JP2009513119A - Ｌ−メチオニン調製のための微生物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、L-メチオニンのようなL-アミノ酸の効率的な調製のための微生物および方法に関する。具体的には、本発明は、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積が低減および／または阻止される微生物および方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、L-メチオニンの効率的な調製のための微生物および方法に関する。具体的には、本発明は、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積が低減および／または阻止される微生物および方法に関する。

現在、全世界で毎年約500,000トンのメチオニンが生産されている。メチオニンは、家禽飼料の第１制限アミノ酸であり、そのために、主に飼料用栄養剤として使用されている。他の工業アミノ酸とは対照的に、メチオニンは、ほとんどの場合、化学的合成により製造されるラセミ混合物として使用される。動物は、メチオニンの両方の立体異性体を代謝することができるため、化学的に製造したラセミ混合物の直接給餌が可能である（D'MelloおよびLewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals: Amino Acids, Rechgigl（編）、CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490, 1978）。

しかし、既存の化学的製造法を生物工学的方法に代えることには、やはり大きな利点がある。というのは、補給レベルが低ければ、L-メチオニンはD-メチオニンより優れた硫黄アミノ酸の供給源となるからである（KatzおよびBaker, (1975) Poult. Sci., 545, 1667-74）。さらに、化学的方法では、かなり有害な化学薬品を用い、大量の廃棄物流を生み出してしまう。化学的製造のこれらの問題点はすべて、効率的な生物工学的方法により回避することができるのである。

グルタミン酸のような他のアミノ酸の場合、発酵法を用いてこれらを生産することが知られている。このような目的のためには、大腸菌（E. coli）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）など、特定の微生物が特に適していることが明らかにされている。発酵によるアミノ酸の生産にはまた、L-メチオニンだけを生成するという具体的な利点もある。さらに、化学的合成で用いられる、環境に問題のある化学薬品（溶剤など）を用いなくてもよい。しかし、微生物によるメチオニンの発酵生産は、化学的製造と同等価格で商業規模でのメチオニン生産が可能である場合にしか、化学的合成の代替法にならない。

従って、この分子を大量に生産および分泌するように作製した細菌の大規模培養によるL-メチオニンの生産が望ましい目標である。この方法に加えられる改善としては、発酵措置（例えば、攪拌および酸素の補給）、栄養培地の組成（例えば、発酵中の糖濃度）、または、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる、産物の後処理、あるいは微生物自体の固有の生産性などを挙げることができる。

また、これら微生物の生産性を向上させるために、突然変異誘発、選択および突然変異体選別のような方法も用いられる。このような方法で、代謝拮抗物質に耐性の、または調節に重要な代謝物について栄養要求性の高産生株が得られる。

また、組換えDNA技術も、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅して、アミノ酸生産への効果を調べることにより、L-アミノ酸を産生する微生物株を改善するのに数年にわたり使用されてきた。

Ruckertら、Journal of Biotechnology 2003, 104, 213-228は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるL-メチオニン生合成経路の分析を記載している。MetZ（MetYとしても知られる）およびMetBの既知の機能を確認することができ、MetC（AecDとしても知られる）がシスタチオン-β-リアーゼであることが証明された。さらに、この研究で、L-ホモシステインからL-メチオニンへの変換を触媒するMetEおよびMetHが同定された。

WO 02/097096では、McbRリプレッサー遺伝子（MetDとして知られる）が減弱された細菌を用いてアミノ酸を調製するのに、McbRリプレッサー遺伝子をコードするコリネ型細菌由来のヌクレオチド配列を用いている。WO 02/097096によれば、転写レギュレーターMcbRの減弱により、コリネ型細菌におけるL-メチオニンの生産が改善される。さらに、WO 02/097096には、McbRリプレッサー遺伝子の減弱に加えて、シスタチオニン-γ-シンターゼをコードするMetB遺伝子を増強または過剰発現させるのがL-メチオニンの製造に好ましいと記載されている。

特定の分子の生産のために改善された菌株の選択は、時間がかかり、しかも難しいプロセスである。従って、効率的にL-メチオニンを産生し、かつ／またはメチオニン化合物の取得に利用可能な、L-メチオニン含量が有意に増加した微生物がやはり強く求められる。

本発明の目的は、微生物におけるL-メチオニンの効率的な生産のための方法を提供することである。

本発明の別の目的は、L-メチオニンを効率的に産生する微生物を提供することである。

本発明の上記およびさらに別の目的は、以下の説明から明らかになるように、独立請求項の内容により達成される。

また、本発明のさらに別の実施形態は従属請求項により限定される。

本発明の一実施形態によれば、特にメチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、L-メチオニン調製のための微生物が提供される。L-メチオニンの生合成経路においてホモランチオニンの生成および／または蓄積をこのように低減および／または阻止することにより、微生物は大量の所望の分子、すなわちL-メチオニン、を産生し分泌することが可能になると考えられる。

本発明のさらに別の実施形態では、野生型微生物と比較して、転写調節タンパク質McbRの含量および／または生物活性を低減し、かつ、特にメチオニン経路における、ホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、微生物が提供される。

本発明の別の実施形態によれば、野生型微生物と比較して、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB、EC 2.5.1.48）の含量および／または生物活性を低減することにより、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、微生物が提供される。

本発明の別の実施形態では、MetBをコードする遺伝子を減弱もしくは破壊および／または排除することにより、MetBの含量および／または生物活性を低減する。

本発明の方法の別の実施形態によれば、破壊されたMetB遺伝子は、培養した微生物における機能的MetBタンパク質の発現を阻止する。

本発明の微生物の一実施形態では、McbRをコードする遺伝子を減弱、好ましくは破壊、さらに好ましくは排除する。具体的には、破壊されたMcbR遺伝子は、本発明の微生物における機能的McbRタンパク質の発現を阻止しうる。

別の実施形態によれば、ホモシステインをメチオニンに効率的に変換することができるメチオニンシンターゼ、すなわちmetE（EC 2.1.1.13）および／またはmetH（EC 2.1.1.14）をコードする、同種または異種起源の遺伝子を導入した、および／または過剰産生する、微生物が提供される。

本発明の別の形態によれば、
− L-メチオニンを産生し、しかも、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した微生物を培養および／または発酵させるステップ、および
− L-メチオニンを単離するステップ、
を含むL-メチオニンの調製方法が提供される。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、野生型微生物と比較して、転写調節タンパク質McbRの含量および／または生物活性を低減した生物を培養する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、McbRをコードする遺伝子を減弱および／または破壊および／または排除した微生物を培養する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、破壊されたMcbR遺伝子は、機能的McbRタンパク質の発現を阻止する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、ホモランチオニンをホモシステインに効率的に変換することができるシスタチオニン-β-リアーゼ（MetC）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入した、微生物を培養する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、O-アセチル-ホモセリンおよびシステインをシスタチオンに効率的に変換することができ、かつ、O-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインをホモランチオニンに変換することができない、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）をコードする異種遺伝子を導入した、微生物を培養する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、野生型微生物と比較して、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）からなる群より選択されるタンパク質の含量および／または生物活性を増大した、微生物を培養する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、野生型微生物と比較して、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）からなる群より選択されるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を増強および／または過剰発現させた、微生物を培養する。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、前記微生物は、コリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトミセス、サルモネラ、大腸菌、シゲラ、バチルス、セラチアおよびシュードモナスからなる群より選択される。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、または枯草菌である。

本発明の方法のさらに別の実施形態によれば、所望のL-アミノ酸を前記微生物の培地または細胞において濃縮させる。

本発明の別の形態では、発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の調製方法が提供され、該方法は、
− L-メチオニンを産生し、しかも、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した微生物を発酵培地で培養および／または発酵させるステップ、
− L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去するステップ、
− 発酵中に形成されたバイオマスの０〜100重量％、例えば10〜90重量％、または20〜80重量％、または30〜70重量％、または40〜60重量％、または約50重量％の量を除去するステップ、および
− 発酵ブロスを乾燥させることにより、粉末または顆粒形態の動物飼料用添加物を取得するステップ
を含む。

さらに、本発明の別の形態は、L-メチオニン生産のための、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカム、の使用に関する。

本発明の代表的な実施形態を詳細に説明する前に、以下のような定義を行う。

「メチオニン合成の効率」という用語は、メチオニンの炭素収率を表す。この効率は、炭素基質の形で系に入ったエネルギー投入量に対するパーセンテージとして計算する。本発明全体を通じて、この値は、別途記載のない限り、パーセント値（（メチオニンのモル数）(炭素基質のモル数)^-1×100）で示す。

用語「ホモランチオニン合成の効率」とは、ホモランチオニンの炭素収率を意味する。この効率は、炭素基質の形で系に入ったエネルギー投入量に対するパーセンテージとして計算する。本発明全体を通じて、この値は、別途記載のない限り、パーセント値（（ホモランチオニンのモル数）(炭素基質のモル数)^-1×100）で示す。

本発明の好ましい炭素源は、単糖、二糖、もしくは多糖などの糖類である。特に好ましい炭素源として、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンもしくはセルロースからなる群より選択される糖を用いることができる。

用語「メチオニン合成の増大した効率」は、遺伝子的に改変され、もとの野生型生物と比べてメチオニン合成の効率が高くなった生物間の比較に関する。

用語「メチオニンの収率」とは、細胞量(重量)につき得られたメチオニンの量として計算されるメチオニンの収率を意味する。

用語「メチオニン経路」とは、当分野で認識されているもので、野生型生物で行われている、メチオニン生合成をもたらす一連の反応を意味する。この経路は、生物によって違うこともある。生物特異的な経路の詳細については、ウェブサイトhttp://www.genome.jp/hegg/metabolism.htmlに挙げられている資料および科学文献から調べることができる。具体的には、本発明の意味に含まれるメチオニン経路を図１に示す。

用語「ホモランチオニンの収率」とは、細胞量(重量)につき得られたホモランチオニンの量として計算されるホモランチオニンの収率を意味する。

メチオニン経路でホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止するとは、MetB、MetC、MetZ、MetEおよび／またはMetHのようなメチオニン経路の酵素の活性が本発明に従い改変されていないメチオニン産生微生物におけるホモランチオニンの効率および／または収率および／または量と比較して、好ましくは90％以下、70％以下、50％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、５％以下もしくは２％以下の効率および／または収率および／または量でホモランチオニンが産生されることを意味する。

メチオニンとホモランチオニンに関して前述した定義は、メチオニン経路の他の代謝物にも同様に適用される。

本発明の目的にかなう用語「生物」または「微生物」とは、メチオニンのようなアミノ酸の生産に通常用いられるあらゆる生物を指す。具体的には、用語「生物」は原核生物、下等真核生物および植物に関する。前述した生物の好ましい群には、アクチノバクテリア、シアノバクテリア、プロテオバクテリア、クロロフレクサス・アウランチアクス、ピレルラsp.1、ハロバクテリアおよび／またはメタノコッカス、好ましくはコリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトミセス、サルモネラ、大腸菌、シゲラおよび／またはシュードモナスが含まれる。特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、バチルス属の微生物、特に枯草菌、ならびに、ストレプトミセス属の微生物から選択される。

