過するエネルギー入力の量を説明する。該ネットワークの各反応は、通常、全体の代謝流量に寄与する。結果として、代謝流量を該ネットワークの各反応に割り当ててよい。エレメンタリー・フラックスモードは、ネットワークモデルの種々の反応の化学量論に基づいて算出され、流量は、典型的に、グルコースの形式で測定されるエネルギー摂取率に対して標準化された相対モル値で表記され、すなわち流量はｍｏｌ（物質）×（グルコースｍｏｌ）^−１×１００）で表記される。

用語「改変された代謝流量」とは、遺伝的に改変された生物の特定の反応または代謝経路を通る代謝流量が出発生物と比較して増大または低減する状況に関する。この用語はまた、メチオニン合成に関して最適化された生物を決定または設計する前述の理論的方法にしたがって、理論的代謝経路ネットワークのパラメータを変更することによって代謝経路ネットワークの特定の反応または代謝経路を通る理論的代謝流量が増大または低減する状況に関する。

本発明の関連で、用語「代謝流量に近づける（approximating the metabolic flux）」が使用される場合、この用語は、生物を遺伝的に改変して、前述の理論モデルの構築に使用されたメチオニン合成の経路を通る代謝流量を増大および／または低減させ、かつ／または導入することに関する。遺伝的改変は前述のモデルの予測に基づいて選択されるため、遺伝的に改変された生物の代謝流量は、それぞれの出発生物と比較して、前述の最適化されたモデルの代謝流量により密接に近づくはずであろう。

用語「発現する（express）」、「発現している（expressing）」、「発現された（expressed）」および「発現（expression）」とは、遺伝子産物（例えば、本出願で規定および記載される経路または反応の遺伝子の生合成酵素）についての発現であって、得られたコード対象のこのタンパク質の酵素活性またはそれが参照する経路または反応が、この遺伝子／経路が発現されている生物におけるこの経路または反応を通る代謝流動を可能にするレベルでの発現を表す。該発現は、出発生物として使用される微生物の遺伝的改変によって施しうる。ある実施形態では、微生物を遺伝的に改変（例えば遺伝子操作）して、出発微生物によって、あるいは改変されていない同等の微生物において生産されるレベルと比べて向上したレベルで遺伝子産物を発現させることができる。遺伝的改変には、非限定的に、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列または部位の変更または改変（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは複数のプロモーター（multiple promoters）を付加するか、あるいは発現が構成的であるように調節配列を除去することによる変更または改変）、特定の遺伝子の染色体上の位置の改変、特定の遺伝子に隣接する核酸配列、例えばリボソーム結合部位または転写ターミネーターの変更、特定の遺伝子のコピー数の増加、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子等）の改変、または当技術分野の習慣的手法を使用する、特定の遺伝子の発現を調節解除する任意の他の慣用の手段（非限定的に、例えばリプレッサータンパク質の発現をブロックするための、アンチセンス核酸分子の使用が含まれる）が含まれる。

用語「過剰発現する（overexpress）」、「過剰発現している（overexpressing）」、「過剰発現された（overexpressed）」および「過剰発現（overexpression）」とは、遺伝子産物（例えば、本出願において規定および記載されているメチオニン生合成酵素または硫酸還元経路の酵素またはシステイン生合成酵素または遺伝子または経路または反応）の発現であって、出発微生物の遺伝的改変前に存在するレベルより高いレベルでの発現を表す。ある実施形態では、微生物を遺伝的に改変（例えば遺伝子操作）して、出発微生物によって生産されるレベルと比べて向上したレベルで遺伝子産物を発現させることができる。遺伝的改変には、非限定的に、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列または部位の変更または改変（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターまたは複数のプロモーターを付加するか、あるいは発現が構成的であるように調節配列を除去することによる変更または改変）、特定の遺伝子の染色体上の位置の改変、特定の遺伝子に隣接する核酸配列、例えばリボソーム結合部位または転写ターミネーターの変更、特定の遺伝子のコピー数の増加、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子等）の改変、または当技術分野の習慣的手法を使用する、特定の遺伝子の発現を調節解除する任意の他の慣用の手段（非限定的に、例えばリプレッサータンパク質の発現をブロックするための、アンチセンス核酸分子の使用が含まれる）が含まれる。コリネバクテリウム・グルタミカム等の生物における遺伝子の過剰発現の例はEikmanns et al（Gene. (1991) 102, 93-8）に見出せる。

ある実施形態では、微生物を物理的または環境的に改変して、出発微生物による遺伝子産物の発現のレベルと比べて増加したレベルまたは低いレベルで遺伝子産物を発現させることができる。例えば、微生物を、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を増加させることが知られているか、あるいはそう疑われている物質で処理するか、あるいは該物質の存在下で培養して、転写および／または翻訳が増強されるか、あるいは増加するようにすることができる。あるいは、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を増加させるよう選択される温度で微生物を培養して、転写および／または翻訳が増強されるか、あるいは増加するようにすることができる。

用語「調節解除する（deregulate）」、「調節解除された（deregulated）」および「調節解除（deregulation）」とは、微生物中の少なくとも１つの遺伝子の変更または改変を表し、その場合、該変更または改変によって、変更または改変の不存在下でのメチオニン生産と比べて微生物中のメチオニン生産効率が向上する。ある実施形態では、変更または改変対象の遺伝子が生合成経路の酵素をコードし、微生物中の該生合成酵素のレベルまたは活性が変更または改変されるようにする。ある実施形態では、生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を変更または改変し、該酵素のレベルまたは活性が未改変または野生型遺伝子の存在下でのレベルと比べて増強されるか、あるいは増加するようにする。ある実施形態では、該生合成経路はメチオニン生合成経路である。他の実施形態では、該生合成経路はシステイン生合成経路である。調節解除にはまた、例えば、フィードバック抵抗性であるか、あるいはより高い比活性またはより低い比活性を有する酵素を生じさせるための１以上の遺伝子のコード領域の改変が含まれる。また、調節解除はさらに、メチオニンおよび／またはシステイン生合成経路中の遺伝子の発現を調節する転写因子（例えばアクチベーター、リプレッサー）をコードする遺伝子の遺伝的改変を包含する。

フレーズ「調節解除された経路または反応」とは、少なくとも１つの生合成酵素のレベルまたは活性が変更または改変されるように、生合成経路または反応中の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が変更または改変されている生合成経路または反応を表す。フレーズ「調節解除された経路」には、１以上の遺伝子が変更または改変されていることによって、対応する遺伝子産物／酵素のレベルおよび／または活性が変更されている生合成経路が含まれる。ある場合には、微生物中の経路を「調節解除する」（例えば、特定の生合成経路の２以上の遺伝子を同時に調節解除する）能力は、２以上の酵素（例えば、２または３つの生合成酵素）が、「オペロン」と称される連続片の遺伝物質上で互いに隣接して存在する遺伝子によってコードされている、微生物の特定の現象から生じる。他の場合には、経路を調節解除するために、一連の連続操作ステップにおいて、いくつかの遺伝子を調節解除する必要がある。

用語「オペロン」とは、１以上の、好ましくは少なくとも２つの、構造遺伝子（例えば、酵素、例えば生合成酵素をコードする遺伝子）に付随するプロモーターおよびおそらく調節エレメントを含有する遺伝物質の協調単位を表す。構造遺伝子の発現は、例えば調節エレメントに結合する調節タンパク質によって、あるいは転写のアンチターミネーションによって、協調的に調節されうる。構造遺伝子の転写によって、すべての構造タンパク質をコードする単一のｍＲＮＡが生じうる。オペロン中に含まれる遺伝子の協調された調節に起因して、単一のプロモーターおよび／または調節エレメントの変更または改変によって、オペロンによってコードされる各遺伝子産物の変更または改変が生じうる。調節エレメントの変更または改変には、非限定的に、内因性プロモーターおよび／または調節エレメント（群）の除去、強力なプロモーター、誘導性プロモーターまたは複数のプロモーターの付加または、遺伝子産物の発現が改変されるような調節配列の除去、オペロンの染色体上の位置の改変、オペロンに隣接するか、あるいはオペロン内の核酸配列、例えばリボソーム結合部位の変更、コドン使用頻度、オペロンのコピー数の増加、オペロンの転写および／またはオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子等）の改変、または当技術分野で習慣的な遺伝子の発現を調節解除する任意の他の慣用の手段（非限定的に、例えばリプレッサータンパク質の発現をブロックするための、アンチセンス核酸分子の使用が含まれる）が含まれる。

ある実施形態では、本明細書中に記載の組換え微生物を遺伝子操作して、細菌由来の遺伝子または遺伝子産物を過剰発現させている。用語「細菌由来の（bacterially-derived）」および「細菌に由来する（derived-from bacteria）」とは、細菌中で天然に認められる遺伝子または細菌遺伝子によってコードされる遺伝子産物を表す。

用語「生物」とは、本発明の目的では、メチオニン等のアミノ酸の生産に一般に利用される任意の生物を表す。特に、用語「生物」は、原核生物、下等真核生物および植物に関する。前述の生物の好ましい群には、アクチノバクテリア（actino bacteria）、シアノバクテリア（cyano bacteria）、プロテオバクテリア（proteo bacteria）、クロロフレクサス・アウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）、ピレルラｓｐ．１（Pirellula sp. 1）、ハロバクテリア（halo bacteria）および／またはメタノコッカス（methanococci）、好ましくはコリネバクテリア（coryne bacteria）、マイコバクテリア（myco bacteria）、ストレプトマイセス（streptomyces）、サルモネラ（salmonella）、大腸菌、シゲラ（Shigella）および／またはシュードモナス（Pseudomonas）が含まれる。特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、バシラス（Bacillus）属の微生物、特に枯草菌（Bacillus subtilis）、およびストレプトマイセス属の微生物から選択される。

用語「当初の生物」は、独立請求項１に記載の前述のモデルに関する初期セットのパラメータの割り当てに使用された生物および代謝経路ネットワークを説明するために使用される。

用語「出発生物」とは、メチオニン生産の信用を向上させるための遺伝的改変に使用される生物を表す。出発生物は、野生型生物であっても、すでに突然変異を保持する生物であってもよい。出発生物は当初の生物と同一でありうる。出発生物は、例えば、メチオニン過剰生産者であってよい。

用語「野生型生物」とは、遺伝的に改変されていない生物に関する。用語メチオニン過剰生産者とは、遺伝子操作によって、突然変異および選択によって、あるいは任意の他の公知の方法によって改変されている生物であって、メチオニン過剰生産者の取得に使用された野性株より多くのメチオニンを過剰生産する生物に関する。

しかし、本発明の生物は、酵母、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）またはセレビシエ（cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含んでもよい。

植物もまた、アミノ酸の生産に関して本発明によって考慮される。そのような植物は、単子葉植物または双子葉植物、例えば単子葉または双子葉の作物、食用植物または飼料植物であってよい。単子葉植物の例は、アベナ属（avena）（カラスムギ）、コムギ属（triticum）（コムギ）、ライムギ属（secale）（ライムギ）、オオムギ属（hordeum）（オオムギ）、イネ属（oryza）（イネ）、キビ属（panicum）、チカラシバ属（pennisetum）、エノコログサ属（setaria）、モロコシ属（キビ（millet））、トウモロコシ属（zea）（トウモロコシ）等に属する植物である。

双子葉の作物には、とりわけ、綿、マメ類（leguminoses）例えばマメ科（pulse）および、特に、アルファルファ、ダイズ、アブラナ、トマト、サトウダイコン、ジャガイモ、観賞植物ならびに木が含まれる。別の作物には、果実（特に、リンゴ、セイヨウナシ、サクランボ、ブドウ、柑橘類、パイナップルおよびバナナ）、油ヤシ、茶の木、カカオの木およびコーヒーの木、タバコ、サイザルアサならびに、薬用植物に関しては、ラウオルフィアおよびジギタリスが含まれうる。穀物コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシおよびキビ、サトウダイコン、アブラナ、ダイズ、トマト、ジャガイモおよびタバコが特に好ましい。別の作物はUS 6,137,030から選ぶことができる。

用語「代謝産物」とは、生物の代謝経路中で前駆体、中間体および／または最終産物として使用される化学物質を表す。そのような代謝産物は、化学的構築単位として働くだけでなく、さらに酵素およびその触媒活性に対する調節活性を発揮する。そのような代謝産物が酵素の活性を阻害または刺激することが文献から公知である（Stryer, Biochemistry, (1995) W.H. Freeman & Company, New York, New York）。

本発明の目的では、用語「外因的な代謝産物」には、基質、例えばグルコース、スルフェート、チオスルフェート、スルファイト、スルフィド、アンモニア、ホスフェート、金属イオン、例えばＦｅ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｏ^２＋、ＭｏＯ^２＋および酸素等が含まれる。特定の実施形態では、（外因的な）代謝産物はいわゆるＣ１代謝産物を含む。これらの後者の代謝産物は、例えばメチル供与体として機能することができ、それには、ギ酸、メタノール、ホルムアルデヒド、メタンチオール、ジメチルジスルフィド等の化合物が含まれる。

用語「生成物（産物）」には、メチオニン、システイン、グリシン、リシン、トレハロース、バイオマス、ＣＯ_２、等が含まれる。

本発明をその具体的実施形態に関して説明する前に、elementary flux解析による予測が取得された方法に関する一般的概要を記載する。

elementary flux解析は、生育およびメチオニン生産に関連するすべての代謝反応の組織立ておよび具体化で出発する。必要な情報はＫＥＧＧ（http://www.genome.jp/kegg/）等の公的データベースから収集することができる。次いでモデルを相応にセットアップする。該モデルは、野生型生物の天然の潜在能力を反映し、メチオニン過剰生産モデル株のさらなる開発のための出発点として役立つ。当初のモデルの取得では、メチオニン合成に関する生化学反応モデルを構築した。この目的で、中枢炭素および硫黄代謝のすべての関連経路を含むモデルを構築した。該経路には、メチオニン生産に関連しているすべての関連経路が含まれる。それらの経路は文献から公知である。特定の生物、例えば大腸菌に関する経路が別の生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムに存在しないことが知られていれば、該生物特異的経路反応は、当初の生物に関するモデルを構築する場合、該特定の生物に関するモデルにおいてのみ考慮され、他の生物に関しては省略された。当初のモデルが得られた後、さらなる最適化のために、モデル生物において存在しないことが知られている他の生物に由来する経路を考慮、すなわち導入してよい。代謝経路ネットワークに寄与する種々の生化学反応は、例えば標準的な教科書、科学文献またはインターネットリンク、例えばhttp://www.genome.jp/kegg/metabolism.htmlから取得してよい。

そしてエレメンタリー・フラックスモード解析を文献に記載されるように実施した（例えばPapin et al. (2004) 上記, Schilling et al. (2000) 上記, Schuster et al. (1999) 上記を参照のこと）。エレメンタリー・フラックスモードは種々の反応の化学量論に基づいて算出される。各反応の特定の速度論は、通常、考慮に入れない。

構築された代謝経路ネットワークは、典型的に、多くの経路回路および可逆反応を含む。ゆえに、種々の経路を経由して、メチオニン等の化合物に到達しうる。ゆえに、どの経路を経由するかに応じて、同一化合物の生産に関するエネルギー要求性が同一ネットワーク内で変化することがある。結果として、ネットワークの種々の反応をパラメータによって表現し、ＭＥＴＡＴＯＯＬソフトウェア（Pfeiffer et al. (1999) Bioinformatics, 153, 251-257; Schuster et al. (1999) 上記参照のこと）等のアルゴリズムに入力すれば、該ネットワークを改変および最適化して、最も効率的なメチオニン合成を可能にする経路を特定することができる。

本発明の目的では、プログラムＭＥＴＡＴＯＯＬを使用して代謝経路解析を実行した。本発明に関して使用されたバージョン（meta 4.0.1_double.exe）はインターネット（http://www.biozentrum.uni-wuerzburg.de/bioinformatik/computing/metatool/pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/）で入手可能である。該アルゴリズムの数学的詳細は、Pfeifferら（Pfeiffer et al. (1999) 上記参照のこと）によって記載されている。ＭＥＴＡＴＯＯＬプログラムを使用して代謝経路解析を実行すれば、調査対象の各状況に関して数百のエレメンタリー・フラックスモードが得られる。これらのフラックスモードの各々に関して、上記のように、メチオニンの炭素収率を、基質として系に入った炭素のパーセンテージとして算出した。種々のフラックスモードに関して、バイオマスの炭素収率を、炭素基質の形式で系に入ったエネルギーのパーセンテージとして算出してよい。ゆえに、このパラメータは（（バイオマスｍｏｌ）（基質ｍｏｌ）^−１×１００）として算出してよい。グルコース以外の補基質、例えばギ酸、ホルムアルデヒド、メタノール、メタンチオールまたはその二量体であるジメチルジスルフィドを相応に考慮してもよい。そして、特定のネットワークシナリオに関して取得されるすべてのそのようなエレメンタリー・フラックスモードの比較解析によって、メチオニン合成に関する理論的最大効率の決定が可能である。

このように、最適なメチオニン合成効率を有するはずである生物の代謝経路ネットワークを通る最適な代謝流量の理論的予測が取得される。そのような理論的代謝流量解析の詳細は実験セクションで記載する。

そのような向上したメチオニン合成効率を有する生物を理論的に決定または設計する方法は、独立請求項１の対象発明を構成する。

そして、これらの方法によって取得される理論的予測は、それぞれの生物を遺伝的に改変して、該予測モデルによって特定された経路を通る代謝流量を増大または低減させることによって実現してよい。驚くべきことに、理論的予測は、該モデルの予測にしたがって、当初の生物と同一でない出発生物を遺伝的に改変することによって実現することもできる。ゆえに、そのような出発生物は、野生型生物ではなく、すでに遺伝的に改変されている生物であってよい。一実施形態では、出発生物は、例えばメチオニン過剰生産者、すなわちそれぞれの野生型生物より多くのメチオニンを生産することがすでに知られている遺伝的に改変された生物であってよい。そのようなメチオニン過剰生産者に関する理論的予測は算出されていないが、それらは、向上したメチオニン合成効率を提供する該メチオニン過剰生産者に基づく遺伝的に改変された生物の構築をなお可能にする。

例えば理論的予測によって、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）を通る代謝流量が増大した場合にメチオニン合成が最も効率的であると示されれば、生物を該目的で遺伝的に改変する。これは、例えば、その他の点では厳密に同一の条件下で培養された遺伝的に未改変の生物と比較して、この経路を通る、より多くの代謝流量を開通させるようにＰＰＰの特定のステップを触媒する酵素の量および／または活性を増大させることによって達成できる。ＰＰＰ中への流量は、例えば該代謝流量をＰＰＰ中へ向け直す別の並行経路の不可逆的反応中の酵素活性を下方制御することによって向上させてもよい。ＰＰＰを通る流量は、ピルビン酸カルボキシラーゼ中の突然変異のようなＰＰＰ回路酵素に関与するタンパク質をコードする遺伝子中に特定の突然変異を導入することによって向上させてもよい。それは、Onishiら（Appl Microbiol Biotechnol. (2002), 58,217-23）によって記載されている。これらの改変された遺伝子は、いわゆる野性型株に由来する遺伝子と比較して突然変異を含有する。これらの突然変異は、改変された酵素活性または分子的フィードバックインヒビターに対する感受性を生じさせる。

相応に、理論モデルがペントースリン酸経路への代謝流量の低減を必要とすれば、この経路の酵素の量および／または活性を低減させてよい。

代謝流量解析を使用して、ある生物に関して作成された結果を別の生物に移転してもよい。ゆえに、エレメンタリー・フラックスモード解析によって、例えば大腸菌において、向上した活性を有する特定の経路が効率的なメチオニン合成に重要であることが発見され、かつ、この経路が別の生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて明らかに使用されていないか、あるいは存在しなければ、この経路の酵素活性をコードする遺伝子をそれぞれの生物中に導入することによってこの経路をそれぞれの生物中に導入してよい。該アプローチによって、微生物を、その内因性の代謝経路を最適化することによって、メチオニン合成に関して最適化することが可能であるばかりでなく、外来性の代謝経路を導入して、さらにメチオニン合成を増強し、かつ／または合成効率を向上させることも可能である。

この状況を考慮して、本発明はまた、出発生物と比較して向上したメチオニン合成効率を有する原核生物、下等真核生物および植物からなる群より選択される生物の作製方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
ａ． 前述のエレメンタリー・フラックスモード解析を実行して、メチオニン合成に関して最適化された生物中の最適な代謝流量分布についての理論的予測を取得するステップ、および
ｂ． 生物中の既存の代謝経路を改変するように生物を遺伝的に改変することにより、出発生物と比較して該生物の代謝流量をステップ（ａ）の理論モデルに近づけるようにするステップ、および／または
ｃ． 生物に外来性の代謝経路を導入するように生物を遺伝的に改変することにより、出発生物と比較して該生物の代謝流量をステップ（ａ）の理論モデルに近づけるようにするステップ、および／または
ｄ． （ｂ）および（ｃ）の代謝経路を通る代謝流量を開通させるのに十分な量の外因的な代謝産物を提供するステップ。

本発明の別の態様は、以下のステップによって原核生物、下等真核生物および植物からなる群より選択される生物を作製することによって、メチオニン合成に関して最適化された生物中の流量分布の理論的予測を実現する方法に関する：
該生物の遺伝的改変により、少なくとも１つの以下の代謝経路を通る代謝流量を改変するステップ：
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／または
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）および／または
解糖（ＥＭＰ）および／または
トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／または
グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／または
補充経路（anaplerosis）（ＡＰ）および／または
呼吸鎖（ＲＣ）および／または
硫黄同化（ＳＡ）および／または
メチオニン合成（ＭＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）および／または
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
第１経路（Ｐ１）および／または
第２経路（Ｐ２）および／または
第３経路（Ｐ３）および／または
第４経路（Ｐ４）および／または
第５経路（Ｐ５）および／または
第６経路（Ｐ６）および／または
第７経路（Ｐ７）、および／または
生物の遺伝的改変により、少なくとも１つの以下の外来性の代謝経路を通る代謝流量を導入するステップ：
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／または
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／または
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／または
ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／または
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）、および／または
以下のものの存在下で生物を培養するステップ：
ａ． スルフェートおよび／または
ｂ． スルファイトおよび／または
ｃ． スルフィドおよび／または
ｄ． チオスルフェートおよび／または
ｅ． 硫黄含有有機化合物および／または
ｆ． ギ酸（formate）、ホルムアルデヒド、メタノール、メタンチオールもしくはその二量体であるジメチルジスルフィド等のＣ１代謝産物。

向上したメチオニン生合成効率を有するモデル生物に関する予測を実現するために遺伝的に改変されている生物はまた、本発明の対象である。

上述のように、メチオニン合成に関する代謝経路ネットワークを通る最適な代謝流量の算出に関して、このアミノ酸を導く、該生物特有の代謝経路を使用する。さらにまた、特定の生物の特定の化学量論を、構築対象の各代謝経路ネットワークに関して考慮する必要がある。化学量論は前述の供給源から入手してよい。

そのような代謝経路ネットワークは生物間で、例えば大腸菌とコリネバクテリウム・グルタミカムで異なるかもしれないが、図１は、例としてコリネバクテリウム・グルタミカムを使用して当初の代謝経路ネットワークの算出に使用された１セットの反応を示す。このセットは、メチオニン合成に寄与する代謝経路ネットワークに関する最小セットの反応でしかないので、追加の経路の存在が知られていれば、他の生物、例えば大腸菌に関して該追加の経路を考慮した。ただし、以下、概して特定の代謝経路または具体的な酵素に言及する場合、特に記載しない限り、これらの一般的言及はすべて、図１に示される反応に関する。これは理にかなっていると思われる。その理由は、大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカムにおいてこれらの反応の大部分が同一であったからである。本発明の目的では、種々の反応を以下の経路群に分類する：
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）
解糖（ＥＭＰ）
トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）
グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）
補充経路（ＡＰ）
呼吸鎖（ＲＣ）
硫黄同化（ＳＡ）
メチオニン合成（ＭＳ）
セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）
グリシン切断系（ＧＣＳ）
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）
第１経路（Ｐ１）
第２経路（Ｐ２）
第３経路（Ｐ３）
第４経路（Ｐ４）
第５経路（Ｐ５）
第６経路（Ｐ６）
第７経路（Ｐ７）
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）
ギ酸変換系（ＦＣＳ）
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）。

