BRPI0614891A2 - mÉtodo, dispositivo e elemento de programa para determinar um organismo com eficiÊncia aumentada para a sÍntese de metionina, meio legÍvel por computador, mÉtodo para produzir um organismo, organismo, mÉtodos para produzir um microorganismo do gÊnero corynebacterium e do gÊnero escherichia com eficiÊncia aumentada da produÇço de metionina, microorganismos dos gÊneros corynebacterium e escherichia, uso de qualquer um dos organismos, e, mÉtodo para produzir metionina - Google Patents

Abstract

MÉTODO, DISPOSITIVO E ELEMENTO DE PROGRAMA PARA DETERMINAR UM ORGANISMO COM EFICIÊNCIA AUMENTADA PARA A SÍNTESE DE METIONINA, MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ORGANISMO, ORGANISMO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM MICROORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM E DO GÊNERO ESCHERICHIA COM EFICIÊNCIA AUMENTADA DA PRODUÇçO DE METIONINA, MICROORGANISMOS DOS GÊNEROS CORYNEBACTERIUM E ESCHERICHIA, USO DE QUALQUER UM DOS ORGANISMOS, E, MÉTODO PARA PRODUZIR METIONINA. A presente invenção diz respeito a métodos para a produção de microorganismos com eficiência aumentada para a síntese de metionina. A presente invenção diz respeito a microorganismos com eficiência aumentada para a síntese de metionina. Além disso, a presente invenção diz respeito a métodos para determinar o fluxo metabólico ótimo para os organismos com respeito à síntese de metionina.

Description

"MÉTODO, DISPOSITIVO E ELEMENTO DE PROGRAMA PARA DETERMINAR UM ORGANISMO COM EFICIÊNCIA AUMENTADA PARA A SÍNTESE DE METIONINA, MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ORGANISMO, ORGANISMO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM MICROORGANISMO DO GÊNERO COR YNEBA CTERIUM E DO GÊNERO ESCHERICHIA COM EFICIÊNCIA AUMENTADA DA PRODUÇÃO DE METIONINA, MICROORGANISMOS DOS GÊNEROS COR YNEBA CTERIUM E ESCHERICHIA, USO DE QUALQUER UM DOS ORGANISMOS, E, MÉTODO PARA PRODUZIR METIONINA" Campo da invenção

A invenção situa-se no campo dos produtos químicos que são produzidos pelos organismos. Particularmente, a presente invenção diz respeito aos métodos para a produção de microorganismos com eficiência aumentada para a síntese de metionina. A presente invenção também diz respeito aos microorganismos com eficiência aumentada para a síntese de metionina. Além disso, a presente invenção diz respeito aos métodos para determinar o fluxo metabólico ótimo para os organismos com respeito à síntese de metionina. Fundamentos Tecnológicos

Os aminoácidos são usados para propósitos diferentes, um campo de aplicação sendo o uso como aditivos alimentícios na alimentação de seres humanos e animais. A metionina é um aminoácido essencial que deve ser ingerido com alimentos. Além de ser essencial para a biossíntese de proteína, a metionina serve como um precursor para metabólitos diferentes tais como glutationa, S-adenosil metionina e biotina. Ela também atua como um doador do grupo metila em vários processos celulares.

Correntemente, a produção anual mundial de metionina é de cerca de 500.000 tons. A metionina é o primeiro aminoácido limitante na criação de aves alimentadas e devido a isto, principalmente aplicada como suplemento de ração. Ao contrário a outros aminoácidos industriais, a metionina é quase exclusivamente aplicada como um racemato produzido pela síntese química (DE 190 64 05). Visto que os animais podem metabolizar ambos os estereoisômeros de metionina, a alimentação direta da mistura racêmica quimicamente produzida é possível (D'Mello e Lewis (1978) Effect of Nutrition Deficiencies in Animais: Amino Acidsi Rechgigl (Ed.) CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490).

Entretanto, existe ainda um interesse enorme em substituir a produção química existente por um processo biotecnológico. Isto é devido ao fato de que em níveis mais baixos de suplementação a L-metionina é uma fonte melhor de aminoácidos de enxofre do que a D-metionina (Katz & Baker, (1975) Poult. Sci., 545, 1667-74). Entretanto, o processo químico usa produtos químicos particularmente perigosos e produz correntes de resíduo substanciais. Um processo biotecnológico eficiente evitaria todas estas desvantagens de produção química.

Para outros aminoácidos tais como glutamato, lisina, treonina e triptofano, é conhecido produzi-los usando métodos de fermentação. Para estes propósitos, certos microorganismos tais como Escherichia coli (E. coli) e Corynebacterium glutamieum (C. glutamieum) têm provado ser particularmente adaptado. A produção de aminoácidos pela fermentação também tem a vantagem particular de que apenas os L-aminoácidos são produzidos e que os produtos químicos ambientalmente problemáticos tais como solventes, etc. que são usados na síntese química são evitados. Entretanto, a produção fermentativa de metionina pelos microorganismos apenas serão uma alternativa para a síntese química se a mesma possibilitar a produção de metionina em uma escala comercial em um preço comparável com aquele da produção química.

No passado, houve tentativas para usar microorganismos tais como Ε. coli e C glutamicum para a produção de compostos contendo enxofre que são também habitualmente designados como produtos químicos finos. Estes métodos incluíram a seleção de cepa clássica pela mutagênese assim como pela otimização das condições de cultivo, por exemplo, direcionamento, fornecimento de oxigênio, composição de meio de cultivo, etc. (Kumar et al. (2005) Biotechnology Advances, 23, 41-61).

Uma das razões para que a produção fermentativa de metionina em microorganismos não tenha ainda mostrado ser economicamente interessante provavelmente resulta dos peculiares da biossíntese e vias metabólicas que levam à metionina. No geral, as vias metabólicas básicos que levam à síntese de metionina em organismos tais como E. coli e C. glutamicum são bem conhecidos (por exemplo, Voet e Voet (1995) Biochemistry, 2a edição, John Wiley & Sons, Inc e http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html). Entretanto, os detalhes da biossíntese de metionina em C. glutamicum e E coli é submetido à pesquisa intensiva e foi recentemente revisado em Rückert et al. (Rückert et al (2003), J. of Biotechnology, 104, 213-228) e Lee et al (Lee et al (2003), Appl. Microbiol. BiotechnoI., 62, 459-467).

Uma etapa chave na biossíntese de metionina é a incorporação de enxofre na cadeia carbônica principal. A fonte de enxofre regularmente é o sulfato e deve ser absorvido pelos microorganismos. Os microorganismos depois têm que ativar e reduzir o sulfato. Estas etapas requerem uma entrada de energia de 7 moles de ATP e 8 moles de NADPH por molécula de metionina (Neidhardt et al. (1990) Physiology of the bacterial cell: a molecular approach, Sunderland, Massachusetts, USA5 Sinauer Associates, Inc.) Assim, a metionina é o aminoácido com respeito ao qual uma célula tem que fornecer a maior parte da energia.

Como uma conseqüência disto, os microorganismos que produzem metionina têm evolvido as vias metabólicas que estão sob controle estrito com respeito à taxa e quantidade de síntese de metionina (Neidhardt F. * C. (1996) E. coli e S. typhimurium, ASM Press Washington). Estes mecanismos de regulagem incluem por exemplo, os mecanismos de controle de retroalimentação, isto é, vias metabólicas que produzem metionina são infra-regulados com respeito à sua atividade uma vez que as células têm produzido quantidades suficientes de metionina. Métodos da técnica anterior para a obtenção microorganismos que podem ser usados para a produção em escala comercial de metionina pelos microorganismos principalmente focalizaram na superação dos mecanismos de controle mencionados acima pela identificação de genes que estão envolvidos na biossíntese de metionina. Estes genes foram depois super-expressados ou reprimidos, dependendo da sua respectiva função com a meta final de aumentar a quantidade de metionina produzida. Neste contexto, a quantidade de metionina foi definida como a quantidade de metionina obtida por quantidade de massa celular ou como a quantidade de metionina obtida por tempo e volume (rendimento espaço-tempo) ou como uma combinação de ambos os fatores que são a massa celular e o rendimento espaço-tempo.

Por exemplo, a WO 02/10209 descreve a super-expressão ou repressão de certos genes de modo a aumentar a quantidade de metionina produzida. Recentemente, Rey et ai. (Rey et ai. (2003), J. Biotechnol., 103, 51-65) identificaram o repressor transcricional McbR que controla a expressão de genes envolvidos na biossíntese de metionina tais como metY (que codifica a O-acetil-L-homosserina-sulfídrilase), metK (que codifica a S- adenosil-metionina sintetase), hom (que codifica a homosserinadesidrogenase), cysK (que codifica a L-cisteína sintase), cysl (que codifica a Sulfito redutase dependente de NADPH) e ssuD (que codifica a alcano sulfonato monooxigenase).

Embora estes métodos possibilitassem a construção de cepas de microorganismo que produzissem mais metionina comparadas com a do tipo selvagem com a quantidade de metionina sendo calculada por massa celular ou por tempo e volume (rendimento espaço-tempo), nenhum organismo super-produtor de metionina industrialmente competitivo foi descrito até agora (Mondai et al. (1996) Folia Microbiol. (Praha), 416, 465- 72, (Kumar et al. (2005) Biotechnology Advancesj 23,41-61). Sumário da Invenção

Foi descoberto que a quantidade de metionina produzida por um organismo que tipicamente é calculada como a quantidade de metionina por quilograma de massa celular ou por tempo e volume não é um indicador suficiente de se um organismo que produz metionina pode ser considerado como uma alternativa economicamente interessante e comercialmente viável para a produção química deste aminoácido. Particularmente, de modo a ser uma alternativa economicamente interessante para o método de síntese química, um organismo que produz metionina com alta eficiência é requerida, isto é, um organismo que fornece um alto rendimento espaço-tempo de metionina com base na entrada de energia do sistema de produção que pode ser representado pela quantidade ou entrada de uma fonte de carbono tal como glicose que está sendo consumida para a produção de metionina.

Assim, quando da decisão se um organismo que produz metionina pode ser considerado como uma alternativa para a síntese química, os parâmetros chave não devem ser a quantidade de metionina produzida por massa celular em peso, mas a eficiência, isto é, a quantidade molar de metionina produzida por quantidade de entrada de energia consumida pelo sistema por exemplo, na forma de glicose. Neste contexto, foi ainda descoberto que de modo a produzir

metionina em uma alta eficiência em um microorganismo, as vias metabólicas do organismo que contribuem direta ou indiretamente para a síntese de metionina têm que ser usado em uma via ótimo com respeito à síntese de metionina. Assim, para a produção eficiente de metionina por um organismo, o fluxo metabólico através das vias metabólicas têm que ser modificados. A modificação podem não apenas ser requeridos para aqueles vias que são diretamente envolvidos na síntese da cadeia principal de metionina, mas também daqueles vias que fornecem substratos adicionais tais como átomos de enxofre em estados oxidativos diferentes, nitrogênio no estado reduzido tal como amônia, outros precursores de carbono incluindo fontes de carbono Cl tais como serina, glicina e formiato, precursores de metionina e metabólitos diferentes de tetraidrofoliato que é substituído com carbono em N5 e ou N10. Além disso a energia por exemplo, na forma de equivalentes de redução tais como NADH, NADPH, FADH2 podem estar envolvidos nas vias que levam à metionina. Assim, um microorganismo que produz metionina muito eficientemente pode requerer um alto fluxo metabólico através das vias que levam à construção de metionina e que fornecem seus precursores, mas pode requerer apenas fluxos metabólicos baixos através das vias da biossíntese por exemplo, de outros aminoácidos.

É portanto um objetivo da presente invenção identificar o fluxo metabólico ótimo através das vias envolvidos direta ou indiretamente na síntese de metionina de modo a identificar organismos potenciais que podem ser muito eficientes na síntese de metionina. Um outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos

que possibilitem prognosticar o fluxo metabólico ideal através dos várias vias metabólicas de um organismo para a síntese de metionina de modo a obter a biossíntese de metionina eficiente.

Um outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos para a obtenção de organismos que tenham uma eficiência aumentada na síntese de metionina.

A presente invenção também visam organismos que sejam mais eficiente com respeito à síntese de metionina.

Estes e outro objetivos, conforme eles se tornarão evidentes a partir da descrição subseqüente, são resolvidos pelo assunto objeto como definido nas reivindicações independentes. As reivindicações dependentes dizem respeito a algumas das formas de realização consideradas pela invenção.

No curso da presente invenção uma análise da via metabólica,

também aludido como análise do modo de fluxo elementar ou análise da via extremo, foi usado para estudar as propriedades metabólicas de organismos com respeito à síntese de metionina. Embora a análise da via metabólica acima tenha sido descrita na técnica anterior para outros sistemas celulares (Papin et ai (2004) Trends Biotechnol. 228, 400-405; Schilling et ai (2000) J. Theor. Biol, 2033, 229-248; Schuster et ai (1999) Trends Biotechnol. 172, 53-60), este tipo de análise não foi considerada com respeito à eficiência da produção de metionina em organismos tais como C. glutamicum e E. coli. A análise da via metabólica habitualmente permite o cálculo de um espaço de solução que contém todas as distribuições de fluxo de estado constante possível de uma rede metabólica. Por meio disto, a estequiometria da precursores rede metabólica estudada, incluindo energia, assim como exigências de co-fator são totalmente consideradas.

Na presente invenção, esta análise do modo de fluxo elementar foi realizada pela primeira vez com respeito à eficiência de produção de metionina pela comparação das redes metabólicas dos maiores produtores de aminoácido industrial tais como C. glutamicum e E. coli. Para este propósito, os modelos de reação bioquímica foram construídos para C. glutamicum e E. coli (ver abaixo). Os modelos compreenderam todas as vias relevantes de metabolismo de enxofre envolvendo todos as vias ligados à produção de metionina. Estes modelos foram construídos a partir do conhecimento bioquímico dos organismos investigados (ver abaixo). Com base nestes modelos, o fluxo metabólico ótimo através dos várias vias foi calculado de modo a prognosticar quais vias devem ser usados mais ou menos intensivamente de modo a aumentar a eficiência de produção de metionina.

Calculando-se estes modelos, um organismo modelo foi obtido que para um dado conjunto de condições incluindo a presença de metabólitos externos tais como a fonte de carbono e a fonte de enxofre seriam ótimos para a produção de metionina.

A presente invenção assim diz respeito a um método para planejar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina. Este método compreende as etapas de descrever ou determinar os parâmetros um organismo sintetizador de metionina inicial por meio de uma pluralidade de parâmetros, que são obtidos com a base de vias metabólicas pré conhecidos relacionados para a síntese de metionina e que dizem respeito ao fluxo metabólico através da reação destes vias e depois determinando um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina pela modificação de pelo menos uma da pluralidade dos ditos parâmetros e/ou introduzir pelo menos um outro de tais parâmetros em uma tal maneira como para aumentar a eficiência da síntese de metionina comparada com a eficiência de síntese de metionina do organismo sintetizador de metionina inicial. Usando este método, é assim possível prognosticar um organismo teórico que deve permitir quanto a eficiência da síntese de metionina. O desempenho detalhado do método é descrito mais tarde.

Para os propósitos da invenção, estes parâmetros foram definidos em relação às reações únicas da rede metabólica considerada. Assim, os parâmetros para a otimização foram definidos em relação à existência de uma reação no organismo utilizado, a estequiometria de uma reação e a reversibilidade da reação. Como uma conseqüência dos parâmetros dizem respeito ao fluxo metabólico através das várias reações da rede.

A presente invenção também diz respeito a um dispositivo para planejar um organismo inicial com eficiência aumentada para a síntese de metionina, o dispositivo que compreende um processador adaptado para realizar as etapas de método mencionadas acima para prognosticar vias otimizados para um organismo com síntese de metionina aumentada.

A invenção ainda diz respeito a um meio legível por computador em que um programa de computador para planejar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina é armazenado. O meio legível por computador que quando é executado por um processador é adaptado para realizar as etapas de método mencionadas acima para planejar um organismo teoricamente otimizado com eficiência aumentada de síntese de metionina.

A invenção diz respeito ainda a um elemento de programa de

planejar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina que, quando é executado por um processador, é adaptado para realizar as etapas de método mencionadas acima.

A invenção também diz respeito aos métodos para produzir organismos com eficiência aumentada de síntese de metionina que torna o uso dos prognósticos acima mencionados modificando-se geneticamente um organismo do tipo selvagem de modo a influenciar o fluxo metabólico deste organismo tal que este se pareça mais com os prognósticos dos métodos mencionados acima. Isto pode ser obtido modificando-se geneticamente o organismo tal que o fluxo metabólico através de um certa via de reação é aumentado e/ou diminuído. As modificações genéticas podem ser introduzidas pela tecnologia de DNA recombinante. Além disso isto pode ser obtido também por outras técnicas tais como mas não limitada à mutação e processos de seleção tais como a mutagênese química ou de UV e seleção subseqüente pelo crescimento em análogos de meio contendo substrato, levando às cepas resistentes com características melhoradas.

A invenção também diz respeito aos métodos para produzir organismos com eficiência aumentada de síntese de metionina que fazem uso dos prognósticos mencionados acima modificando-se geneticamente um organismo que não é um organismo do tipo selvagem, mas que já foram geneticamente modificados antes, preferivelmente para produzir metionina em uma massa aumentada e/ou rendimento de espaço tempo. Tais organismos podem ser organismos que são conhecidos como super produtores de metionina e incluem por exemplo, organismos em que genes para a assimilação de sulfato, genes para a biossíntese de cisteína e genes para a síntese de metionina assim como genes para a conversão de oxaloacetato para aspartato semialdeído são super expressados. Em tais organismos que já foram geneticamente modificados os prognósticos mencionados acima com respeito à eficiência aumentada da síntese de metionina pode ser implementados de modo a influenciar o fluxo metabólico daquele organismo tal que ele se pareça mais com os prognósticos dos métodos mencionados acima. Isto pode ser obtido modificando-se geneticamente o organismo tal que o fluxo metabólico através de um certa via de reação seja aumentado e/ou diminuído. As modificações genéticas podem ser introduzidas pela tecnolpgia de DNA recombinante. Além disso isto pode ser também obtido por outras técnicas tais como mas não limitadas aos processos de mutação e seleção processes tais como mutagênese química ou de UV e selefao subseqüente pelo cultivo em meios contendo análogos de substrato, levando às cepas resistentes com características melhoradas.

Foi surpreendentemente descoberto que os prognósticos teóricos que são obtidos com respeito a um organismo do tipo selvagem podem ser usados para aumentar a eficiência da síntese de metionina também em um organismo que já carrega mutações por exemplo, em vias que dizem respeito à síntese de metionina ou por exemplo, vias acessórios que dizem respeito a estes. Assim, parece não ser necessário que prognósticos teóricos sejam calculados com base no respectivo organismo de partida mas que prognósticos teóricos obtidos para um organismo do tipo selvagem pode ser suficiente. Entretanto, a presente invenção certamente também considera uma forma de realização em que um fluxo metabólico ótimo é calculado com base em um organismo inicial que já fornece algumas das mutações mencionadas acima de modo que os prognósticos possam ser usados para modificar ainda mais geneticamente o organismo.

Particularmente, a presente invenção diz respeito aos métodos para produzir microorganismos do gênero Corynebacterium e Escherichia com eficiência aumentada de produção de metionina que compreende as etapas de aumentar e/ou introduzir o fluxo metabólico através de vias que foram usados para construir o modelo mencionado acima. Estes métodos podem adicionalmente incluir as etapas de diminuir pelo menos parcialmente o fluxo metabólico através das vias mencionados acima.

A presente invenção também diz respeito aos organismos com uma eficiência aumentada de síntese de metionina que são obteníveis por qualquer um dos métodos mencionados acima.

Além disso, a presente invenção diz respeito ao uso de tais organismo para produzir metionina e aos métodos de produzir metionina cultivando-se os organismos mencionados acima e isolando a metionina. Descrição resumida das figuras

A Figura 1 mostra uma rede de reação estequiométrica de um organismo C. glutamicum do tipo selvagem que foi usado para a análise do modo de fluxo elementar.

A Figura 2 mostra a análise da via metabólica de C. glutamicum e E. coli para a síntese de metionina.

A Figura 3 mostra a distribuição do fluxo metabólico de um organismo C. glutamicum do tipo selvagem com rendimento máximo teórico de metionina.

A Figura 4 mostra a distribuição do fluxo metabólico de um organismo E. coli do tipo selvagem com rendimento máximo teórico de metionina. A Figura 5 mostra a análise da via metabólica de C. glutamicum para a síntese de metionina com diferentes fontes de carbono e enxofre.

As Figuras 6 a 9 mostram vários vetores que são usados nos exemplos de forma de realização.

A Figura 10 mostra uma distribuição de fluxo metabólico otimizado de uma cepa de C. glutamicum em que vias metabólicas adicionais foram incluídos.

Descrição detalhada da presente invenção

Antes de descrever em detalhes como o método mencionado acima pode ser realizado de modo a identificar um organismo otimizado teórico com eficiência aumentada de síntese de metionina, as seguintes definições são dadas.

O termo "eficiência de síntese de microorganismo" descreve o rendimento de carbono de metionina. Esta eficiência é calculada como uma porcentagem da entrada de energia que entrou no sistema na forma de um substrato de carbono. Por toda a invenção este valor é dado em valores percentuais ((mol de metionina) (mol de substrato de carbono)"1 χ 100) a menos que de outro modo indicado.

O termo "eficiência aumentada de síntese de metionina" diz respeito a uma comparação entre um organismo que foi teoricamente modelado pelos métodos mencionados acima e que tem uma eficiência mais alta de síntese de metionina comparada com o organismo modelo inicial que foi usado para determinar os parâmetros.

O termo "eficiência aumentada de síntese de metionina" também pode descrever a situação em que um organismo que foi por exemplo, geneticamente modificado fornece uma eficiência aumentada de síntese de metionina comparada com o respectivo organismo de partida.

O termo "via metabólica" diz respeito a uma série de reações 3Χ 13

que são parte da rede metabólica que é usada no modelo teórico mencionado acima para planejar um organismo com síntese de metionina melhorada.

O termo "via metabólica" também descreve uma série de reações que ocorrem em um organismo real. Uma via metabólica pode compreender uma série bem conhecida de reações como estas são conhecidas de livros texto padrão tais como por exemplo, cadeia respiratória, glicosilação, ciclo do ácido tricarboxílico, etc. Alternativamente, as vias metabólicas podem ser definidos separadamente para os propósitos da presente invenção.

O termo "fluxo metabólico" descreve a quantidade de entrada

de energia que é alimentada no sistema, por exemplo, na forma de uma fonte de carbono tal como glicose e que passa através das reações da rede metabólica de um organismo ou do modelo teórico mencionado acima. Cada reação da rede usualmente contribuirá para o fluxo metabólico global. Como uma conseqüência, um fluxo metabólico pode ser designado a cada reação da rede. Visto que os modos de fluxo elementares são calculados com base na estequiometria das várias reações do modelo de rede, os fluxos são tipicamente dados como valores molares relativos, normalizados para as taxas de captação de energia que é medida na forma de glicose, isto é, fluxos são dados em mol (substância) χ (mol de glicose)"1 χ 100).

O termo "fluxo metabólico modificado" diz respeito a uma situação em que o fluxo metabólico através de uma certa reação ou uma via metabólica de um organismo que foi geneticamente modificado, é aumentado ou diminuído comparado com o organismo de partida. Este termo também diz respeito à situação onde, de acordo com o método teórico mencionado acima de determinar ou planejar um organismo otimizado para a síntese de metionina, o fluxo metabólico teórico através de uma certa reação ou via metabólica da rede metabólica é aumentado ou diminuído mudando-se os parâmetros da rede metabólica teórica. Se no contexto da presente invenção uso é feito do termo "que se aproxima do fluxo metabólico", isto diz respeito a modificar geneticamente organismos de modo a aumentar e/ou diminuir e/ou introduzir o fluxo metabólico através das vias de síntese de metionina que foram usados para construir o modelo teórico mencionado acima. Como as modificações genéticas são selecionadas com base nos prognósticos do modelo mencionado acima, o fluxo metabólico dos organismos geneticamente modificados, em comparação ao respectivo organismo de partida, deve se parecer mais próximo do fluxo metabólico do modelo otimizado mencionado acima. Os termos "expressam", "expressando", "expressado" e

"expressão" referem-se à expressão de um produto de gene (por exemplo, uma enzima biossintética de um gene de uma via ou reação definidos e descritos neste pedido) em um nível que a atividade de enzima resultante desta proteína codificada ou a via ou reação que a mesma se refere para possibilitar o fluxo metabólico através deste via ou reação no organismo em que este gene/via é expressado. A expressão podem ser feita pela alteração genética do microorganismo que é usado como um organismo de partida. Em algumas formas de realização, um microorganismo pode ser geneticamente alterado (por exemplo, geneticamente engendrado) para expressar um produto de gene em um nível aumentado em relação àquele produzido pelo microorganismo de partida ou em um microorganismo comparável que não foi alterado. A alteração genética inclui, mas não é limitada a, alteração ou modificação das seqüências regulatórias ou sítios associados com a expressão de um gene particular (por exemplo, pela adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou pela remoção de seqüências reguladoras tal que a expressão seja constitutiva), modificação da localização cromossômica de um gene particular, alterando as seqüências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular tal como um sítio de ligação de ribossoma ou terminador de transcrição, aumento do número de cópia de um gene particular, modificação de proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressores, realçadores, ativadores transcricionais e outros) envolvidos na transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular ou qualquer outros meios convencionais de desregular a expressão de um gene particular usando rotina na técnica (incluindo mas não limitado ao uso de moléculas de ácido nucleico de anti-sentido, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras).

Os termos "super-expressam", "super-expressando", "super- expressado" e "super-expressão" referem-se à expressão de um produto de gene (por exemplo, uma enzima biossintética de metionina ou enzima da via da redução de sulfato ou enzima biossintética de cisteína ou um gene ou uma via ou uma reação definida e descrita neste pedido) em um nível maior do que aquele presente antes de uma alteração genética do microorganismo de partida. Em algumas formas de realização, um microorganismo pode ser geneticamente alterado (por exemplo, geneticamente engendrado) para expressar um produto de gene em um nível aumentado em relação àquele produzido pelo microorganismo de partida. A alteração genética inclui, mas não é limitada a, alteração ou modificação de seqüências reguladoras ou sítios associados com a expressão de um gene particular (por exemplo, pela adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou pela remoção de seqüências reguladoras tal que a expressão seja constitutiva), a modificação da localização cromossômica de um gene particular, alteração de seqüências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular tais como um sítio de ligação de ribossoma ou terminador de transcrição, aumentando o número de cópia de um gene particular, modificação de proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressores, realçadores, ativadores transcricionais e outros) envolvidos na transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular ou qualquer outros meios convencionais de desregular a expressão de um gene particular usando rotina na técnica (incluindo mas não limitado ao uso de moléculas de ácido nucleico de anti-sentido, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras). Os exemplos para a super-expressão de genes em organismos tais como C. glutamicum podem ser encontrados em Eikmanns et al (Gene.

(1991) 102,93-8).

Em algumas formas de realização, um microorganismo pode ser física ou ambientalmente alterado para expressar um produto de gene em um nível aumentado ou mais baixo em relação ao nível de expressão do produto de gene pelo microorganismo de partida. Por exemplo, um microorganismo pode ser tratado com ou cultivado na presença de um agente conhecido ou suspeito de aumentar a transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular tal que a transcrição e/ou tradução sejam realçadas ou aumentadas. Alternativamente, um microorganismo pode ser cultivado em uma temperatura selecionada para aumentar a transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular tal que a transcrição e/ou tradução sejam realçadas ou aumentadas.

Os termos "desregular," "desregulada" e "desregulagem" referem-se à alteração ou modificação de pelo menos um gene em um microorganismo, em que a alteração ou modificação resulta em aumentar a eficiência de produção de metionina no microorganismo em relação à produção de metionina na ausência da alteração ou modificação. Em algumas formas de realização, um gene que é alterado ou modificado codifica uma enzima em uma via biossintética, tal que o nível ou atividade da enzima biossintética no microorganismo seja alterado ou modificado. Em algumas formas de realização, pelo menos um gene que codifica uma enzima em uma via biossintética seja alterada ou modificada tal que o nível ou atividade da enzima seja realçada ou aumentada em relação ao nível na presença do gene não alterado ou do tipo selvagem. Em algumas formas de realização, a via biossintética é a via biossintética da metionina. Em outras formas de realização, a via biossintética é a via biossintética da cisteína. A desregulagem também inclui a alteração da região codificadora de um ou mais genes para produzir, por exemplo, uma enzima que é resistência à retro alimentação ou tem uma atividade específica mais alta ou mais baixo. Também, a desregulagem ainda abrange a alteração genética de genes que codificam fatores transcricionais (por exemplo, ativadores, repressores) que regulam a expressão de genes na via biossintética da metionina e/ou cisteína.

A frase "via ou reação desregulados" referem-se a uma via ou reação biossintéticos em que pelo menos um gene que codifica uma enzima em uma via ou reação biossintéticos é alterado ou modificado tal que o nível ou atividade de pelo menos uma enzima biossintética seja alterada ou modificada. A frase "via desregulado" inclui uma via biossintética em que mais do que um gene foi alterado ou modificado, alterando deste modo o nível e/ou atividade do produto de genes/enzimas correspondentes. Em alguns casos a capacidade para "desregular" uma via (por exemplo, para desregular simultaneamente mais do que um gene em um dada via biossintética) em um microorganismo surge do fenômeno particular dos microorganismos em que mais do que uma enzima (por exemplo, duas ou três enzimas biossintéticas) são codificados pelos genes que ocorrem adjacentes um do outro em um pedaço contíguo de material genético chamado de um "operon." Em outros casos, de modo a desregular uma via, vários genes devem ser desregulados em uma série de etapas de engenheiramento seqüencial.

O termo "operon" refere-se a uma unidade coordenada de material genético que contém um promotor e possivelmente um elemento regulador associado com um ou mais, preferivelmente pelo menos dois, genes estruturais (por exemplo, genes que codificam enzimas, por exemplo, enzimas biossintéticas). A expressão dos genes estruturais pode ser coordenadamente regulada, por exemplo, pelas proteínas reguladoras que se ligam ao elemento regulador ou pela anti-terminação de transcrição. Os genes estruturais podem ser transcritos para dar um único mRNA que codifica todas as proteínas estruturais. Devido às regulagem coordenada de genes incluídas em um operon, a alteração ou modificação do promotor e/ou elemento regulador únicos podem resultar na alteração ou modificação de cada produto de gene codificado pelo operon. A alteração ou modificação de um elemento regulador inclui, mas não é limitada a, remoção do promotor e/ou elemento(s) regulador(es) endógenos, adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou remoção das seqüências reguladoras tal que a expressão de produtos de gene seja modificada, modificação do local cromossômico do operon, alteração das seqüências de ácido nucleico adjacentes ao operon ou dentro do operon tais como um sítio de ligação de ribossoma, uso de códon, aumento do número de cópia do operon, modificação de proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressoras, realçadoras, ativadoras transcricionais e outras) envolvidas na transcrição do operon e/ou tradução dos produtos de gene do operon ou qualquer outros meios convencionais de desregular a expressão de genes rotina na técnica (incluindo, mas não limitada ao, uso de moléculas de ácido nucleico de anti- sentido, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras).

Em algumas formas de realização, microorganismos

recombinantes aqui descritos foram geneticamente engendrados para super-

expressar um gene ou produto de gene bacterialmente derivado. Os termos

"bacterialmente derivado" e "derivado de bactérias" referem-se a um gene

que é naturalmente encontrado em bactérias ou um produto de gene que é

codificado por um gene bacteriano. O termo "organismo" para os propósitos da presente invenção

refere-se a qualquer organismo que é habitualmente usado da produção de

aminoácidos tais como metionina. Em particular, o termo "organismo" diz

respeito aos procariotas, eucariotas inferior e plantas. Um grupo preferido dos

organismos mencionados acima compreende actino bactérias, ciano bactérias, proteo bactérias, Chloroflexus aurantiaeus, Pirellula sp. 1, halo bactérias e/ou metanococos, preferivelmente corine bactérias, mico bactérias, streptomyces, salmonela, Escherichia coli, Shigella e/ou Pseudomonas. Os microorganismos particularmente preferidos são selecionados de Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, microorganismos do gênero Bacillus, particularmente Bacillus subtilis e microorganismos do gênero Streptomyces.

O termo "organismo inicial" é usado para descrever o organismo e a rede metabólica que foi usada para designar o conjunto inicial de parâmetros para o modelo mencionado acima de acordo com a reivindicação independente 1.

O termo "organismo de partida" refere-se ao organismo que é usado para a modificação genética para aumentar fidelidade de produção de metionina. Um organismo de partida pode ser um organismo do tipo selvagem ou um organismo que já carrega mutações. O organismo de partida pode ser idêntico ao organismo inicial. Os organismos de partida podem ser por exemplo, super produtores de metionina.

O termo "organismo do tipo selvagem" diz respeito a um organismo que não foi geneticamente modificado. O termo super produtor de metionina diz respeito a um organismo que foi alterado pela manipulação genética, pela mutação e seleção ou por qualquer outro método conhecido e que super produza mais metionina do que a cepa do tipo selvagem que foi usada para obter um super produtor de metionina.

Os organismos da presente invenção, entretanto, também podem compreender leveduras tais como Schizosaccharomyces pombe ou cerevisiae e Pichiapastoris.

As plantas também são consideradas pela presente invenção para a produção de aminoácidos. Tais plantas podem ser monocots ou dicots tais como plantas de safra monocotilédones ou dicotilédones, plantas alimentícias ou plantas forrageiras. Os exemplos para as plantas monocotilédones são plantas pertencentes aos gêneros de avena (aveia), triticum (trigo), secale (centeio), hordeum (cevada), oryza (arroz), panicum, pennisetum, setaria, sorghum (painço), zea (milho) e outros.

As plantas de safra dicotilédones compreendem inter alia

algodão, leguminosas como pulse e em particular alfalfa, soja, colza, tomate, beterraba açucareira, batata, plantas ornamentais assim como árvores. Outras plantas de safra podem compreender frutas (em particular maçãs, pêras, cerejas, uvas, cítricas, abacaxi e bananas), dendês, arbustos de chá, árvores de cacau e árvores de café, tabaco, sisal assim como, plantas medicinais concernentes, rauwolfia e digitalis. Particularmente preferidos são os grãos trigo, centeio, aveias, cevada, arroz, milho e painço, beterraba açucareira, colza, soja, tomate, batata e tabaco. Outras plantas de safra podem ser tiradas da US 6.137.030.

O termo "metabólito" refere-se aos compostos químicos que

são usados nas vias metabólicas de organismos como precursores, intermediários e/ou produtos finais. Tais metabólitos podem não apenas servir como unidades de construção química, mas também podem exercer uma atividade reguladora sobre as enzimas e a sua atividade catalítica. E conhecido da literatura que tais metabólitos podem inibir ou estimular a atividade de enzimas (Stryer, Biochemistry, (1995) W. H. Freeman & Company, Nova Iorque, Nova Iorque).

Para os propósitos da presente invenção, o termo "metabólito externo" compreende substratos tais como glicose, sulfato, tiossulfato, sulfito, sulfeto, amônia, fosfato, íons metálicos tais como Fe2+ Mn 2+ Mg2+, Co2+ Mo02+ e oxigênio etc. Em certas formas de realização os metabólitos (externos) compreendem os chamados metabólitos C1. Estes últimos metabólitos podem funcionar como por exemplo, doadores de metila e compreender compostos tais como formiato, metanol, formaldeído, metanotiol, sulfeto de dimetila etc.

O termo "produtos" compreende metionina, cisteína, glicina,

Usina, trealose, biomassa, CO2, etc.

Antes de descrever a invenção com respeito às suas formas de realização particulares, uma vista geral é dada de como os prognósticos pela análise de fluxo elementar foram obtidos.

A análise de fluxo elementar começa com a formulação e implementação de todas as reações metabólicas relevantes para o crescimento e produção de metionina. A informação requerida pode ser coletada de bases de dados públicas tais como KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) e outras. O modelo é depois ajustado conseqüentemente e reflete o potencial natural do organismo do tipo selvagem e serve como o ponto de partida para outros desenvolvimentos de cepas modelo que super produzem metionina. Para a obtenção de um modelo inicial, modelos de reação bioquímica foram construídos para a síntese de metionina. Para este propósito, modelos foram construídos que compreendem todas as vias relevantes de metabolismo de carbono e enxofre central envolvendo todos as vias relevantes ligadas à produção de metionina como eles são conhecidos da literatura. Se uma via para um certo organismo, tal como por exemplo, E. coli, é conhecida não estar presente em um outro organismo tal como C. glutamicum, as reações de via específicas do organismo foram apenas consideradas no modelo para aquele organismo específico e omitidos para os outros organismos quando da construção do modelo para o organismo inicial. Depois que um modelo inicial foi obtido, as vias de outros organismos que são conhecidos não ocorrer no organismo modelo podem ser depois considerados, isto é, introduzidos, para mais otimização. As reações bioquímicas diferentes que contribuem para uma rede metabólica podem ser obtidas por exemplo, de livros texto padrão, da literatura científica ou links da Internet tais como http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html. Uma análise do modo de fluxo elementar foi depois realizada como descrito na literatura (ver por exemplo, Papin et al (2004) vide supra, Schilling et al (2000) vide supra, Schuster et al (1999) vide supra). Os modos de fluxo elementares são calculados com base na estequiometria das várias reações. As cinéticas específicas de cada reação usualmente não são

levadas em consideração.

Como construída, uma rede metabólica tipicamente

compreende muitos ciclos de via e reações reversíveis. Várias vias de via

podem ser assim tomados de modo a chegar a um composto tal como

metionina. Assim, dependendo de qual via é tomada, as exigências de energia

para a produção do mesmo composto pode mudar dentro da mesma rede.

Como uma conseqüência, se as várias reações de uma rede são descritas por

parâmetros e colocadas em um algoritmo tal como o software METATOOL

(Pfeiffer et al (1999) Bioinformatics, 153, 251-257; Schuster et al (1999)

vide supra), a rede pode ser modificada e otimizada de modo a identificar a

via que permite a síntese mais eficiente de metionina.

Para os propósitos da presente invenção, a análise da via metabólica foi realizada usando o programa METATOOL. A versão usada para a presente invenção (meta 4.0. l_double.exe) está disponível na Internet

em http://www.biozentrum.uni-wuerzburg.de/ bioinformatik/computing/ metatool/pinguin.biologie.uni-jena.de/ bioinformatik/networks/. Os detalhes

matemáticos do algoritmo são descritos por Pfeiffer et al. (Pfeiffer et al (1999) vide supra). Se a análise da via metabólica é realizada usando o programa METATOOL, várias centenas de modos de fluxo elementares resultam para cada situação investigada. Para cada um destes modos de fluxo os rendimentos de carbono de metionina foram, como indicado acima, calculados como porcentagem , do carbono que entrou no sistema como substrato. Para os vários modos de fluxo o rendimento de carbono da biomassa pode ser calculado como porcentagem da energia que entrou no sistema na forma de substrato de carbono. Este parâmetro pode ser assim calculado como ((biomassa em mol)(substrato em mol)"1 χ 100). Co- substratos outros que não a glicose, tais como formiato, formaldeído, metanol, metanotiol ou seu dímero sulfeto de dimetila também podem ser considerados correspondentemente. A análise comparativa de todos de tais modos de fluxo elementares que são obtidos para um certo cenário de rede depois permite a determinação da eficiência máxima teórica para a síntese de metionina.

Deste modo, obtém-se um prognóstico teórico do fluxo metabólico ótimo através da rede metabólica de um organismo que deve ter uma ótima eficiência para a síntese de metionina. Os detalhes de uma tal análise de fluxo metabólico teórico está descrita na seção experimental.

O método de determinar ou planejar teoricamente um tal organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina constitui a

questão objeto da reivindicação independente 1.

Os prognósticos teóricos que são obtidos por estes métodos

podem ser depois postos em prática modificando-se geneticamente o respectivo organismo de modo a realçar ou reduzir o fluxo metabólico através daqueles vias identificados pelo modelo de prognóstico. Surpreendentemente, os prognósticos teóricos também podem ser postos em prática de acordo com os prognósticos do modelo alterando-se geneticamente um organismo de partida, que não seja idêntico com o organismo inicial. Tal organismo de partida assim pode não ser um organismo do tipo selvagem, mas organismos que já são geneticamente modificados. Em uma forma de realização, o organismo de partida pode ser por exemplo, um super produtor de metionina, isto é, um organismo geneticamente modificado que já é conhecido produzir mais metionina do que o respectivo organismo do tipo selvagem. Embora os prognósticos teóricos não tenham sido calculados para um tal super produtor de metionina, eles ainda permitem construir organismos geneticamente modificados com base no super produtor de metionina que fornece uma eficiência aumentada de síntese de metionina.

Se, por exemplo, os prognósticos teóricos implicam que a síntese de metionina é a mais eficiente se o fluxo metabólico através da via da pentose fosfato (PPP) é aumentado, um organismo é geneticamente modificado para este propósito. Isto poderia ser feito, por exemplo, aumentando-se a quantidade e/ou atividade de enzimas que catalisam certas etapas do PPP de modo a canalizar mais fluxo metabólico através deste via comparado a um organismo não geneticamente modificado que é cultivado sob outro modo exatamente as mesmas condições. O fluxo no PPP também pode ser realçado por exemplo, infra-regulando-se a atividade enzimática em uma reação irreversível de um outra via paralelo que redireciona o fluxo metabólico no PPP. O fluxo através do PPP também pode ser realçado pela introdução de mutações específicas nos genes que codificam as proteínas que são envolvidas nas enzimas do ciclo de PPP tais como mutações na piruvato carboxilase como descrito por Onishi et al (Appl Microbiol Biotechnol. (2002), 58, 217-23). Estes genes alterados contém mutações comparadas com os genes derivados das chamadas cepas do tipo selvagem. Estas mutações podem levar à atividade ou sensibilidade enzimática alteradas voltadas para

inibidores da retroalimentação molecular. Correspondentemente, se o modelo teórico requer uma

redução do fluxo metabólico para a via da pentose fosfato, a quantidade e/ou

atividade de enzimas deste via podem ser reduzidos.

