ES2517394T3 - Bacterias corineformes con actividad de escisión de glicina - Google Patents

Abstract

Método para la producción de L-metionina en una corinebacteria, seleccionada del grupo que consiste en la especie Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola y Corynebacterium effiziens, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida productor de metionina que es una corinebacteria de tipo salvaje o una corinebacteria que ya posee alteraciones genéticas en comparación con la corinebacteria de tipo salvaje, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementado en dicho microorganismo en comparación con el organismo de partida, y en el que la cantidad y/o actividad de ácido lipoico sintasa (lipA), lipoil tansferasa (lipB) o lipA y lipB están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

Description

Bacterias corineformes con actividad de escisión de glicina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir L-metionina y a bacterias corineformes que presentan un sistema de escisión de glicina funcional.

Antecedentes de la invención

Actualmente, la producción anual mundial de metionina es alrededor de 500.000 toneladas. La metionina es el primer aminoácido limitante en el ganado de aves de corral y en el pienso, y, debido a esto, se aplica principalmente como suplemento del pienso.

En contraste con otros aminoácidos industriales, la metionina se aplica casi exclusivamente como un racemato de Dy L-metionina, que se produce mediante síntesis química. Puesto que los animales pueden metabolizar ambos estereoisómeros de metionina, es posible la alimentación directa de la mezcla racémica producida químicamente (D’Mello y Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals: Amino Acids, Rechgigl (Ed.), CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490, 1978).

Sin embargo, existe todavía un gran interés en la sustitución de la producción química existente mediante un procedimiento biotecnológico que produzca exclusivamente L-metionina. Esto es debido al hecho de que, a menores niveles de suplementación, L-metionina es una mejor fuente de aminoácidos de azufre que D-metionina (Katz y Baker (1975) Poult. Sci. 545: 1667-74). Además, el procedimiento químico usa sustancias químicas más bien peligrosas, y produce corrientes residuales sustanciales. Todas estas desventajas de producción química se podrían evitar mediante un procedimiento biotecnológico eficiente.

La producción fermentativa de sustancias químicas finas, tales como aminoácidos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, se lleva a cabo típicamente hoy en microorganismos tales como Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), Escherichia coli (E. coli), Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Schizzosaccharomycs pombe (S. pombe), Pichia pastoris (P. pastoris), Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus o Gluconobacter oxydans.

Los aminoácidos tales como glutamato se producen así usando métodos de fermentación. Para estos fines, se ha mostrado que ciertos organismos tales como Escherichia coli (E. coli) y Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) son particularmente adecuados. La producción de aminoácidos mediante fermentación también tiene, entre otras, la ventaja de que sólo se producen L-aminoácidos, y que se evitan sustancias químicas medioambientalmente problemáticas tales como disolventes, ya que se usan típicamente en síntesis química.

Algunos intentos en la técnica anterior para producir sustancias químicas finas tales como aminoácidos, lípidos, vitaminas o hidratos de carbono en microorganismos tales como E. coli y C. glutamicum han intentado lograr esta meta incrementando, por ejemplo, la expresión de genes implicados en las rutas biosintéticas de las sustancias químicas respectivas.

Los intentos para incrementar la producción de por ejemplo lisina al aumentar la expresión de genes que están implicados en la ruta biosintética de la producción de lisina se describen, por ejemplo, en los documentos WO 02/10209, WO 2006008097, WO2005059093, o en Cremer et al. (Appl. Environ. Microbiol, (1991), 57(6), 17461752).

Krömer et al. (Metabolic Engineering 8 (2006) 353-369) analizan rutas metabólicas teóricas para la producción de Lmetionina mediante E. coli y C. glutamicum. A fin de mejorar la producción de metionina a partir de sustratos de azúcar mediante C. glutamicum, los autores proponen introducir el sistema de escisión de glicina en C. glutamicum.

Sin embargo, existe todavía una fuerte necesidad para identificar dianas adicionales en las rutas metabólicas que se puedan usar para influir beneficiosamente en la producción de metionina en microorganismos tales como C. glutamicum.

Objeto y sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para la producción de L-metionina en microorganismos.

Es un objeto además de la presente invención proporcionar microorganismos que producen L-metionina.

Estos y otros objetos de la invención, según se manifestarán a partir de las descripciones que se suceden, se logran mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes.

Otras realizaciones de la invención se definen por las reivindicaciones dependientes.

El método usa un microorganismo del género Corynebacterium. Se prefiere particularmente el uso de la especie Corynebacterium glutamicum.

La presente invención se refiere a métodos en los que se cultiva un microorganismo, a saber, una corinebacteria, que se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementada en comparación con el organismo de partida.

Esto se puede lograr mediante modificación genética de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de glicina descarboxilasa dependiente de PLP (gcvP, proteína P), aminometil transferasa que contiene lipoamida (gcvH, proteína H) y enzima sintetizadora de N5,N10-metileno-THF (gcvT, proteína T) están incrementadas en comparación con el organismo de partida. Estas modificaciones genéticas aseguran que la glicina acumulada se convierta en NH4+, CO2 y N5,N10-metileno-THF. Los microorganismos se pueden cultivar en presencia de ácido lipoico y/o lipoamida.

Adicionalmente, los microorganismos se modifican además genéticamente de manera que presentan una mayor cantidad y/o actividad biológica de ácido lipoico sintasa (lipA), lipoil transferasa (lipB), y/o ácido lipoico sintetasa (lplA).

Los microorganismos cultivados se pueden modificar adicional o alternativamente de forma genética para presentar una mayor cantidad y/o actividad de una lipoamida deshidrogenasa (lpd) que requiere FAD, dependiente de NAD+.

Se describe además un método que permite producir L-metionina cultivando microorganismos que se han modificado genéticamente de manera que se incrementa la cantidad y/o actividad biológica de formiato-THFsintetasa, y de manera que se ha establecido un sistema de escisión de glicina funcional. Tales microorganismos presentarán típicamente una mayor cantidad y/o actividad biológica de formiato-THF-sintetasa, gcvH, gcvP y gcvT (gcvHPT). En un aspecto, estos últimos microorganismos se cultivarán en presencia de ácido lipoico y/o lipoamida. Como alternativa, o adicionalmente, los microorganismos se pueden modificar además genéticamente para presentar una mayor cantidad y/o actividad de lipA, lipB y/o lplA. Los microorganismos también pueden presentar una mayor cantidad y/o actividad biológica de lpd.

Las realizaciones descritas anteriormente de métodos según la invención se llevan a cabo preferiblemente cultivando microorganismos de la especie C. glutamicum. Las modificaciones genéticas descritas anteriormente se pueden introducir en una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum. En realizaciones preferidas, estas alteraciones genéticas se introducen en una cepa de C. glutamicum que ya se considera que es una cepa productora de metionina.

Las secuencias codificantes para las formiato-THF-sintetasa gcvP, gcvT, gcvH, lplA, lipA y lipB mencionadas anteriormente derivan preferiblemente de C. jeikeium o E. coli. Se han de considerar particularmente las secuencias de C. jeikeium en caso de que el método se lleve a cabo cultivando cepas de C. glutamicum.

Se describen además microorganismos que se han derivado mediante modificación genética a partir de un microorganismo de partida para producir más N5,N10-metileno-THF en comparación con el organismo de partida. Los microorganismos se seleccionan de las bacterias del género corineforme, siendo preferidas la especie C. glutamicum.

En un aspecto, el microorganismo se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa se incrementan en comparación con el organismo de partida. Otras elaboraciones de este último aspecto comprenden microorganismos con una disminución en la cantidad y/o actividad de formiato-THF-desformilasa, y/o con un incremento en cualquiera de las actividades de N5,N10-metenil-THF-ciclosintetasa, N5,N10-metenil-THF-reductasa y/o N5,N10-metileno-THF-reductasa.

Otro aspecto de la invención se refiere a bacterias corineformes que se obtienen mediante modificación genética a partir de un organismo de partida de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina está incrementada en dicho organismo en comparación con el organismo de partida.

Además, el microorganismo está modificado además de forma genética para presentar una mayor capacidad para captar ácido lipoico y/o lipoamida proporcionados externamente, y/o para sintetizar endógenamente ácido lipoico. Para este fin, la cantidad y/o actividad de lplA, lipA y/o lipB está incrementada en dichos microorganismos. La cantidad y/o actividad de lpd también puede estar incrementada en comparación con el organismo de partida.

El microorganismo se puede alterar genéticamente a fin de presentar una mayor cantidad y/o actividad de gcvP, gcvT y gcvH.

El microorganismo deriva preferiblemente de la especie de C. glutamicum. Las alteraciones genéticas se pueden introducir en una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum, o en una cepa que ya se considera que es una cepa productora de metionina.

Se describen además aquí bacterias corineformes en las que la cantidad y/o actividad biológica de formiato-THFsintetasa, gcvP, gcvT y gcvH están incrementadas en comparación con el organismo de partida. En elaboraciones adicionales de este aspecto, la cantidad y/o actividad de lplA, lipA y/o lipB se pueden incrementar en comparación con el organismo de partida. Como alternativa y/o adicionalmente, la cantidad y/o actividad de lpd puede estar incrementada.

El microorganismo deriva preferiblemente de la especie de C. glutamicum. Las alteraciones genéticas se pueden introducir en una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum, o en una cepa que ya se considera que es una cepa productora de metionina.

Leyendas de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación de secuencias de la secuencia de aminoácidos de lpd de C. jeiekeum y C. glutamicum.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir L-metionina, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo genéticamente modificado y aislar opcionalmente metionina. La presente invención también se refiere a un microorganismo genéticamente modificado que es capaz de producir L-metionina.

La invención se basa en el hallazgo de que una producción eficiente de L-metionina (también denominada como metionina) se puede lograr en microorganismos si tales organismos se han modificado genéticamente a partir de un organismo de partida de manera que el microorganismo resultante produce más N5,N10-metileno-tetrahidrofolato (THF) en comparación con el organismo de partida.

Antes de describir con detalle realizaciones ejemplares de la presente invención, se dan las siguientes definiciones.

Un nombre de un gen o un nombre de una proteína, por ejemplo, pero sin limitarse a, formiato-THF-sintetasa, gcvPTH, lipA, lipB, lpla, lpd, y cualquier otro nombre de gen o de proteína contenido aquí, se referirá al gen y/o a la proteína o enzima codificada por dicho gen, o a ambos, dependiendo del contexto en el que se use el nombre.

La expresión “alrededor de”, en el contexto de la presente invención, representa un intervalo de exactitud que la persona experta en la técnica entenderá que es habitual para el rasgo en cuestión. La expresión indica típicamente desviación del valor numérico indicado de +/-10%, y preferiblemente +/-5%.

El término “microorganismo”, para los fines de la presente invención, se refiere a procariotas y a eucariotas inferiores.

Los organismos de la presente invención comprenden así microorganismos tal como son conocidos en la técnica como útiles para la producción de sustancias químicas finas tales como aminoácidos, vitaminas, cofactores enzimáticos, etc. Se seleccionan del género de Corynebacterium, con un foco particular en Corynebacterium glutamicum.

Como se explicará con detalle mediante la siguiente descripción, la presente invención se refiere principalmente a microorganismos que se han modificado genéticamente a fin de presentar una mayor cantidad y/o actividad de ciertas enzimas.

Las expresiones “modificación genética” y “alteración genética”, así como sus variaciones gramaticales dentro del significado de la presente invención, pretenden significar que un microorganismo se ha modificado por medio de tecnología génica para expresar una cantidad alterada de una o más proteínas que pueden estar presentes de forma natural en el microorganismo respectivo, una o más proteínas que no están presentes de forma natural en el microorganismo respectivo, o una o más proteínas con una actividad alterada en comparación con las proteínas del microorganismo no modificado respectivo. Se considera que un microorganismo no modificado es un “organismo de partida”, cuya alteración genética da como resultado un microorganismo según la presente invención.

La expresión “organismo de partida” se puede referir por lo tanto al tipo salvaje de un organismo. En el caso de C. glutamicum, éste puede ser por ejemplo ATCC13032. Sin embargo, la expresión “organismo de partida”, para los fines de la presente invención, también se puede referir a un organismo que ya posee alteraciones genéticas en comparación con el organismo de tipo salvaje de la especie respectiva, pero que entonces se modifica además genéticamente a fin de producir un organismo según la presente invención.

En caso de C. glutamicum, el organismo de partida puede ser así una cepa de C. glutamicum de tipo salvaje, tal como ATCC13032. Sin embargo, el organismo de partida puede ser también preferiblemente, por ejemplo, una cepa de C. glutamicum que ya se ha manipulado mediante ingeniería para la producción de metionina.

Tal organismo de partida productor de metionina puede derivar por ejemplo de una bacteria corineforme de tipo salvaje, y preferiblemente de una bacteria C. glutamicum de tipo salvaje que contiene alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: askfbr , homfbr y metH, en la que las alteraciones genéticas conducen a la

sobreexpresión de cualquiera de estos genes, dando de ese modo como resultado una mayor producción de metionina con respecto a la metionina producida en ausencia de las alteraciones genéticas. En una realización preferida, tal organismo de partida productor de metionina contendrá alteraciones genéticas simultáneamente en askfbr , homfbr y metH, dando como resultado de ese modo una mayor producción de metionina con respecto a la metionina producida en ausencia de las alteraciones genéticas.

En estos organismos de partida, las copias endógenas de ask y hom se cambian típicamente a alelos resistentes a la retroalimentación, que ya no están sujetos nunca más a la inhibición por retroalimentación mediante lisina, treonina, metionina, o mediante una combinación de estos aminoácidos. Esto se puede realizar mediante mutación y selección, o mediante sustituciones genéticas definidas de los genes por alelos mutados que codifican proteínas con inhibición por retroalimentación reducida o disminuida. Una cepa de C. glutamicum que incluye estas alteraciones genéticas es, por ejemplo, C. glutamicum DSM17322. La persona experta en la técnica estará al tanto de que se pueden usar alteraciones genéticas alternativas a aquellas que se han descrito más abajo para la generación de C. glutamicum DSM17322 para lograr también la sobreexpresión de askfbr , homfbr y metH.

Para los fines de la presente invención, askfbr representa una aspartato cinasa resistente a retroalimentación. homfbr representa una homoserina deshidrogenasa resistente a retroalimentación. metH representa una metionina sintasa dependiente de vitamina B12.

En otra realización preferida, un organismo de partida productor de metionina puede derivar de una bacteria corineforme de tipo salvaje, y preferiblemente de una bacteria C. glutamicum de tipo salvaje que contiene alteraciones genéricas en al menos uno de los siguientes genes: askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), y hskmutado, en la que las alteraciones genéticas conducen a la sobreexpresión de cualquiera de estos genes, dando como resultado de ese modo una mayor producción de metionina con respecto a la metionina producida en ausencia de las alteraciones genéticas. En una realización preferida, tal organismo de partida productor de metionina contendrá alteraciones genéticas simultáneamente en askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), y hskmutado , dando como resultado de ese modo una mayor producción de metionina con respecto a la metionina producida en ausencia de las alteraciones genéticas.

En estos organismos de partida, las copias endógenas de ask, hom y hsk se sustituyen típicamente por askfbr , homfbr, y hskmutado como se describe anteriormente para askfbr y homfbr. Una cepa de C. glutamicum que incluye estas alteraciones genéticas es, por ejemplo, C. glutamicum M2014. La persona experta en la técnica estará al tanto de que se pueden usar alteraciones genéticas alternativas a aquellas que se describen más abajo específicamente para la generación de C. glutamicum M2014, para lograr también la sobreexpresión de askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), y hskmutado .

Para los fines de la presente invención, metA representa una homoserina succiniltransferasa de por ejemplo E. coli. metY representa una O-acetilhomoserina sulfhidrilasa. hskmutado representa una homoserina cinasa que se ha mutado para mostrar actividad enzimática reducida. Esto se puede lograr intercambiando treonina con serina o alanina en una posición que corresponde a T190 de hsk de C. glutamicum ATCC 13032 con número de acceso Genbank Cgl1184. Como alternativa o adicionalmente, se puede sustituir el codón de partida ATG por un codón de partida TTG. Tales modificaciones conducen a una reducción en la actividad enzimática de la proteína hsk resultante en comparación con el gen hsk no mutado.

En otra realización preferida, un organismo de partida productor de metionina puede derivar de una bacteria corineforme de tipo salvaje, y preferiblemente de una bacteria C. glutamicum de tipo salvaje que contiene alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), hskmutado y metF, en la que las alteraciones genéticas conducen a la sobreexpresión de cualquiera de estos genes, en combinación con alteraciones genéticas en uno de los siguientes genes: serA, en la que las alteraciones genéticas disminuyen la expresión de este gen en el que la combinación da como resultado una mayor producción de metionina por el microorganismo con respecto a la producción de metionina en ausencia de la combinación.

En estos organismos de partida, la copia endógena de ask, hom, hsk se sustituye como se describe anteriormente, y la copia endógena de serA se interrumpe típicamente de forma funcional. Una cepa de C. glutamicum que incluye estas alteraciones genéticas es, por ejemplo, C. glutamicum OM264C. La persona experta en la técnica estará al tanto de que se pueden usar alteraciones genéticas alternativas a aquellas que se describen más abajo específicamente para la generación de C. glutamicum OM264C, para lograr también la sobreexpresión de askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), hskmutado y metF, y la expresión reducida de serA.

Para los fines de la presente invención, serA representa 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (véase la Tabla 1).

En otra realización preferida, un organismo de partida productor de metionina puede derivar de una bacteria corineforme de tipo salvaje, y preferiblemente de una bacteria C. glutamicum de tipo salvaje que contiene alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado

como metX), metY (también denominado como metZ), hskmutado y metF, en la que las alteraciones genéticas conducen a la sobreexpresión de cualquiera de estos genes, en combinación con alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: mcbR y metQ, en la que las alteraciones genéticas disminuyen la expresión de cualquiera de estos genes, en la que la combinación da como resultado una mayor producción de metionina por el microorganismo con respecto a la producción de metionina en ausencia de la combinación. En una realización preferida, tal organismo de partida productor de metionina contendrá alteraciones genéticas simultáneamente en askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), hskmutado y metF, en el que las alteraciones genéticas conducen a la sobreexpresión de cualquiera de estos genes, en combinación con alteraciones genéticas en mcbR y metQ, en el que las alteraciones genéticas disminuyen la expresión de cualquiera de estos genes, en el que la combinación da como resultado una mayor producción de metionina por el microorganismo con respecto a la producción de metionina en ausencia de la combinación.

En estos organismos de partida, las copias endógenas de ask, hom y hsk se sustituyen típicamente como se describe anteriormente, mientras que las copias endógenas de mcbR y metQ están interrumpidas o suprimidas típicamente de forma funcional. Una cepa de C. glutamicum que incluye estas alteraciones genéticas es, por ejemplo, C. glutamicum OM469. La persona experta en la técnica estará al tanto de que se pueden usar alteraciones genéticas alternativas a aquellas que se describen más abajo específicamente para la generación de C. glutamicum OM469, para lograr también la sobreexpresión de askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), hskmutado y metF, y la expresión reducida de mcbR y metQ.

Para los fines de la presente invención, metF representa una N5,10-metileno-tetrahidrofolato reductasa (EC 1.5.1.20). mcbR representa un regulador transcripcional de tipo TetR del metabolismo del azufre (número de acceso Genbank AAP45010). metQ representa una lipoproteína de unión a D-metionina que funciona en la importación de metionina.

En una realización preferida adicional, un organismo de partida productor de metionina puede derivar de una bacteria corineforme de tipo salvaje, y preferiblemente de una bacteria C. glutamicum de tipo salvaje que contiene alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como metZ), hskmutado , metF, tkt, tal, zwf y 6pgl, en la que las alteraciones genéticas conducen a la sobreexpresión de cualquiera de estos genes, en combinación con alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: mcbR, metQ y sda, en la que las alteraciones genéticas disminuyen la expresión de cualquiera de estos genes, en la que la combinación da como resultado una mayor producción de metionina por el microorganismo con respecto a la producción de metionina en ausencia de la combinación. En una realización preferida, tal organismo de partida productor de metionina contendrá alteraciones genéticas simultáneamente en askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como

metZ), hskmutado

, metF, tkt, tal, zwf y 6pgl, en el que las alteraciones genéticas conducen a la sobreexpresión de cualquiera de estos genes, en combinación con alteraciones genéticas en al menos uno de los siguientes genes: mcbR, metQ y sda, en el que las alteraciones genéticas disminuyen la expresión de cualquiera de estos genes, en el que la combinación da como resultado una mayor producción de metionina por el microorganismo con respecto a la producción de metionina en ausencia de la combinación.

Una cepa de C. glutamicum que incluye estas alteraciones genéticas es, por ejemplo, C. glutamicum GK1259. La persona experta en la técnica estará al tanto de que se pueden usar alteraciones genéticas alternativas a aquellas que se describen más abajo específicamente para la generación de C. glutamicum GK1259, para lograr también la sobreexpresión de askfbr , homfbr , metH, metA (también denominado como metX), metY (también denominado como

metZ), hskmutado

, metF, tkt, tal, zwf y 6pgl, y la expresión reducida de mcbR, metQ y sda.