単一の経路は、Ｒｎで指定される酵素によって触媒される以下の反応に細分してよい。略語を使用して、これらの反応を規定する。本発明の目的のためにこれらの規定を解すべき方式は、ホスホトランスフェラーゼ系に関して説明する。この説明は他の反応にも適用される。

本発明の目的では、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）は外因的なグルコース〜グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）の反応を含む。この反応は酵素Ｒ１によって触媒される。Ｒ１はホスホトランスフェラーゼである。この酵素は、ホスホル基（phosphor-group）供与体としてホスホエノールピルビン酸を使用する（図１を参照のこと）。本発明の目的では、この反応は以下のように記載される：
より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１。

ゆえに、種々の前述の経路の単一の反応は、該反応を触媒する酵素および該反応から得られる生成物に関して規定される。そのような反応がＡＴＰ、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨまたは他の補助因子の形式のエネルギー入力を必要とするか否かは示されていないが、図１から取得してよい。具体的な化学量論もまた示されていない。その理由は、それが生物間で変動するからである。一般に、反応の抽出物およびエネルギー入力もまた示されていない。これらのデータは、種々の生物に関する標準的な教科書または科学刊行物から取得してよい。

本発明の目的では、ペントースリン酸経路は以下の反応によって特徴付けられる：
ＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３
６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４
ＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５
ＸＹＬ−５Ｐを生成するためのＲ６
ＲＩＢＯ−５Ｐを生成するためのＲ７
Ｓ７ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ８
Ｅ−４ｐおよびＦ６Ｐを生成するためのＲ９
Ｆ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０
Ｇ６Ｐを生成するためのＲ２。

本発明の目的では、解糖経路（ＥＭＰ）は以下の反応によって特徴付けられる：
Ｆ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１
ＤＨＡＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１３
ＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１４
１，３−ＰＧを生成するためのＲ１５
３−ＰＧを生成するためのＲ１６
２−ＰＧを生成するためのＲ１７
ＰＥＰを生成するためのＲ１８
Ｐｙｒを生成するためのＲ１９。

本発明の目的では、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）は以下の反応によって規定される：
Ａｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０
ＣＩＴを生成するためのＲ２１
Ｃｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２
ＩＣＩを生成するためのＲ２３
２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４
ＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６
ＳＵＣＣを生成するためのＲ２７
ＦＵＭを生成するためのＲ２８
ＭＡＬを生成するためのＲ２９
ＯＡＡを生成するためのＲ３０。

本発明の目的では、グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）経路は以下の反応によって規定される：
ＣＩＴを生成するためのＲ２１
Ｃｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２
ＩＣＩを生成するためのＲ２３
ＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１
ＭＡＬを生成するためのＲ３２
ＦＵＭを生成するためのＲ２８
ＭＡＬを生成するためのＲ２９
ＯＡＡを生成するためのＲ３０。

本発明の目的では、補充経路（ＡＰ）は以下の反応によって規定される：
ＯＡＡを生成するためのＲ３４
ＯＡＡを生成するためのＲ３３／Ｒ３６。

本発明の目的では、呼吸鎖（ＲＣ）は以下の反応によって規定される：
２ＮＡＤＨ＋Ｏ２_ｅｘ＋４ＡＤＰ＝２ＮＡＤ＋４ＡＴＰを触媒するＲ５９
２ＦＡＤＨ＋Ｏ_２ｅｘ＋２ＡＤＰ＝２ＦＡＤ＋２ＡＴＰを触媒するＲ６０。

本発明の目的では、硫黄同化経路（ＳＡ）は以下の反応によって規定される：
Ｈ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５
Ｈ_２Ｓを生成するためのＲ５８。

本発明の目的では、メチオニン合成経路（ＭＳ）は以下の反応によって規定される：
Ａｓｐを生成するためのＲ３７
ＡＳＰ−Ｐを生成するためのＲ４７
ＡＳＰ−ＳＡを生成するためのＲ４８
ＨＯＭを生成するためのＲ３９
Ｏ−ＡＣ−ＨＯＭを生成するためのＲ４０
ＣＹＳＴＡを生成するためのＲ４６
ＨＭＯＣＹＳを生成するためのＲ４９
ＨＯＭＯＣＹＳを生成するためのＲ５４
ＭＥＴを生成するためのＲ５２
ＭＥＴ_ｅｘを生成するためのＲ５３。

本発明の目的では、セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）経路は以下の反応によって規定される：
３−ＰＨＰを生成するためのＲ４１
ＳＥＲ−Ｐを生成するためのＲ４２
ＳＥＲを生成するためのＲ４３
Ｏ−ＡＣ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４
ＣＹＳを生成するためのＲ４５
Ｍ−ＴＨＦおよびグリシン_ｅｘを生成するためのＲ３８。

本発明の目的では、第１経路（Ｐ１）は以下の反応を含む：
ＧＬＵを生成するためのＲ２５。

本発明の目的では、第２経路（Ｐ２）は以下の反応を含む：
ＯＡＡを生成するためのＲ３３／Ｒ３６
ＭＡＬを生成するためのＲ３０
ＰＹＲ＋ＣＯ_２を生成するためのＲ５７。

本発明の目的では、第３経路（Ｐ３）は以下の反応を含む：
ＡＴＰ＝ＡＤＰを触媒するＲ５６。

本発明の目的では、第４経路（Ｐ４）は以下の反応を含む：
ＧＴＰ＋ＡＤＰ＝ＡＴＰ＋ＧＤＰを触媒するＲ６２。

本発明の目的では、第５経路（Ｐ５）は以下の反応によって規定される：
ＡＴＰ＋アセテート＝ＡＤＰ＋アセチルＰを触媒するＲ５０。

本発明の目的では、第６経路（Ｐ６）は以下の反応を含む：
アセチルＰ＋ＨＣｏＡ＝アセチルＣｏＡを触媒するＲ５１。

本発明の目的では、第７経路（Ｐ７）は以下の反応を含む：
６２３１ ＮＨ_３ｅｘ＋２３３ ＳＯ_４ｅｘ＋２０５ Ｇ６Ｐ＋３０８ Ｆ６Ｐ＋８７９ ＲＩＢＯ−５Ｐ＋２６８ Ｅ４Ｐ＋１２９ ＧＡ３Ｐ＋１２９５ ３−ＰＧ＋６５２ ＰＥＰ＋２６０４ ＰＹＲ＋３１７７ ＡＣ−ＣｏＡ＋１６８０ ＯＡＡ＋１２２４ ２−ＯＸＯ＋１６４２９ ＮＡＤＰＨ＝ＢＩＯＭＡＳＳ_ｅｘ＋１６４２９ ＮＡＤＰ＋３１７７ Ｈ−ＣｏＡ＋１２２７ ＣＯ_２ｅｘを触媒するＲ６１。

上記のように、化学量論は生物間で変動する。該化学量論は文献または前述のインターネットページから取得してよい。さらにまた、大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカム等の特定の生物の代謝経路ネットワークは、追加の反応経路を含んでよい。

本発明の目的で使用されるように、そのような追加の経路には以下の経路が含まれる：
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／または
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／または
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／または
ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／または
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）。

本発明の目的では、グリシン切断系（ＧＣＳ）は以下の反応を含む：
Ｍ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１
メチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２。

当業者は、Ｒ７１およびＲ７２の反応が少なくとも３つのタンパク質、すなわちｇｃｖＨ、ＰおよびＴによって触媒されることを十分承知している（表１および２を参照のこと）。ｇｃｖＰは、グリシンをＣＯ_２およびアミノメチル基に脱炭酸する反応を触媒し、ＧｃｖＨはアミノメチル基の担体である（Ｒ７１）。グリシン切断系の記述は、Neidhardt F.C. (1996) E. coli and S. typhimurium, ASM Press Washingtonに見出せる。ｇｃｖＴは、Ｈ−タンパク質からテトラヒドロ葉酸へのＣ１単位の移動およびＮＨ_３の放出に関与する（Ｒ７２）。そして該反応は、典型的に、リポアミドデヒドロゲナーゼである第四サブユニットによって完了する。ｌｐｄＡによってコードされるリポアミドデヒドロゲナーゼはＮＡＤからＮＡＤＨへの電子伝達として機能する。このデヒドロゲナーゼはマルチサブユニットピルビン酸デヒドロゲナーゼから借用され、一般にｌｐｄＡと称される。ゆえに本発明の目的では、ＧＣＳは以下のようにまとめてよい：
メチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７１／７２。

本発明の目的では、ＧＣＳは場合により以下の追加の反応をさらに含みうる：
メチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８。

厳密に言えば、Ｒ７８はＧＣＳに属さない。Ｒ７８はメチル−ＴＨＦを提供する働きをするだけである。しかし、Ｒ７８が存在しない生物では、Ｒ７８はＧＣＳの他の反応とともに実施されることがある。Ｒ７８がすでに存在している生物では、これは必要でないかもしれない。

本発明の目的では、トランスヒドロゲナーゼ変換系（ＴＨＧＣ）は以下の反応を含む：
ＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０。

本発明の目的では、ＴＨＧＣは以下の反応を含んでもよい：
ＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１。

Ｒ７０は例えばサイトゾルのトランスヒドロゲナーゼであり、Ｒ８１は例えば膜貫通型のトランスヒドロゲナーゼである。

本発明の目的では、チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）は以下の反応を含む：
チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３。

本発明の目的では、ＴＲＳは以下のものをさらに含んでよい：
細胞外Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_３を細胞に取り込むためのＲ８２および／または
より多くのＳ−スルホシステインを生産するためのＲ４５ａおよび／または
より多くのＳ−スルホシステインを生成するためのＲ４９。

Ｒ４５ａおよび／またはＲ４９はチオスルフェートをＳ−スルホ−システインに変換し、ゆえにＳＲＳに属する。

本発明の目的では、硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）は以下の反応を含む：
スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０。

本発明の目的では、亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）は以下の反応を含む：
スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４。

本発明の目的では、ギ酸変換系（ＦＣＳ）は以下の反応を含む：
１０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５
メチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６
メチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８。

本発明の目的では、メタンチオール変換系（ＭＣＳ）は以下の反応を含む：
メタンチオールを用いてＯ−アセチル−ホモセリンをメチル−スルフヒドリル化（methyl-sulfhydrylate）するためのＲ７７。

本発明の目的では、第８経路（Ｐ８）は以下の反応を含む：
ホルミル−ＴＨＦをギ酸およびテトラヒドロ葉酸に分解するためのＲ７９。

以下の表では、前述の酵素に関する具体例を挙げる。

さらに下記の反応の総覧中には、追加の反応が見出せる。

上記登録番号はGenbankの公式登録番号であるか、あるいはGenbankで相互参照されている登録番号のシノニムである。これらの番号は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で検索し、見出すことができる。

本発明はまた、向上したメチオニン合成効率を有する生物を作製するための生物の理論的または遺伝的操作によって、他の経路および反応を通る代謝流量をモジュレートすることを想定し、それは、これらの反応が、例えば科学文献で、メチオニン合成に直接的または間接的に関与することが知られている限りにおいてである。これらの経路および反応は、もちろん、理論的なエレメンタリー・フラックスモード解析に組み込んでもよい。これらの方法によって取得される（遺伝的に改変された）生物はまた、本発明の部分である。

上述のように、本発明にしたがって、生物中の実際の代謝流量は、請求項１に記載のエレメンタリー・フラックスモード解析によって決定される向上したメチオニン合成を伴う生物に関する最適な理論的流量に近づけることができる。本発明の目的では、「近づける」とは、遺伝的に改変された生物の、遺伝的改変の結果としての代謝流量が、理論的予測の代謝流量に対して、出発生物の代謝流量が類似するよりも、より類似していることを意味する。

すでに記載したように、出発生物の代謝流量のモジュレーションに、該生物の遺伝的改変によって、例えば検討対象のネットワークの特定の反応を触媒する酵素の量および／または活性に影響を与えることによって、影響を与えてよい。さらに、特定の栄養素および外因的な代謝産物、例えばスルフェート、チオスルフェート、スルファイトおよびスルフィドならびにＣ１化合物、例えばギ酸 ホルムアルデヒド、メタノール メタンチオールおよびジメチルジスルフィドの使用によって該代謝流量に影響を与えてよい。外因的な代謝産物、例えばチオスルフェート、ギ酸またはメタンチオールの影響は、追って、さらに詳細に説明する。生物の遺伝的改変に関する一般例を以下に挙げる。

以下、具体的な反応に関して、特定の経路を通る代謝流量が生物の遺伝的改変によってどのように開通されるかを説明する。これらの説明は、相応に、他の反応に適用される。

例えば、本発明の方法にしたがって取得された理論モデルまたは設計されたモデル生物において、効率的メチオニン合成に関して、ＰＰＰ中への代謝流量が主に開通されるべきであることが予測された場合、この経路を通る向上した代謝流量を有する実際の生物は、ＰＰＰの部分である上述の反応の量および／または活性に遺伝的に影響を与えることによって取得してよい。ゆえに、ＰＰＰ中への代謝流量は、Ｒ３の量および／または活性を増大させて、より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを形成させることによって、増大させてよい。同様に、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の量および／または活性を増大させて、ＰＰＰ中への代謝流量を増大させてよい。Ｇ６Ｐの生成に向かうＲ２の活性を増大させることによって、同結果を達成してよい。

本発明の方法によって取得された理論モデルにおいて、ＴＣＡを通る代謝流量の低減が予測された場合、以下の酵素：Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９またはＲ３０の量および／または活性を低減させることによってこれを達成してよい。酵素の活性および／または量を増大または低減させる方法は当業者に自明であり、さらに下記で例証される。

しかし一般的目的では、例えば図１の代謝経路において、特定の反応が不可逆であるとみなされることに留意すべきであろう。生物学的ネットワークのほとんどの任意の反応は、両方向に進行できる平衡反応であるが、不可逆反応は、概して、例えばエネルギーの入力によって、反応が主に一方向に追いやられ、反応の平衡がほぼ例外なく該反応の片側にある反応であるとみなされる。

ＰＰＰの場合、そのような不可逆反応は、例えば、Ｒ３およびＲ５によって触媒される反応である。それらはいずれも、ＮＡＤＰＨの形成を促進する。本発明の関連でこの用語が使用される場合、他のそのような不可逆反応は、例えばＥＭＰのＲ１６、ＴＣＡのＲ２４、等である。図１では、不可逆反応は一方向のみを指す矢印によって示される。

本発明の関連で、該方向を触媒する酵素の量および／または活性を増大させることによって特定の反応経路を通る代謝流量が増大することが記載される場合、この記載は、該反応がどのように上で規定されているかに照らして理解される必要がある。酵素の量および／または活性の増大または低減は、該反応がさらに押し進められるか、あるいは開通されるべき方向に関して理解される必要がある。本発明に記載の代謝経路ネットワークの種々の経路の反応は、酵素および、該酵素によって形成される生成物によって規定されているので、酵素の量および／または活性に影響を与えて、より多いか、あるいは少ない生成物が得られるようにするための該酵素の量および／または活性の増大または該酵素の量および／または活性の低減は当業者によって明確に理解される。

ゆえに、例えば酵素Ｒ６の活性を増大させると記載される場合、この反応についての前述の説明を考慮して、このことは、Ｒ６の量および／または活性を増大させることによってＸＹＬ−５Ｐの量を増大させることを意味する。同様に、Ｒ２３の量および／または活性を増大させると記載される場合、これは、Ｒ２３の量および／または活性を増大させて、より多くのＩＣＩを生成する状況を表す。相応に、例えばＲ２９の量および／または活性を低減させる場合、このことは、Ｒ２９の量および／または活性を低減させて、より少ないＭＡＬを生成することを意味する。

向上したメチオニン効率を有する理論モデル生物が、例えば、特定の経路を通る代謝流量の増大を必要とする場合、本発明の一実施形態では、該反応経路の１酵素のみの量および／または活性を改変することで十分である。あるいは、この代謝経路の種々の酵素の量および／または活性を改変してもよい。例えば、elementary flux解析によって得られた理論モデルにおいて、例えば、ＰＰＰおよびＴＣＡを通る代謝流量を増大させることが示唆され、一方、ＲＣを通る代謝流量を低減させるべきである場合、これは、ＰＰＰおよびＴＣＡ回路の１酵素のみの量および／または活性を増大させることによって達成してよく、一方、ＲＣの１酵素のみの活性および／または量を低減させてよい。あるいは、これらの経路の種々の酵素またはすべての酵素の量および／または活性に同時に影響を与えてよい。

当業者はまた、酵素反応が単一の酵素活性によって実行されると上で規定される場合が、実際には、全体として指定の活性全体（例えば亜硫酸またはチオ硫酸レダクターゼ）を提供する種々の酵素による一連の酵素（サブ）ステップであってよいことを十分承知している。指定の酵素活性全体（上記Ｒナンバーを参照のこと）は種々のサブユニットから構成されていてもよい。これらの場合、上で特定される反応を通る代謝流量に、単一（サブ）ステップのうちの、あるいは少なくとも１つのサブユニットのうちの１つを実行する少なくとも１つの酵素の活性および／または量の改変によって影響を与えてよい。したがって、（サブ）ステップまたはサブユニットをコードする遺伝子は、それぞれの酵素活性全体の部分とみなしてよい。

グリシン切断系に関して、当業者は、遺伝子ｇｃｖＴ、および／またはＨ、および／またはＰおよび／またはＬ（ｌｐｄＡ）（表１および２を参照のこと）がこの系に関与することを承知している。ゆえに、反応Ｒ７１、Ｒ７２およびＲ７１／Ｒ７２によって上で規定されるこの系を通る代謝流量は、例えば少なくとも１つの上で特定される遺伝子またはそのホモログの過剰発現によって増大させるか、あるいは導入してよい。代謝流量の増大は、これらの遺伝子の４つ全部またはこれらの遺伝子のうち２つもしくは３つだけの過剰発現によって達成してもよい。該遺伝子は、例えば天然に存在するオペロンにおいて、あるいはプロモーターを使用して構築された人工オペロンにおいて、共同で過剰発現させてよい。さらに、遺伝子ｇｃｖＨ、Ｐ、Ｔ（再び表１および２を参照のこと）とともに遺伝子ｌｐｄＡを過剰発現させることも有用でありうる。

メチオニン合成系に関して、当業者は以下の反応を承知している：
Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ３９、Ｒ４０ Ｒ４６、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４がメチオニンの合成に関与している。

トランスヒドロゲナーゼ（Ｒ７０およびＲ８１）の過剰発現では、遺伝子ｕｄｈ、ｐｎｔＡおよび／またはｐｎｔＢまたはそのホモログ（表１および２を参照のこと）の少なくとも１つを過剰発現させてよい。該遺伝子もまた、例えば天然に存在するオペロンにおいて、あるいはプロモーターを使用して構築された人工オペロンにおいて、共同で過剰発現させてよい。もちろん、それに加えて、あるいはその代わりに、膜貫通型トランスヒドロゲナーゼに関する遺伝子、例えばｕｄｈＡおよびまたはｐｎｔＡ、Ｂを過剰発現させてもよい。

チオ硫酸レダクターゼ（Ｒ７３、Ｒ４５ａ、Ｒ４９および／またはＲ８２）の過剰発現では、チオ硫酸レダクターゼシトクロムＢサブユニット、チオ硫酸レダクターゼ電子伝達タンパク質および／またはチオ硫酸レダクターゼ前駆体の遺伝子を、例えば天然に存在するオペロンにおいて、あるいはプロモーターを使用して構築された人工オペロンにおいて、単独で、あるいは組み合わせて過剰発現させてよい。これらの目的では、ｐｈｓＡ、Ｂおよび／またはＣ遺伝子またはそのホモログを使用してよい（表１および２を参照のこと）。同様に、ＡＢＣ輸送体の遺伝子、例えばYP_224929を過剰発現させてよい。

ペントースリン酸経路の過剰発現では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＯＰＣＡ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、６−ホスホグルコノラクトンデヒドロゲナーゼまたはそのホモログの遺伝子（表１および２を参照のこと）を、単独で、あるいは２、３、４またはそれ以上の遺伝子の任意の組み合わせで、例えば天然に存在するオペロンにおいて、あるいはプロモーターを使用して構築された人工オペロンにおいて過剰発現させることができる。

亜硫酸還元系（Ｒ７４）の過剰発現では、嫌気的亜硫酸レダクターゼサブユニットＡ、ＢおよびＣの遺伝子を、単独または共同で、例えば天然に存在するオペロンにおいて、あるいはプロモーターを使用して構築された人工オペロンにおいて過剰発現させてよい。遺伝子ｄｓｒＡ、ｄｓｒＢおよび／またはｄｓｒＣまたはそのホモログ（表１および２を参照のこと）を前記目的で使用してよい。

ギ酸変換系（ＦＣＳ）に関しては、ギ酸−ＴＨＦ−リガーゼ、ホルミル−ＴＨＦ−シクロリガーゼ、メチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼ、５，１０−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼ、メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの量および／または活性を改変することによって、代謝流量を改変してよく、ある実施形態では、増大させるか、あるいは導入してよい。そのホモログを使用してもよい（表１および２を参照のこと）。前記遺伝子のいずれかの過剰発現によって、ＦＣＳを通る代謝流量を増大させてもよい。

硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ、Ｒ８０）は、ＡＴＰ：硫酸アデニル酸トランスフェラーゼを構成する硫酸アデニル酸トランスフェラーゼサブユニット１（NP_602005）および硫酸アデニル酸トランスフェラーゼサブユニット２（NP_602006）、アデノシン５’−ホスホスルフェートキナーゼ（EC:2.7.1.25）、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）レダクターゼ（EC:1.8.4.8, NCgl2717）および亜硫酸レダクターゼ（EC: 1.8.1.2, CAF20840）からなると考えられる。

好ましい改変の標的は、本発明の意味合いで、不可逆であると考えられる酵素の量および／または活性であってよい。ゆえに、向上したメチオニン合成効率を示す生物に関する代謝流量解析によって得られる理論モデルは、そのような最適化された代謝流量を有する微生物を取得するために当業者がどの遺伝的操作を考慮するべきかについての明確なガイダンスを当業者にもたらす。そして、当業者は、理論的代謝経路ネットワークを構築することによって当業者にすべて周知である決定的な酵素を選び出し、該生物の遺伝的改変によってこれらの酵素の量および／または活性に影響を与える。そのような生物を遺伝的改変によってどのように取得できるかは当技術分野の一般的知識に属する。

本発明にしたがって生物を遺伝的に改変することによって、メチオニン合成効率を向上させるためにこれらの生物中の代謝流量を改変して、これらの生物が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％の効率でメチオニンを生産することを特徴とするようにしてよい。

実験セクションの理論部分では、向上したメチオニン生産効率を有するコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌の最適な代謝流量モード（様式）がどのようであるかを説明する。これらのモデルがどのように算出されたか、どの反応が考慮されたか、およびどの化学量論が使用されたかをそこで詳細に記載し、これらのモデルから得られた一般的結論を以下で列挙する。したがって、以下のセクションは、これらの経路を通る代謝流量を理論モデルに関して得られる最適な値に近づけるためにどの代謝経路を遺伝的に改変するべきかを当業者に助言するものとして理解される必要がある。そして、実験セクションの実施部分で作業計画を記載し、特定の酵素に関して、遺伝的操作のためにどの具体的手段を施す必要があるかを例証する。

コリネバクテリウム・グルタミカム
本発明の目的の１つは、出発生物と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る代謝流量を増大させ、かつ／または導入するために遺伝的に改変されているコリネバクテリウム属の微生物に関する：
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／または
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）および／または
硫黄同化（ＳＡ）および／または
補充経路（ＡＰ）および／または
メチオニン合成経路（ＭＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）および／または
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
第１経路（Ｐ１）および／または
第２経路（Ｐ２）および／または
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／または
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／または
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／または
ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／または
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）および／または。

同時に、そのような最適化された微生物は、場合により、少なくとも１つの以下の経路を通る少なくとも低減した代謝流量を有するべきであろう：
解糖（ＥＭＰ）および／または
トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／または
グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／または
呼吸鎖（ＲＣ）および／または
第３経路（Ｐ３）および／または
第４経路（Ｐ４）および／または
第７経路（Ｐ７）および／または
より少ないピルビン酸を生成するためのＲ１９および／または
より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／または
より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９。

本発明は、向上したメチオニン生産効率を有するコリネバクテリウム属の微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する。