A análise de fluxo metabólico também pode ser usada para transferir os resultados gerados de um organismo para um outro. Assim, se é descoberto pela análise do modo de fluxo elementar que por exemplo, na E. coli um certa via com atividade aumentada é crucial para a síntese de metionina eficiente e se este via obviamente não é usado ou não está presente em um outro organismo tal como C. glutamicum, este via pode ser introduzido no respectivo organismo pela introdução dos genes que codificam as atividades enzimáticas deste via no respectivo organismo. Por este método, pode não apenas ser possível otimizar microorganismos com respeito à síntese de metionina pela otimização de seus vias metabólicas endógenos, mas também para introduzir uma via metabólica exógeno de modo a realçar ainda a síntese de metionina e/ou aumentar a eficiência da síntese.

Em vista desta situação, a presente invenção também diz respeito a um método para produzir um organismo que é selecionado do grupo de procariotas, eucariotas inferior e plantas com eficiência aumentada de síntese de metionina comparada ao organismo de partida que compreende

as etapas de:

a. realizar a análise do modo de fluxo elementar mencionada acima para obter um prognóstico teórico a cerca da distribuição do fluxo metabólico ótimo em um organismo que é otimizado com respeito à síntese de

metionina, e

b. modificar geneticamente um organismo em uma maneira para modificar as vias metabólicas existentes no organismo tal que o fluxo metabólico do organismo seja aproximado ao modelo teórico da etapa a)

comparado com o organismo de partida e/ou

c. modificar geneticamente um organismo em uma maneira

para introduzir vias metabólicas exógeno no organismo tal que o fluxo metabólico do organismo seja aproximado ao modelo teórico da etapa a)

comparada ao organismo de partida e/ou

d. fornecer metabólitos externos em quantidades suficiente

para canalizar o fluxo metabólico através das vias metabólicas de b) e c).

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método que coloca os prognósticos teóricos de distribuição de fluxo em um organismo que é otimizado para a síntese de metionina na prática pela produção de um organismo que é selecionado do grupo de procariotas, eucariotas inferior e plantas pela: • modificação do fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguinte vias metabólicas pela modificação genética dos organismos:

• sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou

• via da pentose fosfato (PPP) e/ou

• glicólise (EMP) e/ou

• ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou

• desvio do glioxilato (GS) e/ou

• anaplerose (AP) e/ou

• cadeia respiratória (RC) e/ou

• enxofre assimilação (SA) e/ou

• síntese de metionina (MS) e/ou

• síntese serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• via 1 (Pl) e/ou

• via 2 (P2) e/ou

• via 3 (P3) e/ou

• via 4 (P4) e/ou

• via 5 (P5) e/ou

• via 6 (P6) e/ou

• via 7 (P7), e/ou

• introduzir um fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguintes vias metabólicas exógenos pela modificação genética dos organismos:

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou

• sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou

• sistema de sulfite redutase (SRS) e/ou • sistema que converte formiato (FCS) e/ou

• sistema que converte metanotiol (MCS)s e/ou

• cultivar os organismos na presença de:

a. sulfato e/ou

b. sulfito e/ou

c. sulfeto e/ou

d. tiossulfato e/ou

e. compostos contendo enxofre orgânico e/ou

f. Metabólitos Cl tais como formiato, formaldeído, metanol, metanotiol ou seus dímeros de sulfeto de dimetila.

Os organismos que foram geneticamente modificados de modo a colocar os prognósticos como para um organismo modelo com eficiência aumentada da biossíntese de metionina na prática também são um objetivo da

presente invenção.

Como mencionado acima, para o cálculo do fluxo metabólico ótimo através de uma rede metabólica para a síntese de metionina, as vias metabólicas específicos do organismo que levam a este aminoácido são usados. Além disso, as estequiometrias específicas dos organismos específicos têm que ser consideradas para cada rede metabólica construída. As estequiometrias podem ser tiradas das fontes mencionadas acima.

Embora tais redes metabólicas possam diferir entre organismos tais como E. coli para C. glutamicum, a Figura 1 mostra um conjunto de reações que foi usado para calcular a rede metabólica inicial usando C. glutamicum como um exemplo. Como este conjunto é apenas um conjunto mínimo de reações para uma rede metabólica que contribui para a síntese de metionina, vias adicionais foram considerados para outros organismos tais como E. coli se sua existência foi conhecida. Entretanto, se referência é feita abaixo no geral a um certa via metabólica ou uma enzima específica, estas referências gerais todas dizem respeito às reações mostradas na Figura 1 a menos que de outro modo indicado. Isto parece justificado porque estas reações foram amplamente idênticas na E. coli e C. glutamicum. Para os propósitos da presente invenção, as várias reações são agrupadas nos

seguintes grupos de via:

• sistema de fosfotransferase (PTS)

• via da pentose fosfato (PPP)

• glicólise (EMP)

• ciclo do ácido tricarboxílico (TCA)

• desvio de glioxilato (GS)

• anaplerose (AP)

• cadeia respiratória (RC)

• assimilação de enxofre (SA)

• síntese de metionina (MS)

• síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS)

• sistema de clivagem de glicina (GCS)

• conversão de transidrogenase (THGC)

• via 1 (Pl)

• via 2 (P2)

• via 3 (P3)

• via 4 (P4)

• via 5 (P5)

• via 6 (P6)

• via 7 (P7)

• sistema de tiossulfato redutase (TRS)

• sistema de sulfato redutase (SARS)

• sistema de sulfito redutase (SRS)

• sistema que converte formiato (FCS)

• sistema que converte metanotiol (MCS).

As vias únicos podem ser subdivididos nas seguintes reações que são catalisadas pelas enzimas designadas Rn. As abreviações são usadas para definir estas reações. O modo que estas definições devem ser entendidas para os propósitos da invenção é explicado com respeito ao sistema de fosfotransferase. Esta explicação também se aplica às outras reações.

Para os propósitos da presente invenção, o sistema de fosfotransferase (PTS) compreende a reação de glicose externa para glicose- 6-fosfato (G6P). Esta reação é catalisada pela enzima Rl que é fosfotransferase. Esta enzima usa fosfoenolpiruvato como um grupo doador de fósforo (ver a Figura 1). Para os propósitos da invenção esta reação é descrita como:

Rl de modo a produzir mais G6P

As reações únicas dos várias vias mencionados acima são assim definidos com respeito às enzimas que catalisam a reação e os produtos que resultam das reações. Se uma tal reação pode requerer ou não entrada de energia na forma de ATP, NADH e/ou NADPH ou outros co-fatores não é indicado, mas pode ser tirado da Figura 1. A estequiometria específica também não está indicada, visto que isto pode variar de organismo para organismo. No geral, os deduções e entradas de energia da reação também não são indicadas. Estes dados podem ser tirados de livros texto padrão ou publicações científicas nos vários organismos.

Para os propósitos da presente invenção, a via da pentose fosfato é caracterizado pelas seguintes reações:

R3 de modo a produzir GLC-LAC R4 de modo a produzir 6-P-Gliconato R5 de modo a produzir RIB-5P R6 de modo a produzir XIL-5P R7 de modo a produzir RIB0-5P R8 de modo a produzir S7P e GA3P R9 de modo a produzir E-4p e F6P RlO de modo a produzir F6P e GA3P R2 de modo a produzir G6P

Para os propósitos da presente invenção, a via da glicólise (EMP) é caracterizado pelas seguintes reações:

Rl 1 de modo a produzir F-1,6-BP Rl 3 de modo a produzir DHAP e GA3P R14 de modo a produzir GA3P Rl 5 de modo a produzir 1,3-PG Rl 6 de modo a produzir 3-PG Rl 7 de modo a produzir 2-PG Rl 8 de modo a produzir PEP Rl 9 de modo a produzir Pyr

Para os propósitos da presente invenção, o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) é definido pelas seguintes reações: R20 de modo a produzir Ac-CoA R21 de modo a produzir CIT R22 de modo a produzir Cis-ACO R23 de modo a produzir ICI R24 de modo a produzir 2-OXO R26 de modo a produzir SUCC-CoA R27 de modo a produzir SUCC R28 de modo a produzir FUM R29 de modo a produzir MAL R30 de modo a produzir OAA

Para os propósitos da presente invenção, o desvio da via de glioxilato (GS) é definido pelas seguintes reações: R21 de modo a produzir CIT R22 de modo a produzir Cis-ACO R23 de modo a produzir ICI R31 de modo a produzir GLYOXY e SUCC

R32 de modo a produzir MAL

R28 de modo a produzir FUM

R29 de modo a produzir MAL

R30 de modo a produzir OAA

Para os propósitos da presente invenção, a via da anaplerose (AP) é definido pelas seguintes reações:

R34 de modo a produzir OAA R33/R36 de modo a produzir OAA

Para os propósitos da presente invenção, a cadeia respiratória (RC) é definida pelas seguintes reações:

R59 que catalisa: 2NADH + 02ex + 4ADP = 2NAD + 4ATP R60 que catalisa: 2FADH + O2ex + 2 ADP = 2FAD + 2ATP Para os propósitos da presente invenção, a via da assimilação de enxofre (SA) é definido pelas seguintes reações: R55 de modo a produzir H2SO3 R58 de modo a produzir H2S

Para os propósitos da presente invenção, a via da síntese de metionina (MS) é definido pelas seguintes reações: R37 de modo a produzir Asp R47 de modo a produzir ASP-P R48 de modo a produzir ASP-SA R39 de modo a produzir HOM R40 de modo a produzir O-AC-HOM R46 de modo a produzir CYSTA R49 de modo a produzir HMOCYS R54 de modo a produzir HOMOCYS R52 de modo a produzir MET R53 de modo a produzir METex Para os propósitos da presente invenção, a via da síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS) é definido pelas seguintes reações: R41 de modo a produzir 3-PHP R42 de modo a produzir SER-P R43 de modo a produzir SER

R44 de modo a produzir O-AC-SER R45 de modo a produzir CYS R38 de modo a produzir M-THF e Glicina ex Para os propósitos da presente invenção, a via 1 (Pl) compreende as seguintes reações:

R25 de modo a produzir GLU

Para os propósitos da presente invenção, a via 2 (P2) compreende as seguintes reações:

R33/R36 de modo a produzir OAA R30 de modo a produzir MAL

R57 de modo a produzir PYR + CO2

Para os propósitos da presente invenção, a via 3 (P3) compreende a seguinte reação:

R56 que catalisa: ATP = ADP Para os propósitos da presente invenção, a via 4 (P4)

compreende as seguintes reações:

R62 que catalisa: GTP + ADP = ATP + GDP Para os propósitos da presente invenção, a via 5 (P5) é definido pelas seguintes reações: R50 que catalisa: ATP + acetato = ADP + acetil P

Para os propósitos da presente invenção, a via 6 (P6) compreende as seguintes reações:

R51 que catalisa: acetil P + HCoA = acetil CoA

Para os propósitos da presente invenção, a via 7 (P7) compreende a seguinte reação:

R61 que catalisa: 6231 NH3ex + 233 SO4ex + 205 G6P + 308 F6P + 879 RIBO-5P + 268 E4P + 129 GA3P + 1295 3-PG + 652 PEP + 2604 PYR +3177 AC-CoA + 1680 OAA + 1224 2-OXO + 16429 NADPH = BIOMASSAex + 16429 NADP + 3177 H-CoA + 1227 CO2ex

Como apresentado acima, a estequiometria variará de organismo para organismo e pode ser tirada da literatura ou das páginas da Internet mencionadas acima. Alem disso, a rede metabólica de certos organismos tais como E. coli ou C. glutamicum podem compreender vias de reação adicionais.

Tais vias adicionais, conforme são usados para os propósitos da presente invenção, incluem:

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou

• sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou

• sistema de sulfito redutase (SRS) e/ou

• sistema que converte formiato (FCS) e/ou

• sistema que converte metanotiol (MCS)

Para os propósitos da presente invenção, o sistema de clivagem de glicina (GCS) compreende as seguintes reações:

R71: de modo a produzir M-HPL

R72: de modo a produzir Metileno-THF

A pessoa habilitada na técnica está bem ciente de que as reações de R71 e R72 são catalisadas por pelo menos três proteínas, a saber gcvH, PeT (ver as Tabelas 1 e 2). gcvP catalisa a descarboxilação de glicina para CO2 e um grupo aminometila, enquanto que GcvH é um carregador do grupo aminometila (R71). Uma descrição do sistema de clivagem de glicina pode ser encontrado em Neidhardt F. C. (1996) E. coli e S. typhimurium, ASM Press Washington. gcvT é envolvido na transferência unidade Cl da proteína H para tetraidrofoliato e a liberação de NH3 (R72). A reação é depois tipicamente completada pela quarta subunidade que é a lipoamida desidrogenase. A lipoamida desidrogenase codificada por IpdA funciona como a transferência de elétron de NAD para NADH. Esta desidrogenase é emprestada da piruvato desidrogenase de subunidade múltipla e é habitualmente chamada de IpdA. Para os propósitos da presente invenção o GCS pode ser assim resumido como:

R71/72: de modo a produzir Metileno-THF Para os propósitos da presente invenção, o GCS pode opcionalmente compreender também a seguinte reação adicional: R78: de modo a produzir Metil-THF

Estritamente falando, R78 não pertence ao GCS visto que o mesmo serve apenas para fornecer Metil-THF. Entretanto, em organismos em que R78 não está presente, R78 pode ser implementado junto com as outras reações do GCS. Em organismos em que R78 já está presente, isto pode não ser necessário.

Para os propósitos da presente invenção, a conversão do sistema de transidrogenase (THGC) compreende a seguinte reação: R70: de modo a produzir NADPH

Para os propósitos da presente invenção, o THGC pode também compreender a seguinte reação:

R81: de modo a produzir NADPH

Embora R70 por exemplo possa ser uma Transidrogenase citossólica, R81 por exemplo, pode ser uma Transidrogenase de transmembrana.

. Para os propósitos da presente invenção, o sistema da tiossulfato redutase (TRS) compreende as seguintes reações:

R73: de modo a metabolizar tiossulfato em sulfeto e sulfito Para os propósitos da presente invenção, a TRS pode adicionalmente compreender:

R82: de modo a importar H2S2O3 extracelular dentro da célula

e/ou

R45a: de modo a produzir mais S-Sulfocisteina e/ou

R49: de modo a produzir mais S-Sulfocisteína.

R45a e/ou R49 convertem Tiossulfato em S-Sulfo-Cisteina e assim pertence ao SRS.

Para os propósitos da presente invenção, o sistema de sulfato redutase (SARS) compreende a seguinte reação:

R80: de modo a metabolizar sulfato em sulfito Para os propósitos da presente invenção, o sistema da sulfito redutase (SRS) compreende a seguinte reação:

R74 de modo a metabolizar sulfito em sulfeto Para os propósitos da presente invenção, o sistema que converte formiato (FCS) compreende as seguintes reações: R75: de modo a produzir 10-formila-THF R76: de modo a produzir Metileno-THF R78: de modo a produzir Metila-THF

Para os propósitos da presente invenção, o sistema que converte metanotiol (MCS) compreende as seguintes reações:

R77 de modo a metil-sulfidrilar O-Acetil-homosserina com

metanotiol

Para os propósitos da presente invenção, a via 8 (P8) compreende a seguinte reação:

R79 de modo a degradar formila-THF a formiato e

tetraidrofoliato

Na tabela que segue os exemplos específicos são dados para as enzimas mencionadas acima. ^ •Γ"'-'

36

Outras reações podem ser encontradas na vista geral de reações dadas mais abaixo.

Tabela 1

Número Enzima Número de acesso no Gene bank Organismo Rl Sistema de fosfo- transferase Cgll360, Cgll936, Cgl2642 Corynebacterium glutamicum R2 G6P-isomerase Cgl0851 Corynebacterium glutamicum R3 Proteína G6P- Desidrogenase5 OPCA Cgll 576, BAB98969) Cgll 577 Corynebacterium glutamicum e outros) R4 Lactonase CgIl 578 Corynebacterium elutamicum R5 Glieonato- Desidrogenase Cgl1452, BAB98845 Corynebacterium glutamicum e outros) R6 Ribulose-5-Ρ- epimerase Cgll598 Corynebaeterium glutamicum R7 Ribose-5-P-isomerase Cgl2423 Corynebacterium glutamicum R8 Transcetolase 1 Cgll 574, YP_225858 - Corynebacterium glutamicum e outros R9 Transaldolase Cgl 15 75 Corynebaeterium glutamicum e outros RlO Transcetolase 2 CgIl 574 Corynebacterium glutamicum e outros Rll Fosfofhitocinase CgI 1250 Corynebacterium glutamicum R12 Frutosebisfosfatase Cgl 1058 Cgl 1909 Cgl2095 Corynebacterium glutamicum e outras R13 Frutosebisfosfato- aldolase Cgl2770 Corynebacterium glutamicum R14 Triosefosfato- isomerase Cgl 1586 Corynebacterium glutamicum R15 3-fosfo glieerate- Cinase Cgll587 Corynebacterium glutamicum Rl 6 PG-cinase CgI2080 Corynebacterium glutamicum R17 PG-mutase Cgl0438 Corynebacterium glutamicum Rl 8 PEP-hidratase CglO974 Corynebacterium glutamicum R19 PYR-cinase Cgl2089 Corynebacterium glutamicum R20 PYR-Desidrogenase Cgl2248 CgI2610 Cgl 1271 Cgll 129 Cgl0097 CglO 162 Corynebacterium glutamicum R21 CIT-Sintase CgI0659 Corynebacterium glutamicum R22 ACO-Hidrolase Cgl 1315 Cgl 1540 Corynebacterium glutamicum R23 Aconitase Cgll315 Corynebacterium glutamicum R24 Isocitrato- Desidrogenase Cgl 1286 Cgl0664 Corynebacterium glutamicum R25 Glutamato- Desidrogenase Cgl2079 Corynebacterium glutamicum R26 2-0X0- Cglll29 Corynebacterium glutamicum Desidrogenase R27 SUCC-CoA-sintase Cgl2565 Corynebacterium glutamieum R28 SUCC-Desidrogenase Cgl0370 Corynebaeterium glutamieum R29 Fumarase CgllOlO Corynebaeterium glutamieum R30 MAL-Desidrogenase Cgl2380 Corynebaeterium glutamieum R31 ICI-Liase Cgl0097 Cgl2331 Corynebaeterium glutamieum R32 MAL-Sintase Cgl2329 Corynebacterium glutamieum R33 PYR-Carboxilase Cgl0689 Corynebaeterium glutamieum R34 PEP-Carboxilase Cgll 585 Corynebaeterium glutamieum R35 PEP-Carboxicinase Cgl2863 Corynebaeterium glutamieum R36 OAA-Descarboxilase CE0804 Corynebaeterium glutamieum R37 ASP-Transaminase Cgl0240 Corynebaeterium glutamieum R38 síntese de M-THF 1 Cgl08 60 Cgll600 Cgl0382 Cgl0861 Cgl0648 Cgl2171 Cgl0881 Cgl0996 Cgl1972 Corynebaeterium glutamieum R39 HOM-Des idrogenase Cglll83 Corynebaeterium glutamieum R40 HOM-Transacetilase CglO 652 Corynebaeterium glutamieum R41 PG-Desidrogenase Cgll284 Corynebaeterium glutamieum R42 Fosfoserina- transaminase Cgl0828 Corynebaeterium glutamieum R43 Fosfoserina-fosfatase Cgl0299 Corynebaeterium glutamieum R44 Serina-Transacetilase Cgl2563 Corynebaeterium glutamieum R45 Cisteina-Sintase Cgl2136Cgl0653 Corynebaeterium glutamieum R45a S-Sulfo-Cisteina- Sintase Cgl2136 Cgl0653 Corynebaeterium glutamieum R46 Cistationina-Sintase Cgl2446 Corynebaeterium glutamieum R47 Aspartocinase Cgl0251 Corynebaeterium glutamieum R48 ASP-P-Desidrogenase Cgl0252 Corynebaeterium glutamieum R49 O-Ac-HOM SulfidriIase Cgl0653 Corynebaeterium glutamieum R50 Aeetato-Cinase Cg3047 Corynebaeterium glutamieum R51 Fosfotransacetilase Cg3048 Corynebaeterium glutamieum R52 MET-Sintase (MetE/H) Cgl1507 Cglll39 Corynebaeterium glutamieum R53 Exportador de Metionina YP 224558 CAFl 8830 Corynebaeterium glutamieum R54 Cistationina-Liase Ceg2536 Corynebaeterium glutamieum R55 ATP-Sulfurilase Cgl2814 Corynebaeterium glutamieum R56 ATP-Hidrólise Não aplicável reação espontânea R57 Enzima málica Cgl3007 Corynebaeterium glutamieum R58 Sulfito-Redutase Cg3118 Corynebaeterium glutamieum R59 Cadeia respiratória 1 Cgl 1-2-1-2 Cgl 1210 Cgll211 Cgll209 Cgll213 Cgll207 Cgll206 Cgll208 Corynebaeterium glutamieum R60 Cadeia respiratória 2 Cgll212 Cgll210 Cgll211 Cgll209 Cgll213 Cgll207 Ggll206 Cgll208 Corynebacterium glutamieum R61 ) ^ormação de J Equação de soma Biomassa R62 GTP-ATP-Fosfo- transferase Cg2603 Corynebacterium glutamicum R70 Transidrogenase AAC76944, NP 214669, NP' 334574 E. coli e outras R71 Proteína glicina descarboxilase P Proteína H Q8FE66, P0A6T9 E. coli e outras R72 Aminometiltransferas e proteína T proteína H CAA52144.1, P0A6T9 E. coli e outras R71/72 Sistema de clivagem de glicina GcvPjH,T Ipda CAA52144, Q8FE66, P0A9P0, P0A6T9 E. coli e outras R73 TiossuIfato Redutase consistindo de 3 subunidades NP 461008, NP 461009, NP_461010 Salmonella typhimurium e outras R74 Sulfito Redutase anaeróbica consistindo de 3 subunidades AAL21442, AAL21443, NP_804181 Salmonella typhimurium e outras R75 Formiato-THF-Iigase NP 939608) C diphteriae e outras R76 5-formil- tetraidrofoliat ociclo-ligase NCgIO 845 C. glutamicum e outras R77 O-AcetiI- homosserina-(metil)- sulfidrilase NCgl0625 C. glutamicum e outras R78 5,10-metiIenoTHF redutase(N AD(P)H Metilenotetraidrofolia to desidrogenase (NADP+) (EC 1.5.1.5) NCgl2091, NP_601375 C. glutamicum R79 formil-tetraidrofoliato desformilase degrada formila-THF a formiato e tetraidrofoliato ADD13491 C. glutamicum R80 Sistema de sulfato redutase NP__602005, NP 602006, NP 602007, CAF20840, CAF20841 C. glutamicum e outros R81 Transmembrana Transidrogenase CAA46822 outras R82 Transportador da captação de sulfato (transportador ABC) YP_224929 C. glutamicum e outros

Os números de acesso acima são os números de acesso oficiais

do Genbank ou são sinônimos para os números de acesso que têm referências cruzadas com o Genbank. Estes números podem ser pesquisados e encontrados em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

A presente invenção também prevê que o fluxo metabólico através de outras vias e reações pode ser modulado pela manipulação teórica ou genética de organismos para produzir organismos com eficiência aumentada de síntese de metionina contanto que estas reações sejam conhecidas por exemplo, na literatura científica como participando direta ou indiretamente na síntese de metionina. Estes vias e reações, naturalmente, também podem ser implementadas na análise teórica do modo de fluxo elementar. Os organismos (geneticamente modificados) obtidos por estes métodos também são parte da invenção.

Como mencionado acima, de acordo com a presente invenção o fluxo metabólico real em um organismo deve ser aproximado do fluxo teórico ótimo para um organismo com síntese de metionina aumentada, como determinado pela análise do modo de fluxo elementar de acordo com a reivindicação 1. Para os propósitos da presente invenção, "aproximado" significa que o fluxo metabólico do organismo geneticamente modificado como uma conseqüência da modificação genética se parece mais com o fluxo metabólico dos prognósticos teóricos do que com o fluxo metabólico do organismo de partida.

Como já apresentado, a modulação do fluxo metabólico do organismo de partida pode ser influenciado pela alteração genética do organismo, por exemplo, influenciando-se a quantidade e/ou a atividade de enzimas que catalisam reações específicas da rede considerada. Adicionalmente, o fluxo metabólico pode ser influenciado pelo uso de certos nutrientes e metabólitos externos tais como sulfato, tiossulfato, sulfito e sulfeto e compostos Cl tais como formiato, formaldeído, metanol, metanotiol e sulfeto de dimetila. Embora a influência de metabólitos externos tais como tiossulfato, formiato ou metanotiol será explicada em mais detalhes mais tarde, exemplos gerais são dados abaixo para a modificação genética de organismos.

No que segue, será explicado com respeito a uma reação específica como o fluxo metabólico através de um certa via pode ser canalizado pela modificação genética de um organismo. Estas explicações correspondentemente se aplicam às outras reações.

Se, por exemplo, o modelo teórico obtido ou o organismo modelo projetado de acordo com o método da presente invenção prediz que para a síntese de metionina eficiente o fluxo metabólico deve ser principalmente canalizado no PPP, um organismo real com fluxo metabólico aumentado através deste via pode ser obtido influenciando-se geneticamente a quantidade e/ou atividade das reações anteriormente mencionadas sendo parte do PPP. Assim, o fluxo metabólico pode ser aumentado no PPP aumentando- se a quantidade e/ou atividade de R3, levando à formação de mais GLC-LAC. Do mesmo modo, aumentar a quantidade e/ou atividade de R4, R5, R6, R7, R8, R9 ou RlO pode aumentar o fluxo metabólico no PPP. O mesmo pode ser obtido aumentando-se a atividade de R2 para a produção de G6P.

Se o modelo teórico obtido pelo método da presente invenção prediz uma redução do fluxo metabólico através do TCA, isto pode ser obtido reduzindo-se a quantidade e/ou a atividade das seguintes enzimas R21, R22, R23, R24, R26, R27, R28, R29 ou R30. Como a atividade e/ou quantidade de uma enzima pode ser aumentada ou reduzida está evidente para o técnico habilitado e também será exemplificado abaixo.

Para os propósitos gerais, entretanto deve ser mencionado que em uma via metabólica, tal como na Figura 1, certas reações podem ser consideradas como sendo irreversível. Embora quase qualquer reação de uma rede biológica seja uma reação e, equilíbrio que é capaz de proceder em ambas as direções, as reações irreversíveis são habitualmente consideradas serem reações em que, por exemplo, pela entrada de energia, a reação é predominantemente impelida em uma direção, de modo que o equilíbrio da reação se situe quase exclusivamente em um lado da reação.

No caso do PPP, tais reações irreversíveis são por exemplo, as reações catalisadas por R3 e R5, ambas das quais são favorecidas pela formação de NADPH. Outras de tais reações irreversíveis, como este termo é usado no contexto desta invenção, são por exemplo, Rl 6 do EMP, R24 do TCA, etc. As reações irreversíveis são indicadas na Figura 1 pelas setas que apontam apenas em uma direção.

Se, no contexto da presente invenção, é estabelecido que o fluxo metabólico através de um certa via de reação é aumentado aumentando- se a quantidade e/ou atividade da enzima que catalisa aquela direção, então esta afirmação deve ser observada no contexto de como as reações são definidas acima. Aumentar ou diminuir a quantidade e/ou atividade de uma enzima deve ser entendido com respeito à direção em que a reação deve ser ainda pressionada ou canalizada. Como as reações dos várias vias da rede metabólica de acordo com a presente invenção foram definidas por uma enzima e o produto que é formado por esta enzima, aumentando a quantidade e/ou atividade de uma enzima ou diminuindo a quantidade e/ou atividade de uma enzima são claramente entendidas pela pessoa habilitada na técnica para influenciar a quantidade e/ou atividade da enzima em um tal modo que mais ou menos produto seja obtido.

Assim, se por exemplo, é estabelecido que a atividade da enzima R6 é aumentada, então em vista da descrição mencionada acima desta reação isto significa que aumentando-se a quantidade e/ou atividade de R6, a quantidade de XIL-5P é aumentada. Similarmente, se é estabelecido que a quantidade e/ou atividade de R23 é aumentada, isto se refere a uma situação onde a quantidade e/ou atividade de R23 é aumentada para produzir mais ICI. Correspondentemente, se por exemplo, a quantidade e/ou atividade de R29 são diminuídas, então isto significa que a quantidade e/ou atividade de R29 é reduzida de modo a produzir menos MAL. Se os organismos modelos teóricos com eficiência de metionina aumentada requerer por exemplo, um aumento do fluxo metabólico através de um certa via, em uma forma de realização da invenção pode ser suficiente modificar a quantidade e/ou atividade de apenas uma enzima daquele via de reação. Alternativamente, a quantidade e/ou atividade dè várias enzimas deste via metabólica podem ser modificadas. Se5 por exemplo, o modelo teórico obtido pela análise de fluxo elementar sugere por exemplo, aumentar o fluxo metabólico através do PPP e do TCA enquanto o fluxo metabólico através do RC deva ser reduzido, isto pode ser obtido aumentando-se a quantidade e/ou atividade apenas de uma enzima do ciclo de PPP e de TCA enquanto que a atividade e/ou quantidade de apenas uma enzima do RC podem ser reduzidas. Alternativamente, a quantidade e/ou atividade de várias ou de todas as enzimas destes vias podem ser influenciadas ao mesmo tempo. A pessoa habilitada na técnica também está bem ciente de que

o que pode ser definido acima como uma reação enzimática que é realizada por uma única atividade enzimática pode ser realmente uma série de (sub)etapas enzimáticas pelas várias enzimas que como um todo fornecem a atividade global indicada (por exemplo, sulfito ou tiossulfato redutase). A atividade enzimática global indicada (ver números R acima) também pode ser composta de várias subunidades. Neste caso o fluxo metabólico através das reações identificadas acima pode ser influenciado pela modificação da atividade e/ou quantidade de pelo menos uma das enzimas que realizam uma das (sub)etapas únicas ou de pelo menos uma das subunidades. Conseqüentemente, os genes que codificam as (sub)etapas ou subunidades podem ser considerados como parte da atividade enzimática respectiva global.

Com respeito ao sistema de clivagem de glicina, a pessoa habilitada sabe que os genes gcvT, e/ou H, e/ou P e/ou L (IpdA) (ver as Tabelas 1 e 2) estão envolvidos neste sistema. O fluxo metabólico através deste sistema que é definido acima pelas reações R71, R72 e R71/R72 pode ser assim aumentado ou introduzido por exemplo, pela super-expressão de pelo menos um dos genes identificados acima ou seus homólogos. O aumento do fluxo metabólico também pode ser obtido pela super-expressão de todos os quatro destes genes ou apenas dois ou três destes gene. Os genes podem ser super-expressados juntos por exemplo em um operon que ocorre naturalmente ou em um operon artificial construído usando promotores. Adicionalmente estes podem ser úteis também para super-expressar o gene IpdAjunto com os genes gcvH,P,T (ver novamente as Tabelas 1 e 2).

Com respeito ao sistema de síntese de metionina, a pessoa habilitada sabe que as reações :

R47, R48, R39, R40 R46, R49, R52, R53, R54 são envolvidos na síntese de metionina.

Para a super-expressão da transidrogenase (R70 e R81) pelo menos um dos genes udh, pntA e/ou pntB ou seus homólogos (ver as Tabelas 1 e 2) podem ser super-expressados. Os genes também podem ser super- expressados junto por exemplo, em um operon que ocorre naturalmente ou em um operon artificial construído usando promotores. Pode-se, naturalmente, além disso ou alternativamente super-expressar também um gene para uma transidrogenase de transmembrana tal como udhA e ou pntA,B.

Para a super-expressão da Tiossulfato-Redutase (R73, R45a, R49 e/ou R82) os genes da tiossulfato redutase subunidade de citocromo B, a proteína de transporte de elétron da tiossulfato redutase e/ou precursor da tiossulfato redutase pode ser super-expressado sozinho ou em combinação por exemplo em um operon que ocorre naturalmente ou em um operon artificial construído usando promotores. Para estes propósitos os genes phsA, B e/ou C ou seus homólogos podem ser usados (ver as Tabelas 1 e 2). Similarmente os genes de um transportador ABC tais como YP_224929 podem ser super- expressados. 15

20

!5

ΡαΠΙ " SUper"eXpreSsã0 da via ^ pentose fosfato os genes da Glicose-6-fosfato desidrogenase, OPCA, transcetolase, transaldolase, 6-

fosfoglucono lactona desidrogenase ou seus homólogos (ver as Tabelas 1 e 2)

_ podem ser super-expressados sozinhos ou em qualquer combinação de 2 3 4

°U maÍS 8meS P°r 6Xempl° em ™ operon que ocorre naturalmente ou em um operon artificial construído usando promotores.

Para a super-expressão do sistema de redução de sulfite (R74)

os genes das subunidades A, B e C da sulfito redutase anaeróbica podem ser

super-expressados sozinhos ou juntos por exemplo, em um operon que ocorre

naturalmente ou em um operon artificia, construído usando promotores Os

genes dsrA, dsrB e/ou dsrC ou seus homólogos (ver as Tabelas 1 e 2) podem ser usados para estes propósitos.

Com respeito ao sistema que converte formiato (FCS) o fluxo metabólico pode ser modificado e em algumas formas de realização aumentada ou introduzida pela modificação da quantidade e/ou atividade de pelo menos um dos seguintes genes que são selecionados do grupo da F«HF-ligase, Fonnil-THF-cicloligase, Metileno-THF-desidrogenase, 5,10 Met1,eno-THF-redutase, Metileno-THF-Redutase. Os seus homólogos também podem ser usados (ver as Tabelas 1 e 2). O fluxo metabólico através

do FCS também pode ser aumentado pela super-expressão de qualquer um destes genes.

o sistema- da sulfato redutase (SARS, R80) pode ser considerado consistir da subunidade 1 da sulfato adenilate transferase (NP_602005) e subunidade 2 da sulfato adenilato transferase (NP 602006) constituindo a ATP:sulfato adenililtransferase, a adenosina 5>-fosfosulfato cmase (EC:2.7.1.25), a 3'-fosfoadenosina 5>-fosfossulfato (PAPS) redutase (EC: 1.8.4.8, NCgl2717) e a sulfito redutase, (EC: 1.8.1.2, CAF20840)

Um alvo preferido para a modificação pode ser a quantidade e/ou atividade de enzimas que são consideradas serem irreversíveis no sentido

\ 15

20

25

da presente invenção. Assim, os modelos teóricos obtidos pela análise do fluxo metabólico para os organismos mostrando uma eficiência aumentada para a síntese de metionina dá à pessoa habilitada na técnica um guia claro de quais manipulações genéticas a pessoa habilitada deve considerar para a obtenção de um microorganismo com um tal fluxo metabólico otimizado A Pessoa habilitada na técnica escolherá depois as enzimas decisivas que são todas bem conhecidas por ela da construção da rede metabólica teórica e influenciará a quantidade e/ou atividade destas enzimas pela modificação geneüca do organismo. Como tais organismos podem ser obtidos pela modificação genética pertence ao conhecimento geral na técnica.

Por organismos geneticamente aperfeiçoados de acordo com a presente invenção, o fluxo metabólico nestes organismos pode ser aperfeiçoado de modo a aumentar a eficiência de síntese de metionina tal que estes organismos sejam caracterizados em que a metionina seja produzida com uma eficiência de pelo menos 10%, pel0 menos ,5%, pe,o menos 20% pelo menos 25*. pelo menos 30»/», pe,o menos 35»/, pelo menos W0 pe,0' me«os 45o/0, peIo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60°/,, pelo menos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos

Na parte teórica da seção experimental é descrito que os modos de flUXo metabólico ótimo para C ,Mamicum e £ co// com efídência

aumentada de produção de metionina se parecem. Embora seja apresentado em detalhes como estes modelos foram calculados, quais reações foram consideradas e quais estequiometrias foram usadas, as conclusões gerais destes modelos são listadas abaixo. A seguinte seção portanto tem que ser entendida como uma instrução para a pessoa habilitada na técnica, quais vias metabólicas devem ser geneticamente modificados de modo a se aproximar do fluxo metabólico através destes vias para os valores ótimos como obtidos Para o modelo teórico. Um programa de trabalho será então dado na parte prática da seção experimental para ilustrar quanto a certas enzimas quais medidas específicas têm que ser tomadas para a manipulação genética. C. glutamicum

Um objetivo da presente invenção diz respeito a um microorganismo do gênero Corynebacterium que foi geneticamente modificado de modo a aumentar e/ou introduzir um fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguinte vias comparados com o organismo de partida:

• sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou

• via da pentose fosfato (PPP) e/ou

• assimilação de enxofre (SA) e/ou

• via da anaplerose (AP) e/ou

• síntese da via da metionina (MS) e/ou

• síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• via 1 (Pl) e/ou

• via 2 (P2) e/ou

• sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou

• sistema da sulfito redutase (SRS) e/ou

• sistema da sulfato redutase (SARS) e/ou

• sistema que converte formiato (FCS) e/ou

• sistema que converte metanotiol (MCS) e/ou

Ao mesmo tempo um tal microorganismo otimizado deve ter opcionalmente um fluxo metabólico pelo menos reduzido através de pelo menos um dos seguinte vias:

• glicólise (EMP) e/ou

• ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou

• desvio de glioxilato (GS) e/ou

• cadeia respiratória (RC) e/ou • via 3 (P3) e/ou

• via 4 (P4) e/ou

• via 7 (P7) e/ou

• Rl 9 de modo a produzir menos piruvato e/ou

• R35 de modo a produzir menos PEP e/ou

• R79 de modo a produzir menos THF.

A presente invenção diz respeito a um método para produzir um microorganismo do gênero Corynebacterium com eficiência aumentada de produção de metionina que compreende as seguintes etapas.

• aumentar e/ou introduzir o fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguintes vias comparados com o de partida pela modificação genética do organismo:

• sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou

• via da pentose fosfato (PPP) e/ou

• assimilação de enxofre (SA) e/ou

• via da anaplerose (PA) e/ou

• síntese da via da metionina (MS) e/ou

• sistema de serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• via 1 (Pl) e/ou

• via 2 (P2) e/ou

• sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou

• sistema de sulfito redutase (SRS) e/ou

• sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou

• sistema que converte formiato (FCS) e/ou

• sistema que converte metanotiol (MCS) e/ou

• pelo menos parcialmente diminuir o fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguintes vias comparado com o de partida pela modificação genética do organismo:

• glicólise (EMP) e/ou

• ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou

• desvio de glioxilato (GS) e/ou

• cadeia respiratória (RC) e/ou

• via 3 (P3) e/ou

• via 4 (P4) e/ou

• via 7 (P7) e/ou

• Rl 9 de modo a produzir menos piruvato e/ou

• R35 de modo a produzir menos PEP e/ou

• R79 de modo a produzir menos THF.