しかし、本発明の生物は、シゾサッカロミセス・ポンベまたはセレビシエ、およびピキア・パストリスなどの酵母も含みうる。

本発明が意図する「L-メチオニンを過剰産生する微生物」とは、野生型微生物と比較して、メチオニン生産の効率および／または収率および／または量が、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％または少なくとも1,000％もしくはそれ以上増大した、微生物を指す。

微生物の生産のために、本発明では植物も考慮される。このような植物は、単子葉または双子葉植物、例えば、単子葉または双子葉作物植物、食用植物もしくは飼草などでよい。単子葉植物の例として、カラスムギ属（オーツムギ）、コムギ属（コムギ）、ライムギ属（ライムギ）、オオムギ属（オオムギ）、イネ属（イネ）、キビ属、チカラシバ属、エノコログサ属、モロコシ属（雑穀）、トウモロコシ属（トウモロコシ）などの属に属する植物が挙げられる。

双子葉作物植物として、中でも、ワタ、豆類植物、特にアルファルファ、ダイズ、ナタネ、トマト、テンサイ、ジャガイモ、観賞植物、ならびに樹木などが挙げられる。さらに別の作物植物としては、果実（特に、リンゴ、ナシ、サクランボ、ブドウ、カンキツ類、パイナップルおよびバナナ）、ギネアアブラヤシ、チャノキ、カカオノキおよびコーヒーノキ、タバコ、サイザル、ならびに、薬用植物に関しては、インドジャボクおよびジギタリスが挙げられる。特に、穀類、コムギ、ライムギ、カラスムギ、イネ、トウモロコシおよびキビ、テンサイ、ナタネ、ダイズ、トマト、ジャガイモおよびタバコが好ましい。さらに別の作物植物については、米国特許第6,137,030を参照することができる。

用語「野生型生物」または「野生型微生物」とは、遺伝子的に改変されていない生物を指す。

用語「代謝物」または「代謝産物」とは、前駆体、中間体および／または最終産物として、生物の代謝経路で使用される化合物を意味する。このような代謝物は、化学的構成単位として役立つだけではなく、酵素およびその触媒活性に対する調節活性も発揮すると考えられる。文献から、このような代謝物は酵素の活性を阻害または刺激しうることがわかっている（Stryer, Biochemistry, (1995) W. H. Freeman & Company、ニューヨーク州ニューヨーク）。

本発明において用語「外部代謝物」は、グルコース、硫酸、チオ硫酸、亜硫酸、硫化物、アンモニア、酸素などの基質を含む。特定の実施形態では、（外部）代謝物は、いわゆるC1-代謝物を含む。このような代謝物は、例えばメチル供与体として機能することができ、ギ酸、ホルムアルデヒド、メタノール、メタンチオール、ジメチル-ジスルフィドなどの化合物を含む。

用語「産物」は、メチオニン、バイオマス、CO₂などを含む。

アミノ酸は、あらゆるタンパク質の基本的構造単位を構成し、それ自体、生物における正常な細胞機能に必須である。用語「アミノ酸」は当分野において周知である。タンパク質生成アミノ酸（20種）は、タンパク質の構造単位として働き、その際、これらのアミノ酸はペプチド結合により結合されるのに対し、非タンパク質生成アミノ酸は、通常、タンパク質に存在しない（Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry、A2巻、57-97ページ、VCH, Weinheim (1985)を参照）。アミノ酸は、D-またはL-光学配置であると考えられるが、L-アミノ酸は、一般に、天然に存在するタンパク質に認められる。20種のタンパク質生成アミノ酸各々の生合成および分解経路は、原核および真核生物細胞の両方で十分に特性決定がなされている（例えば、Stryer, L. Biochemistry, 第３版、578-590ページ (1988)を参照）。必須アミノ酸、すなわち、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン（これらは、一般に、その生合成の複雑さのために栄養必要物である）は、残る11種の非必須アミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシンに単純な生合成経路により容易に変換される。高等動物は、これらアミノのいくつかを合成する能力を保持してはいるが、正常なタンパク質合成が起こるようにするために、必須アミノ酸を食事から補給しなければならない。タンパク質生合成におけるそれらの機能以外にも、上記アミノ酸はそれ自体が有利な化学薬品であり、その多くが食品、飼料、化学薬品、化粧品、農業および医薬品産業に様々な用途が見出されている。リシンはヒトだけではなく、家禽およびブタのような単胃動物の栄養においても重要なアミノ酸である。グルタミン酸は、調味添加剤として極めて一般的に用いられており、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシンおよびシステインと同様、食品産業全体に広く用いられている。グリシン、L-メチオニンおよびトリプトファンはすべて、医薬品産業に用いられている。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリンおよびアラニンは、製薬および化粧品産業の両方で用いられている。トレオニン、トリプトファンおよびD/L-メチオニンは、一般的な飼料添加物である（Leuchtenberger, W. (1996), Amino acids - technical production and use, p.466-502, Rehmら（編者）Biotechnology、第6巻、第14a章、VCH: Weinheim）。さらに、これらのアミノ酸は、例えば、N-アセチルシステイン、S-カルボキシメチル-L-システイン、(S)-5-ヒドロキシトリプトファン、ならびにUllmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p.57-97, VCH: Weinheim, 1985に記載されているもののような、合成アミノ酸およびタンパク質の合成のための前駆体として有用であることがわかっている。

これら天然アミノ酸を産生することができる生物（例えば、細菌）における該アミノ酸の生合成は、十分に研究されている（細菌のアミノ酸生合成およびその調節については、Umbarger H.E. (1978), Ann. Rev. Biochem. 47:533-606を参照）。グルタミン酸は、クエン酸回路の中間体であるα‐ケトグルタル酸の還元的アミノ化により合成される。グルタミン、プロリンおよびアルギニンは、各々、後にグルタミン酸から生成される。セリンの生合成は、3-ホスホグリセリン酸（解糖における中間体）から開始する３段階プロセスであり、酸化、アミノ基転移、および加水分解段階後に、このアミノ酸が得られる。システインとグリシンはいずれも、セリンから生成され；システインは、ホモシステインとセリンの縮合によって、またグリシンは、セリントランスヒドロキシメチラーゼにより触媒される反応において、側鎖β炭素原子のテトラヒドロ葉酸への転移により、それぞれ得られる。フェニルアラニンとチロシンは、解糖およびペントースリン酸経路前駆体である、エリトロース-4-リン酸およびホスホエノールピルビン酸から、９段階生合成経路（プレフェン酸の合成後、最後の２段階だけが異なる）で合成される。トリプトファンもまた、これら２つの初期分子から生成されるが、その合成は11段階経路である。チロシンもまた、フェニルアラニンヒドロキシラーゼにより触媒される反応において、フェニルアラニンから合成することができる。アラニン、バリンおよびロイシンはすべて、解糖の最終産物である、ピルビン酸の生合成産物である。アスパラギン酸は、クエン酸回路の中間体である、オキサロ酢酸から形成される。アスパラギン、メチオニン、トレオニンおよびリシンは各々、アスパラギン酸の変換により生成される。イソロイシンは、トレオニンから形成することができる。複雑な９段階経路により、活性化糖である5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸からヒスチジンが生成される。

細胞のタンパク質合成に必要な過剰量のアミノ酸は、貯蔵することができず、その代わりに分解されて、細胞の主要な代謝経路の中間体を供給する（詳しくは、Stryer, L., Biochemistry、第3版、第21章、"Amino acid degradation and the urea cycle", p. 495-516 (1988)を参照）。細胞は不要なアミノ酸を有用な代謝中間体に変換することができるが、アミノ酸の生産には、エネルギー、前駆体分子、およびこれらを合成するのに必要な酵素の点から割高である。従って、アミノ酸生合成がフィードバック阻害（特定のアミノ酸の存在が、それ自体の生産を低速化または完全に停止する役割を果たす）により調節されることは驚くに値しない（アミノ酸生合成経路におけるフィードバック機構の概要については、Stryer, L., Biochemistry、第3版、第24章: "Biosynthesis of amino acids and heme", p.575-600 (1988)を参照）。このように、いずれか特定のアミノ酸の生産量は、細胞に存在するそのアミノ酸の量により制限される。

グラム陽性土壌細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムは、様々なアミノ酸の工業生産に広く用いられている。主要な工業製品であるリシンおよびグルタミン酸の生合成は多年にわたり研究されているが、メチオニン生合成経路の調節についての知識は限られたものである。少なくとも上記経路の鍵となる酵素はわかっている（図１参照）。コリネバクテリウム・グルタミカムは、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ（MetA）（EC 2.3.1.31）を用いたアセチル化によりホモセリンを活性化する。さらに、ホモシステインを生産するのに、トランススルフレーション(transsulfuration)および直接スルフヒルドリル化の両方が用いられることも明らかにされた（Hwang, B.J., Yeom, H.J., Kim, Y., Lee, H.S., J. Bacteriol. 2002, 1845, 1277-86）。トランススルフレーションは、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）（EC 2.5.1.48）により触媒される（Hwang, B.J., Kim, Y., Kim, H.B., Hwang, H.J., Kim, J.H., Lee, H.S., Mol Cells 1999, 93, 300-8）。この反応では、システインとO-アセチル-ホモセリンが結合してシスタチオニンとなり、これがシスタチオニン-β-リアーゼ（MetC；これはAecDとしても知られる）（EC 4.4.1.8）（Kim, J.W., Kim, H.J., Kim, Y., Lee, M.S., Lee, H.S., Mol Cells 2001, 112, 220-5；Ruckertら、2003, 前掲参照）により、ホモシステイン、ピルビン酸およびアンモニアに加水分解される。直接スルフヒドリル化の場合には、O-アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ；これはMetYとしても知られる）（EC 2.5.1.49）（Ruckertら、2003、前掲参照）が、O-アセチルホモセリンと硫化物をホモシステインと酢酸に変換する。最後に、コリネバクテリウム・グルタミカムは、ホモシステインをS-メチル化してメチオニンを生成するための、２つの異なる酵素（Lee, H.S., Hwang, B.J., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 625-6, 459-67；Ruckertら、2003, 前掲参照）、すなわち、コブ（I）アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）（EC 2.1.1.13）およびコブ（I）アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）（EC 2.1.1.14）を有する。前者は5-メチルテトラヒドロ葉酸を、後者は5-メチルテトラヒドロプテロイルトリ-L-グルタミン酸をメチル供与体として用いる。