生物の遺伝的改変により、出発生物（the starting）と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る代謝流量を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／または
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）および／または
硫黄同化（ＳＡ）および／または
補充経路（ＰＡ）および／または
メチオニン合成経路（ＭＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン系（ＳＣＧＳ）および／または
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
第１経路（Ｐ１）および／または
第２経路（Ｐ２）および／または
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／または
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／または
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／または
ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／または
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）および／または
生物の遺伝的改変により、出発生物と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る代謝流量を少なくとも部分的に低減させるステップ：
解糖（ＥＭＰ）および／または
トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／または
グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／または
呼吸鎖（ＲＣ）および／または
第３経路（Ｐ３）および／または
第４経路（Ｐ４）および／または
第７経路（Ｐ７）および／または
より少ないピルビン酸を生成するためのＲ１９および／または
より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／または
より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９。

本発明の一実施形態は、向上したメチオニン合成効率を有するコリネバクテリウム属の微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
ＰＴＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１；および／または
ＰＰＰに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／または
ｂ． より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／または
ｃ． より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／または
ｄ． より多くのＸＹＬ−５Ｐを生成するためのＲ６および／または
ｅ． より多くのＲＩＢＯ−５Ｐを生成するためのＲ７および／または
ｆ． より多くのＳ７ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ８および／または
ｇ． より多くのＥ−４ｐおよびＦ６Ｐを生成するためのＲ９および／または
ｈ． より多くのＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／または
ｉ． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２；および／または
ＳＡに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／または
ｂ． より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／または
ＡＰに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／または
ＭＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＡｓｐを生成するためのＲ３７および／または
ｂ． より多くのＨＯＭを生成するためのＲ３９および／または
ｃ． より多くのＯ−ＡＣ−ＨＯＭを生成するためのＲ４０および／または
ｄ． より多くのＣＹＳＴＡを生成するためのＲ４６および／または
ｅ． より多くのＡＳＰ−Ｐを生成するためのＲ４７および／または
ｆ． より多くのＡＳＰ−ＳＡを生成するためのＲ４８および／または
ｇ． より多くのＨＯＭＯＣＹＳを生成するためのＲ４９および／または
ｈ． より多くのＭＥＴを生成するためのＲ５２および／または
ｉ． より多くのＭＥＴ_ｅｘを生成するためのＲ５３および／または
ｊ． より多くのＨＯＭＯＣＹＳを生成するためのＲ５４および／または
ＳＣＧＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＭ−ＴＨＦおよびグリシン_ｅｘを生成するためのＲ３８および／または
ｂ． より多くのＯ−ＡＣ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４および／または
ｃ． より多くのＣＹＳを生成するためのＲ４５および／または
ＣＧＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／または
ｂ． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２
ｃ． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
ＴＨＧＣに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／または
ｂ． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／または
Ｐ１に関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５；および／または
Ｐ２に関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／またはＲ３６および／または
ｂ． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３０および／または
ｃ． より多くのＰｙｒを生成するためのＲ５７；および／または
ＴＲＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／または
ｂ． より多くの外因的なＨ_２Ｓ_２Ｏ_３を細胞に取り込むためのＲ８２および／または
ＳＲＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／または
ＦＣＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／または
ｂ． １０−ホルミル−ＴＨＦからメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
ｃ． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
ＭＣＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． メタンチオールを用いてＯ−アセチル−ホモセリンをメチル−スルフヒドリル化するためのＲ７７および／または
ＳＡＲＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのスルファイトを生成するためのＲ８０および／または
ＥＭＰに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． より少ないＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／または
ｂ． より少ないＤＨＡＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１３および／または
ｃ． より少ないＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１４および／または
ｄ． より少ない１，３−ＰＧを生成するためのＲ１５および／または
ｅ． より少ない３−ＰＧを生成するためのＲ１６および／または
ｆ． より少ない２−ＰＧを生成するためのＲ１７および／または
ｇ． より少ないＰＥＰを生成するためのＲ１８および／または
ｈ． より少ないＰｙｒを生成するためのＲ１９；および／または
ＴＣＡに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． より少ないＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／または
ｂ． より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
ｃ． より少ないＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／または
ｄ． より少ないＩＣＩを生成するためのＲ２３および／または
ｅ． より少ない２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／または
ｆ． より少ないＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／または
ｇ． より少ないＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／または
ｈ． より少ないＦＵＭを生成するためのＲ２８および／または
ｉ． より少ないＭＡＬを生成するためのＲ２９および／または
ｊ． より少ないＯＡＡを生成するためのＲ３０；および／または
ＧＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
ｂ． より少ないＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／または
ｃ． より少ないＩＣＩを生成するためのＲ２３および／または
ｄ． より少ないＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／または
ｅ． より少ないＭＡＬを生成するためのＲ３２および／または
ｆ． より少ないＦＵＭを生成するためのＲ２８および／または
ｇ． より少ないＭＡＬを生成するためのＲ２９および／または
ｈ． より少ないＯＡＡを生成するためのＲ３０；および／または
ＲＣに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ６０；および／または
出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ１９；および／または
出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ３５；および／または
Ｐ３に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ５６；および／または
Ｐ４に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ６２；および／または
Ｐ７に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ６１、および／または
Ｐ８に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ａ． Ｒ７９。

本発明の別の実施形態は、向上したメチオニン合成効率を有するコリネバクテリウム属の微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
１． より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／または
２． より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／または
３． より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／または
４． より多くのＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／または
５． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２および／または
６． より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／または
７． より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／または
８． より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／または
９． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／または
１０． メチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
１１． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
１２． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／または
１３． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／または
１４． より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／または
１５． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／またはＲ３６および／または
１６． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３０および／または
１７． より多くのＰｙｒを生成するためのＲ５７および／または
１８． スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／または
１９． チオスルフェート（thiosulafte）をスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／または
２０． スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／または
２１． より多くの外因的なＨ_２Ｓ_２Ｏ_３を細胞に取り込むためのＲ８２および／または
２２． １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／または
２３． １０−ホルミル−ＴＨＦ（10-forml-THF）からメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
２４． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
２５． メタンチオールを用いてＯ−アセチル−ホモセリンをメチル−スルフヒドリル化するためのＲ７７および／または
出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
１． より少ないＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／または
２． より少ないＰｙｒを生成するためのＲ１９および／または
３． より少ないＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／または
４． より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
５． より少ない２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／または
６． より少ないＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／または
７． より少ないＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／または
８． より少ないＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／または
９． より少ないＭＡＬを生成するためのＲ３２および／または
１０． より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／または
１０． より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９。

本発明の別の実施形態は、向上したメチオニン合成効率を有するコリネバクテリウム属の微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
１． より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／または
２． より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／または
３． より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／または
４． より多くのＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／または
５． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２および
６． より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／または
７． より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および
８． より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／または
９． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／または
１０． メチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
１１． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
１２． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／または
１３． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／または
１４． より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／または
１５． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／またはＲ３６
１６． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３０
１７． より多くのＰｙｒを生成するためのＲ５７
１８． スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／または
１９． １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／または
２０． １０−ホルミル−ＴＨＦからメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
２１． メタンチオールを用いてＯ−アセチル−ホモセリンをメチル−スルフヒドリル化するためのＲ７７および／または
出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
１． より少ないＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／または
２． より少ないＰｙｒを生成するためのＲ１９および／または
３． より少ないＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／または
４． より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
５． より少ない２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／または
６． より少ないＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／または
７． より少ないＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／または
８． より少ないＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／または
９． より少ないＭＡＬを生成するためのＲ３２および／または
１０． より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／または
１１． より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９。

これらの方法によって取得される任意の生物もまた、本発明の対象である。

これらの方法に使用されるコリネバクテリウム微生物は、以下の微生物からなる群より選択してよい：
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ １３０３２，
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ＡＴＣＣ １５８０６，
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ＡＴＣＣ １３８７０，
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９，および
コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）ＡＴＣＣ １７９６５，
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＫＦＣＣ１００６５および
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ２１６０８
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ １７３２２。

略語ＫＦＣＣはKorean Federation of Culture Collectionを意味し、略語ＡＴＣＣはAmerican Type Strain Culture Collectionを意味し、略語ＤＳＭはGerman Resource Centre for Biological Materialを意味する。

遺伝的に改変されて、以下の経路を通る代謝流量が導入されているコリネバクテリウム属の生物は特に興味深い：
グリシン切断系
トランスヒドロゲナーゼ変換
チオ硫酸レダクターゼ系
硫酸レダクターゼ系
ギ酸変換系
メタンチオール変換系。

メタンチオール変換系をコリネバクテリウムに導入する場合、チオ硫酸レダクターゼ系およびギ酸変換系は退化するかもしれない。これらの前述の追加経路系は、大腸菌中の効率的メチオニン合成に最適な代謝流量に大きく寄与することが発見されている（下記参照のこと）。理論的予測にしたがって、これらの代謝経路をコリネバクテリウム・グルタミカムに含ませると、コリネバクテリウム・グルタミカムのメチオニン合成効率がさらに向上するはずであろう。

ゆえに、本発明の一態様は、前述の経路のいずれかを通る代謝流量を増大させるために遺伝的に改変されている生物に関する。

本発明にしたがってコリネバクテリウム・グルタミカムを遺伝的に改変することによって、メチオニン合成効率を向上させるためにこれらの生物中の代謝流量を改変して、これらの生物が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％の効率でメチオニンを生産することを特徴とするようにしてよい。

本発明は、コリネバクテリウム・グルタミカムに関する限り、Rey et al.（2003）（上記参照のこと）に記載のΔｍｃｂＲノックアウト株に関連しない。

大腸菌
本発明の一態様は、出発生物と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る代謝流量を増大させ、かつ／または導入するために遺伝的に改変されているエシェリキア属（）の微生物に関する：
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／または
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／または
解糖（glyoclysis）（ＥＭＰ）および／または
トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／または
グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／または
補充経路（ＡＰ）および／または
メチオニン合成経路（ＭＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン系（ＳＣＧＳ）および／または
第１経路（Ｐ１）および／または
硫黄同化（ＳＡ）および／または
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／または
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／または
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／または
ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／または
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）。

さらに、向上したメチオニン合成効率を有するこれらの微生物は、場合により、出発生物と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る少なくとも低減した代謝流量（該低減した代謝流量は遺伝的改変によって達成してもよい）を特徴とする：
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）
メチオニン合成（ＭＳ）および／または
第３経路（Ｐ３）および／または
第４経路（Ｐ４）および／または
第７経路（Ｐ７）および／または
第８経路（Ｐ８）。

ある実施形態では、ＰＰＰを通る代謝流量を低減させずに増大させてよい。

エシェリキア属の前述の微生物に加えて、本発明はまた、向上したメチオニン生産効率を有するエシェリキア属の微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
生物の遺伝的改変により、出発生物と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る代謝流量を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／または
解糖（glyoclysis）（ＥＭＰ）および／または
トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／または
グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／または
補充経路（ＡＰ）および／または
メチオニン合成経路（ＭＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン系（ＳＣＧＳ）および／または
第１経路（Ｐ１）および／または
硫黄同化（ＳＡ）および／または
グリシン切断系（ＧＣＳ）および／または
トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／または
チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／または
亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／または
硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／または
ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／または
メタンチオール変換系（ＭＣＳ）および／または
セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）および／または
生物の遺伝的改変により、出発生物と比較して、少なくとも１つの以下の経路を通る代謝流量を少なくとも部分的に低減させるステップ：
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）
第３経路（Ｐ３）および／または
第４経路（Ｐ４）および／または
第７経路（Ｐ７）および／または
Ｒ１９および／または
Ｒ３５および／または
Ｒ７９。

本発明の別の態様は、向上したメチオニン合成効率を有するエシェリキア属の微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法である：
ＰＴＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させるステップ：
ａ． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１；および／または
ＥＭＯに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＦ６Ｐを生成するためのＲ２および／または
ｂ． より多くのＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／または
ｃ． より多くのＤＨＡＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１３および／または
ｄ． より多くのＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１４および／または
ｅ． より多くの１，３−ＰＧを生成するためのＲ１５および／または
ｆ． より多くの３−ＰＧを生成するためのＲ１６および／または
ｇ． より多くの２−ＰＧを生成するためのＲ１７および／または
ｈ． より多くのＰＥＰを生成するためのＲ１８および／または
ｉ． より多くのＰｙｒを生成するためのＲ１９；および／または
ＴＣＡに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／または
ｂ． より多くのＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
ｃ． より多くのＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／または
ｄ． より多くのＩＣＩを生成するためのＲ２３および／または
ｅ． より多くの２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／または
ｆ． より多くのＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／または
ｇ． より多くのＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／または
ｈ． より多くのＦＵＭを生成するためのＲ２８および／または
ｉ． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ２９および／または
ｊ． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３０；および／または
ＡＰに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／または
ＭＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＡｓｐを生成するためのＲ３７および／または
ｂ． より多くのＨＯＭを生成するためのＲ３９および／または
ｃ． より多くのＯ−ＡＣ−ＨＯＭを生成するためのＲ４０および／または
ｄ． より多くのＣＹＳＴＡを生成するためのＲ４６および／または
ｅ． より多くのＡＳＰ−Ｐを生成するためのＲ４７および／または
ｆ． より多くのＡＳＰ−ＳＡを生成するためのＲ４８および／または
ｇ． より多くのＨＯＭＯＣＹＳを生成するためのＲ４９および／または
ｈ． より多くのＭＥＴを生成するためのＲ５２および／または
ｉ． より多くのＭＥＴ_ｅｘを生成するためのＲ５３および／または
ｊ． より多くのＨＯＭＯＣＹＳを生成するためのＲ５４および／または
ＳＣＧＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＭ−ＴＨＦおよびグリシン_ｅｘを生成するためのＲ３８および／または
ｂ． より多くのＯ−ＡＣ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４および／または
ｃ． より多くのＣＹＳを生成するためのＲ４５および／または
ＧＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
ｂ． より多くのＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／または
ｃ． より多くのＩＣＩを生成するためのＲ２３および／または
ｄ． より多くのＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／または
ｅ． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３２および／または
ｆ． より多くのＦＵＭを生成するためのＲ２８および／または
ｇ． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ２９および／または
ｈ． より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３０；および／または
Ｐ１に関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５；および／または
ＳＡに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／または
ｂ． より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８；および／または
ＧＣＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／または
ｂ． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／または
ｃ． より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
請求項ＴＨＧＣに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． ＮＡＤＨからより多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／または
ｂ． ＮＡＤＨからより多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／または
ＴＲＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／または
ｂ． より多くの外因的なＨ_２Ｓ_２Ｏ_３を細胞に取り込むためのＲ８２および／または
ＳＲＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／または
ＳＡＲＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／または
ＦＣＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／または
ｂ． １０−ホルミル−ＴＨＦ（10-forml-THF）からメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
ｃ． より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８
ＭＣＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
ａ． メタンチオールを用いてＯ−アセチル−ホモセリンをメチル−スルフヒドリル化するためのＲ７７および／または
ＳＣＧＳに関して、出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させるステップ：
ａ． より多くのＯ−Ａｃ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４および／または
ｂ． より多くのＣＹＳを生成するためのＲ４５；および／または
ＰＰＰに関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を増大させるステップ：
ａ． より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／または
ｂ． より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／または
ｃ． より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／または
ｄ． より多くのＸＹＬ−５Ｐを生成するためのＲ６および／または
ｅ． より多くのＲＩＢＯ−５Ｐを生成するためのＲ７および／または
ｆ． より多くのＳ７ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ８および／または
ｇ． より多くのＥ−４ｐおよびＦ６Ｐを生成するためのＲ９および／または
ｈ． より少ないＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／または
ｉ． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２；および／または
ＰＰＰに関して、ある実施形態において、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させてもよいステップ：
ｊ． より少ないＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／または
ｋ． より少ない６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／または
ｌ． より少ないＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／または
ｍ． より少ないＸＹＬ−５Ｐを生成するためのＲ６および／または
ｎ． より少ないＲＩＢＯ−５Ｐを生成するためのＲ７および／または
ｏ． より少ないＳ７ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ８および／または
ｐ． より少ないＥ−４ｐおよびＦ６Ｐを生成するためのＲ９および／または
ｑ． より少ないＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／または
ｒ． より少ないＧ６Ｐを生成するためのＲ２；および／または
Ｐ３に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも低減させるステップ：
ａ． Ｒ５６；および／または
Ｐ４に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも低減させるステップ：
ａ． Ｒ６２；および／または
Ｐ７に関して、出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも低減させるステップ：
ａ． Ｒ６１。

出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも低減させるステップ：
ａ． より少ないピルビン酸を生成するためのＲ１９；および／または
ｂ． より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５；および／または
ｃ． より少ないテトラヒドロ葉酸を生成するためのＲ７９。

エシェリキア属に関する本発明の別の実施形態は、向上したメチオニン合成効率を有するエシェリキア微生物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
出発生物と比較して、以下の酵素の量および／または活性を増大させ、かつ／または導入するステップ：
１． より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１および／または
２． より多くのＦ６Ｐを生成するためのＲ２および／または
３． より多くのＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／または
４． より多くのＰｙｒを生成するためのＲ１９および／または
５． より多くのＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／または
６． より多くのＣＩＴを生成するためのＲ２１および／または
７． より多くの２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／または
８． より多くのＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／または
９． より多くのＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／または
１０． より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３２および／または
１１． より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／または
１２． より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／または
１３． より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／または
１４． より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／または
１５． より多くのＭ−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／または
１６． より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／または
１７． より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
１８． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／または
１９． より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／または
２０． スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／または
２１． チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／または
２２． より多くの外因的なＨ_２Ｓ_２Ｏ_３を細胞に取り込むためのＲ８２および／または
２３． スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／または
２４． １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／または
２５． １０−ホルミル−ＴＨＦ（10-forml-THF）からメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／または
２６． メタンチオールを用いてＯ−アセチル−ホモセリンをメチル−スルフヒドリル化するためのＲ７７および／または
２７． より多くのＯ−Ａｃ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４および／または
２８． より多くのＣＹＳを生成するためのＲ４５；
出発生物と比較して、以下の酵素（群）の量および／または活性を少なくとも部分的に低減させるステップ：
１． より少ないピルビン酸を生成するためのＲ１９；および／または
２． より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５；および／または
３． より少ないテトラヒドロ葉酸を生成するためのＲ７９。

前述の方法のいずれかによって取得できるエシェリキア属の微生物は、例えば大腸菌を含む群より選択される。

大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物に関する実施形態では、以下の酵素活性：Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８の過剰発現によって代謝流量を創出する。任意の組み合わせの前述のＲナンバーまたはこれらの触媒活性の部分である任意の遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、および／またはＲ８０の任意の組み合わせが、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８とともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の１酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の２酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の３酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の４酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の５酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の６酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の７酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の８酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、およびＲ８０からなる群の９酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも１つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも２つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも３つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも４つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも５つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも６つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも７つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも８つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも９つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも１つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも１つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも２つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

Ｒ７０、Ｒ８１、Ｒ７１／Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ８２、Ｒ７４、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８およびＲ８０からなる群の少なくとも１つの酵素活性が、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４および／またはＲ５８のいずれかとともに、またはこれらの触媒活性の部分である遺伝子が過剰発現され、かつ、Ｒ１９、Ｒ３５およびＲ７９からなる群の少なくとも３つの酵素活性が低減されている大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカム等の生物もまた、本発明の対象を形成する。

好ましい実施形態では、本発明は、上記のように例えば遺伝的改変によって、以下の経路：ＦＣＳまたはＧＣＳまたはＭＣＳまたはＴＲＳまたはＴＨＧＣの１つを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィド（Sulfid）またはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＧＣＳ、ＦＣＳおよびＭＣＳ、ＦＣＳおよびＴＲＳ、またはＦＣＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＧＣＳおよびＴＲＳ、ＦＣＳおよびＧＣＳおよびＴＲＳ、またはＦＣＳおよびＧＣＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＧＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳ、またはＦＣＳおよびＧＣＳおよびＭＣＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＧＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳ、またはＦＣＳおよびＭＣＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳ、またはＦＣＳおよびＭＣＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＦＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＭＣＳおよびＴＲＳ、またはＭＣＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＭＣＳおよびＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の経路：ＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が導入され、かつ／または増大しているコリネバクテリウム・グルタミカム生物に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、スルフィドまたはチオスルフェートを外因的な硫黄供給源として使用して、これらの生物をさらに培養する。

ＧＣＳの場合の遺伝的操作では、Ｒ７１および／またはＲ７２の発現を増加させることができる。ＴＨＧＳの場合、Ｒ７０および／またはＲ８１の発現を増加させることができる。ＴＲＳの場合、Ｒ７３、Ｒ４５ａ、Ｒ４９および／またはＲ８２の発現を増加させることができる。ＭＣＳに関しては、Ｒ７７の発現を増加させることができる。ＦＣＳの場合、Ｒ７５、Ｒ７６および／またはＲ７８の発現を増加させることができる。

本発明の好ましい一実施形態を図１０に記載する。この実施形態では、例えば既述の遺伝的操作を用いて、出発生物と比較して、以下の経路：ＦＣＳおよびＧＣＳおよびＭＣＳおよびＴＲＳおよびＴＨＧＣを通る代謝流量が増大し、かつ／または導入されている生物を示す。硫黄供給源としてスルフィドおよびチオスルフェートを同時に使用することも考慮される。

本発明の生物には、好ましくは、コリネバクテリウム属の微生物、特にコリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（C. acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（C. efficiens）、コリネバクテリウム・ジェジェキ（C. jejeki）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（C. acetophilum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・リリウム（C. lilium）、コリネバクテリウム・ニトリロフィラス（C. nitrilophilus）またはコリネバクテリウム亜種（C. spec.）が含まれる。本発明の生物にはまた、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属のメンバー、例えばブレビバクテリウム・ハーモニアゲネス（Brevibacterium harmoniagenes）、ブレビバクテリウム・ボタニカム（Brevibacterium botanicum）、ブレビバクテリウム・ディバラティカム（B. divaraticum）、ブレビバクテリウム・フラバム（B. flavam）、ブレビバクテリウム・ヘアリル（B. healil）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（B. ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・ケトソレダクタム（B. ketosoreductum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（B. lactofermentum）、ブレビバクテリウム・リネンス（B. linens）、ブレビバクテリウム・パラフィノリティカム（B. paraphinolyticum）およびブレビバクテリウム亜種（B. spec.）が含まれる。エシェリキア属に関しては、本発明は例えば大腸菌（E. col）に関する。

上記のように、特定の反応または特定の代謝経路を通る代謝流量は、それぞれの反応を触媒する酵素の量および／または活性を増大または低減させることによって改変してよい。

酵素の量および／または活性を増大させることに関して、前述の生物等の宿主中のタンパク質の量および／または活性を増大させるための、当技術分野において公知のすべての方法を使用してよい。

量および／または活性の増大または導入
量を増大させることに関して、２つの基本的シナリオを区別することができる。第一のシナリオでは、外来型のそれぞれのタンパク質の発現によって酵素の量を増大させる。他のシナリオでは、プロモーターおよび／またはエンハンサー要素の活性および／または、転写、翻訳または翻訳後レベルに対するそれぞれのタンパク質の活性を調節する他の調節活性、例えばリン酸化、スモイル化（sumoylation）、ユビキチン化（ubiquitylation）等に影響を与えることによって、内因性タンパク質の発現を増加させる。

例えば表１の酵素の量を単に増大させることに加えて、該酵素の向上した活性を提供する特定の突然変異を保持しうる酵素を使用することによって、該タンパク質の活性を増大させてよい。そのような突然変異は、例えば、フィードバック阻害を担う酵素の領域を不活性化する。例えば非保存的突然変異を導入することによってこれらを突然変異させることにより、該酵素はもはやフィードバック制御を提供せず、ゆえに、より多くの生成物が生産されても酵素の活性は下方制御されない。該突然変異は、内因性コピーの該酵素中に導入するか、あるいは対応する突然変異型の外来性酵素を過剰発現させることによって提供してよい。そのような突然変異には、点突然変異、欠失または挿入が含まれる。点突然変異は保存的または非保存的であってよい。さらに、欠失には、それぞれのタンパク質の２つまたは３つのアミノ酸のみ〜ドメイン全体が含まれる。

ゆえに、タンパク質の活性および量の増大は、例えば転写、翻訳、およびタンパク質レベルで阻害性調節機構のスイッチをオフにするか、あるいは例えば内因性Ｒ３遺伝子を誘導することによって、またはＲ３をコードする核酸を導入することによって、出発生物と比較してこれらのタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより、異なる道筋で達成してよい。