Uma forma de realização da presente invenção diz respeito a um método para produzir um microorganismo do gênero Corynebacterium com uma eficiência aumentada para a síntese de metionina em que

com respeito ao PTS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com o organismo de partida:

a. Rl de modo a produzir mais G6P; e/ou

com respeito à PPP, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com as do organismo de partida:

a. R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou

b. R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou

c. R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou

d. R6 de modo a produzir mais XIL-5P e/ou

e. R7 de modo a produzir mais RIBO-5P e/ou

f. R8 de modo a produzir mais S7P e GA3P e/ou

g. R9 de modo a produzir mais E-4p e F6P e/ou

h. RlO de modo a produzir mais F6P e GA3P e/ou i. R2 de modo a produzir mais G6P; e/ou com respeito à SAj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com as do organismo de partida:

a. R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou

b. R58 de modo a produzir mais H2S e/ou

com respeito à AP, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R33 de modo a produzir mais OAA e/ou com respeito à MS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R37 de modo a produzir mais Asp e/ou

b. R39 de modo a produzir mais HOM e/ou

c. R40 de modo a produzir mais O-AC-HOM e/ou

d. R46 de modo a produzir mais CISTA e/ou

e. R47 de modo a produzir mais ASP-P e/ou

f. R48 de modo a produzir mais ASP-SA e/ou

g. R49 de modo a produzir mais HOMOCIS e/ou

h. R52 de modo a produzir mais MET e/ou

i. R53 de modo a produzir mais METex e/ou

j. R54 de modo a produzir mais HOMOCIS e/ou com respeito à SCGS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R38 de modo a produzir mais M-THF e Glicinaex e/ou

b. R44 de modo a produzir mais O-AC-SER e/ou

c. R45 de modo a produzir mais CIS e/ou com respeito à CGS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou

b. R72 de modo a produzir mais Metileno-THF

c. R78 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

com respeito à THGC5 a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou

b. R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou

com respeito à PI, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R25 de modo a produzir mais Glu; e/ou com respeito à P2, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R33 e/ou R36 de modo a produzir mais OAA e/ou

b. R30 de modo a produzir mais MAL e/ou

c. R57 de modo a produzir mais Pyr; e/ou

com respeito à TRS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R73 de modo a metabolizar tiossulfato para sulfeto e sulfite

e/ou

b. R82 para transportar mais H2S2O3 externo para dentro da

célula e/ou

com respeito à SRS, a quantidade e/ou atividade da seguinte enzima é aumentada comparada e/ou introduzida com a do organismo de partida:

a. R74 de modo a metabolizar sulfito em sulfeto e/ou

com respeito à FCSs a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou

b. R76 de modo a produzir Metileno-THF a partir de 10- formil-THF e/ou

c. R78 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

com respeito à MCSs a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R77 de modo a metil-sulfidrilar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou

com respeito à SARS, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são aumentada(s) e/ou introduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. R80 de modo a produzir mais sulfito e/ou

com respeito à EMP, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. Rl 1 de modo a produzir menos F-1,6-BP e/ou

b. Rl 3 de modo a produzir menos DHAP e GA3P e/ou

c. Rl 4 de modo a produzir menos GA3P e/ou

d. Rl 5 de modo a produzir menos 1,3-PG e/ou

e. Rl 6 de modo a produzir menos 3-PG e/ou

f. Rl 7 de modo a produzir menos 2-PG e/ou

g. Rl 8 de modo a produzir menos PEP e/ou h. Rl 9 de modo a produzir menos Pyr; e/ou com respeito à TCA, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. R20 de modo a produzir menos Ac-CoA e/ou

b. R21 de modo a produzir menos CIT e/ou

c. R22 de modo a produzir menos Cis-ACO e/ou

d. R23 de modo a produzir menos ICI e/ou

e. R24 de modo a produzir menos 2-OXO e/ou

f. R26 de modo a produzir menos SUCC-CoA e/ou

g. R27 de modo a produzir menos SUCC e/ou

h. R28 de modo a produzir menos FUM e/ou

i. R29 de modo a produzir menos MAL e/ou j. R30 de modo a produzir menos OAA; e/ou

com respeito à GS, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. R21 de modo a produzir menos CIT e/ou

b. R22 de modo a produzir menos Cis-ACO e/ou

c. R23 de modo a produzir menos ICI e/ou

d. R31 de modo a produzir menos GLYOXY e SUCC e/ou

e. R32 de modo a produzir menos MAL e/ou

f. R28 de modo a produzir menos FUM e/ou

g. R29 de modo a produzir menos MAL e/ou

h. R30 de modo a produzir menos OAA; e/ou

com respeito à RC, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida: a. R60; e/ou 10

15

a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são

pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. Rl 9; e/ou

a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são

pelo menos parcialmente reduzida(s) comparadas) com a do organismo de partida:

a. R35; e/ou

com respeito à P3, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida: a. R56; e/ou

com respeito à P4, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida: a. R62; e/ou

com respeito à P7, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida: a. R61, e/ou

com respeito à P8, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente redUzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida: a. R79.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um método para produzir um microorganismo do gênero

Corynebacterium com uma eficiência aumentada para a síntese de metionina em que

• a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são

25 aumentada(s) e/ou introduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

1. R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou

2. R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou

3. R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou

4. RlO de modo a produzir mais F6P e GA3P e/ou

5. R2 de modo a produzir mais G6P e/ou

6. R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou

7. R58 de modo a produzir mais H2S e/ou

8. R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou

9. R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

10. R78 de modo a produzir Metil-THF e/ou

11. R76 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

12. R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou

13. R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou

14. R25 de modo a produzir mais Glu e/ou

15. R33 e/ou R36 de modo a produzir mais OAA e/ou

16. R30 de modo a produzir mais MAL e/ou

17. R57 de modo a produzir mais Pyr e/ou

18. R80 de modo a metabolizar sulfato a sulfito e/ou

19. R73 de modo a metabolizar tiossulfato em sulfeto e sulfito

e/ou

20. R74 de modo a metabolizar sulfito em sulfeto e/ou

21. R82 para transportar mais H2S2O3 externo para dentro da

célula e/ou

22. R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou

23. R76 de modo a produzir Metileno-THF a partir de 10- formil-THF e/ou

24. R78 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou 25. R77 de modo a metil-sulfidrilar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou

• a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

1. Rl 1 de modo a produzir menos F-1,6-BP e/ou

2. Rl 9 de modo a produzir menos Pyr e/ou

3. R20 de modo a produzir menos Ac-CoA e/ou

4. R21 de modo a produzir menos CIT e/ou

5. R24 de modo a produzir menos 2-OXO e/ou

6. R26 de modo a produzir menos SUCC-CoA e/ou

7. R27 de modo a produzir menos SUCC e/ou

8. R31 de modo a produzir menos GLYOXY e SUCC e/ou

9. R32 de modo a produzir menos MAL e/ou

10. R35 de modo a produzir menos PEP e/ou 10. R79 de modo a produzir menos THF.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz

respeito a um método para produzir um microorganismo do gênero

Corynebacterium com uma eficiência aumentada para a síntese de metionina, em que

• a quantidade e/ou atividade da seguinte enzima são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

1. R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou

2. R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou

3. R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou

4. RlO de modo a produzir mais F6P e GA3P e/ou

5. R2 de modo a produzir mais G6P e

6. R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou

7. R58 de modo a produzir mais H2S e 8. R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou

9. R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

10. R78 de modo a produzir Metil-THF e/ou

11. R76 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

12. R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou

13. R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou

14. R25 de modo a produzir mais Glu e/ou

15. R33 e/ou R36 de modo a produzir mais OAA

16. R30 de modo a produzir mais MAL

17. R57 de modo a produzir mais Pyr

18. R80 de modo a metabolizar sulfato a sulfito e/ou

19. R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou

20. R76 de modo a produzir Metileno-THF a partir de 10- formil-THF e/ou

21. R77 de modo a metil-sulfidrílar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou

♦ a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são pelo menos parcialmente reduzidas comparadas com a do organismo de partida:

1. Rl 1 de modo a produzir menos F-1,6-BP e/ou

2. Rl 9 de modo a produzir menos Pyr e/ou

3. R20 de modo a produzir menos Ac-CoA e/ou

4. R21 de modo a produzir menos CIT e/ou

5. R24 de modo a produzir menos 2-OXO e/ou

6. R26 de modo a produzir menos SUCC-CoA e/ou

7. R27 de modo a produzir menos SUCC e/ou

8. R31 de modo a produzir menos GLYOXY e SUCC e/ou

9. R32 de modo a produzir menos MAL e/ou

10. R35 de modo a produzir menos PEP e/ou

11. R79 de modo a produzir menos THF. Qualquer organismo obtido por estes métodos também é um objeto da presente invenção.

Os microorganismos de Corynebacterium usados para estes métodos podem ser selecionadas do grupo que consiste de Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamieum ATCC 15806, Corynebaeterium aeetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-153 9, e Corynebaeterium melasseeola ATCC 17965, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 e Corynebaeterium glutamicum ATCC21608 Corynebacterium glutamicum DSM 17322

A abreviação KFCC significa Korean Federation of Culture Collection, enquanto que a abreviação ATCC significa a American Type

Strain Culture Collection e a abreviação DSM significa a German Resource Centre for Biological Material.

Particularmente interessantes são os organismo geneticamente modificados do gênero Can^nebaeierium9 em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido:

• sistema de clivagem de glicina

• conversão de transidrogenase

• sistema de tiossulfato redutase

• sistema de sulfato redutase

• sistema que converte formiato

• sistema que converte metanotiol.

Se um sistema que converte metanotiol é introduzido em Corynebacterium9 o sistema de tiossulfato redutase e o sistema que converte formiato pode se tornar obsoleto. Estes sistemas de via adicional anteriormente mencionados foram descobertos contribuir signifícantemente para o fluxo metabólico ótimo para síntese de metionina eficiente em E coli (ver abaixo). De acordo com os prognósticos teóricos, a inclusão destes vias metabólicas na C glutamicum deve aumentar ainda mais a eficiência de C. glutamicum para a síntese de metionina.

Assim, um aspecto da presente invenção diz respeito aos organismos que foram geneticamente modificados de modo a aumentar o fluxo metabólico através de qualquer um das vias anteríoimente mencionados.

Corrigindo-se geneticamente a C. glutamicum de acordo com a presente invenção, o fluxo metabólico nestes organismos pode ser corrigido de modo a aumentar a eficiência de síntese de metionina tal que estes organismos sejam caracterizados em que a metionina é produzida com uma eficiência de pelo menos 10%, de pelo menos 20%, de pelo menos 30%, de pelo menos 35%, de pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo' menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%.

A presente invenção não diz respeito, até o ponto em que a C. glutamicum é concentrada, às cepas silenciadas em AmcbR descritas em Rey et al. (2003) vide supra. E. coli

Um aspecto da presente invenção diz respeito a um microorganismo do gênero Escherichia 0 que foi geneticamente modificado de modo a aumentar e/ou introduzir um fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguintes vias comparados com o de partida:

• sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou

• sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou

• glióclise (EMP) e/ou

• ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou

• desvio de glioxilato (GS) e/ou

• via da anaplerose (AP) e/ou O

• síntese da via da metionina (MS) e/ou

• sistema de serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou

• via 1 (Pl) e/ou

• assimilação de enxofre (SA) e/ou

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou

• sistema de sulfíto redutase (SRS) e/ou

• sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou

• sistema que converte formiato (FCS) e/ou

• sistema que converte metanotiol (MCS) e/ou

• síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS).

Estes microorganismos com eficiência aumentada de síntese

de metionina também são opcionalmente caracterizados por um fluxo

metabólico pelo menos diminuído através de pelo menos um dos seguintes

vias comparados com o de partida que também podem ser obtidos pela modificação genética:

• via da pentose fosfato (PPP)

• síntese de metionina (MS) e/ou

• via 3 (P3) e/ou

• via 4 (P4) e/ou

• via 7 (P7) e/ou

• via 8 (P8).

Em algumas formas de realização, o fluxo metabólico através de PPP pode não ser diminuído mas aumentado.

Além dos microorganismos mencionados acima do gênero Eseheriehia^ a presente invenção também diz respeito a um método para produzir microorganismos do gênero Eseheriehia com eficiência aumentada de produção de metionina que compreende as seguintes etapas: • aumentar e/ou introduzir o fluxo metabólico através pelo menos um dos seguintes vias comparados com o de partida pela modificação genética of o organismo:

• sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou

• glióclise (EMP) e/ou

• ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou

• desvio de glioxilato (GS) e/ou

• via da anaplerose (AP) e/ou

• síntese da via da metionina (MS) e/ou

• sistema de serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou

• via 1 (Pl) e/ou

• assimilação de enxofre (SA) e/ou

• sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou

• conversão de transidrogenase (THGC) e/ou

• sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou

• sistema de sulfite redutase (SRS) e/ou

• sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou

• sistema que converte formiato (FCS) e/ou

• sistema que converte metanotiol (MCS) e/ou

• síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou

• pelo menos parcialmente diminuir o fluxo metabólico através de pelo menos um dos seguintes vias comparados com o de partida pela modificação genética do organismo:

• via da pentose fosfato (PPP)

• via 3 (P3) e/ou

• via 4 (P4) e/ou

• via 7 (P7) e/ou •RI 9 e/ou

• R35 e/ou • R79.

Outros aspectos da presente invenção são métodos para produzir um microorganismo do gênero Escherichia com uma eficiência aumentada para a síntese de metionina em que

com respeito à PTS, a quantidade e/ou atividade da seguinte enzima é aumentada comparada com a do organismo de partida:

a. Rl de modo a produzir mais G6P; e/ou

com respeito à EMO, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são aumentada(s) e/ou introduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

b. R2 de modo a produzir mais F6P e/ou

c. Rl 1 de modo a produzir mais F-1,6-BP e/ou

d. R13 de modo a produzir mais DHAP e GA3P e/ou

e. Rl 4 de modo a produzir mais GA3P e/ou

f. R15 de modo a produzir mais 1,3-PG e/ou

g. R16 de modo a produzir mais 3-PG e/ou

h. Rl7 de modo a produzir mais 2-PG e/ou

i. Rl 8 de modo a produzir mais PEP e/ou j. Rl9 de modo a produzir mais Pyr; e/ou

com respeito à TCAj a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são aumentada(s) e/ou introduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. R20 de modo a produzir mais Ac-CoA e/ou

b. R21 de modo a produzir mais CIT e/ou

c. R22 de modo a produzir mais Cis-ACO e/ou

d. R23 de modo a produzir mais ICI e/ou

e. R24 de modo a produzir mais 2-0X0 e/ou

f. R26 de modo a produzir mais SUCC-CoA e/ou

g. R27 de modo a produzir mais SUCC e/ou h. R28 de modo a produzir mais FUM e/ou

i. R29 de modo a produzir mais MAL e/ou j. R30 de modo a produzir mais OAA; e/ou

com respeito à AP, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R33 de modo a produzir mais OAA e/ou com respeito à MS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R37 de modo a produzir mais Asp e/ou

b. R39 de modo a produzir mais HOM e/ou

c. R40 de modo a produzir mais O-AC-HOM e/ou

d. R46 de modo a produzir mais CISTA e/ou

e. R47 de modo a produzir mais ASP-P e/ou

f. R48 de modo a produzir mais ASP-SA e/ou

g. R49 de modo a produzir mais HOMOCIS e/ou

h. R52 de modo a produzir mais MET e/ou

i. R53 de modo a produzir mais METex e/ou

j. R54 de modo a produzir mais HOMOCIS e/ou com respeito à SCGS5 a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R38 de modo a produzir mais M-THF e Glicina ex e/ou

b. R44 de modo a produzir mais O-AC-SER e/ou

c. R45 de modo a produzir mais CIS e/ou

com respeito à GS5 a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são aumentada(s) e/ou introduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida: a. R21 de modo a produzir mais CIT e/ou

b. R22 de modo a produzir mais Cis-ACO e/ou

c. R23 de modo a produzir mais ICI e/ou

d. R31 de modo a produzir mais GLYOXY e SUCC e/ou

e. R32 de modo a produzir mais MAL e/ou

f. R28 de modo a produzir mais FUM e/ou

g. R29 de modo a produzir mais MAL e/ou

h. R30 de modo a produzir mais OAA; e/ou

com respeito à PI, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

R25 de modo a produzir mais GIu; e/ou

com respeito à SA, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou

b. R58 de modo a produzir mais H2S; e/ou

com respeito à GCS, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou

b. R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

c. R78 de modo a produzir mais Metil-THF e/ou

com respeito à reivindicação THGC, a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com as do organismo de partida:

a. R70 de modo a produzir mais NADPH a partir de NADH

e/ou

b. R81 de modo a produzir mais NADPH a partir de NADH e/ou

com respeito à TRSj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfito

e/ou

b. R82 para transportar mais H2S2O3 externo para dentro da

célula e/ou

com respeito à SRSj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R74 de modo a metabolizar sulfito a sulfeto e/ou com respeito à SARSj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R80 de modo a metabolizar sulfato em sulfito e/ou com respeito à FCSj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou

b. R76 de modo a produzir Metileno-THP a partir de 10- formil-THF e/ou

c. R78 de modo a produzir mais Metil-THF

com respeito à MCSj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R77 de modo a metil-sulfidrilar OAcetil-homosserina com metanotiol e/ou

com respeito à SCGSj a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas comparadas com a do organismo de partida:

a. R44 de modo a produzir mais O-Ac-SER e/ou

b. R45 de modo a produzir mais CIS; e/ou

com respeito à PPP, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são aumentada(s) comparada(s) com a do organismo de partida:

a. R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou

b. R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou

c. R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou

d. R6 de modo a produzir mais XIL-5P e/ou

e. R7 de modo a produzir mais RIBO-5P e/ou

f. R8 de modo a produzir mais S7P e GA3P e/ou

g. R9 de modo a produzir mais E-4p e F6P e/ou

h. RlO de modo a produzir menos F6P e GA3P e/ou

i. R2 de modo a produzir 1 mais G6P; e/ou

com respeito à PPP, em algumas formas de realização a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) também pode(m) ser pelo menos parcialmente reduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R3 de modo a produzir menos GLC-LAC e/ou

b. R4 de modo a produzir menos 6-P-Gliconato e/ou

c. R5 de modo a produzir menos RIB-5P e/ou

d. R6 de modo a produzir menos XIL-5P e/ou

e. R7 de modo a produzir menos RIBO-5P e/ou

f. R8 de modo a produzir menos S7P e GA3P e/ou

g. R9 de modo a produzir menos E-4p e F6P e/ou

h. RlO de modo a produzir menos F6P e GA3P e/ou

i. R2 de modo a produzir menos G6P; e/ou com respeito à P3, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos reduzidas comparadas com a do

organismo de partida:

a. R56; e/ou

com respeito à P4, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos reduzidas comparadas com as do organismo de partida:

a. R62; e/ou

com respeito à P7, a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos reduzidas comparadas com a do organismo de partida: a. R61.

a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos reduzidas comparadas com a do organismo de partida:

a. R19 de modo a produzir menos piruvato; e/ou

b. R35 de modo a produzir menos PEP; e/ou

c. R79 de modo a produzir menos tetraidrofoliato.

Uma outra forma de realização da invenção com respeito ao gênero Escherichia diz respeito a um método para produzir microorganismos de Escherichia com eficiência aumentada de síntese de metionina, em que

• a quantidade e/ou atividade das seguintes enzimas são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida:

1. Rl de modo a produzir mais G6P e/ou

2. R2 de modo a produzir mais F6P e/ou

3. Rl 1 de modo a produzir mais F-1,6-BP e/ou

4. R19 de modo a produzir mais Pyr e/ou

5. R20 de modo a produzir mais Ac-CoA e/ou

6. R21 de modo a produzir mais CIT e/ou

7. R24 de modo a produzir mais 2-OXO e/ou 8. R26 de modo a produzir mais SUCC-CoA e/ou

9. R31 de modo a produzir mais GLYOXY e SUCC e/ou

10. R32 de modo a produzir mais MAL e/ou

11. R25 de modo a produzir mais Glu e/ou

12. R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou

13. R58 de modo a produzir mais H2S e/ou

14. R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou

15. R72 de modo a produzir mais M-THF e/ou

16. R78 de modo a produzir mais Metil-THF e/ou

17. R76 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou

18. R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou

19. R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou

20. R80 de modo a metabolizar sulfato em sulfite e/ou

21. R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfito

e/ou

célula e/ou

22. R82 para transportar mais H2S2O3 externo para dentro da

23. R74 de modo a metabolizar sulfito a sulfeto e/ou

24. R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou

25. R76 de modo a produzir Metileno-THF a partir de 10-

forml-THF e/ou

26. R77 de modo a metil-sulfidrilar O-Acetil-homosserina com

metanotiol e/ou

27. R44 de modo a produzir mais O-Ac-SER e/ou

28. R45 de modo a produzir mais CIS;

• a quantidade e/ou atividade da(s) seguinte(s) enzima(s) é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de

partida:

1. R19 de modo a produzir menos piruvato; e/ou 2. R35 de modo a produzir menos PEP; e/ou

3. R79 de modo a produzir menos tetraidrofoliato.

O microorganismo do gênero Escherichia que é obtenível por

qualquer um dos métodos anteriormente mencionados é selecionado do grupo

que compreende por exemplo, Eseheriehia coli.

Em algumas formas de realização que dizem respeito a

organismos tais como E eoli e C. glutamieum, o fluxo metabólico é gerado pela super-expressão das seguintes atividades enzimáticas: R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58. organismos E eoli e C. glutamieum em que qualquer combinação dos números R anteriormente mencionados ou qualquer um dos genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressadas também formam um objetivo da

invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamieum em que qualquer combinação de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e/ou R80 junto com R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamieum em que uma atividade enzimática do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 junto com qualquer um de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados também

formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C glutamieum em que duas

atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que três

atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados

também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que quatro

atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados

também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que cinco

atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77> R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados

também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que seis

atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados

também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que sete

atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que oito atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que nove atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78, e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super-expressados também formam um objetivo da invenção. Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo

menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 junta com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46> R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo menos duas atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da Η {β, 71

invenção.

Organismos tais como Ε. coli e C. glutamicum em que pelo menos três atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo

menos quatro atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo menos cinco atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo menos seis atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54

\ e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de Rl9, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo

menos sete atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C glutamicum em que pelo menos oito atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 é diminuída também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo menos nove atividades enzimáticas do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R19, R35 e R79 é diminuída também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 junta com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos duas atividades enzimáticas do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da invenção.

Organismos tais como E. coli e C. glutamicum em que pelo menos uma atividade enzimática do grupo que consiste de R70, R81, R71/R72, R73, R82, R74, R75, R76, R77, R78 e R80 juntas com qualquer uma de R37, R38, R39, R40, R44, R45, R46, R47, R48, R49, R52, R53, R54 e/ou R58 ou os genes que são parte destas atividades catalíticas são super- expressados e também pelo menos três atividades enzimáticas do grupo que consiste de R19, R35 e R79 são diminuídas também formam um objetivo da

invenção.

Em uma forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo C. glutamicum em que o fluxo metabólico através de um dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado por exemplo, pela modificação genética como descrita acima: FCS ou GCS ou MCS ou TRS ou THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes

externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz

respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através

dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e GCS, FCS e MCS,

FCS e TRS ou FCS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da

invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou

Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz H It 74

respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e GCS e TRS, FCS e GCS e TRS ou FCS e GCS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e GCS e MCS e TRS ou FCS e GCS e MCS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e GCS e MCS e TRS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e MCS e TRS ou FCS e MCS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e MCS e TRS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre. Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e TRS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes

externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e MCS e TRS ou FCS e MCS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato

como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: FCS e MCS e TRS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato

como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: MCS e TRS ou MCS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato

como fontes externas de enxofre. Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz

respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: MCS e TRS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Em uma outra forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um organismo de C. glutamicum em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é introduzido e/ou aumentado: TRS e THGC. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, estes organismos são adicionalmente cultivados usando Sulfeto ou Tiossulfato como fontes externas de enxofre.

Para a manipulação genética no caso de GCS, a expressão de R71 e/ou R72 pode ser aumentada. No caso de THGS a expressão de R70 e/ou R81 pode ser aumentada. No caso de TRS a expressão de R73, R45a, R49 e/ou R82 pode ser aumentada. Para MCS a expressão de R77 pode ser aumentada. No caso de FCS, a expressão de R75, R76 e/ou R78 pode ser aumentada.

Uma forma de realização preferida da invenção é representada na Figura 10. Nesta forma de realização, um organismo é representado em que o fluxo metabólico através dos seguintes vias é aumentado e/ou introduzido em comparação com o organismo de partida por exemplo, por via das manipulações genéticas já mencionadas: FCS e GCS e MCS e TRS e THGC. Concomitantemente o uso de Sulfeto e Tiossulfato como fontes de enxofre é considerado.

Os organismos da presente invenção podem preferivelmente compreender um microorganismo do gênero Corynebacterium^ particularmente Corynebacterium aeetoacidophilum, C. aeetoglutamicum, C. efficiens, C. jejeki, C. acetophilum, C amoniagenes, C. glutamicum, C. Iilium, C. nitrilophilus ou C. spec. Os organismos de acordo com a presente invenção também compreendem membros do gênero Brevibacterium, tais como Brevibaeterium harmoniagenes, Brevibacterium botanicum, B. divaraticum, B. fiavam, B. healil, ketoglutamicum, B. ketosoreductum,

Iactofermentum, Hnens9 B. paraphinolytieum e B. spec. Como para o gênero Escherichia, a presente invenção diz respeito por exemplo à, E. coli.

Como apresentado acima, o fluxo metabólico através de uma reação específica ou via metabólica específico pode ser modificado pelo aumento ou diminuição da quantidade e/ou atividade das enzimas que catalisam as respectivas reações.

Com respeito a aumentar a quantidade e/ou atividade de uma enzima, todos os métodos que são conhecidos na técnica para aumentar a quantidade e/ou atividade de uma proteína em um hospedeiro tal como os organismos mencionados acima podem ser usados. Aumentar ou introduzir a quantidade e/ou atividade

Com respeito a aumentar a quantidade, dois cenários básicos podem ser diferenciados. No primeiro cenário, a quantidade da enzima é aumentada pela expressão de uma versão exógena da respectiva proteína. No outro cenário, a expressão das proteínas endógenas é aumentada pela influencia a atividade dos elementos promotores e/ou realçadores e/ou outras atividades reguladoras tais como fosforilação, sumoilação, ubiquitilação etc. que regulam as atividades das respectivas proteínas em um nível transcricional, traducional ou pós-traducional.

Além de simplesmente aumentar a quantidade por exemplo, das enzimas da Tabela 1, a atividade das proteínas podem ser aumentadas usando-se as enzimas podem carregar mutações específicas que possibilitam uma atividade aumentada da enzima. Tais mutações, por exemplo, podem inativar as regiões de uma enzima que são responsáveis para a inibição da retroalimentação. Pela mutação destes por exemplo, pela introdução de mutações não conservativas, a enzima pode não fornecer mais a regulagem de retroalimentação e assim a atividade da enzima pode não ser infra regulada se mais produto fosse produzido. As mutações podem ser introduzidas na cópia endógena da enzima ou podem ser fornecidas pela super-expressão de uma forma mutante correspondente da enzima exógena. Tais mutações podem compreender mutações pontuais, deleções ou inserções. As mutações pontuais podem ser conservativas ou não conservativas. Além disso, as deleções podem compreender apenas dois ou três aminoácidos até completar os domínios da respectiva proteína.

Assim, o aumento da atividade e a quantidade de uma proteína

pode ser obtida por intermédio de vias diferentes, por exemplo, desligando-se mecanismos reguladores inibitórios ao nível da transcrição, tradução e proteína ou pelo aumento da expressão de gene de um ácido nucleico que codifica estas proteínas em comparação com a de partida, por exemplo, pela indução do gene R3 endógeno ou pela introdução de ácidos nucleicos que codificam a R3

Em uma forma de realização, o aumento da atividade e quantidade enzimáticas, respectivamente, em comparação com a de partida é obtido por um aumento da expressão de gene de um ácido nucleico que codifica tais enzimas. As seqüências podem ser obtidas a partir das respectivas bases de dados, por exemplo, na NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBL (http://www.embl.org) ou Expasy (http://www.expasy.org/). Os exemplos são dados na Tabela 1.

Em uma outra forma de realização, o aumento da quantidade e/ou atividade das enzimas da Tabela 1 é obtido pela introdução de ácidos nucleicos que codificam as enzimas da Tabela 1 no organismo, preferivelmente C. glutamicum ou E. coli.

Em princípio, cada proteína de organismos diferentes com um atividade enzimática das proteínas listadas na Tabela 1, pode ser usada. Com as seqüências de ácido nucleico genômicas de tais enzimas a partir de fontes eucarióticas contendo introns, as seqüências de ácido nucleico já processadas como os cDNAs correspondentes devem ser usadas no caso em que o organismo hospedeiro não é capaz ou não pode ser feitos capazes de unir os mRNAs correspondentes. Todos os ácidos nucleicos mencionado na descrição 10

podem ser, por exemplo, uma seqüência de RNA, DNA ou cDNA.

Em um método de acordo com a presente invenção para produzir organismos com eficiência aumentada de síntese de metionina, uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma das enzimas funcionais ou não funcionais, reguladas pela retroalimentação ou independentes da retroalimentação definidas acima é transferida a um microorganismo tal como C. glutamicum ou E coli., respectivamente. Esta transferência leva a um aumento da expressão da enzima, respectiva e correspondentemente a mais fluxo metabólico através da via de reação desejado.

De acordo com a presente invenção, aumentar ou introduzir a quantidade e/ou a atividade de uma proteína tipicamente compreende as seguinte etapas:

a) produção de um vetor que compreende as seguintes seqüências de ácido nucleico, preferivelmente as seqüências de DNA, na orientação de 5' para 3':

- uma seqüência promotor funcional nos organismos da

invenção

- operativamente ligado a este uma seqüência de DNA que codifica uma proteína da Tabela 1 ou partes equivalentes funcionais desta

- uma seqüência funcional de terminação nos organismos da

invenção

b) transferência do vetor da etapa a) aos organismos da invenção tais como C. glutamicum ou E coli e, opcionalmente, a integração nos respectivos genomas.

Quando partes funcionalmente equivalentes de enzimas são mencionadas dentro do escopo da presente invenção, fragmentos de seqüências de ácido nucleico que codificam as enzimas da Tabela 1 são intencionados, cuja expressão ainda leva às proteínas tendo a atividade enzimática da respectiva proteína de tamanho natural. De acordo com a presente invenção, as enzimas funcionais têm as mesmas seqüências de ácido nucleico e seqüências de aminoácido, respectivamente, como enzimas funcionais e partes funcionalmente equivalentes destas, respectivamente, mas têm, em algumas posições, mutações, inserções ou deleções pontuais de nucleotídeos ou aminoácidos, que têm o efeito que a enzima não funcional não são ou apenas a um grau muito limitado, capazes de catalisar a respectiva reação. Estas enzimas funcionais podem não ser intermisturadas com enzimas que ainda são capazes de catalisar a respectiva reação, mas que não são mais reguladas na retroalimentação. As enzimas funcionais também compreendem tais enzimas da Tabela 1 as mutações, inserções ou deleções pontuais que carregam ao nível da seqüência de ácido nucleico ou ao nível da seqüência de aminoácido e não são ou não obstante, capazes de interagir com parceiros de ligação fisiológica das enzimas. Tais parceiros de ligação fisiológica compreendem, por exemplo, os respectivos substratos. O que os mutantes não funcionais são incapazes é catalisar uma reação que a enzima do tipo selvagem, a partir da qual o mutante é derivada, pode.

De acordo com a presente invenção, o termo "enzima não funcional" não compreende tais proteínas que não têm nenhuma homologia de seqüência essencial para as respectivas enzimas funcionais ao nível do aminoácido e ao nível do ácido nucleico, respectivamente. As proteínas incapazes de catalisar as respectivas reações e não tendo nenhuma homologia de seqüência essencial com a respectiva enzima são portanto, por definição, não intencionadas pelo termo "enzima não funcional" da presente invenção. As enzimas funcionais, dentro do escopo da presente invenção, também são aludidas como enzimas inativadas ou inativas.

Portanto, as enzimas funcionais da Tabela 1 de acordo com a presente invenção que carregam as mutações, inserções e/ou deleções pontuais mencionadas acima são caracterizadas por uma homologia de seqüência essencial para as enzimas do tipo selvagem da Tabela 1 de acordo com a presente invenção ou partes funcionalmente equivalentes destas.

De acordo com a presente invenção, uma homologia de seqüência substancial é no geral entendido indicar que a seqüência de ácido nucleico ou a seqüência de aminoácido, respectivamente, de uma molécula de DNA ou uma proteína, respectivamente, é pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferido pelo menos 60%, também preferivelmente pelo menos 70%, também preferivelmente pelo menos 80%, particularmente preferido pelo menos 90%, em particular preferido pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelo menos 98% idêntica com as seqüências de ácido nucleico ou as seqüências de aminoácido, respectivamente, das proteínas da Tabela 1 ou partes funcionalmente equivalentes destas.

A identidade de duas proteínas é entendido ser a identidade dos aminoácidos em relação ao respectivo comprimento inteiro da proteína, em particular a identidade calculada pela comparação com a ajuda do software Lasergene pela DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) aplicando o método CLUSTAL (Higgins et ai, (1989), Comput. Appl. Biosci, 5(2), 151).

As homologias também podem ser calculadas com a ajuda do software Lasergene pela DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) aplicando o método CLUSTAL (Higgins et ai, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151).

A identidade de seqüências de DNA deve ser entendida correspondentemente.

Os métodos mencionados acima podem ser usados para aumentar a expressão de seqüências de DNA que codificam as enzimas funcionais ou não funcionais, regulada por retroalimentação ou independente da retroalimentação da Tabela 1 ou partes funcionalmente equivalentes destas. 10

15

O uso de tais vetores que compreendem seqüências reguladoras, como

seqüências promotoras e de terminação são, é conhecido pela pessoa

habilitada na técnica. Além disso, a pessoa habilitada na técnica sabe como

um vetor da etapa a) podem ser transferidos aos organismos tais como C

glutamicum ou E coli e cujas propriedades um vetor deve ser capaz de ter para ser integrado nos seus genomas.

Se o teor de enzima em um organismo tal como C. glutamicum e aumentado pela transferência de um ácido nucleico que codifica uma enzima de um outro organismo, como por exemplo, £ coli, é conveniente transferir a seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de ácido nucleico por exemplo, de E coli pela retro-tradução da seqüência de pohpeptídeo de acordo com o código genético em uma seqüência de ácido nucleico que compreende principalmente aqueles códons, que são usados

maiS freqÜentemente devid0 a° uso específico de organismo do códon. O uso de códon pode ser determinado por meio de avaliações de computador de outros genes conhecidos dos organismos relevantes.

De acordo com a presente invenção, um aumento da expressão

de gene e da atividade, respectivamente, de um ácido nucleico que codifica

uma enzima da Tabela 1 também é entendido ser a manipulação da expressão

das respectivas enzimas endógenas de um organismo, em particular de C

glutamicum ou E coli. Isto pode ser obtido, por exemplo, pela alteração da

seqüência de DNA promotora para os genes que codificam estas enzimas.

Uma tal alteração, que causa uma taxa de expressão alterada, preferivelmente

aumentada, destas enzimas pode ser obtida pela deleção ou inserção de seqüências de DNA.

Uma alteração da seqüência promotora de genes endógenos usualmente causa uma alteração da quantidade expressada do gene e portanto também uma alteração da atividade detectável na célula ou no organismo.

Além disso, uma expressão alterado e aumentada,

20 respectivamente, de um gene endógeno pode ser obtida por uma proteína reguladora, que não ocorre no organismo transformado e que interage com o promotor destes genes. Um tal regulador pode ser uma proteína quimérica que consiste de um domínio de ligação de DNA e um domínio ativador de transcrição, como por exemplo, descrito na WO 96/06166.

Uma outra possibilidade para aumentar a atividade e o teor de genes endógenos é super-regular fatores de transcrição envolvidos na transcrição dos genes endógenos, por exemplo, por meio da super-expressão. As medidas para a super- expressão de fatores de transcrição são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e também são divulgados para as enzimas da Tabela 1 dentro do escopo da presente invenção.

Além disso, uma alteração da atividade de genes endógenos pode ser obtida pela mutagênese alvejada das cópias de gene endógeno.

Uma alteração dos genes endógenos que codificam as enzimas da Tabela 1 também pode ser obtida pela influência das modificações pós traducionais das enzimas. Isto pode acontecer por exemplo, pela regulagem da atividade de enzimas como cinases ou fosfatases envolvidas na modificação pós traducional das enzimas por meio de medidas correspondentes como a super-expressão ou silenciamento de gene.

Em uma outra forma de realização, uma enzima pode ser melhorada em eficiência ou a sua região de controle de alostérico destruído tal que a inibição da retroalimentação da produção do composto é prevenida. Similarmente, uma enzima degradativa pode ser deletada ou modificada pela substituição, deleção ou adição tal que a sua atividade degradativa é diminuída para a enzima desejada da Tabela 1 sem comunicar a viabilidade da célula. Em cada caso, o rendimento ou taxa globais de produção de um destes produtos químicos finos desejados podem ser aumentados.

Também é possível que tais alterações nas moléculas de proteína e nucleotídeo da Tabela 1 possam melhorar a produção de outros produtos químicos finos tais como outros compostos contendo enxofre como cisteína ou glutationa, outros aminoácidos, vitaminas, co-fatores, nutracêuticos, nucleotídeos, nucleosídeos e trealose. O metabolismo de qualquer composto é necessariamente misturado com outras vias biossintéticos e degradativos dentro da célula e co-fatores, intermediários ou substratos necessários em uma via são provavelmente fornecidos ou limitados por um outro de tais vias. Portanto, pela modulação da atividade de uma ou mais das proteínas da Tabela 1, a produção ou eficiência de atividade de um outra via biossintética ou degradativo químico fino além daqueles que levam à metionina podem ser impactadas.

A expressão e função de enzima também pode ser regulada com base nos níveis celulares de um composto de um processo metabólico diferente e os níveis celulares de moléculas necessárias para o crescimento básico, tais como aminoácidos e nucleotídeos, podem afetar criticamente a viabilidade do microorganismo em cultura de larga escala. Assim, a modulação de uma enzima da biossíntese de aminoácido da Tabela 1 tal que ela não seja mais responsiva à inibição da retroalimentação ou tal que ela seja melhorada em eficiência ou quantidade de material metabolizado deve resultar em fluxo metabólico mais alto através das vias de produção de metionina. O método teórico da invenção ajudará a incorporar os efeitos destes nutrientes, metabólitos etc. nos organismos modelo e assim fornecerão orientação valiosa para as vias metabólicas que devem ser geneticamente modificados para aumentar a eficiência da síntese de metionina.

Estas estratégias anteriormente mencionadas para aumentar ou introduzir a quantidade e/ou atividade das enzimas da Tabela 1 não são intencionados a serem limitantes; variações nestas estratégias estarão facilmente evidentes a uma pessoa de habilidade comum na técnica. Reduzir a quantidade e/ou atividade de enzimas

Para reduzir a quantidade e/ou atividade de qualquer uma das enzimas da Tabela 1, várias estratégias também são disponíveis.

A expressão das enzimas endógenas da Tabela 1 por exemplo, pode ser regulada por intermédio da expressão de aptâmeros que se ligam especificamente às seqüências promotoras dos genes. Dependendo da ligação de aptâmeros que se ligam às regiões promotoras estimuladoras ou repressoras, a quantidade e assim, neste caso, a atividade das enzimas da Tabela 1 é aumentada ou reduzida.

Os aptâmeros também podem ser planejados em uma maneira como para ligar especificamente às próprias enzimas e para reduzir a atividade das enzimas por exemplo, pela ligação ao centro catalítico das respectivas enzimas. A expressão de aptâmeros é usualmente obtida pela super-expressão com base em vetor (ver acima) e é, assim como o planejamento e a seleção de aptâmeros, bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (Famulok et ai, (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36).

Além disso, uma diminuição da quantidade e da atividade das enzimas endógenas da Tabela 1 podem ser obtidas por meio de várias medidas experimentais, que são bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica. Estas medidas estão usualmente resumidas sob o termo "silenciamento de gene". Por exemplo, a expressão de um gene endógeno pode ser silenciado pela transferência de um vetor mencionado acima, que tem uma seqüência de DNA que codifica a enzima ou partes destas na ordem de anti-sentido, para os organismos tais como C glutamicum e E. colu Isto está fundamentado no fato de que a transcrição de um tal vetor na célula leva a um RNA, que pode hibridizar com os transcritos de mRNA pelo gene endógeno e portanto impede a sua tradução.

As seqüências reguladoras operativamente ligadas a um ácido nucleico clonado na orientação de anti-sentido podem ser escolhidas de modo que direcionem a expressão contínua da molécula de RNA de anti-sentido em uma variedade de tipos de célula, por exemplo, promotores e/ou realçadores virais ou seqüências reguladoras podem ser escolhidas que direcionam a expressão de RNA de anti-sentido constitutiva, específica de tecido ou específica do tipo de célula. O vetor de expressão de anti-sentido podem estar na forma de um plasmídeo recombinante, fagomídeo ou vírus atenuado em que os ácidos nucleicos de anti-sentido são produzidos sob o controle de uma região reguladora de alta eficiência, a atividade da qual pode ser determinada pelo tipo de célula na qual o vetor é introduzido. Para um debate da regulagem da expressão de gene usando genes de anti-sentido ver Weintraub, H. et ai, o RNA de anti-sentido como uma ferramenta molecular para a análise genética, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986.

Em princípio, a estratégia de anti-sentido pode ser ligada com um método de ribozima. As ribozimas são seqüências de RNA cataliticamente ativas, que, se ligadas às seqüências de anti-sentido, clivam as seqüências alvo cataliticamente (Tanner et aL, (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Isto pode realçar a eficiência de uma estratégia de anti-sentido.

Em plantas, o silenciamento de gene pode ser obtido pela interferência do RNA ou um processo que é conhecido como co-supressão.

Outros métodos são a introdução de mutações de não sentido no gene endógeno por meio da introdução de oligonucleotídeos de RNA/DNA no organismo (Zhu et ai, (2000) Nat. BiotechnoL 18 (5), 555-558) ou geração de mutantes silenciados com a ajuda da recombinação homóloga (Hohn et ai., (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 8321-8323.).

Para criar um microorganismo recombinante homólogo, um vetor é preparado que contém pelo menos uma porção de gene que codifica uma enzima da Tabela 1 na qual uma deleção, adição ou substituição foi introduzida para alterar deste modo, por exemplo, romper funcionalmente, o gene endógeno.

Preferivelmente, este gene endógeno é um gene e C. glutamicum ou Ε. coli, mas pode ser um homólogo de uma bactéria

relacionada ou ainda de uma levedura ou fonte vegetal. Em uma forma de

realização, o vetor é planejado tal que, na recombinação homóloga, o gene

endógeno é funcionalmente rompido (isto é, não mais codifica uma proteína

funcional; também aludido como um vetor "silenciado"). Alternativamente, o

vetor podem ser planejado tal que, na recombinação homóloga, o gene

endógeno é mutado ou de outro modo alterado mas ainda codifica proteína

funcional (por exemplo, a região reguladora a montante pode ser alterada para

alterar deste modo a expressão da enzima endógena da Tabela 1). No vetor de

recombinação homóloga, a porção alterada do gene endógeno é flanqueada

nas suas extremidades 5' e 3' pelo ácido nucleico adicional do gene endógeno

para permitir que a recombinação homóloga ocorra entre o gene exógeno

carregado pelo vetor e um gene endógeno no (micro)organismo. O ácido

nucleico endógeno flanqueador adicional é de comprimento suficiente para a

recombinação homóloga bem sucedida com o gene endógeno. Tipicamente,

diversas quilobases de DNA flanqueador (tanto na extremidade 5' quanto 3')

são incluídos no vetor (ver por exemplo, Thomas, K. R. e Capecchi, M. R.

(1987) Cell 51: 503 para uma descrição de vetores de recombinação homóloga).

O vetor é introduzido em um microorganismo (por exemplo, pela eletroporação) e as células em que o gene endógeno introduzido recombinou homologamente com as enzimas endógenas da Tabela 1 são selecionadas, usando técnicas conhecidas no ramo.

Em uma outra forma de realização, um gene endógeno para as enzimas da Tabela 1 em uma célula hospedeira é rompido (por exemplo, pela recombinação homóloga ou outros meios genéticos conhecidos na técnica) tal que a expressão de seu produto de proteína não ocorra. Em uma outra forma de realização, um gene endógeno ou introduzido de enzimas da Tabela 1 em uma célula hospedeira foi alterada por uma ou mais mutações pontuais, deleções ou inversões, mas ainda codificam uma enzima funcional. Ainda em uma outra forma de realização, uma ou mais das regiões reguladoras (por exemplo, um promotor, repressor ou indutor) de um gene endógeno para as enzimas da Tabela 1 em um (micro)organismo foram alteradas (por exemplo, pela deleção, truncagem, inversão ou mutação pontual) tal que a expressão do gene endógeno é modulado, uma pessoa de habilidade comum na técnica avaliará que as células hospedeiras contendo mais do que um dos genes que codificam a enzima da Tabela 1 e as modificações de proteína podem ser facilmente produzidas usando os métodos da invenção e são intencionadas a serem incluídas na presente invenção.

Além disso, uma repressão de gene (mas também a super-

expressão de gene) também é possível por meio de fatores de ligação de DNA

específicos, por exemplo, fatores do tipo fator de transcrição de dedo de

zinco. Além disso, fatores que inibem a própria proteína alvo podem ser

introduzidos em uma célula. Os fatores que ligam proteína por exemplo,

podem ser os aptâmeros mencionados acima (Famulok et ai, (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243,123-36).