近年、TetRファミリーの推定上の転写調節タンパク質がみいだされた（Reyら、Journal of Biotechnology 2003, 103, 51-65）。この調節タンパク質は、メチオニンおよび硫黄代謝に属する数個の遺伝子の転写を抑制することが証明された。上記調節タンパク質の遺伝子ノックアウトは、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするhom、O-アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼをコードするmetZ、S-アデノシルメチオニン（SAM）シンターゼ（EC 2.5.1.6）をコードするmetK、システインシンターゼ（EC 2.5.1.47）をコードするcysK、推定NADPH依存性亜硫酸レダクターゼをコードするcysl、そして最後に、推定アルカンスルホネートモノオキシゲナーゼをコードするssuDの発現増加をもたらした。Reyら（Molecular Microbiology 2005, 56, 871-887）はまた、metB遺伝子がmcbRマイナス株において顕著に誘導されることもみいだした。

本発明は、少なくとも部分的に、ホモランチオニンの生成を低減および／または阻止する、具体的には、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止することにより、微生物におけるL-メチオニンのような望ましい化合物の合成の効率および／または収率を高められるという発見に基づくものである。

メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積は、O-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインのホモランチオニンへのMetB触媒による変換の効率および／または収率を低減する、あるいは、該変換を抑制することにより、低減および／または阻止することができる。O-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインのホモランチオニンへのMetB触媒による変換の効率を低減する、または該変換を抑制するとは、MetBの活性が改変されていないメチオニン産生微生物における効率および／または収率および／または量と比較して、90％以下、70％以下、50％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、５％以下もしくは２％以下の効率および／または収率および／または量で、ホモランチオニンが産生されることを意味する。

上記に加え、またはこれに代わり、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積は、ホモランチオニンの、ホモシステイン、2-オキソブタン酸およびNH₄ ^-への、水を用いたMetC触媒切断の効率および／または収率を高めることにより、低減および／または阻止することもできる。ホモランチオニンの、ホモシステイン、2-オキソブタン酸およびNH₄ ⁺への、水を用いたMetC触媒切断の効率および／または収率を高めるとは、ホモランチオニンからのホモシステイン生産の効率および／または収率および／または量が、MetBおよび／またはMetCの活性が改変されていないメチオニン産生微生物における効率および／または収率および／または量と比較して、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上もしくは98％以上増加することを意味する。

微生物におけるL-メチオニン合成の効率および／または収率は、野生型微生物と比較して転写調節タンパク質McbRの含量および／または生物活性を低減すれば、さらに高めることができる。従って、本発明の一態様では、野生型微生物と比較して、転写調節タンパク質McbRの含量および／または生物活性を低減し、かつ、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成を阻止した微生物が提供される。

コリネバクテリウム・グルタミカムのような微生物における転写調節McbRのノックアウトは、細胞の代謝に深刻な影響をもたらす。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムにおける転写リプレッサーMcbRのノックアウトは、細胞の代謝に強力な影響を及ぼす。表現型は、増殖低下、バイオマス収率の減少、およびシステインとホモシステインのようなメチオニン前駆体の細胞内蓄積を含む。興味深いことに、メチオニン蓄積は観察することができなかった。しかし、本発明に関して、McbRのノックアウトにより、ホモランチオニンの蓄積、およびトレオニン非依存性イソロイシン合成も起こることが見いだされた。

他の生物によるホモランチオニンの蓄積が、これまでの研究文献に記載されている。大腸菌のメチオニン栄養要求性株は、大量のホモランチオニンを蓄積する（Huang, H.T., Biochemistry 1963, 2, 296-8）。また、メチオニン栄養要求性アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）もホモランチオニンを蓄積する（Paszewski, A., Grabski, J., Acta Biochim. Pol. 1975, 223, 263-8）。研究された両生物に共通していたのは、メチオニンシンターゼのノックアウトであった。しかし、ヒト肝臓シスタチオナーゼもホモランチオニンを蓄積することができる（Tallan, H.H.ら、Biochem Biophys Res Commun 1971, 432, 303-10）。加えて、ストレプトミセス・フェオクロモゲネス（Streptomyces phaeochromogenes）のシスタチオナーゼは、ホモランチオニンのin vitro合成に用いられ（Kanzaki, Hら、Agric Biol Chem 1986, 502, 391-397）、シロイヌナズナ由来のシスタチオニン-γ-シンターゼは、in vitroでホモシステインおよびO-アセチル-ホモセリンからホモランチオニンを生産した（Ravanel, S.ら、Biochem J 1998, 331 ( Pt 2), 639-48）。

コリネバクテリウム・グルタミカムのような生物の場合、ホモランチオニンの生成（図３参照）は、高い細胞内ホモシステインレベルによるMetBの副反応であることが現在わかっている。基質特異性が低く、ホモシステイン力価が上昇するために、MetBは偶発的に、システインの代わりにホモシステインを基質として、O-アセチル-ホモセリンと一緒に用いる。この反応により、シスタチオニンではなく、ホモランチオニンが得られる。MetCによるホモランチオニンの切断が弱いために、ホモランチオニンの夥しい蓄積が起こる。

特にMcbRノックアウト株（また、コリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbR株とも呼ばれる）における、ホモシステインレベルの上昇は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Hom）、O-アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）およびS-アデノシルメチオニンシンターゼ（MetK）の過剰発現によって起こると考えられる（Reyら、2003、前掲参照）。HomおよびMetZが、恐らく、ホモシステイン力価の直接増加を引き起こすのに対し、MetKはメチオニンをSAMに変換し、次に、これがS-アデノシルホモシステインを介してホモシステインに変換される。ホモシステインレベルの上昇のほかに、ホモランチオニン生成は、McbRノックアウト株におけるMetBの過剰発現によっても促進される。現在、McbRノックアウト株の粗抽出物は、野生型のほぼ３倍のMetB活性を示しうることがわかっている。

ホモランチオニンがコリネバクテリウム・グルタミカムにおいてMetBの副反応により生成されることを確認するため、コリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbRでMetBをノックアウトした。MetBのノックアウトにより、コリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbRにおけるホモランチオニンの蓄積は完全に阻止され、我々の知見を支持する結果となった。MetCによるホモランチオニンの遅い切断は、ホモシステインが再循環されるが、O-アセチルホモセリンは酢酸、2-オキソブタン酸およびアンモニアに変換される開放代謝回路をもたらす。この回路は、アセチル-CoAを消費するだけではなく、重要なイソロイシン前駆体である2-オキソブタン酸を供給する。これにより、ΔMcbR株は、トレオニン非依存性経路を介してイソロイシンを合成することが可能になる。

従って、本発明の別の実施形態によれば、野生型微生物と比較して、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）の含量および／または生物活性を低減することにより、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止する。シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）の含量および／または生物活性は、MetBをコードする遺伝子を減弱および／または破壊および／または排除することにより、野生型微生物と比較して低減することもできる。具体的には、本発明に従う微生物において破壊されたMetB遺伝子は、機能的MetBタンパク質の発現を阻止する。実施例で示すように、MetBのノックアウトにより、コリネバクテリウム・グルタミカムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbRのような微生物におけるホモランチオニンの蓄積は完全に阻止される。

さらに、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成は、ホモランチオニンをホモシステインに効率的に変換することができるシスタチオニン-β-リアーゼ（MetC）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入することにより、低減および／または阻止することもできる。

ホモランチオニンをホモシステインに効率的に変換することができるシスタチオニン-β-リアーゼ（MetC）突然変異体は、ホモランチオニンからのホモシステイン生産の効率および／または収率および／または量が、MetBおよび／またはMetCの活性が改変されていないメチオニン産生微生物における効率および／または収率および／または量と比較して、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上もしくは98％以上増大することを特徴とする。

ホモシステインおよびシステインの蓄積は、特に蓄積したホモシステインがmetHおよび／またはmetEの活性により触媒されるメチオニンにさらに代謝されれば、メチオニン過剰生産に有益であると考えられる。

さらに、O-アセチル-ホモセリンとシステインをシスタチオンに効率的に変換し、かつ、O-アセチル-ホモセリンとホモシステインをホモランチオニンに変換することができないシスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入することにより、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成を低減および／または阻止することも可能である。

O-アセチル-ホモセリンとシステインをシスタチオンに効率的に変換することができるシスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）突然変異体は、システインとO-アセチル-ホモセリンからのシスタチオン生産の効率および／または収率および／または量が、MetBの活性が改変されていないメチオニン産生微生物における効率および／または収率および／または量と比較して、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上もしくは85％以上、90％以上、95％以上、もしくは98％以上増大することを特徴とする。

O-アセチル-ホモセリンとホモシステインをホモランチオニンに変換することができないシスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）突然変異体は、MetBの活性が改変されていないメチオニン産生微生物における効率および／または収率および／または量と比較して、70％以下、50％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下もしくは５％以下の効率および／または収率および／または量で、ホモランチオニンを生産することを特徴とする。

本発明のさらに別の実施形態によれば、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）からなる群より選択されるタンパク質の含量および／または生物活性が、野生型微生物と比較して増強および／または過剰発現される微生物を提供する。

酵素の含量もしくは量および／または生物活性を増大または低減するとは、反応をさらに進行させるべきまたは導くべき方向に関して理解しなければならない。酵素の含量および／または生物活性を増大する、または酵素の含量および／または生物活性を低減するとは、図１に示す経路に従って産物が多かれ少なかれ得られるように、酵素の量および／または活性に影響を与えることを意味する。

本発明の一実施形態では、メチオニン経路の唯一つの酵素の量および／または活性を改変するだけで十分なこともある。あるいは、代謝経路の様々な酵素の量および／または活性を改変してもよい。あるいはまた、メチオニン経路の様々な、もしくは全部の酵素の量および／または活性に同時に影響を与えてもよい。遺伝子改変によりこのような生物を取得する方法は、当業者の技術常識に属するものである。

以下の表に、メチオニン合成の効率を高めるように含量および／または生物活性を改変することができるメチオニン経路の酵素について、具体例を記載する。

本発明に従って生物を遺伝子的に改変することにより、これらメチオニン過剰産生生物が、好ましくは50％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上もしくは85％以上の効率および／または収率でメチオニンを生産することを特徴とするように、メチオニン合成の効率および／または収率を高めることもできる。野生型微生物と比較して、本発明のメチオニン過剰産生生物におけるメチオニン生産の効率および／または収率および／または量は、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上、もしくは10,000％以上増大する。

本発明の微生物は、コリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトミセス、サルモネラ、大腸菌、シゲラ、バチルス、セラチアおよびシュードモナスからなる群より選択することができる。

本発明の生物は、好ましくは、コリネバクテリウム属の微生物、具体的には、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・アセトフィルム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・ニトロフィラス、もしくはコリネバクテリウム種を含む。本発明の生物はまた、ブレビバクテリウム属のメンバー、例えば、ブレビバクテリウム・ハルモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ボタニカム、ブレビバクテリウム・ジバラチカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ヘアリル、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム・ケトソレデュクタム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・リネンス、ブレビバクテリウム・パラフィノリチカムおよびブレビバクテリウム種も含む。特に、コリネバクテリウム微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（ATCC 13032）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（ATCC 15806）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（ATCC 13870）、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（FERM BP-1539）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（ATCC 17965）、コリネバクテリウム・グルタミカム（KFCC 10065）、コリネバクテリウム・グルタミカム（DSM 17322）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（YS-314）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（ATCC 21608）からなる群より選択しうる。

