BRPI0618080A2 - microorganismo que superproduz l-metionina, processos para a preparação de l-metionina e para a preparação de um aditivo para gêneros alimentìcios para animal contendo l-metionina a partir de caldos de fermentação, e, uso de um microorganismo - Google Patents

Abstract

MICROORGANISMO QUE SUPERPRODUZ L-METJONINA, PROCESSOS PARA A PREPARAçãO DE L-METIONINA E PARA A PREPARAçãO DE UM ADITIVO PARA GêNEROS ALIMENTìCIOS PARA ANIMAL CONTENDO L-METIONINA A PARTIR DE CALDOS DE FERMENTAçãO, E, USO DE UM MICROORGANISMO. A presente invenção se refere a microorganismos e processo para a preparação eficiente de L-aminoácidos, tal como L-metionina. Em particular, a presente invenção se refere a microorganismos e processos nos quais a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido.

Description

"MICROORGANISMO QUE SUPERPRODUZ L-METIONINA, PROCESSOS PARA A PREPARAÇÃO DE L-METIONINA E PARA A PREPARAÇÃO DE UM ADITIVO PARA GÊNEROS ALIMENTÍCIOS PARA ANIMAL CONTENDO L-METIONINA A PARTIR DE CALDOS DE FERMENTAÇÃO, E, USO DE UM MICROORGANISMO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a microorganismos e processos para a preparação eficiente de L-metionina. Em particular, a presente invenção se refere a microorganismos e processos nos quais a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido.

FUNDAMENTO TECNOLÓGICO

Atualmente, a produção anual no mundo todo de metionina é cerca de 500.000 toneladas. Metionina é o primeiro aminoácido limitativo em criação de animais da alimentação de aves e, em virtude disso, principalmente aplicada como um suplemento para ração. Em contraste a outros aminoácidos industriais, a metionina é quase que exclusivamente aplicada como um racemato produzido através de síntese química. Uma vez que animais podem metabolizar estéreo-isômeros de metionina, alimentação da mistura racêmica quimicamente produzida é possível (D1Mello e Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animais: Amino Acids, Rechgigl (Ed.), CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441 -490, 1978).

Contudo, ainda há um grande interesse na substituição da produção química existente por um processo biotecnológico. Isso é em virtude do fato de que em menores níveis de suplementação, a L-metionina é uma melhor fonte de aminoácidos de enxofre do que a D-metionina (Katz e Baker, (1975) Poult. Sei, 545, 1667-74). Além disso, o processo químico usa produtos químicos perigosos e produz correntes residuais substanciais. Todas essas desvantagens de produção química poderiam ser evitadas através de um processo biotecnológico eficiente. Para outros aminoácidos, tal como glutamato, é conhecido produzir os mesmos usando métodos de fermentação. Para essas finalidades, foi provado que determinados microorganismos, tais como Escherichia coli (E. coli) e Corynebaeterium glutamieum (C. glutamieum), são particularmente adequados. A produção de aminoácidos através de fermentação também têm a vantagem particular de que apenas L-aminoácidos são produzidos. Ainda, produtos químicos ambientalmente problemáticos, tais como solventes, etc., os quais são usados em síntese química são evitados. Contudo, a produção fermentativa de metionina através de microorganismos apenas será uma alternativa à síntese química se ela permite a produção de metionina em uma escala comercial em um preço comparável àquele da produção química.

Conseqüentemente, a produção de L-metionina através de cultura em larga escala de bactérias desenvolvidas para produzir e secretar grandes quantidades dessa molécula é um objetivo desejável.

Aperfeiçoamentos no processo podem se referir à medidas de fermentação, tais como agitação e fornecimento de oxigênio ou a composição de meios nutrientes, tal como a substituição de açúcar durante fermentação ou o processamento do produto, por exemplo, através de cromatografia de troca de íons ou as propriedades de rendimento intrínsecas do microorganismo em si.

Métodos de mutagênese, seleção e seleção de mutante também são usados para aperfeiçoar as propriedades de rendimento desses microorganismos. Cepas de alta produção as quais são resistentes a anti- metabólitos ou as quais são auxotróficas para metabólitos de importância regulatória são obtidas dessa maneira.

A tecnologia de DNA recombinante também foi empregada durante alguns anos para aperfeiçoamento de cepas de microorganismo as quais produzem L-aminoácidos através de amplificação de genes da biossíntese de aminoácido individuais e investigação do efeito sobre a produção de aminoácido. Ruckert e colaboradores, Journal of Biotechnology 2003, 104, 213-228 proporcionam uma análise da via biossintética de L-metionina em Corynebacterium glutamicum. Funções conhecidas de MetZ (também conhecido como MetY) e MetB puderam ser confirmadas e foi provado que MetC (também conhecido como AecD) é uma cistationina-P-liase. Ainda, MetE e MetH5 os quais catalisam a conversão de L-homocisteína em L- metionina, foram identificados nesse estudo.

O WO 02/097096 usa seqüências de nucleotídeo de bactérias corineformes as quais codificam o gene repressor McbR (também conhecido como MetD) e processos para a preparação de aminoácidos usando bactérias nas quais o gene repressor McbR é atenuado. De acordo com o WO 02/097096, a atenuação do regulador transcricional McbR melhora a produção de L-metionina em bactérias corineformes. E ainda descrito no WO 02/097096 que, além da atenuação do gene repressor McbR, intensificação ou superexpressão do gene MetB, o qual codifica cistationina-y-sintase, é preferida para a preparação de L-metionina.

A seleção de cepas aperfeiçoadas para a produção de uma molécula em particular é um processo que consome tempo e difícil. Portanto, há ainda uma grande necessidade por microorganismos os quais produzem eficientemente L-metionina e/ou têm teores significativamente aumentados de L-metionina, os quais podem ser utilizados para obtenção dos compostos de metionina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

E um objetivo da presente invenção proporcionar métodos para produção eficiente de L-metionina em microorganismos.

E um outro objetivo da presente invenção proporcionar microorganismos os quais produzem eficientemente L-metionina.

Esses e outros objetivos da invenção, conforme se tornará evidente a partir da descrição, são obtidos a partir do assunto em questão das reivindicações independentes.

Outras modalidades da invenção são definidas pela reivindicações dependentes.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, um microorganismo para a preparação de L-metionina é proporcionado em que a formação e/ou acúmulo de homolantionina, em particular na via de metionina, é reduzido e/ou impedido. Tal redução e/ou prevenção da formação e/ou acúmulo de homolantionina na via para a biossíntese de L-metionina pode tornar possível que um microorganismo produza e secrete grandes quantidades da molécula desejada, isto é, L-metionina.

Em uma outra modalidade da presente invenção, um microorganismo é proporcionado, em que o teor e/ou atividade biológica da proteína reguladora transcricional McbR é reduzida comparado com o microorganismo do tipo selvagem e em que a formação e/ou acúmulo de homolantionina, em particular na via de metionina, é reduzido e/ou impedido.

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, um microorganismo é proporcionado, em que a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido através de redução do teor e/ou da atividade biológica de cistationina-y-sintase (MetB, EC 2.5.1.48) comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

Em outra modalidade da presente invenção, o teor e/ou atividade biológica de MetB é reduzida através de atenuação ou ruptura e/ou eliminação do gene o qual codifica MetB.

De acordo com uma outra modalidade do processo de acordo com a presente invenção, o gene MetB rompido impede a expressão de uma proteína MetB funcional nos microorganismos cultivados.

Em uma modalidade dos microorganismos de acordo com a presente invenção, um gene o qual codifica McbR é atenuado, de preferência rompido e, mais preferivelmente, eliminado. Em particular, o gene McbR rompido pode impedir a expressão de uma proteína McbR funcional em um microorganismo de acordo com a presente invenção.

De acordo com uma outra modalidade, um microorganismo é proporcionado no qual um gene de origem homóloga ou heteróloga que codifica sintase de metionina a qual é capaz de converter eficientemente homocisteína em metionina, isto é, metE (EC 2.1.1.13) e/ou metH (EC 2.1.1.14) é introduzido e/ou super-produzido.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, um processo para a preparação de L-metionina é proporcionado, o qual compreende as seguintes etapas:

- cultura e/ou fermentação de um microorganismo o qual produz a L-metionina e no qual a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido; e

- isolamento de L-metionina.

De acordo com uma outra modalidade do processo de acordo com a presente invenção, organismos são cultivados nos quais o teor e/ou atividade biológica da proteína reguladora transcricional McbR é reduzida comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, microorganismos são cultivados nos quais um gene o qual codifica McbR é atenuado e/ou rompido e/ou eliminado.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, o gene McbR rompido impede a expressão de uma proteína McbR funcional.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, microorganismos são cultivados nos quais um gene heterólogo que codifica um mutante de cistationina-P-liase (MetC) é introduzido, o qual é capaz de converter eficientemente homolantionina em homocisteína.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, microorganismos são cultivados nos quais um gene heterólogo que codifica uma cistationina-y-sintase (MetB) é introduzido, o qual é capaz de converter eficientemente O-acetil-homoserina e cisteína em cistationina e o qual não é capaz de converter O-acetil-homoserina e uma homocisteína em homolantionina.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, microorganismos são cultivados nos quais o teor e/ou a atividade biológica de uma proteína selecionada do grupo consistindo de sulfidrolase de O-acetil-homoserina (MetZ), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II dependente de cob(I)alamina (MetE) é aumentada comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, microorganismos são cultivados nos quais pelo menos um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo de sulfidrolase de Ο- acetil-homoserina (MetZ), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II dependente de cob(I)alamina (MetE) é intensificado e/ou superexpresso comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de bactérias corineformes, micobactérias, streptomycetaceae, salmonella, Escherichia coli, Shigella, Bacillns, Serratia e Pseudomonas.

De acordo com uma outra modalidade preferida do processo da presente invenção, o organismo é Corynebaeterium glutamieum, Eseherichia coli, Saccharomyees eerevisiae ou Bacillus subtilis.

De acordo com uma outra modalidade do processo da presente invenção, o L-aminoácido desejado está concentrado no meio ou nas células do microorganismo.

Em um outro aspecto da presente invenção, um processo para a preparação de uma L-metionina contendo aditivo para gênero alimentício para animal a partir de caldos de fermentação é proporcionado, o qual compreende as seguintes etapas:

- cultura e/ou fermentação de um microorganismo o qual produz L-metionina e no qual a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido em um meio de fermentação;

- remoção de água do caldo de fermentação contendo L- metionina;

- remoção de uma quantidade de 0 a 100% em peso, tal como 10 a 90% em peso ou 20 a 80% em peso ou 30 a 70% em peso ou 40 a 60% em peso ou cerca de 50% em peso da biomassa formada durante fermentação; e

- secagem do caldo de fermentação para obter o aditivo para gênero alimentício para animal na forma em pó ou grânulo.

Ainda, outro aspecto da presente invenção se refere a uso de um microorganismo, em particular Corynebacterium glutamicum no qual a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido para a produção de L-metionina.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura Ia é um modelo da via para biossíntese de L- metionina em microorganismos, tal como C. glutamicum. Enzimas envolvidas são MetA (transacetilase de homoserina), MetB (cistationina-y-sintase), MetZ (sulfidrolase de O-acetilhomoserina), MetC (cistationina-P-liase), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE).

A Figura Ib mostra a estrutura de L-homolantionina (S-[(3S)- 3-amino-3-carbóxipropil]-L-homocisteína).

A Figura 2 mostra espectros da medição fotométrica de grupos SH livres a 412 nm em diferentes pontos de tempo de ensaios com MetC (Fig. 2a) e ensaios com MetB (Fig. 2b). A ruptura no eixo χ entre 80 e 140 minutos é igual ao tempo para separação de MetB através de ultrafiltração. A adição de MetC é indicada por setas cinzas tracejadas. As concentrações correspondentes de substrato e produto, medidas com HPLC, são fornecidas na Tabela 3a e 3b, respectivamente.

A Figura 3 representa um espectro de massa por GC/MS de cistationina MBDSTFA-derivatizada (A) e homolantionina (B). m/z = 678 e m/z = 692 é igual ao m-sinal de cistationina e homolantionina, respectivamente, m-15, m-57 e m-302 característicos também são observados como um desvio de massa de 14. m/z = 170, m/z = 244 e m/z - 272 são fragmentos característicos do resíduo de homocisteína em ambas as moléculas.

A Figura 4 mostra plasmídeos pH430 AMcbR (a), pH238 delta Ahom/Ahsdh-hsk (b) e pSL315 (c).

DESCRIÇÃO_DETALHADA DE_MODALIDADES

EXEMPLIFICATIVAS

Antes de descrever em detalhes modalidades exemplificativas da presente invenção, as seguintes definições são fornecidos.

O termo "eficiência de síntese de metionina" descreve o rendimento de carbono de metionina. Essa eficiência é calculada como um percentual da entrada de energia, a qual entrou no sistema na forma de um substrato de carbono. Por toda a invenção, esse valor é fornecido em valores percentuais ((mol de metionina) (mol de substrato de carbono)"1 χ 100), a menos que de outro modo indicado.

Fontes preferidas de carbono de acordo com a presente invenção são açúcares, tais como mono-, di- ou polissacarídeos. Por exemplo, açúcares selecionados do grupo consistindo de glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose podem servir como fontes particularmente preferidas de carbono. O termo "eficiência aumentada de síntese de metionina" se refere a uma comparação entre um organismo que foi geneticamente modificado e o qual tem uma maior eficiência de síntese de metionina comparado com o organismo do tipo selvagem inicial.

O termo "rendimento de metionina" descreve o rendimento de metionina o qual é calculado como a quantidade de metionina obtida por massa de célula em peso.

O termo "via de metionina" é reconhecido na técnica e descreve uma série de reações as quais ocorrem em um organismo do tipo selvagem e levam à biossíntese de metionina. A via pode variar de organismo para organismo. Os detalhes de uma via organismo-específica podem ser tirados de livros texto e da literatura específica listada no website http://www.genome.jp/hegg/metabolism.html. Em particular, uma via de metionina dentro do significado da presente invenção é mostrada na Figura 1.

O termo "rendimento de homolantionina" descreve o rendimento de homolantionina, o qual é calculado como a quantidade de homolantionina obtida por massa de célula em peso.

Redução e/ou prevenção da formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina significa que homolantionina é produzida com uma eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de preferência de menos de 90%, menos de 70%, menos de 50%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% comparado com a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade em um microorganismo que produz metionina no qual a atividade de enzimas da via de metionina, tais como MetB, MetC, MetZ, MetE e/ou MetH, não é alterada de acordo com a presente invenção.