Como outros fatores de ligação de proteína, cuja expressão em

organismos causa uma redução da quantidade e/ou da atividade das enzimas

da Tabela 1, os anticorpos específicos de enzima podem ser considerados. A

produção de anticorpos específicos de enzima monoclonais, policlonais ou

recombinantes segue protocolos padrão (Guide to Protein Purification, Meth.

EnzymoL 182, pp. 663-679 (1990), Μ. P. Deutscher, ed.). A expressão de

anticorpos também é conhecida da literatura (Fiedler et ai, (1997)

Immunotechnology 3, 205-216; Maynard e Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).

As técnicas mencionadas são bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica. Portanto, o mesmo também conhece quais tamanhos que as construções de ácido nucleico usadas por exemplo, para os métodos de anti-sentido devem ter e qual complementaridade, homologia ou identidade, as respectivas seqüências de ácido nucleico devem ter. Os termos complementaridade, homologia e identidade são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.

Dentro do escopo da presente invenção, a homologia de seqüência e homologia, respectivamente, são no geral entendidas significar que a seqüência de ácido nucleico ou a seqüência de aminoácido, respectivamente, de uma molécula de DNA ou uma proteína, respectivamente, é pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferido pelo menos 60%, também preferivelmente pelo menos 70%, também preferivelmente pelo menos 80%, particularmente preferido pelo menos 90%, em particular preferido pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelo menos 98% idêntico com as seqüências de ácido nucleico ou seqüências de aminoácido, respectivamente, de uma molécula DNA ou RNA ou proteína conhecidas, respectivamente. Aqui, o grau de homologia e identidade, respectivamente, referem-se ao comprimento inteiro da seqüência codificadora.

O termo complementaridade descreve a capacidade de uma molécula de ácido nucleico de hibridizar com uma outra molécula de ácido nucleico devido às ligações de hidrogênio entre duas bases complementares. A pessoa habilitada na técnica sabe que duas moléculas de ácido nucleico não têm que ter uma complementaridade de 100% de modo a ser capaz de hibridizar entre si. Uma seqüência de ácido nucleico, que é para hibridizar com uma outra seqüência de ácido nucleico, é preferida ser pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, particularmente preferido pelo menos 80%, também particularmente preferido pelo menos 90%, em particular preferido pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelo menos 98 ou 100%, respectivamente, complementar com a dita outra seqüência de ácido nucleico. 10

As moléculas de ácido nucleico são idênticas, se elas têm nucleotídeos idêntico na ordem 5' a 3' idêntica.

A hibridização de uma seqüência de anti-sentido com uma seqüência de mRNA endógena tipicamente ocorre in vivo sob condições celulares ou in vitro. De acordo com a presente invenção, a hibridização é realizada in vivo ou in vitro sob condições que são estringentes o bastante para garantir uma hibridização específica.

As condições de hibridização in vitro são conhecidas pela pessoa habilitada na técnica e podem ser tiradas da literatura (ver por exemplo, Sambrook et ai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press). O termo "hibridização específica" refere-se ao caso em que uma molécula preferencialmente se liga a uma certa seqüência de ácido nucleico sob condições estringentes, se esta seqüência de ácido nucleico é parte de uma mistura complexa por exemplo, de moléculas de DNA ou RNA.

O termo "condições estringentes" portanto refere-se às condições, sob as quais uma seqüência de ácido nucleico preferencialmente se liga a uma seqüência alvo, mas não ou pelo menos a um grau significantemente reduzido, a outras seqüências.

As condições estringentes são dependentes das circunstâncias. As seqüências mais longas especificamente hibridizam em temperaturas mais altas. No geral, as condições estringentes são escolhidas em um tal modo que a temperatura de hibridização se situa a cerca de 5°C abaixo do ponto de fosão (Tm) da seqüência específica com uma concentração iônica definida e um valor de PH definido. A Tm é a temperatura (com um valor de pH definido, uma concentração iônica definida e uma concentração de ácido nucleico definida), na qual 50% das moléculas, que são complementares a uma seqüência alvo, hibridizam com a dita seqüência alvo. Tipicamente, as condições estringentes compreendem concentrações salinas entre 0,01 e 1,0 M de íons sódio (ou íons de um outro sal) e um valor de pH entre 7,0 e 8,3. A temperatura é de pelo menos 30°C para as moléculas curtas (por exemplo, para tais moléculas que compreendem entre 10 e 50 nucleotídeos). Além disso, as condições estringentes podem compreender a adição de agentes desestabilizantes como por exemplo, fomiamida. Os tampões de hibridização e lavagem típicos são da seguinte composição.

Solução de pré hibridização: 0,5% de SDS 5x SSC

50 mM de NaPO4, pH 6,8

0,1% de Na-pirofosfato

5x reagente de Denhardt

100 μg/esperma de salmão

Solução de hibridização.-solução de pré hibridização

Ix IO6 cpm/ml de sonda (5 a 10 min 95°C)

20x SSCrNaCl 3 M

citrato de sódio 0,3 M

ad pH 7 com HCl

50x reagente de Denhardt:5 g de Ficoll g de polivinilpirrolidona g de Albumina Sérica Bovina ad 500 ml A. dest.

Um procedimento típico para a hibridização é como segue: Opcionalmente: lavagem Blot 30 min em Ix SSC/ 0,1% de

SDS a 65°C

Pré hibridização:pelo menos 2 h de 50 a 55°C Hibridização:durante a noite de 55 a 60°C lavagem:05 min2x SSC/ 0,1% de SDS temperatura de Hibridização min2x SSC/ 0,1% de SDS 10

15

20

25

temperatura de hibridização minlx SSC/ 0,1% de SDS temperatura de hibridização 45 min 0.2x SSC/ 0,1% de SDS 65°C min0,lx SSC temperatura ambiente Os termos "sentido» e "anti-sentido" assim como "orientação de anti-sentido" são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Além disso a pessoa habilitada na técnica sabe, quão longa as moléculas de ácido' nucleico, que devem ser usadas para os métodos de anti-sentido, devem ser e

que a homologia ou complementaridade elas devem ter com respeito às suas seqüências alvo.

Conseqüentemente, a pessoa habilitada na técnica também sabe, quão longa as moléculas de ácido nucleico, que são usadas para os métodos de silenciamento de gene, devem ser. Para os propósitos de complementaridade de anti-sentido em relação aos comprimentos de seqüência de 100 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 40 nucleotídeos e 20 nucleotídeos podem ser suficientes. Os comprimentos de nucleotídeo mais longos certamente também serão suficientes. Uma aplicação combinada dos métodos mencionados acima também é concebível.

Se, de acordo com a presente invenção, as seqüências de DNA

são usadas, que são operativamente ligadas na orientação de 5' a 3' a um

promotor ativo no organismo, vetores, no geral, podem ser construídos, que

depois da transferência às células do organismo, pennitem a super-expressão

da seqüência codificadcra ou causam a supressão ou competição e bloqueio

de seqüências de ácido nucleico endógenos e as proteínas expressadas, respectivamente.

A atividade de uma enzima particular também pode ser reduzida pela super-expressão de um mutante não funcional deste no organismo. Assim, um mutante não funcional que não é capaz de catalisar a reação em questão, mas que é capaz de ligar por exemplo, o substrato ou co- fator, pode, por via da super-expressão compete com a enzima endógena e portanto inibe a reação. Outros métodos de modo a reduzir a quantidade e/ou atividade de uma enzima em uma célula hospedeira são bem conhecidos para a pessoa habilitada na técnica.

Vetores e Células Hospedeiras

Um outro aspecto da invenção diz respeito a vetores, preferivelmente vetores de expressão, contendo um ácido nucleico que codifica as enzimas da Tabela 1 (ou porções destes) ou combinações destes. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual o mesmo foi ligado.

Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA circular de filamento duplo no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicional podem ser ligados no genoma viral.

Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual elas são introduzidas (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma vetores bacterianos de replicação e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores não mamíferos epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e deste modo são replicadas junto com o genoma hospedeiro. Entretanto, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operativamente ligados.

Tais vetores são aqui aludidos como "vetores de expressão".

No geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma mais habitualmente usada de vetor. Entretanto, a invenção é intencionada a incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituoso em replicação, adenovírus e vírus associados a adeno), que servem para funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica as enzimas da Tabela 1 em uma forma adequada para a expressão do respectivo ácido nucleico em uma célula hospedeira, que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, que é operativamente ligado com a seqüência de ácido nucleico a ser expressada.

Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado" é intencionado a significar que a seqüência de nucleotídeo de interesse é ligado à(s) seqüência(s) reguladora(s) em uma maneira que permite a expressão da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüência reguladora" é intencionado a incluir promotores, sítios de ligação repressores, sítios de ligação ativadores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, terminadores, sinais de poliadenilação ou outros elementos de estrutura secundária de mRNA). Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). As seqüências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma seqüência de1 nucleotídeo em muitos tipos de célula hospedeira e aquelas que direcionam a expressão da seqüência de nucleotídeo apenas em certas células hospedeiras. As seqüências reguladoras preferidas são, por exemplo, promotores tais como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02 e -Pp- ore PL, que são usados preferivelmente em bactérias. As seqüências reguladoras adicionais são, por exemplo, promotores de leveduras e fungos, tais como ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promotores de plantas tais como os promotores CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos ou ubiquitina ou faseolina. Também é possível usar promotores artificiais. Será avaliado por uma pessoa de habilidade comum na técnica que o planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível da proteína de expressão desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir deste modo proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados pelos ácidos nucleicos que codificam as enzimas da Tabela 1.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser planejados para a expressão das enzimas na Tabela 1 em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os genes para as enzimas da Tabela 1 podem ser expressados em células bacterianas tais como C. glutamicum e E. coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), levedura e outras células fungicas (ver Romanos, M. A. et ai (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C. A. M. J. J. et ai (1991) em: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) em: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et ai, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas e células vegetais multicelulares (ver Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.: 583-586). As células hospedeiras adequadas são debatidas ainda em Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando as seqüências reguladoras de promotor T7 e T7 polimerase.

A expressão de proteínas em procariotas é mais freqüentemente realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou indutíveis que direcionam a expressão das proteínas de fusão ou que não de fusão.

Os vetores de fusão adicionam vários aminoácidos a uma proteína codificada dessa maneira, usualmente ao terminal amino da proteína recombinante mas também ao término C ou fundido dentro de regiões adequadas nas proteínas. Tais vetores de fusão tipicamente servem para três propósitos: 1) para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante pela ação como um ligando na purificação por afinidade. Freqüentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e a proteína recombinante para possibilitar a separação da proteína recombinante da porção de fusão subseqüente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas e suas seqüências de reconhecimento cognatas, incluem o Fator Xa, trombina e enterocinase.

Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31- 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fundem glutationa S-transferase (GST), maltose e proteína de ligação ou proteína A, respectivamente.

Os exemplos de E. coli que não de fusão adequadas indutíveis incluem pTrc (Amann et ai, (1988) Gene 69: 301-315), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-IIIl 13-B1, egtll, pBdCl e pET Ild (Studier et ai, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89; e Pouwels et ai, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nova Iorque IBSN O 444 904018). A expressão de gene alvo do vetor thepTrc contam com a transcrição da RNA polimerase do hospedeiro a partir de um promotor de fusão trp-lac híbrido. A expressão de gene alvo a partir de vetor pET Ild conta com a transcrição de um promotor de fusão T7 gnlO-lac mediado por uma RNA polimerase viral coexpressada (T7gnl). Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) a partir de um prófago X residente que abriga um gene T7gnl sob o controle transcricional do promotor IacUV 5. Para a transformação de outras variedades de bactérias, vetores apropriados podem ser selecionados. Por exemplo, os plasmídeos apropriados pIJlOl, pIJ364, pü702 e pIJ361 são conhecidos serem úteis em Streptomyces transformantes, enquanto que os plasmídeos pUBl 10, pC194 ou pBD214 são adequados para a transformação de espécies de Bacillus. Diversos plasmídeos de uso na transferência de informação genética em Corynebacterium incluem PHM1519, pBLl, pSA77 ou pAJ667 (Pouwels et al, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nova Iorque IBSN O 444 904018).

Uma estratégia para maximizar a expressão de proteína recombinante é expressar a proteína em uma bactéria hospedeira com uma capacidade prejudicada para clivar proteoliticamente a proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128). Uma outra estratégia é alterar a seqüência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácido sejam aqueles preferencialmente utilizados na bactéria escolhida para a expressão, tais como C. glutamieum (Wada et al. (1992) Nucleic Acid Res. 20: 2111-2118). Tais alterações de seqüência de ácido nucleico da invenção podem ser realizadas pelas técnicas de síntese de DNA padrão.

Os exemplos de vetores transportadores de C. glutamieum e E.

coli adequados podem ser encontrados em Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8).

Em uma outra forma de realização, o vetor de expressão de proteína é um o vetor de expressão de levedura. Os exemplos de vetores para a expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), 2i, pAG-1, Yepó, Yepl3, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan e Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Os vetores e métodos para a construção de vetores apropriados para o uso em outros fungos, tais como os fungos fílamentosos, incluem aqueles detalhados em: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) em: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge e Pouwels et ai, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nova Iorque (IBSN O 444 904018).

Para os propósitos da presente invenção, uma ligação operativa é entendido ser o arranjo seqüencial de promotor, seqüência codificadora, terminador e, opcionalmente, outros elementos reguladores em um tal modo que cada um dos elementos reguladores possam satisfazer a sua função, de acordo com a sua determinação, quando da expressão da seqüência codificadora.

Em uma outra forma de realização, as proteínas da Tabela 1 podem ser expressadas em células vegetais unicelulares (tais como algas) ou em células vegetais de plantas superiores (por exemplo, os espermatófitos, tais como plantas de safra). Os exemplos de vetores de expressão vegetais incluem aqueles detalhados em: Becker, D., Kemper, E., Schell5 J. e Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; e Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721 e incluem pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 e pDH51 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nova Iorque IBSN 0 444 904018).

Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto eucarióticas ver os capítulos 16 e 17 de Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003.

Para os propósitos da presente invenção, uma ligação operativa é entendido ser o arranjo seqüencial de promotor, seqüência codificadora, terminador e, opcionalmente, outros elementos reguladores em um tal modo que cada um dos elementos reguladores possam satisfazer a sua função, de acordo com a sua determinação, quando da expressão da seqüência codificadora.

Em uma outra forma de realização, o vetor de expressão mamífero recombinante é capaz de direcionar a expressão do ácido nucleico preferencialmente em um tipo de célula particular, por exemplo, em células vegetais (por exemplo, elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Os elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica.

Um outro aspecto da invenção diz respeito aos organismos ou células hospedeiras em que um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados aqui intercambiavelmente. É entendido que tais termos referem-se não apenas à célula objeto particular mas também à progênie ou progênie potencial de uma tal célula. Porque certas modificações possam ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célula precursora, mas são ainda incluídas dentro do escopo do termo como aqui usado.

Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, uma enzima da Tabela 1 pode ser expressada em células bacterianas tais como C. glutamicum ou E. coli, células de inseto, levedura ou plantas. Aqueles de habilidade comum na técnica conhece outras células hospedeiras adequadas.

O DNA vetorial pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por intermédio de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Como aqui usado, os termos "transformação" e "transfecção", "conjugação" e "transdução" são intencionados a se referir a uma variedade de técnicas reconhecidas no ramo para introduzir ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA ou RNA lineares (por exemplo, um vetor linearizado ou um construção de gene sozinha sem um vetor) ou ácido nucleico na forma de um vetor (por exemplo, um plasmídeo, fago, fasmídeo, fagomídeo, transposon ou outro DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, competência natural, transferência mediada por produto químico ou eletroporação. Os métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et ai. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003) e outros manuais de laboratório.

De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência aos antibióticos) é no geral introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência aos medicamentos, tais como G418, higromicina e metotrexato. O ácido nucleico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no mesmo vetor como aquele que codifica as enzimas da Tabela 1 ou podem ser introduzidos em um vetor separado. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas pela seleção de medicamento (por exemplo, as células que têm incorporado o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto que as outras células morrerão).

Em uma outra forma de realização, os microorganismos recombinantes podem ser produzidos de modo que contenham sistemas selecionados que possibilitem a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, a inclusão de um gene da Tabela 1 em um vetor que o coloca sob o controle do operon Iac permite a expressão do gene apenas na presença de IPTG. Tais sistemas reguladores são bem conhecidos na técnica.

Em uma forma de realização, o método compreende cultivar os organismos da invenção (nos quais um vetor de expressão recombinante que codifica por exemplo, uma enzima da Tabela 1 foi introduzido ou em que no genoma foi introduzido um gene que codifica uma enzima do tipo selvagem ou alterada) em um meio adequado para a produção de metionina. Em uma outra forma de realização, o método compreende ainda isolar a metionina do meio ou a célula hospedeira.

Foi apresentado acima que de modo a modular o fluxo metabólico de um organismo, a quantidade e/ou atividade de enzimas da Tabela 1 que catalisam uma reação da rede metabólica pode ser aumentada ou reduzida. Entretanto, de modo a modificar o fluxo metabólico de um organismo para produzir um organismo que seja mais eficiente na síntese de metionina, a mudança da quantidade e/ou atividade de uma enzima não é limitada às enzimas listadas na Tabela 1. Qualquer enzima que seja é homóloga às enzimas da Tabela 1 e carregue a mesma função em um outro organismo pode ser perfeitamente adaptada para modular a quantidade e/ou atividade de modo a influenciar o fluxo metabólico por via da super- expressão. As definições para homologia e identidade foram dadas acima.

Na tabela seguinte, os exemplos são dados de homólogos a algumas das enzimas de Rl a R61 da Tabela 1 que podem ser usadas para os propósitos da presente invenção por exemplo, super-expressando-as em C. glutamicum ou E. coli de modo a aumentar a quantidade e/ou atividade das respectivas enzimas: Tabela 2

Nome do Função Número(s) de produto de gene acesso (número EC)

Seqüências de números de acesso de proteínas relacionadas/alternativas. com atividade conservada sistema clivagem glicina (R71/R72)

de de

recuperação da glicina. proteína T amino-metil- transferase

CAA52144.1

YP_079782.1 ;NP_980596.1 ;YP_021091.1 ;AA111 39.1 ; YPJ 48276.1 ;YP_175989.1 ;BAB06533.1 ;NP _464875.1 ;NP_470723.1; YP_013965.1 ;ZP_002313 85.1 ;ZP_00538577.1 ;NP_692823.1 ;NP_764775.1; YP_188676.1 ;NP_372059.1 ;CAG43268.1 ;YP_253 296.1 ;YP_18643 3.1YP_041008.1 ;NP_621985.1 ;Z P_00560257.1 ;AAU84894.1 ;ZP_00574838.1 ;YP_0 75748.1 ;NP_143816.1 ;CAB50682.1 ;NP_662997.1; NP_972230.1 ;AAL82124.1 ;ZP_00590815.1 ;ZP_00 528533.1 ;BAD85568.1 ;NP_228029.1 ;ZP_0051110 4.1 ;ZP_00591209.1 ;ZP_00532593.1 ;ZP_00525162 . 1 ;ZP_00355911.1 ;YP_112880.1 ;ZP_00399764.1; YP_143792.1 ;CAD75448.1 ;YP_004126.1 ;ZP_005 35960.1 ;ZP_00334892.1 ;CAG35027.1 ;CAF23008. 1 ;YP_010643.1 ;NP_951437.1 ;NP_840694.1 ;EAN2 8088.1 ;YP_125490.1 ;YP_094168.1 ;AA091208.1; YP_122478.1;NP_110817.1;NP_214308.1;CAC12 478.1 ;ZP_00602311.1 ;YP_256007.1 ;EAM94548.1; BAB66249.1 ;NP_342409.1 ;YP_023949.1 ;ZP_000 54699.1 ;AAK25314.1 ;ZP_00270640.1 ;YP_169455 . 1 ;NP_148400.1 ;ZP_00577149.1 ;ZP_00375766.1; ZP_00303628.1 ;NP_2803 87.1 ;AAV46419.1 ;EAOO 4791.1 ;CAC32302.1 ;CAI36361.1 ;AAZ12256.1 ;NP _013914.1 ;YP_034020.1 ;BAC74698.1 ;Q827D7;ZP _00396527.1 ;EAK92665.1 ;EAK92694.1 ;ZP_0029 2858.1 ;ZP_00625542.1 ;NP_298674.1 ;EAO 14274. 1 ;NP_883104.1 ;NP_887405.1 ;ZP_00038971.2;NP J778843.1 ;ZP_00327636.1 ;EAA72140.1 ;NP_8790 86.1 ;NP_102591.1 ;CAJ04455.1 ;CAG61762.1 ;NP_ 716412.1 ;CAG88846.1 ;ZP_00582521.1 ;CAD1708 3.1 ;AAM36086.1 ;YP_191522.1 ;EAM75690.1 ;CA H00726.1 ;CAF26479.1 ;AAF 113 60.1; YP_202186.1 ;ZP_00308932.1 ;EAA47849.1 ;ZP_00278041.1 ;CA A81076.1 ;CAA91000.1 ;CAA85353.1 ;EAM85167. 1 ;YP_071681.1 ;ZP_0063 8529.1 ;CAB 16911.1 ;EA N06353.1;BAD35509.1;EAL84525.1;YP_118701. 1;AAQ24377.1;YP_223286.1;NP_541539.1;ZP_00 634544.1 ;CAB 16916.1 ;BAD82264.1 ;AAN47559.1 ;NP_7723 93.1; YP_000299.1 ;CAB 16918.1 ;CAD52 982.1 ;XP_314216.2;NP_930808.1 ;AAD56281.1 ;A AQ66378.1 ;AA076254.1 ;AAN33907.1 ;CAG7365 9.1 ;XP_219785.3 ;ZP_00111607.1 ;ZP_00585062.1; AAL21928.1; AAH42245.1; AAX66900.1 ;AAS467 34.1 ;NP_949187.1 ;NP_989653.1 ;AAC31228.1 ;;A AA63 798.1 ;ZP_00004510.1 ;CAA42443.1 ;ZP_005 55139.1;YP_132995.1;NP_251135.1;NP_636487.1 ;ZP_00213263.1;ZP_00140178.2 ;ZP_00516950.1; AAB82711.1 ;AAZ27773.1 ;EAA61388.1 ;ZP_0016 7208.2;EAN04068.1 ;AA007159.1 ;NP_936747.1 ;Z P_00499479.1 ;NP_806663.1 ;AAW42121.1 ;CAG8 3849.1;NP_923192.1;NP_441838.1;ZP_00593912. 1 ;CAA52146.1 ;BAA14286.1 ;Q8XD33;AAA69071 . 1 ;EAM28058.1 ;ZP_00494650.1 ;ZP_00489316.1 ;Z P_00470629.1 ;YP_152074.1 ;AAM14125.1 ;AAM9 1322.1 ;ZP_00569907.1 ;ZP_00459442.1 ;NP_75535 8.1 ;ZP_00436271.1 ;NP_613061.1 ;CAE59244.1 ;B AC38022.1 ;CAA91099.1 ;ZPJ)0264533.1 ;AAC46 780.1 ;AAG58030.1 ;YP_261725.1 ;AAL24244.1 ;N P_708666.1 ;CAH07776.1 ;Q8YNF9;YP_099306.1; ZP_00474391.1 ;AAL57651.1 ;YP_055456.1 ;NP_6 82393.1;NP_893785.1;YP_172756.1;CAH74116.1; ZP 00622638.1 ;YP_234188.1 ;NP 791106.1;NP 9 67658.1 ;ΕΑΝ85656.1 ;ΖΡ_00379711.1 ;ΧΡ_520482 . 1 ;ΑΑΝ66613.1 ;ΖΡ_00162707.1 ;ΖΡ_00417692.1; ΥΡ_264083.1 ;AAQ61092.1 ;ΝΡ__216348.1 ;ΝΡ_855 515.1 ;CAE76410.1 ;ΑΑ039460.1 ;CAE22343.1 ;ΝΡ _800311.1 ;ΥΡ_206661.1 ;ΖΡ_00506636.1 ;ΖΡ_0041 7032.1 ;ΥΡ_164890.1 ;ΧΡ_760322.1; ΥΡ_266091.1; ΥΡ_156473.1 ;CAC46126.1 ;ΖΡ_00244924.1 ;ΕΑΝ9 1112.1 ;ΧΡ_637330.1 ;ΝΡ_960479.1 ;ΥΡJ60522.1 · ΖΡ_00317484.1 ;ΖΡ_00412767.1 ;ΝΡ_253900.1 ;ΑΑ Q00873.1 ;ΝΡ_532152.1 ;ΖΡ_00151464.1 ;ΕΑ00997 0.1 ;ΖΡ_00631036.1 ;ΖΡ_00141690.2;ΝΡ_3 02381.1' CAG08109.1 ;CAE08889.1 ;ΥΡ_263017.1 ;ΑΑΝ707 57.1 ;ΖΡ_00264788.1 ;ΧΡ_538655.1 ;ΑΑΖ27305.1; AAN17423.1 ;ΑΑ03 8610.1 ;CAB85154.1 ;AAW89 976.1 ;ΑΑ044232.1 ;ΝΡ_789087.1 ;ΖΡ_00496567.1; ΑΑΗ57478.1 ;AAS 16361.1 ;AAL33595.1 ;ΖΡ_0004 8418.1 ;CAA72255.1 ;ΧΡ_598207.1 ;Β AD82265.1; ΑΑΚ26613.1 ;ΑΑΜ93931.1 ;ΧΡ_517277.1 ;CAB50 683.1 ;ΝΡ_143 817.1; AAL82123.1 ;BAD82266.1 ;Ε ΑΝ80863.1 ;BAD85569.1 ;ΖΡ_00574837.1 ;ΒΑΒ26 854.1 ;ΖΡ_00560256.1 ;AAU84893.1 ;AAD33990.1; ΥΡ_175990.1 ;ΖΡ__00641578.1 ;ΝΡ_390336.1 ;ΥΡ_0 23948.1 ;ΑΑΚ25315.1 ;CAA38252.1 ;ΕΑΜ94547 1 · ΖΡ_00530977.1; ΥΡ_013964.1 ;ΝΡ_470722.1 ;ΝΡ_4 64874.1 ;ΖΡ_00525161.1 ;ΝΡ_148401.1 ;ΖΡ_005899 15.1 ;ΥΡ_079783.1 ;ΖΡ__00233535.1 ;ΖΡ_00577150 1 ;ΝΡ_228028.1 ;ΖΡ_00238490.1 ;ΝΡ_980597.1 ;ΥΡ _021092.1 ;ΑΑΡ11140.1 ;ΥΡ_038289.1 ;ΒΑΒ06534 1 ;ΖΡ_00399763.1; ΥΡ_148277.1 ;ΧΡ_606427.1 ;ΑΑ L04442.1 ;ΥΡ_075749.1 ;ΖΡ_00527784.1 ;ΝΡ_6928 24.1 ;ΖΡ_00334895.1 ;CAD75449.1 ;ΝΡ_840693.1 ;Ζ Ρ_00591425.1 ;CAF23007.1 ;ΖΡ_00054162.1 ;ΝΡ_6 21986.1 ;CAC 12479.1 ;ΝΡ_662508.1 ;ΖΡ_00512041 . 1 ;AAV46420.1 ;ΖΡ_00375765.1 ;ΝΡ_110816.1 ;ΝΡ _2803 88.1 ;ΒΑΒ66248.1 ;ΖΡ__00538578.1 ;ΝΡ_9514 36.1 ;ΖΡ_00367500.1 ;ΥΡ_169454.1 ;ΑΑΧ77943.1; ΥΡ_094170.1 ;ΥΡ_122480.1 ;ΥΡ_125492.1 ;;ΖΡ_00 270641.1 ;ΥΡ_178313.1 ;ΧΡ__473181.1 ;ΖΡ_0053596 1.1 ;ΝΡ_3 72060.1 ;ΖΡ_00602310.1 ;ΥΡ_255986.1 ;C AE05443.2;CAB72709.1 ;CAG43269.1 ;ΝΡ_34241 0.1 ;ΒΑΒ95353.1 ;ΑΑΑ92036.1 ;ΥΡ_186434.1 ;ΥΡ_ 041009.1 ;ΑΑΜ63785.1 ;ΧΡ_584346.1 ;ΑΑΜ51302. 1 ;AAF99780.1 ;ΖΡ_00563258.1 ;ΕΑΝ09988.1 ;ΝΡ_ 148290.1 ;ΥΡ_253295.1 ;ΖΡ_00627278.1; ΥΡ_25600 8.1 ;ΑΑ091209.1 ;XPj555257.1 ;ΖΡ_00303629.1 ;C AC11669.1 ;ΝΡ_394004.1 ;ΕΑΜ93962.1 ;CAB5776 9.1 ;CAB50124.1 ;ΖΡ__00520055.1 ;ΖΡ_003 69709.1; EAN28089.1;CAC12627.1;AAB85605.1;Q9HI38; ΑΑΗ26135.1 ;ΕΑΜ24571.1 ;AAC03768.1 ;ΑΑΡ986 45.1 ;CAJ18422.1 ;ΝΡ_213757.1 ;CAA05909.1 ;ΝΡ_ 142859.1;BAD32415.1;BAC31437.1;ΝΡ_947805.1 ;ΥΡ_080623.1 ;CAH93356.1 ;ΖΡ_00600159.1 ;ΝΡ_7 75139.1 ;ΖΡ_00400734.1 ;CAA09590.2;XP_321361 .2;AAL81283.1 ;ΒΑΒ81491.1 ;ΖΡ_00506445.1 ;ΖΡ_ 00533640.1 ; YPJ 60688.1 ;ΝΡ_764776.1 ;ΝΡ_9672 01.1 ;ΑΑΗ52991.1 ;ΑΑ038289.1 ;ΝΡ_837365.1 ;ΧΡ _521504.1 ;ΝΡ__371248.1 ;ΝΡ_753970.1 ;CAG42465 . 1; AAC74750.1; AAU93 791.1 ;Q7ADI4; 1ΚΜΚ; 1JF 9;ΒΑΑ86566.1 ;ΥΡ_170184.1 ;ΥΡ_165179.1 ;ΝΡ 62 4289.1;AAX77932.1;CAD14721.1;BAD84717.1;Z P_00048472.2;AAF73526.1 ;ΧΡ_641773.1 ;ΖΡ_005 70672.1;ΖΡ 00400089.1;ΝΡ 391148.1;ΝΡ 001007 947.1 ;CAE08806.1 ;CAB50330.1 ;YP 192068.1 ;ZP 00152262.1;ZP 00502920.1;YP 096188.1;NP 79 6975.1;YP 254084.1;YP 124440.1;BAD86003.1; CAH04407.1 ;BAB07188.1 ;Q9K7A0;XP 313472.2 ;NP 103175.1; AAF63 783.1 ;AAN58019.1; YP 127 437.1 ;AAM62682.1 ;CAG90500.1 ;AAB85857.1 ;Z P 00387883.1;XP 562557.1;027433;ZP 0017092 0.2;CAA63066.1 ;EAN08419.1 ;CAB73027.1 ;ZP 0 0335679.1 ;AAB85866.1 ;ZP 00129032.1;YP 1788 55.1;YP 145876.1 ;AAV94639.1 ;NP 623991.1;YP 040300.1;YP 040204.1;YP 080545.1;YP 25395 2.1 ;ZP 00638523.1;NP 371368.1;YP 255707.1;A AU38404.1 ;NP 085678.1 ;AAK68403.2;BAB6641 6.1 ;XP 624944.1 ;ZP 00135005.2;ZP 00595047.1; NP 950100.1;ZP 00458730.1;AAQ75173.1;AAP9 9129.1;YP 004062.1;XP 601722.1;CAC45089.1; CAA07007.1 ;EAL01528.1 ;XP 694140.1;NP 7709 78.1; AAC4993 5.1 ;EAA21518.1 sistema de clivagem de glicina (R71/R72) recuperação de glicina: proteína H 08FE66. NP 391159: YP 152075.1;NP 806664.1;NP 755359.1;Q8FE66 ;AAX66901.1 ;ZP 00585063.1;NP 716411.1 ;ZP 0 0582520.1;NP 930809.1;YP 071682.1;ZP 006385 30.1;CAG73658.1;YP 156474.1;ZP 00634545.1; YP 131233.1;YP 268018.1;ZP 00417033.1;AAN 70758.1;ZP 00141691.2;NP 253901.1;AAZ18651 .1;EA018275.1;ZP 00264789.1;ZP 00474390.1;Z P 00499480.1;ZP 00459441.1;EAM28059.1;ZP 0 0318113.1;AAQ61093.1;NP 790167.1;AA091210 .1;CAH37374.1;YP 169453.1;AAW49868.1;NP 8 40692.1;AA007160.1 ;YP 263019.1 ;Q9K0L7;YP 160523.1;NP 800312.1;ZP 00334896.1;ZP 00278 042.1;YP 233358.1 ;AAW90049.1 ;ZP 00213264.1 ;AAF96187.1 ;CAB84042.1 ;AAM37905.1 ;ZP 006 58478.1;YP 112591.1;YP 132994.1;YP 200434.1 ;ZP 00593911.1;YP 206660.1;ZP 00167207.1;XP 464281.1;NP 638224.1;EAM75684.1;ZP 005748 36.1;ZP 00151463.1;YP 270507.1;CAD17082.1; BAD45416.1;YP 004124.1;YP 143790.1;YP 075 750.1 ;AAF11361.1 ;NP 465948.1 ;CAG35029.1 ;NP 960473.1;ZP 00568923.1;EAN06352.1;ZP 0050 6635.1;NP 532153.1;YP 223285.1;NP 541538.1; YP 014985.1 ;AA063775.1 ;CAA20174.1 ;ZP 0039 9762.1;YP 010645.1;NP 471849.1;AA077626.1; 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6362.1;ΑΑ079689.1;ΑΑΧ16385.1;ΝΡ_393488 1·

CAH07007.1 ;CAA20175.1 ;ΝΡ_110577.1 ·ΖΡ_0029 2300.1 ;ΥΡ_055458.1 ;Β ΑΒ59199.1 ;BAC70484 1 E ΑΜ94419.1 ;ΝΡ_960885.1 ;ΖΡ_00412766 I-YP Π 7906.1 ;ΝΡ__301653.1 ;ΝΡ_972233.1 ;ΝΡ_295535 1 ·

AAQ66593.1;NP_216727.1;P64220;ZP__0064613()

1 ;ΥΡ_023281.1 ;CAC 11159.1 ;067441 ;ΕΑΜ73669 1 ;CAF23 005.1 ;ΖΡ_00656447.1 ;ΑΑΝ47561 1 · YP 000301.1 ;CAD75451.1 ;Q8F935; AAV46422.1 Q5~ V230;ZP_0063103 8.1 ;AA007163.1 ;ZP_003 79710 1 ;AAK25317.1 ;ZP__00574284.1 ;ZPJI0549460 1-A AL33597.1 ;NP_936752.1 ;XP_473945.1 ;CAA8108 1.1;ZP_00054164.1;ZP^00577153.1;CAB16917 1· NP_143049.1 ;058888;CAB50008.1 ;BAD86224 1 · AAB38502.1 ;YP_164888.1 ;EAL00308.1 ;NP 2803 90.1;YP 206658.1 ;Q9HPJ7;CAA52800.1 ;EAL001 86.1 ;ZP_00130510.2;AAP21169.1 ;NP 800315 I C AA81077.1 ;CAA94902.1 ;NP_789581.1 ;CAA 1097 6.1 ;AA044735.1 ;XP_756577.1 ;YP_266089.1 ;CA B11698.1 ;ZP_00535963.1 ;NP 949185.1-XP 6297 08.1 ;ZP_00270643.1 ;AAK87256.1 ;AAL81465 I-Y P_261727.1 ;NP_010302.1 ;EAN063 51.1; YP_01090 2.1 ;CAG77727.1 ;A AB05000.1 ;ZP_00303631 1-NP .001006021.1;ZP_00625540.1;CAG85941 I-NP 9 51434.1 ;NP_772391.1 ;CAF93 361.1 ;CAH02226 1 · YP_270503.1 ;CAF26481.1 ;ZP_00601921.1-XP 39 4029.2;ZP_004743 88.1 ;CAC46128.1; AAN666 li 1 ;ZP_00264535.1 ;NP_251132.1;ZP_00375763 I-ZP _00140175.2;ZP_00555141.1 ;YP_234187.1-AAT5 1611.1 ;ZP__00622636.1 ;ZP_00506634.1 ;NP_79110 5.1; AAR21108.1 ;ZP_00417689.1 ;EAN86200.1-A AW42395.1 ;EAL33114.1 ;BAB66247.1 ;NP 53215 4.1 ;YP_034022.1 ;NP_102589.1 ;XP_331926.1-EA N853 87.1 ;CAG58515.1 ;;AAB37080.1 ;ZP_002449 22.1 ;YP_191520.1 ;CAJ09347.1 ;CAJ09346.1 ;CAE

64583.1;AAN33909.1;YP_223284.1;NP_214006 1

;BAA02967.1 ;BAA03512.1 ;AAF52996.1 ;AAX333 83.1 ;XP_322034.2;NP_541537.1 ;NP_001013836 1 ;EAA68431.1 ;NP_001014026.1 ;XP_620786.1-EA A51066.1 ;EAN04066.1 ;XP__541886.1; YP_256009 1;Q9TSZ7;YP_132990.1 ;NP_990119.1 ;AAH0754 6.2;EAA65791.1 ;Q9YBA2;EAL90405.1 ;CAC4149 1.1 ;NP_342411.1 ;EAN79919.1 ;XP_517018 I-NP 107651.1 ;ZP_00004512.2;BAA 12709.1 ;NP_14810 4.1 ;AAV94849.1 ;YP_266710.1 ;XP_516459.1 ;NP 105581.1 ;ZP_00620069.1 ;ZP_00631895.1 ;AAL13~ 520.1; YP^04713 7.1; AAF68432.3 ;CAC46853.1-XP .542460.1 ;ZP_00460296.1 ;ZP_00554633.1 ;ZP 00 282393.1 ;NP_102909.1 ;YP_235303.1 ;AAQ87218 1 ;ZP_00213445.1 ;NP_ 106044.1 ;ZP_00169723.2 -Z P_00500952.1 ;ZP_00489849.1 ;ZP_00480439 1-ZP _00450235.1 ;ZP_00436058.1 ;AAY59105.1 ;EAM3 2228.1 ;AAW21506.1 ;CAD 14805.1 ;ZP_00410721 1 ;NP_792264.1 ;Q46337;NP_521609.1 ;BAD97818 1; 1X31 ;NP_534554.1 ;ZP_00602139.1; AAK16489 1 ;YP_266475.1 ;EAA22341.1 ;XP_318114.2-CAC4 7432.1;ZP 00004192.1;NP 534790.1;AAL52901 sistema clivagem glicina (R71/R72)

de de

LpdA-proteína

POA9PO

1 ;ZP_00565350.1 ;ZPJ>0657316.1 ;YP_134767 1 Z P_003 793 71.1; YP_134764.1 ;XP_742683.1 ;AAN2 9180.1 ;ZP_00602144.1 ;CAG35030.1 ;EAM31940 1 ;ZP_00556129.1 ;CAC49374.1 ;ZP_00050264 2-Z P_00379741.1 ;NP_705537.1 ;ZP_00471825.1 ;NP__ 104736.1 ;ZPJÍ0600293.1 ;AA Y87206.1; YP_26669 0.1; AAL76414.1 ;AAC31611.1 ;AAR3 8319.1 ;ZP_0 0658996.1 ;YP_266673.1 ;NP_105928.1 ;ZP_006301 98.1 ;YP_266631.1 ;NP_254105.1 ;NP_107666.1 ;NP _104289.1 ;NP_102901.1; A A V96623.1 ;B AC74662 . 1 ;AAV95607.1 ;ZP_00620942.1 ;ZP_00645790.1 ;C AC41486.1 ;EAN05 741.1 ;AAN65213.1; YP_26919 6.1 ;ZP_00620654.1 ;ZP_00660136.1 ;NP_885663.1 · NP_436414.1 ;NP_881143.1 ;AAM75070.1 ;NP__572 162.2;ZP_00379745.1 ;CAA39468.1 ;ZP_00264573 1;YP_262784.1;ZP_00380782.1;ZP__00278582.1-A AV94866.1 ;XP_414684.1 ;YP_237780.1 ;ZP_00602 141.1;YP_165138.1;NP_790307.1;NP_620802.2'N P_534700.1 ;AA V95690.1 ;EAL32452.1; AAF21941 . 1 ;AAN65956.1 ;NP_083048.1 ;AA V9493 5.1 ;CAC4 6854.1;CAC41470.1;AAH24126.1;NP_037523.2;Z P_00565365.1 ;NP_102887.1 ;YP_134760.1 ;AAQ8 7217.1 ;AAH89599.1 ;ZP_00554816.1 ;AAK16482. 1 ;NP_103085.1;ZP_00620147.1 ;NP_ 102906.1 ZP_ 00556188.1 ;XP_307967.2;ZP_00622120.1 ;CAC47 100.1 ;NP_106776.1 ;CAH90377.1 ;ZP_00554918 1· CAD31640.1 ;XP_672544.1 ;AAT81177.1 ;AAK278

67.2; AAD33412.1 ;NP_107653.1 ;CAI 12276.1 ;BA D97122.1 ;ZP_00410737.1 ;AAD43585.1 ;NP_1037 93.1;XP_526883.1;XP_548398.1;CAB63337.2;YP _266661.1 ;ZPJ)0521798.1 ;EAA60688.1; AAL518 65.1 ;AAV95026.1 ;EAL26357.1 ;ZP_00619907 1 C AE74368.1 ;NP_103190.1 ;AAV94915.1 ;AAG5566 3.1 ;XP_395831.2;AAK92969.1 ;NP_446116.1 ;AA F57796.1 ;AAN71380.1 ;ZP_00005411.1 ;CAE5894 2.1 ;EAA70894.1 ;AAV94873.1 ;ZP_00631887.1-ZP _00629673.1 ;BAB34711.1 ;ZP_00619923.1 ;ZP_00 622863.1 ;EAL85410.1;AAL76413.1;AAR38318 l· CAD47921.1 ;AAH03456.1 ;NP_102854.1 ;AAH768 59.1; AAL04443.1; AAH68953.1; YP_16513 7.1 ;XP _580581.1 ;ZP_00050273.2;ZP_00556400.1 ;ZP_00 555517.1 ;AAV96627.1 ;AAV93943.1 ;AAH81271 1 ;AAK87410.1 ;ZP_00556086.1 ;AAV93879.1 ;AA H44792.1 ;XP_527208.1 ;ZP_00327983.1 ;ZP_0055 4213.1 ;NP_532318.1 ;CAI12274.1 ;AAH22388.1 ;X PJ46052.1 ;XP_676622.1; AAV93533.1; YP_2656 71.1; AAV473 50.1 ;A AV95190.1 ;CAD31286.1 ;ZP_ 00516133.1 ;ZP_00620892.1 ;AAH55193.1; AAY82 706.1;ZP 00052785.2;AAR3 8102.1