略語KFCCは韓国微生物保存連盟を意味し、また略語ATCCはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションを意味する。略語DSMはドイツ生物材料資源センターを意味する。

エシェリキア属の微生物は、大腸菌を含む群から選択することができる。サルモネラ属の微生物は、ネズミチフス菌を含む群から選択することができる。本発明の一部の実施形態では、上記生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよび枯草菌からなる群より選択される。

酵素の含量もしくは量および／または生物活性の増大または低減に関して、前述した生物などの宿主におけるタンパク質の量および／または生物活性を増大する当分野で周知のどのような方法を用いてもよい。

酵素の量は、対応するタンパク質の外来型の発現により増加させることもできる。さらに、転写、翻訳もしくは翻訳後レベルのいずれかに対する当該タンパク質の活性を調節する、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性、および／またはリン酸化、SUMO化、ユビキチン化などの他の調節活性に影響を与えることにより、内因性タンパク質の発現を増大させることも可能である。

例えば前述の酵素の量を単純に増加する以外にも、酵素の活性増加を可能にする特定の突然変異を保有する酵素を用いることにより、タンパク質の活性を増強することもできる。このような突然変異は、例えば、フィードバック阻害に関与する酵素の領域を不活性化するものでありうる。例えば、非保存的突然変異を導入することによりこれらを突然変異させれば、これらの酵素はフィードバック調節をそれ以上実施しなくなるため、さらに多くの産物が生産されても酵素の活性はダウンレギュレートされない。突然変異は、酵素の内在性コピーに導入してもよいし、あるいは、外因性酵素の対応する突然変異型を過剰発現することにより提供してもよい。このような突然変異には、点突然変異、欠失もしくは挿入が含まれる。点突然変異は、保存的または非保存的のいずれでもよい。さらに、欠失は、それぞれのタンパク質の２または３個のみのアミノ酸から完全なドメインまでであってよい。

従って、タンパク質の活性および量の増大は、例えば、転写、翻訳、もしくはタンパク質レベルで阻害調節機構をオフに切替える、あるいは、内在性MetC遺伝子を誘導するか、またはMetCをコードする核酸を導入することにより、野生型と比較して、上記タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増大させるなど、様々な経路によって達成することができる。

一実施形態では、MetC、MetZ、MetEおよびMetHのような酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増大により、野生型と比較して、酵素の活性および量の増大をそれぞれ達成する。配列は、対応するデータベース、例えばNCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、EMBL(http://www.embl.org)、Expasy(http://www.expasy.org/)、KEGG（http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg.html）などから入手することができる。例を表１に記載する。

さらに別の実施形態では、表１に示す酵素の量および／または活性の増大は、表１の酵素をコードする核酸を生物、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌に導入することにより達成される。

原則として、量および／または活性の増大を考慮する場合、表１に挙げたタンパク質の酵素活性を有する様々な生物のタンパク質を用いることができる。宿主生物が、対応するmRNAをスプライシングすることができないか、またはスプライシングすることができるように作製できない場合には、イントロンを含む真核生物由来の上記のような酵素のゲノム核酸配列と一緒に、対応するcDNAなど、すでにプロセシングされた核酸配列を用いるものとする。本明細書に挙げる核酸はすべて、例えば、RNA、DNAもしくはcDNA配列であると考えてよい。

メチオニン合成の効率が高い生物を作製する本発明の一方法では、前述した機能的または非機能的な、フィードバック調節型またはフィードバック非依存性の酵素のうちの１つをコードする核酸配列を微生物（コリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌など）にそれぞれ導入する。この導入は、それぞれの酵素の発現増加と、それに対応して所望の反応経路を介したさらに高い代謝フラックスをもたらす。

本発明によれば、タンパク質の量および／または活性の増大または導入は、典型的には、以下のステップを含む：
ａ）次の核酸配列（好ましくはDNA配列）を5’から3’の配向で含むベクターを作製するステップ、
‐本発明の生物において機能的なプロモーター配列、
‐上記配列に機能的に連結された、表１のタンパク質をコードするDNA配列、またはその機能的に同等な部分、
‐本発明の生物において機能的な終結配列、
ｂ）コリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌などの本発明の生物に、ステップａ）で得たベクターを導入し、場合により、各ゲノムに組み込むステップ。

本発明の範囲内で、酵素の機能的に同等な部分と述べるとき、表１の酵素をコードする核酸配列の断片を意味し、その発現からは、依然として、対応する全長タンパク質の酵素活性を有するタンパク質が得られる。

本発明によれば、非機能的酵素は、機能的酵素およびその機能的に同等の部分と同じ核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ有するが、ある位置では、ヌクレオチドまたはアミノ酸の点突然変異、挿入もしくは欠失を有し、これによって、非機能的酵素が、それぞれの反応を触媒することができないか、または非常に限られた程度までしかできなくなる。これらの非機能的酵素は、対応する反応をまだ触媒することができる酵素とは相違するが、もはやフィードバック調節されない。非機能的酵素はまた、核酸配列レベルまたはアミノ酸配列レベルで点突然変異、挿入もしくは欠失を有する表１の酵素をも含むが、該酵素の生理学的結合パートナーと相互作用することができない。このような生理学的結合パートナーとして、例えば、対応する基質が挙げられる。非機能的突然変異体は、該突然変異体の起源である野生型酵素が触媒することができる反応を触媒することができない。

本発明によれば、用語「非機能的酵素」は、アミノ酸レベルおよび核酸レベルで、それぞれの機能的酵素に対する必須配列相同性が一切ない遺伝子またはタンパク質を包含しない。対応する反応を触媒することができず、しかも、対応する酵素との必須配列相同性が一切ないタンパク質は、従って、本発明の用語「非機能的酵素」の定義に含まれない。非機能的酵素は、本発明の範囲内で、不活性化酵素または不活性酵素とも称する。

このように、前述した点突然変異、挿入および／または欠失を保有する表１に示した本発明の非機能的酵素は、表１に示す本発明の野生型酵素またはその機能的に同等の部分に対する必須配列相同性を特徴とする。

本発明によれば、実質的な配列相同性とは、一般に、DNA分子またはタンパク質のそれぞれ核酸配列もしくはアミノ酸配列が、表１のタンパク質またはその機能的に同等の部分の核酸配列もしくはアミノ酸配列に対して40％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、また好ましくは70％以上、特に好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上、そして最も好ましくは98％以上同一であることを意味すると理解される。

２つのタンパク質の同一性は、タンパク質それぞれの全長にわたるアミノ酸の同一性であると理解され、具体的には、CLUSTAL法（Higginsら、(1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151）を適用したDNA Star社（米国ウィスコンシン州マディソン郡）によるレーザージーン（Lasergene）ソフトウエアを用いて、比較により計算した同一性であると理解される。

また、CLUSTAL法（Higginsら、(1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151）を適用したDNA Star社（米国ウィスコンシン州マディソン郡）によるレーザージーン（Lasergene）ソフトウエアを用いて、相同性も計算することが可能である。

DNA配列の同一性についても、同様に理解すべきである。

前述した方法は、機能的または非機能的な、フィードバック調節型もしくはフィードバック非依存性の酵素、またはその機能的に同等の部分をコードするDNA配列の発現を増強するのに用いることができる。プロモーターおよび終結配列などの調節配列を含むこのようなベクターの使用は、当業者には周知である。さらに、当業者は、ステップａ）から得たベクターをどのようにしてコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌のような生物に導入できるのか、また、それらのゲノムに組み込むためにはベクターがどのような特性を備えていなければならないのかについても周知である。

コリネバクテリウム・グルタミカムのような生物における酵素含量を、例えば大腸菌などの、別の生物由来の酵素をコードする核酸を導入することによって、増加させる場合、ポリペプチド配列を、遺伝子コードに従って、生物特異的コドン使用頻度のためによく用いられるコドンを主に含む核酸配列に逆翻訳することによって、例えば大腸菌由来の、核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を導入することが推奨される。コドン使用頻度は、該当する生物の他の既知遺伝子のコンピューター評価により決定することができる。

本発明によれば、表１の酵素をコードする核酸の遺伝子発現および活性それぞれの増大はまた、生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌の対応する内在性酵素の発現の操作でもあると理解されたい。これは、例えば、これら酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA配列を改変することにより、達成することができる。このような改変（これにより、これら酵素の発現率の改変、好ましくは上昇が起こる）は、DNA配列の欠失または挿入により達成することができる。

内在性遺伝子のプロモーター配列の改変により、通常、該遺伝子の発現量の改変と、それゆえに細胞または生物中で検出可能な活性の改変も起こる。

さらに、内在性遺伝子の発現の改変および増強は、それぞれ、これら遺伝子のプロモーターと相互作用する調節タンパク質（これは形質転換生物には存在しない）により達成することができる。このような調節タンパク質は、例えばWO 96/06166に記載されているような、DNA結合ドメインと転写活性化ドメインからなるキメラタンパク質でありうる。

内在性遺伝子の活性および含量を増大するために考えられる別の方法は、例えば過剰発現により、内在性遺伝子の転写に関与する転写因子をアップレギュレートさせることである。転写因子の過剰発現の方法は、当業者には周知であり、また、本発明の範囲内に含まれる表１の酵素についても開示されている。

さらに、内在性遺伝子の活性の改変は、内在性遺伝子コピーの標的突然変異誘発により達成することができる。

表１の酵素をコードする内在性遺伝子の改変は、酵素の翻訳後修飾に影響を与えることによっても達成することができる。これは、例えば過剰発現または遺伝子サイレンシングなどの対応する方法を用いて酵素の翻訳後修飾に関与するキナーゼまたはホスファターゼなどの酵素の活性を調節することにより、実施することができる。

別の実施形態では、酵素の効率を向上させたり、あるいは、化合物の生産のフィードバック阻害が阻止されるように酵素のアロステリック制御領域を破壊したりすることができる。同様に、分解酵素を欠失または改変することができるが、それは、表１に示す所望の酵素に対するその分解活性を細胞の生存能を損なわずに低減させるような置換、欠失もしくは付加により行う。いずれの場合も、これら所望のファインケミカルのいずれか１つの全体収率または生産率を高めることができる。

また、表１に示すタンパク質およびヌクレオチド分子のこのような改変が、メチオニン以外のファインケミカル、例えば、システインやグルタチオンのような他の硫黄含有化合物、その他のアミノ酸、ビタミン、補因子、栄養剤、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびトレハロースの生産を高めることも考えられる。いずれの化合物の代謝も、細胞内の他の生合成および分解経路と必然的に絡み合うため、１つの経路における必要な補酵素、中間体もしくは基質が別の経路により供給されたり、制限されたりする可能性がある。従って、表１に示す１以上のタンパク質の活性を調節することにより、メチオニンをもたらす以外の別のファインケミカル生合成または分解経路の生産または活性の効率にも影響を与えることができる。