As definições conforme fornecido acima com relação à metionina e homolantionina se aplicam, correspondentemente, a outros metabólitos da via de metionina. O termo "organismo" ou "microorganismo", para fins da presente invenção, se refere a qualquer organismo que é comumente usado para a produção de aminoácidos, tal como metionina. Em particular, o termo "organismo" se refere a procariotas, eucariotas inferiores e plantas. Um grupo preferido dos organismos acima mencionados compreende actino bactérias, ciano bactérias, proteo bactérias, Chloroflexus aurantiaeus, Pirellula sp. 1, halo bactérias e/ou metanococos, de preferência bactérias corineformes, mico bactérias, streptomyces, salmonella, Escherichia eoli, Shigella e/ou Pseudomonas. Microorganismos particularmente preferidos são selecionados de Corynebacterium glutamicum, Eseherichia eoli, microorganismos do gênero Baeillus, particularmente Bacillus subtilis, e microorganismos do gênero Streptomyces.

Os organismos da presente invenção podem, contudo, também compreender levedos, tais como Schizosaceharomyees pombe ou eerevisiae e Pichia pastoris.

O termo "microorganismo que super-produz L-metionina", para fins da presente invenção, se refere a um microorganismo no qual, comparado com um microorganismo do tipo selvagem, a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de produção de metionina é aumentada em pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900% ou pelo menos 1000% ou mais.

Plantas são também consideradas pela presente invenção para a produção de microorganismos. Tais plantas podem ser monocots ou dicots, tais como plantas de safra monocotiledôneas ou dicotiledôneas, plantas alimentícias ou plantas de forragem. Exemplos de plantas monocotiledôneas são plantas pertencendo aos gêneros de avena (aveias), tritieum (trigo), seeale (centeio), hordeum (cevada), oryza (arroz), panieum, pennisetum, setaria, sorghum (painço), zea (milho) e semelhantes. Plantas de safra dicotiledôneas compreendem, inter alia, algodão, leguminosas, tais como sementes comestíveis e, em particular, alfafa, soja, colza, tomate, beterraba sacarínica, batata, plantas ornamentais, bem como árvores. Outras plantas de safra podem compreender frutas (em particular maçãs, pêras, cerejas, uvas, cítricas, abacaxi e bananas), palmas oleosas, arbustos de chá, árvores de cacau e árvores de café, tabaco, sisal, bem como plantas medicinais relacionadas, rauwolfia e digitalis. Particularmente preferidos são os grãos trigo, centeio, aveias, cevada, arroz, milho e painço, beterraba sacarínica, colza, soja, tomate, batata e tabaco. Outras plantas de safra podem ser tiradas do US 6.137.030.

O termo "organismo do tipo selvagem" ou "microorganismo do tipo selvagem" se refere a um organismo que não foi geneticamente modificado.

O termo "metabólito" se refere a compostos químicos que são usados nas vias metabólicas de organismos como precursores, intermediários e/ou produtos finais. Tais metabólitos podem não apenas servir como unidades de construção química, mas também podem exercer uma atividade regulatória sobre enzimas e sua atividade catalítica. É sabido na literatura que tais metabólitos podem inibir ou estimular a atividade de enzimas (Stryer, Biochemistry, (1995) W.H. Freeman & Company, New York, New York).

Para fins da presente invenção, o termo "metabólito externo" compreende substratos tais como glicose, sulfato, tiossulfato, sulfito, sulfeto, amônia, oxigênio, etc. Em determinadas modalidades, metabólitos (externos) compreendem os assim denominados Cl-metabólitos. Os últimos metabólitos podem funcionar, por exemplo, como doadores de metila, e compreendem compostos tais como formato, formaldeído, metanol, metanotiol, sulfóxido de dimetila, etc.

O termo "produtos" compreende metionina, biomassa, CO2, etc. Aminoácidos compreendem as unidades estruturais básicas e, como tal, são essenciais para funcionamento celular normal em organismos. O termo "aminoácido" é bem conhecido na técnica. Os aminoácidos proteinogênicos, dos quais existem 20 espécies, servem como unidades estruturais para proteínas, nas quais eles são ligados por ligações peptídicas, enquanto que os aminoácidos não-proteinogênicos não são normalmente encontrados em proteínas (veja Ullmann1S Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, páginas 57-97, VCH, Weinheim (1985)). Aminoácidos podem estar na configuração D- ou L-óptica, embora L-aminoácidos sejam geralmente o único tipo encontrado em proteínas que ocorrem naturalmente.

As vias biossintética e degradativa de cada um dos 20 aminoácidos proteinogênicos foram bem caracterizadas em células procariotas e eucariotas (veja, por exemplo, Stryer, L. Biochemistry, 3a edição, páginas 578-590 (1988)). Os aminoácidos essenciais, isto é, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina, os quais são geralmente um requisito nutricional em virtude da complexidade de sua biossíntese, são prontamente convertidos por vias biossintéticas simples aos 11 aminoácidos não-essenciais restantes, isto é, alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, prolina, serina e tirosina. Animais superiores retêm a capacidade de sintetizar alguns desses aminoácidos, mas os aminoácidos essenciais devem ser fornecidos a partir da dieta de forma que síntese normal de proteína ocorra. Além de sua função na biossíntese de proteína, esses aminoácidos são produtos químicos interessantes em si e descobriu-se que muitos têm várias aplicações nas indústrias de alimento, ração, química, cosmética, agrícola e farmacêutica. Lisina é um aminoácido importante na nutrição não apenas de seres humanos, mas também de animais monogástricos, tais como ave e suíno. Glutamato é mais comumente usado como um aditivo flavorizante e é amplamente usado por toda a indústria de alimento, assim como o aspartato, fenilalanina, glicina e cisteína. Glicina, L-metionina e triptofano são todos utilizados na indústria farmacêutica.

Glutamina, valina, leucina, isoleucina, histidina, arginina, prolina, serina e alanina são de uso nas indústrias farmacêutica e cosmética.

Treonina, triptofano e D/L-metionina são aditivos comuns para ração (Leuchtenberger, W. (1996), Amino acids - technical production and use, páginas 466-502 em Rehm e colaboradores (editores) Biotechnology, Vol. 6, Capítulo 14a, VCH: Weinheim). Adicionalmente, descobriu-se que esses aminoácidos são úteis como precursores para a síntese de aminoácidos e proteínas sintéticos, tais como N-acetil cisteína, S-carbóximetil-L-cisteína, (S)-5-hidróxitriptofano e outros descritos em Ullmann1S Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, páginas 57-97, VCH: Weinheim, 1985.

A biossíntese desses aminoácidos naturais em organismos capazes de produzir os mesmos, tais como bactérias, foi bem caracterizada (para revisão da biossíntese de aminoácidos bacteriana e regulação da mesma (veja, Umbarger Η. E. (1978), Ann. Rev. Biochem. 47:533-606). Glutamato é sintetizado através da aminação redutiva de α-cetoglutarato, um intermediário no ciclo de ácido cítrico. Glutamina, prolina e arginina são, cada um, subseqüentemente produzidos a partir de glutamato. A biossíntese de serina é um processo em três etapas começando com 3-fosfoglicerato (um intermediário na glicólise) e resulta nesse aminoácido após etapas de oxidação, transaminação e hidrólise. Cisteína e glicina são produzidos a partir de serina; o primeiro através da condensação de homocisteína com serina e o último através de transferência do átomo de β-carbono da cadeia lateral para tetrahidrofolato, em uma reação catalisada pela transhidróximetilase de serina. Fenilalanina e tirosina são sintetizados a partir dos precursores da via de fosfato de pentose e glicolítica eritrose-4-fosfato e fosfoenolpiruvato em uma via biossintética com 9 etapas que difere apenas nas duas etapas finais após a síntese de prefenato. Triptofano é também produzido a partir dessas duas moléculas iniciais, mas sua síntese é uma via com onze etapas. Tirosina também pode ser sintetizada a partir de fenilalanina em uma reação catalisada por hidroxilase de fenilalanina. Alanina, valina e leucina são todos produtos biossintéticos do piruvato, o produto final da glicólise. Aspartato é formado a partir de oxaloacetato, um intermediário do ciclo de ácido cítrico. Asparagina, metionina, treonina e lisina são, cada um, produzidos através da conversão de aspartato. Isoleucina pode ser formada a partir de treonina. Uma via com nove etapas complexa resulta na produção de histidina a partir de 5-fosforibosil-1- pirofosfato, um açúcar ativado.

Aminoácidos em excesso na síntese de proteína necessários para a célula não podem ser armazenados e são, antes, degradados para proporcionar intermediários para as principais vias metabólicas da célula (para uma revisão veja Stryer, L., Biochemistry, 3a edição, Capítulo 21 "Amino acid degradation and the urea cycle", páginas 495-516 (1988)). Embora a célula seja capaz de converter aminoácidos indesejáveis em intermediários metabólicos úteis, a produção de aminoácidos é trabalhosa em termos de energia, moléculas precursoras e as enzimas necessárias para sintetizar os mesmos. Assim, não é surpreendente que a biossíntese de aminoácido seja regulada através de inibição de feedback, na qual a presença de um aminoácido em particular serve para diminuir ou parar totalmente sua própria produção (para uma visão geral de mecanismos de feedback em vias biossintéticas de aminoácido, veja Stryer, L., Biochemistry, 3a edição, Capítulo 24: "Biosynthesis of amino acids e heme", páginas 575-600 (1988)). Assim, o rendimento de qualquer aminoácido em particular está limitado pela quantidade desse aminoácido presente na célula.

A bactéria do solo Gram-positiva Corynebacterium glutamicum é amplamente usada para a produção industrial de diferentes aminoácidos. Embora a biossíntese de lisina e glutamato, os principais produtos industriais, tenha sido estudada durante muitos anos, conhecimento a respeito da regulação da via biossintética de metionina é limitado. Pelo menos, as enzimas chave da via são conhecidas (veja Fig. 1). C. glutamicum ativa homoserina através de acetilação com homoserina-O-acetiltransferase (MetA) (EC 2.3.1.31). Foi ainda mostrado que a trans-sulfurização e sulfidrilação direta são usadas para produzir homocisteína (Hwang, B. J., Yeom, H. J., Kim5 Y., Lee, H. S., J. Bacteriol. 2002, 1845, 1277-86). Trans- sulforização é catalisada por cistationina-y-sintase (MetB) (EC 2.5.1.48) (Hwang, B. J., Kim, Y., Kim, H. B., Hwang, H. J., Kim, J. H., Lee, H. S., Mol Cells 1999, 93, 300-8). Nessa reação, cisteína e O-acetil-homoserina são combinados em cistationina, a qual é hidrolisada pela cistationina-P-liase (MetC, o qual é também conhecido como AecD) (EC 4.4.1.8) (Kim, J. W., Kim, H. J., Kim, Y., Lee, M. S., Lee, H. S., Mol Cells 2001, 112, 220-5; Ruckert e colaboradores, 2003, vide supra) em homocisteína, piruvato e amônia. Na sulfidrilação direta, sulfidrolase de O-acetilhomoserina (MetZ o qual é também conhecido como MetY) (EC 2.5.1.49) (Ruckert e colaboradores, 2003, vide supra) converte O-acetilhomoserina e sulfeto em homocisteína e acetato. Finalmente, C. glutamicum tem duas enzimas diferentes para a S-metilação de homocisteína, proporcionando metionina (Lee, H. S., Hwang, B. J., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 625-6, 459-67; Ruckert e colaboradores, 2003, vide supra), isto é, uma metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) (EC 2.1.1.13) e a metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE) (EC 2.1.1.14). A primeira utiliza 5- metiltetrahidrofolato e a última 5-metilltetrahidropteroiltri-L-glutamato como o doador de metila.

Recentemente, uma proteína reguladora transcricional putativa da família TetR foi descoberta (Rey e colaboradores, Journal of Biotechnology 2003, 103, 51-65). Foi mostrado que esse regulador reprime a transcrição de vários genes pertencendo ao metabolismo de metionina e enxofre. O knockout do gene da proteína reguladora levou a uma expressão aumentada de hom que codifica desidrogenase de homoserina, metZ que codifica sulfidrolase de O- acetilhomoserina, metK que codifica sintase de S- adenosilmetionina (SAM) (EC 2.5.1.6), cysK que codifica sintase de cisteína (EC 2.5.1.47), cysl que codifica uma reductase de sulfeto NADPH- dependente putativa e, finalmente, ssuD, que codifica uma monooxigenase de alcano-sulfonato putativa. Rey e colaboradores (Molecular Microbiology 2005, 56, 871-887) também descobriram que o gene metB é significativamente induzido em uma cepa mcbR menos.

A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que redução e/ou prevenção da formação de homolantionina, em particular redução e/ou prevenção da formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina pode aumentar a eficiência da síntese e/ou o rendimento de compostos desejáveis, tal como L-metionina, no microorganismo.

A formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina pode ser reduzida e/ou impedida através de redução de eficiência e/ou rendimento de ou através de supressão da conversão MetB-catalisada de O-acetil-homoserina homocisteína em homolantionina. Redução da eficiência ou supressão da conversão MetB-catalisada de O-acetil-homoserina homocisteína em homolantionina significa que homolantionina é produzida com uma eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de menos de 90%, menos de 70%, menos de 50%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% comparado com a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade em um microorganismo que produz metionina no qual a atividade de MetB não foi alterada.

Além disso ou alternativamente, a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina pode ser reduzida e/ou impedida através de aumento da eficiência e/ou rendimento da clivagem MetC-catalisada de homolantionina com água em homocisteína, 2-oxobutanoato e NH/. Aumento da eficiência da clivagem MetC-catalisada de homolantionina com água em homocisteína, 2-oxobutanoato e NH4"1", significa que a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de produção de homocisteína a partir de homolantionina é aumentada em pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% comparado com a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade em um microorganismo que produz metionina no qual a atividade de MetB e/ou MetC não é alterada.

A eficiência e/ou rendimento de síntese de L-metionina no microorganismo pode ser ainda aumentada se o teor e/ou atividade biológica da proteína reguladora transcricional McbR é reduzida comparado com o microorganismo do tipo selvagem. Conseqüentemente, em um aspecto da presente invenção, microorganismos são proporcionados, nos quais o teor e/ou atividade biológica da proteína reguladora transcricional McbR é reduzida comparado com o microorganismo do tipo selvagem e em que a formação de homolantionina na via de metionina é impedida.