NP_706070.2;

AAX64059.1;

YP_149503.1;

NP_930833.1;

AAF95555.1;

NP_798896.1;

ZP_00132373.2;

NP_752095.1; AAL19118.1; CAG76686.1; NP_935564.1; ZP_00585786.1; AAC46405.1; YPJ31302.1;

NP_716063.1; ZP_00637900.1; ZP_00582828.1; AAU37941.1; ZP_00157402.1; AAX88688.1; ZP_00154973.1; AAP96400.1; YP_271444.1; ZP 00464633.1:

CAA24742.1 NP_804043.1 YP_069256.1 AAO10051.1 AAK02977.1 ZP_00122566.1 YP__205561.1 ZP_00633839.1 ZP_00134358.2 NP_439387.1 YP_154852.1 ZP 00451158.1 ΖΡ_00212747.1; ΖΡ_00500723.1; ΖΡ_00486500. ΖΡ_00463487.1; ΖΡ_00467577.1; ΖΡ_00423839. ΖΡ_00423458.1; ΖΡ_00283805.1; ΑΑ090013. ΖΡ_00595215.1; ΖΡ_00170705.2; NPJ79789. ΥΡ_123783.1; ΝΡ_889077.1; YPJ26870. ΝΡ_240038.1; ΥΡ_095531.1; CAD15305. A AQ58205.1; ΝΡ_883762.1; NPJ770362. ΥΡ_170418.1; CAA61894.1; AAV29309. CAB84783.1; AAF41719.1; ΖΡ_00565931. CAA59171.1; CAA54878.1; AAW89295. CAA62435.1; ZPJ)0150164.2; 1ΒΗΥ; IOJT CAA61895.1; YPJ57096.1; CAA57206. ΑΑΜ38502.1; ΝΡ_635936.1; ΥΡ_199361. ΝΡ 660554.1; ΝΡ 842161.1; ΖΡ_00507350. ΝΡ_779995.1; ΥΡ_115390.1; ΖΡ_00651360. ΝΡ_298158.1; AAR3 8073.1; EAO17659. ΖΡ 00245305.1; AAR38213.1; AAR38090. ΝΡ 777818.1; BAC24467.1; ΝΡ_891227. ΝΡ 879460.1; ΝΡ_878457.1; CAD71978. ΥΡ_078853.1; ΑΑΚ50273.1; ΑΑΚ50266. AAFl 1916.1; ΝΡ_389344.1; ΖΡ00396676. ΕΑ021015.1; CAA37631.1; 1EBD; ΥΡ_146914. ΒΑΒ06371.1; ΥΡ_085309.1; ΑΑΡ10890. ΥΡ_020826.1; ΥΡ_175913.1; Q04829 ΑΑΝ03817.1; ΝΡ_692336.1; AAG17888.1 ΖΡ_00474314.1; ΝΡ_764349.1; ΑΑΑ99234.1 1LPF; ΝΡ_250278.1; ΧΡ_475628.1; ΥΡ_253771.1 ΥΡ_143499.1; ΥΡ_257414.1; AAF34795.3 AAF79529.1; ΥΡ_040483.1; ΥΡ_005722.1 ΥΡ_074243.1; ΑΑΝ23154.1; ΑΑΚ50305.1 AAS20045.1; ΖΡ_00540244.1; ΕΑΝ07674.1 NP 815077.1; ΝΡ_908725.1 AAS47493.1; AAF34796.1 ΥΡ_013676.1; ΖΡ_00317120.1 CAB84413.1; ΑΑΒ30526.1 ΒΑΒ44156.1; ΝΡ_464580.1 AAF41363.1; ΑΑΚ50280.1 ΥΡ_265659.1; NP 470384.1

AAC26053.1;

ΖΡ 00307577.1;

CAA11554.1;

AAV48381.1;

ΝΡ_969527.1;

ΧΡ_635122.1;

ΖΡ_00397330.1;

CAA44729.1;

ΖΡ_00401182.1;

ΖΡ_00625011.1;

ΕΑΝ08634.1;

ΥΡ_235092.1;

ΝΡ_945538.1;

B AD92940.1;

AABO1381.1;

AAS47708.1;

ΥΡ_034342.1;

CAA61483.1;

AAW89611.1; IDXL ΖΡ_00418304.1; ΝΡ_792022.1 AAD53185.1; 3 LAD

ΑΑΗ18696.1; ΝΡ_967737.1; ; ΝΡ_763632.1;

ΝΡ_000099.1; ΝΡ_999227.1; AAR21288.1; ΕΑΝ90443.1; ΑΑΝ69768.1;

Ρ31052; NPJ05199.1; ΑΑΗ62069.1; CAA72132.1;

CAG58981.1; ΑΑΝ15202.1; CAD72797.1; AAC53170.1; CAG81278.1; ΕΑΚ93183.1; AAS53883.1; CAG31211.1; ΑΑΚ11679.1; ΑΑΝ30810.1; AAQ91233.1;

CAF26798.1; CAA72131.1; ΖΡ_00554136.1; CAF05589.1; ΖΡ_00284261.1; ΖΡ_00492121.1; YPJ60845.1; CAA49991.1; ΖΡ_00427535.1; ΖΡ_00449174.1; ΑΑΗ44432.1;

CAH93405.1 C A JO8862.1 ΒΑΕ00452.1 IZMD ΝΡ_767089.1 ΑΑΑ35764.1 ΕΑΝ96941.1 AAF 12067.1 ΖΡ_00263252.1 ΝΡ_031887.2 ΕΑΝ80618.1 ΖΡ_00269527.1 CAD61860.1 ΖΡ_00622437.1 ΖΡ_00497224.1 ΝΡ_533297.1 AAV93660.1 ΑΑΜ93255.1 ΥΡ_258846.1 CAF92514.1 XP 320877.2 CAC47627 ΝΡ_280867 AAL51327 ΝΡ_105334 NPJ772974 ΕΑΝ27796 ZP 00340462

ΑΑΗ56016.1; ΥΡ_222565.1; ΑΑΑ96487.1; ΖΡ_00464142.1; ΥΡ_067405.1; CAB65609.1; ΑΑΚ22329.1; ΥΡ_246823.1; XPJ7586 08.1; CAH00655.1; AAB88282.1; ΖΡ 00211386.1; ΑΑΝ70931.1; EAL29693.1; ΖΡ_00153792.2; ΝΡ_266215.1; ΖΡ_00383074.1; AAF49294.1; ΝΡ_360330.1; ΖΡ_00578463.1; ΒΑΒ03935.1; ΖΡ_00654346.1; ΝΡ_623271.1; ΧΡ_623438.1; ΖΡ_00007570.1; ΖΡ_00320049 ΑΑΝ75183.1; ΖΡ_00323583.1; ΥΡ_200681 1LVL; ΖΡ_00151187.2; ΑΑΡ03132 CAD14973.1; ΖΡ_00630163.1; ΖΡ_00139957 ΝΡ 250940.1; ΝΡ_636857.1; CAB05249. ΖΡ00166998.2; ΑΑΝ75720.1; CAA62982. ΖΡ 00265019.1; ΖΡ_00384289.1; AAV47687. ZPJ)0303079.1; ΝΡ_842316.1; XP 331183.

ΖΡ_00579524.1; ΑΑΝ33719.1; ΖΡ 00597315.1; ΥΡ_223465.1; ΕΑΑ26462.1; ΥΡ_047424.1; ΑΑΝ69982.1;

CAG85768.1; 1V5 ΑΑΑ65618.1; ZP 00305550

AAZl 7978 AAD30450 CAC47514 ΝΡ_220840 CAA39235 ΑΑΜ36402 NP 116635

AAV28779.1; ΑΑΝ48422.1; ΖΡ_00597992 ΑΑΝ75618.1; AAV28746.1; ΖΡ_00267415 ΖΡ_00650982.1; AAQ58749.1; ΝΡ_298837. ΑΑΝ75159.1; ΝΡ_778978.1; ΖΡ_00575798 ΥΡ_002403.1; ΑΑΒ97089.1; ΖΡ_00511405 ΥΡ_005669.1; ΕΑ021998.1; ΧΡ_613473 ΖΡ_00245417.1; ΖΡ_00210841.1; ΖΡ_00561492 ΥΡ_259638.1; ΕΑ016949.1; NPJ785656. CAF23 812.1; ΖΡ_00055963.2; YPJ 43553. ΝΡ_953492.1; CAA63810.1; CAF22875. AAV89136.1; ΖΡ_00536790.1; AAF39644. ZP 00621355.1; ΖΡ_00486105.1; ΖΡ_00020745.2 ΖΡ_00589771.1; ΥΡ_180376.1; ΝΡ_220072. CAI27032.1; EAL87307.1; ΥΡ_112273. ΖΡ_00376179.1; ΖΡ__00498294.1; ZPJM492099. ΖΡ_00463379.1; ΖΡ_00217095.1; CAI27980.1 ΑΑΚ23707.1; CAD60736.1; ΖΡ_00268854.1 ΕΑΑ77706.1; ΖΡ_00629856.1; ΕΑΑ51976.1; ΝΡ_885384.1; ΑΑΑ91879.1; ΖΡ_00376555.1; ΝΡ_253516.1; ΝΡ_300890.1; ΑΑΝ03 814.1; ZP_00644737.1; ΑΑΡ98791.1; YPJJ79735.1; ΑΑΡ05672.1; ΝΡ_966507.1; Ρ95596 ΕΑΝ04065.1; ΝΡ_532124.1; ΖΡ_00507305.1 ΝΡ_948204.1; ΖΡ_00557093.1; YP 220287 1 ΖΡ_00642506.1; ΖΡ_00591535.1; NPJ771418.1; ΑΑΑ19188.1; ΑΑΚ72470.1; ΝΡ_345630.1; ΖΡ_00404212.1; ΑΑΚ72472.1; CAC46029.1; ΥΡ_001129.1; ΖΡ_00526430.1; ZP 00308S67.1; ΥΡ_036862.1; ΖΡ_00210426.1; ΖΡ_00625423.1 ZP_00601791.1; ΥΡ_045732.1; ΥΡ_016277.1 Ρ54533; AAV95488.1; AAW71149.1 YP 021029.1; ΥΡ_153983.1; ΖΡ_00240355.1

ΝΡ_879905.1 CAI29613.1 ΖΡ_00141283.2 ΑΑΒ40885.1 ΑΑ036548.1 NP 388690.1

ΝΡ_102193.1 ΑΑΚ72471.1 ΝΡ_756887.1 ΑΑΝ50085.1 AAL64341.1 YP 053282.1

XPJ95801.2 NP 326592.1

ΕΑΝ08156.1; AAPl 1076.1;

ΑΑΡ94898.1 ZP 00239726.1 tiossulfato redutase (R73) phsA

tiossulfato redutase (R73) PhsB

redução

tiossulfato

sulfeto

de

NP 461008

tiossulfato redutase (R73) PhsC

redução de tiossulfato a sulfeto

proteína de

transporte de elétron

NP 461009

precursor

tiossulfato

redutase

da

NP 461010

NP_980528.1; YP019413.1; YP_180009.1; AAN30046.1; ZP 00373647.1; EAM72947.1; EAAl 6706.1; AAL52038.1; AAA74473.1; AA078292.1; ZP_00545191.1; BAB05544.1; AAL97648.1; AAV62625.1;

ZP_00620223.1; NP_148088.1; NP_735347.1; BAB04498.1; NP_692788.1; YP 078075.1; YPJ221832.1; NP__966125.1; ZP_00589476.1; EAA26057.1; CAE73952.1; NP_802451.1; ZP_00154188.2; CAG35032.1;

ZP00512893. XP_678378. CAI26632. AAN57909. ZP_00053288. ZP_00006401. XP_742153. YP_247286. CAI38117. BADl 1090. YP_060098. NP_360876.1 ZP__00331725.1 YP_084091.1 YP 121481.1

ZP 00366080.1; YP_139515.1; ZP_00340821.1; ZP_00531539.1; ZP_00630106 1 CAB06298.1; NP_979105.1; ; ZP 00162168 1

AAP09729.1; ZP_00277446.1; AAK33 923.1; YP__116014.1; YPJ)33412.1; ZP_00111840.1; YP_055934.1; NP_975267.1; AAG 12404.1; BAB64316.1; ZP 00413985.1

YP_175948.1; BAB76444.1; AA075416.1; BADl 1095.1; AAT47753.1; ZP_00293744.1; EAM93810.1; NP_701672.1; NPJ90286.1; YP_075992.1;

NP_938751.1 YP_148232.1 AAT5 8044.1 ZP_00571989.1 NP_221155.1 CAF34426.1 NP_214976.1 NP_662186.1 AAB96096.1 ZP 00656450.1

AAL20967.1 YP_150111.1 AAG56657.1 AAA68434.1 ZP_00532396.1 ZP 00535768.1

NP_804652.1 AAA68433.1 NP_707568.1 NP_951651.1 ZP 00591595.1 ZP 00552446.1

AAX65978.1 NPJ753 9 59.1 AAC74740.1 YP_012355.1 ZP_00588551.1 ZP 00511962.1

ZP 00528880.1 EAN28924.1 ZP 00303670.1

YP_150110.1;AAX65979.1 AAA68432.1ZP_005 85996.1 ;NP_719591.1 AAC74741.1 ;P77375;ZP_00639669.1 NP_753960.1 ;NP_83 7355.1 ;Q8X616 AAG56658.1 ;NP_707569.1 ΖΡ_00583250 1 YP_129473.1;AA011357.1;NP_934045.1 CAG73826.1 ;CAA46177.1 ;NP_709848.1 NP_756920.1 ;YP_204935.1 ZP_005 85235.1

AAL20969.1 ;AAX65980.1 ;NP_804650.1 ;NPJ719 592.1 ;ZP_00639668.1 ;ZP_00585997.1 ;CAA46176 1 ;CAE09281.1 ;ZPJ)0575008.1 ;ZP_00401980 I-Y

P_009398.1;ZP_00130114.2;YP_004130.1 ;ZPJ)01

30395.1 ;CAE09834.1 ;ZP_00583252.1 ;ZPJ)05832 51.1 ;ZP_00550659.1 ;ZP_00534062.1 ;ZPJÍ052965 3.1 ;NP_070031.1 ;ZP_00531012.1 ;ZP_00511630 1· ZP_00557320.1;ZP_00583253.1;ZP_00589338.1;Z PJÍ0592921.1; YP_073 93 8.1 ;ZP_00550240.1 ·ΖΡ_0

0558485.1;ZP_00537210.1;YP_157558.1;YP_1607

03.1 ;AAL64489.1 ;EAN27258.1 ;ZP_00550224 I-A AQO8379.1 ;CAB71267.1 ;ZP_00557316.1 ;ZP_005

75750.1;ZP_00150980.1;ZP_00559031.1;ZP_0055

8228.1 ;ZP_00557853.1 ;YP_132003.1 ;CAE 10491 1 ;YP_206040.1;NP_668198.1;CAC92557.1;YP_069 346.1; AAC74659.1; AAK03 83 8.1 ;ZP_00557324 1 · CAE11227.1 ;AAX88061.1 ;ZP 00155680.2;NP 43 9206.1 ;ZP_00557867.1 ;AAG56574.1 ;ZP 0015689 3.2;NP_753872.1;AAB06233.1;ZP 00557301 I-N P_805734.1 ;ZP_00053862.2;AAL21424.1 ;NP 752 960.1 ;AAX64824.1 ;AAL 19899.1 ;NP 309006 2-C AB50383.1 ;P 18775;EAM94677.1 ;ZP 00550524 1- AAX66433.1;AAL19562.1 ;ZP 00600783.1;BAB3* 4402.1 ;AAC73980.1 ;YP 074347.1;AAG55381 1- NP_836552.1;NP 753873.1;ZP 00509629.1;EAM 95020.1;AAG56575.1 ;ZP 00557953.1 ;BAB35717 1; AAX64548.1 ;CAE09880.1; AAX65422.1 ;AAC74 660.1;P77783;YP 150613.1;ZP 00550244.1-AAL 20417.1;NP 805214.1;YP 075885.1;NP 805215 1 ;AAX65421.1 ;NP 106243.1;YP 151327.1;AAX68 089.1 ;BAB36807.1 ;ZP 00559319.1;AAG57632 l· AAL23129.1 ;CAB49710.1 ;NP 463170.2;CAG741 60.1 ;BAB6503 8.1;YP 160885.1;YP 079335 I NP 805998.1;YP 119157.1;; sulfito redutase anaeróbica subunídade A R(74) DsrA converte sulfito a sulfeto AAL21442 YP_149649.1;NP 804183.1;AAX66448.1;AAK79 480.1 ;BAB81146.1;AA036949.1 ;ZP 00576801 l· BAB81244.1;ZP 00145179.1;ZP 00662254 l Zp' 00575186.1;ZP 00536228.1;BAD86261.1;AAL81 453.1;NP 143176.1;ZP 00667024.1 ;NP 951149 1 ;CAA53034.1 ;AAL81015.1;YP 011613.1;ZP 005 88237.1;NP 662768.1;ZP 00511990.1;CAB49782 . 1 ;NP_110522.1 ;CAC 11194.1 ;ZP 00130780 I-ZP 00528291.1;ZP 00590992.1;AAU82616.1;ZP 005~ 32275.1;ZP 00347064.1 ;EAN28921.1 ;ZP 005477 37.1 ;AAB94933.1 ;YP 096477.1;ZP 00335593 l· YP_124840.1 ;CAB49860.1 ;YP 127720.1;ZP 004 16523.1 ;NP_662137.1 ;ZP 00661877.1;ZP 005884 74.1 ;ZP_00511238.1 ;EA034975.1 ;ZP 00528312 1 ;NP_147088.1;ZP 00346179.1;NP 246968.1-AAG 53710.1 ;NP_632708.1 ;AAC37042.1 ;ZP 00582131 . 1 ;NP_937321.1;AA007727.1 ;XP 652137.1;AAM 94492.1;ZP 00536224.1;ZP 00557435.1;NP 7016 24.1 ;AAU06262.1 ;NP 880822.1;NP 889860.1;AA U83 862.1 sulfito redutase anaeróbica subunídade B (τΊΑ) DsrB converte sulfito a sulfeto AAL21443 YP_149648.1;NP 804182.1;AAX66449.1-AAA99 276.1 ;ZP_00576802.1 ;BAB81243.1 ;BAB81145 1 · AAK79481.1 ;AA036948.1 ;ZP 00575185 1ΎΡ 0 11612.1;CAC11195.1;ZP 00145178.1;ZP 006622 55.1 ;NP_110523.1 ;EAN28920.1 ;ZP 00588238 IZ PJ)0130781.1;NP 951147.1;ZP 00667025.1;AAB 94934.1 ;ZPJ)0347063.1 ;EA034974.1 ;CAA53035 1 ;AAL81016.1 ;BAD86260.1 ;ZP 00536229 LZP 00590993.1 ;CAB49781.1 ;CAB49861.1 ;ZP 00511 991.1 ;NP_143177.1 ;ZP 00416521.1;ZP 00528292 .1;AAL81454.1;NP 662769.1;YP 124839 1ΎΡ 1 27719.1 ;ZP_00532276.1 ;YP 096476.1;ZP 005Π2 37.1 ;ZP_00528313.1 ;ZP 00661878.1;AAU82615 1 ;ZP_00588475.1 ;NP 662138.1;ZP 00335592 I Z P_00547738.1;ZP 00417715.1;CAB50658.1 BAD 85995.1;AAL80312.1 ;ZP 00562249.1 ;057738-ZP _00541622.1;NP 143791.1;AAM04028.1;YP 022 952.1 ;AAA23200.2;NP 633770.1;NP 988039 I-N P_971592.1;NP 111690.1;CAC11546.1;NP 06936 4.1;NP_248450.1;NP 632687.1;AAT38120.1;AA Q66178.1 ;AAM18706.1 ;AAC65704.1 ;BAB80961 1 ;NP_971022.1 ;NP 613849.1;NP 622237.1;AAK 80598.1 ;NP_622352.1 ;AAB85701.1 ;YP 147006.1- CAA51740.1;AAM07137.1;AAN58909.1-NP 229' 439.1 ;EAM94068.1 ;NP 267503.1;CAG37745 I-N P_623138.1;AA03 6853.1 ;ZP 00541900.1;AAL94 626.1 ;ZP_00563837.1 ;ZP 00539594.1;AA036887 . 1 ;CAB49859.1 ;Q8XL63;AAP 10806.1 ;NP 389436 . 1; YP 020666.1;YP 078946.1;ZP 00143318 I-AA K99669.1 ;Q8DQ38;NP 816202.1;NP 345444 I-N P_692413.1;ZP 00240193.1;YP 011687.1;ZP 005 04646.1 ;ZP 00575869.1;AA035521.1;YP 055711 . 1 ;NP_758176.1 ;P56968; 1EP2;ZP 00520109 I NP _815421.1;YP 181916.1;ZP 00575375.1;YP 1807 92.1;YP 175828.1;ZP 00382098.1;ZP 00130793 1 ;ZP_00401561.1 ;ZP 00561001.1;ZP 00655811 1 ;NP_012221.1;AA075998.1 ;NP 952806.1 ;AAQ97 765.1 ;AAL81452.1 ;AAS51833.1 ;ZP 00128609 l· NP_531891.1 ;CAE71880.1 ;NP 946031.1-CAH003 58.1 ;CAA37672.1 ;CAG35490.1 ;AAN68771.1-AA V52085.1 ;AAV62537.1 ;ZP 00389517.1;ZP 00535 043.1;XP 550297.1 ;ZP 00664777.1;NP 465359 1 ;CAD14793.1;XP 330548.1;AAN15927.1;ZP 002 34145.1 ;P23312;AAA18377.1 ;ZP 00591027.1 CA 147849.1 ;AAA67175.1 ;BAA13047.1 ;AAA72422 1 ;ZP_00503086.1;NP 057313.2;ZP 00401594 1 P3 9866;XP_396639.1 ;XP 623086.1 ;BAB55002.1 |P3 9870;AAB66010.1 ;NP 471282.1;EAA51298.1;;E AN09251.1 ;CAA56696.1 ;AAC69483.1 ;AAC4946 0.1;AAF63450.1 ;ZP 00505244.1 ;CAA32217.1 ;A AU84695.1 ;AAF04811.1 ;AAB93308.1 ;NP 79619 0.1 ;CAH08182.1 ;AAG30576.1 ;AAB39554.1 sulfite redutase anaeróbica subunidade C (R74) DsrC Converte sul fito a sulfeto NP_804181 YP_149647.1 ;AAA99277.1 ;BAB81242.1 ;AA0369 47.1 ;BAB81144.1 ;AAK79482.1 ;ZP 00576803 I-C AA60228.1;NP 952404.1;AAM06806.1;ZP 00542 975.1 ;ZP_00503774.1 ;ZP 00561650.1;ZP 005607 87.1;ZP 00535294.1;NP 635288.1;ZP 00145130 1 ;ZP_00576896.1 ;ZP 00563866.1;NP 247865 I-A AU83232.1 ;AA035782.1 ;NP 987198.1;NP 61408 3.1 ;AAB84786.1 ;AAM06538.1 ;ZP 00540799 I-N P_632386.1 ;AAM04125.1 ;ZP 00558670.1 NP 61 4085.1;ZP 00130988.2;AAM06540.1;NP 632384 1;NP_633866.1;ZP 00631188.1;ZP 00541754 I-E AN05933.1;ZP 00056315.1;ZP 00562004.1-ZP 0 0667805.1 ;YP_147721.1 ;AAK49018.1 ;AAC 17127 . 1 ;NP_534394.1 ;AAK89517.1 ;BAB92078.1-NP 1 04101.1 ;AAQ 18184.1 ;AAM73544.1 ;P17847;AAA 60450.1 ;NP_247530.1 ;ZP 00623963.1;AAK22600 . 1 ;ZP_00303419.1 ;ZP 00536025.1;AAP46170 I N P_442378.1;NP 954306.1;CAC49509.1;AAP7914 4.1 ;BAD15364.1 ;ZP 00576654.1;ZP 00575700 1- CAG36393.1;ZP 00579652.1;NP 918873.1;-ZP 0 0556586.1;ZP 00333573.1;CAA46940.1;BAD530 72.1 ;CAA46942.1 ;BAD15363.1 ;CAA34893.1-ZP 00558945.1;NP 952142.1;BAD15365.1;ZP 00535 147.1 ;NP_924503.1 ;B AE06055.1 ;BAB55003 1-ZP _00415177.1;YP 036299.1 ;AAM06247.1 ;ZP 003 92410.1;ZP 00674499.1;EAM75787.1;AA038372 . 1 ;YPJ)18789.1 ;AAN31831.1 ;AAN31830.1 ;AAN 13223.1 ;BAD93723.1;YP 083541.1;ZP 00575701 1;BAA06530.1;ZP 00571935.1;ZP 00534536 I-A AP09103.1;YP 010301.1;ZP 00500892.1 ;ZP 004 96099.1 ;ZP_00486991.1 ;ZP 00482951.1;ZP 0046 7711.1;ZP 00452175.1;YP 104614.1;ZP 0064528 3.1 ;CAH34502.1 ;ZP_0023 7633.1 ;ZP_00516217.1; 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;AAF93646.1 ;AAF96525.1; YPOl 5228 1ZP_0023

Ss282.1;ZP 00416485, ;ZP-°°'155~6971 ;NP_466182.1 ;ZPJ)0156879.2 ;ZP 00528273 1 ;NP_472138.1 ;NP_798983.1 ;NP_267781 I YP I3

Z^20S';1CAB58,35, ;ZP-°0381829 1

zeo^if-00129328·1

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AL90682.1

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nVnnL, ;YP_104015.1;23> 00488354.1

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;BAC24728.1 ;AAD08131.1 ;CAG28449.1ΈΑΑ226

43.1 ;CAA86607.1 ;NP_223056.1;XP 743287 1

;NP_703770.1 ;ZP_00062992.2

;YP_053590.1 ;AAA35168.1 ;ZP 00545078 1

;ZP_00371544.1

;NP_975365.1 ;XP_674383.1 ;YP_179787.1-ZP 00 419453.1 ;CAB73633.1;ZP_00367926 1

;XP_651838.1;CAH07360.1;AA075454.1;EAL17 469.1 ;EAL20938 1

; AAQ66751.1 ;EAA66976.1 ;ZPJ)0368598 1 ;EAA53 893.1 ;XP_648840.1 ;ZP_001203 73.1 ;AAA26967.1 ;ZP 00050045.2

;EAA64069.1 ;EAL17468.1 ;CAD25372.1;CAG88707.1;YPJ15941.1;EAA70 882.1;EAL86575.1 ;AAC83349.1 ;AAG59818 1 ;ZPJ>0514509.1 ;ZP_00645002'l

;CAG84976.1 ;NP_326342.1;YP_016250.1-ZP 000 20488.2 ;NPJ757837.1 ;EAA37632.1 ;EAN84471 1 ;NP_078425.1 ;NP_757463.1 ;ZP 00053756 1 ;CAA26276.1

;NP_072728.1 ;AAB95721.1 ;AAP563 80.1 ;BAA 13 834.1 ;AAN18173.1 ;ZP_00404457 1 ;CAH25336.1 ;ZP_00403049.1 ;ZP_00403048 1 ;XP_648680.1;ZP_00234017.1 ;ZP_00404458 1 ;ZP_00332380.1 ;ZP_00514508.1 ;ZP_00357197 1 ;ZP_00642210.1 ;ZP_00372877.1 ;AAM94004 1 ;BAA95691.1 ;AAG43112.1 ;ZP_00405278 1 ;ZP_00053393.1 ;ZP_00374249.1 ;ZP_00120372 1 ;AAA50394.1 ;AAS93346.1 ;ZP_00642816 1 ;CAC21145.1 ;CAC21168.1 ;CAC21141 1 ;CAC21161.1 ;CAC21159.1 ;CAC21148 1 ;CAC21142.1 ;CAC21140.1 ;AAS93351 1 ;AAK63242.1 ;AAK63239.1 ;AAS93349 1 ;AAS93347.1 ;CAC21156.1 ;AAS93356 1 ;CAC21157.1 ;CAC21162.1 ;CAC211371 ;CAE75672.1 ;CAA13584.1 ;CAA13374 1 subunidade glicose-6-Ρ desidrogenase opcA (R3)

de

6-Fosfoglicono Iactona desidrogenase (R5)

fornecimento de

equivalentes de redução para reduções bioquímicas tais como reduções de sulfato para sulfeto ou metileno tetraidrofoliato para metil THF

YP 225861

fornecimento de

equivalentes de redução para reduções bioquímicas tais como reduções de sulfato para sulfeto ou metileno tetraidrofoliato para metil THF

; AAK63244.1 ;AAQ20076.Í ;ΑΑΌ95206 1 ;CAB60654.1 ;CAA13585.1 ;ZP 00405277 1 ;ZP_00510627.1 ;ZP_00374310.1 ;AAK63246~1 ;ZP_00574965.1

;AAL94500.1 ;CAC 11757.1; YP_076140.1 -ZP_005

Im4!'1 ;NP_228762.1 ;EAN81253.1

;NP 953961.1;AAK17116.1

;XP_651839.1;AAN50417.1;YP 077731 I-YP 09

0144.1 ;ZP_00207814.1 " ' "

;NP_247665.1;ZP_00559948 1

;NP_346546.1 ;XP_734906.1

;BAB80002.1 ;NP_111187.1 ;ZP 00403604 1

;NP_687234.1 ;CAB71601.1

;YP_023469.1 ;NP_532581.1 ;NP_988235.1-AAX6

6248.1;CAB71607.1 ;CAB71595.1 ;CAB71613 1

;CAB39235.1

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55527·! NP 691106 I-

YP_148197.1 ;ZP_00283191.1 ;NP_470749 1·γρ o' 79721.1 ;NP_464901.1 ;CAG74354.1 ;NP 92885 fl · YP_056324.1 ;NPJ90267.2;YP_07008Ll;NP 669 932.1 ;ZP_00212780.1 ;ZP_00424035.1 ;ZP 004623 13.1;YP_016771.1;YP_111755.1 ;AA044589 TNP ,992794.1 ;YP_034514.1 ;ZP_00390566.1 ;ZP 0023 6407.1 ;ZP_00232091.1 ;YP^081773.1 ;ZP_0049451 7.1 ;EAN09346.1 ;ZP_00502057.1 ;ZP 00403921 1- NP__344902.1 ;ZP_00111860.1 ;NPJ14782 1-AAL 67561.1 ;AAA24492.1 ;AAG35235.1 ;AAG35224 1- AAG57088.1 ;BAB76974.1 ;AAG35219 1-AAA244

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AAC43807.1 ;AAC43817.1 ;P41580vCS * i '

AAC43805a;AAC43793.1 ZP 0032Ω99 8P4157

son^^i Λ r-82 *IAAC43811.1 ;ÃAC43808.1; AAC43 800. ;AAC43798.1 ;AAC43795.1 ;NP 785144 I A AOt 806.1;AAC43804.1;AAC437S1TIiCAD7^44 . 1;AAC43813.1;AAC43809.1;AAC43803 I^AAC4

3787.1;P41578;P41574;AAC43786.1;P4158f^C 43797.1;AAC43788.1;AAC43834.1;AAC43810^ AAC43785.1;AAC43784.1;AAC43812 1 P415?7' AAS99175.1 ;P41575;AAC43799.1 ;AAC439 3 1 AAC43906.1;AAC43828.1;P41583 AAC43794 ■ AAC43825.1 ;AAL76323.1 ;AAC43902 1'AAC438

32 l;AAC43923.1;AAC43916.1;AAC439M 1AA

,AAC43824.1 ;CAA41555.1 ;AAC43918.1 ;AAL27 335.1 ;AAC43920.1 ;AAC43901.1 ;AAC43831 1A AC43904.1 ;AAW29822.1 ;AAC43908 1 AAC438?

9.1;ΑΑ€43919.1;ΑΑ043910.1;χΓ342980 2 W 14383.1;AAC43830.1;ZP 00319215 FQ9DC^

AAH59958.);AAA74174_f 329 ^D0

66. ;AAC43921.1 ;AAC43915.1;YP 081362 I CA

72^f ^AA ' ;NP 694109 1; AAA741^

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™1;AAA74146.1;AAR24280.1;AAA74Í»

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62 1, AAA74157.1; A AA74147.1; AAA2733 0 1-AA

A74173.1;AAA74143.1;AAA74Í69.1;NP 39 888

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56. ι;YP 129657.1 ;ZP 00539485.1 ;AAK5^90 1 · AAA74161.1; AAA74150.1; AAK64376 1 AAA741 68.1 ;AAA74175.1 ;AAA74165.1 ;XP 758724^AA

^I4A11,·] ^aa74155·1 ^aaa7-* ΐ 60.1 ;âAG07546 1 ;AAA74153.1 ;AAQ 13889.1 ;NP 910282 I-AAm

2456.1;AAH44196.1;CAA76734.l;™49^lÍ APf/«;I/AQ'3S81.1;CAE46650.1;W 9987f7 .AA042814.1 ;AAM64891.1 ;EAL03585.Í-01328 7'™380.1 ;AAK49897.1 ;AAQ13887.1 506.2;CAH02996.1;XP 625090.1;AAA74142 1N

P 798087.1;CAG62903:i;NP 012053J;AAOim2

9.1;AAQ13885.1 ;ΝΡ_934400Γΐ ;AAO 19944 "AA ^ I a Uo ^' .1 ;AAL76326.1 ;AAQ13883

1;AAH95571.1;ZP 00524274.1;AAQ13879 1 CA

G86870.1 ;CAG83189.1 ;AAC27703.1;NP 239^40 , ;CAB61332.1; AAO19942.1 ;AAO 1994 f 1 ZP 00 123635.1;CAB83570.1 ;AA019934 1AAO13880 1

1 TvTt^ ^ 1772.13AD98151

1;NP_438711.1 ;AA032396.1 ;EAA48517 I NP 77

7731.1;AA032497.1;AAU36620.1;AAM61057l- AAX87602. l;AAQ13878.1 ;CAE70848.1 ;BAD367 66.1;EAL88658.1;AAS53500.1;XP 330536 I ZP

00156373.2;XP_313091.2;AAF96795 1 CAEsfse

n^1553·';CAA22536·1 ;AAC27702 f;YP 2 06428.1 ;BAC06328.1 ;EAA59263.1 ;EAL31500 1

AAP95728.1;CAB10974.1;AAQ13886.1-P7071

AAF45732.1 ;;AAK03638.1 ;AAC65319 EAA676 transaldolase (R9)

fornecimento de

equivalentes de redução para reduções bioquímicas tais como reduções de sulfato para sulfeto ou metileno tetraidrofoliato para metil THF

CAF21583.1

AN05374.1;P41573;YP_219832.1;CAD80254 1-C

AD56883.1 ;CAC46511.1; AAP05178 I-NP 53221 5.1; A AQ 13884.1 ;NP_104453.1; A AL2732(Tl -NP ^^! AA0363 83.1; AA076329.1 ;CAH07617~1

;YP_099135.1;NP_542102.1;YP_222920 1-AAF39

196.1 ;AAB20377.1 ;AAC97362.1 ;NP 878753 I-C AE07634.1 ;AAP98300.1 ;NP_892888.1 ;NP 22824 8.1 ;NP_623 516.1 ;NP_219566.1 ;CAE20740! ZP

005m32ol;AAZ25595J;NP^717509.1;EAA'l897

^71A94797-13AD36765.1;AAP99887. IiXP5 50483.1 ;AA037720.1 ;AAL76318.1 ;AAV34504 T- NP_965830.1;ZP_00586799.1;AAW29924 1-AAW

29923.1;ZP 00383992 1 ' W

;NP_738305.1 ;NP_960111.1 ;NP_855135.1 ;YP_062114.1 ; ;ZP_00658918.1 ;CAA19941.1

;NP_93 9656.1 ;CAI37157.1 ;YPJ19786.1 ;NP_215964 1 ;NP_301493.1 ;ZP_00413481 1 ;ZP_00294056.1 ;BAC69478 1 · ;BAC74025.1 ; ;CAB50761.1 : . ;EAM76741.1 ;ZP 00548314 1 ;ZP_00569430.1 ;ZPJ)0120374.1 ;NP 695898 Γ · ;ZP_00381422.1 ;AAL15881.1 ;AA044438 1 ' ;ZP_00600251.1 ;BAD88191 í ;AAP83926.1 ;AAG 16981 1 · ;ZP_00326211.1 ;YP_192100 1

;AAA17140.1

;NP_224106.1

;YP_178349.1

;AAL15879.1

;AAL15876.1

;AAL15880.1

;ZP_00333934.1 ;BAD08583.1 ;NP_926323.1 ; ;NP_948972.1 ; ;CAB85348.1 ■ ;ZP_00203717.1 ; ;AAT08720.1 ;ZP_00648773.1 ;CAD73 047.1

;NP_789361.1 ;ZPJ)0655611.1 ; AAM64693.1 ; ;XP 463680.1 ; ;BAB75719 1 ;AAA98852.1 ;P48983 ;ZP_00160726.2 ;NP_773398 1 ;ZP_00623652.1 ;YP_159671.1 ;EAO 16453.1 ;AAW90238 1 ;AAQ58240.2 ; ;Q9K139 ;ZP_00522015.1 ;NP_842140 1 ;AAA 17145.1 ;CAE11079.1 ;

;AAD08536.1 ;