Para los fines de la presente invención, tkt representa transcetolasa, tal representa transaldolasa, zwf representa glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, 6pgl representa 6-fosfo-glucono-lactonasa, y sda representa serina desaminasa (véase la Tabla 1). La persona experta en la técnica entiende que para incrementar la cantidad y/o actividad de zwf, se incrementará también la cantidad y/o actividad de opca, que sirve como una proteína de armazón estructural para zwf. En GK1259, esto se logra mediante el uso del promotor PSOD que incrementa simultáneamente la transcripción del operón de fosfato de pentosa que comprende tkt, tal, zwf y 6pgl.

Como se ha expuesto anteriormente, los microorganismos genéticamente modificados de la presente invención se caracterizan por que se incrementa la cantidad de N5,N10-metileno-THF.

Típicamente, la cantidad de N5,N10-metileno-THF se incrementará en el microorganismo según la presente invención en comparación con el organismo de partida respectivo en al menos alrededor de 2%, al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, o al menos alrededor de 20%. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de N5,N10metileno-THF se incrementará en al menos alrededor de 30%, en al menos alrededor de 50%, o en al menos alrededor de 75%. Incluso realizaciones más preferidas se refieren a microorganismos en los que la cantidad de N5,N10-metileno-THF se incrementa en al menos alrededor de un factor de 2, al menos alrededor de un factor de 5, o al menos alrededor de un factor de 10.

Los métodos y microorganismos según la presente invención se pueden usar para producir más metionina en comparación con una situación en la que se cultiva el microorganismo de partida respectivo, que no se ha

modificado genéticamente como se esboza más abajo. Los microorganismos y métodos de la presente invención también se pueden usar para incrementar la eficiencia de la síntesis de metionina.

La expresión “eficiencia de la síntesis de metionina” describe el rendimiento de carbono de metionina. Esta eficiencia se calcula como un porcentaje de la entrada de energía que entra en el sistema en forma de un sustrato de carbono. A lo largo de la invención, este valor se da en valores de porcentajes ((mol de metionina) (mol de sustrato de carbono (-1 x 100). La expresión “mayor eficiencia de la síntesis de metionina” se refiere así a una comparación entre el organismo de partida y la bacteria corineforme actual, en la que se han incrementado la cantidad y/o actividad de al menos una de las enzimas mencionadas más abajo.

Las fuentes de carbono preferidas según la presente invención son azúcares tales como mono-, di-o polisacáridos. Por ejemplo, los azúcares seleccionados del grupo que comprenden glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa pueden servir como fuentes de carbono particularmente preferidas.

Los métodos y bacterias corineformes según la invención también se pueden usar para producir más metionina en comparación con el organismo de partida.

Los métodos y bacterias corineformes según la invención también se pueden usar para producir metionina a una velocidad más rápida en comparación con el organismo de partida. Si, por ejemplo, se considera un período de producción típico, los métodos y bacterias corineformes permitirán producir metionina a una velocidad más rápida, es decir, se producirá la misma cantidad de metionina en un punto en el tiempo más pronto, en comparación con el organismo de partida. Esto se aplica particularmente para la fase de crecimiento logarítmica.

Los métodos y bacterias corineformes según la invención permiten producir al menos alrededor de 3 g de metionina/l de volumen de cultivo si la cepa se incuba en incubaciones de matraces de agitación. Se puede preferir un título de al menos alrededor de 4 g de metionina/l de volumen de cultivo, al menos alrededor de 5 g de metionina/l de volumen de cultivo, o al menos alrededor de 7 g de metionina/l de volumen de cultivo si la cepa se incuba en incubaciones de matraces de agitación. Un valor más preferido asciende hasta al menos alrededor de 10 g de metionina/l de volumen de cultivo, e incluso más preferiblemente hasta al menos alrededor de 20 g de metionina/l de masa celular si la cepa se incuba en incubaciones de matraces de agitación.

Los métodos y bacterias corineformes según la invención permiten producir al menos alrededor de 25 g de metionina/l de volumen de cultivo si la cepa se incuba en experimentos de fermentación usando un fermentador agitado y alimentado con fuente de carbono. Se puede preferir un título de al menos alrededor de 30 g de metionina/l de volumen de cultivo, al menos alrededor de 35 g de metionina/l de volumen de cultivo, o al menos alrededor de 40 g de metionina/l de volumen de cultivo si la cepa se incuba en experimentos de fermentación usando un fermentador agitado y alimentado con una fuente de carbono. Un valor más preferido asciende hasta al menos alrededor de 50 g de metionina/l de volumen de cultivo, e incluso más preferiblemente hasta al menos alrededor de 60 g de metionina/l de masa celular si la cepa se incuba en experimentos de fermentación usando un fermentador agitado y alimentado con fuente de carbono.

En una realización preferida, los métodos y microorganismos de la invención permiten incrementar la eficiencia de la síntesis de metionina y/o la cantidad de metionina y/o el título y/o la velocidad de la síntesis de metionina en comparación con el organismo de partida en al menos alrededor de 2%, al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, o al menos alrededor de 20%. En realizaciones preferidas, la eficiencia de la síntesis de metionina y/o la cantidad de metionina y/o el título y/o la velocidad se incrementan en comparación con el organismo de partida en al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, o al menos alrededor de 50%. Incluso más preferido es un incremento de al menos alrededor de un factor de 2, al menos alrededor de un factor de 3, al menos alrededor de un factor de 5, y al menos alrededor de un factor de 10.

El término “metabolito” se refiere a compuestos químicos que se usan en las rutas metabólicas de organismos como precursores, intermedios y/o productos finales. Tales metabolitos pueden servir no sólo como unidades de construcción químicas, sino también pueden ejercer una actividad reguladora sobre enzimas y su actividad catalítica. Se sabe de la bibliografía que tales metabolitos pueden inhibir o estimular la actividad de las enzimas (Stryer, Biochemistry (2002) W.H. Freeman & Co., Nueva York, Nueva York).

La expresión “condiciones estándar” se refiere al cultivo de un microorganismo en un medio estándar que no está enriquecido con respecto a un compuesto particular. La temperatura, el pH y el tiempo de incubación pueden variar, como se describirá con más detalle más abajo.

Las condiciones de cultivo estándar para microorganismos se pueden tomar de la bibliografía, incluyendo libros de texto tales como “Sambrook y Russell, Molecular Cloning -A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición (2001).

“Medios mínimos” son medios que contienen solamente las necesidades para el crecimiento de células de tipo salvaje o mutantes, es decir, sales inorgánicas, una fuente de carbono, yagua. En el caso de células mutantes, un medio mínimo puede contener uno o más aditivos de compuestos químicos sustancialmente puros, para permitir el

crecimiento de células mutantes que son deficientes en la producción de tal sustancia o sustancias químicas.

Por el contrario, “medios enriquecidos” se diseñan para satisfacer todos los requisitos de crecimiento de un organismo específico, es decir, además de los contenidos de los medios mínimos, contienen, por ejemplo, aminoácidos, factores de crecimiento, cofactores enzimáticos, etc.

La expresión “incrementar la cantidad” de al menos una proteína en comparación con un organismo de partida, en el contexto de la presente invención, significa que un microorganismo de partida se modifica genéticamente para expresar una mayor cantidad de por ejemplo una de las enzimas mencionadas anteriormente. Se ha de entender que incrementar la cantidad de, por ejemplo, una enzima se refiere a una situación en la que se incrementa la cantidad de enzima funcional. En el contexto de la presente invención, una enzima se considera funcional si es capaz de catalizar la reacción respectiva.

Hay diversas opciones para incrementar la cantidad de una proteína en microorganismos tales como bacterias corineformes, que son bien conocidas por la persona experta en la técnica. Estas opciones incluyen incrementar el número de copias de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína respectiva, incrementar la transcripción y/o traducción de tales secuencias de ácidos nucleicos, o sus combinaciones. Estas diversas opciones se discutirán con más detalle más abajo.

La expresión “incrementar la actividad” de al menos una proteína se refiere a la situación de que se introduce al menos una mutación en las secuencias de tipo salvaje respectivas de la proteína que conduce a la producción de más metionina en comparación con una situación en la que se expresa la misma cantidad de proteína de tipo salvaje. Esto se puede lograr, por ejemplo, usando enzimas que poseen mutaciones específicas que permiten una mayor actividad de la enzima. Tales mutaciones pueden, por ejemplo, inactivar las regiones de las enzimas que son responsables de la inhibición por retroalimentación. Al mutar estas posiciones, por ejemplo introduciendo mutaciones de punto no conservativas, la enzima ya no proporciona regulación por retroalimentación, y de este modo la actividad de la enzima no se puede disminuir si, por ejemplo, se producen más moléculas de producto. Además, la actividad de una enzima se puede incrementar introduciendo mutaciones que incrementan el metabolismo catalítico de una enzima. Tales mutaciones se pueden introducir en la copia endógena del gen que codifica la enzima respectiva, o se pueden proporcionar sobreexpresando un mutante correspondiente a partir de las secuencias de ácidos nucleicos exógenas que codifican tal enzima. Tales mutaciones pueden comprender mutaciones de punto, supresiones o inserciones. Las mutaciones de punto pueden ser conservativas (sustitución de un aminoácido por un aminoácido de propiedades bioquímicas y fisicoquímicas comparables) o no conservativas (sustitución de un aminoácido por otro que no es comparable en términos de propiedades bioquímicas y fisicoquímicas). Además, las supresiones pueden comprender sólo dos o tres aminoácidos hasta dominios completos de la proteína respectiva. Para dar un ejemplo, en el caso de transcetolasa de C. glutamicum ATCC13032 (número de acceso Genbank Cgl1574), una mutación de alanina en una posición que corresponde a A293 por R, y/o alanina en una posición que corresponde a A327 por T, el intercambio conduce a una enzima con actividad enzimática mejorada. La persona experta en la técnica será capaz de desarrollar mutaciones adicionales o alternativas basándose en la información proporcionada aquí.

De este modo, la expresión “incrementar la actividad” de al menos una enzima se refiere a la situación en la que se introducen mutaciones en la secuencia de tipo salvaje respectiva para reducir mecanismos reguladores negativos tales como inhibición por retroalimentación, y/o para incrementar el metabolismo catalítico de la enzima.

Un incremento de la cantidad y/o actividad de una proteína tal como una enzima se puede lograr mediante diferentes rutas, por ejemplo cambiando mecanismos reguladores inhibidores a nivel transcripcional, traduccional o proteico, y/o incrementando la expresión génica de un ácido nucleico que codifica esta proteína en comparación con el organismo de partida, por ejemplo induciendo el gen endógeno o introduciendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína.

Por supuesto, los enfoques para incrementar la cantidad y/o actividad de una proteína tal como una enzima se pueden combinar. De este modo, es posible, por ejemplo, sustituir la copia endógena de una enzima de bacteria corineforme por un mutante que codifica su versión insensible a la retroalimentación. Si la transcripción de esta copia mutada se pone bajo el control del promotor fuerte, se incrementan la cantidad y la actividad de la enzima respectiva. Se entiende que, en este caso, la enzima todavía debe ser capaz de catalizar la reacción en la que participa habitualmente.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína tal como una enzima pueden ser de origen endógeno

o exógeno. De este modo, por ejemplo se puede incrementar la cantidad de una proteína tal como una enzima incrementando la expresión de secuencias de ácidos nucleicos que aparecen de forma natural en el microorganismo de partida respectivo, por ejemplo, mediante integración cromosómica de secuencias de ácidos nucleicos adicionales, o usando un promotor fuerte delante del gen endógeno. Como alternativa o adicionalmente, también se puede incrementar la cantidad de una proteína tal como una enzima expresando la secuencia de ácido nucleico que codifica un homólogo de esta enzima a partir de otro organismo. Los ejemplos de este último escenario se ofrecerán más abajo.

De este modo, por ejemplo se puede incrementar la cantidad de lpd en C. glutamicum al sobreexpresar la secuencia de C. glutamicum respectiva, ya sea a partir de un vector autónomamente replicante o a partir de una copia cromosómica insertada adicionalmente (véase más abajo), o se pueden usar las enzimas correspondientes de, por ejemplo, Bacillus subtilis o E. coli y sobreexpresar la enzima, por ejemplo, mediante el uso de un vector autónomamente replicable.

En algunas circunstancias, puede ser preferible usar las enzimas endógenas, ya que la secuencia codificante endógena de, por ejemplo, C. glutamicum ya están optimizadas con respecto a su uso de codones para la expresión en C. glutamicum.

Si, en el contexto de la siguiente descripción, se establece que la cantidad y/o actividad de una proteína tal como una enzima específica se debería disminuir en comparación con el organismo de partida, las definiciones anteriores se aplican cambiando lo que haya que cambiar.

La reducción de la cantidad y/o actividad de una proteína tal como una enzima se puede lograr suprimiendo parcial o completamente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína respectiva, inhibiendo la transcripción al introducir, por ejemplo, promotores débiles, inhibiendo la traducción al modificar el uso de codones en consecuencia, al introducir mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas respectivas, que hacen no funcionales a las proteínas, y/o sus combinaciones.

En el contexto de la siguiente descripción, se hará uso de la expresión “homólogo funcional”. La expresión “homólogo funcional”, para los fines de la presente invención, se refiere al hecho de que una cierta actividad enzimática puede ser proporcionada no sólo por una proteína específica de secuencia de aminoácidos definida, sino también por proteínas de secuencia similar de otros organismos (no) relacionados.

Por ejemplo, la actividad de formiato-THF-sintetasa se puede establecer en C. glutamicum expresando secuencias de ácido nucleico que codifican la formiato-THF-sintetasa de C. jeikeium (SEC ID NO.1: secuencia de ácido nucleico, SEC ID NO. 2: secuencia de aminoácidos, número de acceso gene bank (NP_939608)), o mediante sus homólogos funcionales.

Los homólogos de una proteína de otros organismos se pueden identificar por la persona experta mediante análisis de homología. Esto se puede realizar determinando la similitud, es decir, porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos para homólogos putativos y las secuencias para los genes o proteínas codificados por ellos (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico para formiato-THF-sintetasa, gcvH, gcvP, gcvT, lpd, lplA, lipA, lipA).

El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante inspección visual o usando homología a base de algoritmos.

Por ejemplo, a fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, el algoritmo alineará las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir saltos en la secuencia de aminoácidos de una proteína para el alineamiento óptimo con la secuencia de aminoácidos de otra proteína). Entonces se comparan los restos de aminoácidos en las posiciones de los aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido que la posición correspondiente en la otra, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones multiplicado por 100).

Para estos fines, se conocen en la técnica diversos programas de ordenador. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se puede determinar comparando la información de secuencia usando el programa de ordenador GAP descrito por Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res., 12:387 y disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El porcentaje de identidad también se puede determinar alineando dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos usando el programa de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™) (como se describe por Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett.,

174:247.

En la fecha de presentación de esta solicitud de patente, un paquete de software estándar que proporciona el programa BLAST se puede encontrar en el sitio web de BLAST del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/). Por ejemplo, si se usa cualquiera de las SEC IDs mencionadas anteriormente, se puede realizar una búsqueda BLAST a base de secuencias de ácidos nucleicos o a base de secuencias de aminoácidos e identificar homólogos estrechamente relacionados de las enzimas respectivas en, por ejemplo, E. coli, S. cervisiae, Bacillus subtilis, etc. Por ejemplo, para alineamientos de secuencias de ácidos nucleicos usando el programa BLAST™, los ajustes por defecto son los siguientes: el premio para el emparejamiento es 2, la penalización para el desemparejamiento es -2, las penalizaciones para salto abierto y salto de extensión son 5 y 2 respectivamente, la caída de los tiempos de salto es 50, la expectativa es 10, el tamaño de la palabra es 11, y el filtro está OFF.

Las búsquedas y análisis de secuencias comparables se pueden realizar en la base de datos de EMBL (http://www.embl.org) o la página de Expasy (http://www.expasy.org/). Todas las búsquedas de secuencias

anteriores se realizan típicamente con los parámetros por defecto tal como están preinstalados por los proveedores de bases de datos en la fecha de presentación de la presente solicitud. Las búsquedas de homología también se pueden realizar de forma habitual usando programas de software tales como el software Lasergene de DNA Star, Inc., Madison, Winconsin, USA, que usa el método CLUSTAL (Higgins et al. (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2) 151).

La persona experta entiende que dos proteínas probablemente realizarán la misma función (por ejemplo, proporcionan la misma actividad enzimática) si comparten un cierto grado de identidad como se describe anteriormente. Un límite inferior típico en el nivel de aminoácidos es típicamente al menos alrededor de 25% de identidad. A nivel de ácidos nucleicos, el límite inferior es típicamente al menos 50%.

Los grados de identidad preferidos para ambos tipos de secuencias son al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60% o al menos alrededor de 70%. Los niveles de identidad más preferidos son al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, o al menos alrededor de 95%. Se considera que estos niveles de identidad son significativos.

Como se usan aquí, los términos “homología” y “homólogo” no están limitados para designar proteínas que tienen un ancestro genético común teórico, sino que incluyen proteínas que pueden estar genéticamente no relacionadas que, no obstante, han evolucionado para realizar funciones similares y/o tener estructuras similares. El requisito de que los homólogos deben ser funcionales significa que los homólogos descritos aquí engloban proteínas que tienen sustancialmente la misma actividad que la proteína de referencia. Para que las proteínas tengan homología funcional, no se requiere necesariamente que tengan identidad significativa en sus secuencias de aminoácidos, sino, más bien, proteínas que tienen homología funcional se definen así por tener actividades similares o idénticas, por ejemplo actividades enzimáticas.

Preferiblemente, una enzima procedente de otro organismo distinto de por ejemplo la bacteria corineforme hospedante se considerará que es un homólogo funcional si muestra similitud al menos significativa, es decir, alrededor de 50% de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos, y cataliza la misma reacción que su contraparte en la bacteria corineforme. Los homólogos funcionales que proporcionan la misma actividad enzimática y comparten un grado mayor de identidad, tal como al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos, son homólogos funcionales preferidos adicionales.

La persona experta en la técnica sabe que también se pueden usar fragmentos o versiones mutadas de las enzimas mencionadas anteriormente procedentes de bacterias corineformes o de sus homólogos funcionales en otros organismos en tanto que estos fragmentos y versiones mutadas presenten el mismo tipo de actividad funcional. Los fragmentos típicos funcionalmente activos presentarán supresiones N-terminales y/o C-terminales, mientras que las versiones mutadas comprenden típicamente supresiones, inserciones o mutaciones de punto.

A título de ejemplo, se considerará que una secuencia de E. coli codifica un homólogo funcional de formiato-THFsintetasa de C. jeikeum si presenta los niveles de identidad mencionados anteriormente a nivel de aminoácidos con respecto a SEC ID NO. 2, y presenta la misma actividad enzimática. Los ejemplos se pueden tomar de la Tabla 1. También se pueden usar fragmentos o, por ejemplo, mutantes de punto de estas secuencias, en tanto que las proteínas resultantes todavía catalicen el mismo tipo de reacción que las enzimas de longitud completa.

Más abajo se mostrarán ejemplos de incremento de la cantidad de una enzima para formiato-THF-sintetasa, gcvTHP, lplA, lipA y lipB. Para serina desaminasa se proporcionarán ejemplos para disminuir la cantidad de una enzima.

Incremento de la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa en microorganismos

Se describen aquí microorganismos en los que un organismo de partida se manipula genéticamente de manera que la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa se incrementa en el microorganismo resultante en comparación con el organismo de partida. También se describen métodos para producir metionina en microorganismos, que comprenden la etapa de cultivar el microorganismo mencionado anteriormente.

En microorganismos tales como E. coli y C. jeikeum, se conocen las secuencias para formiato-THF-sintetasa. En tales microorganismos, el incremento de la cantidad y/o de la actividad de formiato-THF-sintetasa requerirá elevar la cantidad y/o actividad de esta enzima por encima del nivel del organismo de partida respectivo, por ejemplo sobreexpresando secuencias de ácido nucleico que codifican esta actividad enzimática.

En C. glutamicum, no se conoce una formiato-THF-sintetasa. Los siguientes pasajes describen cómo se puede establecer una actividad de formiato-THF-sintetasa en C. glutamicum. La persona experta en la técnica estará no obstante al tanto de cómo se puede incrementar la cantidad y/o actividad de una formiato-THF-sintetasa en otros microorganismos tales como C. jeikeum y E. coli.

Se describe aquí, entre otros, un microorganismo de C. glutamicum en el que se incrementan la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa, y el uso de tal microorganismo para producir metionina. Esto se puede lograr, por ejemplo, incrementando el número de copias de secuencias de ácido nucleico que codifican una formiato-THF

sintetasa, incrementando la transcripción y/o traducción de secuencias que codifican una formiato-THF-sintetasa, o una combinación de los mismos.

Se puede usar una formiato-THF-sintetasa de C. jeikeum. La secuencia de ácido nucleico de esta formiato-THFsintetasa se representa en SEC ID NO. 1, mientras que la secuencia de aminoácido se representa en SEC ID NO. 2. El número de acceso gene bank es YP_250663.1. Esta secuencia deriva de la cepa C. jeikeium NCTC K11915, que también se denomina como K411. Una formiato-THF-sintetasa también se puede obtener a partir de la cepa DSMZ 7171. En este caso, la secuencia de ácido nucleico se representa mediante SEC ID No: 51, y la secuencia de aminoácidos se representa mediante SEC ID No. 52.