O knockout do regulador transcricional McbR em microorganismos, tal como Corynebacterium glutamicum, tem diversas conseqüências para o metabolismo celular. Por exemplo, o knockout do repressor transcricional McbR em Corynebacterium glutamicum tem um forte impacto sobre o metabolismo celular. O fenótipo inclui crescimento reduzido, rendimento reduzido de biomassa e acúmulo intracelular de precursores de metionina, tais como cisteína e homocisteína. De modo interessante, nenhum acúmulo de metionina pôde ser observado. Contudo, descobriu-se, no contexto da presente invenção, que o knockout de McbR também leva ao acúmulo de homolantionina e uma síntese de isoleucina independente de treonina. Acúmulo de homolantionina por outros organismos foi descrito em estudos anteriores. Uma cepa auxotrófica para metionina de E. coli acumula grandes quantidades de homolantionina (Huang, H. T., Biochemistry 1963, 2, 296-8). Também, Aspergillus nidulans auxotrófico para metionina acumula homolantionina (Paszewski, A., Grabski, J., Acta Biochim. Pol. 1975, 223, 263-8). Como um para ambos os organismos investigados era um knockout da sintase de metionina. Mas, também, a cistationase de fígado humano pode acumular homolantionina (Tallan, Η. H. e colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 1971, 432, 303-10).

Adicionalmente, cistationase de Streptomyces phaeochromogenes foi usada para síntese in vitro de homolantionina (Kanzaki, H. e colaboradores, Agric Biol Chem 1986, 502, 391-397) e cistationina-y-sintase de Arabidopsis thaliana produziu homolantionina a partir de homocisteína e O-acetil-homoserina in vitro ( Ravanel, S. e colaboradores, Biochem J 1998,331 ( Pt 2), 639-48).

Para um organismo tal como C. glutamicum, descobriu-se agora que a formação de homolantionina (veja Fig 3) é uma reação colateral de MetD em virtude dos altos níveis intracelulares de homocisteína. Em virtude da baixa especificidade de substrato e titulações elevadas de homocisteína, MetB incidentalmente usa homocisteína ao invés de cisteína como um substrato, junto com O-acetil-homoserina. Essa reação proporciona homolantionina ao invés de cistationina. A pobre clivagem de homolantionina por MetC leva a um acúmulo tremendo de homolantionina.

O nível elevado de homocisteína, especialmente nas cepas McbK-knockout (as quais também são designadas como cepas C. glutamicum AMcbR) pode ser causado pela superexpressão de desidrogenase de homoserina (Horn), sulfidrolase de O-acetilhomoserina (MetZ) e sintase de S- adenosilmetionina (MetK) (Rey e colaboradores, 2003, vide supra). Horn e MetZ provavelmente levam a um aumento direto das titulações de homocisteína, enquanto que MetK converte metionina em SAM a qual é, então, convertida em homocisteína de S-adenosila novamente em homocisteína. Além do nível elevado de homocisteína, a formação de homolantionina é favorecida através de uma superexpressão de MetB em cepas knockout para McbR. Agora, foi mostrado que os extratos brutos de cepas knockout para McbR podem exibir uma atividade de MetB de quase 3 vezes comparado com o tipo selvagem.

Para confirmar que homolantionina é formada em C. glutamicum através de uma reação colateral de MetB, MetB sofreu knockout em C. glutamicum AMcbR. Sustentando nossas descobertas, o knockout de MetB impediu completamente o acúmulo de homolantionina em C. glutamicum AMcbR. A lenta clivagem de homolantionina por MetC leva a um ciclo metabólico aberto onde homocisteína é reciclada, mas O-acetil- homoserina é convertido em acetato, 2-oxobutanoato em amônia. Esse ciclo não apenas consome acetil-CoA, mas fornece um precursor importante de isoleucina: 2-oxobutanoato. Isso permite que cepas AMcbR sintetizem isoleucina através de uma via independente de treonina.

Conseqüentemente, de acordo com outra modalidade da presente invenção, a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina de um microorganismo é reduzido e/ou impedido através de redução do teor e/ou da atividade biológica de cistationina-y-sintase (MetB) comparado com o microorganismo do tipo selvagem. O teor e/ou a atividade biológica de cistationina- γ-sintase (MetB) pode ser reduzida comparado com o microorganismo do tipo selvagem através de atenuação e/ou ruptura e/ou eliminação de um gene o qual codifica MetB. Em particular, o gene MetB rompido no microorganismo de acordo com a presente invenção impede a expressão de uma proteína MetB funcional. Conforme é mostrado nos exemplos, o knockout de MetB impede completamente o acúmulo de homolantionina em microorganismos, tais como Coiynebacterium glutamicum e C. glutamicum AMcbR.

Ainda, a formação de homolantionina na via de metionina pode ser reduzida e/ou impedida através de introdução de um gene heterólogo que codifica um mutante de cistationina-P-liase (MetC) o qual é capaz de converter eficientemente homolantionina em homocisteína.

Um mutante de cistationina-p-liase (MetC) o qual é capaz de converter eficientemente homolantionina em homocisteína é caracterizado pelo fato de que a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de produção de homocisteína a partir de homolantionina é aumentada em pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% comparado com a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade em um microorganismo que produz metionina no qual a atividade de MetB e/ou MetC não é alterada.

O acúmulo de homocisteína e cisteína poderia ser considerado como benéfico para a superprodução de metionina, em particular se a homocisteína acumulada é ainda metabolizada em metionina catalisada pelas atividades de metH e/ou metE.

Ainda, a formação de homolantionina na via de metionina pode ser reduzida e/ou impedida através de introdução de um gene heterólogo que codifica um mutante de a cistationina-y-sintase (MetB) o qual é capaz de converter eficientemente O-acetil-homoserina e cisteína em cistationa e o qual não é capaz de converter O-acetil-homoserina e homocisteína em homolantionina.

Um mutante de cistationina-y-sintase (MetB) o qual é capaz de converter eficientemente O-acetil-homoserina e cisteína em cistationa é caracterizado pelo fato de que a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de produção de cistationa a partir de cisteína e O-acetil-homoserina é aumentada em pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% comparado com a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade em um microorganismo que produz metionina no qual a atividade de MetB não é alterada.

Um mutante de cistationina-y-sintase (MetB) o qual não é capaz de converter O- acetil-homoserina e homocisteína em homolantionina é caracterizado pelo de que homolantionina é produzida com uma eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de menos de 70%, menos de 50%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10% ou menos de 5% comparado com a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade em um microorganismo que produz metionina no qual a atividade de MetB não é alterada.

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, um microorganismo é proporcionado em que o teor e/ou atividade biológica de uma proteína selecionada do grupo consistindo de sulfidrolase de O-acetil- homoserina (MetZ), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE) é intensificada e/ou superexpressada comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

Aumento ou diminuição do teor ou quantidade e/ou atividade biológica de uma enzima deve ser compreendido com relação à direção na qual a reação deverá ser ainda conduzida ou canalizada. Aumento do teor e/ou atividade biológica de uma enzima ou diminuição do teor e/ou atividade biológica de uma enzima são compreendidos por influenciar a quantidade e/ou atividade da enzima de uma forma tal que mais ou menos produto, de acordo com a via mostrada na Figura 1, é obtido.

Em uma modalidade da invenção, pode ser suficiente modificar a quantidade e/ou atividade de apenas uma enzima da via de metionina. Alternativamente, a quantidade e/ou atividade de várias enzimas dessa via metabólica pode ser modificada. Alternativamente, a quantidade e/ou atividade de várias ou todas as enzimas da via de metionina pode ser influenciada ao mesmo tempo. Como tais organismos podem ser obtidos através de modificação genética pertence ao conhecimento geral na técnica.

Na tabela a seguir, exemplos específicos são fornecidos para enzimas da via de metionina cujo teor e/ou atividade biológica pode ser modificada de forma a aumentar a eficiência da síntese de metionina.

Tabela 1

<table>table see original document page 23</column></row><table> <table>table see original document page 24</column></row><table> <table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table> <table>table see original document page 28</column></row><table> <table>table see original document page 29</column></row><table> Através de correção genética de organismos de acordo com a presente invenção, a eficiência e/ou rendimento de síntese de metionina pode ser aumentada de modo que esses organismos que superproduzem metionina são caracterizados pelo fato de que metionina é produzida com uma eficiência e/ou rendimento, de preferência, de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%. Comparado com um microorganismo do tipo selvagem, a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de produção de metionina no organismo que superproduz metionina de acordo com a presente invenção é aumentada, de preferência, em pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500 %, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900% ou pelo menos 10000% ou mais.

O microorganismo de acordo com a presente invenção pode ser selecionado do grupo consistindo de bactérias corineformes, micobactérias, streptomycetes, Salmonella, Escherichia eoli, Shigella, Bacillus, Serratia e Pseudomonas.

Os organismos da presente invenção podem, de preferência, compreender um microorganismo do gênero Corynebaeterium, particularmente Corynebaeterium aeetoaeidophilum, C. aeetoglutamieum, C. aeetophilum, C. ammoniagenes, C. glutamieum, C. lilium, C. nitrilophilus ou C. spee. Os organismos de acordo com a presente invenção também compreendem membros do gênero Brevibaeterium, tais como Brevibaeterium harmoniagenes, Brevibaeterium botanicum, B. divaratieum, B. flavam, B. healil, B. ketoglutamieum, B. ketosoreduetum, B. laetofermentum, B. linens, B. paraphinolyticum e B. spee. Em particular, microorganismos Corynebaeterium podem ser selecionado do grupo consistindo de Corynebaeterium glutamieum (ATCC 13032), Corynebaeterium aeetoglutamieum (ATCC 15806), Corynebaeterium aeetoaeidophilum (ATCC 13870), Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539), Corynebaeterium melassecola (ATCC 17965), Corynebacterium glutamieum (KFCC 10065), Corynebacterium glutamieum (DSM 17322), Corynebaeterium effieiens (YS-314) e Corynebaeterium glutamieum (ATCC21608).

A abreviação KFCC significa Korean Federation of Culture Collection, enquanto que a abreviação ATCC significa American Type Strain Culture Collection. A abreviação DSM significa German Resource Centre for Biological Material.

Microorganismos do gênero Escheriehia podem ser selecionado do grupo compreendendo Eseheriehia eoli. Microorganismos do gênero Salmonella podem ser selecionado do grupo compreendendo Salmonella typhimurium. Em algumas modalidades da presente invenção, o organismo é selecionado do grupo consistindo de Corynebaeterium glutamieum, Escheriehia eoli, Saccharomyees cerevisiae e Bacillus subtilis.

Com relação ao aumento ou diminuição do teor ou quantidade e/ou atividade biológica de uma enzima, todos os métodos que são conhecidos na técnica para aumento da quantidade e/ou atividade de uma proteína em um hospedeiro, tais como os organismos mencionados acima, podem ser usados.

A quantidade da enzima pode ser aumentada através de expressão de uma versão exógena da respectiva proteína. Ainda, expressão da proteína endógena pode ser aumentada influenciando a atividade do promotor e/ou elementos intensificadores e/ou outras atividades regulatórias, tais como fosforilação, sumoilação, ubiquitilação, etc., que regulam as atividades das respectivas proteínas em um nível transcricional, traducional ou pós- traducional.

Além de simplesmente aumento da quantidade, por exemplo, das enzimas mencionadas antes, atividade das proteínas pode ser aumentada usando enzimas as quais trazem mutações específicas que permitem uma atividade aumentada da enzima. Tais mutações podem, por exemplo, inativar as regiões de uma enzima que são responsáveis pela inibição de feedback. Através de mutação, por exemplo, através de introdução de mutações não conservativas, a enzima não proporciona mais regulação de feedback e, assim, a atividade da enzima não é sub-regulada se mais produtos são produzidos. As mutações podem ser introduzidas na cópia endógena da enzima ou podem ser proporcionadas através de superexpressão de uma forma mutante correspondente da enzima exógena. Tais mutações podem compreender mutações de ponto, deleções ou inserções. Mutações de ponto podem ser conservativas ou não conservativas. Além disso, deleções podem compreender apenas dois ou três aminoácidos até domínios completos da respectiva proteína.

Assim, o aumento da atividade e da quantidade de uma proteína pode ser obtido através de diferentes vias, por exemplo, através de interrupção de mecanismos regulatórios inibitórios a nível de transcrição, tradução ou proteína ou através de aumento de expressão de gene de um ácido nucleico que codifica essas proteínas em comparação com o tipo selvagem, por exemplo, através de indução do gene metC endógeno ou através de introdução de ácidos nucleicos que codificam MetC.

Em uma modalidade, o aumento da atividade enzimática e quantidade, respectivamente, em comparação com o tipo selvagem é obtido através de um aumento da expressão do gene de um ácido nucleico que codifica enzimas tais como MetC, MetZ, MetE e MetH. Seqüências podem ser obtidas a partir dos respectivos bancos de dados, por exemplo, no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBL (http ://www. embl. org), Expasy (http://www.expasy.org/), KEGG (http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg.html) etc. Exemplos são fornecidos na Tabela 1.

Em uma outra modalidade, o aumento da quantidade e/ou atividade das enzimas da Tabela 1 é obtido através de introdução de ácidos nucleicos que codificam as enzimas da Tabela 1 no organismo, de preferência C. glutamicum ou E. coli.

Em princípio, proteínas de diferentes organismos tendo a atividade enzimática das proteínas listadas na Tabela 1 podem ser usadas, se aumento da quantidade e/ou atividade é considerado. Com seqüências de ácido nucleico genômicas de tais enzimas de fontes eucariotas contendo íntrons, seqüências de ácido nucleico já processadas, tais como os cDNAs correspondentes, têm de ser usadas no caso em que o organismo hospedeiro não é capaz ou não pode ser tornado capaz de se dividir nos mRNAs correspondentes. Todos os ácidos nucleicos mencionados na descrição podem ser, por exemplo, uma seqüência de RNA, DNA ou cDNA.

Em um processo de acordo com a presente invenção para preparo de organismos com eficiência aumentada de síntese de metionina, uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma das enzimas reguladas por retroalimentação ou independentes por retroalimentação, funcionais ou não funcionais, acima mencionadas é transferida para um microorganismo, tal como C. glutamicum ou E. coli, respectivamente. Essa transferência leva a um aumento da expressão da enzima, respectivamente e, correspondentemente, a mais fluxo metabólico através de da via de reação desejada.

De acordo com a presente invenção, aumento ou introdução da quantidade e/ou atividade de uma proteína compreende, tipicamente, as seguintes etapas:

a) produção de um vetor compreendendo as seguintes seqüências de ácido nucleico, de preferência seqüências de DNA, na orientação 5-3':

- uma seqüência promotora funcional nos organismos da invenção;

- operativamente ligada a um seqüência de DNA que codifica uma proteína da Tabela 1 ou uma parte equivalente funcional da mesma; - uma seqüência de terminação funcional dos organismos da invenção;

b) transferência do vetor da etapa a) para os organismos da invenção, tais como C. glutamicum ou E. coli e, opcionalmente, integração nos respectivos genomas.