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(R76) converte formil-THF para 5,10- metenil-THF NP_600108 NP 737565.1;ZP 00655917.1;NP 939225.1;BAC 71386.1 ;CAB59679.1 ;ZP 00292666.1;YP 121170 .1;YP 061656.1;ZP 00545597.1;NP 301256.1;NP 959857.1;ZP 00573419.1;CAI37699.1;NP 21418 7.1;lSOU;YP 075021.1;NP 696710.1;ZP 004122 60.1;ZP 00134730.1 ;EAM72866.1 ;ZP 00575597. 1;AA089633.1;NP 215507.1;NP 854676.1;AAK4 5268.1;EAN27919.1;ZP 00552794.1;NP 882562. 1 ;ΖΡ_00326738.1 ;ΥΡ_115170.1 ;ΝΡ_886754.1 ;ΝΡ _881632.1 ;ΝΡ_534225.1 ;ΝΡ_440379.1 ;ΖΡ_006267 22.1 ;ΖΡ_00600182.1 ;ΥΡ_079816.1 ;ΥΡ_148302.1; ΖΡ_00519228.1 ;ΝΡ_439018.1 ;ΑΑ044764.1 ;ΝΡ_2 66325.1 ;ΖΡ_00323162.1 ;ΖΡ_00156713.1 ;ΖΡ_0011 0015.2;ΖΡ_00471373.1 ;ΖΡ_00534935.1 ;ΖΡ_00159 040.2;ΖΡ_00171408.2;ΖΡ_00398486.1;ΥΡ_190665 . 1 ;ΖΡ_003 9653 0.1; ΥΡ_009590.1 ;AAQ66843.1; YP 125990.1 ;AAR37522.1 ;ΥΡ_270316.1 ;ΥΡ_094629 . 1 ;ΥΡ_122981.1 ;AAL00707.1 ;ΝΡ_930816.1 ;ΒΑΒ8 2030.1 ;ΖΡ_00155857.2;ΥΡ_222388.1 ;ΖΡ_0026965 8.1 ;ΑΑΧ87904.1 ;AAL51496.1 ;ΥΡ_233427.1 ;CAG 3 5375.1 ;ΑΑΚ79064.1 ;ΒΑΒ76524.1 ;ΝΡ_79495 8.1; ΑΑΝ70768.1 ;ΑΑ009973.1 ;ΑΑ079363.1 ;ΖΡ_0058 5069.1 ;ΑΑΝ48446.1 ;ΖΡ_00538598.1 ;ΖΡ_0041704 3.1 ;ΕΑ024395.1 ;ΖΡ_00638539.1 ;AAQ58176.1 ;ΖΡ _00403498.1 ;ΥΡ_144877.1 ;ΑΑΧ66908.1 ;CAC414 62.1 ;ΝΡ_952189.1 ;ΥΡ_055204.1 ;ΖΡ_00347044.1; YP_005216.1;1WKC;YP_156483.1;ΕΑ017392.1; ΥΡ_175218.1 ;ΖΡ_00594221.1 ;ΖΡ_00319181.1 ;ΑΑ H19921.1 ;ΝΡ_001009349.1 ;ΝΡ_798970.1 ;ΖΡ_005 56764.1 ;ΝΡ_253 915.1 ;ΖΡ_00630769.1; ΑΑΤ49915 . 1 ;ΖΡ J)0141705.1 ;ΖΡ_00264800.1 ;ΝΡ_081105.1; CAC47337.1 ;ΖΡ_00055330.1 ;ΑΑΤ42396.1 ;ΝΡ_10 2175.1 ;CAD 13617.1 ;ΖΡ_00062893.1 ;ΖΡ_0031543 8.1; AAF95621.1 ;ΝΡ_971601.1 ;ΖΡ_00588425.1; Y P_034143.1;NP_923705.1;CAH06623.1;YP_09824 6.1 ;ΝΡ_670599.1 ;ΝΡ_311809.2;ΖΡ_00630026.1 ;Υ Ρ_263029.1 ;AAG 10441.1 ;ΖΡ_00592340.1; ΥΡ_ 170 963.1;YP_131238.1;NP_614888.1;CAH03038.1;A AL95098.1 ;ΒΑΑ28715.1 ;ΕΑΝ08520.1 ;ΥΡ_15208 2.1 ;ΝΡ_726312.1 ;ΝΡ_611785.1 ;ΝΡ_726311.2;ΥΡ_ 071689.1 ;CAF26595.1 ;ΝΡ_755368.1 ;ΝΡ_681770. 1;AAR38106.1;NP_840158.1;ZP_00509367.1;AA H12417.1 ;ΝΡ_104943.1 ;ΖΡ_00634551.1 ;ΕΑ Α2646 3.1 ;ΖΡ_005 82514.1; ΑΑΝ5 8080.1 ;ΝΡ_768167.1 ;Ζ Ρ 00211724.1 ;ΝΡ_638609.1 ;ΝΡ_965424.1 ;ΧΡ_30 8920.2;ΝΡ_785167.1 ;ΖΡ_00004961.1 ;ΑΑΚ25207. 1 ;AAF 11368.1 ;ΒΑΒ05136.1 ;ΖΡ_00153791.1 ;ΝΡ_ 949790.1 ;ΕΑΜ47244.1 ;ΖΡ_00380928.1 ;ΥΡ_20548 7.1 ;ΖΡ_00243180.1 ;ΖΡ_00152677.2;ΖΡ_00623093 .1;ΖΡ_00529088.1;ΖΡ_00511292.1 ;ΖΡ_00655348. 1 ;ΝΡ_975489.1 ;ΝΡ_806671.1 ;ΝΡ_777982.1 ;ΖΡ_0 0388995.1;ΧΡ_413857.1;ZP_00123619.1;AAC759 49.1 ;NP_708674.2;AAV63351.1 ;ΥΡ_067406.1 ;ΑΑ Κ03 805.1; ΑΑΗ89273.1; AAG5803 8.1 ;ΥΡ_253281. 1;ΧΡ_478853.1;ΝΡ_360331.1;ΥΡ_021133.1;ΖΡ_0 0530394.1 ;ΝΡ_220841.1 ;ΝΡ_470709.1 ;ΖΡ_000469 26.1 ;ΖΡ_00334623.1 ;ΖΡ_00143346.1 ;ΖΡ_0037674 7.1 ;ΕΑΝ07877.1 ;ΝΡ_464861.1 ;ΑΑΒ31354.1 ;ΥΡ_ 013951.1 ;ΝΡ_692845.1 ;CAD74215.1 ;ΖΡ_0027895 1.1 ;ΝΡ_716405.1 ;ΝΡ_980638.1 ;ΕΑΜ31460.1 ;ΖΡ_ 00463106.1 ;AAL21936.1 ;CAE07229.1 ;CAC05433 . 1; ΑΑΜ60972.1 ;ΑΑ041971.1; ΥΡ_085 596.1; AAM 90961.1;AAV96195.1 ;ΧΡ_510537.1 ;ΝΡ_660736.1 ;CAB83635.1;YP_246824.1 ;AAC65661.1 ;ΝΡ_764 791.1 ;ΝΡ_878554.1 ;CAG86858.1 ;ΖΡ_00386875.1; ΥΡ_194357.1 ;AAW90586.1 ;ΖΡ_00434550.1 ;ΖΡ_0 0492814.1 ;ΥΡ_053491.1 ;CAG73377.1 ;ΑΑ035597 . 1 ;EAL25167.1 ;ΖΡ_00499196.1 ;CAG80466.1 ;ΑΑ W70845.1 ;ΥΡ_045820.1 ;ΝΡ_734906.1 ;ΑΑΜ9930 9.1;YP 038325.1 ;CAB66452.1 ;AAV48062.1 ;ΑΑΗ 24567.1;YP 041023.1;YP 186447.1;NP 372074.1 ;ZP 00385074.1;NP 390369.1;XP 591041.1;XP 588513.1 ;AAV88839.1 ;AAF42416.1 ;AAP11177.1; ZP 00238535.1;AAM38252.1;YP 153863.1;AAZ 19506.1;YP 266014.1;NP 968104.1;NP 816417.1 ;YP 255152.1;CAA12119.1;CAH89819.1;BAB14 383.1 ;BAC43679.1 ;BAB 14739.1 ;CAA21728.1; 1Y DM;ZP 00544875.1;NP 766349.1;NP 779018.1; AAB84710.1;ZP 00210813.1;ZP 00579599.1;YP 170178.1;AAX78148.1;NP 565139.1;YP 199768. 1;AAF73519.1;ZP 00303053.1;XP 511153.1;AA U37082.1 ;NP 280554.1 ;EAK93783.1 ;AAH79691. 1;AAS51535.1 ;AAH94085.1 ;YP 158939.1;NP 96 6978.1 ;CAF99528.1 ;ZP 00370459.1;ZP 0065204 5.1 ;ZP 00548066.1;ZP 00660458.1;XP 395864.2; NP 341992.1;CAF18476.1;NP 299295.1;CAA835 41.1 ;BAB65129.1 ;ZP 00373105.1;YP 180354.1; NP 220167.1;XP 427228.1;EAL28752.1;NP 011 110.1;XP 694566.1;XP 414185.1;CAE66846.1;Z P 00310271.1;CAE21313.1;CAH64402.1;XP 545 889.1 ;XP 598686.1 ;AAH37852.1 ;EAN86573.1 ;A AP98720.1;ZP 00367232.1;ZP 00063393.2;NP 6 61939.1 ;AAP05733.1 ;NP 701792.1;XP 759454.1; AAL64263.1 ;EAN86747.1 ;AAF52130.1 ;XP 3104 57.2;AAN71569.1 ;AAP56729.1 ;NP 147009.1 ;EA L86873.1;YP 076645.1;ZP 00168659.2;ZP 00598 787.1 ;AAZ13064.1 ;CAB76079.1 ;CAJ04645.1 ;ZP 00632270.1;CAE09241.1; O-acetil- homosserina sulfetorolase O-succinil- homosserina sulfetorolase O-acetil- homosserina metil- sulfetorolase O-succinil- homosserina metil- sulfetorolase (R77) transferência de metil- mercaptano em O-acetil- homosserina ou O-succinil- homosserina CAF19359 NP 737289.1;NP 939004.1;CAI37871.1;NP 9623 91.1 ;NP 217857.1;YP 119808.1;ZP 00411842.1; ZP 00381377.1;EAM75402.1;YP 062728.1;AAP2 1657.1;ZP 00547645.1;ZP 00293095.1;ZP 00570 235.1;ZP 00570237.1;AAK80727.1;YP 146137.1; ZP 00504479.1 ;NP 464123.1;NP 469947.1;YP 0 13229.1;YP 173935.1;BAB06322.1;NP 623710.1; AA077494.1;ZP 00388850.1;AAV62566.1;YP 0 76611.1;ZP 00526270.1;NP 693970.1;YP 098691 . 1 ;AAP51117.1 ;CAH07057.1 ;YP 252508.1;YP 00 1801.1;NP 785969.1;AAN49261.1 ;ZP 00656265. 1;NP 696109.1;NP 266229.1;ZP 00382492.1;AA P21659.1 ;ZP 00319952.1 ;AAN58864.1 ;CAA7173 2.1 ;ZP 00064071.1;ZP 00358038.1;ZP 00499571 .1;ZP 00576077.1 ;EAM27331.1 ;YP 133082.1;ZP 00629666.1;ZP 00217525.1;NP 887601.1;AAN6 8137.1;ZP 00107219.1;ZP 00462048.1;NP 25371 2.1;ZP 00551474.1;ZP 00141499.1;NP 952236.1; ZP 00506665.1;YP 076510.1;ZP 00160457.2;NP 228690.1;YP 242180.1;YP 269261.1;NP 63841 5.1;NP 797008.1;ZP 00208451.1 ;AAL76402.1;ZP 00595723.1;ZP 00512971.1;CAE10117.1;ZP 00 242385.1;ZP 00536577.1;AAR38305.1;NP 94810 6.1 ;ZP 00398593.1;ZP 00654525.1;ZP 00531189 .1;NP 946915.1;NP 930734.1;NP 661504.1;ZP 0 0005143.1 ;NP 841729.1 ;CAE21050.1 ;CAE07366. 1;YP 047868.1;CAD78524.1;ZP 00283981.1 ;NP 767875.1;NP 949925.1;YP 221536.1;AAL52347. 1 ;AAP99844.1 ;AAN29722.1 ;ZP 00589323.1;ZP 00624467.1 ;CAG81467.1 ;ZP 00562640.1 ;EAN27 962.1;ZP 00309879.1;ZP 00556008.1;YP 171853 .1;ZP 00170753.1;YP 160629.1;EA018327.1;YP _156395.1;ZP 00151182.1;ZP 00395964.1;CAG3 7235.1;ZP 00410921.1;ZP 00269047.1 ;AAM0609 4.1 ;NP 772921.1;NP 892760.1;CAG73733.1;NP 766885.1 ;EAL85880.1 ;XP 761728.1 ;AA077030.1 ;AAA61543.1;ZP 00169873.1;ZP 00638540.1;ZP 00527619.1 ;AAV94718.1 ;EAM43226.1 ;ZP 0066 1517.1 ;CAD 15264.1 ;ZP 00268814.1;ZP 0062030 3.1 ;ZP 00634556.1 ;AAF10450.1 ;EAA59015.1 ;AA V31651.1;NP 953471.1 ;NP 771607.1;EAA67392. 1 ;AAQ59608.1 ;EAM75775.1 ;NP 949587.1;ZP 00 595151.1;NP 716721.1;ZP 00534594.1;ZP 00305 184.1;ZP 00592653.1;AAK02822.1;ZP 00269954 .1;ZP 00543698.1;ZP 00552392.1;CAH09043.1;E AA56840.1 ;CAA22286.1 ;ZP 00650573.1 ;CAC45 827.1;NP 108558.1;NP 531944.1;YP 004383.1 ;Y P 144026.1;YP 266440.1;NP 693560.1;YP 2576 42.1;ZP 00134047.2;ZP 00581547.1;CAB99179.2 ;YP 159786.1 ;EAM73042.1 ;CAG36429.1 ;AA035 727.1;YP 022333.1;ZP 00239222.1;ZP 00269964 • 1;YP 086673.1;NP 981827.1;AAP12268.1;AAP7 7233.1;YP 039397.1;ZP 00208374.1;EAN06205. 1 ;CAE10904.1 ;AAK99898.1 ;YP 179865.1;ZP 00 387486.1 ;CAH00339.1 ;CAB73713.1 ;CAC34631.1 ;ZP 00370704.1;NP 013406.1;AAV47483.1;ZP 0 0489181.1 ;AAS51890.1 ;NP 947707.1 ;EAK94256. 1 ;CAG88952.1 ;AAF01454.1 ;AAF01453.1 ;NP 281 028.1 ;CAG58594.1 ;EAM46849.1 ;AAV47781.1 ;ZP 00566262.1;ZP 00402706.1;YP 234755.1;ZP 00 334304.1;YP 259190.1;NP 793584.1;EA018747. 1;ZP 00473306.1;AA036990.1;NP 840779.1;ZP 00333201.1 ;ZP 00265576.1;NP 251797.1;ZP 005 35298.1 ;ZP 00204956.1; 1 Y4I;AAC83351.1 ;AAO 46884.1 ;AAN32868.1 ;YP 074661.1 ;BAC02724.1; ZP 00348658.1;ZP 00593187.1;NP 947695.1;AA V68695.1 ;AAK29460.1 ;ZP 00168139.2;YP 1149 00.1 ;AAL95612.1 ;NP 972801.1;YP 046919.1;YP 200029.1;ZP 00317087.1;ZP 00280956.1;ZP 00 416859.1;YP 111696.1;ZP 00502001.1 ;ZP 00466 954.1 ;AAR38140.1 ;ZP 00448460.1 ;NP 950100.1; ZP 00395704.1;ZP 00457013.1;NP 717420.1;ZP 00464307.1 ;AAQ65554.1 ;ZP 00213081.1 ;AAQ6 0395.1;YP 159732.1;ZP 00637444.1;ZP 0042525 8.1;ZP 00643937.1 ;BAB55900.1 ;ZP 00048836.2; NP 767745.1;YP 268443.1;ZP 00583389.1;ZP 0 0396707.1;ZP 00636123.1;AAV94639.1;EAN050 79.1 ;AAF 11730.1 ;NP 623174.1;ZP 00587584.1;A AZ18645.1 ;CAE 10114.1 ;ZP 00303125.1;ZP 0062 3125.1 ;AAK78087.1 ;ZP 00655219.1 ;CAA09983.1 ;ZP 00624529.1 ;AAK24209.1 ;AAL52798.1 ;AAB 03240.1;ZP 00542518.1;NP 531136.1 ;AAK25130 . 1 ;AAN66932.1 ;P13254;ZP 00400550.1 ;BAB0451 8.1;YP 221092.1;NP 945724.1;NP 970501.1;AA U37954.1;NP 981084.1;1GC2;ZP 00548195.1;NP 635109.1 ;CAA04124.1 ;ZP 00236112.1;YP 0047 65.1;ZP 00055526.1;ZP 00207149.1;AAM05915. 1;YP 085976.1;1E5F;ZP 00308639.1;ZP 005786 07.1 ;EAN29492.1 ;YP 144422.1; ZP 00507181.1; piruvato cinase (RI 9) catalisa a etapa de fosfoenolpiruv ato para YP_226326 piruvato formil tetraidrofoliatode sformilase (R79) Degrada a Formil THF para formiato e tetraidrofoliato ADD13491 fosfoenol- piruvato carboxicinase (GTP) (R35) converte oxaloacetato para Fosfoenol- piruvato NP_602055

Cultivo de Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum -

Meios e Condições de Cultura

A pessoa habilitada na técnica está familiarizada com o cultivo de microorganismos comuns tais como C. glutamicum e E. coli. Assim, uma instrução geral será dada abaixo como para o cultivo de C. glutamicum. A informação correspondente pode ser encontrada em livros texto padrão para o cultivo de E. coli.

As cepas de E. coli são rotineiramente cultivadas em caldos MB e LB, respectivamente (Follettie, M. T., Peoples, O., Agoropoulou, C. e Sinskey, A J. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103). O meio mínimo para E. coli é M9 e MCGC modificados (Yoshihama, M., Higashiro, K., Rao, Ε. A., Akedo, M., Shanabruch, W G., Follettie, M. T., Walker, G. C. e Sinskey, A. J. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507), respectivamente. Glicose pode ser adicionada a uma concentração final de 1%. Os antibióticos podem ser adicionados nas seguinte quantidades (microgramas por mililitro): ampicilina, 50; canamicina, 25; ácido nalidíxico, 25. Aminoácidos, vitaminas e outros suplementos podem ser adicionados nas seguintes quantidades: metionina, 9,3 mM; arginina, 9,3 mM; histidina, 9,3 mM; tiamina, 0,05 mM. As células de E. coli são rotineiramente cultivadas a 37°C, respectivamente. As Corynebacteria geneticamente modificadas são tipicamente

cultivadas em meios de cultivo sintético ou natural. Vários meios de cultivo diferentes para Corynebaeteria são tanto bem conhecidos quanto facilmente disponíveis (Lieb et ai. (1989) AppL MicrobioL BiotechnoL, 32: 205-210; von der Osten et ai. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patente DE 4.120.867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et ai., eds. Springer-Verlag).

Estes meios consistem de uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e elementos traço. As fontes de carbono preferidas são açúcares, tais como mono-, di- ou polissacarídeos. Por exemplo, glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose servem como fontes de carbono muito boas.

Também é possível fornecer açúcar ao meio por intermédio de compostos complexos tais como melaços ou outros subprodutos do refino de açúcar. Também pode ser vantajoso fornecer misturas de fontes de carbono diferentes. Outras fontes de carbono possíveis são álcoois e ácidos orgânicos, tais como metanol, etanol, ácido acético ou ácido láctico. As fontes de nitrogênio são usualmente orgânicas ou inorgânicas compostos de nitrogênio ou materiais que contêm estes compostos. As fontes de nitrogênio exemplares incluem gás de amônia ou sais de amônia, tais como NH4Cl ou (NH4)2SO4, NH4OH, nitratos, uréia, aminoácidos ou fontes complexas de nitrogênio como líquido da maceração do milho, farinha de feijão de soja, proteína de feijão de soja, extrato de levedura, extrato de carne e outras.

A superprodução de metionina é possível usando fontes de enxofre diferentes. Sulfatos, tiossulfatos, sulfitos e também fontes de enxofre mais reduzidas como H2S e sulfetos e derivados podem ser usados. Também fontes de enxofre orgânicas como metil mercaptana, tioglicolatos, tiocianatos e tiouréia, aminoácidos contendo enxofre como cisteína e outros compostos contendo enxofre podem ser usados para a obtenção da produção de metionina eficiente. Formiato também pode ser possível como um suplemento como são outras fontes de Cl tais como metanol ou formaldeído). Particularmente adaptados são metanotiol e seus dímeros de sulfeto de dimetila. Os compostos de sal inorgânicos que podem ser incluídos nos meios incluem os sais de cloreto, fósforo ou sulfato de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro. Compostos queladores podem ser adicionados ao meio para manter os íons metálicos em solução. Os compostos queladores particularmente úteis incluem diidroxifenóis, como catecol ou protocatecuato ou ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico. É típico para os meios conter também outros fatores de crescimento, tais como vitaminas ou promotores de crescimento, os exemplos dos quais incluem biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Os fatores de crescimento e sais freqüentemente originam de componentes de meios complexos tais como extrato de levedura, melaços, líquido da maceração do milho e outras. A composição exata dos compostos dos meios depende fortemente do experimento imediato e é individualmente decidido para cada caso específico. Informação a cerca da otimização dos meios é disponível no livro texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Method (Eds. Ρ. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN O 19 963577 3). Também é possível selecionar meios de cultivo de fontes comerciais, como padrão 1 (Merck) ou BHI (infusão cardíaca granular, DIFCO) ou outras.

Todos os componentes do meio devem ser esterilizados, por aquecimento (20 minutos a 1,5 bar e 121°C) ou pela filtração estéril. Os componentes podem ser esterilizados juntos ou, se necessário, separadamente.

Todos os componentes do meio podem estar presentes no início do cultivo ou estes podem ser opcionalmente adicionados continuamente ou por batelada. As condições de cultura são definidas separadamente para cada experimento.

A temperatura deve estar em uma faixa entre 15°C e 45°C. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o experimento. O pH do meio pode estar na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente em torno de 7,0 e podem ser mantidos pela adição de tampões ao meio. Um tampão exemplar para este propósito é um tampão de fosfato de potássio. Os tampões sintéticos tais como MOPS, HEPESj ACES e outros podem ser alternativa ou simultaneamente usados. Também é possível manter um pH da cultura constante através da adição de NaOH ou NH4OH durante o crescimento. Se os componentes de meio complexo tais como extrato de levedura são utilizados, a necessidade quanto a tampões adicionais pode ser reduzida, devido ao fato de que muitos compostos complexos têm altas capacidades de tampão. Se um fermentador é utilizado para cultivar os microorganismos, o pH também pode ser controlado usando amônia gasosa.

O tempo de incubação está usualmente em uma faixa de várias horas a vários dias. Este tempo é selecionado de modo a permitir a quantidade máxima de produto para acumular no caldo. Os experimentos de cultivo divulgados podem ser realizados em uma variedade de frascos, tais como placas microtituladoras, tubos de vidro, frascos de vidro ou fermentadores de vidro ou metal de tamanhos diferentes. Para triar um grande número de clones, os microorganismos devem ser cultivados em placas microtituladoras, tubos de vidro ou frascos agitados, com ou sem defletores. Preferivelmente frascos agitados de 100 ml são usados, cheios com 10% (em volume) dos meio de cultivo requeridos. Os frascos devem ser agitados em um agitador rotativo (amplitude 25 mm) usando uma faixa de velocidade de 100 a 300 rpm. As perdas por evaporação podem ser diminuídas pela manutenção de uma atmosfera úmida; alternativamente, uma correção matemática para as perdas por evaporação deve ser realizada. Se clones geneticamente modificados são testados, um clone

de controle não modificado ou um clone de controle contendo o plasmídeo básico sem qualquer inserto também devem ser testados. O meio é inoculado a uma ODóOO de 0,5 a 1,5 usando células cultivados em placas de ágar, tais como placas CM (10 g/l de glicose, 2,5 g/l de NaCl, 2 g/l de uréia, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l extrato de levedura, 5 g/l extrato de carne, 22 g/l de NaCl, 2 g/l de uréia, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne, 22 g/l de ágar, pH 6,8 com NaOH 2 M) que foram incubados a 30°C.

A inoculaçao dos meios é realizada pela introdução de uma suspensão salina de células de C glutamicum de placas CM ou adição de uma pré cultura líquida desta bactéria.

A invenção será agora ilustrada por meio de vários exemplos. Estes exemplos entretanto não são de nenhum modo intencionados a limitar a invenção de nenhum modo. Exemplos

As formas de realização dentro do relatório descritivo

fornecem uma ilustração das formas de realização nesta divulgação e não

devem ser interpretadas como limitando o seu escopo. O técnico habilitado

facilmente reconhece que muitas outras formas de realização são abrangidas

por esta divulgação. Todas as publicações e patentes citadas e seqüências

identificadas pelos números de referência de acesso ou bases de dados nesta

divulgação são incorporados por referência em sua totalidade. Até o grau em

que o material incorporado por referência contradiga ou seja incompatível

com o presente relatório descritivo, o presente relatório descritivo substituirá

qualquer um de tais materiais. A citação de quaisquer referências aqui não é

uma admissão de que tais referências sejam técnica anterior à presente divulgação.

A menos que de outro modo indicado, todos os números que expressem quantidades de ingredientes, cultura de célula, condições de tratamento e assim por diante usados no relatório descritivo, incluindo s reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de." Conseqüentemente, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas procuradas ser obtidas pela presente invenção.

A menos que de outro modo indicado, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser entendido referir-se a cada elemento na série. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão ou serão capazes de averiguar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as formas de realização específicas da invenção aqui descrita. Tais equivalentes são intencionados a serem abrangidos pelas seguintes reivindicações

A) O prognóstico teórico de fluxo metabólico ótimo para um organismo com eficiência aumentada de síntese de metionina Construção das redes metabólicas para C. glutamicum e E. coli

Rede de C. glutamicum. A rede metabólica básica da C. glutamicum do tipo selvagem foi ajustada para a utilização de glicose e sulfato como fontes de carbono e enxofre, respectivamente (http://www.genome.jp/ kegg/metabolism.html). Isto inclui a captação de glicose por intermédio de um sistema de fosfotransferase (PTS), glicólise (EMP), a via da pentose fosfato (PPP), ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), anaplerose e cadeia respiratória. A assimilação de sulfato compreende a captação e conversão subseqüente em sulfeto de hidrogênio (Schiff (1979), Ciba Found Symp, 72, 49-69). No modelo estequiométrico a via da assimilação de sulfato foi agrupado em 2 reações: a redução de sulfato para sulfito requerendo 2 ATP e 1 NADPH e a redução de sulfite a sulfeto demandando 3 NADPH. O modelo completo consistiu de 59 metabólitos internos e 8 externos. Os metabólitos externos compreendendo substratos (glicose, sulfato, amônia, oxigênio) e produtos (biomassa, CO2, metionina, glicina). A glicina foi considerada como metabólito externo, porque uma vez formado como subproduto o mesmo não pode ser reutilizado pela C. glutamicum (http://www.genome.jp/kegg/ metabolism.html). No total, a rede metabólica contém 62 reações metabólicas, fora aquelas 19 que foram consideradas reversíveis. Para a produção de ATP na cadeia respiratória uma razão P/O de 2 (para NADH) e 1 (para FADH) foi assumida (Klapa et aL (2003) Eur. J. Biochem., 27017, 3525-3542).. A demanda de precursor para a formação de biomassa foi tirada da literatura (Marx et ai. (1996) Biotechnol. Bioeng., 49 (2), 111-129). A demanda de sulfato e amônia para a biomassa foi calculada a partir do teor dos aminoácidos diferentes na biomassa. O modelo para C. glutamicum é mostrado na Fig. 1.

Rede de E. coli. A construção modelo para o metabolismo central do tipo selvagem de E. coli foi fundamentado na literatura (Carlson et ai. (2004), Biotechnol. Bioeng., 851, 1-19). e nas bases de dados (http://www. genome.jp/kegg/metabolism.html). O modelo para o cultivo e produção de metionina em glicose e sulfato compreendeu a captação de PTS de glicose, ciclos EMP, PPP, TCA, anaplerose, cadeia respiratória e assimilação de sulfato. A rede metabólica conteve 64 reações metabólicas, das quais 20 foram consideradas reversíveis. Glicose, sulfato, amônia e oxigênio foram considerados como substratos externos, biomassa, CO2 e metionina como produtos externos. Para a interconversão de NADH e NADPH, uma transidrogenase reversível foi considerada (Yamaguchi et aL, (1995), J. Biol. Chem., 27028, 166653-9). Entretanto, foi considerado que a E. coli ativa a homosserina por intermédio da succinilação ao invés de acetilação (R40) (Sekowska et aL (2000), J. Mol. MicrobioL Biotechnol., 22, 145-177). Além disso um sistema de clivagem de glicina foi considerado (R71, R72). Para a produção de ATP na cadeia respiratória razões P/O de 2 (para NADH) e 1 (para FADH) foram assumidos (Carlson et ai. (2004), vide supra). A demanda de precursor para a formação de biomassa foi tirada da literatura (Edwards et aL (2000); Weber et aL, (2002).

Modificações de Rede. Em outras simulações as redes estequiométricas descritas acima foram modificadas. Isto envolveu a deleção ou inserção de reações diferentes e vias potencialmente de interesse para melhorar a produção de metionina. Adicionalmente, fontes de carbono e enxofre foram variadas para investigar a sua influência sobre a produção de metionina.

Análise da via metabólica. A análise da via metabólica foi realizada usando METATOOL (Pfeiffer et ai, (1999), Bioinformatics, 153, 251-7, Schuster et ai (1999) Trends Biotechnol., 172, 53-60). A versão usada (meta4.0. l_double.exe) está disponível na internet http://www.biozentrum.uni -wuerzburg.de^ioinformatil^computmg^

/bioinformatik/redes/). Os detalhes matemáticos do algoritmo estão descritos em Pfeiffer et ai (vide supra) que é por meio deste incorporado por referência com respeito ao modo como o software METATOOL deva ser usado.

A análise da via metabólica resultou em várias centenas de modos de fluxo elementares para cada situação -investigada. Para cada um destes modos de fluxo, os rendimentos de carbono da biomassa (Yx7s) e metionina (YMet/s) foram calculados como porcentagem do carbono que entrou no sistema como substrato. Por todo o trabalho é dado em valores percentuais ((C-mol) (C-mol substrato)"1 χ 100). Conseqüentemente também co-substratos, tais como formiato ou metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila foram considerados. A análise comparativa de todos os modos elementares obtidos para um certo cenário de rede permitiu a determinação dos rendimentos máximos teóricos Yx7s, max e YMet/s, max. Resultados e Implicações do Modelo

Comparação da produção de metionina pelo C. glutamicum e E. coli

Os dois organismos- mais promissores para a produção biotecnológica de metionina são C. glutamicum e E. coli. Para avaliar o potencial destes dois organismos, a análise da via metabólica foi realizada como descrito acima.

Inicialmente as redes do tipo selvagem foram investigadas. Como mostrado para o tipo selvagem de C glutamicum e E. coli, um grande número de modos de fluxo elementares com diferentes rendimentos de carbono para a biomassa e metionina foi obtido (Figs. 2 A, B). Entre os modos observados, a maioria são modos extremos exclusivamente ligados à produção de biomassa ou metionina. Estes são dados nos dois eixos da plotagem. Além disso também os modos de fluxo com produção simultânea de biomassa e metionina resultaram. O rendimento da biomassa máxima teórica foi de 88,5% para C glutamicum e assim levemente mais baixo como encontrado para E coli com 91,7%. Ambos os organismos têm um alto potencial para produzir metionina. O rendimento de carbono teórico máximo para metionina de C. glutamicum foi de 48,6% (Fig. 2 A). A E. coli demonstra um valor significantemente mais alto de 56,2% (Fig. 2 Β). O potencial mais alto da R coli do tipo selvagem pode indicar características vantajosas de sua rede metabólica. Este aspecto foi estudado em simulações adicionais (ver abaixo).

Uma inspeção mais próxima aponta para duas reações, isto é, o

sistema de clivagem de glicina e a transidrogenase, que seriam benéficas para

a produção aumentada de metionina. Na verdade a solução ótima encontrada

para C. glutamicum do tipo selvagem está ligada à formação substancial de

glicina, que não pode ser reutilizada, ao passo que nenhuma glicina acumula

para a produção ótima de metionina pela E. coli do tipo selvagem. Com

respeito à alta demanda de 8 NADPH por metionina, também a

disponibilidade da transidrogenase para a interconversão de NADH e

NADPH em E. coli contribuiria para a eficiência mais alta observada

Para investigar ainda mais a importância destas reações para a

produção de metionina, simulações adicionais foram realizadas assumindo

modificações genéticas diferentes das redes metabólicas subjacentes (ver abaixo).

Fluxo metabólicos em C. glutamicum e E coli sob condições ótimas de 145

produção de metionina

Primeiro, as redes metabólicas de ambos organismos foram

estudadas em mais detalhes para identificar quais das vias disponíveis estão

envolvidos na produção ótima de metionina e quais vias devem ser

dispensáveis. Para este propósito, a distribuição do fluxo metabólico foi

calculado para os modos elementares ótimos de C. glutamicum e E. coli, Mo

é, o modo com rendimento de metionina teórica mais alta. Aqui todos os

fluxos são dados como valores molares relativos, normalizados para a taxa de

captação de glicose, como usualmente feito na análise de fluxo metabólico.

Observe que os fluxos (dados em mol (mol)"1 χ 100) diferem dos rendimentos

de carbono (em C-mol (C-mol)"1 χ 100) usado para descrever o desempenho

máximo. Adicionalmente, as reações dos modelos básicos (Fig. 1) que foram

inativas nos respectivos modos foram apagadas das figuras 3 e 4. A

distribuição de fluxo para a produção ótima de metionina nos dois organismos diferiram dramaticamente (Figs. 3, 4).

O fluxo ótimo para metionina em C. glutamicum foi de 58,3%. Para este propósito, a C. glutamicum exibiu uma atividade muito alta de PPP com um fluxo através das reações oxidativas do PPP de 250%. Isto é provavelmente devido à demanda para NADPH visto que 8 NADPH têm que ser fornecidas para a síntese de metionina, primariamente para a redução de enxofre. O fluxo em PPP é substancialmente mais alto do que a o fluxo de captação de glicose. A glicose 6-fosfato isomerase, funcionando na direção gliconeogenética, também significantemente contribui para o fornecimento de carbono para o PPP. O ciclo de TCA é completamente desligado, de modo que a isocitrato desidrogenase não contribua para a formação de NADPH. Adicionalmente a C. glutamicum utiliza dois ciclos metabólicos importantes. O primeiro ciclo não apenas envolve a 2-oxoglutarato e glutamato, que são interconvertidos em alto fluxo, para assimilar amônio e o usa para as reações de aminação requeridas. Estas são a própria formação de metionina e a formação de serina como doador do grupo metila para a formação de metil- THF, de modo que o fluxo através deste ciclo seja exatamente o dobro do fluxo da metionina. O segundo ciclo metabólico compreende os agrupamentos de piruvato, oxaloacetato e malato. Este exibe duas funções principais: Quase metade do CO2 perdido no PPP oxidativo reentra na rede metabólica pela fixação altamente ativa de CO2 (125% de fluxo). Adicionalmente, a combinação das três enzimas envolvidas nos ciclos atua como uma transidrogenase e interconverte NADH em NADPH (25% de fluxo). Por isto, a C glutamicum pode, em algum grau superar a falta de uma transidrogenase.

A produção ótima de metionina em E. coli resultou em um fluxo de metionina de 67,5%. Ao contrário da C. glutamicum, o PPP não foi ativo, ao passo que o ciclo da TCA mostrou um alto fluxo de quase 100%. Entretanto, o ciclo de TCA foi operando em uma maneira modificada. A etapa da succinil-CoA para succinato é ligada em ponte pela reação correspondente que produz succinato na biossíntese da metionina. De maneira interessante a produção ótima de metionina requereu atividade substancial do desvio de glioxilato (31% de fluxo). Mais significante é o fluxo enorme de 574% através da transidrogenase de NADH para NADPH. Isto enfatiza a importância desta enzima para a produção eficiente de metionina na E. coli. Como mostrado acima, produção de metionina teórica máxima cai significantemente (Fig. 2 D), quando esta enzima é deletada. Em ambos os organismos a piruvato cinase é dispensável quanto a produção ótima de metionina. Conseqüentemente, o fluxo de PEP para o piruvato é exclusivamente fornecido pelo PTS, ligado à captação de glicose. Obviamente a piruvato cinase não é requerida para a produção de ATP. O silenciamento desta enzima pode ser um alvo interessante, visto que isto limitaria o fluxo para piruvato e metabólitos de super-fluxo relacionados do ciclo de TCA.

Resumindo, a distribuição ótima de fluxo dos dois organismos foi fundamentalmente diferente. Usando-se a análise do modo de fluxo elementar com respeito à síntese de metionina, prognósticos para as

modificações genéticas podem ser obtidas que devem permitir aumentar a eficiência da síntese de metionina.

Melhorias potenciais de produção de metionina pelas modificações genéticas

Para estudar a influência de algumas reações chave em mais

detalhes, simulações adicionais com redes metabólicas modificadas foram

realizadas. A implementação de uma transidrogenase em C. glutamicum levou

a um rendimento de metionina teórica aumentada de 51.9% (Fig. 2 C). O

silenciamento da transidrogenase na E. coli fortemente diminuiu o seu

potencial para a produção de metionina (Fig. 2 D). Isto enfatiza o efeito

benéfico de uma interconversão ativa de NADH em NADPH para a produção de metionina.

A inserção do sistema de clivagem de glicina na C. glutamicum aumentou o rendimento de metionina máximo teórico para 56,5% (Fig. 2 E). Similarmente, o silenciamento do sistema de clivagem de glicina ou da transidrogenase na E coli resultou em um rendimento de metionina máximo teórico reduzido (Figs. 2 F, D). Observe que a transidrogenase também afeta o rendimento da biomassa máxima teórica. A inserção na C. glutamicum leva a um aumento, ao passo que a deleção na E coli causa uma diminuição de YX/S,max, respectivamente.

Com respeito aos rendimentos de carbono, todos os modos de fluxo foram localizados dentro de um espaço na forma de triângulo, que foi transposto da origem e os dois modos de fluxo extremos com formação de biomassa e metionina máximas, respectivamente (Figs. 2 A-F). A conexão entre os dois modos extremos aqui demonstra uma linha ótima, que dá o rendimento de metionina máximo possível sob regimes diferentes de cultivo. Todos os modos e combinações lineares de modos nesta linha representa soluções interessantes para um processo de produção. Um processo de produção real estará sempre ligado a uma certa formação de biomassa. Influência da fonte de enxofre sobre a produção de metionina

Potencialmente os efeitos positivos de modificações genéticas podem ser claramente identificados. Outras simulações foram realizadas para aumentar ainda mais a eficiência da síntese de metionina teoricamente possível. A este respeito o efeito de nutrientes alternativos foi investigado. Aqui a fonte de enxofre pode desempenhar um papel central. Os resultados obtidos são exemplificados para C. glutamicum.

A fonte de enxofre convencional é o sulfato como também aplicado na análise de via acima para o tipo selvagem. A assimilação de sulfato é, entretanto, ligado a uma alta demanda de 2 ATP e 4 NADPH. Especialmente a exigência alta para reduzir energia sugere que o estado de redução da fonte de enxofre seria um ponto crucial. Conseqüentemente, a análise da via metabólica foi realizada usando sulfato, tiossulfato e sulfeto como fontes de enxofre. Para a utilização de tiossulfato, tiossulfato redutase (Schmidt et al. (1984) vide supra, Heinzinger et al. (1995) J. Bacteriol., 177: 2813-2820, Fong et al. (1993) J. Bacteriol., 175: 6368-6371)) foi incorporado no modelo. Esta enzima permite a clivagem de tiossulfato em sulfito e sulfeto e assim reduzir a demanda global de NADPH para a produção de metionina em cerca de 25%. Deve ser mencionado que, para nosso conhecimento, o consumo de ambos os átomos de enxofre do tiossulfato não foi ainda mostrado na C. glutamicum. Uma outra possibilidade para produzir sulfeto de uma forma mais reduzida de enxofre é a chamada sulfito redutase anaeróbica (Huang et al. (1991) Journal ofBacteriology. 173(4): 1544-53).

Isto torna óbvio que a fonte de enxofre é um ponto chave que diz respeito ao rendimento de carbono teórico de um processo de produção. Comparados ao sulfato (Fig. 2 A), a utilização de fontes de enxofre alternativas significantemente aumenta o rendimento máximo teórico (Figs. 3 A, Β). O aumento de sulfato (48,6%) para tiossulfato (57,8%) para sulfeto (63,4%) de modo impressionante enfatiza o alto potencial de usar nutrientes alternativos para a produção de metionina. Além disso, o mesmo demonstra a alta importância para reduzir energia (NADPH) quanto à biossíntese de metionina ótima. Na C glutamicum NADPH é o mais produzido no PPP oxidativo e em algum grau no ciclo de TCA com uma isocitrato desidrogenase dependente de NADP. Durante o cultivo em sulfato o tipo selvagem requer 8 moles de NADPH por mol de metionina sintetizado por intermédio da sulfidrilação direta e 9 moles de NADPH por intermédio da via da transsulfurização (Hwang et al (2002), J. Bacteriol., 1845,1277-86). A rede de tiossulfato requer 6 moles de NADPH para a produção de metionina e assim 25% menos. A rede que consume sulfeto apenas requererá 50% da demanda de NADPH em sulfato. Esta redução escalonada da demanda de NADPH em 25% de cada um é ligada a um aumento escalonado de YMet/s,max de 9,2% e apenas 5,6% usando sulfeto ao invés de tiossulfato. Isto pode ser de importância no último desenvolvimento de processo como sulfeto é altamente tóxico e volátil.

Influência da fonte C} sobre a produção de metionina

Um alvo maior para a melhora de C. glutamicum para a produção de metionina é o metabolismo de Ci. A produção ótima de metionina está ligada ao acúmulo de quantidades equimolares de glicina, que normalmente não podem ser reutilizadas (Fig. 3). Como mostrado, isto pode ser superado pela implementação de um sistema de clivagem de glicina (Fig. 2 E). Uma alternativa é dada pelo uso de uma fonte de carbono além da de glicose. A este respeito, o formiato foi investigado envolvendo extensões diferentes da rede metabólica. Isto incluiu a incorporação de uma enzima que catalisa a formação de 10-formil-THF a partir de formiato, ATP e THF como descrito para muitos organismos, por exemplo, bacilos (E.C. 6.3.4.3). Adicionalmente etapas diferentes para a conversão de 10-formil-THF em metil-THF foram implementadas. Todas as reações foram agrupadas juntas em uma reação global que converte 10-formil-THF em Metileno-THF ligado à oxidação de 1 NADPH e 1 NADH. A utilização de formiato mais glicose levou a um leve aumento do rendimento de metionina teórico máximo de 3,3% quando comparado com a situação com o uso sozinho de glicose. Adicionalmente a glicina não foi mais acumulada, quando o formiato foi fornecido.

Influência do uso combinado de diferentes fontes de enxofre e Cj sobre a produção de metionina

Foi mostrado acima que tanto a fonte de C1 quanto a fonte de enxofre são importantes para maximizar o rendimento de carbono máximo teórico na produção biotecnológica de metionina. Portanto pareceu interessante observar, se os benefícios das fontes de Ci e enxofre seriam combinados. Os estudos envolveram a combinação de tiossulfato e formiato e a combinação de sulfeto e formiato. Para a combinação de tiossulfato e formiato, o rendimento de carbono teórico máximo aumentou para 63,0% (Fig. 3 D). Este rendimento é ainda levemente mais baixo do que o rendimento máximo teórico do consumo de sulfeto (fig. 3 B). Entretanto, ao contrário do sulfeto, o formiato e tiossulfato não são produtos químicos não nocivos e provavelmente ligados aos esforços reduzidos com respeito à segurança do processo. Combinando o uso de sulfeto e formiato resultou em YMet/s,max de 69,6%. Isto é 6,2% mais alto do que o rendimento máximo teórico do consumo de sulfeto sozinho.

Influência de metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila como fonte combinada para enxofre e carbono Cj sobre a produção de metionina

Uma possibilidade interessante de fornecer enxofre reduzido e resolver o problema do acúmulo de glicina é fornecido pela alimentação de metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila. É conhecido que a C. glutamicum pode produzir metanotiol sob certas condições (Bonnarme et ai. (2000), Appl. Environ. Microbiol., 6612, 5514-7). É aqui assumido que este também é capaz de consumir metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila. Também é assumido que o dímero de dissulfeto de dimetila pode ser clivado para metanotiol pelos organismos mencionados tais como mas não limitado a C. glutamicum ou E. coli. Uma reação putativa foi adicionada à rede que usa a metil-sulfidrilação direta de O-acetil-homosserina com metanotiol. Esta nova reação proposta desvia da homocisteína e diretamente produz metionina. O uso de metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila aumentaram tremendamente o rendimento máximo teórico de metionina para 83,3% (Fig. 3 F). Isto mostra que este substrato é potencialmente muito útil para a produção biotecnológica de metionina. As vias envolvidos no metabolismo de enxofre e formação de MTHF podem ser dispensáveis para a produção de metionina. Na E. coli o rendimento de metionina teórico máximo no metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila foi de 71,4% e assim substancialmente mais baixo quando comparado com a C. glutamicum. A razão é a exigência para succinil-CoA para a produção de metionina neste organismo. Isto demanda uma alta atividade do ciclo de TCA e a perda correspondente de carbono por intermédio do CO2. Em comparação com a C. glutamicum, a formação de CO2 na E. coli sob estas condições é quase duas vezes tão alta. Finalmente o rendimento máximo teórico pode ser melhorado ainda mais pela integração de uma transidrogenase no modelo da C. glutamicum com metabolismo de metanotiol. Sob estas condições a C. glutamicum seria capaz de produzir metionina a partir de metanotiol e seus dímeros de dissulfeto de dimetila e

glicose com um rendimento de carbono máximo de 85,5%.

A análise acima tem assim mostrado que particularmente o uso de glicina ou fontes alternativas do grupo metila na síntese de metionina oferece um potencial importante para otimizar a produção de metionina na C. glutamicum. Além disso, pode ser mostrado que a síntese de metionina na E. coli é mais dependente de uma transidrogenase ativa do que na C. glutamicum. Β) Modificação genética de C. glutamicum para aumentar a

eficiência da síntese de metionina

A meta dos seguintes experimentos é aplicar as implicações

das descobertas teóricas acima para a obtenção de um organismo de C.

glutamicum com eficiência aumentada da síntese de metionina

Material e Métodos

Os protocolos para os métodos gerais podem ser encontrados

em Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005) eds.: L. Eggeling, M.