また、酵素の発現および機能は、別の代謝過程からの化合物の細胞レベルに基づき調節され、また、基本的増殖に必要な分子（例えば、アミノ酸およびヌクレオチド）の細胞レベルは、大規模培養における微生物の生存能に決定的な影響を与えうる。従って、フィードバック阻害にそれ以上応答しないように、あるいは、効率または代謝回転が向上するように、表１のアミノ酸生合成酵素を調節すれば、メチオニン生産の経路を介した代謝フラックスがより高くなるはずである。

表１に示す酵素の量および／または活性を増大または導入するための前述の戦略は限定的なものではない。これらの戦略に加える変更は当業者であれば容易に理解されよう。

また、表１に示す酵素の量もしくは含量および／または活性を低下または抑制または低減するために、各種戦略を利用することもできる。

表１に示す内在性酵素の発現は、例えば、遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現を介して調節することができる。刺激または抑制プロモーター領域に結合するアプタマーに応じて、表１に示す酵素の量、従ってこの場合には酵素の活性、が増強または低減される。

また、酵素自体に特異的に結合して、例えば当該酵素の触媒中心に結合することにより、該酵素の活性を低減するように、アプタマーを設計することもできる。アプタマーの発現は通常、ベクターを用いた過剰発現（前文参照）により達成され、これは、アプタマーの設計および選択と同様、当業者には周知である（Famulokら、（1999）Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36）。

さらに、表１に示す内在性酵素の量および活性の低下は、当業者には周知の各種実験方法を用いて達成することができる。これらの方法は、通常、「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子の減弱」または「遺伝子の破壊」もしくは「遺伝子の排除」という用語で要約される。例えば、内在性遺伝子の発現は、アンチセンス配向で、酵素をコードするDNA配列またはその部分を有する前記ベクターを生物（コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌など）に導入することにより、サイレンシングすることができる。これは、このようなベクターの転写がRNAをもたらし、このRNAは、内在性遺伝子により転写されたmRNAとハイブリダイズすることができ、従って、その翻訳を阻止するということに基づいている。

アンチセンス配向でクローン化した核酸と機能的に連結された調節配列で、しかも、様々な細胞型におけるアンチセンスRNA分子の連続的発現を指令する調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、を選択してもよいし、あるいは、アンチセンスRNAの構成的または組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指令する調節配列を選択してもよい。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で生産される、組換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒ウイルスの形態でよく、その活性はベクターが導入された細胞型によって決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節について詳しくは、Weintraub, H.ら、Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol.1 (1), 1986を参照されたい。

原理的に、アンチセンス戦略はリボザイム法と組み合わせることができる。リボザイムは、触媒活性のあるRNA配列であり、これをアンチセンス配列と結合させると、標的配列を触媒的に切断する（Tannerら、（1999）FEMS Microbiol Rev. 23(3), 257-75）。これにより、アンチセンス戦略の効率を高めることができる。

植物では、遺伝子サイレンシングは、RNA干渉、または共抑制として知られる方法により達成することができる。

さらに別の方法は、RNA／DNAオリゴヌクレオチドを生物に導入する（Zhuら、(2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558）か、または相同組換えを用いてノックアウト突然変異体を作製する（Hohnら、(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8321-8323.）ことにより、内在性遺伝子にナンセンス突然変異を導入するものである。

相同組換え体の微生物を作製するためには、表１の酵素をコードする遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを作製するが、このベクターには、内在性遺伝子を改変する（例えば、機能的に破壊する）ように欠失、付加もしくは置換が導入されている。

好ましくは、上記内在性遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌遺伝子であるが、近縁の細菌からの相同体、あるいは、酵母もしくは植物由来の相同体であってもよい。一実施形態では、ベクターは、相同組換え時に、内在性遺伝子が機能的に破壊される、すなわち、該遺伝子が機能的タンパク質をもはやコードしなくなるように設計され、これは、「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる。この他に、相同組換え時に内在性遺伝子が突然変異する、あるいはまた、改変されるが、依然として機能的タンパク質をコードするように前記ベクターを設計することもできる（例えば、上流調節領域を改変することにより、表１の内在性酵素の発現を改変することができる）。相同組換えベクターの場合、内在性遺伝子の改変部分をその5’および3’末端で、内在性遺伝子のさらに別の核酸にフランキングさせることにより、ベクターが保有する外因性遺伝子と、（微）生物の内在性遺伝子との間に相同組換えを起こすことができる。別のフランキング内在性核酸は、内在性遺伝子との相同組換えを達成するのに十分な長さである。典型的には、数百塩基から数千塩基のフランキングDNA（5’末端と3’末端の両方）がベクターに含まれる（相同組換えベクターについて詳しくは、例えば、Thomas, K.R.およびCapecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503ならびにSchaeferら、Gene. 1994 145:69-73を参照）。

ベクターを微生物に導入し（例えば、エレクトロポレーションによる）、導入された内在性遺伝子が表１の内在性酵素と相同的に組み換えられている細胞を、当分野で周知の方法を用いて、選択する。

別の実施形態では、宿主細胞における表１の酵素の内在性遺伝子を破壊する（例えば、相同組換え、または当分野で周知の他の遺伝的手段による）ことにより、そのタンパク質産物の発現が起こらないようにする。別の実施形態では、宿主細胞における表１の酵素の内在性遺伝子または導入遺伝子が１以上の点突然変異、欠失、もしくは逆位により改変されているが、この遺伝子は、依然として機能的酵素をコードする。さらに別の実施形態では、（微）生物における表１の酵素の内在性遺伝子の１以上の調節領域（例えば、プロモーター、リプレッサー、もしくはインデューサー）が改変されており（例えば、欠失、トランケーション、逆位、もしくは点突然変異による）、その結果内在性遺伝子の発現が調節される。当業者であれば、表１の酵素とタンパク質の改変をコードする２以上の遺伝子を含む宿主細胞は、本発明の方法を用いて容易に作製することができ、本発明の範囲に含まれることが理解されよう。

さらに、遺伝子抑制（しかし、遺伝子過剰発現も）はまた、特定のDNA結合因子（例えば、亜鉛フィンガー転写因子型の因子）によっても可能である。さらに、標的タンパク質自体を阻害する因子を細胞に導入することができる。タンパク質結合因子は、例えば、前述したアプタマーでもよい（Famulokら、(1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36）。

別のタンパク質結合因子（生物においてこれを発現させると、表１に示す酵素の量および／または活性の低減が起こる）を酵素特異的抗体から選択することもできる。モノクローナル、ポリクローナル、もしくは組換え酵素特異的抗体の作製は、標準的プロトコルに従う（Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M.P. Deutscher編）。抗体の発現についても文献から知られている（Fiedlerら、(1997) Immunotechnology 3, 205-216；MaynardおよびGeorgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76）。

上で述べた方法は当業者には周知である。従って、例えば、アンチセンス法に用いられる核酸構築物はどのサイズでなければならないか、また、各核酸配列がどのような相補性、相同性もしくは同一性であるべきかについてもよく知られている。相補性、相同性、および同一性という用語は、当業者には周知である。

本発明の範囲内で、配列相同性および同一性は、それぞれ、一般に、DNA分子またはタンパク質のそれぞれ核酸配列またはアミノ酸配列が、既知DNAまたはRNA分子またはタンパク質のそれぞれ核酸配列またはアミノ酸配列と、40％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、また好ましくは70％以上、特に好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上、そして最も好ましくは98％以上同一であることを意味すると理解される。ここで、相同性および同一性の程度は、それぞれ、コード配列の全長に基づくものである。

用語「相補性」とは、２つの相補的塩基同士の水素結合により、核酸分子が別の核酸分子とハイブリダイズする能力を意味する。当業者であれば、２つの核酸が互いにハイブリダイズできるためには、100％の相補性をもつ必要がないことを知っている。別の核酸配列とハイブリダイズしようとする核酸配列は、他方の核酸配列に対して、40％以上、50％以上、60％以上、好ましくは70％以上、特に好ましくは80％以上、また特に好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上、そして最も好ましくは98％以上または100％相同であるのが好ましい。

核酸分子は、これらが5’から3’の同一の順序で同一のヌクレオチドを有する場合、同一である。

内在性mRNA配列とアンチセンス配列とのハイブリダイゼーションは、典型的には、細胞条件下in vivoで、またはin vitroで行なう。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、特異的なハイブリダイゼーションを確実に実施するのに十分なストリンジェント条件下で、in vivoまたはin vitroで実施する。

ストリンジェントなin vitroハイブリダイゼーション条件は、当業者には周知であり、文献から調べることができる（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press参照）。用語「特異的ハイブリダイゼーション」とは、特定の核酸配列が例えばDNAまたはRNA分子の複雑な混合物の一部であるとき、ある分子がストリンジェントな条件下で該核酸配列と優先的に結合する場合を指す。

従って、用語「ストリンジェントな条件」とは、その条件下で、核酸配列が、標的配列には優先的に結合するが、他の配列には結合しないか、少なくとも有意に少ない程度でしか結合しない条件を意味する。

ストリンジェントな条件は状況に応じて変動する。長い配列ほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定イオン強度および規定pH値で、ハイブリダイゼーション温度が、特定の配列の融解温度（Tm）より約５℃低くなるように選択する。Tmは、標的配列に相補的な分子の50％がその標的配列とハイブリダイズする温度（規定pH値、規定イオン強度および規定核酸濃度での）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、0.01〜1.0Mナトリウムイオン（または別の塩のイオン）の塩濃度と、7.0〜8.3のpH値を含む。温度は、短い分子の場合には30℃以上である（10〜50ヌクレオチドを含む短い分子の場合）。加えて、ストリンジェント条件は、例えばホルムアミドのような、不安定化剤の添加を含んでもよい。典型的なハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーは以下の組成のものである。

プレハイブリダイゼーション液：
0.5％ SDS
5×SSC
50mM NaPO₄、pH6.8
0.1％ピロリン酸ナトリウム
5×デンハルト試薬
100μgサケ精子
ハイブリダイゼーション液：
プレハイブリダイゼーション液
１×10⁶cpm／mLのプローブ（5〜10分、95℃）
20×SSC： 3M NaCl
0.3Mクエン酸ナトリウム
HClでpH７に調整
50×デンハルト試薬： 5ｇのフィコール
5ｇのポリビニルピロリドン
5ｇのウシ血清アルブミン
500mLの蒸留水を添加

ハイブリダイゼーションの典型的手順は以下の通りである：
任意： 65℃の1×SSC/0.1％SDS中でブロットを30分洗浄
プレハイブリダイゼーション： 50〜55℃で２時間以上
ハイブリダイゼーション： 55〜60℃で一晩
洗浄： 05分 2×SSC/0.1％SDS