Quando partes funcionalmente equivalentes de enzimas são mencionadas dentro do escopo da presente invenção, fragmentos de seqüências de ácido nucleico que codificam enzimas da Tabela 1 são considerados, cuja expressão ainda leva à proteínas tendo a atividade enzimática da respectiva proteína de comprimento total.

De acordo com a presente invenção, enzimas não funcionais têm as mesmas seqüências de ácido nucleico e seqüências de aminoácido, respectivamente, que as enzimas funcionais e partes funcionalmente equivalentes das mesmas, respectivamente, mas têm, em algumas posições, mutações de ponto, inserções ou deleções de nucleotídeos ou aminoácidos, as quais têm o efeito de que a enzima não funcional não é, ou apenas até uma extensão muito limitada, capaz de catalisar a respectiva reação. Essas enzimas não funcionais diferem das enzimas que ainda são capazes de catalisar a respectiva reação, mas não são mais reguladas por feedback. Enzimas não funcionais também compreendem enzimas tais como da Tabela 1 trazendo mutações de ponto, inserções ou deleções a nível da seqüência de ácido nucleico ou a nível da seqüência de aminoácido e não são, todavia, capazes de interagir com parceiros de ligação fisiológicos das enzimas. Tais parceiros de ligação fisiológicos compreendem, por exemplo, os respectivos substratos. Mutantes não funcionais são incapazes de catalisar uma reação a qual a enzima do tipo selvagem, a partir da qual um mutante é derivado, pode catalisar.

De acordo com a presente invenção, o termo "enzima não funcional" não compreende genes ou proteínas não tendo homologia de seqüência essencial às respectivas enzimas funcionais a nível de aminoácido e a nível de ácido nucleico, respectivamente. Proteínas incapazes de catalisar as respectivas reações e não tendo homologia de seqüência essencial com a respectivamente com a respectiva enzima são, portanto, por definição, não abrangidas pelo termo "enzima não funcional" da presente invenção. Enzimas não funcionais são, dentro do escopo da presente invenção, também referidas como enzimas inativadas ou inativas.

Portanto, enzimas não funcionais da Tabela 1 de acordo com a presente invenção trazendo as mutações de ponto, inserções e/ou deleções acima mencionadas são caracterizadas por uma homologia de seqüência essencial às enzimas do tipo selvagem da Tabela 1 de acordo com a presente invenção ou partes funcionalmente equivalentes das mesmas.

De acordo com a presente invenção, uma homologia de seqüência substancial é geralmente compreendida como indicando que a seqüência de ácido nucleico ou a seqüência de aminoácido, respectivamente, de uma molécula de DNA ou uma proteína, respectivamente, é pelo menos 40% de preferência, pelo menos 50%, ainda preferido pelo menos 60%, também de preferência pelo menos 70%, particularmente de preferência pelo menos 90%, em particular de preferência pelo menos 95% e, mais preferivelmente, pelo menos 98% idêntica às seqüências de ácido nucleico ou seqüências de aminoácido, respectivamente, das proteínas da Tabela 1 ou partes funcionalmente equivalentes das mesmas.

A identidade de duas proteínas é compreendida como sendo a identidade dos aminoácidos sobre o respectivo comprimento inteiro da proteína, em particular a identidade Lasergene pela DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (EUA) aplicando o método CLUSTAL (Higgins e colaboradores, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151).

Homologias também podem ser calculadas com o auxílio do software Lasergene pela DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (EUA) aplicando o método CLUSTAL (Higgins e colaboradores, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151).

A identidade de seqüências de DNA é correspondentemente compreendida.

O método mencionado acima pode ser usado para aumento da expressão de seqüências de DNA que codificam enzimas reguladas por retroalimentação ou independentes por retroalimentação, funcionais ou não funcionais, da Tabela 1 ou partes funcionalmente equivalentes das mesmas. O uso de tais vetores compreendendo seqüências regulatórias, tais como seqüências de terminação e promotoras, é conhecido por aqueles habilitados na técnica. Além disso, aqueles habilitados na técnica sabem como um vetor da etapa a) pode ser transferido para organismos tais como C. glutamicum ou E. coli e quais propriedades um vetor deve ter para ser capaz de ser integrado em seus genomas.

Se o teor de enzima em um organismo, tal como C. glutamicum, é aumentado através de transferência de um ácido nucleico que codifica uma enzima de outro organismo tal como, por exemplo, E. coli, é aconselhável transferir a seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de ácido nucleico, por exemplo, de E. coli, através de re-tradução da seqüência de polipeptídeo de acordo com o código genético em uma seqüência de ácido nucleico compreendendo principalmente aqueles códons, os quais são usados mais freqüentemente em virtude do uso de códon organismo-específico. O uso de códon pode ser determinado por meios de avaliações em computador de outros genes conhecidos dos organismos relevantes.

De acordo com a presente invenção, um aumento da expressão de gene e atividade de gene, respectivamente, de uma ácido nucleico que codifica uma enzima da Tabela 1 é também compreendido como sendo a manipulação da expressão das respectivas enzimas endógenas de um organismo, em particular, C. glutamicum ou E. coli. Isso pode ser obtido, por exemplo, através de alteração da seqüência de DNA do promotor para genes que codificam essas enzimas. Tal alteração, a qual causa uma taxa de expressão alterada, de preferência aumentada, dessas enzimas pode ser obtida através de deleção ou inserção de seqüências de DNA.

Uma alteração da seqüência promotora de genes endógenos usualmente causa uma alteração da quantidade expressa do gene e, portanto, também uma alteração da atividade detectável na célula ou no organismo.

Além disso, uma expressão alterada e aumentada, respectivamente, de um gene endógeno pode ser obtida por uma proteína regulatória, a qual não ocorre no organismo transformado e a qual interage com o promotor desses genes. Tal regulador pode ser uma proteína quimérica consistindo de um domínio de ligação a DNA e um domínio ativador de transcrição conforme, por exemplo, descrito no WO 96/06166.

Uma outra possibilidade para aumento da atividade e do teor de genes endógenos é super-regular fatores de transcrição envolvidos na transcrição dos genes endógenos, por exemplo, por meio de superexpressão. As medidas para superexpressão de fatores de transcrição são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e são também divulgadas para as enzimas da Tabela 1 dentro do escopo da presente invenção.

Além disso, uma alteração da atividade de genes endógenos pode ser obtida através de mutagênese objetivada das cópias do gene endógeno.

Uma alteração dos genes endógenos que codificam as enzimas da Tabela 1 pode também ser obtida influenciando as modificações pós- traducionais das enzimas. Isso pode acontecer, por exemplo, através de regulação da atividade de enzimas tais como quinases ou fosfatases envolvidas na modificação pós-traducional das enzimas por meio de medidas correspondentes, tais como superexpressão ou silenciamento de gene. Em outra modalidade, uma enzima pode ter a eficiência aperfeiçoada ou sua região de controle alostérica destruída, de modo que inibição de feedback de produção do composto é impedida. Similarmente, uma enzima degradativa pode ser deletada ou modificada através de substituição, deleção ou adição, de modo que sua atividade degradativa é diminuída para a enzima desejada da Tabela 1 sem prejudicar a viabilidade da célula. Em cada caso, o rendimento ou taxa de produção global de um desses produtos químicos finos desejados pode ser aumentada.

Também é possível que tais alterações na proteína e nas moléculas de nucleotídeo da Tabela 1 possam aperfeiçoar a produção de outros produtos químicos finos que não metionina, tais como outros compostos contendo enxofre, tais como cisteína ou glutationa, outros aminoácidos, vitaminas, cofatores, nutracêuticos, nucleotídeos, nucleosídeos e trealose. O metabolismo de qualquer composto é necessariamente inter- enredado com outras vias biossintéticas e degradativas dentro da célula e cofatores, intermediários ou substratos necessários em uma via provavelmente são fornecidos ou limitados por outras de tais vias. Portanto, através de modulação da atividade de uma ou mais das proteínas da Tabela 1, a produção ou eficiência de atividade de outra via biossintética ou degradativa de produto químico fino, além daquelas que levam à metionina, pode sofrer um impacto.

Expressão e função enzimática podem também ser reguladas baseado nos níveis celulares de um composto a partir de um processo metabólico diferente e os níveis celulares de moléculas necessárias para crescimento básico, tais como aminoácidos e nucleotídeos, podem afetar criticamente a viabilidade do microorganismo em cultura em larga escala. Assim, modulação de uma enzima da biossíntese de aminoácido da Tabela 1, de modo que ela não é mais responsiva à inibição de feedback ou de modo que ela tenha a eficiência ou reposição aperfeiçoada, resultará em maior fluxo metabólico através das vias de produção de metionina. Esses estratégias antes mencionadas para aumento ou introdução da quantidade e/ou atividade das enzimas da tabela 1 não se destinam a serem limitativas; variações nessas estratégias serão prontamente evidentes para aqueles habilitados na técnica.

Para diminuição ou supressão ou redução da quantidade ou teor e/ou atividade de qualquer uma das enzimas da Tabela 1, várias estratégias também estão disponíveis.

A expressão das enzimas endógenas da Tabela 1 pode, por exemplo, ser regulada via a expressão de aptâmeros que se ligam especificamente às seqüências promotoras dos genes. Dependendo dos aptâmeros, ligação à regiões promotoras de estimulação ou repressão, a quantidade e, assim, nesse caso, a atividade das enzimas da Tabela 1, é aumentada ou reduzida.

Aptâmeros também podem ser projetados de uma forma a se ligar especificamente às enzimas em si e reduzir a atividade das enzimas, por exemplo, através de ligação ao centro catalítico das respectivas enzimas. A expressão de aptâmeros usualmente é obtida através de superexpressão vetor- baseada (veja acima) e é, assim como o design e a seleção de aptâmeros, bem conhecida por aqueles habilitados na técnica (Famulok e colaboradores, (1999) Curr Top Microbiol Immunol, 243,123-36).

Além disso, uma diminuição da quantidade e da atividade das enzimas endógenas da Tabela 1 pode ser obtida por meio de várias medidas experimentais, as quais são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Essas medidas são, usualmente, resumidas sob o termo "silenciamento de gene" ou "atenuação de um gene" ou "ruptura de um gene" ou "eliminação de um gene". Por exemplo, a expressão de um gene endógeno pode ser silenciada através de transferência de um vetor acima mencionado, o qual tem uma seqüência de DNA que codifica a enzima ou partes da mesma em uma ordem anti-senso, para um organismo, tal como C. glutamicum e E. coli. Isso é baseado no fato de que a transcrição de tal vetor nas células leva a um RNA, o qual pode hibridizar com o mRNA transcrito pelo gene endógeno e, portanto, impede sua tradução.

Seqüências regulatórias operativamente ligadas a um ácido nucleico clonado na orientação anti-senso podem ser escolhidas, as quais dirigem a expressão contínua da molécula de RNA anti-senso em uma variedade de tipos de célula, por exemplo, promotores e/ou intensificadores virais ou seqüências regulatórias podem ser escolhidas as quais dirigem a expressão constitutiva, tecido-específica ou tipo de célula-específica de RNA anti-senso. O vetor de expressão anti-senso pode estar na forma de um plasmídeo recombinante, fagemídeo ou vírus atenuado no qual ácidos nucleicos anti-senso são produzidos sob o controle de uma região regulatória de alta eficiência, a atividade da qual pode ser determinada pelo tipo de célula na qual o vetor é introduzido. Para uma discussão da regulação de expressão de gene usando genes anti-senso veja Weintraub, H. e colaboradores, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol.l (1), 1986.

Em principio, a estratégia anti-senso pode ser acoplada com a um método com ribozima. Ribozimas são seqüências de RNA cataliticamente ativas as quais, se acopladas às seqüências anti-senso, clivam as seqüências alvo cataliticamente (Tanner e colaboradores, (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 251 -IS). Isso pode intensificar a eficiência de uma estratégia anti- senso.

Em plantas, silenciamento de gene pode ser obtido através de interferência de RNA ou um processo que é conhecido como co-supressão.

Outros métodos são a introdução de mutações não-senso no gene endógeno por meio de introdução de oligonucleotídeos de RNA/DNA no organismo (Zhu e colaboradores, (2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558) ou geração de mutantes com knockout com o auxílio de recombinação homóloga (Hohn e colaboradores, (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 8321-8323.).

Para criar um microorganismo recombinante homólogo, um vetor é preparado o qual contém pelo menos uma porção de gene que codifica uma enzima da Tabela 1 na qual uma deleção, adição ou substituição tenha sido introduzida para, desse modo, alterar, por exemplo, romper funcionalmente o gene endógeno.

De preferência, esse gene endógeno é um gene de C. glutamicum ou E. coli, mas pode ser um homólogo de uma bactéria relacionada ou mesmo de uma fonte de levedo ou planta. Em uma modalidade, o vetor é projetado de modo que, quando de recombinação homóloga, o gene endógeno é funcionalmente rompido, isto é, não codifica mais uma proteína funcional a qual é também referida como um vetor "knock out". Alternativamente, o vetor pode ser projetado de modo que, quando recombinação homóloga, o gene endógeno sofre mutação ou, de outro modo, é alterado, mas ainda codifica uma proteína funcional (por exemplo, a região regulatória a montante pode ser alterada para, desse modo, alterar a expressão endógena da enzima da Tabela 1). No vetor de recombinação homóloga, a porção alterada do gene endógeno é flanqueada, em suas extremidades 5' e 3', pelo ácido nucleico adicional do gene endógeno para permitir que recombinação homóloga ocorra entre o gene exógeno trazido pelo vetor e um gene endógeno no (micro) organismo. O ácido nucleico endógeno de flanqueamento adicional é de comprimento suficiente para recombinação homóloga com sucesso com o gene endógeno. Tipicamente, várias centenas de bases a quilobases de DNA de flanqueamento (nas extremidades 5' e 3') são incluídas no vetor (veja, por exemplo, Thomas, K. R., e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 e Schafer e colaboradores Gene. 1994 145:69-73, para descrições de vetores de recombinação homóloga).

O vetor é introduzido em um microorganismo (por exemplo, através de eletroporação) e células nas quais o gene endógeno introduzido foi homologamente recombinado com as enzimas endógenas da Tabela 1 são selecionadas, usando métodos conhecidos na técnica.