一実施形態では、出発生物と比較した酵素活性および量のそれぞれの増大は、そのような酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加によって達成される。それぞれのデータベース、例えばＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、ＥＭＢＬ（http://www.embl.org）、またはＥｘｐａｓｙ（http://www.expasy.org/）から配列を取得してよい。表１に例を挙げる。

別の実施形態では、表１の酵素をコードする核酸を生物、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌に導入することによって、表１の酵素の量および／または活性の増大を達成する。

原理上、表１に列挙されるタンパク質の酵素活性を有する異なる生物のすべてのタンパク質を使用することができる。イントロンを含有する真核生物供給源由来のそのような酵素のゲノム核酸配列の場合、宿主生物が、対応するｍＲＮＡをスプライシング可能でないか、あるいはスプライシング可能にすることができない事例では、対応するｃＤＮＡ等のプロセシング済み核酸配列を使用することができる。この説明で既述されるすべての核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列でありうる。

向上したメチオニン合成効率を有する生物を作製するための本発明に記載の一方法では、上で規定される機能的または非機能的な、フィードバック制御型またはフィードバックに無関係の酵素の１つをコードする核酸配列を微生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌それぞれに導入（transfer）する。この導入によって、それぞれ酵素の発現の増加が生じ、相応して、所望の反応経路を通る、より多くの代謝流量が生じる。

本発明では、タンパク質の量および／または活性の増大または導入は、典型的に、以下のステップを含む：
ａ）以下の核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列を５’−３’方向で含むベクターを製造するステップ：
− 本発明の生物中で機能的なプロモーター配列
− それに作動的に連結されている、表１のタンパク質またはその機能的等価部分をコードするＤＮＡ配列
− 本発明の生物中で機能的な終結配列
ｂ）ステップａ）で得られたベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌等の本発明の生物に導入し、場合により、それぞれのゲノム内に組み込むステップ。

本発明の範囲内で酵素の機能的等価部分が既述される場合、表１の酵素をコードする核酸配列の断片であって、その発現が依然としてそれぞれの全長タンパク質の酵素活性を有するタンパク質を生じさせる断片を意味する。

本発明では、非機能的酵素とは、それぞれ機能的酵素およびその機能的等価部分と、それぞれ同一の核酸配列およびアミノ酸配列を有するが、ある位置で、非機能的酵素がそれぞれの反応を触媒できないか、あるいは非常に限定された程度にしか触媒できない影響を有するヌクレオチドまたはアミノ酸の点突然変異、挿入または欠失を有する。これらの非機能的酵素を、それぞれの反応を依然として触媒可能であるが、もはやフィードバック制御されない酵素と混同（intermixed）してはならない。非機能的酵素にはまた、核酸配列レベルまたはアミノ酸配列レベルで点突然変異、挿入、または欠失を保持し、かつ該酵素の生理的結合パートナーと相互作用できないか、あるいはそれにもかかわらず該パートナーと相互作用できる、表１のそのような酵素が含まれる。そのような生理的結合パートナーには、例えば、それぞれの基質が含まれる。非機能的突然変異体はいずれも、該突然変異体の派生元である野生型酵素が触媒できる反応を触媒できない。

本発明では、用語「非機能的酵素」は、それぞれアミノ酸レベルおよび核酸レベルで、それぞれの機能的酵素に対する必須の配列ホモロジーを有さないそのようなタンパク質を含まない。それぞれの反応を触媒できず、かつ、それぞれの酵素との必須の配列ホモロジーを有さないタンパク質は、したがって、明らかに、本発明の用語「非機能的酵素」が意味する対象ではない。本発明の範囲内で、非機能的酵素は不活性化型酵素または不活性酵素とも称される。

したがって、本発明に記載の、前述の点突然変異、挿入、および／または欠失を保持する表１の非機能的酵素は、本発明に記載の表１の野生型酵素またはその機能的等価部分に対する必須の配列ホモロジーによって特徴付けられる。

本発明では、実質的配列ホモロジーとは、概して、それぞれＤＮＡ分子またはタンパク質のそれぞれ核酸配列またはアミノ酸配列が、表１のタンパク質またはその機能的等価部分のそれぞれ核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％同一であることを示すと理解される。

２つのタンパク質の同一性とは、それぞれのタンパク質の全長にわたるアミノ酸の同一性、特にCLUSTAL法（Higgins et al., (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151）を利用するLasergeneソフトウェア（DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA)）を活用した比較によって算出される同一性であると理解される。

ホモロジーもまた、CLUSTAL法（Higgins et al., (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151）を利用するLasergeneソフトウェア（DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA)）を活用して算出することができる。

ＤＮＡ配列の同一性も相応に理解されるものとする。

前述の方法を使用して、機能的または非機能的な、フィードバック制御型またはフィードバックに無関係の表１の酵素またはその機能的等価部分をコードするＤＮＡ配列の発現を増加させることができる。プロモーターおよび終結配列等の調節配列を含むそのようなベクターの使用は当業者に公知である。さらに、当業者は、ステップａ）で得られるベクターをどのようにコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌等の生物に導入できるか、およびベクターがそれらのゲノム内へ組み込み可能であるためにどの特性を有する必要があるかを承知している。

コリネバクテリウム・グルタミカム等の生物中の酵素含量を、例えば大腸菌等の別の生物由来の酵素をコードする核酸を導入することによって増大させる場合、例えば大腸菌由来の該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の導入を、該遺伝暗号にしたがって該ポリペプチド配列を、生物特有のコドン使用頻度に起因して、より高頻度で使用されるコドンを主に含む核酸配列にバックトランスレーション（back-translation）することによって行うことが賢明である。コドン使用頻度は、関連生物の他の既知遺伝子についてのコンピュータ評価によって決定することができる。

本発明では、表１の酵素をコードする核酸のそれぞれ遺伝子発現および活性の増加とはまた、生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌の内因性のそれぞれの内因性酵素の発現の操作であると理解される。これは、例えばこれらの酵素をコードする遺伝子に関するプロモーターＤＮＡ配列を改変することによって達成することができる。これらの酵素の改変された、好ましくは向上した発現率を生じさせるそのような改変は、ＤＮＡ配列の欠失または挿入によって達成することができる。

内因性遺伝子のプロモーター配列の改変は、通常、該遺伝子の発現量の変化を生じさせ、したがって細胞または生物中の検出可能な活性の変化を生じさせる。

さらに、内因性遺伝子のそれぞれ改変された発現および増加した発現は、形質転換生物中に存在しない、これらの遺伝子のプロモーターと相互作用する調節タンパク質によって達成することができる。そのような調節因子は、例えばWO 96/06166に記載のように、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクチベータードメインからなるキメラタンパク質でありうる。

内因性遺伝子の活性および含量を増大させるための別の可能性は、例えば過剰発現によって、該内因性遺伝子の転写に関与する転写因子を上方制御することである。転写因子を過剰発現するための手段は当業者に公知であり、さらに、本発明の範囲内で表１の酵素に関して開示されている。

さらに、内因性遺伝子の活性の改変は、該内因性遺伝子コピーのターゲティング突然変異誘発によって達成することができる。

表１の酵素をコードする内因性遺伝子の改変は、該酵素の翻訳後修飾に影響を与えることによって達成することもできる。これは、例えば該酵素の翻訳後修飾に関与するキナーゼまたはホスファターゼ等の酵素の活性を、過剰発現または遺伝子サイレンシング等の対応する手段を用いて調節することによって生じうる。

別の実施形態では、酵素の効率を改善してもよいし、あるいはそのアロステリック調節領域を破壊して、化合物の生産のフィードバック阻害を妨げてもよい。同様に、分解酵素を除去または、置換、欠失、もしくは付加によって改変して、細胞の生存性を損なうことなく表１の所望の酵素に関するその分解活性が減少するようにしてよい。各事例で、これらの所望の精製化学製品の１つについての全体の収率または生産率を増加させてよい。

表１のタンパク質およびヌクレオチド分子のそのような改変によって、他の精製化学製品、例えばシステインまたはグルタチオン等の他の硫黄含有化合物、他のアミノ酸、ビタミン、補助因子、栄養補給食品（nutraceuticals）、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびトレハロースの生産を改善することも可能である。任意の１化合物の代謝は、必然的に、細胞内の他の生合成経路および分解経路と絡み合い、１経路中の必要な補助因子、中間体、または基質は、おそらく別のそのような経路によって供給または制限される。したがって、１以上の表１のタンパク質の活性をモジュレートすることによって、メチオニンを生じさせる経路に加えて別の精製化学製品の生合成経路または分解経路の活性の生産または効率が影響を受ける可能性がある。

酵素発現および機能はまた、異なる代謝プロセス由来の化合物の細胞レベルに基づいて調節してよく、アミノ酸およびヌクレオチド等の基本的生育に必要な分子の細胞レベルは大規模培養中の微生物の生存性に決定的に影響するかもしれない。ゆえに、表１のアミノ酸生合成酵素をモジュレートして、それらがもはやフィードバック阻害に応答性でないようにするか、あるいはそれらの効率または代謝回転が改善されるようにすることは、メチオニン生産の経路を通る、より高い代謝流量を生じさせるはずであろう。本発明の理論的方法は、これらの栄養素、代謝産物等の効果をモデル生物内に取り込むことを支援し、ゆえに、メチオニン合成の効率を向上させるために遺伝的に改変すべき代謝経路に対する有益なガイダンスを提供する。

表１の酵素の量および／または活性を増大させるか、あるいは導入するためのこれらの前述のストラテジーは限定的であることを意図しない；これらのストラテジーに関するバリエーションは当業者に自明である。

酵素の量および／または活性の低減
表１の任意の酵素の量および／または活性の低減に関して、種々のストラテジーが同様に利用可能である。

表１の内因性酵素の発現は、例えば、該遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現によって調節することができる。刺激性または抑制性プロモーター領域に対するアプタマーの結合に応じて、表１の酵素の量および、ゆえにこの事例では活性が増大または低減する。

アプタマーは、酵素自体に特異的に結合し、かつ例えばそれぞれの酵素の触媒中心に結合することによって該酵素の活性を低減させるように設計することもできる。アプタマーの発現は、通常、ベクターベースの過剰発現（上記参照のこと）によって達成され、ならびに、当業者に周知の、アプタマーの設計および選択によって達成される（Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36）。

さらに、表１の内因性酵素の量および活性の低減は、当業者に周知の種々の実験手段を用いて達成することができる。これらの手段は、通常、用語「遺伝子サイレンシング」の下にまとめられる。例えば、内因性遺伝子の発現は、酵素またはその部分をアンチセンス方向でコードするＤＮＡ配列を有する前述のベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌等の生物に導入することによってサイレンシングすることができる。これは、そのようなベクターが細胞で転写されるとＲＮＡが生じ、該ＲＮＡは該内因性遺伝子によって転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズでき、したがってその翻訳を妨げるという事実に基づく。

アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動的に連結されている調節配列であって、種々の細胞タイプにおいてアンチセンスＲＮＡ分子の継続発現を導く調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができ、あるいはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞タイプ特異的発現を導く調節配列を選択することができる。該アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形式でありうる。該形式において、アンチセンス核酸は高性能調節領域のコントロール下で生産され、その活性は、該ベクターの導入対象である細胞タイプによって影響されうる。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節についての考察に関しては、Weintraub, H. etal., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1 (1) 1986を参照のこと。

原理上、アンチセンスストラテジーはリボザイム法と連結することができる。リボザイムは触媒活性のＲＮＡ配列であり、アンチセンス配列と連結されると、触媒作用で標的配列を切断する（Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75）。これによりアンチセンスストラテジーの効率を向上させることができる。

植物では、ＲＮＡ干渉または、同時抑制（co-suppression）として知られているプロセスによって遺伝子サイレンシングを達成してよい。

別の方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを生物に導入することによって、内因性遺伝子中にナンセンス突然変異を導入する（Zhu et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558）か、あるいは相同組換えを活用してノックアウト突然変異体を作製する（Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8321-8323.）ことである。

相同組換え微生物を作製するために、欠失、付加または置換が導入されることによって、内因性遺伝子が改変、例えば機能的に破壊されている、表１の酵素をコードする遺伝子の少なくとも部分を含有するベクターを調製する。

好ましくは、この内因性遺伝子はコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌遺伝子であるが、関連細菌由来のホモログであるか、あるいは酵母または植物供給源由来のホモログでさえあってよい。一実施形態では、相同組換え時に、内因性遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも称される）ようにベクターを設計する。あるいは、相同組換え時に、内因性遺伝子が突然変異されるか、あるいは別の様式で改変されるが、依然として機能的タンパク質をコードするようにベクターを設計することができる（例えば、上流調節領域を改変することによって、表１の内因性酵素の発現を改変することができる）。相同組換えベクター中では、内因性遺伝子の改変部分の５’および３’末端に該内因性遺伝子の追加の核酸が隣接していて、該ベクターによって運搬される外来性遺伝子と該（微）生物中の内因性遺伝子の間で相同組換えが生じることを可能にする。追加のフランキング内因性核酸は、該内因性遺伝子との好結果の相同組換えに十分な長さを有する。典型的に、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方において）をベクターに含ませる（例えば、相同組換えベクターの説明に関しては、Thomas, K. R., and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503を参照のこと）。

ベクターを微生物に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、当技術分野において公知の技術を使用して、導入内因性遺伝子が表１の内因性酵素と相同組換えされている細胞を選択する。

別の実施形態では、宿主細胞中の表１の酵素に関する内因性遺伝子を破壊（例えば相同組換えまたは当技術分野において公知の他の遺伝的手段によって）し、そのタンパク質産物の発現が生じないようにする。別の実施形態では、宿主細胞中の表１の酵素の内因性または導入遺伝子は、１以上の点突然変異、欠失、または逆位（inversions）によって改変されているが、依然として機能的酵素をコードする。さらに別の実施形態では、（微）生物中の表１の酵素に関する内因性遺伝子の１以上の調節領域（例えばプロモーター、リプレッサー、またはインデューサー（inducer））が改変（例えば欠失、トランケーション、逆位、または点突然変異によって改変）され、内因性遺伝子の発現がモジュレートされるようになっている。当業者は、表１の酵素をコードする２以上の遺伝子を含有する宿主細胞およびタンパク質改変物が、本発明の方法を使用して容易に作成でき、それらが本発明に含まれるものとされることを認識する。

さらに、特異的ＤＮＡ結合因子、例えばジンクフィンガー転写因タイプの因子を用いて、遺伝子を抑制する（さらには遺伝子を過剰発現させる）ことが可能である。さらに、標的タンパク質自体を阻害する因子を細胞に導入することができる。タンパク質結合因子は、例えば、前述のアプタマーであってよい（Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36）。

別のタンパク質結合因子であって、生物中で発現されると、表１の酵素の量および／または活性を低減させる因子として、酵素特異的抗体を考慮してよい。モノクローナル、ポリクローナル、または組換え型の酵素特異的抗体の製造は標準的プロトコルにしたがう（Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M. P. Deutscher, ed.）。抗体の発現も文献から公知である（Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76）。

上記技術は当業者に周知である。したがって、当業者はまた、例えばアンチセンス法に使用される核酸構築物がどのサイズを有する必要があるか、およびそれぞれの核酸配列がどの相補性、ホモロジーまたは同一性を有する必要があるかを承知している。用語、相補性、ホモロジー（相同性）、および同一性は当業者に公知である。

本発明の範囲内で、配列ホモロジーおよびホモロジーとはそれぞれ、概して、それぞれＤＮＡ分子またはタンパク質のそれぞれ核酸配列またはアミノ酸配列が、それぞれ既知のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはタンパク質のそれぞれ核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％同一であることを意味すると理解される。本明細書中のホモロジーおよび同一性の程度は、それぞれ、コード配列の全長を表す。

相補性という用語は、２つの相補的塩基間の水素結合によって別の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子の能力を説明する。当業者は、２つの核酸分子が、互いにハイブリダイズ可能であるために、１００％の相補性を有する必要はないことを承知している。別の核酸配列とハイブリダイズできる核酸配列は、該他の核酸配列と、それぞれ、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、さらに特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８または１００％相補的であることが好ましい。

核酸分子は、同一のヌクレオチドを同一の５’−３’方向で有すれば、同一である。

内因性ｍＲＮＡ配列とアンチセンス配列のハイブリダイゼーションは、典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞条件下で、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで生じる。本発明では、ハイブリダイゼーションは、特異的ハイブリダイゼーションを保証するために十分にストリンジェントな条件下でｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。

ストリンジェントなｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、文献から入手することができる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Pressを参照のこと）。用語「特異的ハイブリダイゼーション」とは、この核酸配列が例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子の複合混合物の部分である場合に、ストリンジェントな条件下で特定の核酸配列に対して分子が優先的に結合する事例を表す。

したがって、用語「ストリンジェントな条件」とは、核酸配列が標的配列に優先的に結合するが、他の配列には結合しないか、あるいは少なくともかなり低下した程度にしか結合しない条件を表す。

ストリンジェントな条件は状況に依存する。長い配列ほど、高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、特定イオン強度および特定ｐＨ値で、ハイブリダイゼーション温度が具体的配列の融解温度（Ｔｍ）の約５℃下であるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的な分子の５０％が該標的配列とハイブリダイズする（特定ｐＨ値、特定イオン強度および特定核酸濃度での）温度である。典型的に、ストリンジェントな条件は、０．０１〜１．０Ｍの範囲のナトリウムイオン（または別の塩のイオン）の塩濃度および７．０〜８．３の範囲のｐＨ値を含む。該温度は、短い分子（例えば１０〜５０の範囲のヌクレオチドを含むそのような分子）では、少なくとも３０℃である。さらに、ストリンジェントな条件は、例えばホルムアミド（form amide）等の不安定化剤の添加を含みうる。典型的なハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーは以下の組成を有する。

プレハイブリダイゼーション溶液： ０．５％ ＳＤＳ
５×ＳＳＣ
５０ｍＭ ＮａＰＯ_４，ｐＨ６．８
０．１％ Ｎａ−ピロリン酸
５×デンハート試薬
１００μｇ／サケ精子
ハイブリダイゼーション溶液： プレハイブリダイゼーション溶液
１×１０^６ｃｐｍ／ｍｌ プローブ（５〜１０分９５℃）
２０×ＳＳＣ： ３Ｍ ＮａＣｌ
０．３Ｍ クエン酸ナトリウム
ＨＣｌでｐＨ７に調節
５０×デンハート試薬： ５ｇ フィコール
５ｇ ポリビニルピロリドン
５ｇ ウシ血清アルブミン
ａｄ ５００ｍｌ Ａ．ｄｅｓｔ。

典型的なハイブリダイゼーション手順は以下の通りである：
任意選択： １×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で６５℃で３０分間洗浄ブロット
プレハイブリダイゼーション： ５０〜５５℃で少なくとも２時間
ハイブリダイゼーション： ５５〜６０℃で一晩
洗浄： ０５分間 ２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度
３０分間 ２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度
３０分間 １×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度
４５分間 ０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ ６５℃
５分間 ０．１×ＳＳＣ 室温。

用語「センス」および「アンチセンス」ならびに「アンチセンス方向」は当業者に公知である。さらに、当業者は、アンチセンス法に使用されるべき核酸分子がどれだけの長さである必要があるか、およびそれらがその標的配列に関してどのホモロジーまたは相補性を有する必要があるかを承知している。

したがって、当業者はまた、遺伝子サイレンシング法に使用される核酸分子がどれだけの長さである必要があるかを承知している。アンチセンス目的では、１００ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、４０ヌクレオチドおよび２０ヌクレオチドの配列長にわたる相補性で十分である。さらに、より長いヌクレオチド長であれば確実に十分である。前述の方法の併用も考えられる。

本発明にしたがって、生物中で活性なプロモーターに５’−３’方向で作動的に連結されているＤＮＡ配列を使用すれば、概して、該生物の細胞への導入後に、コード配列の過剰発現を可能にするか、あるいは内因性核酸配列およびその発現対象のタンパク質それぞれの抑制または競合および妨害を生じさせるベクターを構築することができる。

特定の酵素の活性は、生物中でその非機能的突然変異体を過剰発現させることによって低減させてもよい。ゆえに、目的の反応を触媒できないが、例えば基質または補助因子に結合できる非機能的突然変異体は、過剰発現によって、内因性酵素を打ち負かし、したがって該反応を阻害することができる。宿主細胞中の酵素の量および／または活性を低減させるための別の方法は当業者に周知である。

ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、表１の酵素（またはその部分）をコードする核酸またはその組み合わせを含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される用語「ベクター」とは、自身が連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を表す。

ベクターの１タイプは「プラスミド」であり、プラスミドは、追加のＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを表す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる。

あるベクターは、導入対象の宿主細胞中で自律複製可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、自身が作動的に連結されている対象の遺伝子の発現を指揮することができる。

そのようなベクターは本明細書中で「発現ベクター」と称される。

一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミド形式であることが多い。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用することができる。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形式であるからである。しかし、本発明は、同等の機能を提供する、そのような他の形式の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のそれぞれの核酸の発現に好適な形式の、表１の酵素をコードする核酸を含んでよく、それは、組換え発現ベクターが１以上の調節配列を含み、該調節配列は、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現対象の核酸配列に作動的に連結されていることを意味する。

組換え発現ベクター内で、「作動的に連結されている」とは、目的のヌクレオチド配列が、調節配列（群）に連結され、該ヌクレオチド配列の発現が（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系または、該ベクターが宿主細胞に導入された場合の宿主細胞において）可能であるようになっていることを意味するものとする。用語「調節配列」には、プロモーター、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えばターミネーター、ポリアデニル化シグナル、またはｍＲＮＡ二次構造の他の要素）が含まれるものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列には、多数のタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導くものおよび特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を導くものが含まれる。好ましい調節配列は、例えば、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰ０２、ｅ−Ｐｐ−または（ore）ＰＬ等のプロモーター（好ましくは細菌において使用される）である。追加の調節配列は、例えば、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ等の酵母および真菌由来のプロモーター、ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチン−もしくはファゼオリン−プロモーター等の植物由来のプロモーターである。人工プロモーターを使用することも可能である。当業者は、発現ベクターの設計が、形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル、等の要因に依存しうることを理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、表１の酵素をコードする核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）を生産することができる。

本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中で表１の酵素を発現させるために設計することができる。例えば、表１の酵素に関する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母および他の真菌細胞（Romanos, M. A. et al. (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C. A. M.J. J. et al.(1991) in: More Gene Manipulations in Fungi,J. W.Bennet & L. L. Lasure, eds.,p. 396-428: Academic Press: San Diego; およびvan den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J.(1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. etal., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeを参照のこと）、藻類および多細胞性植物細胞（Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.: 583-586を参照のこと）中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)でさらに考察されている。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。

原核生物中のタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指揮する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実行されることが最も多い。

融合ベクターでは、該ベクター中でコードされるタンパク質にいくつかのアミノ酸が付加される。該アミノ酸は、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加されるが、Ｃ末端にも付加され、あるいは該タンパク質の好適な領域内に融合される。そのような融合ベクターは、典型的に、以下の３つの目的に役立つ：１）組換えタンパク質の発現を増加させるため；２）組換えタンパク質の溶解性を増加させるため；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして働くことにより組換えタンパク質の精製を支援するため。融合発現ベクターでは、融合部分および組換えタンパク質の連結部に、融合タンパク質の精製後に該融合部分から該組換えタンパク質を分離することを可能にするためのタンパク質分解による切断部位が導入されることが多い。そのような酵素、およびその同系の（cognate）認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。

典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）が含まれ、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡと融合している。

好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳｌ、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂｌ、ｅｇｔｌｌ、ｐＢｄＣｌ、およびｐＥＴ ｌｌｄ（Studier etal., Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; およびPouwels etal., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ ｌｌｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）よって媒介されるＴ７ ｇｎｌＯ−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写調節下にＴ７ｇｎｌ遺伝子を宿す常在性Ｘプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。他の種類の細菌の形質転換に関して、適切なベクターを選択してよい。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２およびｐＩＪ３６１はストレプトマイセスの形質転換に有用であり、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４はバシラス種の形質転換に適していることが知られている。コリネバクテリウムへの遺伝情報の導入に有用ないくつかのプラスミドには、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬｌ、ｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７が含まれる（Pouwels etal., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018）。

組換えタンパク質発現を最大にする１ストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解によって切断する能力が損なわれている宿主細菌中でタンパク質を発現することである（Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128）。別のストラテジーは、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変して、各アミノ酸の個別のコドンが、発現に選択されるコリネバクテリウム・グルタミカム等の細菌中で優先的に利用されるコドンにすることである（Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118）。本発明の核酸配列のそのような改変は標準的ＤＮＡ合成技術によって実行することができる。