Por supuesto, también se pueden usar fragmentos funcionales de una formiato-THF-sintetasa como se representa mediante SEC ID Nos. 1 y 2, o sus homólogos funcionales. En la Tabla 1 se representan algunos de los homólogos que se pueden identificar usando búsquedas de homología estándar.

El número de copias de las secuencias de ácido nucleico que codifican formiato-THF-sintetasa se puede incrementar en un microorganismo, y preferiblemente en C. glutamicum, por ejemplo expresando la secuencia de plásmidos que se replican autónomamente, o integrando copias adicionales de las secuencias de ácido nucleico respectivas en el genoma del microorganismo, y preferiblemente de C. glutamicum.

En el caso de vectores replicables autónomamente, éstos se pueden mantener de forma estable en, por ejemplo, una bacteria corineforme. Los vectores típicos para expresar polipéptidos y enzimas tales como formiato-THFsintetasa en C. glutamicum incluyen pCliK, pB y pEKO como se describe en Bott, M. y Eggeling, L., eds. Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC Press LLC, Boca Raton, FL; Deb, J.K. et al. (FEMS Microbiol. Lett. (1999), 175(1), 11-20), Kirchner O. et al. (J. Biotechnol. (2003), 104 (1-3), 287-299), documento WO2006069711 y en el documento WO2007012078.

En otro enfoque para incrementar el número de copias de secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido en una bacteria corineforme, se pueden integrar copias adicionales de secuencias de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos en el cromosoma de C. glutamicum. La integración cromosómica puede tener lugar, por ejemplo, en el locus en el que está localizada la copia endógena del polipéptido respectivo. Adicionalmente y/o como alternativa, la multiplicación cromosómica de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos puede tener lugar en otros loci en el genoma de una bacteria corineforme.

En caso de C. glutamicum, hay diversos métodos conocidos por la persona experta en la técnica para incrementar el número de copias génicas mediante integración cromosómica. Uno de tales métodos hace uso, por ejemplo, del vector pK19 sacB, y se ha descrito con detalle en la publicación de Schäfer A, et al. J Bacteriol. 1994 176(23): 73097319. Otros vectores para la integración cromosómica de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos incluyen pCLIK int sacB, como se describe en los documentos WO2005059093 y WO2007011845.

Otro enfoque preferido para incrementar la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa en microorganismos, y particularmente en C. glutamicum, es incrementar la transcripción de las secuencias codificantes mediante el uso de un promotor fuerte.

Si la actividad de una formiato-THF-sintetasa endógena se incrementa mediante el uso de un promotor fuerte, entonces la expresión “promotor fuerte” significa que la transcripción a partir del promotor recientemente introducido es más fuerte que la del promotor endógeno de origen natural.

Sin embargo, en un caso en el que formiato-THF-sintetasa se expresa en C. glutamicum que no conoce este tipo de enzima, se puede usar un promotor que se sabe que proporciona una expresión fuerte de genes endógenos de C. glutamicum.

Los promotores preferidos en este contexto son los promotores PSOD (SEC ID No. 3), PgroES (SEC ID No 4), PEFTu (SEC ID No 5), promotor mágico SP01 P15 (SEC ID No 42), y PR (SEC ID No 6), algunas veces también denominado como lambdaPR. En C. glutamicum el promotor PR puede ser más fuerte que el promotor PSOD. El promotor PSOD puede ser más fuerte que el promotor PgroES, y el promotor PgroES puede ser más débil que el promotor PEFTu o el promotor P15. El promotor PEFTu puede ser más fuerte que el promotor PSOD. Sin embargo, la fuerza de un promotor en cualquier organismo no es necesariamente una propiedad inherente del promotor, puesto que la fuerza del promotor puede variar ampliamente dependiendo del contexto en el que se coloca el promotor mediante la ingeniería genética.

El incremento de la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa en microorganismos, y particularmente en C. glutamicum, permitirá que los microorganismos crezcan en medios que comprenden formiato como la fuente de carbono. Además, el uso de formiato que también aparece como un metabolito durante diversas rutas biosintéticas permitirá igualmente incrementar la producción de N5,N10-metileno-THF. Un mayor nivel de N5,N10-metileno-THF conducirá a una mayor producción de metil-THF y producción de metionina.

También se describe aquí un método que comprende cultivar los microorganismos descritos anteriormente y aislar opcionalmente metionina.

En elaboraciones adicionales de la descripción descrita anteriormente, en la que la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa se incrementan en un microorganismo, y preferiblemente en C. glutamicum, la cantidad de N5,N10-metileno-THF se puede incrementar además disminuyendo la cantidad y/o actividad de formil-THFdesformilasa. En SEC ID NO. 7 se representa una secuencia de ácido nucleico para formil-THF-desformilasa, y en SEC ID NO. 8 se representa la secuencia de aminoácidos. La Tabla 1 proporciona números de acceso de gene bank para esta actividad enzimática.

Como alternativa o adicionalmente, la cantidad y/o actividad de N5,N10-metenil-THF-ciclosintetasa, N5,N10-metenilTHF-reductasa y/o N5,N10-metileno-THF-reductasa se incrementan en comparación con el organismo de partida. En una realización preferida, se incrementa la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa, se disminuye la cantidad y/o actividad de formil-THF-desformilasa, y se incrementa la cantidad y/o actividad de N5,N10-metenil-THFciclosintetasa, N5,N10-metenil-THF-reductasa y/o N5,N10-metenil-reductasa, en comparación con el organismo de partida. Puesto que todas estas actividades enzimáticas mencionadas anteriormente están presentes en microorganismos, y también en C. glutamicum (con la excepción de formiato-THF-sintetasa), se puede preferir usar las secuencias de ácido nucleico endógenas para incrementar y/o disminuir la cantidad y/o actividad de las actividades enzimáticas respectivas en los microorganismos, y preferiblemente en C. glutamicum.

Más abajo se describirán con detalle enfoques para incrementar la cantidad y/o actividad para una proteína. Por supuesto, estos enfoques también se pueden aplicar a formiato-THF-sintetasa. Más abajo se describirán enfoques para disminuir la cantidad y/o actividad de una proteína en un microorganismo. Por supuesto, estos enfoques también se pueden aplicar a la disminución de formil-THF-desformilasa.

Por supuesto, también se pueden usar homólogos funcionales de formiato-THF-sintetasa de C. jeikeium o de las otras enzimas mencionadas anteriormente. Estos homólogos funcionales presentarán los grados de identidad mencionados anteriormente con respecto a SEC ID NO. 1 o SEC ID NO. 2, y proporcionan el mismo tipo de actividad enzimática. En la Tabla 1 se proporcionan los números de acceso de formiato-THF-sintetasa para organismos distintos de C. jeikeium.

Un aspecto preferido se refiere a microorganismos de C. glutamicum que expresan formiato-THF-sintetasa, y al uso de estos organismos de C. glutamicum en la producción de metionina. Estas cepas pueden mostrar adicionalmente las alteraciones genéticas mencionadas anteriormente discutidas para formil-THF-desformilasa, N5,N10-metenil-THFciclosintetasa, N5,N10-metenil-THF-reductasa y/o N5,N10-metileno-THF-reductasa.

Una cepa de C. glutamicum típica que se puede usar como organismo de partida será una cepa de tipo salvaje tal como ATCC13032. Sin embargo, se puede preferir usar un organismo de partida que ya se ha modificado genéticamente para asegurar una mayor producción de metionina. Tal organismo puede presentar las características de DSM17323, y de este modo presenta una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr y metH. Una cepa de partida preferida también puede tener las características de M2014, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, y hskmutado. Otros organismos de partida preferidos pueden tener las características de OM469, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, hskmutado y metF y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR y metQ. Aún otros organismos de partida preferidos pueden tener las características de GK1259, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr ,

homfbr , metH, metA, metY, hskmutado

, tkt (y opcionalmente g6pdh, zwfa y 6pgl) y metF, y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR, metQ y sda, o de M2616 y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr ,

homfbr , metH, metA, metY, hskmutado

, tkt (y opcionalmente g6pdh, zwfa y 6pgl) y metF, y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR, metQ y serA.

Se encontró además que la producción de metionina se puede estimular adicionalmente si se cultivan los microorganismos descritos anteriormente, que presentan una mayor cantidad y/o actividad de formiato-THFsintetasa, en un medio que contiene mayores cantidades de formiato.

Este aspecto, en el que el formiato se añade deliberadamente al medio de cultivo, se realiza particularmente de forma preferible con cepas de C. glutamicum que se han modificado genéticamente para presentar las características anteriores de formiato-THF-sintetasa y las otras alteraciones genéticas. Nuevamente, se preferirá incrementar la actividad de formiato-THF-sintetasa expresando las secuencias correspondientes de C. jeikeium en

C. glutamicum o sus homólogos funcionales y fragmentos.

Microorganismos con mayor cantidad y/o actividad del sistema de escisión de glicina

En un aspecto, la presente invención se refiere a microorganismos, y preferiblemente C. glutamicum, que presentan una mayor actividad enzimática del sistema de escisión de glicina. La presente invención también se refiere a métodos que hacen uso de estos microorganismos para la producción de metionina cultivando dichos microorganismos y aislando opcionalmente metionina.

En algunas aplicaciones industriales, microorganismos tales como E. coli o C. glutamicum producen glicina como subproducto. La presente invención hace uso de este subproducto al proporcionar microorganismos que presentan una mayor actividad del sistema de escisión de glicina.

El sistema de escisión de glicina de microorganismos comprende típicamente 4 a 5 subunidades.

La primera subunidad es una glicina descarboxilasa dependiente de PLP (GcvP, también denominada simplemente proteína P). La segunda subunidad es una amino metil transferasa que contiene lipoamida (GcvH, también denominada proteína H). La tercera subunidad es una enzima que sintetiza N5,N10-metileno-THF (GcvT). Estos tres factores se denominan también algunas veces como gcvPTH. La cuarta subunidad es una lipoamida deshidrogenasa dependiente de NAD+, que requiere FAD (lpd, también denominada simplemente proteína L). Los genes correspondientes son nombres gcvP, gcvT, gcvH y lpd, respectivamente. Los ejemplos de este tipo de GCS se encuentran en E. coli y C. jeikeium. La subunidad lpd también es compartida típicamente por al menos otras dos enzimas de multisubunidades, a saber, piruvato deshidrogenasa y -cetoglutarato deshidrogenasa.

Si se incrementa la actividad enzimática del sistema GCS, la glicina en exceso de aquella requerida para la masa celular se metabolizará preferiblemente en NH4+, CO2 y N5,N10-metileno-THF, que entonces se puede usar, por ejemplo, para una mayor síntesis de metionina. Sin embargo, algunos microorganismos, tales como por ejemplo C. glutamicum, carecen de un sistema GCS nativo. No obstante, tales organismos tendrán habitualmente un gen lpd que codifica la subunidad para uso en los dos sistemas enzimáticos mencionados anteriormente.

Como se mostrará más abajo, la proteína Lpd nativa en C. glutamicum es capaz de funcionar junto con un GCS no nativo, de manera que sólo es necesario instalar y expresar los genes gcvP, gcvT y gcvH para obtener una función de GCS activa en C. glutamicum. Sin embargo, también se puede preferir sobreexpresar un gen lpd no nativo, puesto que este gen puede ser más capaz de interactuar específica y eficientemente con los factores gcvP, gcvT y gcvH.

Además, se debería observar que, en algunos organismos, el sistema de escisión de glicina comprende cinco subunidades. Por ejemplo, en Bacillus subtilis, la subunidad P se divide por ejemplo en dos polipéptidos, denominados algunas veces P1 y P2, que son codificados por dos genes, algunas veces denominados gcvP1 y gcvP2.

La presente invención, como se menciona anteriormente, se refiere, en una realización preferida, a microorganismos que se han modificado genéticamente para presentar una mayor actividad del sistema de escisión de glicina. Tal actividad incrementada del sistema de escisión de glicina se puede lograr incrementando la cantidad y/o actividad de las actividades enzimáticas codificadas por gcvP, gcvH y gcvT. Se abordará más abajo cómo se puede establecer un aumento de la actividad del sistema de escisión de glicina en C. glutamicum, puesto que esto representa una realización preferida de la presente invención.

Un aspecto de la presente invención se refiere a bacterias corineformes, y particularmente C. glutamicum, en las que la cantidad y/o actividad de las actividades enzimáticas codificadas por gcvP, gcvH y gcvT (colectivamente denominados gcvPHT) se incrementan mediante alteración genética en comparación con el organismo de partida.

Esto se puede lograr incrementando la cantidad y/o actividad de las enzimas respectivas de C. jeikeium. La secuencia de ácido nucleico de gcvP se representa en SEC ID NO. 9, la secuencia de aminoácidos se representa en SEC ID NO. 10. El número de acceso de Genbank es CAI36361.1.

La secuencia de ácido nucleico de gcvH de C. jeikeium se representa en SEC ID NO. 11. La secuencia de aminoácidos se representa en SEC ID NO. 12. El número de acceso de Genbank es CAI36363.1.

La secuencia de ácido nucleico de gcvT de C. jeikeium se representa en SEC ID NO. 13. La secuencia de aminoácidos se representa en SEC ID NO. 14. El número de acceso de Genbank es CAI36362.1.

Para los fines de la presente invención, se puede preferir usar las secuencias anteriores que derivan de C. jeikeium.

La actividad de un sistema de escisión de glicina en un microorganismo, y particularmente en C. glutamicum, se puede incrementar expresando, y preferiblemente sobreexpresando, las secuencias mencionadas anteriormente, ya sea solas o en combinación, siendo esto último una realización particularmente preferida de la presente invención. De este modo, la presente invención se refiere particularmente a microorganismos de C. glutamicum en los que las actividades enzimáticas de gcvPHT están incrementadas concomitantemente. Esto se puede lograr sobreexpresando las secuencias de gcvP, gcvH y gcvT como se representan mediante SEC ID NOS. 9-14, sus fragmentos funcionales, o sus homólogos funcionales. Los homólogos funcionales de las secuencias mencionadas anteriormente de gcvP, gcvH y gcvT se pueden identificar fácilmente a través de búsquedas de homología de secuencias en las bases de datos relevantes, y producirán secuencias para otros organismos tales como E. coli. Los números de acceso para estas enzimas de otros organismos se proporcionan en la Tabla 1. Se prefiere el uso de secuencias de gcvP, gcvH y gcvT de C. jeikeium, particularmente en C. glutamicum, ya que estos genes están agrupados en un operón (Tauch et al. (2005) J. Bacteriol., 187, 4671-4682). Además, los genes lpd de C. jeikeium y

C. glutamicum muestran un grado elevado de identidad de secuencia (véase la Fig. 1). Es razonable suponer que los factores gcvP, gcvH y gcvT interactúan suave y eficientemente con el lpd de C. glutamicum. La cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT se puede incrementar en microorganismos, y preferiblemente en C. glutamicum, mediante los métodos mencionados anteriormente en el contexto de formiato-THF-sintetasa. De este modo, se puede construir, por ejemplo, una unidad funcional que comprenda las secuencias codificantes de gcvP, gcvH y

gcvT, e incrementar el número de copias de la secuencia de ácido nucleico que comprende esta unidad usando, por ejemplo, plásmidos que se replican autónomamente o plásmidos que se integran en el genoma del microorganismo, y preferiblemente en el genoma de C. glutamicum.

Como alternativa o adicionalmente, se puede instalar un promotor delante de este operón que asegura una fuerte transcripción de las secuencias codificantes para gcvP, gcvH y gcvT. Tal promotor se puede seleccionar preferiblemente del grupo del promotor PEFTu, PgroES, PSOD, P15 y PR.

En principio, no es necesario incrementar la cantidad y/o actividad del factor lpd. Este factor estará presente típicamente en cantidades suficientemente abundantes por el microorganismo hospedante, que se manipula genéticamente a fin de incrementar la cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT. No obstante, en algunas realizaciones de la invención, se puede preferir incrementar también la cantidad y/o actividad de lpd. Para este fin, las secuencias endógenas de lpd se pueden sobreexpresar por cualquiera de los métodos descritos anteriormente que se ofrecen en un poco más de detalle más abajo. Dependiendo de la similitud del lpd del organismo de partida y del lpd a partir del que se toman los factores gcvP, gcvH y gcvT, se puede preferir incrementar la cantidad y/o actividad de lpd incrementando la expresión de lpd endógeno o exógeno. En este caso, se seleccionará preferiblemente el lpd de aquel organismo a partir del que se toman los otros factores del sistema de escisión de glicina.

De este modo, una realización de la presente invención se refiere a microorganismos que derivan del organismo de partida de manera que el microorganismo resultante presenta una mayor cantidad y/o actividad de los factores gcvP, gcvH y gcvT. La invención también se refiere a métodos que usan estos microorganismos para la producción de metionina cultivando los microorganismos y aislando opcionalmente la metionina.

Una realización preferida se refiere a microorganismos de C. glutamicum que expresan los factores gcvP, gcvH y gcvT de C. jeikeium como se representa en SEC ID NOS. 9-14, o sus homólogos funcionales y fragmentos funcionales. La presente invención también se refiere preferiblemente al uso de estos organismos de C. glutamicum en la producción de metionina.

Una cepa de C. glutamicum típica que se puede usar como organismo de partida será una cepa de tipo salvaje tal como ATCC13032. Sin embargo, se puede preferir usar un organismo de partida que ya se ha modificado genéticamente para asegurar la producción incrementada de metionina. Tal organismo puede presentar las características de DSM17323, y de este modo presenta una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr y metH. Una cepa de partida preferida también puede tener las características de M2014, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, y hskmutado. Otros organismos de partida preferidos pueden tener las características de OM469, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, hskmutado y metF y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR y metQ.

Se ha encontrado además que la producción de N5,N10-metileno-THF y de metionina se puede incrementar en microorganismos que presentan una mayor actividad del sistema de escisión de glicina como se describe anteriormente, si los microorganismos se (i) proporcionan con ácido lipoico y/o lipoamida externos, y/o (ii) modifican genéticamente además para producir más ácido lipoico y/o lipoamida que el organismo de partida.

También se describen aquí métodos que hacen uso de los microorganismos descritos anteriormente que presentan una mayor cantidad y/o actividad de los factores gcvP, gcvH y gcvT del sistema de escisión de glicina (y opcionalmente del factor lpd), y que se cultivan en un medio que contiene mayores cantidades de ácido lipoico y/o lipoamida. Para los fines de este aspecto, el ácido lipoico y/o la lipoamida se pueden añadir al medio hasta una concentración final de al menos alrededor de 0,1 mg/1, al menos alrededor de 1 mg/ml, y preferiblemente al menos alrededor de 10 mg/l.

Se sabe en la técnica que la lipoamida, algunas veces denominada amida del ácido lipoico, puede sustituir al ácido lipoico para la lipoilación de enzimas en algunos organismos (Reed, L.J. et al. (1958) J. Biol. Chem. 232, 143-158). Como tal, la alimentación de lipoamida puede sustituir a la alimentación de ácido lipoico en la invención descrita aquí. En otras palabras, la lipoamida, que está comercialmente disponible del mismo proveedor que el ácido lipoico en sus diversas formas (por ejemplo, números T 5875, T 5625, T 1395, T 8260 del catálogo de Sigma-Aldrich), también se puede usar para estimular o incrementar la actividad de escisión de glicina en organismos y métodos de la invención descritos aquí. Se pueden usar tanto las formas oxidadas como las formas reducidas de estos dos compuestos, así como diversas sales y ésteres de cualesquiera de estas formas. De este modo, la fuente del grupo lipoílo puede variar.

Este aspecto, en el que el ácido lipoico y/o la lipoamida se añaden intencionadamente al medio de cultivo, se realiza particularmente de forma preferible con cepas de C. glutamicum que se han modificado genéticamente para presentar las actividades de los factores gcvP, gcvH y gcvT de un sistema de escisión de glicina. Nuevamente, se preferirá incrementar la actividad del sistema de escisión de glicina al expresar las secuencias correspondientes de

C. jeikeium en C. glutamicum o sus homólogos y fragmentos funcionales. En una elaboración adicional de este aspecto de la invención, la cantidad y/o actividad del factor lpd se pueden incrementar usando las secuencias endógenas de C. glutamicum o las secuencias exógenas (véase la Tabla 1).

También en el caso de C. glutamicum, la concentración final de ácido lipoico y/o lipoamida en el medio será al menos alrededor de 0,1 mg/1, al menos alrededor de 1 mg/l, y preferiblemente al menos alrededor de 10 mg/l.

Los microorganismos según la presente invención que presentan mayor actividad en el sistema de escisión de glicina que resulta de una mayor cantidad y/o actividad de los factores gcvP, gcvH y gcvT se modifican genéticamente además para presentar una mayor cantidad de ácido lipoico y/o lipoamida sintetizados internamente.

Hay dos rutas diferentes para hacer uso de ácido lipoico y ligarlo a proteínas diana. En E. coli, estas dos rutas se denominan la ruta dependiente de lplA y la ruta dependiente de lipB (Morris et al. (1995) J. Bacteriol., 177, 1-10).

El gen lplA codifica lipoil sintetasa (proteína LplA). Esta enzima activa ácido lipoico con ATP y une subsiguientemente lipoil-AMP a gcvH.