ハイブリダイゼーション温度
30分 2×SSC/0.1％SDS
ハイブリダイゼーション温度
30分 1×SSC/0.1％SDS
ハイブリダイゼーション温度
45分 0.2×SSC/0.1％SDS 65℃
5分 0.1×SSC 室温

用語「センス」および「アンチセンス」ならびに「アンチセンス配向」は当業者には周知である。さらに、当業者であれば、アンチセンス法に用いようとする核酸分子がどれくらいの長さで、その標的配列に関してどのような相同性または相補性を持つべきかを知っている。

従って、当業者であれば、遺伝子サイレンシング法に用いる核酸分子がどれくらいの長さでなければならないかも知っている。アンチセンスの場合には、100ヌクレオチド、80ヌクレオチド、60ヌクレオチド、40ヌクレオチドおよび20ヌクレオチドの配列長さにわたる相補性で十分であろう。もちろん、これより長いヌクレオチド長であっても十分である。また、前述した方法の併用も考えられる。

本発明によれば、生物において作動性のプロモーターに5’-3’配向で機能的に連結されたDNA配列を用いる場合、一般に、生物の細胞に導入した後で、コード配列の過剰発現を可能にするか、または内在性核酸配列およびそれから発現されるタンパク質の抑制もしくは競合および阻止を引き起こすことができる、ベクターを構築することができる。

特定の酵素の活性は、生物において、その非機能的突然変異体を過剰発現させることにより低減することができる。従って、当該反応を触媒することはできないが、例えば基質または補因子に、結合することができる非機能的突然変異体は、過剰発現により、内在性酵素と競合するため、その反応を阻害することができる。宿主細胞における酵素の量および／または活性を低減するための更なる方法は、当業者には周知である。

本発明の別の態様は、表１の酵素をコードする核酸（もしくはその部分）またはそれらの組合せを含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いる用語「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。

1つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、該ベクターでは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。

特定のベクターは、該ベクターが導入された宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

一般に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられる形態であるため、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」を互換的に用いることもある。しかし、本発明は、同様の機能を果たす発現ベクターの他の形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）も包含するものとする。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における各核酸の発現に適した形態で、表１の酵素をコードする核酸を含みうるが、これは、組換え発現ベクターが、発現させようとする核酸配列に機能的に連結された、１以上の調節配列（これは、発現に用いようとする宿主細胞に基づいて選択する）を含むことを意味する。

組換え発現ベクターに関して、「機能的に連結された」とは、目的とするヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、in vitro転写／翻訳系において、または、ベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞において）、該ヌクレオチド配列が１以上の調節配列に連結されることを意味するものである。用語「調節配列」とは、プロモーター、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、もしくはmRNA二次構造の他のエレメント）を包含するものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）に記載されている。調節配列には、多数のタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、ならびに、特定の宿主細胞でしかヌクレオチド配列の発現を指令しないものが含まれる。好ましい調節配列としては、例えば、cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp- ore PL、sod、ef-tu、groEなどのプロモーターが挙げられ、これらは細菌に用いるのが好ましい。その他の調節配列として、例えば、ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHなどの酵母および真菌由来のプロモーター、CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nosなどの植物由来のプロモーター、あるいは、ユビキチン−またはファセオリン−プロモーターが挙げられる。また、人工プロモーターを用いることも可能である。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要因に左右されうることは理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、表１の酵素をコードする核酸によってコードされたタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）を生産することができる。

原核細胞または真核細胞における表１に示す酵素の発現のために、本発明の組換え発現ベクターを設計することができる。例えば、表１に示す酵素のための遺伝子は、細菌細胞、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌および大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母およびその他の真菌細胞（Romanos, M.A.ら、(1992), Yeast 8: 423-488；van den Hondel, C.A.M.J.J.ら、(1991) in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure編、p. 396-428: Academic Press:サンディエゴ；およびvan den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J.(1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.ら編、p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeを参照）、藻類および多細胞植物細胞（Schmidt, R.およびWillmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.: 583-586を参照）において発現させることができる。好適な宿主細胞については、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）にさらに詳しく記載されている。あるいはまた、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、in vitroで転写・翻訳することができる。

原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合または非融合タンパク質いずれかの発現を指令する構成的または誘導プロモーターを含むベクターを用いて実施する。

融合ベクターは、そこにコードされたタンパク質に（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に、しかしまたＣ末端にも）多数のアミノ酸を付加するか、あるいは、該タンパク質の好適な領域内に融合する。このような融合ベクターは典型的に、以下の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を高める；２）組換えタンパク質の溶解性を高める；３）アフィニティー精製においてリガンドとして働くことにより組換えタンパク質の精製を補助する。往々にして、融合発現ベクターの場合、タンパク質分解切断部位を融合成分と組換えタンパク質との連結部に導入することにより、融合タンパク質の精製後に、融合成分から組換えタンパク質を分離させることができる。このような酵素、およびそれらのコグネイト認識配列として、Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。

典型的融合発現ベクターとして、pQE（Qiagen）、pGEX（Pharmacia Biotech Inc；Smith, D.B.およびJohnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40）、pMAL（New England Biolabs、マサチューセッツ州バーバリー）およびpRIT5（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられ、これらは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、もしくはプロテインＡをそれぞれ融合する。

コリネバクテリウム・グルタミカムのベクターの例は、Handbook of Corynebacterium 2005 Eggeling, L. Bott, M.編、CRC press USAに見出すことができる。

好適な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例として、以下のものが挙げられる：pTrc（Amannら、(1988) Gene 69: 301-315）、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-Bl、egtll、pBdCl、およびpET lld（Studierら、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, カリフォルニア州サンディエゴ (1990) 60-89；およびPouwelsら編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018）。上記pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。上記pET lldベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルスRNAポリメラーゼ（T7gnl）が媒介するT7gnlO-lac融合プロモーターからの転写に基づいて起こる。このウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写制御下でT7gnl遺伝子を保有する常在性Xプロファージから宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により供給される。その他様々な細菌の形質転換のために、適切なベクターを選択することができる。例えば、プラスミドpIJ101、pIJ364、pIJ702およびpIJ361は、ストレプトミセスを形質転換するのに有用であることがわかっているが、プラスミドpUB110、pC194、もしくはpBD214はバチルス属菌種の形質転換に適している。コリネバクテリウムへの遺伝情報の伝達に用いられる数種のプラスミドとして、pHM1519、pBLl、pSA77、もしくはpAJ667（Pouwelsら編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018）が挙げられる。

組換えタンパク質発現を最大限にする一戦略として、組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する能力が欠損した宿主細菌においてタンパク質を発現させるものがある（Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ (1990) 119-128）。別の戦略は、発現ベクターに挿入しようとする核酸の核酸配列を改変して、各アミノ酸のための個々のコドンが、発現のために選択した細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて優先的に用いられるコドンとなるようにするものである（Wadaら、(1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118）。本発明の核酸配列のこのような改変は、標準的DNA合成技術により実施することができる。

別の実施形態では、タンパク質発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエでの発現のためのベクターの例として、以下のものが挙げられる：pYepSecl（Baldariら、(1987) Embo J. 6: 229-234）、2i、pAG-1、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa（KurjanおよびHerskowitz, (1982) Cell 30: 933-943）、pJRY88（Schultzら、(1987) Gene 54: 113-123）、ならびにpYES2（Invitrogen Corporation、カリフォルニア州サンディエゴ）。糸状菌のような他の真菌で用いるのに適したベクターおよびベクターの構築方法としては、下記文献に詳述されているものが挙げられる：van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdyら編、p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge、ならびにPouwelsら編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018)。

本発明において、機能的連結とは、コード配列を発現させるとき、調節エレメントの各々が、その決定に従って、その機能を果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター、場合により更なる調節エレメントの連続配置であると理解されたい。

別の実施形態では、単細胞植物細胞（例えば、藻類）、またはより高等の植物（例えば、作物植物などの種子植物）由来の植物細胞において表１のタンパク質を発現させてもよい。植物発現ベクターの例として、Becker, D., Kemper, E., Schell, J.およびMasterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197；およびBevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721に詳述されているもの、ならびにpLGV23、pGHlac+、pBINl9、pAK2004、およびpDH51（Pouwelsら編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018）が挙げられる。

原核および真核細胞の両方に好適な他の発現系については、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第３版、Cold Spring Harbor Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003の第16章および第17章を参照されたい。

本発明が意味する「機能的連結」とは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、場合により更なる調節エレメント、の連続配置であって、コード配列を発現させるとき、調節エレメントの各々が、その決定に従って、その機能を果たすことができるような配置であると理解されたい。

別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において、例えば植物細胞において、優先的に核酸の発現を指令することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを用いて核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは当分野では周知である。

本発明の別の形態は、本発明の組換え発現ベクターが導入された生物または宿主細胞に関する。本明細書において用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は互換的に用いられる。このような用語が、特定の対象細胞だけを指すのではなく、このような細胞の子孫または考えられる後代をも指すことは理解されよう。特定の改変が、突然変異または環境の影響のいずれかにより継続的世代に起こる可能性があるため、このような子孫は、実際に親細胞と同一ではないこともあるが、やはり本明細書で用いる当該用語の範囲内に含まれる。

宿主細胞はどのような原核または真核細胞であってもよい。例えば、表１の酵素は、コリネバクテリウム・グルタミカムもしくは大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または植物などに発現させることができる。その他の好適な宿主細胞は、当業者には周知である。

ベクターDNAは、通常の形質転換またはトランスフェクション技術により、原核または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる用語「形質転換」および「トランスフェクション」、「コンジュゲーション」および「形質導入」は、外来核酸（例えば、線状DNAまたはRNA、例えば、線状化ベクター、もしくはベクターなしの遺伝子構築物のみ）またはベクターの形態の核酸（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、トランスポゾンもしくは他のDNA）を宿主細胞に導入するための、当分野で理解された各種技術を意味し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然のコンピテンス、化学薬品媒介による遺伝子導入、もしくはエレクトロポレーションなどが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする好適な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第３版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003）に見出すことができる。コリネバクテリウム・グルタミカムのベクターの例は、Handbook of Corynebacterium（Eggeling, L. Bott, M.編、CRC press USA 2005）およびその他の実験マニュアルに記載されている。

本明細書で用いる「キャンベルイン」（Campbell in）とは、単一の相同組換え事象（クロスイン事象）により、環状二本鎖DNA分子（例えば、プラスミド）全体を染色体に組み込みんだ、オリジナルの宿主細胞の形質転換体を意味するが、これによって、上記環状DNA分子の第１DNA配列に相同的な染色体の第１DNA配列に、該環状DNA分子の線状化形態が有効に挿入される。この名称は、この種の組換えを最初に提案したアラン・キャンベル（Alan Campbell）博士にちなんで付けられたものである。「キャンベルドイン」（Campbelled in）とは、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれた線状化DNA配列を意味する。「キャンベルイン」は、第１相同DNA配列の複製を含み、各々のコピーが相同組換え交差点のコピーを含み、これを取り囲んでいる。