好適なコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌シャトルベクターの例は、Eikmanns et al（Gene. (1991) 102, 93-8）に見出せる。

別の実施形態では、タンパク質発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）中で発現させるためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234）、２ｉ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐｌ３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz etal., (1987) Gene 54: 113-123）、およびｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）が含まれる。糸状菌等の他の真菌での使用に適切なベクターおよびベクターを構築するための方法には、以下の文献で詳説されるものが含まれる：van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt,P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, およびPouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018)。

本発明の目的では、作動的連結とは、コード配列を発現する場合に、各々の調節エレメントがその機能を、その決定にしたがって、果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび、場合により、追加の調節エレメントの連続配置であると理解される。

別の実施形態では、単細胞性植物細胞（例えば藻類）または高等植物由来の植物細胞（例えば、作物等の種子植物）中で表１のタンパク質を発現させてよい。植物発現ベクターの例には、Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; およびBevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721で詳説されるベクターが含まれ、ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮｌ９、ｐＡＫ２００４、およびｐＤＨ５１が含まれる（Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018）。

原核細胞および真核細胞の両細胞に関する他の好適な発現系に関しては、Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003の１６および１７章を参照のこと。

本発明の目的では、作動的連結とは、コード配列を発現する場合に、各々の調節エレメントがその機能を、その決定にしたがって、果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび、場合により、追加の調節エレメントの連続配置であると理解される。

別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプ、例えば植物細胞において優先的な核酸の発現を指揮する（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して、核酸を発現させる）ことが可能である。組織特異的調節エレメントは当技術分野において公知である。

本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている生物または宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は本明細書中で交換可能に使用される。そのような用語は、具体的な対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫をも表すことが理解される。後の世代では、突然変異または環境影響に起因して特定の改変が生じるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でない可能性があるが、依然として本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。

宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、表１の酵素は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母または植物中で発現させることができる。当業者は他の好適な宿主細胞を知っている。

ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書中で使用される用語「形質転換」および「トランスフェクション」、「コンジュゲーション」および「形質導入」とは、外来性核酸（例えば直線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば直線化ベクターまたは、ベクターを伴わない遺伝子構築物単独）またはベクター形式の核酸（例えばプラスミド、ファージ、ファスミド（phasmid）、ファージミド、トランスポゾンまたは他のＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、種々の当技術分野において認められている技術を表すものとし、該技術には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、天然コンピテンス（natural competence）、化学媒介性導入、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrook, et al.（Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003）、および他の実験室マニュアルに見出せる。

これらの成分を特定および選択するために、選択マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、概して、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセート等の薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、表１の酵素をコードする核酸と同一のベクターで宿主細胞に導入することができ、あるいは別個のベクターで導入することもできる。導入核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。

別の実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含有する組換え微生物を作製することができる。例えば、表１の遺伝子をベクターに含ませ、ｌａｃオペロンのコントロール下に配置すると、ＩＰＴＧの存在下でのみ該遺伝子の発現が可能になる。そのような調節系は当技術分野において周知である。

一実施形態では、該方法は、メチオニン生産に好適な培地中で本発明の生物（例えば表１の酵素をコードする組換え発現ベクターが導入されているか、あるいは野生型または改変型酵素をコードする遺伝子がゲノムに導入されている生物）を培養するステップを含む。別の実施形態では、該方法は、さらに、培地または宿主細胞からメチオニンを単離するステップを含む。

上記のように、生物の代謝流量をモジュレートするために、代謝経路ネットワークの反応を触媒する表１の酵素の量および／または活性を増大または低減させてよい。しかし、生物の代謝流量を改変して、メチオニン合成がより効率的な生物を作製するために、酵素の量および／または活性の変化は、表１に列挙される酵素に限定されない。表１の酵素に相同的で、別の生物中で同一機能を実行する任意の酵素は、過剰発現によって代謝流量に影響を与える目的で量および／または活性をモジュレートするために完全に好適である。ホモロジーおよび同一性に関する定義は上で提供されている。

以下の表では、表１の酵素Ｒ１〜Ｒ６１のいくつかのホモログの例を挙げる。該ホモログは、それぞれの酵素の量および／または活性を増大させるために、例えばそれらをコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌で過剰発現させることによって、本発明の目的で使用してよいものである：

大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミカムの培養−培地および培養条件
当業者は、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌等の一般的な微生物の培養に精通している。ゆえに、コリネバクテリウム・グルタミカムの培養に関する概略の手引きを以下に挙げる。対応する情報は、大腸菌の培養に関する標準的教科書から入手することができる。

大腸菌株は、通常、それぞれＭＢおよびＬＢブロス中で培養される（Follettie, M. T., Peoples,0., Agoropoulou, C., and Sinskey, A J. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103）。大腸菌用の最少培地はそれぞれＭ９および改変型ＭＣＧＣである（Yoshihama, M., Higashiro, K., Rao, E. A., Akedo, M., Shanabruch, W G., Follettie, M. T., Walker, G. C., and Sinskey, A. J. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507）。グルコースは１％の終濃度で加えてよい。抗生物質は以下の量（マイクログラム／ミリリットル）で加えてよい：アンピシリン、５０；カナマイシン、２５；ナリジクス酸、２５。アミノ酸、ビタミン、および他の補充物質は以下の量で加えてよい：メチオニン、９．３ｍＭ；アルギニン、９．３ｍＭ；ヒスチジン、９．３ｍＭ；チアミン、０．０５ｍＭ。大腸菌細胞は、通常、それぞれ３７℃で培養される。

遺伝的に改変されたコリネバクテリウムは、典型的に、合成または天然培養培地中で培養される。コリネバクテリウム用のいくつかの異なる培養培地はいずれも周知であり、容易に入手できる（Lieb et al. (1989) Appl.Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl(1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag）。

これらの培地は、１以上の炭素供給源、窒素供給源、無機塩、ビタミンおよび微量元素からなる。好ましい炭素供給源は、単糖類、二糖類、または多糖類等の糖である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースは非常に良好な炭素供給源として役立つ。

糖精製から得られる糖蜜または他の副産物等の複合化合物によって培地に糖を供給することも可能である。異なる炭素供給源の混合物を供給することも有益でありうる。他の炭素供給源候補は、アルコールおよび有機酸、例えばメタノール、エタノール、酢酸または乳酸である。窒素供給源は、通常、有機または無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含有する材料である。典型的な窒素供給源には、アンモニアガスまたはアンモニア塩、例えばＮＨ_４Ｃ１または（ＮＨ_４）_２Ｓ０_４、ＮＨ_４０Ｈ、ニトラート、尿素、アミノ酸または複合窒素供給源、例えばコーンスティープリカー（corn steep liquor）、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉エキス等が含まれる。

異なる硫黄供給源を使用してメチオニンを過剰生産させることが可能である。スルフェート、チオスルフェート、スルファイトおよびさらに還元された硫黄供給源、例えばＨ_２Ｓおよびスルフィドおよび誘導体を使用することができる。また、有機硫黄供給源、例えばメチルメルカプタン、チオグリコラート、チオシアナート、およびチオ尿素、硫黄含有アミノ酸、例えばシステインおよび他の硫黄含有化合物を使用して、効率的メチオニン生産を達成することができる。他のＣ１供給源、例えばメタノールまたはホルムアルデヒドと同様にギ酸を補充物質とすることも可能である。メタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドが特に好適である。

培地に含ませてよい無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、亜リン酸塩または硫酸塩が含まれる。金属イオンを溶液状態のまま維持するためにキレート化合物を培地に加えることができる。特に有用なキレート化合物には、ジヒドロキシフェノール、例えばカテコールまたはプロトカテキュアート（protocatechuate）、または有機酸、例えばクエン酸が含まれる。培地には、他の成長因子、例えばビタミンまたは成長促進剤をさらに含ませることが典型的である。その例には、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテナートおよびピリドキシンが含まれる。成長因子および塩は、複合培地成分、例えば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカー等が起源であることが多い。培地化合物の厳密な組成は直接実験に強く依存し、各具体的事例に関して個別に決定される。培地の最適化についての情報は教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach（Eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）から入手できる。市販の供給元の培養培地、例えばstandard 1（Merck）またはBHI（grain heart infusion, DIFCO）等を選択することも可能である。

すべての培地成分は加熱（１．５バールで１２１Ｃで２０分間）または滅菌ろ過によって滅菌されるべきであろう。該成分は、一緒に滅菌することができ、あるいは必要であれば別々に滅菌することもできる。

すべての培地成分は培養の開始時に存在させてよく、場合により、連続的に、またはバッチ式で加えることもできる。培養条件は各実験に関して別個に規定される。

温度は１５℃〜４５℃の範囲であるべきであろう。温度は一定に保つことができ、あるいは実験中に変化させることができる。培地のｐＨは５〜８．５の範囲、好ましくは７．０付近であってよく、培地にバッファーを加えることによって維持することができる。そのための典型的なバッファーはリン酸カリウムバッファーである。合成バッファー、例えばＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ等を、代替的に、または同時に使用することができる。培養中にＮａＯＨまたはＮＨ_４ＯＨを加えることによって一定培養ｐＨを維持することも可能である。複合培地成分、例えば酵母抽出物を利用する場合、多数の複合化合物が高い緩衝能を有するので、追加のバッファーの必要性は低い。微生物の培養に発酵槽を利用する場合、ガス状アンモニアを使用してｐＨをコントロールすることもできる。

インキュベーション時間は、通常、数時間〜数日間の範囲である。この時間は、最大の生成物量がブロス中に蓄積することを可能にするように選択される。開示される培養実験は、種々のサイズのマイクロタイタープレート、ガラス管、ガラスフラスコまたはガラスもしくは金属発酵槽等の種々の容器中で実行することができる。多数のクローンをスクリーニングするために、マイクロタイタープレート、ガラス管または振とうフラスコ（バッフル付きまたはなし）中で微生物を培養すべきであろう。好ましくは１０容量％の必要な培養培地を充填した１００ｍｌ振とうフラスコを使用する。該フラスコは、回転式シェーカー（振幅２５ｍｍ）で１００〜３００ｒｐｍの速度範囲を用いて振とうすべきであろう。湿気の維持によって蒸発減を低減させることができ；あるいは、蒸発減の数学的補正を実施すべきであろう。

遺伝的改変クローンを試験する場合、未改変のコントロールクローンまたは挿入を全く含まない基本プラスミドを含有するコントロールクローンを同様に試験すべきであろう。３０℃でインキュベート済みの寒天プレート、例えばＣＭプレート（１０ｇ／１グルコース、２，５ｇ／１ ＮａＣｌ、２ｇ／１尿素、１０ｇ／１ポリペプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／１ 肉エキス、２２ｇ／１ ＮａＣｌ、２ｇ／１尿素、１０ｇ／１ ポリペプトン、５ｇ／１酵母抽出物、５ｇ／１肉エキス、２２ｇ／１寒天、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨ６．８に調節）で培養された細胞を使用して、０．５〜１．５のＯＤ６００まで培地に接種する。

培地の接種は、ＣＭプレート由来のコリネバクテリウム・グルタミカム細胞の生理食塩水懸濁液の導入またはこの細菌の液体前培養の添加によって達成される。

以下、種々の実施例を挙げて本発明を例証する。しかし、これらの実施例は、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。

本明細書中の実施形態は本開示内容の実施形態の例証を提供するものであり、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は、多数の他の実施形態が本開示内容に包含されることを容易に認識する。本開示内容中のすべての引用刊行物および特許ならびに登録番号（寄託番号）またはデータベース参照番号によって特定される配列は、参照により、その全体が組み入れられる。参照によって組み入れられる材料が本明細書と矛盾するか、あるいは不一致である範囲では、本明細書は任意の該材料に優先する。本明細書中の任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本開示内容の先行技術であることの承認ではない。

特に記載しない限り、本明細書（特許請求の範囲を含む）中で使用される成分の量、細胞培養、処理条件、等を表現するすべての数字は、すべての場合で、用語「約」によって修飾されると理解されるものとする。したがって、特に別の指定をしない限り、数的パラメータは近似であり、本発明によって取得しようとする所望の特性に応じて変動する。

特に記載しない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、該系列のすべての要素を表すと理解されるものとする。当業者は、本明細書中で記載される発明の具体的実施形態の多数の等価形態を認識し、あるいは通常の実験法程度のものを使用して突き止めることができる。そのような等価形態は特許請求の範囲に包含されるものとする。

Ａ）向上したメチオニン合成効率を有する生物のための最適な代謝流量の理論的予測
コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌に関する代謝経路ネットワークの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムネットワーク。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の基本的代謝経路ネットワークは、炭素および硫黄供給源としての、それぞれ、グルコースおよびスルフェートの利用に関して構成された（http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html）。これには、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によるグルコースの取り込み、解糖（ＥＭＰ）、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、補充経路および呼吸鎖が含まれる。スルフェートの同化には、取り込みおよびその後の硫化水素への変換が含まれる（Schiff (1979), Ciba Found Symp, 72,49-69）。化学量論モデルでは、硫酸同化経路を以下の２反応にまとめた：スルフェートからスルファイトへの還元（２つのＡＴＰおよび１つのＮＡＤＰＨを必要とする）およびスルファイトからスルフィドへの還元（３つのＮＡＤＰＨを要求する）。モデル全体は５９の内因的代謝産物および８の外因的代謝産物から構成された。外因的代謝産物には、基質（グルコース、スルフェート、アンモニア、酸素）および生成物（バイオマス、ＣＯ_２、メチオニン、グリシン）が含まれる。グリシンは外因的代謝産物とみなした。その理由は、副産物として形成されると、コリネバクテリウムが再利用できないからである（http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html）。全部で、該代謝経路ネットワークは６２の代謝反応を含有し、そのうち１９の反応が可逆的であるとみなされた。呼吸鎖におけるＡＴＰ生産に関して、２（ＮＡＤＨについて）および１（ＦＡＤＨについて）のＰ／Ｏ比を仮定した（Klapa et al. (2003) Eur. J. Biochem., 27017, 3525-3542）。バイオマス形成のための前駆体需要は文献から入手した（Marx et al. (1996) Biotechnol. Bioeng., 49 (2), 111-129）。バイオマス中の種々のアミノ酸の含量からバイオマスのためのスルフェートおよびアンモニア需要を算出した。コリネバクテリウム・グルタミカムに関するモデルを図１に示す。

大腸菌ネットワーク。野生型の大腸菌の中枢代謝に関するモデル構築は、文献（Carlson et al. (2004), Biotechnol. Bioeng., 851, 1-19）およびデータベース（http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html）に基づいて行った。グルコースおよびスルフェートでの増殖およびメチオニン生産に関するモデルは、ＰＴＳのグルコース取り込み、ＥＭＰ、ＰＰＰ、ＴＣＡ回路、補充経路、呼吸鎖および硫酸同化を含んでいた。該代謝経路ネットワークは６４の代謝反応を含有し、そのうち２０の反応が可逆的であるとみなされた。グルコース、スルフェート、アンモニアおよび酸素を外因的基質とみなし、バイオマス、ＣＯ_２およびメチオニンを外部生成物とみなした。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの相互変換に関しては、可逆的トランスヒドロゲナーゼを考慮した（Yamaguchi et a. (1995), J. Biol. Chem., 27028, 166653-9）。さらに、大腸菌がアセチル化の代わりにスクシニル化によってホモセリンを活性化することを考慮した（Ｒ４０）（Sekowska et al. (2000) , J. Mol. Micorbiol. Biotechnol., 22, 145-177）。さらに、グリシン切断系を考慮した（Ｒ７１，Ｒ７２）。呼吸鎖におけるＡＴＰ生産に関して、２（ＮＡＤＨについて）および１（ＦＡＤＨについて）のＰ／Ｏ比を仮定した（Carlson et al. (2004), 上記参照のこと）。バイオマス形成のための前駆体需要は文献から入手した（Edwards et al. (2000); Weber et al., (2002)）。

ネットワーク改変。別のシミュレーションでは、上記化学量論ネットワークを改変した。この改変には、メチオニン生産を改善するために潜在的に重要な、種々の反応および経路の欠失または挿入が含まれた。さらに、炭素および硫黄供給源を変更して、メチオニン生産に対するその影響を調査した。

代謝経路解析。代謝経路解析はＭＥＴＡＴＯＯＬを使用して実行した（Pfeiffer et al., (1999), Bioinformatics, 153, 251-7, Schuster et al. (1999) Trends Biotechnol., 172, 53-60）。使用されたバージョン（meta4.0.1_double.exe）はインターネットで入手可能である（http://www.biozentrum.uni-wuerzburg.de/bioinformatik/computing/ metatool/pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/）。該アルゴリズムの数学的詳細はPfeiffer et al.（上記参照のこと）に記載されている。該文献は、ＭＥＴＡＴＯＯＬソフトウェアの使用法に関して、参照により本明細書中に組み入れられる。

代謝経路解析から、調査対象の各状況に関して数百のエレメンタリー・フラックスモードが得られた。これらのフラックスモードの各々に関して、バイオマス（Ｙ_Ｘ／Ｓ）およびメチオニン（Ｙ_{Ｍｅｔ／Ｓ}）の炭素収率を、基質として系に入った炭素のパーセンテージとして算出した。作業全体を通して、該収率は％値（（Ｃ−ｍｏｌ）（Ｃ−ｍｏｌ基質）^−１×１００）単位で記載する。したがって、補基質、例えばギ酸またはメタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドをさらに考慮した。特定のネットワークシナリオに関して取得されたすべてのエレメンタリーモード（elementary mode）の比較解析によって、理論的最大収率Ｙ_{Ｘ／Ｓ，ｍａｘ}およびＹ_{Ｍｅｔ／Ｓ，ｍａｘ}を決定することができた。

モデルについての結果および考察（Implications）
コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌によるメチオニン生産の比較
メチオニンの生物工学的生産に関して最も有望な２種類の生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌である。これらの２種類の生物の潜在能力を評価するために、上記のように代謝経路解析を実行した。

最初に、野生型ネットワークを調査した。コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌の野生型に関して示されるように、バイオマスおよびメチオニンに関して異なる炭素収率を有する多数のエレメンタリー・フラックスモードが得られた（図２Ａ，Ｂ）。観察されたモードのうちの大多数は、バイオマスまたはメチオニンのいずれかの生産にもっぱら関連しているエクストリーム・モード（extreme mode）である。これらを２軸のプロットで記載する。さらにまた、バイオマスおよびメチオニンの同時生産を伴うフラックスモードが得られた。コリネバクテリウム・グルタミカムに関する最大の理論的バイオマス収率は８８．５％であり、ゆえに大腸菌で認められた収率９１．７％よりわずかに低かった。両生物はメチオニンを生産する高い潜在能力を有する。コリネバクテリウム・グルタミカムのメチオニンに関する最大の理論的炭素収率は４８．６％であった（図２Ａ）。大腸菌はかなり高い値５６．２％を示す（図２Ｂ）。大腸菌野生型の高い潜在能力は、その代謝経路ネットワークの有利な特性を示すかもしれない。この側面については追加のシミュレーションで研究した（下記参照のこと）。

さらに厳密に調査すると、２つの反応、すなわちグリシン切断系およびトランスヒドロゲナーゼが指摘される。それらは向上したメチオニン生産に有益でありうる。実際、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型に関して認められる最適な解決策はグリシンの実質的形成に関連している。グリシンは再利用できないが、大腸菌野生型による最適なメチオニン生産では、グリシンは蓄積しない。メチオニンあたり８個のＮＡＤＰＨという高い需要に関して、大腸菌におけるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの相互変換に関するトランスヒドロゲナーゼの利用可能性も、観察された高い効率に寄与しうる。

メチオニン生産に関するこれらの反応の重要性をさらに調査するために、根底にある代謝経路ネットワークの種々の遺伝的改変を仮定する追加のシミュレーションを実行した（下記参照のこと）。

最適なメチオニン生産条件下でのコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌中の代謝流量
まず、どの利用可能な経路が最適なメチオニン生産に関与するか、およびどの経路が不必要であるはずかを特定するために、両生物の代謝経路ネットワークをさらに詳細に研究した。そのために、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌の最適なエレメンタリーモード、すなわち最大の理論的メチオニン収率を有するモードに関する代謝流量分布を算出した。ここで、すべての流量は相対的モル値として記載し、グルコース取り込み率に対して標準化されている（代謝流量解析において通常行われる通りである）。留意すべきは、流量（ｍｏｌ（ｍｏｌ）^−１×１００で与えられる）は最大パフォーマンスを記載するために使用される炭素収率（Ｃ−ｍｏｌ（Ｃ−ｍｏｌ）^−１×１００）とは異なることである。さらに、それぞれのモードで不活性であった基本モデルから得られる反応（図１）を図３および４から消去した。２種類の生物中の最適なメチオニン生産に関する流量分布は劇的に異なっていた（図３，４）。

コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるメチオニンへ向かう最適な流量は５８．３％であった。この目的で、コリネバクテリウム・グルタミカムはＰＰＰの非常に高い活性を示し、ＰＰＰの酸化反応を通る流量は２５０％であった。これは、おそらく、ＮＡＤＰＨの需要のせいである。メチオニン合成に関して、主に硫黄還元に関して、８個のＮＡＤＰＨを供給する必要があるからである。ＰＰＰへの流量はグルコースの取り込み流量より実質的に高い。糖新生方向で機能するグルコース６−リン酸イソメラーゼも、ＰＰＰへ向かう炭素の供給に大きく寄与する。ＴＣＡ回路は完全に遮断され、イソクエン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨ形成に寄与しないようになる。さらにコリネバクテリウム・グルタミカムは２つの重要な代謝回路を利用する。第一の回路には、アンモニウムを同化し、必要なアミノ化反応にそれを使用するために２−オキソグルタレートおよびグルタメートがのみを含み、それらは高い流量で相互変換される。メチオニン自体の形成およびメチル−ＴＨＦの形成のためのメチル基の供与体であるセリンの形成が行われるため、この回路を通る流量はメチオニン流量のちょうど２倍になる。第二の代謝回路はピルビン酸、オキサロ酢酸およびリンゴ酸のプールを含む。それは２つの主な機能を示す：酸化的ＰＰＰにおけるＣＯ_２減のほぼ半分はＣＯ_２の非常に活発な固定によって代謝経路ネットワークに再び入る（１２５％流量）。さらに、該回路に関与する３つの酵素の組み合わせはトランスヒドロゲナーゼとして機能し、ＮＡＤＨを相互変換してＮＡＤＰＨにする（２５％流量）。これによって、コリネバクテリウム・グルタミカムは、ある程度まで、トランスヒドロゲナーゼの不足を克服することができる。

大腸菌における最適なメチオニン生産では６７．５％のメチオニン流量が得られた。コリネバクテリウム・グルタミカムとは対照的に、ＰＰＰは活発でなく、一方、ＴＣＡ回路はほぼ１００％の高い流量を示した。しかし、ＴＣＡ回路は改変された様式で動作していた。スクシニル−ＣｏＡからコハク酸へのステップは、メチオニン生合成においてコハク酸を生成する対応する反応によってブリッジされる。興味深いことに、最適なメチオニン生産はグリオキシル酸短絡回路のかなりの活性を必要とした（３１％流量）。ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへのトランスヒドロゲナーゼを通る５７４％の莫大な流量が最も顕著である。このことは、大腸菌における効率的メチオニン生産に関するこの酵素の重要性を強調する。上記のように、この酵素が削除されると最大の理論的メチオニン収率がかなり低下する（図２Ｄ）。両生物において、ピルビン酸キナーゼは最適なメチオニン生産に不必要である。したがって、ＰＥＰからピルビン酸への流量はＰＴＳによってもっぱら提供され、グルコースの取り込みとカップリングされる。明らかに、ピルビン酸キナーゼはＡＴＰ生産に必要とされない。この酵素のノックアウトは興味深い標的でありうる。その理由は、それがピルビン酸およびＴＣＡ回路の関連する過剰代謝産物（related over-flow metabolites）に向かう流量を制限するかもしれないからである。

概して、２種類の生物の最適な流量分布は基本的に異なっていた。メチオニン合成に関するエレメンタリー・フラックスモード（elementary flux mode）解析を使用することによって、メチオニン合成効率を向上させるはずの遺伝的改変に関する予測を取得することができる。