La ruta dependiente de lipB comprende dos enzimas (Morris et al. (1995) J. Bacteriol., 177, 1-10). LipA codifica ácido lipoico sintasa (proteína LipA). El gen lipB codifica lipoil transferasa (proteína LipB). LipA convierte octanoil-ACP en lipoil-ACP. En una segunda etapa, lipB une el resto lipoílo al dominio lipoílo de gcvH y otras proteínas lipoiladas.

De este modo, un incremento en la cantidad y/o actividad de lplA permite una mejor incorporación de ácido lipoico añadido externamente, mientras que un incremento en la cantidad, tipo y/o actividad de lipA y/o lipB incrementa la cantidad de ácido lipoico sintetizada internamente que se transfiere a GcvH.

En SEQ ID NO. 15 se representa una secuencia de ácido nucleico de lplA de E. coli. En SEQ ID NO. 16 se representa la secuencia de aminoácidos. El número de acceso de gene bank es EG11796.

En SEQ ID NO. 17 se representa la secuencia codificante de lipA de C. jeikeium. En SEQ ID NO. 18 se representa la secuencia de aminoácidos. El número de acceso de gene bank es GeneID:3433570.

En SEQ ID NO. 19 se representa la secuencia de ácido nucleico para lipB de C. jeikeium. En SEQ ID NO. 20 se representa la secuencia de aminoácidos. El número de acceso de gene bank es GeneID:3433571.

Para los fines de la presente invención, se puede preferir usar las secuencias anteriores que derivaron de C. jeikeium.

Un microorganismo que presenta una mayor cantidad y/o actividad de los factores gcvP, gcvH y gcvT del sistema de escisión de glicina se puede así optimizar adicionalmente con respecto a la síntesis de N5,N10-metileno-THF y de metionina al incrementar la cantidad y/o actividad de lplA. Para este fin, se puede incrementar la expresión de lplA haciendo uso de SEQ ID NOS. 15, o sus homólogos y fragmentos funcionales. Tal microorganismo mostrará una mejor incorporación de ácido lipoico y/o lipoamida añadidos externamente, y de este modo puede ser particularmente adecuado para aquellos métodos según la presente invención en los que los microorganismos se cultivan en el medio que se suplementa con ácido lipoico y/o lipoamida.

La presente invención se refiere a un microorganismo que, además del incremento en la cantidad y/o actividad de los factores gcvP, gcvH y gcvT del sistema de escisión de glicina, presenta una mayor cantidad y/o actividad de lipA, lipB o lipA y lipB. Se prefiere particularmente un microorganismo que, además de una mayor cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT, presente una mayor cantidad y/o actividad de lipA y lipB. Estos microorganismos pueden mostrar una mejor formación y acomodación de ácido lipoico y/o lipoamida sintetizados endógenamente, y de este modo contribuirán a la producción de N5,N10-metileno-THF y metionina.

Por supuesto, estos microorganismos también se pueden usar en los métodos según la presente invención que pertenecen al cultivo de organismos genéticamente modificados con mayor actividad de sistema de escisión de glicina en medio suplementado con ácido lipoico y/o lipoamida. En una elaboración adicional de este aspecto, se pueden producir y usar microorganismos que, además de una mayor cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT, muestran una mayor cantidad y/o actividad de lplA, lipA y lipB.

Un aspecto particularmente se refiere de nuevo a microorganismos de C. glutamicum que por medio de modificación genética de un organismo de C. glutamicum de partida presentan una mayor cantidad y/o actividad de los factores gcvP, gcvH y gcvT del sistema de escisión de glicina, que presentan una acomodación mejorada del ácido lipoico y/o lipoamida proporcionados externamente, y/o una formación y acomodación mejoradas de ácido lipoico y/o lipoamida producidos internamente, al ser modificados genéticamente a fin de presentar una mayor cantidad y/o actividad de lplA, lipA y/o lipB. De este modo, aspectos preferidos se refieren a microorganismos de C. glutamicum en los que la cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT y lplA están incrementadas en comparación con el organismo de partida. En una realización, el microorganismo de C. glutamicum presenta una mayor cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT y lipA o lipB. Incluso es más preferido un microorganismo de C. glutamicum que presenta una mayor cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT, lipA y lipB. Se prefiere particularmente un microorganismo de C. glutamicum que presenta una mayor cantidad y/o actividad de gcvP, gcvH y gcvT, lpl, lipA y lipB.

Se entiende por la persona experta que el organismo de partida de C. glutamicum que se usa para introducir la

modificación genética mencionada anteriormente puede ser una cepa de tipo salvaje tal como ATCC13032. Sin embargo, se puede preferir usar un organismo de partida que ya se ha modificado genéticamente para asegurar una mayor producción de metionina. Tal organismo puede presentar las características de DSM17323, y de este modo presenta una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr y metH. Una cepa de partida preferida también puede tener las características de M2014, y presenta una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, y hskmutado. Otros organismos de partida preferidos pueden tener las características de OM469, y presentan una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, hskmutado y metF y presentan una reducción de la cantidad y/o actividad de mcbR y metQ.

La persona experta en la técnica está además claramente al tanto de que, en todas las realizaciones mencionadas anteriormente que se refieren a un incremento en el sistema de escisión de glicina y la captación, formación y acomodación mejoradas de ácido lipoico y/o lipoamida, el microorganismo de partida, que preferiblemente es una de las cepas de C. glutamicum mencionadas anteriormente, presenta modificaciones genéticas adicionales con respecto a enzimas que están implicadas en la ruta biosintética de serina como se describe anteriormente.

De este modo, una cepa de partida preferida puede tener las características de OM264C y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, y hskmutado y presentar una menor cantidad y/o actividad de serA. Otra cepa de partida preferida puede tener las características de GK1259, y presentar una mayor cantidad

, metH, metA, metY, hskmutado

y/o actividad de askfbr , homfbr , metF, tkt, tal, zwf y 6pgl, y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR, metQ y sda.

Microorganismos con una mayor cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa y del sistema de escisión de glicina

Se describen aquí además microorganismos que combinan las propiedades de los organismos mencionados anteriormente, es decir, incremento de la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa y una mayor actividad del sistema de escisión de glicina. Se entiende que los aspectos particularmente preferidos descritos anteriormente también se han de combinar.

De este modo, un microorganismo se modificará genéticamente de manera que presentará una mayor cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa, gcvP, gcvH y gcvT.

En un aspecto preferido adicional, el microorganismo se modificará genéticamente además para presentar una mayor cantidad y/o actividad de lplA.

Un aspecto preferido también se refiere a un microorganismo que presenta una mayor actividad de formiato-THFsintetasa, gcvP, gcvH y gcvT y lipA o lipB. Incluso son más preferidos los microorganismos que presentan una mayor cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa, gcvP, gcvH y gcvT, lipA y lipB.

Otro aspecto preferido se refiere a un microorganismo que presenta una mayor cantidad y/o actividad de formiatoTHF-sintetasa, gcvP, gcvH y gcvT, lplA, lipA y lipB.

Por supuesto, los microorganismos también pueden presentar una mayor cantidad y/o actividad de lpd.

Se entiende que los aspectos mencionados anteriormente se alcanzan preferentemente en un microorganismo de C. glutamicum. Tal cepa de C. glutamicum puede ser una cepa de tipo salvaje tal como ATCC13032. Sin embargo, se puede preferir usar un organismo de partida que ya se ha modificado genéticamente para asegurar una mayor producción de metionina. Tal organismo puede presentar las características de DSM17323, y de este modo presenta una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr y metH. Una cepa de partida preferida también puede tener las características de M2014, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, y hskmutado. Otros organismos de partida preferidos pueden tener las características de OM469, y presentar una mayor

, homfbr , metH, metA, metY, hskmutado

cantidad y/o actividad de askfbr y metF, y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR y metQ, o de las características de M2616, y presentar una mayor cantidad y/o actividad de

, metH, metA, metY, hskmutado

askfbr , homfbr , tkt (y opcionalmente g6pdh, zwfa y 6pgl) y metF, y presentar una menor cantidad y/o actividad de mcbR, metQ y serA.

La persona experta en la técnica está además claramente al tanto de que, en todos los aspectos mencionados anteriormente que se refieren a un incremento en el sistema de escisión de glicina y la captación, formación y acomodación mejoradas de ácido lipoico y/o lipoamida, el microorganismo de partida, que preferiblemente es una de las cepas de C. glutamicum mencionadas anteriormente, presenta modificaciones genéticas adicionales con respecto a enzimas que están implicadas en la ruta biosintética de serina como se describe anteriormente, y/o enzimas implicadas en la metabolización de formilo, tales como formil-THF-desformilasa, N5,N10-metenil-THFciclosintetasa, N5,N10-metenil-THF-reductasa y/o N5,N10-metileno-THF-reductasa.

De este modo, una cepa de partida preferida puede tener las características de OM264C y presentar una mayor cantidad y/o actividad de askfbr , homfbr , metH, metA, metY, y hskmutado y presentar una menor cantidad y/o actividad de serA. Otra cepa de partida preferida puede tener las características de GK1259, y presentar una mayor cantidad

, metH, metA, metY, hskmutado

y/o actividad de askfbr , homfbr , metF, tkt, tal, zwf y 6pgl, y presentar una menor cantidad

y/o actividad de mcbR, metQ y sda.

Para incrementar la cantidad y/o actividad de las enzimas mencionadas anteriormente, se puede depender de las secuencias de ácido nucleico endógenas que codifican estas enzimas, o se pueden usar secuencias exógenas, dependiendo de si el organismo de partida respectivo proporciona la actividad requerida.

5 En caso de un microorganismo de C. glutamicum, se preferirá usar las secuencias codificantes de C. jeikeium para incrementar la cantidad y/o actividad de formiato-THF-sintetasa, gcvP, gcvH y gcvT, lplA, lipA, lipA y/o lpd. Las secuencias para estas enzimas se representan en SEQ ID NOS. 1 y 2 y 9 a 20. La persona experta en la técnica está, por supuesto, al tanto de que también se pueden usar secuencias que codifican homólogos o fragmentos funcionales de los números de SEQ ID mencionados anteriormente. Tales homólogos funcionales pueden incluir

10 secuencias de otras fuentes, tales como E. coli. La Tabla 1 proporciona un resumen de posibles secuencias citando números de acceso de gene bank correspondientes.

Los microorganismos, y particularmente microorganismos de C. glutamicum, se pueden usar en la producción de metionina al cultivarlos y opcionalmente aislar la metionina. Como se menciona anteriormente, los organismos modificados se pueden cultivar en un medio suplementado con mayores cantidades de formiato y ácido lipoico y/o

15 lipoamida.

La siguiente tabla proporciona un resumen de algunas de las enzimas que se han discutido anteriormente con más detalle. Los números de acceso de gene bank citados se refieren al gene bank que se puede encontrar en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

formiato-THF-sintetasa

C. jeikeum y otros

formil-THF-desformilasa

C. glutamicum y otros

N5-formil-THFciclosintetasa

C. glutamicum y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

N5,N10-metenil-THFreductasa

C. glutamicum y otros

N5,N10-metilenTHFreductasa

C. glutamicum

glicina descarboxilasa dependiente de PLP (gcvP)

C. jeikeum, E. coli y otros

aminometiltransferasa que contiene lipoamida (gcvH)

C. jeikeum, E. coli y otros

Enzima sintetizadora de N5;N10-metilen-THF (gcvT)

C. jeikeum, E. coli y otros

lipoamida deshidrogenasa (lpd)

C. jeikeum, E. coli y otros

Lip A

C. jeikeum, E. coli y otros

Lip B

C. jeikeum. E. coli y otros

D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa (serA)

C. glutamicum y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

fosfoserina fosfatasa (serB)

C. glutamicum y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

fosfoserina aminotransferasa (serC)

C. glutamicum y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

serina (sdaA)

deshidratasa C. glutamicum

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

serina hidroximetiltransferasa (shmt)

C. glutamicum y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

metilen tetrahidrofolato reductasa (metF)

C glutamicum, E. coli y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

metionina sintasa dependiente cob(I)alamina (metH)

I de

O-acetilhomoserina sulfhidrolasa

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

Aspartato cinasa (ask)

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

homoserina deshidrogenasa (hom)

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

Serina desaminasa (sda)

C. glutamicum, E coli, y otros

Homoserina cinasa (hsk)

C. glutamicum y otros

Enzima

Número de acceso de Gene bank Organismo

lipoproteína de unión a D-metionina (metQ)

C. glutamicum y otros

mcbR

C. glutamicum y otros

Glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa

Corynebacterium glutamicum y otros

proteína OPCA

Corynebacterium glutamicum y otros

Transaldolasa

Corynebacterium glutamicum y otros

6-fosfogluconolactonasa

Corynebacterium glutamicum y otros

Transcetolasa

Corynebacterium glutamicum y otros

Los números de acceso anteriores son los números de acceso oficiales de Genbank, o son sinónimos para números de acceso que tiene referencias cruzadas en Genbank. Estos números se pueden buscar y encontrar en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Más abajo se da un resumen general sobre cómo incrementar y disminuir la cantidad y/o actividad de polipéptidos y genes en C. glutamicum. No obstante, la persona experta en la técnica estará al tanto de otras tecnologías y enfoques para identificar nuevos homólogos de las enzimas de la Tabla 1 al realizar búsquedas en las bases de datos apropiadas, y/o para alterar la expresión de estas enzimas en organismos distintos de bacterias corineformes.

Incremento o introducción de la cantidad y/o actividad

Con respecto al incremento de la cantidad, se pueden diferenciar dos escenarios básicos. En el primer escenario, la cantidad de la enzima se incrementa mediante expresión de una versión exógena de la proteína respectiva. En el otro escenario, la expresión de la proteína endógena se incrementa influyendo sobre la actividad de, por ejemplo, el promotor y/o elemento potenciador y/u otras actividades reguladoras que regulan las actividades de las proteínas respectivas ya sea a nivel transcripcional, traduccional o post-traduccional.

De este modo, el incremento de la actividad y la cantidad de una proteína se pueden lograr vía diferentes rutas, por ejemplo cambiando mecanismos reguladores inhibidores a nivel transcripcional, traduccional, y proteico, o mediante incremento de la expresión génica de un ácido nucleico que codifica estas proteínas en comparación con el organismo de partida, por ejemplo induciendo transcetolasa endógena mediante un promotor fuerte y/o introduciendo ácidos nucleicos que codifican transcetolasa.

En una realización, el incremento de la cantidad y/o actividad de las enzimas de la Tabla 1 se logra introduciendo ácidos nucleicos que codifican las enzimas de la Tabla 1 en un microorganismo tal como C. glutamicum.

En principio, se puede usar cualquier proteína de diferentes organismos con una actividad enzimática de las proteínas enumeradas en la Tabla 1. Con secuencias de ácido nucleico genómicas de tales enzimas procedentes de fuentes eucariotas que contienen intrones, se han de usar secuencias de ácido nucleico ya procesadas, como los ADNc correspondientes, en el caso de que el organismo hospedante no sea capaz o no se pueda hacer que sea capaz del ayuste de los ARNm correspondientes. Todos los ácidos nucleicos mencionados en la descripción pueden ser, por ejemplo, una secuencia de ARN, ADN o ADNc.

Según la presente invención, el incremento o introducción de la cantidad de una proteína comprende típicamente las siguientes etapas:

a) producir un vector que comprende las siguientes secuencias de ácido nucleico, preferiblemente secuencias de ADN, en orientación 5’-3’:

-

una secuencia promotora funcional en un organismo de la invención

-

enlazada operativamente a ella una secuencia de ADN que codifica una proteína de por ejemplo la Tabla 1, sus homólogos funcionales, fragmentos funcionales o versiones mutadas funcionales

-

opcionalmente, una secuencia de terminación funcional en los organismos de la invención

b) transferir el vector de la etapa a) a un organismo de la invención, tal como C. glutamicum, y, opcionalmente, integrarlo en los genomas respectivos.

Como se expone anteriormente, fragmentos funcionales se refiere a fragmentos de secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas de por ejemplo la Tabla 1, cuya expresión todavía conduce a proteínas que tiene la actividad enzimática sustancialmente similar a la de la proteína de longitud completa respectiva.

El método mencionado anteriormente se puede usar para incrementar la expresión de secuencias de ADN que codifican enzimas de por ejemplo la Tabla 1, o sus fragmentos funcionales. El uso de tales vectores, que comprenden secuencias reguladoras, como secuencias promotoras y de terminación, es conocido por la persona experta en la técnica. Además, la persona experta en la técnica sabe cómo se puede transferir un vector de la etapa a) a organismos tales como C. glutamicum o E. coli, y qué propiedades debe tener un vector para ser capaz de ser integrado en sus genomas.

Si el contenido enzimático en un organismo tal como C. glutamicum se incrementa mediante transferencia de un ácido nucleico que codifica una enzima de otro organismo, como por ejemplo E. coli, es aconsejable transferir la secuencia de aminoácidos, codificada por la secuencia de ácido nucleico de por ejemplo E. coli mediante retrotraducción de la secuencia polipeptídica según el código genético, en una secuencia de ácido nucleico que comprende principalmente esos codones, que se usan más a menudo debido al uso de codones específico del organismo. El uso de codones se puede determinar por medio de evaluaciones de ordenador de otros genes conocidos de los organismos pertinentes.

Según la presente invención, un incremento de la expresión génica de un ácido nucleico que codifica una enzima de la Tabla 1 también se entiende que es la manipulación de la expresión de las enzimas endógenas respectivas de un organismo, en particular de C. glutamicum. Esto se puede lograr, por ejemplo, alterando la secuencia de ADN promotora para genes que codifican estas enzimas. Tal alteración, que provoca una velocidad de expresión alterada, preferiblemente incrementada, de estas enzimas, se puede lograr mediante sustitución con promotores fuertes y

mediante supresión y/o inserción de secuencias de ADN.

Una alteración de la secuencia promotora de genes endógenos provoca habitualmente una alteración de la cantidad expresada del gen, y por lo tanto también una alteración de la actividad detectable en la célula o en el organismo.

Además, una expresión alterada e incrementada, respectivamente, de un gen endógeno se puede lograr mediante una proteína reguladora, que no aparece o que se ha eliminado en el organismo transformado, y que interactúa con el promotor de estos genes. Tal regulador puede ser una proteína quimérica que consiste en un dominio de unión de ADN y un dominio activador de la transcripción, tal como se describe por ejemplo en el documento WO 96/06166.

Una posibilidad adicional para incrementar la actividad y el contenido de genes endógenos es aumentar los factores de transcripción implicados en la transcripción de los genes endógenos, por ejemplo por medio de la sobreexpresión. Las medidas para sobreexpresar factores de transcripción son conocidas por la persona experta en la técnica.

La expresión de enzimas endógenas tales como aquellas de la Tabla 1 se puede regular, por ejemplo, vía la expresión de aptámeros que se unen específicamente a las secuencias promotoras de los genes. Dependiendo de la unión del aptámero a regiones promotoras estimulantes o represoras, se puede incrementar, por ejemplo, la cantidad de las enzimas de la Tabla 1.

Además, una alteración de la actividad de genes endógenos se puede lograr mediante mutagénesis dirigida de las copias de genes endógenos.

Una alteración de los genes endógenos que codifican las enzimas de por ejemplo la Tabla 1 también se puede lograr influyendo en las modificaciones post-traduccionales de las enzimas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, regulando la actividad de enzimas como cinasas o fosfatasas implicadas en la modificación post-traduccional de las enzimas, por medio de medidas correspondientes como sobreexpresión o silenciamiento génico.

En otra realización, se puede mejorar la eficiencia de una enzima, o se puede destruir su región de control alostérico, de manera que se evita la inhibición por retroalimentación de la producción del compuesto. De forma similar, una enzima degradativa se puede suprimir o modificar mediante sustitución, supresión, o adición, de manera que su actividad degradativa se reduzca para la enzima deseada de la Tabla 1 sin alterar la viabilidad de la célula. En cada caso, se incrementará el rendimiento global, velocidad de producción, o cantidad de metionina.

Estas estrategias mencionadas anteriormente para incrementar o introducir la cantidad y/o actividad de las enzimas de la Tabla 1 no quieren ser limitantes; las variaciones de estas estrategias serán fácilmente manifiestas para aquel de pericia normal en la técnica.

Reduciendo la cantidad y o actividad de enzimas

Se ha expuesto anteriormente que se puede preferir usar un organismo de partida que ya se haya manipulado mediante ingeniería para la producción de metionina. En C. glutamicum, por ejemplo, se puede disminuir la actividad de metQ.

Para reducir la cantidad y/o actividad de enzimas, existen diversas estrategias.

La expresión de enzimas endógenas tales como aquellas de la Tabla 1 se puede regular por ejemplo vía la expresión de aptámeros que se une específicamente a las secuencias promotoras de los genes. Dependiendo de la unión del aptámero a regiones promotoras estimulantes o represoras, se puede reducir por ejemplo la cantidad y de este modo, en este caso, la actividad de las enzimas de la Tabla 1.

Los aptámeros también se pueden diseñar de una manera para unirse específicamente a las propias enzimas y para reducir la actividad de las enzimas mediante, por ejemplo, la unión al centro catalítico de las enzimas respectivas. La expresión de aptámeros se logra habitualmente mediante sobreexpresión a base de vectores (véase anteriormente), y, así como el diseño y la selección de aptámeros, es bien conocida por la persona experta en la técnica (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36).