Bott., Boca Raton5 CRC Press, em Martin et al (Biotechnology (1987) 5,

137-146 ), Guerrero et al (Gene (1994), 138, 35-41), Ttaisiya und Morinaga

(Biotechnology (1988), 6, 428-430), Eikmanns et al. (Gene (1991), 102, 93-

98), EP 0 472 869, US 4.601.893, Schwarzer e Pühler (Biotechnology (1991),

9, 84-87, Reinscheid et al (Applied and Environmental Microbiology (1994),

60, 126-132), LaBarre et al (Journal of Bacteriology (1993), 175, 1001-

1007), WO 96/15246, Malumbres et al (Gene (1993), 134, 15-24), na JP-A-

10-229891, em Jensen und Hammer (Biotechnology e Bioengineering (1998),

58, 191-195), Makrides (Microbiological Reviews (1996), 60, 512-538) e em

livros texto bem conhecidos de genética e biologia molecular.

Cepas, Meios e Plasmídeos

As cepas podem ser tiradas por exemplo, da seguinte lista:

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,

Corynebacterium melassecola ATCC 17965,

Brevibacterium flavum ATCC 14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 ou cepas que

tenham sido derivadas destas tais como Corynebacterium glutamicum KFCC10065 DSM 17322 ou

Corynebacterium glutamicum ATCC21608 Tecnologia de DNA Recombinante Protocolos podem ser encontrados em: Sambrookj J., Fritsch,

E. F. e Maniatisi T., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 e Handbook on Corynebacterium glutamicum (2005) eds. L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press.

Quantificação de aminoácidos e intermediários de metionina.

A análise é feita pela HPLC (Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Alemanha) com um cartucho de proteção e uma coluna Synergi 4 μηι (MAX-RP 80 Â, 150 * 4,6 mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemanha). Antes da injeção os analitos são derivatizados usando o- ftaldialdeído (OPA) e mercaptoetanol como agente redutor (2-MCE). Os grupos sulfidrila adicionais são bloqueados com ácido iodoacético. A separação é realizada em uma taxa de fluxo de 1 ml/min usando 40 mM de NaH2PO4 (eluente A, pH = 7,8, ajustado com NaOH) como fase polar e uma mistura de metanol e água (100 / 1) como fase não polar (eluente Β). O seguinte gradiente é aplicado: início 0% de B; 39 min 39% de B; 70 min 64% de B; 100% de B por 3,5 min; 2 min de 0% de B para equilíbrio. A derivatização na temperatura ambiente é automatizada como descrito abaixo. Inicialmente 0,5 μΐ de 2-MCE a 0,5% em bicina (0,5 M, pH 8,5) são misturados com 0,5 μΐ de extrato celular. Subseqüentemente 1,5 μΐ de ácido iodoacético 50 mg/ml em bicina (0,5 M5 pH 8,5) é adicionado, seguido pela adição de 2,5 μΐ de tampão de bicina (0,5 M, pH 8,5). A derivatização é feita pela adição de 0,5 μΐ de reagente OPA a 10 mg/ml dissolvido em 1/45/54 v/v/v de 2-MCE/MeOH/bicina (0,5 M, pH 8,5). Finalmente a mistura é diluída com 32 μΐ de H2O. Entre cada uma das etapas de pipetagem acima existe um tempo de espera de 1 min. Um volume total de 37,5 μΐ é depois injetado na coluna. Observe, que os resultados analíticos podem ser significantemente melhorados, se a agulha do auto amostrador for periodicamente limpa durante (por exemplo, dentro do tempo de espera) e depois da preparação da amostra. A detecção é realizada por um detetor de fluorescência (340 nm de excitação, emissão 450 nm, Agilent, Waldbronn, Alemanha). Para a quantificação o ácido α-amino butírico (ABA) foi como padrão interno

Definição de protocolo de recombinação

No seguinte será descrito como uma cepa de C. glutamicum com eficiência aumentada de produção de metionina pode ser construída implementando as descobertas dos prognósticos acima. Antes a construção da cepa é descrita, uma definição de um evento/protocolo de recombinação é

dada que será usada no seguinte.

iiCampbell in" como aqui usado, refere-se a um transformante

de uma célula hospedeira original em que uma molécula de DNA de filamento duplo circular inteira (por exemplo um plasmídeo) integrou em um cromossoma por um único evento de recombinação homóloga (um evento cross in) e que eficazmente resulta na inserção de uma versão linearizada da dita molécula de DNA circular em uma primeira seqüência de DNA do cromossoma que é homóloga a uma primeira seqüência de DNA da dita molécula de DNA circular. iiCampbelled in" refere-se à seqüência de DNA linearizada que foi integrada no cromossoma de um transformante iiCampbell in". Um uCampbell in" contém uma duplicação da primeira seqüência de DNA homóloga, cada cópia da qual inclui e circunda uma cópia do ponto de cruzamento da recombinação homóloga. O nome vem do Professor Alan Campbell, quem primeiro propôs este tipo de recombinação.

iiCampbell out" como aqui usado, refere-se a uma célula descendente de um transformante iiCampbell in", em que um segundo evento de recombinação homóloga (um evento de cross out) ocorreu entre uma segunda seqüência de DNA que está contida no DNA linearizado inserido do DNA iiCampbelled iri" e uma segunda seqüência de DNA de origem cromossômica, que é homóloga à segunda seqüência de DNA do dito inserto linearizado, o segundo evento de recombinação que resulta na deleção (descarte) de uma porção da seqüência de DNA integrada, mas, importantemente, também resultando em uma porção (isto podem ser tão pouco quanto uma única base) do Campbelled integrado no DNA remanescente no cromossoma, tal que comparados com a célula hospedeira original, a célula "Campbell ouf contém uma ou mais mudanças intencionais no cromossoma (por exemplo, uma única substituição de base, substituições de base múltipla, inserção de um gene ou seqüência de DNA heterólogos, inserção de uma cópia ou cópias adicionais de um gene homólogo ou um gene ou inserção homólogos modificados de uma seqüência de DNA que compreende mais do que um destes exemplos anteriormente mencionadas

listados acima).

Uma célula ou cepa iiCampbell out são usualmente, mas não necessariamente, obtidas por uma contra-seleção contra um gene que está contido em uma porção (a porção que é desejada ser descartada) da seqüência de DNA uCampbelled irí\ por exemplo o gene sacB de Bacillus subtilis, que é letal quando expressado em uma célula que é cultivada na presença de cerca de 5% a 10% de sacarose. Com ou sem uma contra-seleção, uma célula iiCampbell out desejada pode ser obtida ou identificada pela triagem para a célula desejada, usando qualquer fenótipo triável, tais como, mas não limitada à, morfologia de colônia, cor da colônia, presença ou ausência da resistência a antibiótico, presença ou ausência de uma dada seqüência de DNA pela reação da cadeia da polimerase, presença ou ausência de uma auxotrofia, presença ou ausência de uma enzima, hibridização de ácido nucleico da colônia, triagem de anticorpo, etc. Os termos iiCampbell in" e iiCampbell out" também podem ser usados como verbos em vários tempos de verbo para se referir ao método

ou processo descrito acima.

É entendido que os eventos de recombinação homóloga que

levam a um iiCampbell irè" ou "Campbell ouf podem ocorrer em uma faixa

de bases de DNA dentro da seqüência de DNA homóloga e visto que as

seqüências homólogas será idêntico entre si por pelo menos parte desta faixa,

não é usualmente possível especificar exatamente onde o evento de

cruzamento ocorreu. Em outras palavras, não é possível especificar

precisamente qual seqüência foi originalmente do DNA inserido e qual foi

originalmente do DNA cromossômico. Entretanto, a primeira seqüência de

DNA homóloga e a segunda seqüência de DNA homóloga são usualmente

separadas por uma região de não homologia parcial e é esta região de não

homologia que permanece depositada em um cromossoma da célula

iiCampbell ouf.

Pela natureza prática, na C. glutamicum, a primeira e segunda

seqüências de DNA homólogas típicas são de pelo menos cerca de 200 pares de base no comprimento e podem ser de até vários milhares de pares de base no comprimento, entretanto, o procedimento pode ser feito para funcionar com seqüências mais longas ou mais curtas. Por exemplo, um comprimento para as primeira e segunda seqüências homólogas podem variar de cerca de 500 a 2000 bases e a obtenção de um iiCampbell ouf a partir de um iiCampbell inn é facilitada dispondo-se a primeira e segunda seqüências homólogas para serem aproximadamente do mesmo comprimento, preferivelmente com uma diferença de menos do que 200 pares de base e o mais preferivelmente com a mais curta das duas sendo de pelo menos 70% do comprimento da mais longa em pares de base. Construção da cepa que produz metionina

Exemplo l:Geração da cepa de partida que produz metionina

cepa M2014 A cepa ATCC 13032 de C. glutamicum foi transformada com DNA A (também aludido como pH273) (SEQ ID NO: 1) e iiCampbeIled in» para produzir uma cepa iiCampbell irí\ A Figura 6 mostra um esquemático do plasmídeo pH273. A cepa uCampbell in" foi depois iiCampbelled ouf para produzir uma cepa iiCampbell ouf\ M440, que contém um gene que codifica uma enzima de homosserina desidrogenase resistente à retroalimentação (Iiomfbr)- A proteína de homosserina desidrogenase resultante incluiu uma mudança de aminoácido onde S393 foi mudado para F393 (aludido como

Hsdh S393F).

A cepa M440 foi subseqüentemente transformada com DNA B (também aludido como pH373) (SEQ ID NO: 2) para produzir uma cepa iiCampbell in". A Figura 6 representa um esquemático de plasmídeo pH373. A cepa iiCampbell iri" foi depois uCampbelled ouf para produzir uma cepa iiCampbell ouf\ M603, que contém um gene que codifica uma enzima de aspartato cinase resistente à retroalimentação (Askfbr) (codificada pela IysC). Na proteína de aspartato cinase resultante, T311 foi mudado para 1311

(aludido como LysC 13111).

Foi descoberto que a cepa M603 produziu cerca de 17,4 mM

de lisina, enquanto que a cepa ATCC13032 não produziu nenhuma

quantidade mensurável de lisina. Adicionalmente, a cepa M603 produziu

cerca de 0,5 mM de homosserina, comparada com nenhuma quantidade

mensurável produzida pela cepa ATCC13032, como resumido na Tabela 3.

Tabela 3: Quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e

lisina produzidas pelas cepas ATCC13032 e M603

Cepa

ATCCl 3032 M603

Homosserina (mM)

0,0 0,5

O-acetil homosserina (mM) M.

0,7

Metionina (mM)

0,0

0,0

Lisina (mM)

0,0 17,4

A cepa M603 foi transformada com DNA C (também aludido como pH304, um esquemático da qual está representado na Figura 6) (SEQ ID NO: 3) para produzir uma cepa iiCampbeII irí\ que foi depois iiCampbeIled ouf para produzir uma cepa iiCampbell ouf\ M690. A cepa M690 conteve um promotor PgroES a montante do gene metH (aludido como P497 metH). A seqüência do promotor P497 é representada na SEQ ID NO: 11. A cepa M690 produziu cerca de 77,2 mM de lisina e cerca de 41,6 mM de homosserina, como mostrado abaixo na Tabela 4.

Tabela 4: Quantidades de homosserina, O-acetil homosserina, metionina e lisina produzidos pelas cepas M603 e M690

Cepa

M603 M690

Homosserina (mM)

0,5 41,6

O-acetil homosserina (mM)

0,7 0,0

Metionina

(mM)

0,0

0,0

Lisina (mM)

17,4 77,2

A cepa M690 foi subseqüentemente mutagenizada como segue: uma cultura durante a noite de M690, cultivada em meio BHI (BECTON DICKINSON), foi lavada em 50 mM de tampão de citrato pH 5,5, tratada por 20 min a 30°C com N-metil-N-nitrosoguanidina (10 mg/ml em 50 mM de citrato pH 5,5). Depois do tratamento, as células foram mais uma vez lavadas em tampão de citrato a 50 mM pH 5,5 e plaqueadas em um meio contendo os seguintes ingredientes: (todas as quantidades mencionadas são calculadas para 500 ml de meio) 10 g de (NH4)2SO4; 0,5 g de KH2PO4; 0,5 g de K2HPO4; 0,125 g de MgSO4JH2O; 21 g de MOPS; 50 mg de CaCl2; 15 mg de ácido protocatecúico; 0,5 mg de biotina; 1 mg de tiamina; e 5 g/l de D,L-etionina (SIGMA CHEMICALS, CATÁLOGO #E5139), ajustado ao pH 7,0 com KOH. Além disso o meio conteve 0,5 ml de uma solução de metal traço composta de: 10 g/l de FeSO4JH2O; 1 g/l de MnSO4*H2O; 0,1 g/l de ZnS04*7H20; 0,02 g/l de CuSO4; e 0,002 g/l de NiCl2*6H20, todos dissolvidos em HCl 0,1 Μ. O meio finai foi esterilizado pela filtração e ao meio, 40 ml de solução de glicose a 50% estéril (40 ml) e ágar estéril a uma concentração final de 1,5% foram adicionados. O meio contendo ágar final foi vertido em placas de ágar e foi rotulado como meio de etionina mínimo. As cepas mutagenizadas foram espalhadas sobre as placas (etionina mínima) e incubada por 3 a 7 dias a 30°C. Os clones que crescem no meio foram isoladas e novamente riscadas no mesmo meio de etionina mínimo. Diversos clones foram selecionados para a análise de produção de metionina. A produção de metionina foi analisada como segue. As cepas

foram cultivadas em meio de CM-ágar por dois dias a 30°C, que conteve: 10 g/l de D-glicose, 2,5 g/l de NaCl; 2 g/l de uréia; 10 g/l de Bacto Peptona (DIFCO); 5 g/l de Extrato de Levedura (DIFCO); 5 g/l de Extrato de Carne Bovina (DIFCO); 22 g/l de Ágar (DIFCO); e que foi autoclavado por 20 min

a cerca de 12PC.

Depois que as cepas foram cultivadas, as células foram

separadas por raspagem e recolocadas em suspensão em NaCl 0,15 M. Para a cultura principal, uma suspensão de células raspadas foi adicionada a uma OD de partida de 600 nm em cerca de 1,5 a 10 ml de Meio II (ver abaixo) junto com 0,5 g de CaCO3 sólido e autoclavado (RIEDEL DE HAEN) e as células foram incubadas em um frasco de agitação de 100 ml sem defletores por 72 h em uma plataforma de agitação orbital em cerca de 200 rpm a 30°C. O Meio II conteve: 40 g/l de sacarose; 60 g/l de açúcar total de melaços (calculado quanto ao teor de açúcar); 10 g/l de (NH4)2SO4; 0,4 g/l de MgS04*7H20; 0,6 g/l de KH2PO4; 0,3 mg/l de tiamina*HCl; 1 mg/l de biotina; 2 mg/l de FeSO4; e 2 mg/l de MnSO4. O meio foi ajustado ao pH 7,8 com NH4OH e autoclavado a cerca de 121°C por cerca de 20 min). Depois da autoclavagem e esfriamento, vitamina B12 (cianocobalamina) (SIGMA CHEMICALS) foi adicionada a partir de uma solução de estoque estéril por filtração (200 Mg/ml)

a um concentração final de 100 μg/l.

As amostras foram tiradas do meio e ensaiadas quanto ao teor

de aminoácido. Os aminoácidos produzidos, incluindo metionina, foram determinados usando o método do aminoácido Agilent em um Sistema de HPLC Agilent 1100 Série LC. (AGILENT). Uma derivatização de pré coluna

10

15

20

da amostra com orto-ftalaldeído permitiu a quantificação de aminoácidos produzidos depois da separação em uma coluna Hypersil AA (AGILENT).

Os clones que mostraram um título de metionina que foi pelo menos duas vezes que em M690 foram isolado. Um de tais clones, usados em outros experimentos, foi denominado Ml 197 e foi depositado em 18 de maio de 2005, na coleção de cepa DSMZ como cepa número DSM 17322. A produção de aminoácido por esta cepa foi comparada com aquela pela cepa M690, como resumido abaixo na Tabela 5.

Tabela 5: Quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e lisina produzidos pelas cepas M690 e Ml 197

Cepa

M690

M1179

Homosserina (mM)

41,6

26,4

O-acetil- homosserina (mM)

0,0

1,9

Metionina

(mM)

0,0

0,7

Lisina (mM)

77,2

79,2

A cepa Ml 197 foi transformada com DNA F (também aludido como pH399, um esquemático do qual é representado na Figura 7) (SEQ ID NO: 4) para produzir uma cepa iiCampbell irí\ que foi subseqüentemente iiCampbelled ouf para produzir a cepa M1494. Esta cepa contém uma mutação no gene para a homosserina cinase, que resulta em uma mudança de aminoácido na enzima de homosserina cinase resultante de T190 a A190 (aludido como HskT190A). A produção de aminoácido pela cepa M1494 foi comparada com a produção pela cepa Ml 197, como resumido abaixo na

Tabela 6.

Tabela 6: Quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e lisina produzidas pelas cepas Ml 197 e M1494

Cepa

Ml 197 M1494

Homosserina (mM)

26,4 18,3

O-acetil- homosserina (mM)

1,9 0,2

Metionina (mM)

0,7 2,5

Lisina

(mM)

79,2 50,1

A cepa M1494 foi transformada com DNA D (também aludido como pH484, um esquemático da qual é mostrado na Figura 7) (SEQ ID NO: 5) para produzir uma cepa ilCampbell irí\ que foi subseqüentemente uCampbelled ouf para produzir a cepa M1990. A cepa M1990 super- expressa um alelo metY usando tanto um promotor groES quanto um promotor EFTU (fator de alongamento Tu) (aludido como P497 Pi284 metY). A seqüência de P497 Pi284 é apresentada na SEQ ID NO: 13. A produção de aminoácido pela cepa M1494 foi comparada com a produção pela cepa M1990, como resumido abaixo na Tabela 7.

Tabela 7: Quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e

Cepa Homosserina O-acetil- Metionina Lisina (mM) homosserina (mM) (mM) (mM) M1494 18,3 0,2 2,5 50,1 M1990 18,2 0,3 5,6 48,9

A cepa M1990 foi transformada com DNA E (também aludido

como pH 491, um esquemático da qual é representado na Figura 7) (SEQ ID NO: 6) para produzir uma cepa iiCampbell iri\ que foi depois iiCampbelled ouf para produzir uma cepa iiCampbell ouf' M2014. A cepa M2014 super- expressa um alelo metA usando um promotor da superóxido dismutase (aludido como P3n9 metA). A seqüência de P3H9 é apresentada na SEQ ID NO: 12. A produção de aminoácido pela cepa M2014 foi comparada com a produção pela cepa M2014, como resumido abaixo na Tabela 8. Tabela 8: Quantidades de homosserina, Ο-acetil-homosserina, metionina e

Cepa Homosserina O-acetil- Metionina Lisina (mM) homosserina (mM) (mM) (mM) M1990 18,2 0,3 5,6 48,9 M2014 12,3 1,2 5,7 49,2

Exemplo 2:Experimentos em frasco agitado e ensaio de HPLC

Os experimentos em frascos agitados, com os Meios de Melaço padrão, foram realizados com as cepas em duplicata ou quadruplicata. Os meios de melaço contiveram em um litro de meio: 40 g de glicose; 60 g de melaços; 20 g de (NH4)2SO4; 0,4 g de MgS04*7H20; 0,6 g de KH2PO4; 10 g de extrato de levedura (DIFCO); 5 ml de 400 mM de treonina; 2 mg de FeS04.7H20; 2 mg de MnS04.H20; e 50 g de CaCO3 (Riedel-de Haen), com o volume completado com ddH20. O pH foi ajustado a 7,8 com 20% de NH4OH, 20 ml de meio continuamente agitado (de modo a manter CaCO3 colocado em suspensão) foram adicionados a 250 ml de frascos Bellco com defletores agitados e os frascos foram autoclavados por 20 min. Subseqüente à autoclavagem, 4 ml de "solução 4B" foram adicionados por litro do meio base (ou 80 μΐ/ frasco). A "solução 4B" conteve por litro: 0,25 g de cloridreto de tiamina (vitamina BI), 50 mg de cianocobalamina (vitamina B12), 25 mg de biotina, 1,25 g de cloridreto de piridoxina (vitamina B6) e foi tamponada com 12,5 mM de KPO4, pH 7,0 para dissolver a biotina e foi esterilizada por fdtração. As culturas foram cultivadas em frascos com defletores cobertos com papel Bioshield preso por faixas de borracha por 48 horas a 28°C ou 30°C e a 200 ou 300 rpm em um agitador de piso New Brunswick Scientific. As amostras foram tiradas em 24 horas e/ou 48 horas. As células foram removidas pela centrifugação seguido pela diluição do sobrenadante com um volume igual de acetonitrila a 60% e depois a filtração por membrana da solução usando colunas giratória Centricon de 0,45 μπι. Os filtrados foram ensaiados usando HPLC para as concentrações de metionina, glicina mais homosserina, O-acetil-homosserina, treonina, isoleucina, lisina e outros aminoácidos indicados.

Para o ensaio de HPLC, os sobrenadantes filtrados foram diluídos 1:100 com 0,45 μπι filtrado 1 mM de Na2EDTA e 1 μΐ da solução foi derivatizada com reagente OPA (AGILENT) em tampão de Borato (80 mM de NaBO3, 2,5 mM de EDTA, pH 10,2) e injetados em uma coluna 200 χ 4,1 mm Hypersil 5μ AA-ODS conduzida em uma HPLC Agilent série 1100 equipada com um detetor de fluorescência G1321A (AGILENT). O comprimento de onda de excitação foi 338 nm e o comprimento de onda de emissão monitorada foi de 425 nm. As soluções padrão de aminoácido foram submetidas à cromatografia e usadas para determinar os tempos de retenção e áreas de pico padrão para os vários aminoácidos. Chem Station, o pacote de software anexo fornecido pela Agilent, foi usado para o controle de instrumento, a aquisição de dados e a manipulação de dados. O hardware foi um computador HP Pentium 4 que suporta o Microsoft Windows NT 4.0 atualizado com um Microsoft Service Pack (SP6a).

Exemplo 3: Geração de um microorganismo contendo uma via de redução de

sulfato desregulado

O plasmídeo pOM423 (SEQ ID NO: 7) foi usado para gerar

cepas que contivessem uma via de redução de sulfato desregulado.

Especificamente, uma construção de promotor divergente Pl e PR de fago

lambda da E. coli foi usada para substituir os promotores divergentes regulon

de redução de sulfato nativos. A cepa M2014 foi transformada com pOM423

e selecionada quanto a resistência à canamicina {Campbell in). A seguir da

contra-seleção de sacB, os derivados sensíveis à canamicina foram isolados a

partir dos transformantes (Campbell out). Estes foram subseqüentemente

analisados pela PCR para determinar as estruturas promotoras do regulon de

redução de sulfato. Os isolados contendo os promotores divergentes Pl-Pr

foram denominados OM429. Quatro isolados de OM429 foram ensaiados

quanto a redução de sulfato usando o teste da tira de DTNB e quanto a

produção de metionina no ensaio de frasco agitado. Para estimar a produção

de sulfeto relativa usando o teste da tira de DTNB, uma tira de papel de filtro

foi embebida em uma solução de reagente de Ellman (DTNB) e colocada em

suspensão em uma cultura de frasco agitado da cepa a ser testada por 48

horas. O sulfeto de hidrogênio produzido pela cultura em crescimento reduz o

DTNBs produzindo uma cor amarela que é aproximadamente proporcional à

quantidade de H2S gerado. Assim, a intensidade da cor produzida pode ser

usada para se obter uma estimativa aproximada da atividade de redução de sulfato relativa de várias cepas. Os resultados (Tabela 10) mostram que dois dos quatro isolados demonstraram níveis relativamente altos de redução de sulfato. Estes mesmos dois isolados também produziram os níveis mais altos de metionina. As culturas foram cultivadas por 48 horas em meio de melaços padrão.

Tabela 10. Produção de metionina e redução de sulfato pelos isolados de OM429 em culturas de frasco agitado _

Cepa Promotores regulon de sulfato Met Teste de _______(g/i) PTNB

M2014 Nativo 1,1

OM429-1 Pl/Pr 1,1

-2 1,1

-3 1,3 ++

-4 1,4_++

Experimento 4: Cepas contendo a clivagem do operon da glicina de E. coli

(gcv).

A produção de tetraidrofoliato de metileno, a partir de serina

por intermédio da enzima GlyA (R38) que é necessário para a biossíntese de metionina a partir de glicose, também produz glicina como um subproduto. Em cepas que super produzem metionina, a quantidade de glicina produzida será em excesso da exigência para a síntese de proteína. Assim, de acordo com o modelo acima, a inclusão do GCS em C. glutamicum deve resultar em eficiência realçada da síntese de metionina.

Na E. coli e B. subtilis, se glicina está presente em excesso destes requeridos para a síntese de proteína, é clivado para dar um segundo equivalente de metileno tetraidrofoliato pelo sistema de enzima de clivagem de glicina. Na E. coli, o sistema de clivagem de glicina envolve quatro proteínas diferentes. Três destas são codificadas pelo operon gcvTHP. A quarta subunidade é a lipoamida desidrogenase, que é emprestada da multi- subunidade da piruvato desidrogenase. C. glutamicum não parece ter um sistema de clivagem de glicina. Nenhum homólogo das proteínas Gcv da E. coli foram encontrados no genoma da C glutamicum, embora a C. glutamicum não tenha a multi-subunidade usual da piruvato desidrogenase. Como um resultado, a produção de metionina na C. glutamicum resulta na produção de glicina concomitante, que aparece nos sobrenadantes de cultura. Foi assim tentado implementar um GCS na C. glutamicum e reciclar a glicina em metileno tetraidrofoliato, como é feito na E. coli e B. subtilis.

Como uma primeira etapa para esta meta, o operon gcvTHP da E. coli foi amplificado pela PCR sem o seu promotor nativo e clonado a jusante do promotor P497 em pOM218, que é um vetor da E. coli de cópia baixa planejado para integrar os cassetes de expressão em bioB na C. glutamicum. Foi assumido que a quarta subunidade necessária a partir da piruvato desidrogenase pode ser fornecida a partir do organismo hospedeiro que é a C. glutamicum. O plasmídeo resultante, pOM229 (Figura 8, SEQ ID NO: 8), foi transformado no organismo iniciador, cepa M2014 e foi Campbelled out com sucesso para dar cepas denominadas OM212. Estas cepas foram depois cultivadas.

O seguinte meio foi usado: 40 g/l de glicose, 60 g/l de melaços com um teor de açúcar de 45%, 10 g/l de (NH4)2SO4, 0,4 g/l de MgSO4* 7H20, 2 mg/l de FeSO4, 2 mg/l de MnSO4, 1,0 mg/l de tiamina, 1 mg/l de biotina. O pH foi ajustado ao pH 7,8 com 30% de NH4OH e o meio autoclavado por 20 minutos. Depois da autoclavagem: 200 mg/l de B12, 2 mM de L-treonina, 2 ml de CaCO3 a 0,5 g/ml por 20 ml de meio. O tampão de fosfato pH 7,2 foi adicionado a 200 mM de um estoque 2 M.

Em culturas de frasco agitado, um isolado, OM212-1 foi analisado como explicado acima. Os resultados que mostram um aumento na produção de metionina e uma diminuição na glicina mais homosserina são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11. Produção de metionina pelos derivados de M2014 que contiveram P497 gcvTHP (E. coli) integrado em bioB, em culturas de frasco agitado cultivados em meio de melaços mais CaC03.

Cepa Característica [Gly + Hse] [O-Ac-Hse] [Lys]_[Met] nova a/l a/l g/l εΛ M2014 U Precursora a 0,66 0,75 1,4 1,6 3.3 3.4 0,64 0,70 Média 0,67 OM212-1 a pOM229 P497 gcvTHP @ bioB 0,67 0,58 1.7 1.8 3,8 3,7 0,74 0,70 Média 0,72

Foi observado que o rendimento de carbono da cepa M2014 foi 0,0103 Mol de metionina/mol de açúcar enquanto que a cepa OM212-1 teve rendimento de carbono de 0,011 Mol de metionina/mol de açúcar.

Em uma outra forma de realização a subunidade do sistema de

clivagem de glicina não codificado pelo operon gcvTHP, que é o gene IpdA (SEQ ID NO: 10), que codifica a lipoamida desidrogenase é clonada a partir do hospedeiro K coli. O gene é amplificado sem o seu promotor natural e o promotor P497 é adicionado no lugar. O fragmento resultante é clonado no vetor transportador pOM229 da E. coli C glutamicum além do operon

gcvTHP.

Experimento 5: Um ensaio in vivo para um sistema de

clivagem de glicina funcional.

O gene serA da C. glutamicum foi gerado pela PCR e clonado

no pC INT de intervalo Swa I para dar o plasmídeo pOM238. Em seguida, um

fragmento abrupto contendo um gene de resistência à espectinomicina gram-

positivo (spc) expressado a partir da C glutamicum P497, foi ligado em

pOM238 de intervalo Ale I. Um isolado que continha o gene spc na mesma

orientação como serA foi denominado pOM253 (ver a Figura 9, SEQ ID NO:

9). pOM253 pode ser usado para criar uma interrupção-deleção no gene serA

de qualquer cepa de C. glutamicum.

pOM253 foi transformado na cepa M2014 de C. glutamicum,

selecionando quanto à resistência à canamicina, para dar a cepa iiCampbelled

in" OM264K. OM264K foi iiCampbelled ouf pela seleção quanto a

resistência à sacarose (BHI + 5% de sacarose) e resistência à espectinomicina

(BHI + 100 mg/l de espectinomicina) para dar a cepa OM264, que é um auxótrofo de serina, treonina e biotina.

A cepa OM264 pode ser transformada com o plasmídeo pOM229 ou um outro plasmídeo (ou plasmídeos) que fornece a via de clivagem de glicina (Gcv). Se a via de clivagem de glicina é ativo, então a cepa serA", Gcv+ resultante será capaz de crescer em meio mínimo contendo glicina, treonina e biotina, visto que o tetraidrofoliato de metileno será gerado pelo sistema de clivagem de glicina e o produto de gene glyA, a serina hidroximetil transferase (SHMT), será capaz de fabricar serina pela condução da reação SHMT na direção reversa, usando glicina e tetraidrofoliato de metileno como substratos.

Se necessário, um gene que codifica a lipoamida desidrogenase, por exemplo, o gene Ipd (também chamado de IpdA; Seq NO: 10) da E. coli pode ser clonado e transformado na cepa descrita acima para fornecer a quarta subunidade necessária para o sistema de clivagem de glicina. Os genes que codificam o sistema de clivagem de glicinas a partir de organismos outros que não a E. coli também podem ser clonados pela PCR ou complementação como descrito acima e usado para fornecer um sistema de clivagem de glicina funcional na C. glutamicum. Por exemplo, os genes do Bacillus subtilis, gcvH, gcvPA, gcvPB, gcvT e pdhD, que codifica um sistema de clivagem de glicina de cinco subunidades (a glicina descarboxilase é compreendida de duas subunidades em B. subtilis, codificadas por gcvPA e gcvPB, enquanto que na E. coli estas duas funções são combinadas em uma subunidade codificada por gcvP) ou qualquer outro conjunto adequado de genes podem ser usados. A única exigência é que o sistema funcione na C. glutamicum em nível suficiente para converter a glicina em excesso (produzida como um resultado da biossíntese de metionina) para tetraidrofoliato de metileno.

Experimento 6: Silenciamento dapiruvato cinase em C. glutamicum

A análise do modo elementar indicou que uma infra regulagem da piruvato cinase (RI 9) pode levar a uma eficiência aumentada da síntese de metionina (ver por exemplo, a Figura 3).

Para investigar o efeito do silenciamento da piruvato cinase, uma cepa produtora de lisina da C. glutamicum foi analisada. Se de fato um aumento na produção de lisina foi observado, isto também deve ser indicativo de uma síntese de metionina aumentada, visto que a formação de lisina é precedida pela formação de aspartato, aspartato fosfato, etc. Um aumento na produção de lisina portanto deve ser precedida por um aumento por exemplo, no aspartato. Visto que o aspartato também é um dos precursores da produção de metionina, uma quantidade aumentada de aspartato também deve levar à síntese aumentada de metionina.

fbr

Uma comparação de cepa entre C glutamicum IysC e C glutamicum IysCfbr Apyk foi realizada. C. glutamicum IysCfbr é um mutante que carrega uma mutação pontual no gene que codifica a aspartocinase (Kalinowski et ai. (1991), Mol. Microbiol. 5(5), 1197-1204). Esta cepa foi depois usada para deletar a piruvato cinase (C. glutamicum IysCfbrApyk).

Ambas as cepas foram cultivadas em frascos agitadores em meio mínimo e os rendimentos de carbono determinados para a biomassa, lisina e subprodutos. Com base no valor médio de dois experimentos independentes, foi observado que a lisina produz o silenciamento da piruvato cinase aumentado de 7,5 a 12,1%. Isto corresponde a um aumento de aproximadamente 62%.

Em conclusão, um silenciamento da piruvato cinase leva a uma síntese aumentada de lisina e correspondentemente também deve levar à síntese aumentada de metionina. Entretanto, o uso do silenciamento da piruvato cinase para produzir metionina não foi esperado aumentar a síntese de metionina, visto que a própria metionina conta com uma piruvato cinase ativa se conhecimento comum a respeito das redes metabólicas é levando em conta. Experimento 7 Comparação da captação no uso de fontes de enxofre diferentes

A análise do modo elementar mostrou que a eficiência da síntese de metionina surpreendentemente foi dependente do estado de redução da fonte de enxofre. Como explicado acima, para cada NADPH economizado um aumento na eficiência da síntese de metionina de 4,6% pode ser esperado. Entretanto, até agora existem apenas dados preliminares e incompletos como para o crescimento e uso de fontes de enxofre diferentes pela C. glutamicum.

De modo a testar se o cultivo da C. glutamicum em fontes de carbono diferentes de fato leva a um nível aumentado da eficiência de síntese de metionina, os seguintes experimentos foram realizados.

Uma cepa do tipo selvagem de C. glutamicum e o mutante AmcbR foram cultivados em sulfato e tiossulfato em frascos agitadores. Para este propósito, as fontes de enxofre correspondentes foram adicionados em concentrações equimolares a um meio mínimo CGll1A isento de enxofre.

CG12x/4-Medien compreende por litro: 20 g de glicose, 16 g de K2HPO4, 4 g de KH2PO4, 20 g de (NH4)2SO4, 300 mg de ácido 3,4-diidróxi benzo, 10 mg de CaCl2, 250 mg de MgSO4 7 H2O, 10 mg de FeSO4* 7 H2O, mg de MnSO4 * H2O, 2 mg de ZnSO4 * 7 H2O, 200 μg de CuSO4 * 5 H2O, 20 μg de NiCl2 * 6 H2O, 20 μg de Na2MoO4 * 2 H2O, 100 μg de cianocobalamina (Vitamina Bj2), 300 μg de tiamina (vitamina B1), 4 μg de piridoxal fosfato (vitamina Bó) e 100 μg de biotina (vitamina B7).

No caso do meio CG1214 isento de enxofre todos os sulfatos foram substituídos por cloros usados em concentrações tais que as concentrações dos cátions correspondentes não mudariam. Os seguintes sais foram usados: MgCl2 * 6 H2O (SO42" < 0,002%, Sigma); ZnCl2 (SO42" < 0,002%, Sigma); NH4Cl (SO42" < 0,002%, Fluka); MnCl4 * 4 H2O (SO42" < 0,002%, Sigma) e FeCl2 * 4 H2O (SO42" < 0,01%, Sigma).

O cultivo de C. glutamicum foi realizada em frascos agitados com indentações a 30°C e 250 upm em cabinas agitadoras (Multitron, Infors AG, Bottmingen, Suíça). De modo a prevenir uma limitação de oxigênio, os frascos foram enchidos a um máximo de 10% com o meio.

É conhecido que a cisteína sintase CisK (R45 e R45a) e a cistationina-y-sintase MetB (R46) são super-expressadas em C. glutamicum AmcbR (Rey et ai (2003) vide supra).

Foi descoberto que ambas as cepas podem crescer em sulfato e tiossulfato. A razão de crescimento mais alta foi observada para o tipo selvagem com μ^ = 0,44 h"1 em sulfato. O sulfato assim parece ser a fonte preferida de enxofre para C. glutamicum. O tiossulfato também foi usado pela C. glutamicum, de nenhuma maneira razões de crescimento observadas mais baixas de μ^ = 0,31 h"1.

Entretanto, um aumento na biomassa foi observado para o tipo selvagem de 0,35 gg"1 a 0,60 gg"1 se sulfato foi substituído pelo tiossulfato. No caso do AmcbR silenciado, o rendimento da biomassa aumentou uniformemente de 0,42 gg"1 a 0,51 gg"1 se sulfato foi substituído pelo tiossulfato. Isto corresponde a um aumento no rendimento de 13% e 21%. Substituindo sulfato pelo tiossulfato assim de fato leva a uma redução no ATP e NADPH que por sua vez tem um efeito positivo sobre o rendimento de carbono.

Visto que uma quantidade reduzida de açúcar/glicose é necessária para a produção de biomassa, mais açúcar/glicose está disponível para a produção de metionina. Assim, uma mudança de sulfato para tiossulfato deve de fato levar a rendimentos aumentados de síntese de metionina e este efeito deve ser até mais pronunciado se o uso de tiossulfato como a fonte de enxofre é combinada com um aumento do fluxo metabólico através das vias metabólicas preferidos pela manipulação genética. Legenda das figuras:

Figura 1: Rede de reação estequiométrica da C. glutamicum do tipo selvagem aplicada para a análise de modo elementar. Uma seta de cabeça dupla representa reações reversíveis. Os metabólitos externos são demonstrados em caixas cinzas.

Figura 2: Análise da via metabólica de C. glutamicum e E. coli para a produção de metionina: o rendimento de carbono para a biomassa e metionina para os modos elementares obtidos de C. glutamicum do tipo selvagem (A), E. coli do tipo selvagem (B), mutante de C. glutamicum com transidrogenase ativa (C), mutante de E. coli que careça de transidrogenase (D), mutante de C. glutamicum com sistema de clivagem de glicina ativa (E), mutante de E. coli que careça do sistema de clivagem de glicina (F). Os números dados indicam o rendimento de carbono teórico máximo para metionina para cada cenário. A linha reta conecta os modos com rendimentos de biomassa máxima e metionina máxima.

Figura 3: Distribuição de fluxo da C. glutamicum do tipo selvagem com rendimento de carbono da metionina teórico máximo. Todos os fluxos são dados como fluxos molares relativos para a captação de glicose.

Figura 4: Distribuição de fluxo da E. coli do tipo selvagem com rendimento de carbono da metionina teórico máximo. Todos os fluxos são dados como fluxos molares relativos para a captação de glicose. Figura 5: Análise da via metabólica de C. glutamicum para a

produção de metionina com diferentes fontes de carbono e enxofre: o rendimento de carbono para a biomassa e metionina para os modos elementares obtidos da C. glutamicum utilizando tiossulfato (A), tiossulfato e formiato (B), sulfeto (C), sulfeto e formiato (D), formiato (E) e metanotiol ou seus dímeros de dissulfeto de dimetila (F). Os números dados indicam o rendimento de carbono teórico máximo para a metionina para cada cenário. A linha reta conecta os modos com biomassa máxima e rendimentos de metionina máximos.

Fig. 6 mostra os vetores pH 273, pH 373 e pH 304 Si5 172

Fig. 7 mostra os vetores pH 399, pH 484 e pH 491

Fig. 8 mostra o vetor pOM 229.

Fig. 9 mostra o vetor pOM 253.

Fig. 10 mostra uma forma de realização preferida de fluxo metabólico otimizado como respeito à síntese de metionina. Abreviações: G6P = Glicose-6-fosfato F6P = Frutose-6-fosfato F-16-BP = Frutose-1,6-bisfosfato ASP = Ácido aspártico ASP-P = Aspartil-fosfato ASP-SA = Aspartato-semialdeído HOM = Homosserina O-AC-HOM = O-acetil-homosserina HOMOCIS = homocisteína

3-PHP = 3-Fosfonooxipiruvato SER-P = 3-Fosfoserina SER = Serina

O-AC-SER = O-acetil-serina CIS = Cisteína

CISTA = Cistationina GA3P = Gliceraldeído 3-fosfato DAHP = Diidroxiacetona fosfato 13-PG= 1,3-Bisfosfo-glicerato 3-PG = 3-Fosfo-glicerato 2-PG = 2-Fosfo-glicerato AC-CoA = Acetil coenzima A PYR = Piruvato PEP = Fosfoenol-piruvato CIT = Ácido cítrico OAA = Oxaloacetato Cis-ACO = cis-Aconitato ICI = ácido iso-cítrico 2-OXO = 2-Oxoglutarato GLU = Glutamato SUCC-CoA = Succinil coenzima A SUCC = Succinato FUM = Fumarato MAL = Malato

GLYOXY = Glioxilato H2S03 = Sulfito H2S = Hidrogeno-sulfeto 6-P-Gliconato = 6-Fosfo-gliconato GLC-LAC = 6-Fosfo-glucono-l ,5-lactona RIB-5P = Ribulose 5-fosfato RIBO-5P = Rlbose 5-fosfato XIL-5P = Xilulose 5-fosfato S7P = Sedo-heptulose 7-fosfato E-4P = Eritrose 4-fosfato MET = L-Metionina

NADP = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidado NADPH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido ACETAT = acetato H-CoA = Coenzima A

FAD = Flavina adenina dinucleotídeo oxidado FADH = Flavina adenina dinucleotídeo reduzido ATP = Adenosina 5'-trifosfato ADP = Adenosina 5'-difosfato NAD = Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado NADH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida M-THF = 5-Metiltetraidrofoliato THF = Tetraidrofoliato GDP = Guanosina 5'-difosfato GTP = Guanosina 5'-trifosfato GLC = Glicose

METex = Metionina excretada 02 = Oxigênio NH3 = Amônia

C02 = Dióxido de Carbono S04 = Sulfato GLICINA = Glicina HPL = proteína H-Iipoillisina Metil-HPL = proteína H-S-aminometildiidrolipoillisina Reações

As seguintes reações são realizadas pelas enzimas de Rl a

R80:

Rl: PEP + GLC = PYR + G6P R2: G6P = F6P.