遺伝的改変によるメチオニン生産の改善可能性
いくつかの重要な反応の影響をさらに詳細に研究するために、改変された代謝経路ネットワークを用いる追加のシミュレーションを実行した。コリネバクテリウム・グルタミカムにトランスヒドロゲナーゼを導入すると、５１．９％の向上した理論的メチオニン収率が得られた（図２Ｃ）。大腸菌におけるトランスヒドロゲナーゼのノックアウトはそのメチオニン生産に関する潜在能力を大きく低下させた（図２Ｄ）。このことは、メチオニン生産に関するＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへの活発な相互変換の有益な効果を強調する。

コリネバクテリウム・グルタミカムにグリシン切断系を挿入すると、理論的最大メチオニン収率が５６．５％に増加した（図２Ｅ）。同様に、大腸菌中のグリシン切断系またはトランスヒドロゲナーゼをノックアウトすると、理論的最大メチオニン収率が低減した（図２Ｆ，Ｄ）。留意すべきは、トランスヒドロゲナーゼは最大の理論的バイオマス収率にも影響することである。それぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムにおける挿入は増加を生じさせ、一方、大腸菌における欠失はＹ_{Ｘ／Ｓ，ｍａｘ}の減少を生じさせる。

炭素収率に関して、すべてのフラックスモードは三角形のスペース内に位置し、該スペースは、起点と、最大バイオマスおよびメチオニン形成をそれぞれ有する２つのエクストリーム・フラックスモードの間にわたっていた（図２Ａ〜Ｆ）。ここで、２つのエクストリーム・モード（extreme mode）の間の連結は最適なラインを表し、該ラインは種々の培養体制下で可能な最大メチオニン収率を提供する。このライン上のすべてのモードおよびモードの一次結合は生産プロセスに関する興味深い解決策である。実際の生産プロセスは、常に、特定のバイオマスの形成に関連しているであろう。

メチオニン生産に対する硫黄供給源の影響
遺伝的改変の潜在的に好ましい効果を明確に特定することができた。理論的に可能なメチオニン合成効率をさらに向上させるために追加のシミュレーションを実行した。この関連で、代替栄養素の影響を調査した。ここで、硫黄供給源は中心的役割を果たすかもしれない。コリネバクテリウム・グルタミカムに関して得られた結果を例示する。

慣用の硫黄供給源はスルフェートであり、野生型に関する上記経路解析においても適用される。しかし、硫酸同化は２つのＡＴＰおよび４つのＮＡＤＰＨの高い需要に関連している。特に、還元力に関する高い要求によって、硫黄供給源の還元状態が重要な点であるかもしれないことが示唆される。したがって、スルフェート、チオスルフェート、およびスルフィドを硫黄供給源として使用して代謝経路解析を実行した。チオスルフェートを利用するために、チオ硫酸レダクターゼ（Schmidt et al. (1984) 上記参照のこと, Heinzinger et al. (1995) J. Bacteriol., 177: 2813-2820, Fong et al. (1993) J. Bacteriol., 175: 6368-6371）をモデルに組み込んだ。この酵素は、チオスルフェートを切断してスルファイトおよびスルフィドにすることを可能にし、ゆえにメチオニン生産に関するＮＡＤＰＨの総需要を約２５％低減させる。留意すべきは、本発明者らの知識の限りでは、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてチオスルフェートの両硫黄原子の消費が未だ示されていないことである。より還元型の硫黄からスルフィドを生成するための別の候補は、いわゆる嫌気的亜硫酸レダクターゼである（Huang et al. (1991) Journal of Bacteriology. 173(4):1544-53）。

硫黄供給源が生産プロセスの理論的炭素収率に関する重要な点であることが明らかになっている。スルフェート（図２Ａ）と比較して、代替の硫黄供給源を利用すると、最大理論的収率がかなり増加する（図３Ａ，Ｂ）。スルフェート（４８．６％）からチオスルフェート（５７．８％）からスルフィド（６３．４％）への増加は、メチオニン生産に代替の栄養素を使用する高い可能性を印象的に強調する。さらに、該増加は、最適なメチオニン生合成のための、還元力（ＮＡＤＰＨ）に関する高い重要性を実証する。コリネバクテリウム・グルタミカムでは、ＮＡＤＰＨは、大半は酸化的ＰＰＰにおいて生成され、ある程度はＴＣＡ回路においてＮＡＤＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼを用いて生成される。スルフェートでの培養中に、野生型は、直接的スルフヒドリル化（direct sulfydrylation）によって合成されるメチオニン１モルあたりＮＡＤＰＨ８モルを必要とし、かつトランススルフレーション（transsulfuration）経路によってＮＡＤＰＨ９モルを必要とする（Hwang et al. (2002), J. Bacteriol., 1845,1277-86）。チオスルフェートネットワークはメチオニン生産にＮＡＤＰＨ６モルを必要とし、ゆえに２５％少ない。スルフィドを消費するネットワークは、スルフェートに関して５０％のＮＡＤＰＨ需要しか必要としない。各２５％のＮＡＤＰＨ需要のこの段階的減少は、９．２％およびチオスルフェートの代わりにスルフィドを使用することによるほんの５．６％のＹ_{Ｍｅｔ／Ｓ，ｍａｘ}の段階的増加に関連している。このことは後のプロセス開発に重要でありうる。スルフィドが非常に有毒で、かつ揮発性であるからである。

メチオニン生産に対するＣ _１ 供給源の影響
コリネバクテリウム・グルタミカムのメチオニン生産に関する改善の主な標的はＣ_１代謝である。メチオニンの最適な生産は等モル量のグリシンの蓄積に関連している。グリシンは通常、再利用できない（図３）。示されるように、グリシン切断系の導入よってこれを克服しうる（図２Ｅ）。代案は、グルコースに加えてＣ_１炭素供給源の使用によってもたらされる。この関連で、ギ酸を調査した。それは代謝経路ネットワークの種々の拡張を含む。これには、多数の生物、例えばバシラスに関して報告されている（E.C. 6.3.4.3）ギ酸、ＡＴＰおよびＴＨＦからの１０−ホルミル−ＴＨＦの形成を触媒する酵素の組み込みが含まれた。さらに、１０−ホルミル−ＴＨＦからメチル−ＴＨＦへの変換の異なるステップを導入した。すべての反応を、１０−ホルミル−ＴＨＦをメチレン−ＴＨＦに変換する全体の反応において一緒にまとめた。該反応は１個のＮＡＤＰＨおよび１個のＮＡＤＨの酸化に関連している。ギ酸とグルコースの利用により、グルコースが単独で使用される状況と比較して、３．３％の最大理論的メチオニン収率のわずかな増加が生じた。さらに、ギ酸が供給された場合、グリシンはもはや蓄積しなかった。

メチオニン生産に対する、異なる硫黄およびＣ _１ 供給源の併用の影響
Ｃ_１供給源および硫黄供給源はともに生物工学的メチオニン生産における最大理論的炭素収率を最大にするために重要であることが上記で示された。したがって、Ｃ_１および硫黄供給源から得られる利益を組み合わせることができるかどうかを調べることが興味深いと思われた。この研究には、チオスルフェートおよびギ酸の組み合わせならびにスルフィドおよびギ酸の組み合わせが含まれた。チオスルフェートおよびギ酸の組み合わせでは、最大理論的炭素収率は６３．０％に増加した（図３Ｄ）。この収率は、依然としてスルフィド消化の最大理論収率よりわずかに低い（図３Ｂ）。しかし、スルフィドとは対照的に、ギ酸およびチオスルフェートは無害の化学物質であり、おそらくプロセスの安全性に関する努力の低減に結び付く。スルフィドおよびギ酸を併用すると６９．６％のＹ_{Ｍｅｔ／Ｓ，ｍａｘ}が得られた。これはスルフィド消費単独の最大理論収率より６．２％高い。

メチオニン生産に対する、硫黄およびＣ _１ 炭素の混合供給源としてのメタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドの影響
硫黄の還元を提供し、グリシン蓄積の問題を解決する興味深い可能性は、メタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドの供給によって提供される。コリネバクテリウム・グルタミカムは特定の条件下でメタンチオールを生産できることが知られている（Bonnarme et al. (2000), Appl. Environ. Microbiol., 6612, 5514-7）。本明細書中では、それはまた、メタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドを消費できると仮定する。上記生物、例えば非限定的にコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌は該二量体ジメチルジスルフィドをメタンチオールに分解できるとさらに仮定する。メタンチオールを用いるＯ−アセチル−ホモセリンの直接的メチルスルフヒドリル化を使用する推定の反応を該ネットワークに加えた。この新たに提案された反応はホモシステインをバイパスし、直接的メチオニンを生成する。メタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドを使用すると、メチオニンの最大理論収率が非常に増加し、８３．３％になった（図３Ｆ）。このことは、この基質が、潜在的に、生物工学的メチオニン生産に非常に有用であることを示す。硫黄代謝およびＭＴＨＦ形成に関与する経路はメチオニン生産に不必要であろう。大腸菌では、メタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドに対する最大理論的メチオニン収率は７１．４％であり、ゆえにコリネバクテリウム・グルタミカムと比較して実質的に低かった。その理由は、この生物におけるメチオニン生産のためのスクシニルＣｏＡ要求性である。これは、ＴＣＡ回路の高い活性および対応するＣＯ_２を介する炭素の減少を必要とする。コリネバクテリウム・グルタミカムと比較して、これらの条件下での大腸菌におけるＣＯ_２形成はほぼ２倍高い。最後に、最大理論収率は、メタンチオール代謝を含むコリネバクテリウム・グルタミカムモデルにトランスヒドロゲナーゼを組み込むことによってさらに改善されうる。これらの条件下で、コリネバクテリウム・グルタミカムはメタンチオールおよびその二量体であるジメチルジスルフィドおよびグルコースからメチオニンを生成することができ、最大炭素収率は８５．５％であろう。

ゆえに、上記解析では、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、特にグリシンまたは代替のメチル基供給源がメチオニン合成に使用されると、メチオニン生産を最適化するための重要な潜在能力が提供されることが示された。さらに、大腸菌におけるメチオニン合成が、コリネバクテリウム・グルタミカムより、活性なトランスヒドロゲナーゼに依存的であることが示されうる。

Ｂ）メチオニン合成効率を向上させるためのコリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝的改変
以下の実験の目標は、向上したメチオニン合成効率を有するコリネバクテリウム・グルタミカム生物を取得するために上記理論的知見の考察を適用することである。

材料および方法
一般的方法に関するプロトコルは以下の文献中に見出せる：Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005) eds.: L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press, Martin et al. (Biotechnology (1987) 5, 137-146 ), Guerrero et al. (Gene (1994), 138, 35-41), Tsuchiya und Morinaga (Biotechnology (1988), 6, 428-430), Eikmanns et al. (Gene (1991), 102, 93-98), EP 0 472 869, US 4,601,893, Schwarzer and Puehler (Biotechnology (1991), 9, 84-87, Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994), 60,126-132), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology (1993), 175, 1001-1007), WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene (1993), 134, 15-24), JP-A-10-229891, Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering (1998), 58,191-195), Makrides (Microbiological Reviews (1996), 60, 512-538) および遺伝学および分子生物学の周知の教科書。

菌株、培地およびプラスミド
例えば以下のリストから菌株を選択することができる：
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ １３０３２，
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ＡＴＣＣ １５８０６，
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ＡＴＣＣ １３８７０，
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９，
コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）ＡＴＣＣ １７９６５，
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＡＴＣＣ １４０６７，
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ＡＴＣＣ １３８６９，および
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ＡＴＣＣ １４０２０またはその派生株、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＫＦＣＣ１００６５
ＤＳＭ １７３２２または
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ２１６０８。

組換えＤＮＡ技術
プロトコルは以下の文献中に見出せる：Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3, およびHandbook on Corynebacterium glutamicum (2005) eds. L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press。

アミノ酸およびメチオニン中間体の定量
保護カートリッジおよびSynergi４μｍカラム（ＭＡＸ−ＲＰ ８０Å，１５０＊４．６ｍｍ）（Phenomenex, Aschaffenburg, Germany）を備えたＨＰＬＣ（Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Germany）による分析を行う。注入前に、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）および還元剤であるメルカプトエタノール（２−ＭＣＥ）を使用してアナライトを誘導体化する。さらにスルフヒドリル基をヨード酢酸でブロックする。極性相として４０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（溶出剤Ａ，ｐＨ＝７．８，ＮａＯＨで調整）および非極性相としてメタノール水混合物（１００／１）（溶出剤Ｂ）を使用して流速１ｍｌ／分で分離を実行する。以下のグラジエントをアプライする：開始時 ０％ Ｂ；３９分 ３９％ Ｂ；７０分 ６４％ Ｂ；１００％ Ｂ ３．５分間；２分 ０％ Ｂ（平衡化）。室温での誘導体化は下記のように自動化する。まずビシン（bicine）（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）中の０．５％ ２−ＭＣＥ０．５μｌを細胞抽出物０．５μｌと混合する。続いて、ビシン（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）中の５０ｍｇ／ｍｌヨード酢酸１．５μｌを加えた後、ビシンバッファー（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）２．５μｌを加える。１／４５／５４ ｖ／ｖ／ｖの２−ＭＣＥ／ＭｅＯＨ／ビシン（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）に溶解した１０ｍｇ／ｍｌ ＯＰＡ試薬０．５μｌを加えることによって誘導体化を行う。最後に混合物を３２μｌ Ｈ_２Ｏで希釈する。上記各ピペッティングステップの間に、１分間の待ち時間を設ける。そして、３７．５μｌの総容量をカラムに注入する。留意すべきは、サンプル調製中（例えば待ち時間中）およびその後にオートサンプラーの針を定期的に掃除すれば、分析結果を大きく改善できることである。検出は蛍光検出器によって実施する（励起３４０ｎｍ，発光４５０ｎｍ，Agilent, Waldbronn, Germany）。定量に関して、α−アミノ酪酸（ＡＢＡ）を内部標準とする。

組換えプロトコルの定義
以下、どのように、向上したメチオニン生産効率を有するコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株を構築して、上記予測の知見を実現することができるかを記載する。該菌株の構築を記載する前に、以下で使用される組換えイベント／プロトコルの定義を挙げる。

本明細書中で使用される「Campbell in」とは、環状二本鎖ＤＮＡ分子（例えばプラスミド）全体が単一の相同組換えイベント（クロスインイベント）によって染色体に組み込まれていて、直線化形式の該環状ＤＮＡ分子が、該環状ＤＮＡ分子の第一のＤＮＡ配列に相同的な染色体の第一のＤＮＡ配列に効果的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体を表す。「Campbelled in」とは、「Campbell in」形質転換体の染色体に組み込まれている直線化ＤＮＡ配列を表す。「Campbell in」は、第一の相同ＤＮＡ配列の重複を含有し、その各コピーは相同組換え交差点のコピーを含み、かつ取り巻く。該名称は、この種類の組換えを最初に提唱したAlan Campbell教授に由来する。

本明細書中で使用される「Campbell out」とは、「Campbelled in」ＤＮＡの直線化挿入済みＤＮＡ上に含有される第二のＤＮＡ配列と、該直線化インサートの第二のＤＮＡ配列と相同である染色体起点の第二のＤＮＡ配列との間で第二の相同組換えイベント（クロスアウトイベント）が生じている「Campbell in」形質転換体に由来する細胞を表し、該第二の組換えイベントは組み込み済みＤＮＡ配列の一部分の欠失（放棄）を生じさせるが、重要なことに、染色体中に残留する組み込み済みCampbelled in ＤＮＡの一部分（これはわずか一塩基でもよい）を同時に生じさせ、元の宿主細胞と比較して、「Campbell out」細胞が染色体中に１以上の意図的な変化を含有するようにする（例えば、一塩基置換、多塩基置換、異種遺伝子またはＤＮＡ配列の挿入、異種遺伝子または改変された相同遺伝子の追加コピーもしくはコピー群の挿入、または２以上の上記で列挙されるこれらの前述の例を含むＤＮＡ配列の挿入）。

「Campbell out」細胞または菌株は、通常、必ずしもではないが、「Campbelled in」ＤＮＡ配列の一部分（放棄されることが望ましい部分）に含有される遺伝子、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）ｓａｃＢ遺伝子（約５％〜１０％スクロースの存在下で培養された細胞で発現されると致死である）に対する対抗選択によって取得される。対抗選択を用いても用いなくても、所望の「Campbell out」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型を使用して所望の細胞に関してスクリーニングすることによって取得または特定することができ、該スクリーニング可能な表現型は、例えば、非限定的に、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在または不存在、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく特定のＤＮＡ配列の存在または不存在、栄養素要求性の存在または不存在、酵素の存在または不存在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニング、等である。用語「Campbell in」および「Campbell out」は、上記方法またはプロセスを表すために動詞として種々の時制で使用することもできる。

「Campbell in」または「Campbell out」を生じさせる相同組換えイベントが相同ＤＮＡ配列内の一定範囲のＤＮＡ塩基にわたって生じうること、および該相同配列はこの範囲の少なくとも一部分に関して互いに同一であるから、通常、クロスオーバーイベントが生じた位置を正確に特定することは可能でないことが理解される。換言すれば、どの配列が元々挿入ＤＮＡ由来であり、どの配列が元々染色体ＤＮＡ由来であったかを正確に特定することは可能でない。さらに、第一の相同ＤＮＡ配列および第二の相同ＤＮＡ配列は、通常、部分的に非相同性の領域によって分離され、「Campbell out」細胞の染色体中に残ったままになるのはこの非相同性の領域である。

実用性に関して、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、典型的に第一および第二の相同ＤＮＡ配列は少なくとも約２００塩基対の長さであり、数千塩基対までの長さであってよいが、該手順はもっと短いか、あるいはもっと長い配列に関しても機能するようにすることができる。例えば、第一および第二の相同配列の長さは約５００〜２０００塩基の範囲であってよく、「Campbell in」からの「Campbell out」の取得は、第一および第二の相同配列がほぼ同一の長さであり、好ましくは差異が２００塩基対未満あり、最も好ましくは２配列のうちの短い方が長い方の塩基対の長さの少なくとも７０％であるように設計することによって促進される。

メチオニン産生株の構築
実施例１：メチオニン産生出発株であるＭ２０１４株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカム株ＡＴＣＣ １３０３２をＤＮＡ Ａ（ｐＨ２７３とも称される）（配列番号１）で形質転換し、「Campbelled in」して「Campbell in」株を得た。図６はプラスミドｐＨ２７３の模式図を示す。そして「Campbell in」株を「Campbelled out」して、「Campbell out」株Ｍ４４０を得た。該株はフィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素（ｈｏｍ^ｆｂｒ）をコードする遺伝子を含有する。得られたホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質は、Ｓ３９３がＦ３９３に変化しているアミノ酸変化を含んでいた（Ｈｓｄｈ Ｓ３９３Ｆと称される）。

次いでＤＮＡ Ｂ（ｐＨ３７３とも称される）（配列番号２）でＭ４４０株を形質転換して、「Campbell in」株を得た。図６はプラスミドｐＨ３７３の模式図を記載する。そして「Campbell in」株を「Campbelled out」して、「Campbell out」株Ｍ６０３を得た。該株はフィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ酵素（Ａｓｋ^ｆｂｒ）（ｌｙｓＣによってコードされる）をコードする遺伝子を含有する。得られたアスパラギン酸キナーゼタンパク質では、Ｔ３１１がＩ３１１に変化していた（ＬｙｓＣ Ｔ３１１Ｉと称される）。

Ｍ６０３株は約１７．４ｍＭのリシンを生成したが、ＡＴＣＣ１３０３２株は測定可能な量のリシンを生成しなかったことが分かった。さらに、ＡＴＣＣ１３０３２株によっては測定可能な量が生成されないのに比べて、Ｍ６０３株は約０．５ｍＭのホモセリンを生成した。それを表３にまとめる。

ＤＮＡ Ｃ（ｐＨ３０４とも称され、その模式図は図６に記載される）（配列番号３）によってＭ６０３株を形質転換して、「Campbell in」株を得た。そして該株を「Campbelled out」して、「Campbell out」株であるＭ６９０を得た。Ｍ６９０株はｍｅｔＨ遺伝子の上流のＰｇｒｏＥＳプロモーター（Ｐ_４９７ ｍｅｔＨと称される）を含有していた。Ｐ_４９７プロモーターの配列は配列番号１１に記載される。Ｍ６９０株は約７７．２ｍＭのリシンおよび約４１．６ｍＭのホモセリンを生成した。それを以下の表４に示す。

次いでＭ６９０株を以下のように突然変異させた：ＢＨＩ培地（BECTON DICKINSON）中で培養したＭ６９０の一晩培養を５０ｍＭクエン酸バッファーｐＨ５．５で洗浄し、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（５０ｍＭクエン酸ｐＨ５．５中１０ｍｇ／ｍｌ）で３０℃で２０分間処理した。処理後、細胞を５０ｍＭクエン酸バッファーｐＨ５．５で再洗浄し、以下の成分を含有する培地にプレートした：（すべての記述される量は５００ｍｌ培地に関して算出される）１０ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４；０．５ｇのＫ_２ＨＰＯ_４；０．１２５ｇのＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ；２１ｇのＭＯＰＳ；５０ｍｇのＣａＣｌ_２；１５ｍｇのプロトカテク酸；０．５ｍｇのビオチン；１ｍｇのチアミン；および５ｇ／ｌのＤ，Ｌ−エチオニン（SIGMA CHEMICALS, CATALOG #E5139）（ＫＯＨでｐＨ７．０に調整）。さらに、培地は以下の成分から構成される０．５ｍｌの微量金属溶液を含有していた：１０ｇ／ｌのＦｅＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ；１ｇ／ｌのＭｎＳＯ_４＊Ｈ_２Ｏ；０．１ｇ／ｌのＺｎＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ；０．０２ｇ／ｌのＣｕＳＯ_４；および０．００２ｇ／ｌのＮｉＣｌ_２＊６Ｈ_２Ｏ（すべて０．１Ｍ ＨＣｌ中に溶解）。最終的な培地をろ過によって滅菌し、該培地に、４０ｍｌの滅菌５０％グルコース溶液（４０ｍｌ）および滅菌寒天を１．５％の終濃度まで加えた。該最終の寒天含有培地を寒天プレートに注ぎ、最少エチオニン培地とラベルした。突然変異株をプレート（最少エチオニン）にまき、３０℃で３〜７日間インキュベートした。培地上で生育したクローンを単離し、同一の最少エチオニン培地上に再ストリークした。メチオニン生産解析のために数個のクローンを選択した。

メチオニン生産を以下のように分析した。菌株を３０℃で２日間ＣＭ寒天培地上で培養した。該培地は、１０ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、２．５ｇ／ｌ ＮａＣｌ；２ｇ／ｌ 尿素；１０ｇ／ｌ バクトペプトン（DIFCO）；５ｇ／ｌ 酵母抽出物（DIFCO）；５ｇ／ｌ ビーフエキス（DIFCO）；２２ｇ／ｌ 寒天（DIFCO）を含有していて、約１２１℃で２０分間オートクレーブされた。

菌株の培養後、細胞をかき取り、０．１５Ｍ ＮａＣｌに再懸濁した。本培養では、かき取った細胞の懸濁液を、０．５ｇの固形のオートクレーブ済みＣａＣＯ_３（RIEDEL DE HAEN）とともに、約１．５までの出発ＯＤ６００ｎｍで１０ｍｌの培地ＩＩ（下記参照のこと）に加え、該細胞を、軌道振とうプラットホーム（orbital shaking platform）（約２００ｒｐｍ，３０℃）上、１００ｍｌ振とうフラスコ（バッフルなし）中で７２時間インキュベートした。培地ＩＩは、４０ｇ／ｌ スクロース；６０ｇ／ｌ 全糖（糖蜜由来）（糖分に関して算出）；１０ｇ／ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；０．４ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ；０．６ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４；０．３ｍｇ／ｌ チアミン＊ＨＣｌ；１ｍｇ／ｌ ビオチン；２ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ_４；および２ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ_４を含んでいた。該培地をＮＨ_４ＯＨでｐＨ７．８に調整し、約１２１℃で約２０分間オートクレーブした。オートクレーブおよび冷却後、ろ過滅菌ストック溶液（２００μｇ／ｍｌ）からビタミンＢ_１２（シアノコバラミン）（SIGMA CHEMICALS）を加えて、終濃度１００μｇ／ｌにした。

サンプルを培地から採取し、アミノ酸含量に関してアッセイした。Agilent 1100 Series LC System HPLC（AGILENT）でAgilentアミノ酸法を使用して、生成アミノ酸（メチオニンを含む）を測定した。サンプルをオルト−フタルアルデヒド（ortho-pthalaldehyde）でプレカラム誘導体化すると、Hypersil AA-column（AGILENT）での分離後に、生成アミノ酸の定量が可能になった。