Además, una disminución de la cantidad y de la actividad de las enzimas endógenas de la Tabla 1 se puede lograr por medio de diversas medidas experimentales, que son bien conocidas por la persona experta en la técnica. Estas medidas se resumen habitualmente bajo la expresión “silenciamiento génico”. Por ejemplo, la expresión de un gen endógeno se puede silenciar transfiriendo un vector mencionado anteriormente, que tiene una secuencia de ADN que codifica la enzima o partes de la misma en orden antisentido, a organismos tales como C. glutamicum. Esto se basa en el hecho de que la transcripción de tal vector en la célula conduce a un ARN, que se puede hibridar con el ARNm transcrito por el gen endógeno, y por lo tanto evita su traducción.

En principio, la estrategia antisentido se puede acoplar con un método de ribozima. Las ribozimas son secuencias de ARN catalíticamente activas, que, si se acoplan a las secuencias antisentido, escinden catalíticamente las secuencias diana (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Esto puede potenciar la eficiencia de una estrategia antisentido.

Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de gen que codifica una enzima de la Tabla 1 en el que se ha introducido una supresión, adición o sustitución para alterar de ese modo, por ejemplo interrumpir funcionalmente, el gen endógeno.

En una realización, el vector se diseña de manera que, con la recombinación homóloga, se interrumpa funcionalmente el gen endógeno (es decir, ya no codifica una proteína funcional). Como alternativa, el vector se puede diseñar de manera que, con la recombinación homóloga, se mute o se altere de otro modo el gen endógeno, pero todavía codifica proteína funcional; por ejemplo, la región reguladora en dirección 5’ se puede alterar para alterar de ese modo la expresión de las enzimas endógenas de la Tabla 1. Este enfoque puede tener la ventaja de que no se anula completamente la expresión de una enzima, pero se reduce hasta el nivel mínimo requerido. La persona experta sabe qué vectores se pueden usar para sustituir o suprimir secuencias endógenas. Más abajo se proporciona una descripción específica para interrumpir secuencias cromosómicas en C. glutamicum.

Además, es posible la represión génica al reducir la cantidad de factores de transcripción.

También se pueden introducir en una célula factores que inhiben a la propia proteína diana. Los factores que se unen a la proteína pueden ser, por ejemplo, los aptámeros mencionados anteriormente (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36).

Como factores adicionales que se unen a la proteína, cuya expresión puede provocar una reducción de la cantidad y/o de la actividad de las enzimas de la tabla 1, se pueden considerar anticuerpos específicos de las enzimas. La producción de anticuerpos recombinantes específicos de las enzimas, tales como anticuerpos monocatenarios, es conocido en la técnica. La expresión de anticuerpos es también conocida en la bibliografía (Fiedler et al., (1997) Immunotechnolgy 3, 205-216; Maynard y Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).

Las técnicas mencionadas son bien conocidas por la persona experta en la técnica. Por lo tanto, el experto conoce también el tamaño típico que debe tener un constructo de ácido nucleico usado por ejemplo para métodos antisentido, y qué complementariedad, homología o identidad deben tener las secuencias de ácido nucleico respectivas. Los términos complementariedad, homología e identidad son conocidos por la persona experta en la técnica.

El término complementariedad describe la capacidad de una molécula de ácido nucleico para hibridarse con otra molécula de ácido nucleico debido a enlaces de hidrógeno entre dos bases complementarias. La persona experta en la técnica sabe que dos moléculas de ácido nucleico no tienen que presentar una complementariedad de 100% a fin de ser capaces de hibridarse entre sí. Una secuencia de ácido nucleico, que se va a hibridar con otra secuencia de ácido nucleico, es preferiblemente al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, particularmente preferido al menos 80%, también particularmente preferido al menos 90%, en particular preferido al menos 95%, y lo más preferible al menos 98 ó 100%, respectivamente, complementaria con dicha otra secuencia de ácido nucleico.

La hibridación de una secuencia antisentido con una secuencia de ARNm endógena ocurre típicamente in vivo en condiciones celulares o in vitro. Según la presente invención, la hibridación se lleva a cabo in vivo o in vitro en condiciones que son suficientemente restrictivas para asegurar una hibridación específica.

Las condiciones de hibridación in vitro restrictivas son conocidas por la persona experta en la técnica, y se pueden tomar de la bibliografía (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (2001)). La expresión “hibridación específica” se refiere al caso en el que una molécula se une preferentemente a cierta secuencia de ácido nucleico en condiciones restrictivas, si esta secuencia de ácido nucleico es parte de una mezcla compleja de por ejemplo moléculas de ADN o ARN.

La expresión “condiciones restrictivas” se refiere por lo tanto a condiciones bajo las cuales una secuencia de ácido nucleico se une preferentemente a una secuencia diana, pero no, o al menos hasta un grado significativamente reducido, a otras secuencias.

Las condiciones restrictivas dependen de las circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas. En general, las condiciones restrictivas se escogen de manera que la temperatura de hibridación está a alrededor de 5ºC por debajo del punto de fusión (Tm) de la secuencia específica con una fuerza iónica definida y un valor de pH definido. Tm es la temperatura (con un valor de pH definido, una fuerza iónica definida y una concentración de ácido nucleico definida) a la que el 50% de las moléculas, que son complementarias a una secuencia diana, se hibridan con dicha secuencia diana. Típicamente, las condiciones restrictivas comprenden concentraciones salinas entre 0,01 y 1,0 M de iones sodio (o iones de otra sal), y un valor de pH entre 7,0 y 8,3. La temperatura es al menos 30ºC para moléculas cortas (por ejemplo, para tales moléculas que comprenden entre 10 y 50 ácidos nucleicos). Además, las condiciones restrictivas pueden comprender la adición de agentes desestabilizantes, como por ejemplo formamida. Los tampones típicos de hibridación y de lavado son de la siguiente composición.

Disolución de pre-hibridación: SDS al 0,5% 5x SSC NaPO4 50 mM, pH 6,8 pirofosfato de Na al 0,1% 5x reactivo de Denhardt 100 g/esperma de salmón

Disolución de hibridación: Disolución de pre-hibridación 1x106 cpm/ml sonda (5-10 min. 95ºC)

20x SSC NaCl 3 M citrato sódico 0,3 M hasta pH 7 con HCl

50x reactivo de Denhardt: 5 g de Ficoll 5 g de polivinilpirolidona 5 g de seroalbúmina bovina hasta 500 ml A dest

Un procedimiento típico para la hibridación es como sigue

Opcional: lavar la transferencia 30 min. en 1x SSC/ 0,1% SDS a 65ºC Pre-hibridación: al menos 2 h a 50-55ºC Hibridación: toda la noche a 55-60ºC Lavado: 05 min. 2x SSC/ 0,1% SDS

Temperatura de hibridación 30 min 2x SSC/0,1% SDS Temperatura de hibridación 30 min 1x SSC/0,1% SDS

Temperatura de hibridación 45 min 0,2x SSC/0,1% SDS 65ºC 5 min 0,1x SSC temperatura ambiente

Para los fines antisentido, puede ser suficiente una complementariedad a lo largo de las longitudes de secuencia de 100 ácidos nucleicos, 80 ácidos nucleicos, 60 ácidos nucleicos, 40 ácidos nucleicos, y 20 ácidos nucleicos. Ciertamente también serán suficientes longitudes más largas de ácidos nucleicos. También es concebible una aplicación combinada de los métodos mencionados anteriormente.

Si, según la presente invención, se usan secuencias de ADN, que están enlazadas operativamente en orientación 5’3’ a un promotor activo en el organismo, se pueden construir en general vectores que, después de la transferencia a las células del organismo, permiten la sobreexpresión de la secuencia codificante o provocan la supresión o competición y bloqueo de secuencias de ácido nucleico endógenas y las proteínas expresadas a partir de ellas, respectivamente.

La actividad de una enzima particular también se puede reducir sobreexpresando un mutante no funcional de la misma en el organismo. De este modo, un mutante no funcional que no es capaz de catalizar la reacción en cuestión, pero que es capaz de unirse por ejemplo al sustrato o cofactor, puede, por medio de la sobreexpresión, superar a la enzima endógena y por lo tanto inhibir la reacción. Otros métodos para reducir la cantidad y/o actividad de una enzima en una célula hospedante son bien conocidos por la persona experta en la técnica.

Según la presente invención, las enzimas no funcionales tienen esencialmente las mismas secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos, respectivamente, que las enzimas funcionales y sus fragmentos funcionales, pero tienen, en algunas posiciones, mutaciones de punto, inserciones o supresiones de ácidos nucleicos o aminoácidos, que tienen el efecto de que la enzima no funcional no sea capaz, o solamente sea capaz en un grado muy limitado, de catalizar la reacción respectiva. Estas enzimas no funcionales se pueden entremezclar con enzimas que todavía son capaces de catalizar la reacción respectiva, pero que ya no están reguladas por retroalimentación. Según la presente invención, la expresión “enzima no funcional” no comprende tales proteínas que no tienen homología de secuencias sustancial con las enzimas funcionales respectivas a nivel de aminoácidos y a nivel de ácidos nucleicos, respectivamente. Las proteínas incapaces de catalizar las reacciones respectivas y que no tienen homología de secuencias sustancial con la enzima respectiva no están por lo tanto, por definición, abarcadas por la expresión “enzima no funcional” de la presente invención. Las enzimas no funcionales también se denominan, dentro del alcance de la presente invención, como enzimas inactivadas o inactivas.

Por lo tanto, las enzimas no funcionales de por ejemplo la Tabla 1 según la presente invención, que poseen las mutaciones de punto, inserciones, y/o supresiones mencionadas anteriormente, se caracterizan por una homología de secuencias sustancial con las enzimas de tipo salvaje de por ejemplo la Tabla 1 según la presente invención, o sus partes funcionalmente equivalentes. Para determinar una homología de secuencias sustancial, se han de aplicar los grados de identidad descritos anteriormente.

Vectores y células hospedantes

Se describen aquí vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen secuencias de ácido nucleico modificadas como se menciona anteriormente. Como se usa aquí, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado.

Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral.

Ciertos vectores son capaces de replicarse autónomamente en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación, y vectores de mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedante al introducirlos en la célula hospedante, y de ese modo se replican junto con el genoma del hospedante. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se enlazan operativamente.

Tales vectores se denominan aquí como “vectores de expresión”.

En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se pueden usar de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus, y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico modificado como se menciona anteriormente en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico respectivo en una célula hospedante, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedantes a usar para la expresión, que está enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar.

Dentro de un vector de expresión recombinante, “enlazado operablemente” pretende significar que la secuencia de ácido nucleico de interés está enlazada a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la

expresión de la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro, o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, sitios de unión represores, sitios de unión activadores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, terminadores, señales de poliadenilación, u otros elementos de la estructura secundaria del ARNm). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de ácido nucleico en muchos tipos de célula hospedante, y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico solamente en ciertas células hospedantes. Las secuencias reguladoras preferidas son, por ejemplo, promotores tales como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, lambdaPR de fago, lambdaPL de fago, SP01 P15 de fago, SP01 P26 de fago, pSOD, EFTu, EFTs, GroEL, MetZ (5 últimos de C. glutamicum), que se usan preferiblemente en bacterias. Las secuencias reguladoras adicionales son, por ejemplo, promotores procedentes de levaduras y hongos, tales como ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, ENO2, promotores procedentes de plantas tales como CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o promotores de ubiquitina o faseolina. También es posible usar promotores artificiales. Aquel de pericia normal en la técnica apreciará que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedante a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión se pueden introducir en células hospedantes para producir de ese modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por las secuencias de ácido nucleico modificadas mencionadas anteriormente.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo muy a menudo con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o no de fusión.

Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, habitualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C, o fusionados con regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión sirven típicamente a cuatro fines: 1) incrementar la expresión de proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad; 4) proporcionar una “etiqueta” para la detección posterior de la proteína. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante, para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión tras la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa.

Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que se fusiona a glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, egtll, pBdCl, y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; y Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York IBSN 0 444 904018). La expresión del gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa del hospedante a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión T7 gnlO-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7gnl). Esta polimerasa viral se suministra por las cepas hospedantes BL21 (DE3) o HMS 174 (DE3) de un profago X residente que posee un gen T7gnl bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. Para la transformación de otras variedades de bacterias, se pueden seleccionar vectores apropiados. Por ejemplo, se sabe que los plásmidos pIJ101, pIJ364, pIJ702 y pIJ361 son útiles en la transformación de Streptomyces, mientras que los plásmidos pUB110, pC 194 o pBD214 son adecuados para la transformación de la especie Bacillus. Varios plásmidos de uso en la transferencia de información genética a Corynebacterium incluyen pHM1519, pBL1, pSA77 o pAJ667 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York IBSN 0 444 904018).

Los ejemplos de vectores lanzadera de C. glutamicum y de E. coli adecuados son, por ejemplo, pClik5aMCS (documento WO2005059093), o se pueden encontrar en Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8).

Los ejemplos de vectores adecuados para manipular corinebacterias se pueden encontrar en el Handbook of Corynebacterium (editado por Eggeling y Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005). Se puede encontrar una lista de vectores lanzadera de E. coli -C. glutamicum (tabla 23.1), una lista de vectores de expresión lanzadera de E. coli -C. glutamicum (tabla 23.2), una lista de vectores que se puede usar para la integración de ADN en el cromosoma de C. glutamicum (tabla 23.3), una lista de vectores de expresión para la integración en el cromosoma de C. glutamicum (tabla 23.4.) así como una lista de vectores para la integración en el cromosoma de C. glutamicum específica del sitio (tabla 23.6).

Como alternativa, el vector de expresión de proteína es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al.,

(1987) Gene 54: 113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen aquellos detallados en: van den Hondel, C. A. M. J. J. y Punt, P. J. (1991) en: Applied Molecular Genetics of Fungi,

J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, y Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York (IBSN 0 444 904018).

Se entiende que un enlace operativo es la disposición secuencial de promotor, secuencia codificante, terminador y, opcionalmente, elementos reguladores adicionales, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir su función, según su determinación, cuando se expresa la secuencia codificante.

Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003.

El ADN del vector se puede introducir en el procariota vía técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa aquí, los términos “transformación” y “transfección”, “conjugación” y “transducción” pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN o ARN lineal (por ejemplo, un vector linealizado o un constructo génico solo sin un vector), o ácido nucleico en forma de un vector (por ejemplo, un plásmido, fago, fásmido, fagómido, transposón u otro ADN en una célula hospedante, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada químicamente, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se pueden encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003), y otros manuales de laboratorio.

A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedantes, junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como, pero sin limitarse a, G418, higromicina, canamicina, tetraciclina, neomicina, ampicilina (y otras penicilinas), cefalosporinas, fluoroquinonas, ácido naladíxico, cloranfenicol, espectinomicina, ertitromicina, estreptomicina y metotrexato. Otros marcadores seleccionables incluyen genes de tipo salvaje que pueden complementar versiones mutadas del gen equivalente en una cepa hospedante o de partida. Por ejemplo, un gen esencial para el crecimiento en un medio mínimo, tal como serA, se puede mutar o suprimir del genoma de una cepa de partida u hospedante de C. glutamicum de la invención como se describe aquí anteriormente, para crear un auxótrofo de serina. Después, se puede usar un vector que contiene una copia de tipo salvaje u otra copia funcional de un gen serA para seleccionar transformantes o integrantes. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula hospedante en el mismo vector que aquel que codifica las secuencias de ácido nucleico modificadas mencionadas anteriormente, o se puede introducir en un vector distinto. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante selección con fármacos (por ejemplo, células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Cuando se usan plásmidos sin un origen de replicación y dos genes marcadores diferentes (por ejemplo pClik int sacB), también es posible generar cepas libres de marcadores que tienen insertado en el genoma parte del inserto. Esto se logra mediante dos sucesos consecutivos de recombinación homóloga (véase también Becker et al., Applied and Environmental Microbilogy, 71 (12), p. 8587-8596). La secuencia del plásmido pClik int sacB se puede encontrar en el documento WO2005059093; SEC ID 24; en este documento, el plásmido se denomina pCIS.

Como alternativa, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de una de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente en un vector al colocarla bajo el control del operón lac permite la expresión del gen solamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

También se describen organismos o células hospedantes en los que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Las expresiones “célula hospedante” y “célula hospedante recombinante” se usan aquí de forma intercambiable. Se entiende que tales expresiones se refieren no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero todavía se incluye dentro del alcance de la expresión como se usa aquí.

Crecimiento de E. coli y C. glutamicum – Medios y condiciones de cultivo

La persona experta en la técnica está familiarizada con el cultivo de microorganismos habituales tales como C. glutamicum y E. coli. De este modo, más abajo se dará una enseñanza general en cuanto al cultivo de C. glutamicum. La información correspondiente se puede recuperar de libros de texto estándar para el cultivo de E. coli.

Las cepas de E. coli se hacen crecer habitualmente en caldo MB y LB, respectivamente (Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103). Varios medios mínimos para bacterias, incluyendo E. coli y C. glutamicum, son bien conocidos en la técnica. Los medios mínimos para E. coli incluyen, pero no se limitan a, medio E, medio M9 y MCGC

modificado (Yoshihama et al. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507), respectivamente. Se puede añadir glucosa a una concentración final de entre alrededor de 0,2% y 1%. Se pueden añadir antibióticos en las siguientes cantidades (microgramos por mililitro): ampicilina, 5 a 1000; kanamicina, 25; ácido nalidíxico, 25; cloranfenicol, 5 a 120, espectinomicina 50 a 100, tetraciclina 5 a 120. Se pueden añadir aminoácidos, vitaminas, y otros suplementos, por ejemplo, en las siguientes cantidades: metionina, 9,3 mM; arginina, 9,3 mM; histidina, 9,3 mM; tiamina, 0,05 mM. Las células de E. coli se hacen crecer de forma habitual a 18 a 37 44ºC, respectivamente, dependiendo del experimento

o procedimiento particular que se esté realizando.

Las Corynebacteria genéticamente modificadas se cultivan típicamente en medios de crecimiento sintéticos o naturales. Un número de medios de crecimiento diferentes para Corynebacteria son tanto bien conocidos como fácilmente disponibles (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; patente DE 4.120.867; Liebl (1992) “The Genus Corynebacterium, en: The Procaryotes, Volumen II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag). También se pueden encontrar instrucciones en el Handbook of Corynebacterium (editado por Eggeling y Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005).

Estos medios consisten en una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y oligoelementos. Las fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di-o polisacáridos. Por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribosa, lactosa, maltosa, sacarosa, glicerol, rafinosa, almidón o celulosa sirven como fuentes de carbono muy buenas.

También es posible suministrar azúcar a los medios vía compuestos complejos tales como molasas u otros subproductos del refinado del azúcar. También puede ser ventajoso suministrar mezclas de diferentes fuentes de carbono. Otras fuentes de carbono posibles son alcoholes y ácidos orgánicos, tales como metanol, etanol, ácido acético o ácido láctico. Las fuentes de nitrógeno son habitualmente compuestos nitrogenados orgánicos o inorgánicos, o materiales que contienen estos compuestos. Las fuentes de nitrógeno ejemplares incluyen amoníaco gaseoso o sales de amoníaco, tales como NH4Cl o (NH4)2SO4, NH4OH, nitratos, urea, aminoácidos, o fuentes de nitrógeno complejas como licor de maceración del maíz, harina de haba de soja, proteína de haba de soja, extracto de levadura, extracto de carne, y otros.

La sobreproducción de metionina es posible usando diferentes fuentes de azufre. Se pueden usar sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, y también fuentes de azufre más reducido, como H2S y sulfuros, y derivados. Para lograr la producción eficiente de metionina, se pueden usar también fuentes de azufre orgánico, como metilmercaptano, tioglicolatos, tiocianatos, y tiourea, aminoácidos que contienen azufre, como cisteína, y otros compuestos que contienen azufre. También puede ser posible el formiato como suplemento, como lo son otras fuentes de C1 tales como metanol o formaldehído.

Los compuestos de sales inorgánicas que se pueden incluir en los medios incluyen las sales de cloruro, fosforosas o de sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre y hierro. Se pueden añadir compuestos quelantes al medio, para mantener a los iones metálicos en disolución. Los compuestos quelantes particularmente útiles incluyen dihidroxifenoles, como catecol o protocatecuato, o ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico. Es típico que los medios también contengan otros factores de crecimiento, tales como vitaminas

o promotores del crecimiento, cuyos ejemplos incluyen cianocobalamina (u otra forma de vitamina B12), biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales se originan frecuentemente a partir de componentes de medios complejos tales como extracto de levadura, molasas, licor de maceración del maíz, y otros. La composición exacta de los compuestos de los medios depende fuertemente del experimento inmediato, y se decide individualmente para cada caso específico. En el libro de texto “Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3) existe información sobre la optimización de los medios. También es posible seleccionar medios de crecimiento a partir de proveedores comerciales, como standar 1 (Merck) o BHI (infusión de corazón de grano, DIFCO), u otros.

Todos los componentes del medio se deberían estabilizar, ya sea por calor (20 minutos a 1,5 bares y 121 C) o mediante filtración estéril. Los componentes se pueden esterilizar juntos o, si es necesario, separadamente.