Em outra modalidade, um gene endógeno para as enzimas da Tabela 1 em uma célula hospedeira é rompido (por exemplo, através de recombinação homóloga ou outro meio genético conhecido na técnica), de modo que a expressão de seu produto de proteína não ocorra. Em outra modalidade, um gene endógeno ou introduzido das enzimas da Tabela 1 em uma célula hospedeira foi alterado através de uma ou mais mutações de ponto, deleções ou inversões, mais ainda codifica uma enzima funcional. Em ainda outra modalidade, uma ou mais das regiões regulatórias (por exemplo, promotor, repressor ou indutor) de um gene endógeno para as enzimas da Tabela 1 em um micro (organismo) foram alteradas (por exemplo, através de deleção, truncamento, inversão ou mutação de ponto), de modo que a expressão do gene endógeno é modulada. Aqueles habilitados na técnica apreciarão que células hospedeiras contendo mais de um dos genes que codificam a enzima da Tabela 1 e modificações de proteína podem ser prontamente produzidas usando os métodos da invenção e se destinam a serem incluídos na presente invenção.

Além disso, uma repressão de gene (mas também superexpressão de gene) também é possível por meio de fatores de ligação a DNA específicos, por exemplo, fatores do tipo fator de transcrição do dedo de zinco. Além disso, fatores que inibem a proteína alvo em si podem ser introduzidos em uma célula. Os fatores de ligação à proteína podem, por exemplo, ser os aptâmeros mencionados acima (Famulok e colaboradores, (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36).

Outros fatores de ligação à proteína, cuja expressão em organismos causa uma redução da quantidade e/ou atividade das enzimas da Tabela 1, podem ser selecionados de anticorpos enzima-específicos. A produção de anticorpos enzima-específicos monoclonais, policlonais ou recombinantes segue protocolos padrões (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, páginas 663-679 (1990), Μ. P. Deutscher, ed.). A expressão de anticorpos é também conhecida da literatura (Fiedler e colaboradores, (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard e Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).

Os métodos mencionados são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Portanto, é também bem sabido quais tamanhos das estruturas de ácido nucleico usadas, por exemplo, métodos anti-senso, devem ter e quais complementaridade, homologia ou identidade as respectivas seqüências de ácido nucleico devem ter. Os termos complementaridade, homologia e identidade são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Dentro do escopo da presente invenção, homologia de seqüência e homologia, respectivamente, são geralmente compreendidos como significando que a seqüência de ácido nucleico ou a seqüência de aminoácido, respectivamente, de uma molécula de DNA ou uma proteína, respectivamente, é pelo menos 40%, de preferência pelo menos 50%, ainda preferido pelo menos 60%, também de preferência pelo menos 70%, particularmente de preferência pelo menos 90%, em particular de preferência pelo menos 95% e, mais preferivelmente, pelo menos 98% idêntica às seqüências de ácido nucleico ou seqüências de aminoácido, respectivamente, de uma molécula de DNA ou RNA ou proteína conhecida, respectivamente. Aqui, o grau de homologia e identidade, respectivamente, se refere ao comprimento todo da seqüências de codificação.

O termo "complementaridade" descreve a capacidade de uma molécula de ácido nucleico de hibridizar com outra molécula de ácido nucleico em virtude de ligações de hidrogênio entre duas bases complementares. Aqueles habilitados na técnica sabem que duas moléculas de ácido nucleico não têm de ter uma complementaridade de 100%"de forma a serem capazes de hibridizar uma com a outra. Uma seqüência de ácido nucleico, a qual tem de hibridizar com outra seqüência de ácido nucleico é, de preferência, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, particularmente preferido pelo menos 80%, também particularmente preferido pelo menos 90%, em particular de preferência pelo menos 95% em mais preferivelmente, pelo menos 98 ou 100%, respectivamente, complementar à referida outra seqüência de ácido nucleico.

Moléculas de ácido nucleico são idênticas se elas têm nucleotídeos idênticos na ordem 5'-3' idêntica.

A hibridização de uma seqüência anti-senso com uma seqüência de mRNA endógena ocorre, tipicamente, in vivo sob condições celulares ou in vitro. De acordo com a presente invenção, hibridização é realizada in vitro ou in vivo sob condições que são estringentes o bastante para assegurar uma hibridização específica.

Condições de hibridização in vitro estringentes são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem ser tiradas da literatura (veja, por exemplo, Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press). O termo "hibridização específica se refere ao caso em que uma molécula se liga, de preferência, a uma determinada seqüência de ácido nucleico sob condições estringentes, se essa seqüência de ácido nucleico é parte de uma mistura complexa, por exemplo, de moléculas de RNA ou DNA.

O termo "condições estringentes", portanto, se refere à condições sob as quais uma seqüência de ácido nucleico se liga, de preferência, a uma seqüência alvo, mas não ou pelo menos até uma extensão significativamente reduzida à outras seqüências.

Condições estringentes são dependentes das circunstâncias. Seqüências mais longas se hibridizam especificamente em temperaturas maiores. Em geral, condições estringentes são escolhidas de uma forma que a temperatura de hibridização repousa cerca de 5°C abaixo do ponto de fusão (Tm) da seqüência específica com uma resistência iônica definida e um valor de pH definido. Tm é a temperatura (com um valor de pH definido, uma resistência iônica definida e uma concentração de ácido nucleico definida) na qual 50% das moléculas, as quais são complementares a uma seqüência alvo, hibridizam com a referida seqüência alvo. Tipicamente, condições estringentes compreendem concentrações de sal entre 0,01 e 1,0 M íons de sódio (ou íons de outro sal) e um valor de pH entre 7,0 e 8,3. A temperatura é pelo menos 30 0C para moléculas curtas (por exemplo, para tais moléculas compreendendo entre 10 e 50 nucleotídeos). Além disso, condições estringentes podem compreender a adição de agentes de desestabilização tais como, por exemplo, formamida. Tampões de hibridização e lavagem típicos são da seguinte composição.

Solução de pré-hibridização:

SDS a 0,5% 5x SSC NaPO4 a 50 nM, pH de 6,8 Na-pirofosfato a 0,1% 5x reagente de Denhardt 100 μg de esperma de salmão Solução de hibridização: Solução de pré-hibridização IxlO6 com/mL de sonda (5-10 min, 95 °C) 20x SSC: NaCl a 3 M Citrato de Sódio a 0,3 M ad pH de 7 com HCl 5Ox reagente de Denhardt: 5 g de Ficoll 5 g de polivinilpirrolidona 5 g de Albumina de soro bovino Ad 50 mL A. dest.

Um procedimento típico para hibridização é como segue: Opcional: Lavar Blot 30 min em 1x SSC/ SDS a 0,1% a 65°C

Pré-hibridização: pelo menos 2 h a 50-55°C

Hibridização: durante a noite a 55-60°C

Lavagem: 05 min 2x SSC/SDS a 0,1 %

Temperatura de hibridização

30 min 2x SSC/SDS a 0,1%

Temperatura de hibridização

30 min 1x SSC/SDS a 0,1%

Temperatura de hibridização

45 min 0,2x SSC/SDS a 0,1% 65°C

5 min 0,1 χ SSC temperatura ambiente

Os termos "senso" e "anti-senso", bem como "orientação anti- senso" são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Além disso, aqueles habilitados na técnica sabem o quão longas as moléculas de ácido nucleico as quais têm de ser usadas para métodos anti-senso devem ser e qual homologia ou complementaridade elas devem ter com referência às suas seqüências alvo.

Conseqüentemente, aqueles habilitados na técnica sabem quão longas moléculas de ácido nucleico as quais são usadas para métodos de silenciamento de gene devem ser. Para fins anti-senso, complementaridade sobre comprimentos de seqüência de 100 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 40 nucleotídeos e 20 nucleotídeos pode ser suficientes. Comprimentos de nucleotídeo mais longos certamente também serão suficientes. Uma aplicação combinada dos métodos acima mencionados também é concebível.

Se, de acordo com a presente invenção, seqüências de DNa são usadas, as quais são operativamente ligadas na orientação 5'-3' a um promotor ativo no organismo, vetores podem, em geral, ser construídos os quais, após a transferência para as células do organismo permitir a superexpressão da seqüência de codificação ou causar a supressão ou competição e bloqueio de seqüências de ácido nucleico endógenas e das proteínas expressas a partir das mesmas, respectivamente.

A atividade de uma enzima em particular também pode ser reduzida através de superexpressão de um mutante não funcional da mesma no organismo. Assim, um mutante não funcional o qual não é capaz de catalisar a reação em questão, mas que é capaz de se ligar, por exemplo, ao substrato ou co-fator pode, por meio de superexpressão, competir com a enzima endógena e, portanto, inibir a reação. Outros métodos de forma a reduzir a quantidade e/ou atividade de uma enzima em uma célula hospedeira são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Outro aspecto da invenção se refere a vetores, de preferência, vetores de expressão, contendo um ácido nucleico que codifica as enzimas da Tabela 1 (ou porções das mesmas) ou combinações das mesmas. Conforme usado aqui, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele tenha sido ligado.

Um tipo de vetor é um "plasmídeo", o qual se refere a um Ioop de DNA fita dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral.

Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não- epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira quando de introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados.

Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados permutavelmente, uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Contudo, a invenção se destina a incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus com replicação defectiva, adenovírus e vírus adeno-associados), os quais servem à funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica as enzimas da Tabela 1 em uma forma adequada para expressão do respectivo ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, as quais são operativamente ligadas à seqüências de ácido nucleico a ser expressa.

Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado" se destina a significar que a seqüência de nucleotídeo de interesse é ligada à(s) seqüência(s) regulatória(s) de uma maneira a qual permite a expressão da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüências regulatória" se destina a incluir promotores, sítios de ligação a repressor, sítios de ligação a ativador, intensificadores, e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, terminadores, sinais de poliadenilação ou outros elementos da estrutura secundária de mRNA). Tais seqüências regulatórias são descritas por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Seqüências regulatórias incluem aquelas as quais dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célula hospedeira e aquelas as quais dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeo apenas em determinadas células hospedeira. Seqüências regulatórias preferidas são, por exemplo, promotores tais como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac- laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, e-Pp- ore PL, sod, ef- tu, groE, os quais são usados, de preferência, em bactérias. Seqüências regulatórias adicionais são, por exemplo, promotores de levedos e fungos, tais como ADCl5MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promotores de plantas, tais como CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos ou ubiquitina ou promotores de faseolina. Também é possível usar promotores artificiais. Será apreciado por aqueles habilitados na técnica que o design do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc.

Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para, desse modo, produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados pelos ácidos nucleicos que codificam as enzimas da Tabela 1.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser projetados para expressão das enzimas na Tabela 1 em células procariotas ou eucariotas. Por exemplo, os genes para as enzimas da Tabela 1 podem ser expressos em células bacterianas, tais como C. glutamicum, B. subtilis e E. coli, células de inseto (usando vetores de expressão de báculo vírus), células de levedo e outras fungicas, veja Romanos, M. A. e colaboradores (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C. A. MJ. J. e colaboradores (1991) em: More Gene Manipulations em Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., páginas 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J.Q991) em: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. e colaboradores, eds., páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas e células de planta multicelulares (veja (veja Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.: 583-586). Células hospedeiras adequadas são ainda discutidas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, usando seqüências regulatórias do promotor T7 e polimerase T7.

Expressão de proteínas em procariotas é, mais freqüentemente, realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou proteínas de não-fusão.

Vetores de fusão adicionam uma série de aminoácidos a uma proteína codificada nos mesmos, usualmente ao amino término da proteína recombinante, mas também ao C-término ou fundidos dentro de regiões adequadas nas proteínas. Tais vetores de fusão servem, tipicamente, para três finalidades: 1) aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um ligante em purificação por afinidade. Freqüentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e da proteína recombinante para permitir separação da proteína recombinante da porção de fusão subseqüente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas seqüências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enteroquinase.

Vetores de expressão de fusão típicos incluem pQE (Qiagen), pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), os quais fundem S-transferase de glutationa (GST), proteína de ligação à maltose E ou proteína A, respectivamente.

Exemplo para vetores de C. glutamicum podem ser encontrados no Handbook of Corynebacterium 2005Eggeling, L. Bott, M., eds., CRC press EUA. Exemplos vetores de expressão de E. coli de não-fusão induzíveis adequados incluem pTrc (Amann e colaboradores, (1988) Gene 69: 301-315), pLG338, pACYC184, pBR322,pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, PPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, egtll, pBdCl e pET Ild (Studier e colaboradores, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89; e Pouwels e colaboradores, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018). Expressão de gene alvo a partir do vetor pTrc conta com transcrição de RNA polimerase a partir de um promotor de fusão trp-lac híbrido. Expressão de gene alvo a partir do vetor pET Ild conta com transcrição a partir de um promotor de fusão T7 gnlO-lac mediado através de uma RNA polimerase viral co-expressa (T7gnl). Essa polimerase viral é fornecida por cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS 174 (DE3) a partir de um pró-fago residenteX abrigando um gene T7gnl sob o controle transcricional do promotor IacUV 5. Para transformação de outras variedades de bactérias, vetores apropriados podem ser selecionados. Por exemplo, os plasmídeos pIJlOl, pIJ364, pIJ702 e pIJ361 são conhecidos por serem úteis na transformação de Streptomyces, enquanto que plasmídeos pUBllO, Vários plasmídeos de uso na transferência de informação genética para Corynebacterium incluem pHM1519, pBLl, pSA77, ou pAJ667 (Pouwels e colaboradores, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018).

Uma estratégia para maximizar a expressão de proteína recombinante é expressar a proteína em bactérias hospedeiras com uma capacidade deficiente de clivar proteoliticamente a proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128). Outra estratégia é alterar a seqüência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácido são aqueles utilizados de preferência na bactéria escolhida para expressão, tal como C. glutamicum (Wada e colaboradores (1992) Nucleic Aeids Res. 20: 2111-2118). Tal alteração de seqüências de ácido nucleico da invenção pode ser realizada através de técnicas padrões de síntese de DNA.

Em uma modalidade, o vetor de expressão de proteína é um vetor de expressão de levedo. Exemplos de vetores para expressão em levedo S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari, e colaboradores, (1987) Embo J. 6: 229-234), 2i, pAG-1, Yep6, Yepl3, PEMBLYe23, pMFa (Kurjan e Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz e colaboradores, (1987) Gene 54: 113-123), e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores e métodos para construção de vetores apropriados para uso em outros fungos, tais como os fungos filamentosos, incluem aqueles detalhados em: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt5P. J. (1991) em: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, e colaboradores, eds., páginas 1- 28, Cambridge University Press: Cambridge, e Pouwels e colaboradores, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018).