Ｍ６９０の少なくとも２倍のメチオニン力価を示したクローンを単離した。追加の実験で使用されるそのような１クローンはＭ１１９７と命名され、２００５年５月１８日にＤＳＭＺ strain collectionに菌株番号ＤＳＭ １７３２２として寄託された。この菌株によるアミノ酸生産をＭ６９０株による生産と比較した。それを以下の表５にまとめる。

ＤＮＡ Ｆ（ｐＨ３９９とも称され、その模式図は図７に記載される）（配列番号４）によってＭ１１９７株を形質転換して、「Campbell in」株を得た。次いで該株を「Campbelled out」してＭ１４９４株を得た。この菌株はホモセリンキナーゼの遺伝子中に突然変異を含有する。該突然変異は、得られるホモセリンキナーゼ酵素にＴ１９０からＡ１９０へのアミノ酸変化を生じさせる（ＨｓｋＴ１９０Ａと称される）。Ｍ１４９４株によるアミノ酸生産をＭ１１９７株による生産と比較した。それを以下の表６にまとめる。

ＤＮＡ Ｄ（ｐＨ４８４とも称され、その模式図は図７に示される）（配列番号５）によってＭ１４９４株を形質転換して、「Campbell in」株を得た。次いで該株を「Campbelled out」してＭ１９９０株を得た。Ｍ１９９０株は、ｇｒｏＥＳプロモーターおよびＥＦＴＵ（伸長因子Ｔｕ）プロモーターの両者を使用してｍｅｔＹ対立遺伝子を過剰発現する（Ｐ_４９７ Ｐ_１２８４ ｍｅｔＹと称される）。Ｐ_４９７ Ｐ_１２８４の配列は配列番号１３に記載される。Ｍ１４９４株によるアミノ酸生産をＭ１９９０株による生産と比較した。それを以下の表７にまとめる。

ＤＮＡ Ｅ（ｐＨ４９１とも称され、その模式図は図７に記載される）（配列番号６）によってＭ１９９０株を形質転換して、「Campbell in」株を得た。そして該株を「Campbelled out」して、「Campbell out」株であるＭ２０１４を得た。Ｍ２０１４株はスーパーオキシドジスムターゼプロモーターを使用してｍｅｔＡ対立遺伝子を過剰発現する（Ｐ_３１１９ ｍｅｔＡと称される）。Ｐ_３１１９の配列は配列番号１２に記載される。Ｍ２０１４株によるアミノ酸生産をＭ１９９０株による生産と比較した。それを以下の表８にまとめる。

実施例２：振とうフラスコ実験およびＨＰＬＣアッセイ
標準糖蜜培地を用いる振とうフラスコ実験を二重または四重で菌株で実施した。糖蜜培地は１リットルの培地中に以下の成分を含有していた：４０ｇ グルコース；６０ｇ 糖蜜；２０ｇ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；０．４ｇ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ；０．６ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４；１０ｇ 酵母抽出物（DIFCO）;５ｍｌの４００ｍＭスレオニン；２ｍｇ ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ；２ｍｇのＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ；および５０ｇ ＣａＣＯ_３（Riedel-de Haen）（ｄｄＨ_２Ｏで容量を補う）。２０％ ＮＨ_４ＯＨでｐＨを７．８に調整し、２０ｍｌの連続撹拌培地（ＣａＣＯ_３を懸濁状態で維持するため）を２５０ｍｌバッフル付きBellco振とうフラスコに加え、該フラスコを２０分間オートクレーブした。オートクレーブ後、基本培地１リットルあたり４ｍｌの「４Ｂ溶液」を加えた（または８０μｌ／フラスコ）。「４Ｂ溶液」は、１リットルあたり、０．２５ｇの塩酸チアミン（ビタミンＢ１）、５０ｍｇのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、２５ｍｇ ビオチン、１．２５ｇ 塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）を含有していた。ビオチンを溶解するために該溶液を１２．５ｍＭ ＫＰＯ_４，ｐＨ７．０で緩衝化し、ろ過滅菌した。New Brunswick Scientificフロアシェーカー中２００または３００ｒｐｍで、ゴムバンドで保護されたBioshieldペーパーでカバーされたバッフル付きフラスコ中で、２８℃または３０℃で４８時間、培養物を増殖させた。２４時間および／または４８時間でサンプルを採取した。遠心分離によって細胞を除去し、次いで上清を等容量の６０％アセトニトリルで希釈し、そしてCentricon ０．４５μｍスピンカラムを使用して溶液をメンブレンろ過した。ＨＰＬＣを使用して、メチオニン、グリシンおよびホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、スレオニン、イソロイシン、リシン、および他の指定アミノ酸の濃度に関してろ液をアッセイした。

ＨＰＬＣアッセイでは、ろ過済み上清を０．４５μｍろ過済み１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡで１：１００に希釈し、１μｌの該溶液をホウ酸バッファー（８０ｍＭ ＮａＢＯ_３、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．２）中のＯＰＡ試薬（AGILENT）で誘導体化し、２００×４．１ｍｍのHypersil 5μ AA-ODSカラムに注入し、G1321A蛍光検出器を備えたAgilent 1100 series HPLC（AGILENT）上で分析した。励起波長は３３８ｎｍであり、モニター対象の発光波長は４２５ｎｍであった。アミノ酸標準溶液をクロマトグラフし、それを使用して、種々のアミノ酸の保持時間および標準ピーク領域を測定した。Agilentによって提供される添付ソフトウェアパッケージであるChem Stationを、機器コントロール、データ収集およびデータ操作に使用した。ハードウェアはMicrosoft Windows NT 4.0（Microsoft Service Pack (SP6a)でアップデート）をサポートするHP Pentium 4コンピュータであった。

実施例３：脱調節された硫酸還元経路を含有する微生物の作製
プラスミドｐＯＭ４２３（配列番号７）を使用して、脱調節された硫酸還元経路を含有する菌株を作製した。具体的には、大腸菌ファージλＰ_ＬおよびＰ_Ｒ分岐プロモーター（divergent promoter）構築物を使用して、生来型硫酸還元レギュロン分岐プロモーターを置き換えた。Ｍ２０１４株をｐＯＭ４２３で形質転換し、カナマイシン耐性に関して選択した（Campbell in）。ｓａｃＢ対抗選択に続いて、形質転換体からカナマイシン感受性誘導体を単離した（Campbell out）。次いでこれらをＰＣＲによって解析し、硫酸還元レギュロンのプロモーター構造を決定した。Ｐ_Ｌ−Ｐ_Ｒ分岐プロモーターを含有する単離体をＯＭ４２９と命名した。ＯＭ４２９の４つの単離体を、ＤＴＮＢストリップ検査を使用して硫酸還元に関してアッセイし、かつ振とうフラスコアッセイにおいてメチオニン生産に関してアッセイした。ＤＴＮＢストリップ検査を使用して相対的スルフィド生産を見積もるために、ろ紙のストリップをエルマン試薬（ＤＴＮＢ）の溶液に浸し、試験対象の菌株の振とうフラスコ培養上に４８時間つるした。増殖中の培養物によって生産された硫化水素はＤＴＮＢを還元し、Ｈ_２Ｓの生成量におおよそ比例して黄色を呈する。ゆえに、生じた色の強度を使用して、種々の菌株の相対的硫酸還元活性の概算を取得することができる。その結果（表１０）は、４単離体のうち２つが相対的に高レベルの硫酸還元を示したことを表す。これらの同じ２単離体はまた、最高レベルのメチオニンを生産した。標準糖蜜培地中で４８時間、培養物を増殖させた。

実験４：大腸菌グリシン切断（ｇｃｖ）オペロンを含有する菌株
グルコースからのメチオニン生合成に必要なＧｌｙＡ酵素（Ｒ３８）を介する、セリンからのメチレンテトラヒドロ葉酸の生産は、同時に、副産物としてグリシンを生じさせる。メチオニン過剰産生株では、グリシンの生産量はタンパク質合成の必要量より過剰である。ゆえに、上記モデルにしたがって、コリネバクテリウム・グルタミカムにＧＣＳを含ませると、メチオニン合成効率が向上するはずであろう。

大腸菌および枯草菌では、グリシンがタンパク質合成の必要量より過剰に存在する場合、それはグリシン切断酵素系によって分解されて、第二の当量のメチレンテトラヒドロ葉酸が生じる。大腸菌では、グリシン切断系には４つの異なるタンパク質を含む。これらのうち３つはｇｃｖＴＨＰオペロンによってコードされる。第四のサブユニットはリポアミドデヒドロゲナーゼであり、マルチサブユニットピルビン酸デヒドロゲナーゼから援用される。コリネバクテリウム・グルタミカムはグリシン切断系を有さないと考えられる。コリネバクテリウム・グルタミカムは通常のマルチサブユニットピルビン酸デヒドロゲナーゼを実際有するが、大腸菌Ｇｃｖタンパク質のホモログはコリネバクテリウム・グルタミカムゲノム中に認められなかった。結果として、コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるメチオニン生産では、同時にグリシン生産が生じ、それは培養上清中に現れる。ゆえに、コリネバクテリウム・グルタミカムにＧＣＳを導入し、大腸菌および枯草菌で行われるようにグリシンをメチレンテトラヒドロ葉酸に再循環することを試みた。

この目標に向けての第一ステップとして、大腸菌ｇｃｖＴＨＰオペロンを、その生来型のプロモーターを用いずにＰＣＲによって増幅し、ｐＯＭ２１８中のＰ_４９７プロモーターの下流にクローニングした。ｐＯＭ２１８は、コリネバクテリウム・グルタミカム中のｂｉｏＢ位置に発現カセットを組み込むように設計された低コピーの大腸菌ベクターである。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ由来の必要な第四のサブユニットは、宿主生物コリネバクテリウム・グルタミカムから供給できると仮定した。得られたプラスミドｐＯＭ２２９（図８，配列番号８）を出発生物であるＭ２０１４株に形質導入し、うまくCampbelled outして、ＯＭ２１２と命名される菌株を得た。そしてこれらの菌株を培養した。

以下の培地を使用した：４０ｇ／ｌ グルコース，６０ｇ／ｌ 糖蜜（糖分４５％），１０ｇ／ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，０．４ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ，２ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ_４，２ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ_４，１．０ｍｇ／ｌ チアミン，１ｍｇ／ｌ ビオチン。３０％ ＮＨ_４ＯＨでｐＨをｐＨ７．８に調整し、培地を２０分間オートクレーブした。オートクレーブ後、培地２０ｍｌあたり２００Ｍｇ／ｌ Ｂ１２，２ｍＭ Ｌ−スレオニン，２ｍｌの０．５ｇ／ｍｌ ＣａＣＯ_３を加えた。リン酸バッファーｐＨ７．２を、２Ｍストック溶液から２００ｍＭまで加えた。

振とうフラスコ培養において、上で説明されるように１つの単離体ＯＭ２１２−１を分析した。メチオニン生産の増加およびグリシンおよびホモセリンの減少を表す結果を表１１に示す。

Ｍ２０１４株の炭素収率は０．０１０３Ｍｏｌメチオニン／糖１ｍｏｌであり、ＯＭ２１２−１株は０．０１１Ｍｏｌメチオニン／糖１ｍｏｌの炭素収率を有することが観察された。

別の実施形態では、リポアミドデヒドロゲナーゼをコードするｌｐｄＡ遺伝子（配列番号１０）である、ｇｃｖＴＨＰオペロンによってコードされないグリシン切断系のサブユニットを、宿主である大腸菌からクローニングする。該遺伝子をその天然のプロモーターを用いずに増幅し、Ｐ_４９７プロモーターを代わりに加える。得られた断片を、ｇｃｖＴＨＰオペロンに加えて、大腸菌コリネバクテリウム・グルタミカムシャトルベクターｐＯＭ２２９にクローニングする。

実験５：機能的グリシン切断系に関するｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
コリネバクテリウム・グルタミカムｓｅｒＡ遺伝子をＰＣＲによって作製し、Ｓｗａ ＩギャップｐＣ ＩＮＴにクローニングして、プラスミドｐＯＭ２３８を得た。次いで、コリネバクテリウム・グルタミカムＰ４９７から発現されたグラム陽性スペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐｃ）を含有する平滑末端断片をＡｌｅ ＩギャップｐＯＭ２３８にライゲーションした。ｓｐｃ遺伝子をｓｅｒＡと同一方向で含有していた単離体をｐＯＭ２５３と命名した（図９，配列番号９を参照のこと）。ｐＯＭ２５３を使用して、任意のコリネバクテリウム・グルタミカム株のｓｅｒＡ遺伝子中の中断−欠失を作製することができる。

ｐＯＭ２５３をコリネバクテリウム・グルタミカムＭ２０１４株に形質導入し、カナマイシン耐性に関して選択し、「Campbelled in」ＯＭ２６４Ｋ株を得た。スクロース耐性（ＢＨＩ＋５％スクロース）およびスペクチノマイシン耐性（ＢＨＩ＋１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシン）によって選択することによってＯＭ２６４Ｋを「Campbelled out」して、ＯＭ２６４株を得た。該株は、セリン、スレオニン、およびビオチン栄養要求体である。

ＯＭ２６４株を、プラスミドｐＯＭ２２９、またはグリシン切断経路（Ｇｃｖ）を供給する別のプラスミド（またはプラスミド群）で形質転換することができる。グリシン切断経路が活性である場合、得られたｓｅｒＡ⁻，Ｇｃｖ^＋株は、グリシン、スレオニン、およびビオチンを含有する最少培地で増殖することができる。その理由は、メチレンテトラヒドロ葉酸はグリシン切断系によって生成され、ｇｌｙＡ遺伝子産物であるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）は、グリシンおよびメチレンテトラヒドロ葉酸（methylene tetrahydrofolage）を基質として使用してＳＨＭＴ反応を逆方向で実行することによってセリンを生成できるからである。

必要であれば、リポアミドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、例えば大腸菌由来のｌｐｄ遺伝子（ｌｐｄＡとも称される；配列番号１０）をクローニングし、上記株に形質導入して、グリシン切断系に必要な第四のサブユニットを供給することができる。大腸菌以外の生物由来のグリシン切断系をコードする遺伝子をＰＣＲまたは相補性によって上記のようにクローニングし、それを使用してコリネバクテリウム・グルタミカムに機能的グリシン切断系を供給することもできる。例えば、枯草菌遺伝子、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰＡ、ｇｃｖＰＢ、ｇｃｖＴおよびｐｄｈＤ（これらはグリシン切断系の５サブユニットをコードする（グリシンデカルボキシラーゼは枯草菌では２サブユニットから構成され、それらはｇｃｖＰＡおよびｇｃｖＰＢによってコードされ、大腸菌では、これらの２機能は、ｇｃｖＰによってコードされる１サブユニットにまとめられている））、または任意の他の好適な遺伝子のセットを使用しうる。唯一の要件は、該系が、コリネバクテリウム・グルタミカム中で、過剰のグリシン（メチオニン生合成の結果として生産される）をメチレンテトラヒドロ葉酸に変換するために十分なレベルで機能することである。

実験６：コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるピルビン酸キナーゼのノックアウト
エレメンタリーモード解析では、ピルビン酸キナーゼ（Ｒ１９）のダウンレギュレーションによってメチオニン合成効率が向上することが示された（例えば図３を参照のこと）。

ピルビン酸キナーゼノックアウトの影響を調査するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのリシン産生株を分析した。リシン生産の増加が実際に観察されれば、このことは同時にメチオニン合成の増加を示しているはずである。リシンの形成は、アスパラギン酸、アスパラギン酸リン酸、等の形成によって先行されるからである。リシン生産の増加は、したがって、例えばアスパラギン酸の増加によって先行されるはずである。アスパラギン酸はメチオニン生産の前駆体の１つでもあるため、アスパラギン酸の量が増加すると、メチオニン合成も増加するはずである。

コリネバクテリウム・グルタミカムｌｙｓＣ^ｆｂｒとコリネバクテリウム・グルタミカムｌｙｓＣ^ｆｂｒ Δｐｙｋの菌株比較を実行した。コリネバクテリウム・グルタミカムｌｙｓＣ^ｆｂｒは、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子中に点突然変異を保持する突然変異体である（Kalinowski et al. (1991), Mol. Microbiol. 5(5), 1197-1204）。そしてこの菌株をピルビン酸キナーゼの欠失に使用した（コリネバクテリウム・グルタミカムｌｙｓＣ^ｆｂｒ Δｐｙｋ）。

振とうフラスコ中で最少培地で両株を培養し、バイオマス、リシンおよび副産物に関する炭素収率を測定した。２回の独立した実験の平均値に基づいて、ピルビン酸キナーゼノックアウトに関するリシン収率が７．５〜１２．１％に増加することが観察された。これは約６２％の増加に相当する。

結論として、ピルビン酸キナーゼノックアウトはリシンの合成を増加させ、対応してメチオニン合成も増加させるはずである。しかし、メチオニンを生産するためのピルビン酸キナーゼノックアウトの使用が、メチオニン合成を増加させるとは予測されていなかった。この代謝経路ネットワークについての一般的な知識を考慮すれば、メチオニン自体が活性なピルビン酸キナーゼに依存するからである。

実験７ 異なる硫黄供給源の使用における取り込みの比較
エレメンタリーモード解析では、驚くべきことに、メチオニン合成効率が硫黄供給源の還元状態に依存することが示されている。上記で説明したように、それぞれの節約された（saved）ＮＡＤＰＨに関して、メチオニン合成効率の４．６％の増加が予測される。しかし、これまで、コリネバクテリウム・グルタミカムによる異なる硫黄供給源の使用および増殖に関して、予備的かつ不完全なデータしか存在しない。

異なる炭素供給源でのコリネバクテリウム・グルタミカムの培養が、実際に、メチオニン合成効率のレベルを増加させるかどうかを試験するために、以下の実験を実施した。

コリネバクテリウム・グルタミカム野生型株およびΔｍｃｂＲ突然変異体を振とうフラスコ中でスルフェートおよびチオスルフェートで培養した。そのために、等モル濃度の対応する硫黄供給源を、硫黄を含まないＣＧ１２ １／２最少培地に加えた。

ＣＧ１２ １／２培地（Medien）は１リットルあたり以下の成分を含む：２０ｇ グルコース，１６ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４，４ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４，２０ｇ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，３００ｍｇ ３．４−ジヒドロキシ安息香酸（3.4-dihydroxy benzo acid），１０ｍｇ ＣａＣｌ_２，２５０ｍｇ ＭｇＳＯ_４ ７Ｈ_２Ｏ，１０ｍｇ ＦｅＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ，１０ｍｇ ＭｎＳＯ_４＊Ｈ_２Ｏ，２ｍｇ ＺｎＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ，２００μｇ ＣｕＳＯ_４＊５Ｈ_２Ｏ，２０μｇ ＮｉＣｌ_２＊６Ｈ_２Ｏ，２０μｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４＊２Ｈ_２Ｏ，１００μｇ シアノコバラミン（ビタミンＢ_１２），３００μｇ チアミン（ビタミンＢ_１），４μｇ ピリドキサルリン酸（ビタミンＢ_６）および１００μｇ ビオチン（ビタミンＢ_７）。

硫黄を含まないＣＧ１２ １／２培地の場合、すべてのスルフェートを塩素によって置き換え、該塩素は、対応するカチオンの濃度が変化しないような濃度で使用した。以下の塩を使用した：ＭｇＣｌ_２＊６Ｈ_２Ｏ（ＳＯ_４ ^２−＜０．００２％，Sigma）；ＺｎＣｌ_２（ＳＯ_４ ^２−＜０．００２％，Sigma）；ＮＨ_４Ｃｌ（ＳＯ_４ ^２−＜０．００２％，Fluka）；ＭｎＣｌ_４＊４Ｈ_２Ｏ（ＳＯ_４ ^２−＜０．００２％，Sigma）およびＦｅＣｌ_２＊４Ｈ_２Ｏ（ＳＯ_４ ^２−＜０．０１％，Sigma）。

切込み付き振とうフラスコ中で３０℃、２５０ｕｐｍでシェーカーキャビネット（Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland）においてコリネバクテリウム・グルタミカムの培養を実行した。酸素制限を防ぐために、フラスコを最大１０％まで培地で充填した。

システインシンターゼＣｙｓＫ（Ｒ４５およびＲ４５ａ）およびシスタチオニン−γ−シンターゼＭｅｔＢ（Ｒ４６）はコリネバクテリウム・グルタミカムΔｍｃｂＲにおいて過剰発現されることが知られている（Rey et al. (2003) 上記参照のこと）。

両株はスルフェートおよびチオスルフェートで増殖できることがわかった。最高の生育速度は野生型に関して観察され、スルフェートでμ_ｍａｘ＝０．４４ｈ^−１であった。ゆえにスルフェートはコリネバクテリウム・グルタミカムにとって好ましい硫黄供給源であると思われる。チオスルフェートもコリネバクテリウム・グルタミカムによって使用され、低い生育速度μ_ｍａｘ＝０，３１ｈ^−１が観察された。

しかし、スルフェートをチオスルフェートによって置き換えた場合、野生型に関して０．３５ｇｇ^−１から０．６０ｇｇ^−１へのバイオマスの増加が観察された。ΔｍｃｂＲノックアウトの場合、スルフェートをチオスルフェートで置き換えると、バイオマス収率は０．４２ｇｇ^−１から０．５１ｇｇ^−１にさえ増加した。これは１３％および２１％の収率の増加に相当する。ゆえに、スルフェートをチオスルフェートによって置き換えると、実際、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨが低減され、ひいては炭素収率に正の効果を有する。

バイオマスの生産に低減した量の糖／グルコースしか必要でないため、より多くの糖／グルコースがメチオニンの生産に利用可能である。ゆえに、スルフェートからチオスルフェートへの変更は、実際に、メチオニン合成の収率を増加させ、この効果は、硫黄供給源としてのチオスルフェートの使用を、遺伝的操作による好ましい代謝経路を通る代謝流量の増大と組み合わせた場合に、さらにより顕著なはずである。

図面の説明：
図１：エレメンタリーモード解析に適用されたコリネバクテリウム・グルタミカム野生型の化学量論反応経路ネットワーク。両方向の矢印は可逆反応を表す。外因的な代謝産物はグレーのボックス中に表示する。

図２：メチオニン生産に関するコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌の代謝経路解析。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型（Ａ）、大腸菌野生型（Ｂ）、活性なトランスヒドロゲナーゼを有するコリネバクテリウム・グルタミカム突然変異体（Ｃ）、トランスヒドロゲナーゼを欠く大腸菌突然変異体（Ｄ）、活性なグリシン切断系を有するコリネバクテリウム・グルタミカム突然変異体（Ｅ）、グリシン切断系を欠く大腸菌突然変異体（Ｆ）について取得されたエレメンタリーモードのバイオマスおよびメチオニンに関する炭素収率。記載される数値は、各シナリオに関するメチオニンの最大理論的炭素収率を示す。直線（strait line）は最大バイオマスおよび最大メチオニン収率を有するモードをつなぐ。

図３：最大理論的メチオニン炭素収率を有するコリネバクテリウム・グルタミカム野生型の流量分布。すべての流量はグルコース取り込みに対する相対モル流量として記載する。

図４：最大理論的メチオニン炭素収率を有する大腸菌野生型の流量分布。すべての流量はグルコース取り込みに対する相対モル流量として記載する。

図５：異なる炭素および硫黄供給源を用いるメチオニン生産に関するコリネバクテリウム・グルタミカムの代謝経路解析：チオスルフェート（Ａ）、チオスルフェートおよびギ酸（Ｂ）、スルフィド（Ｃ）、スルフィドおよびギ酸（Ｄ）、ギ酸（Ｅ）ならびにメタンチオールまたはその二量体であるジメチルジスルフィド（Ｆ）を利用するコリネバクテリウム・グルタミカムについて取得されたエレメンタリーモードのバイオマスおよびメチオニンに関する炭素収率。記載される数値は、各シナリオに関するメチオニンの最大理論的炭素収率を示す。直線は最大バイオマスおよび最大メチオニン収率を有するモードをつなぐ。