Todos los componentes de los medios pueden estar presentes al comienzo del crecimiento, o se pueden añadir opcionalmente de forma continua o por lotes. Las condiciones de cultivo se definen separadamente para cada experimento.

La temperatura debería estar habitualmente en un intervalo entre 15ºC y 45ºC, pero el intervalo puede ser mayor, hasta 105ºC para organismos termófilos. La temperatura se puede mantener constante, o se puede alterar durante el experimento. El pH del medio puede estar en el intervalo de 5 a 8,5, preferiblemente alrededor de 7,0, y se puede mantener mediante la adición de tampones a los medios. Un tampón ejemplar para este fin es un tampón de fosfato de potasio. Como alternativa o simultáneamente, se pueden usar tampones sintéticos tales como MOPS, HEPES, ACES, y otros. También es posible mantener un pH de cultivo constante a través de la adición de un ácido o base, tal como ácido acético, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, NaOH, KOH o NH4OH, durante el crecimiento. Si se utilizan componentes del medio complejos, tales como extracto de levadura, se puede reducir la necesidad de tampones adicionales, debido al hecho de que muchos compuestos complejos tienen capacidades tamponantes elevadas. Si

se utiliza un fermentador para cultivar los microorganismos, el pH se puede controlar también usando amoníaco gaseoso.

El tiempo de incubación está habitualmente en un intervalo desde varias horas a varios días. Este tiempo se selecciona a fin de permitir que se acumule la cantidad máxima de producto en el caldo. Los experimentos de crecimiento descritos se pueden llevar a cabo en una variedad de vasijas, tales como placas de microtitulación, tubos de vidrio, matraces de vidrio, o fermentadores de vidrio o metálicos de diferentes tamaños. Para el cribado de un gran número de clones, los microorganismos se deberían de cultivar en placas de microtitulación, tubos de vidrio

o matraces de agitación, ya sea con o sin deflectores. Preferiblemente, se usan matraces de agitación de 100 ó 250 ml, llenos con alrededor de 10% (en volumen) del medio de crecimiento requerido. Los matraces se deberían de agitar en un agitador giratorio (amplitud de alrededor de 25 mm) usando un intervalo de velocidades de alrededor de 100-300 rpm. Las pérdidas por evaporación se pueden reducir mediante el mantenimiento de una atmósfera húmeda; como alternativa, se debería realizar una corrección matemática para las pérdidas por evaporación.

Si se ensayan clones genéticamente modificados, también se debería ensayar un clon de control sin modificar, o un clon de control que contiene el plásmido básico sin ningún inserto. El medio se inocula hasta una OD600 de 0,5-1,5 usando células que se hacen crecer en placas de agar, tales como placas CM (10 g/l de glucosa, 2,5 g/l de NaCl, 2 g/l de urea, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de extracto de carne, 22 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de urea, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de extracto de carne, 22 g/l de agar, pH alrededor de 6,8 a 7,2 con NaOH 2M) que se han incubado a 30ºC. La inoculación de los medios se logra mediante introducción de una suspensión salina de células de C. glutamicum a partir de placas CM, o mediante adición de un precultivo líquido de esta bacteria.

Métodos generales

En Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005) eds.: L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press, at Martin et al. (Biotechnology (1987) 5, 137-146 ), Guerrero et al. (Gene (1994), 138, 35-41), Tsuchiya y Morinaga (Biotechnology (1988), 6, 428-430), Eikmanns et al. (Gene (1991), 102, 93-98), documento EP 0.472.869, US 4.601.893, Schwarzer y Pühler (Biotechnology (1991), 9, 84-87, Reinscheid et al. (Applied and Enviromnental Microbiology (1994), 60,126-132), LaBarre et al (Journal of Bacteriology (1993), 175, 1001-1007), documento WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene (1993), 134, 15-24), en documento JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering (1998), 58,191-195), Makrides (Microbiological Reviews (1996), 60, 512-538), y en libros de texto bien conocidos de biología genética y molecular, se pueden encontrar protocolos para métodos generales.

Cepas, medios y plásmidos

Las cepas se pueden tomar, por ejemplo, pero sin limitarse a, de la siguiente lista

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,

Corynebacterium thermoaminognes FERM BP-1539,

Corynebacterium melassecola ATCC 17965,

Brevibacterium flavum ATCC 14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, y

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020

o cepas que han derivado de ellas tales como

Coryneabacterium glutamicum KFCC10065, DSM 17322 o

Corynebacterium glutamicum ATCC21608

Corynebacterium efficiens DSMZ44547, 44548, 44549

Tecnología de ADN recombinante

En Sambrook, J, Fritsch, E F, y Maniatis, T, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3, y en Handbook on Corynebacterium glutamicum (2005) eds. L. Eggeling, M. Bott, Boca Raton, CRC Press, se pueden encontrar protocolos.

Cuantificación de aminoácidos e intermedios de metionina

El análisis se realizó mediante HPLC (Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Alemania) con un cartucho de guarda y una columna Synergi 4 m (MAX-RP 80 Å, 150 * 4 6 mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Antes de la inyección, los analitos se derivatizaron usando o-ftaldialdehído (OPA) y mercaptoetanol como agente reductor (2-MCE). Adicionalmente, los grupos sulfhidrilo se bloquearon con ácido yodoacético. La separación se lleva a cabo a un caudal de 1 ml/min. usando 40 mM de NaH2PO4 (eluyente A, pH = 7,8, ajustado con NaOH) como fase polar, y una mezcla de metanol con agua (100/1) como fase no polar (eluyente B). Se aplica el siguiente gradiente: comienzo 0% de B; 39 min. 39% de B; 70 min. 64% de B; 100% de B durante 3,5 min.; 2 min. 0% de B para el equilibrio. La derivatización a temperatura ambiente se automatiza como se describe más abajo. Inicialmente, se mezclan 0,5 l de 2-MCE al 0,5% en bicina (0,5M, pH 8,5) con 0,5 l de extracto celular. Subsiguientemente, se añaden 1,5 l de ácido yodoacético 50 mg/ml en bicina (0,5 M, pH 8,5), seguido de la adición de 2,5 l de tampón de bicina (0,5 M, pH 8,5). La derivatización se realiza añadiendo 0,5 l de reactivo OPA 10 mg/ml disuelto en 1/45/54 v/v/v de 2MCE/MeOH/bicina (0,5 M, pH 8,5). Finalmente, la mezcla se diluye con 32 l de H2O. Entre cada una de las etapas de pipeteado anteriores, hay un tiempo de espera de 1 min. Entonces se inyecta en la columna un volumen total de 37 l. Obsérvese que los resultados analíticos se pueden mejorar significativamente si la aguja automuestreadora se limpia periódicamente durante (por ejemplo dentro del tiempo de espera) y después de la separación de la muestra. La detección se lleva a cabo mediante un detector de fluorescencia (excitación 340 nm, emisión 450 nm, Agilent, Waldbronn, Alemania). Para la cuantificación, se usa ácido -aminobutírico (ABA) como patrón interno.

Definición del protocolo de recombinación

En lo siguiente se describirá cómo se puede construir una cepa de C. glutamicum con mayor eficiencia de producción de metionina implementando los hallazgos de las predicciones anteriores. Antes de que se describa la construcción de la cepa, se da una definición de un suceso/protocolo de recombinación, que se usará en lo siguiente.

“Campbell in”, como se usa aquí, se refiere a un transformante de una célula hospedante original en la que se ha integrado en un cromosoma una molécula de ADN bicatenario circular completa (por ejemplo, un plásmido que se basa en pCLIK int sacB) mediante un suceso de recombinación homóloga individual (un suceso cross-in), y que da eficazmente como resultado la inserción de una versión linealizada de dicha molécula de ADN circular en una primera secuencia de ADN del cromosoma que es homóloga a una primera secuencia de ADN de la mencionada molécula de ADN circular. “Campbelled in”, se refiere a la secuencia de ADN linealizada que se ha integrado en el cromosoma de un transformante “Campbell in”. Un “Campbell in” contiene una duplicación de la primera secuencia de ADN homóloga, cada copia de la cual incluye y rodea a una copia del punto de intercambio genético de recombinación homóloga. El nombre procede del Profesor Alan Campbell, quien propuso primeramente este tipo de recombinación.

“Campbell out”, como se usa aquí, se refiere a una célula que desciende de un transformante “Campbell in”, en la que se ha producido un segundo suceso de recombinación homóloga (un suceso de cross out) entre una segunda secuencia de ADN que está contenida en el ADN insertado linealizado del ADN “Campbelled in”, y una segunda secuencia de ADN de origen cromosómico, que es homóloga a la segunda secuencia de ADN de dicho inserto linealizado, dando el segundo suceso de recombinación como resultado la supresión (el descarte) de una porción de la secuencia de ADN integrada, pero, de forma importante, dando también como resultado que una porción (esta puede ser tan pequeña como una única base) del ADN Campbelled in integrado permanezca en el cromosoma, de manera que, comparada con la célula hospedante original, la célula “Campbell out” contiene uno o más cambios intencionados en el cromosoma (por ejemplo, una única sustitución de una base, múltiples sustituciones de bases, inserción de un gen o secuencia de ADN heteróloga, inserción de una copia o copias adicionales de un gen homólogo o de un gen homólogo modificado, o inserción de una secuencia de ADN que comprende más de uno de estos ejemplos mencionados anteriormente enumerados anteriormente).

Una célula o cepa “Campbell out” se obtiene habitualmente, pero no necesariamente, mediante una contraselección frente a un gen que está contenido en una porción (la porción que se desea descartar) de la secuencia de ADN “Campbelled in”, por ejemplo el gen sacB de Bacillus subtilis, que es letal cuando se expresa en una célula que se hace crecer en presencia de alrededor de 5% a 10% de sacarosa. Ya sea con o sin una contraselección, una célula “Campbell out” deseada se puede obtener o identificar cribando la célula deseada, usando cualquier fenotipo cribable, tal como, pero sin limitarse a, morfología de la colonia, color de la colonia, presencia o ausencia de resistencia a antibióticos, presencia o ausencia de una secuencia de ADN dada mediante reacción en cadena de la polimerasa, presencia o ausencia de una auxotrofia, presencia o ausencia de una enzima, hibridación de ácidos nucleicos de la colonia, cribado con anticuerpos, etc. Las expresiones “Campbell in” y “Campbell out” también se pueden usar como verbos en diversos tiempos para referirse al método o procedimiento descrito anteriormente.

Se entiende que los sucesos de recombinación homóloga que conducen a un “Campbell in” o “Campbell out” pueden ocurrir a lo largo de un intervalo de bases de ADN dentro de la secuencia de ADN homóloga, y puesto que las secuencias homólogas serán idénticas entre sí para al menos parte de este intervalo, habitualmente no es posible especificar exactamente dónde se produjo el suceso de intercambio genético. En otras palabras, no es posible especificar de forma precisa cuál secuencia procedió originalmente del ADN insertado, y cuál procedió originalmente del ADN cromosómico. Además, la primera secuencia de ADN homóloga y la segunda secuencia de ADN homóloga

están separadas habitualmente por una región de falta de homología parcial, y es esta región de falta de homología la que permanece depositada en un cromosoma de la célula “Campbell out”.

Por utilidad, en C. glutamicum, la primera y segunda secuencia de ADN homóloga típica tienen al menos alrededor de 200 pares de bases de longitud, y pueden tener hasta varios miles de pares de bases de longitud; sin embargo, se puede hacer que el procedimiento trabaje con secuencias más cortas o más largas. Por ejemplo, una longitud para las secuencias homólogas primera y segunda puede oscilar desde alrededor de 500 hasta 2000 bases, y la obtención de un “Campbell out” a partir de un “Campbell in” se facilita haciendo que las secuencias homólogas primera y segunda tengan aproximadamente la misma longitud, preferiblemente con una diferencia menor que 200 pares de bases, y muy preferiblemente, teniendo la más corta de las dos al menos 70% de la longitud de la más larga en pares de bases. El “método de Campbell in y out” se describe en el documento WO2007012078.

Ejemplos

Los siguientes experimentos demuestran cómo la sobreexpresión de formiato-THF-sintetasa y gcvHTP así como lipB

o lpl de C. jeiekeium conduce a una mayor producción de metionina. Estos ejemplos sin embargo no pretenden limitar de ningún modo la invención.

Experimentos con matraces de agitación y ensayo de HPLC

Se realizaron experimentos con matraces de agitación, con el medio de molasas estándar, con cepas por duplicado

o cuadruplicado. El medio de molasas contenía, en un litro de medio: 40 g de glucosa; 60 g de molasas; 20 g de (NH4)2SO4; 0,4 g de MgSO4*7H2O; 0,6 g de KH2PO4; 10 g de extracto de levadura (DIFCO); 5 ml de 400 mM de treonina; 2 mg de FeSO4.7H2O; 2 mg de MnSO4.H2O; y 50 g de CaCO3 (Riedel-de Haen), completando el volumen con ddH2O. El pH se ajustó hasta 7,8 con NH4OH al 20%. Se añadieron 20 ml de medio agitado continuamente (a fin de mantener suspendido el CaCO3) a 250 ml de matraces de agitación Bellco con deflectores, y los matraces se sometieron a autoclave durante 20 min. Tras el autoclave, se añadieron 4 ml de “disolución 4B” por litro del medio base (u 80 l/matraz). La “disolución 4B” contenía por litro: 0,25 g de hidrocloruro de tiamina (vitamina B1), 50 mg de cianocobalamina (vitamina B12), 25 mg de biotina, 1,25 g de hidrocloruro de piridoxina (vitamina B6), y se tamponó con 12,5 mM de KPO4, pH 7,0, para disolver la biotina, y se esterilizó mediante filtración. Los cultivos se hicieron crecer en matraces con deflectores cubiertos con papel Bioshield sujeto con bandas de caucho, durante alrededor de 48 horas a alrededor de 28ºC o 30ºC y a 200 ó 300 rpm en un agitador de suelo New Brunswick Scientific. Las muestras se tomaron típicamente a alrededor de 24 horas y/o alrededor de 48 horas. Las células se eliminaron mediante centrifugación, seguido de la dilución del sobrenadante con un volumen igual de 60% de acetonitrilo o 60% de etanol, y después filtrando con membrana la mezcla de la disolución usando columnas de giro Centricon 0,45 m. Los filtrados se evaluaron usando HPLC para determinar las concentraciones de metionina, glicina más homoserina, O-acetilhomoserina, treonina, isoleucina, lisina, y otros aminoácidos indicados.

Para el ensayo de HPLC, los sobrenadantes filtrados se diluyeron 1:100 con 1 mM de Na2EDTA filtrado con 0,45 m, y 1 l de la disolución se derivatizó con el reactivo OPA (AGILENT) en tampón de borato (80 mM de NaBO3, 2,5 mM de EDTA, pH 10,2) y se inyectó en una columna 200 x 4,1 mm Hypersil 5 AA-ODS, que se hace correr en un HPLC Agilent serie 1100 equipada con un detector de fluorescencia G1321A (AGILENT). La longitud de onda de excitación fue 338 nm, y la longitud de onda de emisión monitorizada fue 425 nm. Las disoluciones patrón de aminoácidos se cromatografiaron y se usaron para determinar los tiempos de retención y las áreas de los picos estándar para los diversos aminoácidos. Para el control del instrumento, la adquisición de datos y la manipulación de datos, se usó Chem Station, el paquete de software adjunto proporcionado por Agilent. El hardware fue un ordenador HP Pentium 4 que soporta Microsoft Windows NT 4.0 actualizado con un Microsoft Service Pack (SP6a).

Experimento 1: Generación de la cepa M2014

La cepa de C. glutamicum ATCC 13032 se transformó con ADN A (también denominado como pH273) (SEC ID NO: 21) y se sometió a “Campbell in” para producir una cepa “Campbell in”. La cepa “Campbell in” se sometió entonces a “Campbell out” para producir una cepa “Campbell out”, M440, que contiene un gen que codifica una enzima homoserina deshidrogenasa resistente a retroalimentación (homfbr). La proteína de homoserina deshidrogenasa resultante incluyó un cambio de aminoácido en el que se cambió S393 a F393 (denominado Hsdh S393F).

La cepa M440 se transformó subsiguientemente con ADN B (también denominado como pH373) (SEC ID NO: 22) para producir una cepa “Campbell in”. La cepa “Campbell in” se sometió entonces a “Campbell out” para producir una cepa “Campbell out”, M603, que contiene un gen que codifica la enzima aspartato cinasa resistente a retroalimentación (Askfbr) (codificada por lysC). En la proteína de aspartato cinasa resultante, T311 se cambió a I311 (denominado LysC T311I).

Se encontró que la cepa M603 produjo alrededor de 17,4 mM de lisina, mientras que la cepa ATCC13032 no produjo ninguna cantidad medible de lisina. Adicionalmente, la cepa M603 produjo alrededor de 0,5 mM de homoserina, en comparación con la cantidad no medible producida por la cepa ATCC 13032, según se resume en la Tabla 2.

Tabla 2: Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas ATCC13032 y M603

Cepa

Homoserina (mM) O-acetil homoserina (mM) Metionina (mM) Lisina (mM)

ATCC13032

0,0 0,4 0,0 0,0

M603

0,5 0,7 0,0 17,4

La cepa M603 se transformó con ADN C (también denominado como pH304) (SEC ID NO:23) para producir una cepa “Campbell in”, que entonces se sometió a “Campbell out” para producir una cepa “Campbell out”, M690. La cepa M690 contenía un promotor PgroES en dirección 5’ del gen metH (denominado P497 metH). La secuencia del promotor P497 se representa en SEC ID NO: 4. La cepa M690 produjo alrededor de 77,2 mM de lisina y alrededor de 41,6 mM de homoserina, como se muestra más abajo en la Tabla 3.

Tabla 3: Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M603 y M690

Cepa

Homoserina (mM) O-acetil homoserina (mM) Metionina (mM) Lisina (mM)

M603

0,5 0,7 0,0 17,4

M690

41,6 0,0 0,0 77,2

La cepa M690 se mutageneizó subsiguientemente como sigue: un cultivo durante toda la noche de M603, que se hizo crecer en medio BHI (BECTON DICKINSON), se lavó en 50 mM de tampón de citrato pH 5,5, se trató durante 20 min. a 30ºC con N-metil-N-nitrosoguanidina (10 mg/ml en 50 mM de citrato pH 5,5). Después del tratamiento, las células se lavaron nuevamente en 50 mM de tampón de citrato pH 5,5 y se colocaron en placas sobre un medio que contiene los siguientes ingredientes: (todas las cantidades mencionadas se calculan para 500 ml de medio) 10g de (NH4)2SO4; 0,5 g de KH2PO4; 0,5 g de K2HPO4; 0,125 g de MgSO4*7H2O; 21 g de MOPS; 50 mg de CaCl2; 15 mg de ácido protocatecuico; 0,5 mg de biotina; 1 mg de tiamina; y 5 g/l de D,L-etionina (SIGMA CHEMICALS, nº de CATÁLOGO E5139), ajustado a pH 7,0 con KOH. Además, el medio contenía 0,5 ml de una disolución de oligometales compuesta de: 10 g/l de FeSO4*7H2O; 1 g/l de MnSO4*H2O; 0,1 g/l de ZnSO4*7H2O; 0,02 g/l de CuSO4; y 0,002 g/l de NiCl2*6H2O, todos disueltos en HCl 0,1 M. El medio final se esterilizó mediante filtración, y se añadieron al medio 40 ml de disolución de glucosa al 50% estéril (40 ml) y agar estéril hasta una concentración final de 1,5%. El medio final que contiene agar se vertió a placas de agar y se etiquetó como medio de etionina mínima. Las cepas mutageneizadas se extendieron sobre las placas (etionina mínima) y se incubaron durante 3-7 días a 30ºC. Los clones que crecieron en el medio se aislaron y se volvieron a estriar sobre el mismo medio de etionina mínima. Se seleccionaron varios clones para el análisis de la producción de metionina.

La producción de metionina se analizó según lo siguiente. Se hicieron crecer cepas en medio CM-agar durante dos días a 30ºC, que contenía: 10 g/l de D-glucosa, 2,5 g/l de NaCl; 2 g/l de urea; 10 g/l de bactopeptona (DIFCO); 5 g/l de extracto de levadura (DIFCO); 5 g/l de extracto de carne de res (DIFCO); 22 g/l de agar (DIFCO); y que se sometió a autoclave durante 20 min. a alrededor de 121ºC.

Después de que se hicieron crecer las cepas, las células se retiraron mediante raspado y se resuspendieron en NaCl 0,15 M. Para el cultivo principal, se añadió una suspensión de células raspadas a una OD de partida de 600 nm a alrededor de 1,5 a 10 ml de Medio II (véase más abajo) junto con 0,5 g de CaCO3 sólido y sometido a autoclave (RIEDEL DE HAEN), y las células se incubaron en un matraz de agitación de 100 ml sin deflectores durante 72 h en una plataforma de agitación orbital a alrededor de 200 rpm a 30ºC. El Medio II contenía: 40 g/l de sacarosa; 60 g/l de azúcar total procedente de molasas (calculado para el contenido de azúcar); 10 g/l de (NH4)2SO4; 0,4 g/l de MgSO4*7H2O; 0,6 g/l de KH2PO4; 0,3 mg/l de tiamina*HCl; 1 mg/l de biotina; 2 mg/l de FeSO4; y 2 mg/l de MnSO4. El medio se ajustó hasta pH 7,8 con NH4OH y se sometió a autoclave a alrededor de 121ºC durante alrededor de 20 min.). Después de someter a autoclave y de enfriar, se añadió vitamina B12 (cianocobalamina (SIGMA CHEMICALS) a partir de una disolución madre esterilizada mediante filtración (200 g/ml) hasta una concentración final de 100 g/l.