R3: G6P + NADP = GLC-LAC + NADPH R4: GLC-LAC = 6-P-Gliconato.

R5: 6-P-Gliconato + NADP = RIB-5P + C02 + NADPH. R6: RIB-5P = XIL-5P. R7: RIB-5P = RIB0-5P.

R8: S7P + GA3P = RIBO-5P + XIL-5P. R9: S7P + GA3P = E-4P + F6P. RIO: F6P + GA3P = E-4P + XIL-5P. Rl 1: ATP + F6P = ADP + F-16-BP. R12: F-16-BP = F6P.

R13: F-16-BP = GA3P + DAHP.

Rl 4: DAHP = GA3P.

Rl 5: GA3P + NAD = 13-PG + NADH.

R16: ADP + 13-PG = ATP + 3-PG.

R17: 3-PG = 2-PG.

R18: 2-PG = PEP.

R19: PEP + ADP = PYR + ATP.

R20: PYR + H-CoA + NAD - AC-CoA + NADH + C02.

R21: AC-CoA + OAA = CIT + H-CoA.

R22: CIT = Cis-ACO.

R23: Cis-ACO = ICI.

R24: ICI + NADP = 2-OXO + C02 + NADPH.

R25: 2-OXO + NH3 + NADPH = GLU + NADP.

R26: 2-OXO + NAD + H-CoA = SUCC-CoA + NADH +

R27: SUCC-CoA + GDP - SUCC + H-CoA + GTP.

R28: SUCC + FAD = FUM + FADH.

R29: FUM = MAL.

R30: MAL + NAD = OAA + NADH.

R31: ICI = GLYOXY + SUCC.

R32: GLYOXY + AC-CoA = MAL + H-CoA.

R33: PYR + ATP + C02 = OAA + ADP.

R34: PEP + C02 = OAA.

R35: OAA + ATP = PEP + ADP + C02.

R36: OAA + ADP = PYR + C02 + ATP.

R37: OAA + GLU + NADPH = ASP + 2-OXO + NADP.

R38: THF + SER = MTHF + GLICINA.

R39: ASP-SA + NADPH = HOM + NADP. R40: HOM + SUCC-CoA = O-SUCC-HOM + H-CoA. R41: 3-PG + NAD = 3-PHP + NADH. R42: 3-PHP + GLU = SER-P + 2-OXO. R43: SER-P = SER.

R44: SER + AC-CoA = O-AC-SER + H-CoA.

R45: O-AC-SER + H2S = CIS + ACETAT.

R45a: H2S2O3 + O-Ac-SER = S-Sulfocisteína + ACETAT

R46: CIS + O-SUCC-HOM = CISTA + SUCC.

R47: ASP + ATP = ASP-P + ADP.

R48: ASP-P + NADPH = ASP-SA + NADP.

R49 O-Acetil-homosserina + H2S = Homocisteína + ácido

acético

R50: ATP + ACETAT = ADP + acetil-fosfato.

R51: acetil-fosfato + H-CoA = AC-CoA.

R52: HOMOCIS + MTHF = MET + THF.

R53: MET = METex.

R54: CISTA = HOMOCIS + NH3 + PYR.

R55: S04 + 2 ATP + NADPH = H2S03 + 2 ADP + NADP.

R56: ATP = ADP.

R57: MAL + NADP = PYR + C02 + NADPH. R58: H2S03 + 3 NADPH = H2S + 3 NADP. R59: 2 NADH + 02 + 4 ADP = 2 NAD + 4 ATP. R60: 2 FADH + 02 + 2 ADP = 2 FAD + 2 ATP. R61: 6965 NH3 + 233 S04 + 206 G6P + 72 F6P + 627 RIBO- 5P + 361 E-4P + 129 GA3P + 1338 3-PG + 720 PEP + 2861 PYR + 2930 AC-CoA + 1481 OAA + 1078 2-OXO + 16548 NADPH = BIOMASS +

16548 NADP + 2930 H-CoA + 1678 C02.

R62: ADP + GTP = ATP + GDP. R70: NADPH + NAD = NADP + NADH. R71: GLICINA + HPL = Metil-HPL + C02. R72: Metil-HPL + THF = HPL + MTHF + ΝΗ4.

R73: 1 tiossulfato (S2O32") + 1 NAD(P)H = 1 sulfite + 1

sulfeto + 1 NAD(P)

R74: sulfite + 3 NAD(P)H = sulfeto + 3 NAD(P) R75: ATP + Formiato + THF = ADP + Ortofosfato + 10-

R76: 5,IO-Metenil-THF + NADPH = 5,IO-Metileno-THF +

R77: O-Acetil-homosserina + metanotiol = metionina +

R78: 5,IO-Metileno-THF + NADP(H) = Metil-THF R79: formil-tetraidrofoliato = formiato + tetraidrofoliato R80: sulfato + 1 NAD(P)H + 1 ATP + 1 G(UM)TP = sulfito +

1 NAD(P)i IPPi, 1 G(A)DP + adenilato + P

R81: 3 NADH + 3 NADP+ + ATP = 3 NAD+ + 3 NADPH

R82: H2S2O3eXterno + ATP = H2S2OBinterno+ ADP O modelo de C. dutamicum do tipo selvagem Tcomparar com a figura 1) -

Reações e Enzimas:

RI: Sistema de fosfo-transferase

R2: G6P-isomerase

R3: G6P-DH

R4: Lactonase

R5: Gliconato-DH

R6: Ribose-5-P-epimerase

R7: Ribose-5-P-isomerase

R8: Transcetolase 1

R9: Transaldolase

RIO: Transcetolase 2

formil-THF

NADP

acetato Rl 1: Fosfofruto cinase

R12: Frutosebisfosfatase

Rl 3: Frutosebisfosfato-aldolase

R14: Triosefosfato-isomerase

Rl 5: 3-fosfo glicerato-Cinase

R16: PG-cinase

Rl 7: PG-mutase

Rl 8: PEP-hidrolase

R19: PYR-cinase

R20: PYR-DH

R21: CIT-sintase

R22: ACO-hidrolase

R23: ACONITASE

R24: Isocitrato-DH

R25: Glutamato-DH

R26: 2-OXO-DH

R27: SUCC-CoA-sintase

R28: SUCC-DH

R29: FUMARASE

R30: MAL-DH

R31: ICI-Iiase

R32: MAL-sintase

R33: PYR-carboxilase

R34: PEP-carboxilase

R35: PEP-carboxicinase

R36: OAA-descarboxilase

R37: ASP-transaminase

R38: M-THF síntese 1

R39: HOM-DH R40: HOM-transacetilase R41: PG-DH

R42: Fosfoserina-transaminase

R43: Fosfoserina-fosfatase

R44: Serina-transacetilase

R45: Cisteína-sintaseR46: Cistationina-sintase

R47: Aspartocinase

R48: ASP-P-DH

R49: O-Ac-HOM sulfidrilase

R50: ACETAT-cinase

R51: Fosfotransacetilase

R52: MET-sintase (MetE/H)

R53: Exportador de Metionina

R54: Cistationina-g-liase

R55: ATP-sulfurilase

R56: ATP-hidrólise

R57: Enzima málica

R58: Sulfito-redutase

R59: Cadeia respiratória 1

R60: Cadeia respiratória 2

R61: Formação de biomassa

R62: GTP-ATP-Fosfo transferase

Tipo de Reação (reversível ou irreversível):

Reversível.

R2r R6r R7r R8r R9r RlOr R13r R14r R15r R17r R18r R22r

R23r R28r R29r R30r R37r R41r R42r Irreversível:

Rl R3 R4 R5 Rl 1 R12 R16 R19 R20 R21 R24 R25 R26 R27 R31 R32 R33 R34 R35 R36 R38 R39 R40 R43 R44 R45 R46 R47 R48 R49 R50 R51 R52 R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R60 R61 R62 Metabólitos (internos ou externos): Internos:

G6P F6P F-16-BP ASP ASP-P ASP-SA HOM ATP O-AC- HOM HOMOCIS 3-PHP SER-P SER O-AC-SER CIS CISTA GA3P DAHP 13-PG 3-PG 2-PG AC-CoA PYR PEP CIT OAA Cis-ACO ICI 2-0X0 GLU SUCC-CoA SUCC FUM MAL GLYOXI H2S03 H2S 6-P-Gliconato GLC- LAC RIB-5P RIB0-5P XIL-5P S7P E-4P MET NADP NADPH acetil-fosfato ACETAT H-CoA FAD FADH ADP NADH NAD MTHF THF GDP GTP Externo:

BIOMASSA GLC METex 02 NH3 C02 S04 GLICINA Estequiometrias de Reação: Rl: PEP + GLC = PYR + G6P. R2r: G6P = F6P.

R3: G6P + NADP = GLC-LAC + NADPH. R4: GLC-LAC - 6-P-Gliconato.

R5: 6-P-Gliconato + NADP = RIB-5P + C02 + NADPH.

R6r: RIB-5P = XIL-5P.

R7r: RIB-5P = RIB0-5P.

R8r: S7P + GA3P = RIBO-5P + XIL-5P.

R9r: S7P + GA3P = E-4P + F6P.

RlOr: F6P + GA3P = E-4P + XIL-5P.

Rl 1: ATP + F6P = ADP + F-16-BP.

R12: F-16-BP = F6P.

R13r: F-16-BP = GA3P + DAHP.

R14r: DAHP = GA3P.

R15r: GA3P + NAD = 13-PG + NADH.

R16: ADP + 13-PG = ATP + 3-PG.

Rl 7r: 3-PG = 2-PG. Rl 8r: 2-PG = PEP.

R19: PEP + ADP = PYR + ATP.

R20: PYR + H-CoA + NAD = AC-CoA + NADH + C02.

R21: AC-CoA + OAA = CIT + H-CoA. R22r: CIT = Cis-ACO. R23r: Cis-ACO = ICI.

R24: ICI + NADP = 2-0X0 + C02 + NADPH.

R25: 2-OXO + NH3 + NADPH = GLU + NADP.

R26: 2-OXO + NAD + H-CoA = SUCC-CoA + NADH +

R27: SUCC-CoA + GDP = SUCC + H-CoA + GTP.

R28r: SUCC + FAD = FUM + FADH.

R29r: FUM = MAL.

R30r: MAL + NAD = OAA + NADH.

R31: ICI = GLYOXI + SUCC.

R32: GLYOXI + AC-CoA = MAL + H-CoA.

R33: PYR + ATP + C02 - OAA + ADP.

R34: PEP + C02 = O AA.

R35: OAA + ATP = PEP + ADP + C02.

R36: OAA + ADP = PYR + C02 + ATP.

R37r: OAA + GLU + NADPH = ASP + 2-OXO + NADP.

R38: THF + SER = MTHF + GLICINA.

R39: ASP-SA + NADPH = HOM + NADP.

R40: HOM + AC-CoA = O-AC-HOM + H-CoA.

R41r: 3-PG + NAD = 3-PHP + NADH.

R42r: 3-PHP + GLU = SER-P + 2-OXO.

R43: SER-P = SER.

R44: SER + AC-CoA - O-AC-SER + H-CoA. R45: O-AC-SER + H2S = CIS + ACETAT. R46: CIS + O-AC-HOM = CISTA + ACETAT.

R47: ASP + ATP = ASP-P + ADP.

R48: ASP-P + NADPH = ASP-SA + NADP.

R49: O-AC-HOM + H2S = HOMOCIS + ACETAT.

R50: ATP + ACETAT = ADP + acetil-fosfato.

R51: acetil-fosfato + H-CoA = AC-CoA.

R52: HOMOCIS + MTHF = MET + THF.

R53: MET = METex.

R54: CISTA = HOMOCIS + NH3 + PYR.

R55: S04 + 2 ATP + NADPH = H2S03 + 2 ADP + NADP.

R56: ATP = ADP.

R57: MAL + NADP = PYR + C02 + NADPH. R58: H2S03 + 3 NADPH = H2S + 3 NADP. R59: 2NADH + 02 + 4 ADP = 2NAD + 4 ATP. R60: 2 FADH + 02 + 2 ADP = 2 FAD + 2 ATP. R61: 6231 NH3 + 233 S04 + 205 G6P + 308 F6P + 879 RIBO-5P + 268 E-4P + 129 GA3P + 1295 3-PG + 652 PEP + 2604 PYR + 3177 AC-CoA + 1680 OAA + 1224 2-OXO + 16429 NADPH = BIOMASS + 16429 NADP+ 3177 H-CoA+ 1227 C02.

R62: ADP + GTP = ATP + GDP. O modelo de E. coli do tipo selvagem - Reações e Enzimas: RI: Sistema de fosfo-transferase R2: G6P-isomerase R3: G6P-DH R4: Lactonase R5: Gliconato-DH R6: Ribose-5-P-epimerase R7: Ribose-5-P-isomerase R8: Transcetolase 1 R9: Transaldolase

RIO: Transcetolase 2

Rl 1: Fosfofruto cinase

Rl 2: Frutosebisfosfatase

Rl 3: Frutosebisfosfato-aldolase

Rl 4: Triosefosfato-isomerase

Rl 5: 3-fosfo glicerato-Cinase

R16: PG-cinase

R17: PG-mutase

Rl8: PEP-hidrolase

R19: PYR-cinase

R20: PYR-DH

R21: CIT-sintase

R22: ACO-hidrolase

R23: ACONITASE

R24: Isocitrato-DH

R25: Glutamato-DH

R26: 2-OXO-DH

R27: SUCC-CoA-sintase

R28: SUCC-DH

R29: FUMARASE

R30: MAL-DH

R31: ICI-Iiase

R32: MAL-sintase

R33: PYR-carboxilase

R34: PEP-carboxilase

R35: PEP-carboxicinase

R36: OAA-descarboxilase

R37: ASP-transaminase R38: M-THF síntese 1 R39: HOM-DH R40: HOM-traiisacetilase R41: PG-DH

R42: Fosfoserina-transaminase

R43: Fosfoserina-fosfatase

R44: Serina-transacetilase

R45: Cisteína-sintase

R46: Cistationina-sintase

R47: Aspartocinase

R48: ASP-P-DH

R50: ACETAT-cinase

R51: Fosfotransacetilase

R52: MET-sintase (MetE/H)

R53: Exportador de Metionina

R54: Cistationina-g-liase

R55: ATP-sulfurilase

R56: ATP-hidrólise

R57: Enzima málica

R58: Sulfito-redutase

R59: Cadeia respiratória 1

R60: Cadeia respiratória 2

R61: Formação de Biomassa

R62: GTP-ATP-Fosfo transferase

R70: Transidrogenase

R71: Clivagem de glicina 1

R72: Clivagem de glicina 2

Tipo de Reação (reversível ou irreversível):

Reversível: R2r R6r R7r R8r R9r RlOr R13r R14r R15r RlIr Rl8r R22r

R23r R28r R29r R30r R37r R41r R42r R70r Irreversível.

Rl R3 R4 R5 Rll R12 Rl 6 R19 R20 R21 R24 R25 R26 R27 R31 R32 R33 R34 R35 R36 R38 R39 R40 R43 R44 R45 R46 R47 R48 R50 R51 R52 R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R60 R61 R62 R71 R72 Metabólitos (internos ou externos): Internos:

G6P F6P F-16-BP ASP ASP-P ASP-SA HOM ATP O-SUCC- HOM HOMOCIS 3-PHP SER-P SER O-AC-SER CIS CISTA GA3P DAHP 13-PG 3-PG 2-PG AC-CoA PYR PEP CIT OAA Cis-ACO ICI 2-OXO GLU SUCC-CoA SUCC FUM MAL GLYOXI H2S03 H2S 6-P-Gliconato GLC- LAC RIB-5P RIB0-5P XIL-5P S7P E-4P MET NADP NADPH H-CoA FAD FADH ADP NADH NAD MTHF THF GDP GTP ACETAT acetil-fosfato

HPL metil-HPL GLICINA Externos:

BIOMASSA GLC METex 02 NH3 C02 S04 Estequiometrias de Reação: Rl: PEP + GLC = PYR + G6P. R2r: G6P = F6P.

R3: G6P + NADP = GLC-LAC + NADPH. R4: GLC-LAC = 6-P-Gliconato.

R5: 6-P-Gliconato + NADP = RIB-5P + C02 + NADPH.

R6r: RIB-5P = XIL-5P.

R7r: RIB-5P = RIB0-5P.

R8r: S7P + GA3P = RIBO-5P + XIL-5P.

R9r: S7P + GA3P = E-4P + F6P.

Rl Or: F6P + GA3P = E-4P + XIL-5P.

Rl 1: ATP + F6P = ADP + F-16-BP. R12: F-16-BP = F6P.

R13r: F-16-BP = GA3P + DAHP.

Rl 4r: DAHP = GA3P.

Rl 5r: GA3P + NAD = 13-PG + NADH.

R16: ADP + 13-PG = ATP + 3-PG.

R17r: 3-PG = 2-PG.

Rl 8r: 2-PG = PEP.

R19: PEP + ADP - PYR + ATP.

R20: PYR + H-CoA + NAD = AC-CoA + NADH + C02.

R21: AC-CoA + OAA = CIT + H-CoA. R22r: CIT = Cis-ACO. R23r: Cis-ACO = ICI.

R24: ICI + NADP - 2-OXO + C02 + NADPH.

R25: 2-0X0 + NH3 + NADPH = GLU + NADP.

R26: 2-0X0 + NAD + H-CoA = SUCC-CoA + NADH +

R27: SUCC-CoA + GDP = SUCC + H-CoA + GTP.

R28r: SUCC + FAD = FUM + FADH.

R29r: FUM = MAL.

R30r: MAL + NAD = OAA + NADH.

R31: ICI = GLYOXI + SUCC.

R32: GLYOXI + AC-CoA = MAL + H-CoA.

R33: PYR + ATP + C02 = OAA + ADP.

R34: PEP + C02 = OAA.

R35: OAA + ATP = PEP + ADP + C02.

R36: OAA + ADP = PYR + C02 + ATP.

R37r: OAA + GLU + NADPH = ASP + 2-OXO + NADP.

R38: THF + SER = MTHF + GLICINA.

R39: ASP-SA + NADPH = HOM + NADP. R40: HOM + SUCC-CoA = O-SUCC-HOM + H-CoA. R41r: 3-PG + NAD - 3-PHP + NADH. R42r: 3-PHP + GLU = SER-P + 2-OXO. R43: SER-P = SER.

R44: SER + AC-CoA = O-AC-SER + H-CoA.

R45: O-AC-SER + H2S = CIS + ACETAT.

R46: CIS + O-SUCC-HOM = CISTA + SUCC.

R47: ASP + ATP = ASP-P + ADP.

R48: ASP-P + NADPH = ASP-SA + NADP.

R52: HOMOCIS + MTHF - MET + THF.

R53: MET = METex.

R54: CISTA = HOMOCIS + NH3 + PYR.

R55: S04 + 2 ATP + NADPH = H2S03 + 2 ADP + NADP.

R56: ATP = ADP.

R57: MAL + NADP = PYR + C02 + NADPH. R58: H2S03 + 3 NADPH = H2S + 3 NADP. R59: 2 NADH +02 + 4 ADP = 2 NAD + 4 ATP. R60: 2 FADH + 02 + 2 ADP - 2 FAD + 2 ATP. R61: 6965 NH3 + 233 S04 + 206 G6P + 72 F6P + 627 RIBO- 5P + 361 E-4P + 129 GA3P + 1338 3-PG + 720 PEP + 2861 PYR + 2930 AC-CoA + 1481 OAA + 1078 2-OXO + 16548 NADPH = BIOMASS +

16548 NADP + 2930 H-CoA + 1678 C02.

R62: ADP + GTP = ATP + GDP. R50: ATP + ACETAT = ADP + acetil-fosfato. R51: acetil-fosfato + H-CoA = AC-CoA. R70r: NADPH + NAD = NADP + NADH. R71: GLICINA + HPL = Metil-HPL + C02. R72: Metil-HPL + THF - HPL + MTHF + NH3. ^V.'; '1 LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

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6

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<22f»

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25

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Claims (22)

1. Método para determinar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. determinar os parâmetros, por meio de uma pluralidade de parâmetros, do fluxo metabólico de um organismo sintetizador de metionina inicial com base nas vias metabólicas pré-conhecidas relacionadas com a síntese de metionina; b. determinar um modelo teórico de um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina pela modificação de pelo menos um da pluralidade de parâmetros e/ou introduzir pelo menos um outro de tais parâmetros em uma tal maneira como para aumentar a eficiência da síntese de metionina comparada com a do organismo sintetizador de metionina inicial.

2. Dispositivo para determinar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina, caracterizado pelo fato de que compreende um processador adaptado para realizar as seguintes etapas do método a. determinar os parâmetros, por meio de uma pluralidade de parâmetros, do fluxo metabólico de um organismo sintetizador de metionina inicial do tipo selvagem com base em vias metabólicas pré-conhecidas relacionadas com a síntese de metionina; b. determinar um modelo teórico de um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina pela modificação de pelo menos um da pluralidade de parâmetros e/ou introduzir pelo menos um outro de tais parâmetros em uma tal maneira como para aumentar a eficiência da síntese de metionina comparada com a do organismo sintetizador de metionina inicial.

3. Meio legível por computador, caracterizado pelo fato de que um programa de computador de determinar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina é armazenado que, quando é executado por um processador, é adaptado para realizar as seguintes etapas do método a. determinar os parâmetros, por meio de uma pluralidade de parâmetros, do fluxo metabólico de um organismo sintetizador de metionina inicial com base em vias metabólicas pré-conhecidas relacionadas com a síntese de metionina; b. determinar um modelo teórico de um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina pela modificação de pelo menos um da pluralidade de parâmetros e/ou introduzir pelo menos um outro de tais parâmetros em uma tal maneira como para aumentar a eficiência da síntese de metionina comparada com a do organismo sintetizador de metionina inicial.

4. Elemento de programa para determinar um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina, caracterizado pelo fato de que, quando é executado por um processador, é adaptado para realizar as seguintes etapas do método. a. determinar os parâmetros, por meio de uma pluralidade de parâmetros, do fluxo metabólico de um organismo sintetizador de metionina inicial com base em vias metabólicas pré-conhecidas relacionadas com a síntese de metionina; b. determinar um modelo teórico de um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina pela modificação de pelo menos um da pluralidade de parâmetros e/ou introduzir pelo menos um outro de tais parâmetro em uma tal maneira como para aumentar a eficiência da síntese de metionina comparada com a do organismo sintetizador de metionina inicial.

5. Método para produzir um organismo que é selecionado do grupo de procariotas, eucariotas inferiores e plantas com eficiência aumentada da síntese de metionina comparada com a dos organismos de partida, caracterizado pelo fato de que compreende as seguinte etapas: a. determinar os parâmetros, por meio de uma pluralidade de parâmetros, do fluxo metabólico de um organismo sintetizador de metionina inicial com base em vias metabólicas pré-conhecidas relacionadas com a síntese de metionina; b. determinar um modelo teórico de um organismo com eficiência aumentada para a síntese de metionina pela modificação de pelo menos um da pluralidade de parâmetros e/ou introduzir pelo menos um outro de tais parâmetros em uma tal maneira como para aumentar a eficiência da síntese de metionina comparada com a do organismo sintetizador de metionina inicial. c. modificar geneticamente um organismo de partida em uma tal maneira como para modificar pelo menos uma via metabólica existente nos organismos tal que o fluxo metabólico do organismo seja aproximado ao modelo teórico do organismo e/ou d. modificar geneticamente um organismo de partida em uma tal maneira como para introduzir pelo menos uma via metabólica exógena nos organismos tal que o fluxo metabólico do organismo seja aproximado ao modelo teórico do organismo e/ou e. fornecer pelo menos um metabólito externo em uma quantidade suficiente para canalizar o fluxo metabólico através das vias metabólicas, modificadas na etapa c e/ou introduzidas na etapa d.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias metabólicas existentes selecionados do grupo que consiste de sistema de fosfotransferase (PTS) via da pentose fosfato (PPP) glicólise (EMP) ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) desvio de glioxilato (GS) anaplerose (AP) cadeia respiratória (RC) assimilação de enxofre (SA) síntese de metionina (MS) síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS) sistema de clivagem de glicina (GCS) conversão de transidrogenase (THGC) via 1 (Pl) via 2 (P2) via 3 (P3) via 4 (P4) via 5 (P5) via 6 (P6) via 7 (P7) via 8 (P8) é modificado pela modificação genética dos organismos, e/ou o fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias metabólicas exógenas selecionadas do grupo que consiste de Sistema de clivagem de glicina (GCS) conversão de transidrogenase (THGC) Sistema de tiossulfato redutase (TRS) Sistema de sulfito redutase (SRS) Sistema de sulfato redutase (SARS) Sistema que converte formiato (FCS) Sistema que converte metanotiol (MCS) é introduzido pela modificação genética dos organismos, e/ou OS organismos são cultivados na presença de metabólitos externos selecionadas do grupo que consiste de sulfato sul fito sulfeto tiossulfato Metabólitos Cl tais como formiato, formaldeído, metanol, metanotiol ou seus dímeros de dimetil-disulfeto.

7. Método para produzir um organismo que é selecionado do grupo de procariotas, eucariotas inferior e plantas com eficiência aumentada de síntese de metionina comparada com a do organismo de partida, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a. modificação do fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias metabólicas selecionadas do grupo que consiste de: sistema de fosfotransferase (PTS) via da pentose fosfato (PPP) glicólise (EMP) ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) desvio de glioxilato (GS) anaplerose (AP) cadeia respiratória (RC) assimilação de enxofre (SA) síntese de metionina (MS) síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS) sistema de clivagem de glicina (GCS) conversão de transidrogenase (THGC) via 1 (Pl) via 2 (P2) via 3 (P3) via 4 (P4) via 5 (P5) via 6 (P6) via 7 (P7) via 8 (P8) pela modificação genética do organismo, e/ou b. introdução de um fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias metabólicas exógenas selecionados do grupo que consiste de Sistema de clivagem de glicina (GCS) conversão de transidrogenase (THGC) Sistema de tiossulfato redutase (TRS) Sistema de sulfito redutase (SRS) Sistema de sulfato redutase (SRS) Sistema que converte formiato (FCS) Sistema que converte metanotiol (MCS) pela modificação genética do organismo, e/ou c. cultivar os organismos na presença de pelo menos um metabólito externo selecionado do grupo que consiste de: sulfato sulfito sulfeto tiossulfato fontes de enxofre orgânicas metabólitos Cl tais como formiato, formaldeído, metanol, metanotiol ou seus dímeros de sulfeto de dimetila.

8. Organismo, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo de procariotas, eucariotas inferior e plantas com eficiência aumentada da síntese de metionina comparada com a dos organismos de partida obteníveis pelos métodos como definidos em qualquer uma das reivindicações de 5 a 7.

9. Organismo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado do grupo que consiste de microorganismos do gênero Corynebacterium, do gênero Brevibacteriuml, do gênero Escheriehia, leveduras e plantas.

10. Método para produzir um microorganismo do gênero Corynebaeterium com eficiência aumentada da produção de metionina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas a. aumentar e/ou introduzir o fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias selecionadas do grupo que consiste de: sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou via da pentose fosfato (PPP) e/ou assimilação de enxofre (SA) e/ou anaplerose (AP) e/ou síntese de metionina (MS) e/ou serina glicina síntese (SCGS) e/ou sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou conversão de transidrogenase (THGC) e/ou via 1 (Pl) e/ou via 2 (P2) e/ou Sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou Sistema de sulfito redutase (SRS) e/ou Sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou Sistema que converte formiato (FCS) e/ou Sistema que converte metanotiol (MCS) e/ou pela modificação genética do organismo comparada com a do organismo de partida, e/ou b. pelo menos parcialmente diminuir o fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias selecionadas do grupo que consiste de: glicólise (EMP) e/ou ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou desvio de glioxilato (GS) e/ou cadeia respiratória (RC) e/ou Rl 9 e/ou R35 e/ou R79 e/ou via 3 (P3) e/ou via 4 (P4) e/ou via 7 (P7) e/ou pela modificação genética do organismo comparado com o de partida.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de: Rl de modo a produzir mais G6P e/ou R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou R6 de modo a produzir mais XIL-5P e/ou R7 de modo a produzir mais RJBO-5P e/ou R8 de modo a produzir mais S7P e GA3P e/ou R9 de modo a produzir mais E-4p e F6P e/ou RlO de modo a produzir mais F6P e GA3P e/ou R2 de modo a produzir mais G6P e/ou R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou R58 de modo a produzir mais H2S e/ou R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou da célula e/ou R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou RBl de modo a produzir mais NADPH e/ou R25 de modo a produzir mais Glu e/ou R33 e/ou R36 de modo a produzir mais OAA e/ou R30 de modo a produzir mais MAL e/ou R57 de modo a produzir mais Pyr e/ou R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfito e/ou R82 de modo a importar mais tiossulfato externo para dentro R74 de modo a metabolizar sulfito a sulfeto e/ou R75 de modo a produzir mais 10-formil-THF e/ou R76 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R78 de modo a produzir mais Metil-THF e/ou R77 de modo a metil-sulfidrilar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou R80 de modo a metabolizar sulfato em sulfito e/ou R47 e/ou R48 e/ou R39 e/ou R46 e/ou R49 e/ou R52 e/ou R52 e/ou R54 é aumentada e/ou introduzidas comparada com a do organismo de partida, e/ou a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de Rl 1 de modo a produzir menos F-1,6-BP e/ou Rl 3 de modo a produzir menos DHAP e GA3P e/ou R14 de modo a produzir menos GA3P e/ou Rl 5 de modo a produzir menos 1,3-PG e/ou Rl 6 de modo a produzir menos 3-PG e/ou Rl 7 de modo a produzir menos 2-PG e/ou Rl 8 de modo a produzir menos PEP e/ou Rl 9 de modo a produzir menos Pyr e/ou R20 de modo a produzir menos Ac-CoA e/ou R21 de modo a produzir menos CIT e/ou R22 de modo a produzir menos Cis-ACO e/ou R23 de modo a produzir menos ICI e/ou R24 de modo a produzir menos 2-OXO e/ou R26 de modo a produzir menos SUCC-CoA e/ou R27 de modo a produzir menos SUCC e/ou R28 de modo a produzir menos FUM e/ou R29 de modo a produzir menos MAL e/ou R30 de modo a produzir menos OAA e/ou R21 de modo a produzir menos CIT e/ou R22 de modo a produzir menos Cis-ACO e/ou R23 de modo a produzir menos ICI e/ou R31 de modo a produzir menos GLYOXY e SUCC e/ou R32 de modo a produzir menos MAL e/ou R28 de modo a produzir menos FUM e/ou R29 de modo a produzir menos MAL e/ou R30 de modo a produzir menos OAA e/ou R60 e/ou R56 e/ou R62 e/ou R61 e/ou Rl 9 e/ou R35 e/ou R79 é/são pelo menos parcialmente reduzidas comparada(s) com a do organismo de partida.

12. Método de acordo com a reivindicação Ili caracterizado pelo fato de que: a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de: R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou RlO de modo a produzir mais F6P e GA3P e/ou R2 de modo a produzir mais G6P e/ou R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou R58 de modo a produzir mais H2S e/ou R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou R25 de modo a produzir mais Glu e/ou R33 e/ou R36 de modo a produzir mais OAA e/ou R30 de modo a produzir mais MAL e/ou R57 de modo a produzir mais Pyr e/ou R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfito e/ou R82 de modo a importar mais tiossulfato externo para dentro da célula e/ou R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou R76 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R78 de modo a produzir mais Metil-THF e/ou R77 de modo a metil-sulfídrilar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou R47 e/ou R48 e/ou R39 e/ou R46 e/ou R49 e/ou R52 e/ou R52 e/ou R54 e ou R80 de modo a metabolizar sulfato em sulfxto são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida, e/ou a quantidade e/ou atividade de enzimas selecionadas do grupo que consiste de: Rl 1 de modo a produzir menos F-1,6-BP e/ou Rl 9 de modo a produzir menos Pyr e/ou R20 de modo a produzir menos Ac-CoA e/ou R21 de modo a produzir menos CIT e/ou R24 de modo a produzir menos 2-OXO e/ou R26 de modo a produzir menos SUCC-CoA e/ou R27 de modo a produzir menos SUCC e/ou R31 de modo a produzir menos GLYOXY e SUCC e/ou R32 de modo a produzir menos MAL e/ou Rl 9 de modo a produzir menos Piruvato e/ou R35 de modo a produzir menos PEP e/ou R79 de modo a produzir menos THF são pelo menos parcialmente reduzidas comparadas com a do organismo de partida.

13. Método de acordo com a reivindicação Il5 caracterizado pelo fato de que: a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de R3 de modo a produzir mais GLC-LAC e/ou R4 de modo a produzir mais 6-P-Gliconato e/ou R5 de modo a produzir mais RIB-5P e/ou RlO de modo a produzir mais F6P e GA3P e/ou R2 de modo a produzir mais G6P e R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou R58 de modo a produzir mais H2S e R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R78 de modo a produzir mais Metil-THF e R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou R25 de modo a produzir mais Glu e/ou R33 e/ou R36 de modo a produzir mais OAA e/ou R30 de modo a produzir mais MAL e/ou R57 de modo a produzir mais Pyr e/ou R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfito e R82 de modo a importar mais tiossulfato externo para dentro da célula e/ou R75 de modo a produzir 10-formil-THF e/ou R76 de modo a produzir Metileno-THF e R77 de modo a metil-sulfídrílar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou R47 e/ou R48 e/ou R39 e/ou R46 e/ou R49 e/ou R52 e/ou R52 e/ou R54 e/ou R80 de modo a metabolizar sulfato em sulfito são aumentadas e/ou introduzidas comparadas com a do organismo de partida, e/ou: a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de: Rl 1 de modo a produzir menos F-1,6-BP e/ou Rl 9 de modo a produzir menos Pyr e/ou R20 de modo a produzir menos Ac-CoA e/ou R21 de modo a produzir menos CIT e/ou R24 de modo a produzir menos 2-0X0 e/ou R26 de modo a produzir menos SUCC-CoA e/ou R27 de modo a produzir menos SUCC e/ou R31 de modo a produzir menos GLYOXY e SUCC e/ou R32 de modo a produzir menos MAL e Rl 9 de modo a produzir menos Piruvato e R35 de modo a produzir menos PEP e R79 de modo a produzir menos THF são pelo menos parcialmente reduzidas comparadas com a do organismo de partida.

14. Microorganismo do gênero Corynebacterium,, caracterizado pelo fato de que é obtenível por qualquer um dos métodos como definidos nas reivindicações de 10 a 13 preferivelmente selecionadas do grupo que consiste de Corynebacterium acetoacidophilum, C. acetoglutamicum, C aeetophilum, C amoniagenes, C. glutamicum, C. Iiliumv C nitrilophilus ou C. spec. e preferivelmente Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebaeterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 ou Corynebacterium glutamicum ATCC21608 e Corynebacterium glutamicum DSM 17322.

15. Método para produzir um microorganismo do gênero Escherichia com eficiência aumentada da produção de metionina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguinte etapas: aumentar e/ou introduzir o fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias selecionadas do grupo que consiste de: sistema de fosfotransferase (PTS) e/ou glicólise (EMP) e/ou ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e/ou desvio de glioxilato (GS) e/ou via 1 (Pl) e/ou assimilação de enxofre (SA) e/ou anaplerose (AP) e/ou síntese de metionina (MS) e/ou serina/cisteína/glicina (SCGS) e/ou sistema de clivagem de glicina (GCS) e/ou conversão de transidrogenase (THGC) e/ou Sistema de tiossulfato redutase (TRS) e/ou Sistema de sulfito redutase (SRS) e/ou Sistema de sulfato redutase (SARS) e/ou Sistema que converte formiato (FCS) e/ou Sistema que converte metanotiol (MCS) e/ou Síntese de serina/cisteína/glicina (SCGS) comparados com o de partida pela modificação genética do organismo, e/ou pelo menos parcialmente diminuir o fluxo metabólico através de pelo menos uma das vias selecionadas do grupo que consiste de: via da pentose fosfato (PPP) e/ou R19 de modo a produzir menos Piruvato e/ou R35 de modo a produzir menos PEP e/ou R79 de modo a produzir menos THF via 3 (P3) e/ou via 4 (P4) e/ou via 7 (P7) comparados com o de partida pela modificação genética do organismo.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de enzimas selecionadas do grupo que consiste de: Rl de modo a produzir mais G6P R2 de modo a produzir mais F6P e/ou Rl 1 de modo a produzir mais F-1,6-BP e/ou Rl 3 de modo a produzir mais DHAP e GA3P e/ou R14 de modo a produzir mais GA3P e/ou Rl 5 de modo a produzir mais 1,3-PG e/ou Rl 6 de modo a produzir mais 3-PG e/ou Rl 7 de modo a produzir mais 2-PG e/ou Rl 8 de modo a produzir mais PEP e/ou Rl 9 de modo a produzir mais Pyr e/ou R20 de modo a produzir mais Ac-CoA e/ou R21 de modo a produzir mais CIT e/ou R22 de modo a produzir mais Cis-ACO e/ou R23 de modo a produzir mais ICI e/ou R24 de modo a produzir mais 2-OXO e/ou R26 de modo a produzir mais SUCC-CoA e/ou R27 de modo a produzir mais SUCC e/ou R28 de modo a produzir mais FUM e/ou R29 de modo a produzir mais MAL e/ou R30 de modo a produzir mais OAA e/ou R21 de modo a produzir mais CIT e/ou R22 de modo a produzir mais Cis-ACO e/ou R23 de modo a produzir mais ICI e/ou R31 de modo a produzir mais GLYOXY e SUCC e/ou R32 de modo a produzir mais MAL e/ou R28 de modo a produzir mais FUM e/ou R29 de modo a produzir mais MAL e/ou R30 de modo a produzir mais OAA e/ou R25 de modo a produzir mais Glu e/ou R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou R58 de modo a produzir mais H2S e/ou R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R78 de modo a produzir mais Metil-THF e/ou R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfito e/ou R82 de modo a importar mais tiossulfato externo para dentro R74 de modo a metabolizar sulfito a sulfeto e/ou R75 de modo a produzir mais 10-formil-THF e/ou R76 de modo a produzir mais MetiIeno-THF a partir de 10- formil-THF e/ou R77 de modo a metil-sulfidrílar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou R80 de modo a metabolizar sulfato em sulfito e/ou R44 de modo a produzir mais O-Ac-SER e/ou R45 de modo a produzir mais CIS é aumentada e/ou introduzida comparada com a do organismo de partida, e/ou a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de: R3 de modo a produzir menos GLC-LAC e/ou R4 de modo a produzir menos 6-P-Gliconato e/ou R5 de modo a produzir menos RIB-5P e/ou R6 de modo a produzir menos XIL-5P e/ou R7 de modo a produzir menos RIB0-5P e/ou R8 de modo a produzir menos S7P e GA3P e/ou R9 de modo a produzir menos E-4p e F6P e/ou RlO de modo a produzir menos F6P e GA3P e/ou R2 de modo a produzir menos G6P e/ou R49 de modo a produzir menos HOMOCIS e/ou Rl 9 de modo a produzir menos Piruvato e/ou R35 de modo a produzir menos PEP e/ou R79 de modo a produzir menos THF e/ou R56 e/ou R62 e/ou R61 é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que: a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de: Rl de modo a produzir mais G6P e/ou R2 de modo a produzir mais F6P e/ou Rl 1 de modo a produzir mais F-1,6-BP e/ou Rl 9 de modo a produzir mais Pyr e/ou R20 de modo a produzir mais Ac-CoA e/ou R21 de modo a produzir mais CIT e/ou R24 de modo a produzir mais 2-OXO e/ou R26 de modo a produzir mais SUCC-CoA e/ou R31 de modo a produzir mais GLYOXY e SUCC e/ou R32 de modo a produzir mais MAL e/ou R25 de modo a produzir mais Glu e/ou R55 de modo a produzir mais H2SO3 e/ou R58 de modo a produzir mais H2S e/ou R71 de modo a produzir mais M-HPL e/ou R72 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R78 de modo a produzir mais Metil-TLtF e/ou R70 de modo a produzir mais NADPH e/ou R81 de modo a produzir mais NADPH e/ou R73 de modo a metabolizar tiossulfato a sulfeto e sulfíto e/ou R82 de modo a importar mais tiossulfato externo para dentro da célula e/ou R74 de modo a metabolizar sulfíto a sulfeto e/ou R75 de modo a produzir mais 10-formil-THF e/ou R76 de modo a produzir mais Metileno-THF e/ou R77 de modo a metil-sulfidrilar O-Acetil-homosserina com metanotiol e/ou R80 to metabolizar sulfato em sulfito e/ou R44 de modo a produzir mais O-Ac-SER e/ou R45 de modo a produzir mais CIS é/são aumentada(s) e/ou introduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida, e/ou a quantidade e/ou atividade das enzimas selecionadas do grupo que consiste de: R3 de modo a produzir menos GLC-LAC e/ou R4 de modo a produzir menos 6-P-Gliconato e/ou R5 de modo a produzir menos RJB-5P e/ou RlO de modo a produzir menos F6P e GA3P e/ou Rl 9 de modo a produzir menos Piruvato e/ou R35 de modo a produzir menos PEP e/ou R79 de modo a produzir menos THF é/são pelo menos parcialmente reduzida(s) comparada(s) com a do organismo de partida

18. Microorganismo do gênero Escherichia, caracterizado pelo fato de que é obtenível por qualquer um dos métodos como definidos nas reivindicações de 15 a 17 preferivelmente selecionados do grupo que consiste de E. coli.

19. Organismo de acordo com as reivindicações 8, 9, 14 ou 18, caracterizado pelo fato de que a metionina é produzida com uma razão molar de metionina para entrada de glicose de pelo menos 10%, de pelo menos 20%, de pelo menos 30%, de pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%.

20. Uso de qualquer um dos organismos como definidos nas reivindicações 8, 9, 14, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser para produzir metionina.

21. Método para produzir metionina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a. cultivar um organismo como definido nas reivindicações 8,9, 14, 18 ou 19 b. isolar a metionina

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado em um meio adequado e opcionalmente tiossulfato, sulfito, sulfeto e/ou compostos Cl tais como formiato ou metanotiol.