図６は、ベクターｐＨ２７３、ｐＨ３７３およびｐＨ３０４を示す。

図７は、ベクターｐＨ３９９、ｐＨ４８４およびｐＨ４９１を示す。

図８はベクターｐＯＭ２２９を示す。

図９はベクターｐＯＭ２５３を示す。

図１０は、メチオニン合成に関して最適化された代謝流量についての好ましい一実施形態を示す。

図１は、エレメンタリー・フラックスモード解析に使用されたコリネバクテリウム・グルタミカム野生型生物の化学量論（stochiometric）反応経路ネットワークを示す。 図２は、メチオニン合成に関するコリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌の代謝経路解析を示す。 図３は、メチオニンの最大理論収率を有するコリネバクテリウム・グルタミカム野生型生物の代謝流量分布を示す。 図４は、メチオニンの最大理論収率を有する大腸菌野生型生物の代謝流量分布を示す。 図５は、種々の炭素および硫黄供給源を用いるメチオニン合成に関するコリネバクテリウム・グルタミカムの代謝経路解析を示す。 図６は、実施形態の例において使用されるベクターｐＨ２７３、ｐＨ３７３およびｐＨ３０４を示す。 図７は、実施形態の例において使用されるベクターｐＨ３９９、ｐＨ４８４およびｐＨ４９１を示す。 図８は、実施形態の例において使用されるベクターｐＯＭ２２９を示す。 図９は、実施形態の例において使用されるベクターｐＯＭ２５３を示す。 図１０は、追加の代謝経路が含まれている、コリネバクテリウム・グルタミカム株の最適化された代謝流量分布の１つを示す。

Claims (22)

1. 向上したメチオニン合成効率を有する生物を決定するための方法であって、以下のステップ：
   ａ．メチオニン合成に関与する既知の代謝経路に基づいて、当初のメチオニン合成生物の代謝流量を複数のパラメータを用いてパラメータ表現するステップ；
   ｂ．前記当初のメチオニン合成生物と比較してメチオニン合成効率が向上するように、前記複数のパラメータのうちの少なくとも１つを変更することにより、かつ／またはそのような少なくとも１つのさらなるパラメータを導入することにより、向上したメチオニン合成効率を有する生物の理論モデルを決定するステップ
   を含む、上記方法。
2. 向上したメチオニン合成効率を有する生物を決定するデバイスであって、以下の方法ステップ：
   ａ．メチオニン合成に関与する既知の代謝経路に基づいて、当初のメチオニン合成野生型生物の代謝流量を複数のパラメータを用いてパラメータ表現するステップ；
   ｂ．前記当初のメチオニン合成生物と比較してメチオニン合成効率が向上するように、前記複数のパラメータのうちの少なくとも１つを変更することにより、かつ／またはそのような少なくとも１つのさらなるパラメータを導入することにより、向上したメチオニン合成効率を有する生物の理論モデルを決定するステップ
   を実行するようにつくられたプロセッサを含んでなる、上記デバイス。
3. 向上したメチオニン合成効率を有する生物を決定するコンピュータプログラムが格納されたコンピュータ読み込み可能な媒体であって、該コンピュータプログラムは、プロセッサにより実行された場合に、以下の方法ステップ：
   ａ．メチオニン合成に関与する既知の代謝経路に基づいて、当初のメチオニン合成生物の代謝流量を複数のパラメータを用いてパラメータ表現するステップ；
   ｂ．前記当初のメチオニン合成生物と比較してメチオニン合成効率が向上するように、前記複数のパラメータのうちの少なくとも１つを変更することにより、かつ／またはそのような少なくとも１つのさらなるパラメータを導入することにより、向上したメチオニン合成効率を有する生物の理論モデルを決定するステップ
   を実行するようにつくられている、上記媒体。
4. 向上したメチオニン合成効率を有する生物を決定するプログラム要素であって、プロセッサにより実行された場合に、以下の方法ステップ：
   ａ．メチオニン合成に関与する既知の代謝経路に基づいて、当初のメチオニン合成生物の代謝流量を複数のパラメータを用いてパラメータ表現するステップ；
   ｂ．前記当初のメチオニン合成生物と比較してメチオニン合成効率が向上するように、前記複数のパラメータのうちの少なくとも１つを変更することにより、かつ／またはそのような少なくとも１つのさらなるパラメータを導入することにより、向上したメチオニン合成効率を有する生物の理論モデルを決定するステップ
   を実行するようにつくられている、上記プログラム要素。
5. 出発生物と比較して向上したメチオニン合成効率を有する、原核生物、下等真核生物および植物からなる群より選択される生物の作製方法であって、以下のステップ：
   ａ．メチオニン合成に関与する既知の代謝経路に基づいて、当初のメチオニン合成生物の代謝流量を複数のパラメータを用いてパラメータ表現するステップ；
   ｂ．前記当初のメチオニン合成生物と比較してメチオニン合成効率が向上するように、前記複数のパラメータのうちの少なくとも１つを変更することにより、かつ／またはそのような少なくとも１つのさらなるパラメータを導入することにより、向上したメチオニン合成効率を有する生物の理論モデルを決定するステップ；
   ｃ．出発生物体内の少なくとも１つの既存の代謝経路を変更するように出発生物を遺伝的に改変することにより、該生物の代謝流量を該生物の理論モデルに近づけるステップ；および／または
   ｄ．出発生物に少なくとも１つの外来性の代謝経路を導入するように出発生物を遺伝的に改変することにより、該生物の代謝流量を該生物の理論モデルに近づけるステップ；および／または
   ｅ．ステップｃで変更され、かつ／もしくはステップｄで導入される代謝経路を通る代謝流量を変えるのに十分な量の、少なくとも１つの外因的な代謝産物を与えるステップ
   を含む、上記方法。
6. 以下のもの：
   ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）
   ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）
   解糖（ＥＭＰ）
   トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）
   グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）
   補充経路（anaplerosis）（ＡＰ）
   呼吸鎖（ＲＣ）
   硫黄同化（ＳＡ）
   メチオニン合成（ＭＳ）
   セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）
   グリシン切断系（ＧＣＳ）
   トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）
   第１経路（Ｐ１）
   第２経路（Ｐ２）
   第３経路（Ｐ３）
   第４経路（Ｐ４）
   第５経路（Ｐ５）
   第６経路（Ｐ６）
   第７経路（Ｐ７）
   第８経路（Ｐ８）
   からなる群より選択される既存の代謝経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、前記生物の遺伝的改変により変更し、かつ／または
   以下のもの：
   グリシン切断系（ＧＣＳ）
   トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）
   チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）
   亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）
   硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）
   ギ酸変換系（ＦＣＳ）
   メタンチオール変換系（ＭＣＳ）
   からなる群より選択される外来性の代謝経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により導入し、かつ／または
   以下のもの：
   スルフェート
   スルファイト
   スルフィド
   チオスルフェート
   ギ酸、ホルムアルデヒド、メタノール、メタンチオールもしくはその二量体であるジメチルジスルフィドなどのＣ１代謝産物
   からなる群より選択される外因的な代謝産物の存在下に該生物を培養する、
   請求項５に記載の方法。
7. 出発生物と比較して向上したメチオニン合成効率を有する、原核生物、下等真核生物および植物からなる群より選択される生物の作製方法であって、以下のステップ：
   ａ．以下のもの：
   ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）
   ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）
   解糖（ＥＭＰ）
   トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）
   グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）
   補充経路（anaplerosis）（ＡＰ）
   呼吸鎖（ＲＣ）
   硫黄同化（ＳＡ）
   メチオニン合成（ＭＳ）
   セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）
   グリシン切断系（ＧＣＳ）
   トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）
   第１経路（Ｐ１）
   第２経路（Ｐ２）
   第３経路（Ｐ３）
   第４経路（Ｐ４）
   第５経路（Ｐ５）
   第６経路（Ｐ６）
   第７経路（Ｐ７）
   第８経路（Ｐ８）
   からなる群より選択される代謝経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により変更するステップ、および／または
   ｂ．以下のもの：
   グリシン切断系（ＧＣＳ）
   トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）
   チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）
   亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）
   硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）
   ギ酸変換系（ＦＣＳ）
   メタンチオール変換系（ＭＣＳ）
   からなる群より選択される外来性の代謝経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により導入するステップ、および／または、
   ｃ．以下のもの：
   スルフェート
   スルファイト
   スルフィド
   チオスルフェート
   有機硫黄供給源
   ギ酸、ホルムアルデヒド、メタノール、メタンチオールもしくはその二量体であるジメチルジスルフィドなどのＣ１代謝産物
   からなる群より選択される少なくとも１つの外因的な代謝産物の存在下に該生物を培養するステップ
   を含む、上記方法。
8. 請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法により得られる、出発生物と比較して向上したメチオニン合成効率を有する、原核生物、下等真核生物および植物からなる群より選択される生物。
9. コリネバクテリウム属（Corynebacterium）微生物、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）微生物、エシェリキア属（Escherichia）微生物、酵母および植物からなる群より選択される、請求項８に記載の生物。
10. 向上したメチオニン生成効率を有するコリネバクテリウム属微生物の作製方法であって、以下のステップ：
    ａ．以下のもの：
    ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／もしくは
    ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）および／もしくは
    硫黄同化（ＳＡ）および／もしくは
    補充経路（anaplerosis）（ＡＰ）および／もしくは
    メチオニン合成（ＭＳ）および／もしくは
    セリン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）および／もしくは
    グリシン切断系（ＧＣＳ）および／もしくは
    トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／もしくは
    第１経路（Ｐ１）および／もしくは
    第２経路（Ｐ２）および／もしくは
    チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／もしくは
    亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／もしくは
    硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／もしくは
    ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／もしくは
    メタンチオール変換系（ＭＣＳ）
    からなる群より選択される経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により出発生物と比較して増大させ、かつ／または導入するステップ、および／または
    ｂ．以下のもの：
    解糖（ＥＭＰ）および／もしくは
    トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／もしくは
    グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／もしくは
    呼吸鎖（ＲＣ）および／もしくは
    Ｒ１９および／もしくは
    Ｒ３５および／もしくは
    Ｒ７９および／もしくは
    第３経路（Ｐ３）および／もしくは
    第４経路（Ｐ４）および／もしくは
    第７経路（Ｐ７）
    からなる群より選択される経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させるステップ
    を含む、上記方法。
11. 以下のもの：
    より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１および／もしくは
    より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／もしくは
    より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／もしくは
    より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／もしくは
    より多くのＸＹＬ−５Ｐを生成するためのＲ６および／もしくは
    より多くのＲＩＢＯ−５Ｐを生成するためのＲ７および／もしくは
    より多くのＳ７ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ８および／もしくは
    より多くのＥ−４ｐおよびＦ６Ｐを生成するためのＲ９および／もしくは
    より多くのＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／もしくは
    より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２および／もしくは
    より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／もしくは
    より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／もしくは
    より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／もしくは
    より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／もしくは
    より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／もしくはＲ３６および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３０および／もしくは
    より多くのＰｙｒを生成するためのＲ５７および／もしくは
    チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／もしくは
    より多くの外因的チオスルフェートを細胞に取り込むためのＲ８２および／もしくは
    スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／もしくは
    より多くの１０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／もしくは
    より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／もしくは
    メタンチオールを用いてＯ−アセチルホモセリンをメチルスルフヒドリル化（methyl-sulfhydrylate）するためのＲ７７および／もしくは
    スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／もしくは
    Ｒ４７および／もしくは
    Ｒ４８および／もしくは
    Ｒ３９および／もしくは
    Ｒ４６および／もしくは
    Ｒ４９および／もしくは
    Ｒ５２および／もしくは
    Ｒ５２および／もしくは
    Ｒ５４
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して増大させ、かつ／もしくは導入し、かつ／または
    以下のもの：
    より少ないＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／もしくは
    より少ないＤＨＡＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１３および／もしくは
    より少ないＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１４および／もしくは
    より少ない１，３−ＰＧを生成するためのＲ１５および／もしくは
    より少ない３−ＰＧを生成するためのＲ１６および／もしくは
    より少ない２−ＰＧを生成するためのＲ１７および／もしくは
    より少ないＰＥＰを生成するためのＲ１８および／もしくは
    より少ないＰｙｒを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／もしくは
    より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より少ないＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／もしくは
    より少ないＩＣＩを生成するためのＲ２３および／もしくは
    より少ない２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／もしくは
    より少ないＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／もしくは
    より少ないＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／もしくは
    より少ないＦＵＭを生成するためのＲ２８および／もしくは
    より少ないＭＡＬを生成するためのＲ２９および／もしくは
    より少ないＯＡＡを生成するためのＲ３０および／もしくは
    より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より少ないＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／もしくは
    より少ないＩＣＩを生成するためのＲ２３および／もしくは
    より少ないＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／もしくは
    より少ないＭＡＬを生成するためのＲ３２および／もしくは
    より少ないＦＵＭを生成するためのＲ２８および／もしくは
    より少ないＭＡＬを生成するためのＲ２９および／もしくは
    より少ないＯＡＡを生成するためのＲ３０および／もしくは
    Ｒ６０および／もしくは
    Ｒ５６および／もしくは
    Ｒ６２および／もしくは
    Ｒ６１および／もしくは
    Ｒ１９および／もしくは
    Ｒ３５および／もしくは
    Ｒ７９
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させる、
    請求項１０に記載の方法。
12. 以下のもの：
    より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／もしくは
    より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／もしくは
    より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／もしくは
    より多くのＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／もしくは
    より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２および／もしくは
    より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／もしくは
    より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／もしくは
    より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／もしくは
    より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／もしくは
    より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／もしくはＲ３６および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３０および／もしくは
    より多くのＰｙｒを生成するためのＲ５７および／もしくは
    チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／もしくは
    より多くの外因的チオスルフェートを細胞に取り込むためのＲ８２および／もしくは
    １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／もしくは
    より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／もしくは
    メタンチオールを用いてＯ−アセチルホモセリンをメチルスルフヒドリル化する（methyl-sulfhydrylate）ためのＲ７７および／もしくは
    Ｒ４７および／もしくは
    Ｒ４８および／もしくは
    Ｒ３９および／もしくは
    Ｒ４６および／もしくは
    Ｒ４９および／もしくは
    Ｒ５２および／もしくは
    Ｒ５２および／もしくは
    Ｒ５４および／もしくは
    スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して増大させ、かつ／もしくは導入し、かつ／または
    以下のもの：
    より少ないＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／もしくは
    より少ないＰｙｒを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／もしくは
    より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より少ない２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／もしくは
    より少ないＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／もしくは
    より少ないＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／もしくは
    より少ないＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／もしくは
    より少ないＭＡＬを生成するためのＲ３２および／もしくは
    より少ないピルベートを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／もしくは
    より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させる、請求項１１に記載の方法。
13. 以下のもの：
    より多くのＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／もしくは
    より多くの６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／もしくは
    より多くのＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／もしくは
    より多くのＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／もしくは
    より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ２および／もしくは
    より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／もしくは
    より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／もしくは
    より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／もしくは
    より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／もしくは
    より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／もしくは
    より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３３および／もしくはＲ３６および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３０および／もしくは
    より多くのＰｙｒを生成するためのＲ５７および／もしくは
    チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／もしくは
    より多くの外因的チオスルフェートを細胞に取り込むためのＲ８２および／もしくは
    １０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／もしくは
    メチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／もしくは
    メタンチオールを用いてＯ−アセチルホモセリンをメチルスルフヒドリル化（methyl-sulfhydrylate）するためのＲ７７および／もしくは
    Ｒ４７および／もしくは
    Ｒ４８および／もしくは
    Ｒ３９および／もしくは
    Ｒ４６および／もしくは
    Ｒ４９および／もしくは
    Ｒ５２および／もしくは
    Ｒ５２および／もしくは
    Ｒ５４および／もしくは
    スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して増大させ、かつ／もしくは導入し、かつ／または
    以下のもの：
    より少ないＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／もしくは
    より少ないＰｙｒを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／もしくは
    より少ないＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より少ない２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／もしくは
    より少ないＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／もしくは
    より少ないＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／もしくは
    より少ないＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／もしくは
    より少ないＭＡＬを生成するためのＲ３２および／もしくは
    より少ないピルベートを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／もしくは
    より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させる、
    請求項１１に記載の方法。
14. 請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法により得られるコリネバクテリウム属微生物であって、好ましくは、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（C. acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（C. acetophilum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・リリウム（C. lilium）、コリネバクテリウム・ニトリロフィラス（C. nitrilophilus）またはコリネバクテリウム属亜種（C. spec.）からなる群より選択され、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ＡＴＣＣ １５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ＡＴＣＣ １３８７０、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）ＡＴＣＣ １７９６５、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＫＦＣＣ１００６５またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ ２１６０８およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ １７３２２からなる群より選択される、上記微生物。
15. 向上したメチオニン生成効率を有するエシェリキア属微生物の作製方法であって、以下のステップ：
    以下のもの：
    ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）および／もしくは
    解糖（ＥＭＰ）および／もしくは
    トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）および／もしくは
    グリオキシル酸短絡回路（ＧＳ）および／もしくは
    第１経路（Ｐ１）および／もしくは
    硫黄同化（ＳＡ）および／もしくは
    補充経路（anaplerosis）（ＡＰ）および／もしくは
    メチオニン合成（ＭＳ）および／もしくは
    セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）および／もしくは
    グリシン切断系（ＧＣＳ）および／もしくは
    トランスヒドロゲナーゼ変換（ＴＨＧＣ）および／もしくは
    チオ硫酸レダクターゼ系（ＴＲＳ）および／もしくは
    亜硫酸レダクターゼ系（ＳＲＳ）および／もしくは
    硫酸レダクターゼ系（ＳＡＲＳ）および／もしくは
    ギ酸変換系（ＦＣＳ）および／もしくは
    メタンチオール変換系（ＭＣＳ）および／もしくは
    セリン／システイン／グリシン合成（ＳＣＧＳ）
    からなる群より選択される経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により出発生物と比較して増大させ、かつ／もしくは導入するステップ、および／または
    以下のもの：
    ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）および／もしくは
    より少ないピルベートを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／もしくは
    より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９および／もしくは
    第３経路（Ｐ３）および／もしくは
    第４経路（Ｐ４）および／もしくは
    第７経路（Ｐ７）
    からなる群より選択される経路のうち少なくとも１つを通る代謝流量を、該生物の遺伝的改変により出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させるステップ
    を含む、上記方法。
16. 以下のもの：
    より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１および／もしくは
    より多くのＦ６Ｐを生成するためのＲ２および／もしくは
    より多くのＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／もしくは
    より多くのＤＨＡＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１３および／もしくは
    より多くのＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１４および／もしくは
    より多くの１，３−ＰＧを生成するためのＲ１５および／もしくは
    より多くの３−ＰＧを生成するためのＲ１６および／もしくは
    より多くの２−ＰＧを生成するためのＲ１７および／もしくは
    より多くのＰＥＰを生成するためのＲ１８および／もしくは
    より多くのＰｙｒを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より多くのＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／もしくは
    より多くのＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より多くのＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／もしくは
    より多くのＩＣＩを生成するためのＲ２３および／もしくは
    より多くの２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／もしくは
    より多くのＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／もしくは
    より多くのＳＵＣＣを生成するためのＲ２７および／もしくは
    より多くのＦＵＭを生成するためのＲ２８および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ２９および／もしくは
    より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３０および／もしくは
    より多くのＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より多くのＣｉｓ−ＡＣＯを生成するためのＲ２２および／もしくは
    より多くのＩＣＩを生成するためのＲ２３および／もしくは
    より多くのＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３２および／もしくは
    より多くのＦＵＭを生成するためのＲ２８および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ２９および／もしくは
    より多くのＯＡＡを生成するためのＲ３０および／もしくは
    より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／もしくは
    より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／もしくは
    より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／もしくは
    より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／もしくは
    より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／もしくは
    チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／もしくは
    より多くの外因的チオスルフェートを細胞に取り込むためのＲ８２および／もしくは
    スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／もしくは
    より多くの１０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／もしくは
    １０−ホルミル−ＴＨＦからより多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／もしくは
    メタンチオールを用いてＯ−アセチルホモセリンをメチルスルフヒドリル化（methyl-sulfhydrylate）するためのＲ７７および／もしくは
    スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／もしくは
    より多くのＯ−Ａｃ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４および／もしくは
    より多くのＣＹＳを生成するためのＲ４５
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して増大させ、かつ／もしくは導入し、かつ／または
    以下のもの：
    より少ないＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／もしくは
    より少ない６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／もしくは
    より少ないＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／もしくは
    より少ないＸＹＬ−５Ｐを生成するためのＲ６および／もしくは
    より少ないＲＩＢＯ−５Ｐを生成するためのＲ７および／もしくは
    より少ないＳ７ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ８および／もしくは
    より少ないＥ−４ｐおよびＦ６Ｐを生成するためのＲ９および／もしくは
    より少ないＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／もしくは
    より少ないＧ６Ｐを生成するためのＲ２および／もしくは
    より少ないＨＯＭＯＣＹＳを生成するためのＲ４９および／もしくは
    より少ないピルベートを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／もしくは
    より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９および／もしくは
    Ｒ５６および／もしくは
    Ｒ６２および／もしくは
    Ｒ６１
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させる、
    請求項１５に記載の方法。
17. 以下のもの：
    より多くのＧ６Ｐを生成するためのＲ１および／もしくは
    より多くのＦ６Ｐを生成するためのＲ２および／もしくは
    より多くのＦ−１，６−ＢＰを生成するためのＲ１１および／もしくは
    より多くのＰｙｒを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より多くのＡｃ−ＣｏＡを生成するためのＲ２０および／もしくは
    より多くのＣＩＴを生成するためのＲ２１および／もしくは
    より多くの２−ＯＸＯを生成するためのＲ２４および／もしくは
    より多くのＳＵＣＣ−ＣｏＡを生成するためのＲ２６および／もしくは
    より多くのＧＬＹＯＸＹおよびＳＵＣＣを生成するためのＲ３１および／もしくは
    より多くのＭＡＬを生成するためのＲ３２および／もしくは
    より多くのＧｌｕを生成するためのＲ２５および／もしくは
    より多くのＨ_２ＳＯ_３を生成するためのＲ５５および／もしくは
    より多くのＨ_２Ｓを生成するためのＲ５８および／もしくは
    より多くのＭ−ＨＰＬを生成するためのＲ７１および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７２および／もしくは
    より多くのメチル−ＴＨＦを生成するためのＲ７８および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ７０および／もしくは
    より多くのＮＡＤＰＨを生成するためのＲ８１および／もしくは
    チオスルフェートをスルフィドおよびスルファイトに代謝するためのＲ７３および／もしくは
    より多くの外因的チオスルフェートを細胞に取り込むためのＲ８２および／もしくは
    スルファイトをスルフィドに代謝するためのＲ７４および／もしくは
    より多くの１０−ホルミル−ＴＨＦを生成するためのＲ７５および／もしくは
    より多くのメチレン−ＴＨＦを生成するためのＲ７６および／もしくは
    メタンチオールを用いてＯ−アセチルホモセリンをメチルスルフヒドリル化（methyl-sulfhydrylate）するためのＲ７７および／もしくは
    スルフェートをスルファイトに代謝するためのＲ８０および／もしくは
    より多くのＯ−Ａｃ−ＳＥＲを生成するためのＲ４４および／もしくは
    より多くのＣＹＳを生成するためのＲ４５
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して増大させ、かつ／もしくは導入し、かつ／または
    以下のもの：
    より少ないＧＬＣ−ＬＡＣを生成するためのＲ３および／もしくは
    より少ない６−Ｐ−グルコネートを生成するためのＲ４および／もしくは
    より少ないＲＩＢ−５Ｐを生成するためのＲ５および／もしくは
    より少ないＦ６ＰおよびＧＡ３Ｐを生成するためのＲ１０および／もしくは
    より少ないピルベートを生成するためのＲ１９および／もしくは
    より少ないＰＥＰを生成するためのＲ３５および／もしくは
    より少ないＴＨＦを生成するためのＲ７９
    からなる群より選択される酵素の量および／もしくは活性を、出発生物と比較して少なくとも部分的に低減させる、
    請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法により得られるエシェリキア属微生物であって、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）からなる群より選択される微生物。
19. 投入グルコースに対するメチオニンのモル比が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％で、メチオニンが生成される、請求項８、９、１４または１８に記載の生物。
20. メチオニンを生成するための、請求項８、９、１４、１８または１９に記載の生物の使用。
21. 以下のステップ：
    ａ．請求項８、９、１４、１８または１９に記載の生物を培養するステップ、
    ｂ．メチオニンを単離するステップ
    を含む、メチオニンの生成方法。
22. 培養を、チオスルフェート、スルファイト、スルフィドおよび／またはギ酸もしくはメタンチオールなどのＣ１化合物を含んでもよい好適な培地中で行う、請求項２１に記載の方法。

Images