Las muestras se tomaron del medio y se evaluaron para determinar el contenido de aminoácidos. Los aminoácidos producidos, incluyendo metionina, se determinaron usando el método de aminoácidos de Agilent en un aparato Agilent 1100 Serie LC System HPLC (AGILENT). Una derivatización pre-columna de la muestra con orto-ftalaldehído permitió la cuantificación de los aminoácidos producidos tras la separación en una columna Hypersil AA (AGILENT).

Se aislaron clones que mostraron un título de metionina que fue al menos doble de aquel en M690. Uno de tales

clones, usado en experimentos posteriores, se denominó M1197 y se depositó el 18 de mayo de 2005 en la colección de cepas DSMZ como número de cepa DSM 17322. La producción de aminoácidos por esta cepa se comparó con aquella por la cepa M690, como se resume más abajo en la Tabla 4.

Tabla 4: Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M690 y M1197

Cepa

Homoserina (mM) O-acetil-homoserina (mM) Metionina (mM) Lisina (mM)

M690

41,6 0,0 0,0 77,2

M1179

26,4 1,9 0,7 79,2

La cepa M1197 se transformó con ADN F (también denominado como pH399, SEC ID NO: 24) para producir una cepa “Campbell in”, que subsiguientemente se sometió a “Campbell out” para producir una cepa M1494. Esta cepa contiene una mutación en el gen para la homoserina cinasa, que da como resultado un cambio de aminoácidos en la enzima homoserina cinasa resultante de T190 a A190 (denominado HskT190A). La producción de aminoácidos por

10 la cepa M1494 se comparó con la producción por la cepa M1197, como se resume más abajo en la Tabla 5.

Tabla 5: Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M1197 y M1494

Cepa

Homoserina (mM) O-acetil-homoserina (mM) Metionina (mM) Lisina (mM)

M1197

26,4 1,9 0,7 79,2

M1494

18,3 0,2 2,5 50,1

La cepa M1494 se transformó con ADN D (también denominado pH484, SEC ID NO:25) para producir una cepa

15 “Campbell in”, que subsiguientemente se sometió a “Campbell out” para producir la cepa M1990. La cepa M1990 sobreexpresa un alelo metY usando tanto un promotor groES como un promotor EFTU (factor de alargamiento Tu) (denominado P497 P1284 metY). La secuencia del promotor P497P1284 se expone en SEC ID NO:26. La producción de aminoácidos por la cepa M1494 se comparó con la producción por la cepa M1990, como se resume más abajo en la Tabla 6.

20 Tabla 6: Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M1494 y M1990

Cepa

Homoserina (mM) O-acetil-homoserina (mM) Metionina (mM) Lisina (mM)

M1494

18,3 0,2 2,5 50,1

M1990

18,2 0,3 5,6 48,9

La cepa M1990 se transformó con ADN E (también denominado pH 491, SEC ID NO: 27) para producir una cepa “Campbell in”, que subsiguientemente se sometió a “Campbell out” para producir la cepa M2014. La cepa M2014

25 sobreexpresa un alelo metA usando un promotor de superóxido dismutasa (denominado P3119 metA). La secuencia del promotor P3119 se expone en SEC ID NO:3. La producción de aminoácidos por la cepa M2014 se comparó con la producción por la cepa M1990, como se resume más abajo en la Tabla 7.

Tabla 7: Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M1494 y M1990

Cepa

Homoserina (mM) O-acetil-homoserina (mM) Metionina (mM) Lisina (mM)

M1990

18,2 0,3 5,6 48,9

M2014

12,3 1,2 5,7 49,2

Experimento 2 – Supresión de mcbR de M2014 El plásmido pH429 que contiene una supresión RXA00655, (SEC ID NO:28) se usó para introducir la supresión mcbR en C. glutamicum vía integración y escisión (véase el documento WO 2004/050694 A1). 42

El plásmido pH429 se transformó en la cepa M2014 con selección para resistencia a canamicina (Campbell in). Usando contraselección de sacB, se aislaron derivados sensibles a kanamicina de la cepa transformada, que presumiblemente habían perdido el plásmido integrado por escisión (Campbell out). La cepa transformada produjo derivados sensibles a kanamicina que formaron colonias pequeñas y colonias más grandes. Las colonias de ambos

5 tamaños se cribaron mediante PCR para detectar la presencia de la supresión mcbR. Ninguna de las colonias más grandes contenía la supresión, mientras que 60-70% de las colonias más pequeñas contenían la supresión mcbR esperada.

Cuando un aislado original se volvió a estriar para colonias individuales en placas de BHI, apareció una mezcla de colonias minúsculas y pequeñas. Cuando las colonias minúsculas se volvieron a estriar sobre BHI, una vez más

10 apareció una mezcla de colonias minúsculas y pequeñas. Cuando las colonias pequeñas se volvieron a estriar sobre BHI, el tamaño de la colonia fue habitualmente pequeño y uniforme. Se seleccionaron dos aislados de colonia individual pequeña, denominados OM403-4 y OM403-8, para estudio posterior.

Los experimentos en matraces de agitación (Tabla 8) mostraron que OM403-8 produjo al menos el doble de la cantidad de metionina que el progenitor M2014. Esta cepa también produjo menos de un quinto de la cantidad de

15 lisina que M2014, sugiriendo una diversión del flujo de carbono desde semialdehído de aspartato hacia homoserina. Una tercera diferencia llamativa fue un incremento mayor de 10 veces en la acumulación de isoleucina por OM403 con respecto a M2014. Los cultivos se hicieron crecer durante 48 horas en medio de molasas estándar.

Tabla 8: Producción de aminoácidos por aislados de la cepa OM403 en cultivos de matraces de agitación inoculados con células que se hicieron crecer recientemente

Cepa

Tamaño de la colonia Supresión ΔmcbR Met (g/l) Lys (g/l) Hse+Gly (g/l) Ile (g/l)

M2014

Grande ninguna 0,2 2,4 0,3 0,04

0,2

2,5 0,3 0,03

0,2

2,4 0,3 0,03

0,4

3,1 0,4 0,03

OM403-8

Pequeño ΔRXA0655 1,0 0,3 0,8 0,8

1,0

0,3 0,8 0,8

0,9

0,3 0,8 0,8

1,0

0,3 0,8 0,6

También como se muestra en la Tabla 9, hubo una disminución mayor de 15 veces en la acumulación de Oacetilhomoserina por OM403 con respecto a M2014. La explicación más probable para este resultado es que la mayoría de la O-acetilhomoserina que se acumula en M2014 se convierte en metionina, homocisteína, e isoleucina en OM403. Los cultivos se hicieron crecer durante 48 horas en medio de molasas estándar.

25 Tabla 9: Producción de aminoácidos por dos aislados de OM403 en cultivos de matraces de agitación inoculados con células que se hicieron crecer recientemente

Cepa

Supresión ΔmcbR Met (g/l) OAc-Hse (g/l) Ile (g/l)

M2014

Ninguna 0,4 3,4 0,1

0,4

3,2 0,1

OM403-4

ΔRXA0655 1,7 0,2 0,3

1,5

0,1 0,3

OM-403-8

ΔRXA0655 2,2 <0,05 0,6

2,5

<0,05 0,6

Experimento 3 – Disminución de la expresión de metQ

A fin de disminuir el importe de metionina en OM403-8, se suprimió el promotor y una porción de 5’ del gen metQ. El gen metQ codifica una subunidad de un complejo de importación de metionina que es necesaria para que el complejo funcione. Esto se logró usando la técnica Campbelling in y Campbelling out estándar con el plásmido pH449 (SEC ID NO: 29). OM403-8 y OM456-2 se evaluaron para determinar la producción de metionina en ensayos con matraces de agitación. Los resultados (Tabla 10) muestran que OM456-2 produjo más metionina que OM403-8. Los cultivos se hicieron crecer durante 48 horas en medio de molasas estándar.

Tabla 10: Ensayos de OM456-2 en matraces de agitación

Cepa

vector [Met] (g/l) [Lys] (g/l) [Gly/Hse] (g/l) [OAcHS] (g/l) [Ile] (g/l)

OM403-8

ninguno 4,0 0,8 2,2 0,4 1,9

3,9

0,6 2,2 0,4 1,9

OM456-2

ninguno 4,2 0,4 2,3 0,4 2,3

4,3

0,5 2,4 0,4 2,3

Experimento 4 Construcción de OM469

10 Se construyó una cepa, denominada OM469, que incluyó tanto la supresión de metQ como la sobreexpresión de metF al sustituir el promotor de metF por el promotor PR fágico en OM456-2. Esto se logró usando la técnica de Campbelling in y Campbelling out estándar con el plásmido pOM427 (SEC ID NO: 30). Se evaluaron cuatro aislados de OM469 para determinar la producción de metionina en ensayos de cultivo con matraces de agitación, en los que produjeron todos ellos más metionina que OM456-2, como se muestra en la Tabla 11. Los cultivos se hicieron crecer

15 durante 48 horas en medio de molasas estándar que contiene 2 mM de treonina.

Tabla 11: Ensayos en matraces estándar de OM469, un derivado de OM456-2 que contiene el promotor fágico lambda PR en lugar del promotor de metF

Cepa

Promotor de metF MetQ [Met] (g/l) [Lys] (g/l) [Gly/Hse] (g/l) [OAcHS] (g/l) [Ile] (g/l)

OM428-2

PR nativo 4,5 0,5 2,6 0,4 2,6

4,6

0,4 2,6 0,3 2,5

OM456-2

nativo ΔmetQ 4,2 0,4 2,4 0,3 2,5

4,2

0,5 2,4 0,3 2,5

OM469-1

PR ΔmetQ 5,0 0,5 2,7 0,4 3,1

-2

4,9 0,5 2,7 0,4 2,8

-3

4,8 0,4 2,6 0,4 2,7

-4

4,7 0,5 2,6 0,4 2,8

Experimento 5 – Construcción de M2543

20 La cepa OM469-2 se transformó mediante electroporación con el plásmido pCLIK5A PSOD TKT, como se representa en SEC ID NO. 31. Esto se logró usando la técnica de Campbelling in y Campbelling out estándar. Los aislados de OM 469 PSOD TKT, que se etiquetaron como M2543, se evaluaron para determinar la producción

de metionina en ensayos de cultivo con matraces de agitación, en los que produjeron más metionina que OM469-2. Los resultados de la cepa M2543 se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Ensayos de OM469 y M2543 en matraces de agitación

Cepa

plásmido genes met en el plásmido [Met] (mm [Lys] (mm) [Gly] (mm) [Hse] (mm) [AHs] (mm) [Ile] (mm)

OM469-2

Ninguno 14 3,4 16 1,7 0,3 11,8

M2543#

Ninguno 20,4 1,9 21,8 0,8 <0,1 12,4

Experimento 6 – Construcción de GK1259

A fin de disminuir la expresión de serina desaminasa (sda), se suprimió una porción del gen sda. Esto se logró usando la técnica de Campbelling in y Campbelling out estándar con el plásmido pH626 int SacB delta sdaA (SEC ID No. 32). Para este fin, la cepa M2543 se transformó mediante electroporación con el plásmido pH626 int SacB delta sdaA. La cepa resultante se denominó GK1259.

Experimento 7 – Construcción de OM264C

El plásmido pOM253 (SEC ID No. 33) se usó para suprimir serA y sustituirlo por resistencia a espectinomicina en la cepa M2014 de C. glutamicum. La cepa “Campbelled out” resultante, M2014 serA::spec, se denominó OM264C. OM264C es un auxótrofo de serina. Puesto que también carece de un GCS funcional, OM264C no puede crecer en un medio mínimo que carezca de serina pero que contiene glicina. Sin embargo, si se instala en OM264C un sistema GCS funcional, entonces ganará la capacidad para crecer en medio mínimo que contenga glicina.

La receta para las placas mínimas (químicamente definidas) fue como sigue:

Nombre de la disolución madre

Concentración del lote Volumen del lote para 1 litro

10 X sales de Spizizen

Véase más abajo 100 ml

Glucosa

50% w/v 10 ml

Disolución de 4B

Véase más abajo 4 ml

Treonina

400 mM 5 ml

Cisteína HCl

4 g/l 10 ml

CaCl2·2H2O

5% p/v 5 ml

Citrato de sodio

1,0 M 20 ml

Timidina

1% p/v 10 ml

Fenilalanina

1% p/v 10 ml

Isoleucina

1% p/v 10 ml

Tiamina HCl

0,1% p/v 5 ml

Metionina

1% p/v 5 ml

Succinato de sodio

1,0 M 3 ml

Acetato de potasio

5,0 M 1,2 ml

Glicina (cuando se añade)

10% p/v 5 ml

Serina (cuando se añade)

10% p/v 2 ml

Ácido lipoico (cuando se añade)

1 g/l en fosfato de potasio 20 mM, pH 7,0 1 ml

Todos los lotes se esterilizaron mediante filtración. Para las placas de Petri con agar, se suspendieron 15 g de agar en 800 ml de agua destilada, y se sometieron a autoclave.

10 X sales de Spizizen

20 g de sulfato de amonio

174 g de fosfato potásico dibásico (trihidratado)

60 g de fosfato potásico monobásico (anhidro)

10 g de citrato de sodio (dihidratado)

2 g de sulfato de magnesio (heptahidratado)

Agua destilada hasta un litro Añádanse 3,5 ml de FeCl3•6H2O al 0,4%, esterilizado mediante filtración y 1 ml de Disolución de micronutrientes (véase más abajo). El pH final debería ser alrededor de 7,2. Esterilícese mediante filtración. Disolución de micronutrientes: cantidad para 1 litro

0,15 g de Na2MoO4•2H2O

2,5 g de H3BO3

0,7 g de CoCl2•6H2O

0,25 g de CuSO4•5H2O

1,6 g de MnCl•4H2O

0,3 g de ZnSO4•7H2O

Agua destilada hasta un litro.

Esterilizar mediante filtración.

Disolución 4B: cantidad para un litro

0,25 g de tiamina HCl (vitamina B1)

50 mg de cianocobalamina (vitamina B12)

25 a 28 mg de biotina

1,25 g de piridoxina HCl (vitamina B6)

Disolver en fosfato potásico 50 mM, pH 7,0

Esterilícese mediante filtración. Almacénese en la oscuridad. Experimento 8 – Construcción de cepas que expresan los genes de C. jeikeium gcvPTH en C. glutamicum A diferencia de C. glutamicum, un pariente cercano, denominado C. jeikeium, sí contiene un GCS. En el cromosoma de C. jeikeium, los genes gcvP, T, y H están agrupados juntos en un operón (Tauch et al., 2005, J. Bacteriol., vol

187, p. 4671-4682). Este agrupamiento se clonó en cuatro piezas de subconjuntos solapantes mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando como molde ADN cromosómico de la cepa K411 de C. jeikeium. El ADN necesario se obtuvo dividiendo la secuencia en cuatro regiones más pequeñas y obteniendo cuatro

fragmentos de PCR más pequeños independientes. Las cuatro piezas se amplificaron con cuatro conjuntos de cebadores. Se manipularon mediante ingeniería un sitio XbaI artificial y un sitio de unión al ribosoma artificial justo en dirección 5’ del codón de partida de gcvP en el cebador de sentido respectivo, y se manipuló mediante ingeniería un sitio BamHI artificial justo en dirección 3’ a partir del codón de parada de gcvH en el cebador antisentido respectivo. Esto permitió que las secuencias codificantes del agrupamiento gcvPTH se reconstituyeran y fueran portadas en un fragmento XbaI a BamHI.

El fragmento XbaI a BamHI resultante que contiene el agrupamiento de gcvPTH reconstituido se clonó a continuación en plásmidos replicantes de C. glutamicum diseñados para expresar genes a partir del promotor

groESL de C. glutamicum, denominado aquí P497, o un promotor fágico SPO 1 de B. subtilis, denominado aquí P15 (SEC ID No. 42). Los plásmidos resultantes se denominan pOM615 (SEC ID No. 34) y pOM616 (SEC ID No. 35), respectivamente. Los promotores P497 y P15 se usaron debido a que promueven la expresión constitutiva de genes situados en dirección 3’. En particular, estos promotores no están regulados significativamente por ningún metabolito relacionado con la glicina, tal como glicina, serina, metionina, timidina, purina, etc.

Experimento 9 – Los genes gcvP7H de C. jeikeium funcionan en C. glutamicum

Los plásmidos pOM615, pOM616, y el vector vacío pCLIK se transformaron cada uno separadamente en la cepa probadora cepa OM264C de C. glutamicum y la cepa GK1259 de C. glutamicum productora de metionina, usando selección en placas de agar con Infusión de Cerebro Corazón (anteriormente Difco, ahora Becton Dickenson) que contienen sulfato de kanamicina (25 mg/l). Los transformantes OM264C se rallaron en placas mínimas que carecen de serina pero que contienen glicina. Se añadió ácido lipoico al medio para dar una concentración final de 1 mg/l para asegurar que había cantidades suficientes de este cofactor de GcvH.

Ambas cepas derivadas de pOM615 y pOM616, OM264C(pOM615) y OM264C(pOM616) así como GK1259(pOM615) y GK1259(pOM616 crecieron, mientras que el transformante de pCLIK (OM264C(pCLIK) no lo hizo.

Experimento 10 – Los genes lipBA de C. jeikeium funcionan en C. glutamicum

C. glutamicum es un prototrofo de ácido lipoico, y C. glutamicum tiene presuntamente una lipoil sintetasa, puesto que piruvato deshidrogenasa y -cetoglutarato deshidrogenasa están activas.

En E. coli, hay dos rutas diferentes para la unión (ligación) de ácido lipoico a proteínas diana, la ruta dependiente de LipB para ácido lipoico sintetizado endógenamente, y la ruta de LplA para ácido lipoico alimentado (Morris et al., 1995, J. Bacteriol. Vol 177, p. 1-10).

Mediante comparación de secuencias, parece que C. glutamicum tiene buenos homólogos tanto para LipB como para LplA. De este modo, el gen lipB y su promotor nativo, junto con el gen lipA, se clonó mediante PCR a partir de ADN cromosómico de la cepa K411 de C. jeikeium como molde. El fragmento de PCR romo resultante se ligó en el sitio SwaI único de pOM615 o pOM616 para dar pOM620AF (SEC ID No 36) y pOM621AR (SEC ID No 37), respectivamente.

Los plásmidos pOM620AF y pOM621AR se transformaron cada uno en la cepa OM264C dando como resultado OM264C(pOM620AF) y OM264C(pOM621AR) respectivamente, y en la cepa GK1259 productora de metionina, dando como resultado GK1259(pOM620AF) y GK1259(pOM621AR), respectivamente. Los transformantes de OM264C se rallaron en las placas de glicina mínima descritas anteriormente (pero sin ácido lipoico), y ambos transformantes crecieron, mientras que OM264C(pCLIK) no lo hizo, demostrando que la ruta de LipB de C. jeikeium podría lipoilar la proteína GcvH de C. jeikeium cuando los dos se expresan juntos en C. glutamicum.

Los transformantes de GK1259 de pOM615, pOM616, pOM620AF, pOM621AR, y pCLIK se ensayaron para determinar la producción de metionina y de glicina en matraces de agitación usando medio de molasas, sin ácido lipoico o con ácido lipoico añadido hasta una concentración final de alrededor de 10 mg/ml. Los resultados se muestran en las Tablas 13 y 14 más abajo.

Tabla 13: Producción de metionina y de glicina por GK1259 transformado con diversos plásmidos diseñados para

expresar gcvPTH de C. jeikeium con lipBA y que se hacen crecer en matraces de agitación en medio de molasas.

Plásmido

Promotor para gcvPTH lipBA Ácido lipoico Glicina g/l Metionina g/l

pCLIK

- - - 2,5 4,3

pOM615

P497 - + 0,1 4,7

pOM620AF

P497 + - 0,0 5,0

Tabla 14: Producción de metionina y de glicina por O264C transformado con diversos plásmidos diseñados para expresar gcvPTH de C. jeikeium con lipBA y que se hacen crecer en matraces de agitación en medio de molasas.

Plásmido Promotor para Ácido lipoico Glicina* g/l Metionina* g/l

lipBA

gcvPTH añadido pCLIK

---

2,13,8

Plásmido

Promotor para gcvPTH lipBA Ácido lipoico añadido Glicina* g/l Metionina* g/l

pOM616

P15 P15 -+ + - 0,0 0,0 4,1 3,9

POM621AR

* Los títulos de metionina y de glicina son promedios de muestras duplicadas, excepto para la muestra de pOM616 más ácido lipoico, que es una única muestra.