Para fins da presente invenção, uma ligação operativa é compreendida como sendo a disposição seqüencial de promotor, seqüência de codificação, terminador e, opcionalmente, outros elementos regulatórios de uma forma tal que cada um dos elementos regulatórios pode preencher sua função, de acordo com sua determinação, quando do expressão da seqüência de codificação.

Em outra modalidade, as proteínas da Tabela 1 podem ser expressas em células de planta unicelulares (tais como algas) ou em células de planta de plantas superiores (por exemplo, as espermatófitas, tais como plantas de safra). Exemplos de vetores de expressão de planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. e Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; e Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721 e incluem pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, e pDH51 (Pouwels e colaboradores, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN O 444 904018).

Para outros sistemas de expressão adequados para células procariotas e eucariotas, veja capítulos 16 e 17 de Sambrook, J. e colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003.

Para fins da presente invenção, uma ligação operativa é compreendida como sendo a disposição seqüencial de promotor, seqüência de codificação, terminador e, opcionalmente, outros elementos regulatórios de uma forma tal que cada um dos elementos regulatórios pode preencher sua função, de acordo com sua determinação, quando do expressão da seqüência de codificação.

Em outra modalidade, o vetor de expressão de mamífero recombinante é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico, de preferência em um tipo de célula em particular, por exemplo, em células de planta (por exemplo, elementos regulatórios tecido/específicos são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos regulatórios tecido-específicos são conhecidos na técnica.

Outro aspecto da invenção se refere a organismos ou células hospedeiras nas quais um vetor de expressão recombinante da invenção tenha sido introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados permutavelmente aqui. Deve ser compreendido que tais termos se referem não apenas à célula em questão em particular, mas à prole ou prole potencial de tal célula. Em virtude do fato de que determinadas modificações podem ocorrer em gerações que sucedem em virtude de mutação ou influências ambientais, tal prole pode, na verdade, não ser idêntica à célula precursora, mas ainda estar incluída dentro do escopo do termo conforme usado aqui.

Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariota ou eucariota. Por exemplo, uma enzima da Tabela 1 pode ser expressa em células bacterianas, tais como C. glutamicum ou E. coli, células de inseto, levedo ou plantas. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

DNA de vetor pode ser introduzido em células procariotas ou eucariotas via técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Conforme usado aqui, os termos usados aqui "transformação" e "transfecção", "conjugação" e "transdução" se destinam a se referir a uma variedade de métodos reconhecidos na técnica para introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA ou RNA linear, por exemplo, um vetor linearizado ou uma estrutura de gene sozinha sem um vetor) ou ácido nucleico na forma de um vetor (por exemplo, um plasmídeo, fago, fagemídeo, transposon ou outro DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação com cloreto de cálcio ou fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, lipofecção, competência natural, transferência química-mediada ou eletroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, e colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003). Exemplos de vetores para C. glutamicum podem ser encontrados no Handbook of Corynebacterium (Eggeling, L. Bott, M., eds., CRC Press EUA 2005) e outros manuais de laboratório.

"Campbell in", conforme usado aqui, se refere a um transformante de uma célula hospedeira original no qual uma molécula de DNA fita dupla circular inteira (por exemplo, um plasmídeo) é integrada em um cromossoma através de um único evento de recombinação homóloga (um evento de cross in) e que resulta eficazmente na inserção de uma versão linearizada da referida molécula de DNA circular em uma primeira seqüência de DNA do cromossoma que é homóloga a uma primeira seqüência de DNA da referida molécula de DNA circular. O nome vem do Professor Alan Campbell, que primeiro propôs esse tipo de recombinação. "Campbelled in" se refere à seqüência de DNa linearizada que foi integrada no cromossoma de um transformante "Campbell in". Um "Campbell in" contém uma duplicação da primeira seqüência de DNA homóloga, cada cópia da qual inclui e circunda uma cópia do ponto de cruzamento de recombinação homóloga.

"Campbell out", conforme usado aqui, se refere a uma célula que descende de um transformante "Campbell in", no qual um segundo evento de recombinação homóloga (um evento de cross out) ocorreu entre uma segunda seqüência de DNA que está contida sobre o DNA linearizado inserido do DNA "Campbelled in" e uma segunda seqüência de DNA de origem cromossômica, a qual é homóloga à segunda seqüência de DNA do referido inserto linearizado, o segundo evento de recombinação resultando na deleção (jettisoning) de uma porção da seqüência de DNa integrada mas, de modo importante, também resulta em uma porção (essa pode ser tão pouco quanto uma única base) do DNA "Campbelled in" integrado restante no cromossoma de modo que, comparado com a célula hospedeira original, a célula "Campbell out" contém uma ou mais alterações intencionais no cromossoma (por exemplo, uma única substituição de base, múltiplas substituições de base, inserção de um gene ou seqüência de DNA heteróloga, inserção de uma cópia ou cópias adicionais de um gene homólogo ou um gene homólogo modificado ou inserção de uma seqüência de DNA compreendendo mais de um desses exemplos antes mencionados listados acima).

Uma célula ou cepa "Campbell out" é usualmente, mas não necessariamente, obtida através de uma contra-seleção contra um gene que está contido em uma porção (a porção que se deseja causar jettisoning) da seqüências de DNA "Campbelled in", por exemplo, o gene sacB de Bacillus subtilis, o qual é letal quando expresso em uma célula que é crescida na presença de cerca de 5% a 10% de sacarose. Com ou sem uma contra-seleção, uma célula "Campbell out" desejada pode ser obtida ou identificada por através de triagem da célula desejada usando qualquer fenotipo selecionável tal como, mas não limitado a, morfologia de colônia, cor de colônia, presença ou ausência de resistência a antibiótico, presença ou ausência de uma determinada seqüência de DNA através de reação em cadeia de polimerase, presença ou ausência de uma auxotrofia, presença ou ausência de uma enzima, hibridização de ácido nucleico de colônia, triagem de anticorpo, etc.

Os termos "Campbell in" e "Campbell out" também podem ser usados como verbos em vários sentidos para ser referir a um método ou processo descrito acima.

Deve ser compreendido que os eventos de recombinação homóloga que levam a um "Campbell in" ou "Campbell out" podem ocorrer sobre uma faixa de bases de DNA dentro da seqüência de DNA homóloga e, uma vez que as seqüências homólogas serão idênticas umas às outras para pelo menos parte dessa faixa, usualmente não é possível especificar exatamente onde o evento de cruzamento ocorreu. Em outras palavras, não é possível especificar precisamente qual seqüência era originalmente do DNA inserido e qual era originalmente do DNA cromossômico. Além disso, a primeira seqüência de DNA homóloga e a segunda seqüência de DNA homóloga são usualmente separadas por uma região de não homologia parcial e é essa região de não-homologia que permanece depositada em um cromossoma da célula "Campbell out".

Por praticidade, em C. glutamicum, as primeira e segunda seqüências de DNA homólogas típicas têm usualmente pelo menos cerca de 200 pares de base de cumprimento e podem ter até vários milhares de pares de base de comprimento. Contudo, o cumprimento para as primeira e segunda seqüências homólogas pode oscilar de cerca de 500 a 2000 bases e obtenção de um "Campbell out" a partir de um "Campbell in" é facilitada através de disposição das primeira e segunda seqüências homólogas sendo aproximadamente do mesmo comprimento, de preferência com uma diferença de menos de 200 pares de base e, mais preferivelmente, com a mais curta das duas tendo pelo menos 70% do comprimento da mais longa em pares de base.

De forma a identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles os quais conferem resistência à fármacos, tais como canamicina, cloranfenicol, tetraciclina, G418, higromicina e metotrexato. Acido nucleico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no mesmo vetor que aquele que codifica as enzimas da Tabela 1 ou pode ser introduzido em um vetor distinto. Células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas através de seleção com fármaco (por exemplo, células que têm incorporado o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto que as outras células morrem).

Em outra modalidade, microorganismos recombinantes podem ser produzidos, os quais contém sistemas os quais permitem a expressão intensificada do gene selecionado e/ou introduzido. Exemplos de expressão alterada e intensificada de genes em organismos com alto teor de GC, tal como C. glutamicum, são descritos no WO 2005/059144, WO 2005/059143 e WO 2005/059093

Em outra modalidade, microorganismos recombinantes podem ser produzidos, os quais contém sistema selecionados os quais permitem a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão de um gene da tabela 1 em um vetor, colocando-o sob o controle do operon lac, permite a expressão do gene apenas na presença de IPTG. Tais sistemas regulatórios são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o método compreende cultura dos organismos da invenção (nos quais um vetor de expressão recombinante que codifica, por exemplo, uma enzima da Tabela 1 foi introduzido ou nos quais genoma tenha sido introduzido em um gene que codifica uma enzima do tipo selvagem ou alterada) em um meio adequado para a produção de metionina. Em outra modalidade, o método ainda compreende isolamento de metionina do meio ou da célula hospedeira.

De forma a modificar o fluxo metabólico de um organismo para produzir um organismo que é mais eficiente na síntese metionina, alteração da quantidade e/ou atividade de uma enzima não está limitada às enzimas listadas na Tabela 1. Qualquer enzima que é homóloga às enzimas da Tabela 1 e desempenha a mesma função em outro organismo pode ser perfeitamente adequada para modular a quantidade e/ou atividade de forma a influenciar o fluxo metabólico através de superexpressão. As definições para homologia e identidade foram fornecidas acima.

Aqueles habilitados na técnica estão familiarizados com a cultura de microorganismos comuns, tais como C. glutamicum e E. coli. Assim, uma ensinamento geral será fornecido abaixo referente à cultura de C. glutamicum. Informação correspondente pode ser recuperada de livros texto padrões para cultura de E. coli.

Cepas de E. coli são rotineiramente crescidas em caldo MB e LB, respectivamente (Follettie, M. T., Peoples, O., Agoropoulou, C, e Sinskey, A J. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096- 4103). Meio mínimo para E. coli é M9 e MCGC modificado (Yoshihama, M., Higashiro, K., Rao, Ε. A., Akedo, M., Shanabruch, W G., Follettie, M. T., Walker, G. C, e Sinskey, A. J. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507), respectivamente. Glicose pode ser adicionada em uma concentração final de 1%. Antibióticos podem ser adicionados nas seguintes quantidades (microgramas por mililitro): ampicilina, 50; canamicina, 25; ácido nalidíxico, 25. aminoácidos, vitaminas e outros suplementos podem ser adicionados nas seguintes quantidades: metionina, 9,3 mM; arginina, 9,3 mM; histidina, 9,3 mM; tiamina, 0,05 mM. Células de E. coli são rotineiramente crescidas a 37°C, respectivamente.

Corynebacteria geneticamente modificadas são, tipicamente, cultivadas em meio de crescimento sintético ou natural. Uma série de diferentes meios de crescimento para Corynebaeteria são bem conhecidos e prontamente disponíveis (Lieb e colaboradores (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210; von der Osten e colaboradores (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patente DE 4.120.867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium, em: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. e colaboradores, eds. Springer-Verlag). Exemplos para vetores de C. glutamicum podem ser encontrados no Handbook of Corynebacterium (Eggeling, L. Bott, M., eds., CRC Press EUA 2005).

Esses meios consistem de uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e elementos vestigiais. Fontes de carbono preferidas são açúcares, tais como, mono-, di- ou polissacarídeos. Por exemplo, glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose podem servir como fontes de carbono muito boas.

Também é possível fornecer açúcar ao meio via compostos complexos, tais como melaço ou outros subprodutos a partir do refino de açúcar. Também pode ser vantajoso fornecer misturas de diferentes fontes de carbono. Outras possíveis fontes de carbono são álcoois e ácidos orgânicos, tais como metanol, etanol, ácido acético ou ácido láctico. Fontes de nitrogênio usualmente são compostos de nitrogênio orgânicos ou inorgânicos ou materiais os quais contêm esses compostos. Fontes de nitrogênio exemplificativas incluem gás amônia ou sais de amônia, tais como NH4Cl ou (NH4)2SO4, NH4OH, nitratos, uréia, aminoácidos ou fontes de nitrogênio complexas, tais como licor de xarope de milho, farinha de soja, proteína de semente de soja, extrato de levedo, extrato de carne e outros.

A super-produção de metionina é possível usando diferentes fontes de enxofre. Sulfatos, tiossulfatos, sulfitos e também fontes de enxofre mais reduzidas, tal como H2S e sulfetos e derivados podem ser usadas.

Também, fontes de enxofre orgânico, tais como metil mercaptano, tioglicolatos, tiocianatos, tiouréia, aminoácidos contendo enxofre, tal como cisteína e outros compostos contendo enxofre podem ser usados para obter produção eficiente de metionina. Formato e/ou metanotiol também podem ser possíveis como um suplemento, assim como outras fontes de Cl, tais como formaldeído, metanol e dissulfeto de dimetila.

Compostos de sal inorgânico os quais podem ser incluídos no meio incluem os sais de cloreto, fósforo ou sulfato de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro. Compostos de quelação podem ser adicionados ao meio para manter os íons de metal em solução. Compostos de quelação particularmente úteis incluem dihidroxifenóis, tais como catecol ou protocatecuato ou ácido orgânicos, tal como ácido cítrico. É típico que o meio também contenha outros fatores de crescimento, tais como vitaminas ou promotores de crescimento, exemplos dos quais incluem biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Fatores de crescimento e sais freqüentemente se originam de componentes de meio complexos, tais como extratos de levedo, licor de xarope de milho e outros. A composição exato dos compostos do meio depende fortemente do experimento imediato e é individualmente decidida para cada caso específico. Informação sobre otimização de meio está disponível no livro texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. Ρ. M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) páginas 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Também é possível selecionar meios de crescimento de fornecedores comerciais, tais como Standard 1 (Merck) ou BHI (infusão de núcleo de grão, DIFCO) ou outros. Todos os componentes do meio deverão ser esterilizados, através de calor, (20 minutos a 1,5 bar e 121°C) ou através de filtração estéreo. Os componentes podem ser esterilizados juntos ou, se necessário separadamente.

Todos os componentes do meio podem estar presentes no início de crescimento ou eles podem, opcionalmente, ser adicionados continuamente ou em batelada. Condições de cultura são definidas separadamente para cada experimento.

A temperatura deverá estar em uma faixa entre 15°C e 45 °C. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o experimento. O pH do meio pode estar na faixa de 5 a 8,5, de preferência, em torno de 7,0 e pode ser mantido através da adição de tampões ao meio. Um tampão exemplificativo para essa finalidade é um tampão de fosfato de potássio. Tampões sintéticos, tais como MOPS, HEPES, ACES e outros podem, alternativa ou simultaneamente, ser usados. Também é possível manter um pH de cultura constante através da adição de NaOH ou NH4OH durante crescimento. Se componentes do meio complexos, tal como extrato de levedo, são utilizados, a necessidade de tampões adicionais pode ser reduzida, em virtude do fato de que muitos compostos complexos têm altas capacidades de tamponamento. Se um fermentador é utilizado para cultura dos microorganismos, o pH também pode ser controlado usando amônia gasosa.