本明細書で用いる「キャンベルアウト」（Campbell out）は、「キャンベルイン」形質転換体からの子孫細胞を意味し、この細胞では、「キャンベルドイン」DNAの挿入された線状化DNAに含まれる第２DNA配列と、染色体由来の第２DNA配列（上記線状化挿入片の第２DNA配列に相同である）との間に、第２相同組換え事象（クロスアウト事象）が起こっている。この第２組換え事象によって、組み込まれたDNA配列の一部の欠失（放棄：jettisoning）が起こるが、重要なことには、これによって、組み込まれた「キャンベルドイン」DNAの一部（これは、単一の塩基ほどの小さいサイズでありうる）が染色体に残るため、もとの宿主細胞と比較して、「キャンベルアウト」細胞は、染色体に１以上の意図的変化を含むことになる（例えば、単一塩基置換、多塩基置換、異種遺伝子またはDNA配列の挿入、相同遺伝子または改変された相同遺伝子の追加のコピーの挿入、あるいは、前述した例の２以上を含むDNA配列の挿入）。

「キャンベルアウト」細胞または株は、通常、しかし必ずとは限らないが、「キャンベルドイン」DNA配列の一部（放棄しようとする部分）に含まれる遺伝子（例えば、約５％〜10％スクロースの存在下で増殖させた細胞において発現されると致死的である、枯草菌sacB遺伝子）に対する対抗選択（counter-selection）により得られる。対抗選択を用いてまたは用いないで、所望の「キャンベルアウト」細胞は、以下に挙げるがこれらに限らないいずれかのスクリーニング可能な表現型を用いて、所望の細胞をスクリーニングすることにより取得または識別することができる：コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の有無、ポリメラーゼ連鎖反応による所与DNA配列の有無、栄養要求性の有無、酵素の有無、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなど。

また、用語「キャンベルイン」および「キャンベルアウト」は、前記方法または工程を意味するために、様々な時制での動詞として用いることもできる。

「キャンベルイン」または「キャンベルアウト」をもたらす相同組換え事象は、相同DNA配列内のDNA塩基のある範囲にわたって起こりうることがわかっており、相同配列は、この範囲の少なくとも一部について互いに同一になるため、通常、どこで交差事象が起こったかを厳密に特定することはできない。言い換えれば、どの配列が挿入DNAに由来するのか、また、どれが染色体DNAに本来由来するものなのかを正確に特定することはできない。さらに、第１相同DNA配列と第２相同DNA配列は、通常、部分的非相同性の領域によって分離されており、「キャンベルアウト」細胞の染色体に付着したまま残っているのは、非相同性のこの領域である。

実際には、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、典型的な第１および第２相同DNA配列は、通常、長さが少なくとも約200塩基対であり、数千塩基対までの長さでありうる。しかし、これより短いまたは長い配列を用いて実施するために、前記手順を改変することもできる。例えば、第１および第２相同配列の長さは、約500〜2,000塩基の範囲にあり、第１および第２相同配列をほぼ同じ長さに構成することにより、好ましくは両者の差を200塩基対以下とすることにより、また、最も好ましくは２つのうち短い方が長い方の長さの少なくとも70％であるようにすることにより、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」の取得が容易になる。

これらの組込み体を識別および選択するためには、一般に、目的の遺伝子と一緒に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーとして、薬物に対する耐性を賦与するもの、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、G418、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、表１の酵素をコードするのと同じベクターで宿主細胞に導入することもできるし、別のベクターで導入することもできる。導入した核酸で安定にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）により識別することができる。

別の実施形態では、選択および／または導入された遺伝子の発現を増強することができる系を含む組換え微生物を作製することができる。コリネバクテリウム・グルタミカムのような高GC生物における遺伝子発現の改変および増強の例については、WO 2005/059144、WO 2005/059143およびWO 2005/059093に記載されている。

別の実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする、選択された系を含む組換え微生物を作製することができる。例えば、表１の遺伝子を、lacオペロンの制御下にそれを置くベクターに挿入することにより、IPTGの存在下でのみ、該遺伝子の発現が可能になる。このような制御系は当分野では周知である。

一実施形態では、本方法は、本発明の生物（この生物には、例えば表１の酵素をコードする組換え発現ベクターが導入されているか、またはそのゲノムに、野生型または改変型酵素をコードする遺伝子が導入されている）をメチオニン生産のための好適な培地で培養することを含む。別の実施形態では、本方法はさらに、培地または宿主細胞からメチオニンを単離することを含む。

メチオニンの合成効率がより高い生物を作製するように生物の代謝フラックスを改変するために、酵素の量および／または活性を変えることは、表１に挙げた酵素に限定されない。表１の酵素と相同で、かつ別の生物において同じ機能を果たす酵素はどれも、過剰発現により代謝フラックスに影響を与えるために、その量および／または活性を調節するのに極めて適していると考えられる。相同性および同一性の定義は前述の通りである。

当業者は、コリネバクテリウム・グルタミカムおよび大腸菌のような一般的微生物の培養について熟知している。従って、以下にコリネバクテリウム・グルタミカムの培養について概略的に説明することにする。大腸菌の培養についての標準的テキストから、対応する情報を取得することができる。

大腸菌株は、MBおよびLBブロス中でそれぞれ、通常どおりに増殖させる（Follettie, M.T., Peoples, O., Agoropoulou, C.およびSinskey, A J. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103）。大腸菌用の最少培地は、M9および改変MCGC （Yoshihama, M., Higashiro, K., Rao, E.A., Akedo, M., Shanabruch, W G., Follettie, M.T., Walker, G.C.およびSinskey, A.J. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507）である。グルコースを最終濃度１％で添加してもよい。下記量（mg／ml）の抗生物質を添加してもよい：アンピシリン、50；カナマイシン、25；ナリジクス酸、25。また、下記量のアミノ酸、ビタミン、およびその他の栄養補助剤を添加してもよい：メチオニン、9.3mM；アルギニン、9.3mM；ヒスチジン、9.3mM；チアミン、0.05mM。大腸菌細胞は37℃で通常どおり培養する。

遺伝子改変型コリネバクテリアは、典型的には、合成または天然の増殖培地で培養する。コリネバクテリア用の増殖培地は、様々なものが多数知られており、また、容易に入手可能である（Liebら、(1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210；von der Ostenら、(1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16；ドイツ国特許第4,120,867号；Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, 第II巻, Balows, A.ら編、Springer-Verlag）。コリネバクテリウム・グルタミカムのベクターの例は、Handbook of Corynebacterium（Eggeling, L. Bott, M.編、CRC press USA 2005）に記載されている。

これらの培地は、１種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび微量元素から構成される。好ましい炭素源は、単糖、二糖もしくは多糖のような糖である。非常に好適な炭素源として、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンもしくはセルロースを用いることができる。

また、糖精製から得られる糖蜜またはその他の副産物などの複雑な化合物を介して、培地に糖を供給することも可能である。様々な炭素源の混合物を供給するのが有利なこともある。これ以外に考えられる炭素源はアルコールおよび有機酸、例えばメタノール、エタノール、酢酸もしくは乳酸である。窒素源は、通常、有機または無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例として、アンモニアガスまたはアンモニア塩、例えばNH₄Clもしくは(NH₄)₂SO₄、NH₄OH、硝酸塩、尿素、アミノ酸、あるいは、複合窒素源、例えば、トウモロコシ浸漬液、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母エキス、肉エキスなどが挙げられる。

様々な硫黄源を用いて、メチオニンの過剰生産が可能である。硫酸、チオ硫酸、亜硫酸、さらには、H₂Sや硫化物および誘導体のような低硫黄源を用いることができる。また、有機硫黄源、例えばメチルメルカプタン、チオグリコール酸、チオシアン酸、チオ尿素、硫黄含有アミノ酸、例えばシステイン、ならびに、その他の硫黄含有化合物を用いて、効率的なメチオニン生産を達成することができる。ギ酸および／またはメタンチオールも、その他のC1源、例えば、ホルムアルデヒド、メタノールおよびジメチル−ジスルフィドと同様、栄養補助剤として用いることが可能である。

培地に添加することができる無機塩化合物として、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩もしくは硫酸塩が挙げられる。キレート化合物を培地に添加することにより、金属イオンを溶液状に維持することができる。特に有用なキレート化合物として、カテコールまたはプロトカテク酸のようなジヒドロキシフェノール、あるいはクエン酸のような有機酸が挙げられる。培地は、ビタミンまたは増殖促進剤など、他の増殖因子も含有するのが一般的であり、その例として、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが挙げられる。増殖因子および塩類は、酵母エキス、糖蜜、トウモロコシ浸漬液などの複雑な培地成分に由来するものが多い。培地化合物の正確な組成は、実際の実験に大きく左右され、具体的ケースごとに個別に決定される。培地最適化に関する情報は、資料"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach（編集：P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）から取得することができる。また、供給業者からの増殖培地を選択することも可能であり、例えば、スタンダード１（merck）またはBHI（ブレインハートインフュージョン（brain heart infusion）、DIFCO）などがある。

培地成分はすべて、加熱（1.5バール、121℃で20分）により、または滅菌ろ過により滅菌すべきである。培地成分の滅菌は、一緒にまとめて実施してもよいし、必要であれば個別に実施してもよい。

増殖の開始時に全培地成分を存在させてもよいし、また、随意に、これらを連続的またはバッチ方式で添加してもよい。培養条件は、実験ごとに個別に決定する。

温度は15℃と45℃の範囲内でなければならない。実験中、温度は一定に維持しても、変化させてもよい。培地のpHは５〜8.5の範囲、好ましくは7.0前後でよく、培地にバッファーを添加することにより維持することができる。この目的で用いるバッファーの例として、リン酸カリウムバッファーが挙げられる。MOPS、HEPES、ACESなどの合成バッファーを交互に、もしくは同時に用いることができる。また、増殖中、NaOHまたはNH₄OHの添加により一定の培養pHを維持することも可能である。酵母エキスのような複合培地成分を用いる場合には、多数の複合化合物が高いバッファー能力を有するため、バッファーをさらに添加する必要が少なくなると考えられる。微生物を培養するのに発酵槽を用いる場合には、気体アンモニアを用いて、pHを調節することもできる。

インキュベーション時間は、通常、数時間から数日の範囲である。この時間は、最大量の産物がブロス中に蓄積するように選択する。開示した増殖実験は、様々なサイズの各種容器、例えば、マイクロプレート、ガラス管、ガラスフラスコまたはガラスもしくは金属発酵槽において実施することができる。多数のクローンをスクリーニングするためは、バッフルを備えた（またはバッフルなしの）マイクロプレート、ガラス管もしくは振盪フラスコにおいて微生物を培養すべきである。好ましくは、100mL振盪フラスコを用い、必要な増殖培地の10％（体積基準）を充填する。100〜300rpmの速度範囲を用いて、回転振盪機（増幅25mm）でフラスコを振盪させる。加湿雰囲気の維持により、蒸発減量を少なくすることができる；あるいは、蒸発減量の算術的補正を実施すべきである。