A partir de estos resultados, está claro que el subproducto de glicina en exceso se consume y el título de metionina mejora al expresar el operón gcvPTH de C. jeikeium. Se logra una mejora adicional al expresar el operón gcvPTH de

C. jeikeium y el operón lipBA de C. jeikeium a partir del mismo plásmido.

Experimento 11 – Expresión de gcvPTH y lipBA a partir de casetes integrados

En los ejemplos dados anteriormente, los genes gcv y lip se instalaron en plásmidos que se replican en la C. glutamicum. Sin embargo, estos genes también se pueden instalar a través de un vector integrante. Por ejemplo, el operón gcvPTH de C. jeikeium expresado a partir del promotor P15 se ha ligado en un vector integrante para dar pOM627 (SEC ID No. 38), que se diseña para integrarse en el locus bioB de C. glutamicum.

pOM627 se puede obtener a partir de “Campbell in” y “Campbell out” de las cepas OM469 y GK1259. Como en el ejemplo anterior, se observa producción mejorada de metionina y una reducción de la acumulación de glicina como se muestra en la Tabla 15.

Tabla 15: Producción de metionina y glicina por transformantes de OM469 y GK1259 usando pOM627 diseñado para expresar gcvPTH de C. jeikeium a partir de P15 tras la integración en bioB, y que se hacen crecer en matraces de agitación en medio de molasas con o sin ácido lipoico 10 mg/l añadido.

Cepa

Ácido lipoico Glicina g/l Metionina g/l

OM469(pOM627)K

- 2,7 3,8

OM469(pOM627)K

+ 2,0 4,0

GK1259(pOM627)K

- 2,8 3,9

GK1259(pOM627)K

+ 2,0 4,1

El efecto del plásmido integrante pOM627 sobre la producción de glicina y metionina se puede mejorar instalando múltiples copias o incrementando la fuerza del promotor.

También se puede añadir el operón lipBA de C. jeikeium (ya sea en vectores replicantes o integrantes). Un ejemplo de un plásmido integrante que expresa lipBA a partir del promotor P497 tras la integración en el locus bioAD de C. glutamicum es pOM180 (SEC ID No 39).

Experimento 12 – El sistema GCS de E. coli también funciona en C. glutamicum

El gen lpd de E. coli se amplificó mediante PCR y se instaló en un plásmido integrante para dar pOM331 (SEQ ID No 40). El sitio de integración es un gen denominado aquí metE2, un gen que es homólogo a una porción de metE, pero que no parece que es esencial para el crecimiento o producción de metionina en C. glutamicum.

En pOM331, el gen lpd de E. coli se expresa a partir del promotor P497. pOM331 se transformó en y se sometió a Campbell out de OM264C para dar una nueva cepa OM197, que se confirmó mediante una PCR de diagnóstico apropiada que contiene el casete P497 lpd integrado. Además, el operón gcvTHP de E. coli se amplificó mediante PCR y se ligó justamente en dirección 3’ del promotor P497 en un vector replicante, para dar pOM344 (SEC ID No. 41). pOM344 y pCLIK se transformaron cada uno separadamente en la cepa OM197, y las cepas resultantes se rallaron sobre placas de glicina mínima que contienen glicina y ácido lipoico, pero que carecen de serina (véase anteriormente).

Después de varios días a 30ºC, OM197/pOM344 había crecido, pero OM197/pCLIK no lo hizo, demostrando que el sistema GCS de E. coli estaba funcionando en C. glutamicum.

En los ejemplos anteriores, se muestra que los genes que codifican las subunidades P, T y H del GCS, y los genes que codifican enzimas que catalizan la ligación o síntesis de ácido lipoico, clonados a partir de cualesquiera de dos organismos “donantes” (que no están relacionados entre sí de forma parentesca), son capaces cada uno de funcionar para dar actividad de GCS medible en C. glutamicum, ya sea mostrando complementación de una

auxotrofia de serina en placas que contienen glicina pero no serina, o mostrando una disminución en la producción de glicina mediante una cepa productora de metionina en comparación con la producción de glicina de la cepa parental o precursora pertinente transformada con un vector vacío como control.

Por extensión, parece razonable suponer que un experto en la técnica será capaz de seguir los ejemplos descritos aquí y reconstruir otros sistemas GCS en C. glutamicum, y que la actividad de GCS se puede establecer y/o incrementar en otros microorganismos al clonar los genes pertinentes de los mismos (es decir, E. coli y C. jeikeium)

o de otros organismos donantes. La mejora también se puede lograr alimentando ácido lipoico, por ejemplo a alrededor de 0,1 a 10 mg/l.

Experimento 13 – Construcción de M2616

Se construyó M2616 de C. glutamicum. Esta cepa, que muestra actividad de serA suprimida, permite ensayar la función de formiato THF sintetasa.

El plásmido pHF96 (SEC ID 43) es un plásmido integrante diseñado para crear una supresión-sustitución en el gen serA de cepas de C. glutamicum relacionadas con C. glutamicum ATCC 13032. Para suprimir sera en M2543, se usó el plásmido pHF96 int sacB delta serA. El plásmido se transformó en M2543 de C. glutamicum mediante electroporación, y se aislaron los clones resistentes a kanamicina. Después de determinar estas cepas “Campbelled in” resistentes a kanamicina como exitosas mediante PCR, las cepas se hicieron crecer toda la noche en medio CM líquido y se colocaron en placas en Medio CM que contiene sacarosa (concentración 10%). La cepa “Campbelled out” resultante, M2543 delta serA, se denominó M2616. Como se esperaba, M2616 es un auxótrofo de serina cuando se ensaya en medio mínimo. También como se esperaba, puesto que carece de una formiato THF sintetasa funcional, M2616 no puede crecer en un medio mínimo que carezca de serina pero que contenga glicina y formiato (véase el Ejemplo para la receta para el medio mínimo (químicamente definido)). Si se instala en M2616 un sistema de formiato THF sintetasa funcional, entonces ganará la capacidad para crecer en medio mínimo que contiene glicina.

Experimento 14 – Clonación de dos genes de formil-THF sintetasa a partir de dos fuentes de Corynebacterium jeikeium

A diferencia de C. glutamicum, un pariente cercano denominado Corynebacterium jeikeium sí contiene una proteína formil-THF sintetasa con el número de acceso NP_939608, y un gen correspondiente con el número de acceso GeneID: 2649808.

Se utilizaron dos fuentes de moldes para la clonación de la formil-THF sintetasa a partir de Corynebacterium jeikeium. Se usó ADN derivado de la cepa de la NCTC National Collection of Type Cultures Londres, UK, número 11915 con la denominación de cepa K411, y de la cepa 7171 de DSMZ. El ADN cromosómico se preparó usando el kit de ADN de Quiagen, como se describe por el fabricante. Los oligonucleótidos HS1304 (SEC ID No: 44) y HS1305 (SEC ID No. 45) se usaron para amplificar las secuencias genómicas del gen de formiato-THF sintetasa de las dos fuentes de ADN genómico (NCTC 11915 y DZMZ 7171). Se usó la Pwo polimerasa de Roche Mannheim en las siguientes condiciones: hibridación a 52ºC durante 30” y alargamiento a 72ºC durante 120” que produjeron un fragmento de PCR de alrededor de 1700 pb.

Además, los cebadores HS1302 (SEC ID No. 46) y HS1303 (SEC ID No. 47) se usaron para amplificar la unidad de expresión del promotor con la secuencia como se describe a partir de ADN cromosómico derivado de la cepa ATCC13032. Se usó la Pwo polimerasa de Roche Mannheim en las siguientes condiciones: hibridación a 53ºC durante 30” y alargamiento a 72ºC durante 30” que produjeron un fragmento de PCR de alrededor de 200 pb.

Ambos fragmentos se añadieron en una tercera PCR, en la que se añadieron los cebadores HS13032 y HS1305. La tercera PCR se llevó a cabo con cantidades limitantes de los fragmentos I y II de PCR en cantidades suficientes de los cebadores extremo a extremo, y se fusionó usando los cebadores extremo a extremo. HS1302+HS1305 se usaron para amplificar un constructo de fusión de los fragmentos de PCR que resultan de los cebadores HS1302+HS1303 y HS1304+HS1305. Se usó la Pwo polimerasa de Roche Mannheim en las siguientes condiciones: hibridación a 55ºC durante 30” y alargamiento a 72ºC durante 120” que produjeron un fragmento de PCR de alrededor de 1900 pb.

El fragmento se purificó con el kit de purificación de PCR GFX, y se digirió usando las enzimas de restricción MluI y XbaI. Se secuenciaron plásmidos positivos que contienen el inserto del gen de formil-THF sintetasa.

Se secuenció el gen derivado de NCTC K11915 de C jeikeium. La secuenciación de este gen reveló que la secuencia era como se esperaba. Se secuenció el gen derivado de DSMZ 7171 de C jeikeium. La secuenciación de este gen reveló una secuencia como se describe en la secuencia del plásmido pH657.

El plásmido pH655 (SEC ID No. 48) que comprende formiato-THF-sintetasa de NCTC K11915, y pH657 (SEC ID No. 49), que comprende formiato-THF-sintetasa de DSMZ7171, se transformaron mediante electroporación en la cepa M2616 que carece del gen serA funcional.

Las cepas M2616(pH655) y M2616(pH657) resultantes, así como la cepa que carece de un plásmido, se rallaron sobre medio mínimo que contiene 10 mM de treonina, 20 mM de formiato de Na, y 20 mM de glicina +-10 mM de serina. Las cepas que contienen los plásmidos pH655 y pH657 pero no pCLIK5a formaron colonias en medio mínimo que contiene formiato y glicina, mientras que, incluso tras la incubación prolongada, la cepa M2616 no produjo colonias en este medio que carece de serina. En el mismo medio mínimo con treonina añadida, formiato de Na y glicina, pero con serina añadida (20 mM), todas las cepas formaron colonias, incluyendo M2616.

Este resultado mostró la expresión funcional con éxito de la formiato THF sintetasa derivada de Corynebacterium jeikeium NCTC y DSMZ 7171 en Corynebacterium glutamicum, para proporcionar una cepa que utiliza formiato en la síntesis de serina.

Experimento 15 – Construcción de una cepa sobreproductora de metionina que expresa genes de formiato-THF sintetasa

Los plásmidos pH655 y pH657 se transformaron en la cepa GK1259 mediante electroporación. Las cepas resultantes GK1259(pH655) y GK1259(pH657), así como la cepa que no contiene plásmido, se incubaron en ensayos con matraces de agitación como se describe previamente. Además, se añadió formiato 20 mM al medio de crecimiento. Se observó que la expresión del gen de formiato THF sintetasa mejoró la productividad de metionina de la cepa con respecto a la cepa que carece del gen de formiato THF sintetasa. En la tabla 16 se encuentran los datos.

Tabla 16: Ensayos en matraces de agitación de GK1259, y GK1259(pH655) que sobreexpresa formiato-THF sintetasa

Cepa

Plásmido Gen sobreexpresado [Met] (mM/l)

GK1259

Ninguno ninguno 23,3

GK1259

pH655 formiato THF sintetasa 24,6

Experimento 16 – Supresión de formil-THF-desformilasa en la cepa M2543.

Se detectó mediante comparación de secuencias que C. glutamicum contiene un gen, que se ha anotado como una formil-THF desformilasa (nº de Acceso Ncgl0371). Este gen se ha anotado como codificante de una enzima con la actividad enzimática de formil-THF desformilasa, que escinde formiato del metabolito formil-tetrahidrofolato (Annual review of plant physiology and plant molecular biology (2001) 52. 119-137).

La genosupresión de la formil-THF deformilasa (número de acceso Ncgl0371) se llevó a cabo clonando un fragmento de ADN en el que la región en dirección 5’ del gen que codifica NCgl0371 (aproximadamente 500 pb de longitud) y su región en dirección 3’ (aproximadamente 500 pb de longitud) del mismo gen se amplificaron, se fusionaron mediante PCR de fusión, y se clonaron en un vector, dando como resultado pH670 int sacB delta deformilasa (SEC ID No. 50). El plásmido se transforma en la cepa M2543 para producir primeros recombinantes (“etapa de Campbell in”). Tras el cribado con éxito de los primeros recombinantes correctos mediante PCR, la cepa se hizo crecer toda la noche en cultivo líquido, y se colocó en medio de crecimiento que contiene 10% de sacarosa. Este tratamiento (“etapa de Campbell out”) conduce a una cepa denominada GK1546, en la que el marcador de resistencia a kanamicina y el gen de sacarosa de levano codificado por el plásmido pH670 se intercambian genéticamente con éxito en el cromosoma y subsiguientemente se pierden del cromosoma y la célula. Las cepas sucesivas de la etapa de Campbell out se identifican como supresiones de la formil-THF deformilasa mediante cribado por PCR utilizando cebadores que codifican secuencias en las regiones de 5’ y de 3’ de la formil-THF deformilasa descrita. Los clones positivos muestran un fragmento de PCR que es aproximadamente 900 pb más corto que el producto de la PCR procedente de una cepa de tipo salvaje de formil-THF deformilasa. La cepa resultante se denominó GK1546.

Experimento 17 – Construcción de una cepa a la que se le ha suprimido formil-THF deformilasa y que sobreexpresa formiato-THF-sintetasa

La cepa GK1546 se transforma con los plásmidos pH655 y pH657. Las cepas resultantes GK1546(pH655) y GK1546(pH657) muestran un comportamiento de crecimiento significativamente mejorado cuando se hacen crecer en un medio mínimo que contiene formiato, glicina y treonina, pero no serina, con respecto a la cepa M2543.

Experimento 18 – Expresión de formiato-THF-sintetasa funcional para la producción de metionina

La cepa M2616 se transformó con pH655 (formiato-THF-sintetasa NCTC 11915) y pH657 (formiato-THF-sintetasa DSMZ 7171). Las cepas resultantes M2616(pH655) y M2616(pH657) se analizaron en ensayos con matraces de agitación como se describe previamente.

El medio se suministró con 20 mM de glicina así como 20 mM de formiato de Na, además de la composición normal

descrita anteriormente. Los matraces de agitación se incubaron a 30ºC con una velocidad de agitación de 200 RPM. Después de 48 h, se determinó la metionina. Se encontró que la cepa progenitora M2616 sin el plásmido que expresa formiato-THF sintetasa no creció hasta una OD medible, y no utilizó la fuente de carbono dada. Los sobrenadantes se ensayaron para determinar formiato en el sobrenadante mediante HPLC. Las cepas que contienen los plásmidos pH655 y pH657 muestran una utilización de todo el formiato añadido al medio. Además, se observa que las cepas que se hicieron crecer en formiato, glicina y que expresan el gen de formiato THF-sintetasa produjeron cantidades medibles de metionina, mientras que la cepa M2616 no produjo metionina en absoluto. Los resultados se muestran en la tabla 17.

Tabla 17: Producción de metionina en M2616 y en transformantes plasmídicos de M2616

Cepa

plásmido Gen sobreexpresado [Met](mM/l)

M2616

Ninguno ninguno 0

M2616

pH655 formiato-THF-sintetasa NCTC 4,1

M2616

pH657 formiato THF-sintetasa DSMZ 5,5

En otro experimento, se añadió serina 20 mM al medio de cultivo descrito en el Experimento 18. M2616 y M2616 que expresa el gen de formiato-THF-sintetasa DSMZ 7171 se hicieron crecer en presencia de serina, y se evaluaron para determinar la metionina producida. Se encontró que los títulos de metionina resultantes en el caso de sobreexpresión son mayores en el caso de las cepas M2616, que expresaron el gen de formiato-THF-sintetasa

15 DSMZ, en comparación con la cepa que no contiene un gen de formiato-THF-sintetasa. El dato se encuentra en la tabla 18.

Tabla 18: Sobreproducción de metionina en cepas que sobreexpresan formiato-THF-sintetasa

Cepa

Serina añadida Gen sobreexpresado [Met] (mM/l)

M2616

+ ninguno 6,6

M2616 pH657

+ formiato-THF-sintetasa DSMZ 8,9

LISTADO DE SECUENCIAS 20 <110> Evonik Degussa GmbH

<120> Bacterias corineformes con actividad de escisión de glicina

<130> 2007P00927WE01

<160> 52

<170> PatentIn version 3.3 25

<210> 1

<211> 1689

<212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium 30 <400> 1

<210> 2

<211> 562

<212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 2

<210> 3

<211> 192

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> promotor P3119 = PSOD

<400> 3

10 <210> 4

<211> 184

<212> ADN

<213> artificial

<220> 15 <223> promotor P497 = PgroES

<400> 4

<210> 5

<211> 199

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> promotor P1284 = PEFTU

<400> 5

<210> 6 10 <211> 114

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> promotor ... = lpR 15 <400> 6

<210> 7

<211> 915

<212> ADN 20 <213> Corynebacterium glutamicum

<400> 7

<210> 8

<211> 304

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

<210> 9

<211> 2952

<212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 9

<210> 10

<211> 983

<212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 10

<210> 11

<211> 384

<212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 11

<210> 12

<211> 127

<212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 12

<210> 13

<211>

1170 10 <212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 13

<210> 14

<211> 389

<212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 14

<210> 15

<211> 1017

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 15

<210> 16

<211>

338 10 <212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 16

<210> 17

<211> 1050

<212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 17

<210> 18 10 <211> 349

<212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 18

<210> 19

<211> 759

<212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 19

<210> 20

<211> 252 10 <212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 20

<210> 21

<211> 7070

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH273

<400> 21

<210> 22

<211> 7070

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH373

<400> 22

<210> 23

<211> 8766

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH304

<400> 23

<210> 24

<211> 7070

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH399

<400> 24

<210> 25

<211> 6625

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH484

<400> 25

<210> 26

<211> 363

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del promotor P497_P1284 = PgrESPEFTu>P497_P1284

<400> 26

<210> 27

<211> 6350

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH491

<400> 27

<210> 28

<211> 5477

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH429

<400> 28

<210> 29

<211> 5697

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH449

<400> 29

<210> 30

<211> 7318

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM427

<400> 30

<210> 31

<211> 5715

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pCLIK5APsodTKT

<400> 31

<210> 32

<211> 5083

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH626 int SacB delta sdaA

<400> 32

<210> 33

<211> 6995

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM253

<400> 33

<210> 34

<211> 11491

<212> ADN

<213> artificial <220>

<223> Plásmido pOM615

<400> 34

<210> 35

<211> 11639

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM616

<400> 35

<210> 36

<211> 13915

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM620AF

<400> 36

<210> 37

<211> 14063

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM621AR

<400> 37

<210> 38

<211> 11872

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM627

<400> 38

<210> 39

<211> 9206

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM180

<400> 39

<210> 40

<211> 10003

<212> ADN

<213> artificial <220>

<223> Plásmido pOM331

<400> 40

<210> 41

<211> 11325

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pOM344

<400> 41

<210> 42

<211> 200

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Promotor P15

<400> 42

10 <210> 43

<211> 5666

<212> ADN

<213> artificial

<220> 15 <223> Plásmido pHF96

<400> 43

<210> 44

<211> 40

<212> ADN

5

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido HS1304

<400> 44

tacgaaagga ttttttaccc atgactaact cttctgcaac

40

10

<210> 45

<211> 32

<212> ADN

<213> artificial

<220>

15

<223> HS1305

<400> 45

agcgcgtcta gattagaaca gccccgagat aa

32

<210> 46

<211> 32

<212> ADN

5

<213> artificial

<220>

<223> HS1302

<400> 46

gctagaacgc gtgagctgcc aattattccg gg

32

10

<210> 47

<211> 40

<212> ADN

<213> artificial

<220>

15

<223> HS1303

<400> 47

gttgcagaag agttagtcat gggtaaaaaa tcctttcgta

40

<210> 48

<211> 6965

20

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH655

<400> 48

<210> 49

<211> 6132

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH657

<400> 49

<210> 50

<211> 5288

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Plásmido pH670 int sacB delta desformilasa

<400> 50

<210> 51

<211> 1689

<212> ADN

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 51

<210> 52

<211> 562

<212> PRT

<213> Corynebacterium jeikeium

<400> 52

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para la producción de L-metionina en una corinebacteria, seleccionada del grupo que consiste en la especie Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola y Corynebacterium effiziens, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida productor de metionina que es una corinebacteria de tipo salvaje o una corinebacteria que ya posee alteraciones genéticas en comparación con la corinebacteria de tipo salvaje, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementado en dicho microorganismo en comparación con el organismo de partida, y en el que la cantidad y/o actividad de ácido lipoico sintasa (lipA), lipoil tansferasa (lipB) o lipA y lipB están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de

   glicina descarboxilasa dependiente de PLP (gcvP),

   enzima sintetizadora de N5,N10-metileno-THF (gcvT) y

   aminometil transferasa que contiene lipoamida (gcvH)

   están incrementadas en dicho microorganismo en comparación con el organismo de partida.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de C. jeikeium.

4. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de E. coli.

5. 5.

   Corinebacteria seleccionada del grupo que consiste en la especie Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola y Corynebacterium effiziens, en la que dicha corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida productor de metionina que es una corinebacteria de tipo salvaje o una corinebacteria que ya posee alteraciones genéticas en comparación con la corinebacteria de tipo salvaje, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementada en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida, y en la que la cantidad y/o actividad de lipA, lipB o lipA y lipB están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

6. 6.

   Corinebacteria según la reivindicación 5, en la que la corinebacteria es una cepa de C. glutamicum.

7. 7.

   Corinebacteria según las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de gcvP, gcvT y gcvH están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

8. 8.

   Corinebacteria según la reivindicación 7, en la que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de C. jeikeium.

9. 9.

   Corinebacteria según la reivindicación 7, en la que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de E. coli.

   Figura 1