O tempo de incubação usualmente está em uma faixa de várias horas a vários dias. Esse tempo é selecionado de forma a permitir que a quantidade máxima de produto se acumule no caldo. Os experimentos de crescimento divulgados podem ser realizados em uma variedade de vasos, tais como lâminas de microtitulação, tubos de vidro, frascos de vidro ou fermentadores de vidro ou metal de diferentes tamanhos. Para seleção de um grande número de clones, os microorganismos deverão ser cultivados em lâminas de microtitulação, tubos de vidro ou frascos de agitação, com ou sem defletores. De preferência, frascos de agitação de 100 mL são usados, cheios com 10% (em volume) do meio de crescimento requerido. Os fracos deverão ser agitados em um agitador giratório (amplitude de 25 mm) usando uma faixa de velocidade de 100-300 rpm. Perdas por evaporação podem ser diminuídas através de manutenção de uma atmosfera úmida; alternativamente, uma correção matemática para perdas por evaporação deverá ser realizada.

Se clones geneticamente modificados são testados, um clone de controle não modificado ou um clone de controle contendo o plasmídeo básico sem qualquer inserto também deverá ser testado. O meio é inoculado para uma OD600 de 0,5-1,5 usando células crescidas sobre lâminas de agar, tais como lâminas CM (10 g/L de glicose, 2,5 g/L de NaCl, 2 g/L de uréia, 10 g/L de polipeptona, 5 g/L de extrato de levedo, 5 g/L de extrato de carne, 22 g/L de NaCl, 2 g/L de uréia, 10 g/L de polipeptona, 5 g/L de extrato de levedo, 5 g/L de extrato de carne, 22 g/L de agar, pH de 6,8 com NaOH a 2M) que tinha sido incubado a 30 0C.

Inoculação do meio é realizada através de introdução de uma suspensão salina de células de C. glutamicum a partir de lâminas CM ou adição de uma pré-cultura líquida dessa bactéria.

Embora a presente invenção tenha sido descrito com referência à Corynebacterium glutamicum e à produção de L-metionina, deverá ser destacado que a presente invenção também pode ser aplicada a outros microorganismos e à produção de outros aminoácidos.

Além disso, deverá ser destacado que "compreendendo" não exclui quaisquer outros elementos ou etapas e que "um" não exclui um número no plural. Além disso, deverá ser destacado que as características ou etapas as quais foram descritas com referência a uma das modalidades acima também podem ser usadas em combinação com outras características ou etapas de outras modalidades descritas acima.

A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir, os quais não deverão ser construídos como limitativos. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patente, patentes, pedidos de patente publicados, tabelas, apêndices, e as seqüências citadas no decorrer do presente pedido são aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

Cepa Bacteriana. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (tipo selvagem) foi obtido da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Os mutantes com knockout foram construídos como segue:

C. glutamicum M1840 era uma cepa AMcbR derivada de ATCC 13032 do tipo selvagem (Rey e colaboradores, 2003, vide supra). ATCC 13032 foi transformado com o plasmídeo pH430 (SEQ ID No. 1) e "Campbelled in" para proporcionar cepas "Campbell in". Cepas "Campbell in" foram, então, "Campbelled out" para proporcionar a cepa "Campbell out" Ml 840, a qual contém uma deleção do gene McbR.

C. glutamicum M1840 foi transformado com o plasmídeo pH238 (SEQ ID No. 2) e "Campbelled in" para proporcionar cepas "Campbell in". Cepas "Campbell in" foram, então, "Campbelled out" para proporcionar a cepa "Campbell out" M1840 Ahom, Ahsk, a qual contém uma deleção da desidrogenase de homoserina e os genes de quinase de homoserina.

C. glutamicum Ml 840 foi transformado com o plasmídeo ρ (SEQ ID No. 3) e "Campbelled in" para proporcionar cepas "Campbell in". Cepas "Campbell in" foram, então, "Campbelled out" para proporcionar a cepa "Campbell out" M1840 AmetB a qual contém uma deleção do gene MetB. Nessa cepa, nenhuma cistationina γ-sintase mensurável foi observada.

Produtos químicos. Casaminoácidos, extrato de carne, polipeptona e extrato de levedo foram fornecidos da Difco (Detroit, EUA). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e foram adquiridos da Griissing (Filsum, Alemanha), Acros Organics (Geel, Bélgica), Merck (Darmstadt, Alemanha), Aldrich (Steinheim, Alemanha), e Fluka (Buchs, Suíça). Os substratos rastreadores, [13C6] glicose a 99% e [13CC4] treonina a

98% foram fornecidos pela Cambrige Isotopes Inc. (Andova, MA, EUA). [15N] sulfato de amônio a 99% foi adquirido da Campro Scientific (Veenendaal, Países Baixos). [34S] sulfato foi gentilmente fornecido pela BASF AG (Ludwigshafen, Alemanha).

Meios e condições de crescimento. Células para inoculação foram crescidas sobre meio rico contendo 10,00 g/L de glicose, 2,50 g/L de NaCl, 2,00 g/L de uréia, 5,00 g/L de extrato de levedo, 5,0 g/L de extrato de carne, 5,0 g/L de polipeptona, 20,0 g/L de Casaminoácidos e 20,0 g/L de agar (para lâminas). As células foram mantidas sobre as lâminas a 30°C. Pré- culturas foram crescidas durante a noite em frascos de agitação com defletor de 250 mL com 25 mL de meio líquido rico. As células foram coletadas através de centrifugação (2 min, 1000 g, 4°C), lavadas duas vezes com NaCl a 0,9% e usadas para inoculação na segunda pré-cultura sobre meio mínimo. A segunda pré-cultura foi coletada conforme descrito acima e usada como iniciador dos cultivos principais, realizados sobre meio mínimo. O meio mínimo era composto como segue: 40,00 g/L de glicose, 1,00 g/L de K2HPO4, 1,00 g/L de KH2PO4, 42,00 g/L de MOPS, 54,00 g/L de ACES, 20,00 g/L de (NH4)2SO4, 0,30 g/L ácido 3,4-diidroxibenzóico, 0,01 g/L de CaCl2, 0,25 g/L de MgSO4 *7 H2O, 0,01 g/L de FeSO4* 7 H2O, 0,01 g/L de MnSO4 * H2O, 0,002 g/L de ZnSO4 * 7H20, 0,2 mg/L de CuSO4* 5 H2O, 0,02 mg/L de NiCl2 * 6 H2O, 0,02 mg/L de Na2MoO4 * 2H20, 0,1 mg/L de cianocobalamina, 0,3 mg/L de tiamina, 0,004 mg/L de fosfato de piridoxal, 0,1 mg/L de biotina. Para a cultura do mutante auxotrófico Ml 840 H238 e a caracterização da via biossintética de metionina, o meio foi suplementado com 10 mM de treonina, homoserina, metionina, cistationina e homocisteína, respectivamente. Experimentos de rastreamento foram realizados em culturas de 5 mL e em frascos de agitação com defletor de 50 mL sobre um agitador giratório a 250 rpm (raio de agitação de 2,5 cm) e 30°C. As células foram coletadas na fase exponencial tardia. Outros experimentos foram realizados em frascos de agitação com defletor de 500 mL em 50 mL de meio sobre um agitador giratório (250 rpm, 30°C, raio de agitação de 2,5 cm).

Metaboloma. Metabólitos intracelulares foram extraídos, conforme descrito anteriormente (Kromer e colaboradores, 2004). A biomassa lavada (H2O) foi hidrolisada durante 48 h (105 0C, HCl a 6N). Os hidrolisatos foram neutralizados (NaOH a 6 N). Para análise por GC/MS, as amostras (400 μl de extratos ou 50 μl, de hidrolisatos) foram liofilizadas, ressuspensas em 50 pL de solvente (piridina a 0,1% em dimetilformamida) e finalmente derivadas 1 h com 50 μl. de N-Metil(terc-butildimetil-silil)trifluoroacetamida (MBDSTFA) a 80°C. Análise de rotulação com GC/MS foi realizada conforme descrito anteriormente (Wittmann, C. e colaboradores, Anal Biochem 2002, 3072, 379-82). Exceto quanto à prolina, todos os aminoácidos proteinogênicos e intermediários do metabolismo de metionina, incluindo homocisteína, homoserina, O-acetilhomoserina e cistationina, foram quantificados sobre HPLC conforme descrito em alguma parte aqui (Kromer e colaboradores, Anal Biochem. 2005; 340: 171-3). Quantificação de homolantionina foi feita usando HPLC com um fator de calibração de cistationina.

Superexpressão e purificação de enzimas. MetB e MetC de C. glutamicum foram clonados no vetor pQE30 (Qiagen). Expressão com esse vetor compreende a adição de uma His-Tag ao N-término da proteína expressa. Escherichia coli foi transformado com o plasmídeo e selecionado através de resistência à ampicilina (100 μg/mL). E. coli transformado foi cultivado (100 μg / mL de ampicilina, 37°C, 230 rpm) sobre caldo Terrific (Losen e colaboradores, Biotechnol Prog 2004, 204, 1062-8) e induzido em uma densidade óptica de 1 (600 nm) através da adição de tiogalactosídeo de isopropila a 1 mM (concentração final). As células foram coletadas através de centrifugação (4225 g, 15 min, 2°C) após 16 h de crescimento induzido, lavadas e resuspensas em tampão de fosfato (100 mM, fosfato de piridoxal a 100 μΜ, 1 mg / mL de DNAse I, pH de 7,4 a 4°C) e extraídas através de ultra-som (5x15 seg, 20 mícrons). Os extratos brutos foram separados dos restos de célula através de centrifugação (30 min, 2°C e 20000 g). MetB e MetC recombinantes foram, finalmente, purificados através de cromatografia por afinidade sobre um AKTA Purifier 900 (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Inglaterra) equipado com uma coluna de quelação de Níquel- Sepharose HiTrap (5 mL, Amersham) equilibrada com tampão de fosfato de sódio a 0,02 M (pH de 7,4) contendo NaCl a 0,5 M. Após a proteína ser aplicada à coluna, ela foi lavada com 10 vol. de tampão de fosfato de sódio a 0,02 M. Eluição foi realizada com um gradiente linear de tampão de fosfato de sódio a 0,02 M (pH de 7,4) contendo NaCl a 0,5 M e imidazola a 0,5 M. As frações contendo a proteína foram verificadas quanto à pureza com SDS- PAGE e, então, empoçadas juntas. Imidazola foi separada das proteínas através de ultrafiltração.

Ensaios in vitro de MetB e MetC. A atividade de MetB e MetC foi acompanhada fotometricamente (Helios a, Thermo Electronic, Dreieich, Alemanha). As atividades enzimáticas foram medidas através de aumento ou diminuição dos grupos SH livres usando reagente de Ellman (Extinção a 412 nm) (Ellman e Lysko, 1979). As misturas de ensaio continham cisteína ou homocisteína a 1,25 mM e O-acetil homoserina a 3 mM para ensaios de MetB e cistationina a 1,25 mM ou homolantionina a cerca de 1,25 mM para ensaios de MetC. Homolantionina não estava comercialmente disponível. O ensaio de MetC foi, portanto, realizado usando os produtos do ensaio de MetB. MetB foi removido através de ultrafiltração. Assim, a concentração de homolantionina não pôde ser ajustada nos ensaios. Adicionalmente, as soluções de ensaio consistia de tampão de fosfato (100 mM, pH de 7,5) e 5-fosfato de piridoxila a 10 μΜ, co-fator de MetB e MetC. Amostras de 65 μί foram tomadas da mistura de ensaio e injetadas em 935 I_lL de uma solução de término a qualquer momento. A solução de término consistia de tampão de fosfato (100 mM, pH de 7,5) com etanol a 38% e ácido ditionitrobenzóico a 1 mM (DTNB). O etanol cessava a atividade enzimática e o DTNB formou um complexo amarelo com homocisteína ou cisteína. O ensaio proporcionou resultados lineares até 1,5 mM de grupos SH livres. Os valores de Re foram determinados a partir de plotagens recíprocas duplas de Lineweaver-Burk.

A Tabela 2 mostra a rotulação de isoleucina, treonina e alanina em C. glutamicum auxotrófico para homoserina / metionina e treonina AMcbR, Ahom3 Ahsk. Cultivo ocorreu sobre homoserina naturalmente rotulada e [U13C]- Glicose (99%) e [U"C] -treonina (98%). E mostrada a abundância relativa dos diferentes isotopômeros de massa em hidrolisatos de proteína.

Tabela 2

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A Tabela 3 mostra os valores de Km para MetC e MetB de C. glutamicum comparado com outros organismos.

Tabela 3

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Tabela 3

<table>table see original document page 67</column></row><table> Resultados:

Resposta fisiológica ao knockout de McbR. O knockout do regulador transcricional McbR em Corynebacterium glutamicum tem conseqüências graves para o metabolismo celular. A cepa C. glutamicum M1840, diferindo apenas do tipo selvagem pelo knockout de McbR5 mostrou uma taxa de crescimento reduzida de 0,18 [h"1]. Em comparação, o tipo selvagem tinha uma taxa de crescimento de 0,41 [h"1]. Além disso, o rendimento de biomassa era significativamente reduzido em M1840.

Enquanto que o tipo selvagem proporcionou 0,55 g de biomassa g de giiCOse \ C. glutamicum Ml 840 produziu apenas 0,36 g de Biomassa g de Glicose1· Esses resultados indicam que o metabolismo das células é fortemente sensível ao knockout de McbR. Durante crescimento exponencial, C. glutamicum M1840 exibiu titulações intracelulares elevadas de homocisteína e cisteína. Comparado com o tipo selvagem, a concentração intracelular de homocisteína aumentou de 0,1 para 2,9 μmoles gcDw 1 e cisteína aumentou de 0,3 para 2,8 μmoles gcDw"1-· Isso é igual a aumentos de 29 e 9,3 vezes, respectivamente. Se torna óbvio que o knockout de McbR leva ao acúmulo de precursores importantes de metionina. Contudo, os espectros de HPLC e GC/MS também mostram um sinal intenso adicional que pôde ser identificado como homolantionina (Fig. lb).

Identificação de homolantionina. A estrutura de homolantionina difere da cistationina pelo teor de um grupo metileno adicional (Fig. lb). Átomos de α-carbono têm configuração S- em homolantionina natural. A homolantionina foi quantificada com o fator de calibração de HPLC obtido para cistationina. O acúmulo de 250 μmol gcDw 1 em C. glutamicum Ml840 em crescimento exponencial (=ATCC 13032 AMcbR) comparado com 1,3 μmol gcDw 1 na cepa isogênica do tipo selvagem ATCC 13032 torna esse aminoácido o segundo aminoácido intracelular mais importante além do glutamato (325 μmol gcDw"')- Homolantionina foi identificada através de experimentos de rotulação e o padrão de fragmento por GC/MS. Cultivos separados de C. glutamicum Ml 840 com [U13C]-Glicose, [15N]-sulfato de amônio, [34S]-sulfato e subseqüente extração de célula e análise de rotulação com GC/MS confirmaram que o teor de carbono, nitrogênio e enxofre do metabólito observado era equivalente à homolantionina (CSN2S1). Os fragmentos de massa observados m (m/z = 692), m-15 (m/z = 677), m-57 (m/z = 635) de homolantionina em GC/MS eram 14 massas mais pesadas do que suas contra-partes em cistationina (Fig. 3), indicando que um grupo metileno adicional estava presente. Adicionalmente, os fragmentos característicos m/z = 170, m/z = 244 e m/z = 272 do resíduo de homocisteína também puderam ser observados em cistationina, homocisteína e metionina. Quando metB foi deletado no genoma, a cepa resultante Ml 840 AMetB (correspondendo a ATCC 13032 AMcbR AMetB) mostrou apenas cerca de 0,33 μηιοί gcüw 1 de acúmulo de homolantionina, próximo do limite de detecção na análise. Essas observações mostram, inequivocadamente, que deleção de metB leva à prevenção da formação e/ou acúmulo da substância homolantionina e, desse modo, prova que enzimas com atividade de cistationina γ-sintase, tal como metB, suportarão o acúmulo de homolantionina, o qual pode ser prejudicial para a produção de metionina.

Origem de homolantionina no metabolismo celular. Cultivo de um mutante de C. glutamicum AMcbR, Ahom, Ahsk com [U^13 C]-Glicose e [U13C] -treonina e homoserina naturalmente rotulada mostrou claramente que a homolantionina era derivada de homoserina. Assim como homoserina, a rotulação de homolantionina revelou um padrão de rotulação natural, indicando que nem glicose nem treonina proporcionam os precursores necessários para a síntese de homolantionina. Em experimentos adicionais, a cepa foi cultivada sob as mesmas condições, exceto que metionina, cistationina ou homocisteína foram alimentadas ao invés de homoserina. Esses experimentos mostraram que a cepa era capaz de crescer com esses substratos, mas nós observamos um crescimento reduzido de cistationina, corroborando as descobertas de Ruckert e colaboradores, 2003, vide supra. Alimentação desses três substratos não levou ao acúmulo significativo de homolantionina. Isso mostra que o acúmulo desse metabólito na via de metionina tem de ser localizado antes da formação de homocisteína. MetB, MetZ ou a MetC, trabalhando direção inversa poderiam ser considerados como possíveis candidatos para enzimas de formação de homolantionina.

Isolamento e caracterização de MetB e MetC. Para se dirigir adicionalmente às questões referentes ao acúmulo de homolantionina na via de metionina, MetB e MetC foram superexpressos em E. coli e isolados. As proteína isoladas foram caracterizadas em ensaios enzimáticos. Os valores de Km para seus substratos naturais cisteína e cistationina, respectivamente, estão na mesma faixa que aqueles encontrados para as enzimas correspondentes de outros organismos (Tabela 3). O valor de Km de MetB para cisteína era 258 μΜ, enquanto que Km para homocisteína com 541 μΜ era mais do que o dobro. Dadas as concentrações intracelulares iguais de homocisteína e cisteína em C. glutamicum AMcbR, os valores de Km observados podem indicar que ambos os substratos são usados in vivo por MetB. O Km de MetC para cistationina era 107 μΜ, um valor entre aqueles para cistationinases de E. coli e Salmonella (Tabela 3). Em virtude da falta de homolantionina pura, o valor de Km para esse substrato não pode ser determinado. Mas o valor correspondente da cistationiase de E. coli de 4,5 mM (Tabela 2) mostrou que a clivagem de homolantionina era muito pobre. MetB foi ainda caracterizado através de incubação com o-acetil-homoserina e cisteína ou homocisteína, respectivamente. O consumo de cisteína (Fig. 2A) e homocisteína (Fig. 2B) foi acompanhado fotometricamente. Além disso, amostras dos ensaios enzimáticos foram tomadas a 0 min, 80 min e 205 min e analisadas através de HPLC. MetB converteu cisteína e O-acetil- homoserina efetivamente em cistationina. Ele formou homolantionina quando incubado com O-acetil- homoserina e homocisteína. MetB foi removido dos ensaios após 80 min através de ultrafiltração e MetC foi adicionado. A adição de MetC levou a uma clivagem completa da cistationina resultando em acúmulo de homocisteína, também refletida no aumento de extinção no ensaio fotométrico (Fig. 2A). Homolantionina foi apenas pobremente clivada por MetC, levando a um ligeiro aumento em homocisteína e uma concentração ligeiramente diminuída de homolantionina. A clivagem era fraca para ser acompanhada no fotômetro. Isso indicou que o valor de Km de MetC para homolantionina poderia ser tão alto como em E. coli. Na verdade, os valores de Km para MetC de E. coli para cistationina (40 μΜ) e homolantionina (4,5 mM) (Dwivedi, C. M. e colaboradores, Biochemistry 1982, 2113, 3064-9), indicam uma clivagem mais lenta de homolantionina por MetC. Resultados similares foram encontrados por Uren (Uren, J. R., Methods Enzymol 1987, 143, 483-6). De modo interessante, a clivagem de cistationina e o acúmulo de homocisteína também resultaram no acúmulo de pequenas quantidades de homolantionina. Isso indica que MetC também é capaz de formar homolantionina. Contudo, controles com O-acetil-homoserina e homocisteína não contêm MetB no primeiro lugar, não proporcionam homolantionina, quando MetC foi adicionado. Isso mostra que MetC não pode usar esses substratos para criar homolantionina. E possível que homocisteína, que se acumulou durante a clivagem de cistationina, seja usada por MetC para uma reação com cistationina-P-sintase (CysM). Ao invés de serina, MetC poderia usar homoserina que está presente no ensaio como uma impureza a partir de O- acetil- homoserina e, assim, formar homolantionina. Ensaios de controle com O-acetil- homoserina ou homocisteína apenas e controles com homoserina ao invés de O- acetil-homoserina não proporcionam qualquer produto usando MetB ou MetC. Além disso, a clivagem hidrolítica de homolantionina por MetC leva não apenas à formação de homocisteína, mas, em analogia à clivagem de cistationina, também amônia e 2- oxobutanoato serão produzidos. O último é um precursor de isoleucina. Isso levaria a uma via metabólica da biossíntese de metionina na formação de isoleucina eliminando a treonina como a única fonte conhecida de isoleucina.

Impacto sobre metabolismo de isoleucina. Isoleucina é formada a partir de um C^precursor (treonina) e um C3-precursor (piruvato). Na molécula final, 2 átomos de carbono de isoleucina derivam de piruvato. Se o C4-precursor é não rotulado e piruvato é rotulado, um desvio de massa de 2 é observado. O fragmento de isoleucina investigado em GC/MS continha 2 a 6 carbonos do esqueleto de isoleucina. Quando treonina e glicose foram completamente rotulados, o desvio de massa em m/z = 200 seria m+5. Se, contudo, a homoserina derivada C4 foi usada para formar isoleucina, um desvio de m+2 seria observado, derivando do piruvato rotulado. Na verdade, uma formação de isoleucina a partir de um precursor alternativo que não treonina foi observada nas cepas McbR-Knockout. Cerca de 13 % da isoleucina proteinogênica em C. glutamicum AMcbR, Ahom, Ahsk foram formados a partir de um precursor derivado de homoserina naturalmente rotulada e não da treonina rotulada proporcionada no meio de cultura (Tabela 3). Isso foi observado como uma abundância de 13 % de isotopômero de massa m+2 de isoleucina (m/z = 200). A treonina proteinogênica foi identicamente rotulada como a treonina extracelular e a alanina refletia a rotulação de piruvato, idêntico à rotulação de glicose extra celular. Se torna óbvio que C. glutamicum é capaz de geral isoleucina independente de treonina. O precursor de isoleucina adicional é, mais provavelmente, 2- oxobutanoato derivado do metabolismo de metionina. Normalmente, esse ácido orgânico é formado no metabolismo de isoleucina através de desaminação de treonina via uma liase de amônia de treonina. No metabolismo de metionina, existem reações alternativas possíveis para formar 2- oxobutanoato. Um metanotiol-liase de metionina (EC 4.4.1.11), uma sulfeto de hidrogênio-liase de homocisteína (EC 4.4.1.2) ou uma cisteína-liase de cistationina (EC 4.4.1.1) poderiam ser responsáveis pela formação de 2- oxobutanoato. Através de alimentação do mutante com metionina, homocisteína ou cistationina e, ao mesmo tempo, glicose totalmente rotulada com carbono e treonina, essas possibilidades viraram a regra (Tabela 2). Além disso, nesses estudos, a alteração na rotulação de isoleucina estava relacionada ao acúmulo de homolantionina, mostrando que a clivagem por MetC de homolantionina é, mais provavelmente, responsável pela síntese de isoleucina independente de treonina. SEQ ID NO: 1

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<110> BASF AG

<120> Microorganismo e processo para a preparação de L-metionina

<130> B 8174

<140> PCT/EP2006/0 67 680

<141> 2006-10-23

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<170> PatentIn version 3.3

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<211> 5477

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA de plasmideo

<400> 1

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Claims (31)

1. Microorganismo que superproduz L-metionina, caracterizado pelo fato de que a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido.

2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o teor e/ou a atividade biológica da proteína reguladora de transcrição McbR é reduzida comparada com o microorganismo do tipo selvagem.

3. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um gene o qual codifica McbR é rompido e, de preferência, eliminado.

4. Microorganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene mcbR rompido impede a expressão de uma proteína McbR funcional.

5. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido através de redução do teor e/ou da atividade biológica de cistationina-γ- sintase (MetB) comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

6. Microorganismo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene o qual codifica MetB é rompido e, de preferência, eliminado.

7. Microorganismo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o gene metB rompido impede a expressão de uma proteína MetB funcional.

8. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzida e/ou impedida através de introdução de um gene heterólogo que codifica um mutante de cistationina-P-liase (MetC) o qual é capaz de converter eficientemente homolantionina em homocisteína.

9. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzida e/ou impedida através de introdução de um gene heterólogo que codifica um mutante de cistationina-y-sintase (MetB) o qual é capaz de converter eficientemente O- acetil-homoserina e cisteína em cistationina e o qual não é capaz de converter O-acetil-homoserina e homocisteína em homolantionina

10. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o teor e/ou a atividade biológica de uma proteína selecionada do grupo consistindo de sulfidrolase de O-acetilhomoserina (MetZ), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE) é aumentada comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

11. Microorganismo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo de uma proteína tendo a atividade de sulfidrolase de O-acetilhomoserina (MetZ), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE) é intensificada e/ou superexpressada comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

12. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de bactérias corineformes, micobactérias, streptomycetaceae salmonella, Escherichia eoli, Shigella, Baeillus, Serratia e Pseudomonas.

13. Microorganismo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Corynebaeterium glutamicum, Escherichia eoli ou Bacillus subtilis.

14. Processo para a preparação de L-metionina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - cultura e/ou fermentação de um microorganismo o qual produz, preferivelmente superproduz, L-metionina e no qual a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido; e - isolamento de L-metionina.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados nos quais o teor e/ou a atividade biológica de cistationina-y-sintase (MetB) é reduzida comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados em um gene o qual codifica MetB é rompido ou de preferência eliminado.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o gene metB rompido impede a expressão de uma proteína MetB funcional nos microorganismos cultivados.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados nos quais o teor e/ou a atividade biológica da proteína reguladora transcricional McbR é reduzido comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados nos quais um gene o qual codifica McbR é rompido e, de preferência, eliminado.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o gene mcbR rompido impede a expressão de uma proteína McbR funcional.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados nos quais um gene heterólogo que codifica um mutante de cistationina-P-liase (MetC) é introduzido o qual é capaz de converter eficientemente homolantionina em homocisteína.

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados nos quais um gene heterólogo que codifica um mutante de cistationina-y-sintase (MetB) é introduzido o qual é capaz de converter eficientemente O-acetil- homoserina e cisteína em cistationina e o qual não é capaz de converter O- acetil-homoserina e homocisteína em homolantionina.

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo fato de que os microorganismos são cultivados nos quais o teor e/ou a atividade biológica de uma proteína selecionada do grupo consistindo de uma proteína tendo a atividade de O-acetil-homoserina sulfidrolase (MetZ)5 metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE) é aumentada comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23 caracterizado pelo fato de que microorganismos são cultivados nos quais pelo menos um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo de uma proteína tendo atividade de O-acetil-homoserina sulfidrolase (MetZ), metionina sintase I dependente de cob(I)alamina (MetH) e metionina sintase II independente de cob(I)alamina (MetE) é intensificada e/ou superexpressada comparado com o microorganismo do tipo selvagem.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de bactérias corineformes, micobactérias, streptomycetaceae salmonella, Escherichia eoli, Shigella, Baeillus, Serrada e Pseudomonas.

26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Corynebacterium glutamicum, Escherichia eoli ou Baeillus subtilis.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 26, caracterizado pelo fato de que L-metionina é concentrada no meio ou nas células do microorganismo.

28. Processo para a preparação de um aditivo para gêneros alimentícios para animal contendo L-metionina a partir de caldos de fermentação, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: - cultura e fermentação de um microorganismo o qual produz, de preferência, superproduz o L-aminoácido desejado e no qual a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido em um meio de fermentação; - remoção de água do caldo de fermentação contendo L- metionina; - remoção de uma quantidade de 0 a 100% em peso da biomassa formada durante fermentação; e - secagem do caldo de fermentação para obter o aditivos para gêneros alimentícios para animal na forma em pó ou grânulo.

29. Processo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo fato de que os microorganismos como definidos em uma das reivindicações 1 a 13 são cultivados.

30. Uso de um microorganismo, no qual a formação e/ou acúmulo de homolantionina na via de metionina é reduzido e/ou impedido, caracterizado pelo fato de ser para a produção de L-metionina.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um microorganismo como definido em uma das reivindicações 1 a 13.