遺伝子改変型クローンを試験する場合には、非改変型対照クローン、つまり挿入片を含まない基本プラスミドを含有する対照クローンも試験すべきである。30℃でインキュベートしておいた寒天プレート、例えばCMプレート（10g/Lグルコース、2.5 g/L NaCl、２g/L尿素、10g/Lポリペプトン、５g/L酵母エキス、５g/L肉エキス、22g/L寒天、2M NaOHでpH6.8）で増殖させた細胞を用いて、培地に0.5〜1.5のOD600で接種する。

培地の接種は、CMプレートから得られたコリネバクテリウム・グルタミカム細胞の塩水懸濁物を導入するか、またはこの細菌の液体前培養物を添加するかのいずれかにより、達成する。

本発明は、コリネバクテリウム・グルタミカムおよびL-メチオニンの生産に関して記載してきたが、本発明が他の微生物および他のアミノ酸の生産にも適用できることに留意すべきである。

加えて、「含む」は、他の要素またはステップのいずれも排除しないこと、また、「１（つ）」は複数を排除しないことにも留意すべきである。さらに、前記実施形態の１つに関して説明した特徴またはステップは、それ以外の前記実施形態の他の特徴またはステップと組み合わせて用いてもよいことに留意すべきである。

以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例が制限的なものと解釈すべきではない。本明細書を通じて引用したすべての参照文献、特許出願、特許、公開特許出願、表、付録および配列の内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。

細菌株
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国バージニア州マナッサス）からコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032（野生型）を取得した。ノックアウト突然変異体を以下のように作製した：
コリネバクテリウム・グルタミカムM1840は野生型ATCC 13032に由来するΔMcbR株であった（Reyら、2003、前掲参照）。ATCC 13032をプラスミドpH430（配列番号１）で形質転換した後、「キャンベルドイン」して「キャンベルイン」株を取得した。次に、「キャンベルイン」株を「キャンベルドアウト」すると、McbR遺伝子の欠失を含む「キャンベルアウト」株M1840が得られた。

コリネバクテリウム・グルタミカムM1840をプラスミドpH238（配列番号２）で形質転換した後、「キャンベルドイン」して「キャンベルイン」株を取得した。次に、「キャンベルイン」株を「キャンベルドアウト」すると、ホモセリンデヒドロゲナーゼおよびホモセリンキナーゼ遺伝子の欠失を含む「キャンベルアウト」株M1840 Δhom, Δhskが得られた。

コリネバクテリウム・グルタミカムM1840をプラスミドp（配列番号３）で形質転換した後、「キャンベルドイン」して「キャンベルイン」株を取得した。次に、「キャンベルイン」株を「キャンベルドアウト」すると、MctB遺伝子の欠失を含む「キャンベルアウト」株M1840 ΔmetBが得られた。この株では、測定可能なシスタチオニンγ−シンターゼが観察されなかった。

化学薬品
カザアミノ酸、ビーフエキス、ポリペプトンおよび酵母エキスはDifco（米国デトロイト）から入手したものである。その他の化学薬品はすべて分析用のもので、Gruessing（ドイツ、Filsum）、Acros Organics （ベルギー、Geel）、Merck（ドイツ、Darmstadt）、Aldrich（ドイツ、Steinheim）、ならびにFluka（スイス、Buchs）から購入した。トレーサー基質である99％[¹³C₆]グルコースおよび98％[¹³C₄]トレオニンはCambrige Isotopes Inc.（米国マサチューセッツ州アンドーバ）から入手した。99％[¹⁵N]硫酸アンモニウムはCampro Scientific（オランダ、Veenendaal）から購入した。[³⁴S]硫酸は、BASF AG（ドイツ、Ludwigshafen）から親切にも提供された。

培地および増殖条件
接種用の細胞は、10.00g/Lのグルコース、2.50g/LのNaCl、2.00g/Lの尿素、5.00g/Lの酵母エキス、5.0g/Lのビーフエキス、5.0g/Lのポリペプトン、20.0g/Lのカザアミノ酸および20.0g/Lの寒天（プレート用）を含むリッチ培地で増殖させた。30℃で細胞をプレートに維持した。25mLのリッチ液体培地を含む250mLバッフル付き振盪フラスコ中で、前培養物を一晩増殖させた。遠心分離（２分、10,000ｇ、４℃）により細胞を回収し、0.9％NaClで２回洗浄した後、最少培地での第２前培養物としての接種に用いた。第２前培養物を前述のように回収し、主培養（最少培地で実施）の接種菌として用いた。最少培地は以下のように構成した：40.00g/Lのグルコース、1.00g/LのK₂HPO₄、1.00g/LのKH₂PO₄、42.00g/LのMOPS、54.00g/LのACES、20.00g/Lの(NH₄)₂SO₄、0.30g/Lの3,4-ジヒドロキシ安息香酸、0.01g/LのCaCl₂、0.25g/LのMgSO₄*7H₂O、0.01g/LのFeSO₄*7H₂O、0.01g/LのMnSO₄*H₂O、0.002g/LのZnSO₄*7H₂O、0.2mg/LのCuSO₄*5H₂O、0.02mg/LのNiC1₂*6H₂O、0.02mg/LのNa₂MoO₄*2H₂O、0.1mg/Lのシアノコバラミン、0.3mg/Lのチアミン、0.004mg/Lのリン酸ピリドキサル、0.1mg/Lのビオチン。栄養要求性突然変異体M1840 H238の培養、ならびにメチオニン生合成経路の特徴付けのために、10mMのトレオニン、ホモセリン、メチオニン、シスタチオニンおよびホモシステインをそれぞれ補充した。トレーサー実験は、50mLバッフル付き振盪フラスコ中の５mL培養物において、250rpmの回転振盪機（振盪半径2.5cm）上で30℃にて実施した。後期指数増殖期で細胞を回収した。その他の実験は、回転振盪機（250rpm、30℃、振盪半径2.5cm）上の500mLバッフル付き振盪フラスコに入れた50mL培地中で実施した。

メタボローム（Metabolome）
以前記載されている（Kromerら、2004）ように細胞内代謝物を抽出した。洗浄（H₂O）したバイオマスを48時間加水分解した（105℃、6N HCl）。加水分解産物を中和した（6N NaOH）。GC／MS分析のために、サンプル（400μLの抽出物または50μLの加水分解産物）を凍結乾燥し、50μLの溶剤（ジメチルホルムアミド中0.1％ピリジン）に再懸濁させ、最後に、50μLのN-メチル（tert-ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（MBDSTFA）を用いて80℃で１時間誘導体化した。以前記載されている（Wittmann, C.ら、Anal Biochem 2002, 3072, 379-82）ように、GC／MSで標識(labeling)分析を実施した。プロリンを除くすべてのタンパク質生成アミノ酸およびメチオニン代謝の中間体（ホモシステイン、ホモセリン、O-アセチルホモセリンおよびシスタチオニンを含む）を、他所で記載されている（Kroemerら、Anal Biochem. 2005;340:171-3）ようにHPLCで定量した。ホモランチオニンの定量は、シスタチオニン較正係数を用いてHPLCで実施した。

酵素の過剰発現および精製
コリネバクテリウム・グルタミカムのMetBおよびMetCをベクターpQE30（Qiagen）にクローン化した。このベクターでの発現は、発現タンパク質のＮ末端へのHisタグの付加を含む。大腸菌をプラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性（100μg/mL）により選択した。形質転換した大腸菌をテリフィック（terrific）ブロス（Losenら、Biotechnol Prog 2004, 204, 1062-8）で培養し（100μg/mLのアンピシリン、37℃、230rpm）、１mMイソプロピルチオガラクトシド（最終濃度）の添加により光学密度１（600nm）で誘導した。16時間の誘導増殖後、遠心分離（4225ｇ、15分、２℃）により細胞を回収し、洗浄した後、リン酸バッファー（100mM、100μMピリドキサルリン酸、１mg/mL DNAse I、pH7.4、4℃）中に再懸濁し、音波処理（５×15秒、20ミクロン）により抽出した。遠心分離（30分、２℃および20,000ｇ）により細胞破片から粗抽出物を分離した。0.5M NaClを含む0.02Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）で平衡化したHiTrapキレートニッケル−セファロースカラム（５mL、Amercham）を備えたAKTA精製装置900（Amersham Biosciences、英国リトルチァルフォント）でのアフィニティークロマトグラフィーにより、組換えMetBおよびMetCを最終的に精製した。タンパク質をカラムにアプライした後、10容量の0.02Mリン酸ナトリウムバッファーで洗浄した。0.5M NaClと0.5Mイミダゾールを含む0.02Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）を用いた直線勾配で溶離を実施した。タンパク質を含む画分をSDS-PAGEで純度について確認した後、一緒にプールした。限外ろ過によりタンパク質からイミダゾールを分離した。

MetBおよびMetCのin vitroアッセイ
MetBおよびMetCの活性を光度計（Heliosα、Thermo Electronic、ドイツ、Dreieich）により追跡した。エルマン試薬（412nmで励起）（EllmanおよびLysko、1979）を用いて、遊離SH基の増減により酵素活性を測定した。アッセイ混合物は、MetBアッセイについては1.25mMシステインまたはホモシステインと３mM O-アセチルホモセリンを含み、また、MetCアッセイについては1.25mMシスタチオニンまたは約1.25mMホモランチオニンを含んでいた。ホモランチオニンは市販のものが入手できなかった。そのため、MetCアッセイは、MetBアッセイの産物を用いて実施した。MetBは限外ろ過により除去した。従って、これらのアッセイでホモランチオニン濃度を調整することはできなかった。さらに、アッセイ溶液は、リン酸バッファー（100mM、pH7.5）と10μMピリドキシル-5-リン酸、MetBおよびMetCの補因子から成るものであった。アッセイ混合物から65μLのサンプルを抜き出し、任意の時点で935μLの停止液に注入した。停止液は38％エタノールと１mMジチオニトロ安息香酸（DTNB）を含むリン酸バッファー（100mM、pH7.5）から成るものであった。エタノールが酵素活性を停止させ、DTNBはホモシステインまたはシステインとの黄色い複合体を形成した。上記アッセイにより、最大1.5mMまでの遊離SH基の線形結果が得られた。二重逆数Lineweaver-BurkプロットからK_m値を決定した。

表２は、ホモセリン／メチオニンおよびトレオニン栄養要求性コリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbR, Δhom, Δhskにおけるイソロイシン、トレオニンおよびアラニン標識を示す。培養は、自然標識ホモセリンと[U¹³C]-グルコース（99％）および[U¹³C]-トレオニン（98％）上で実施した。タンパク質加水分解産物における異なる質量アイソトポマーの相対存在量を示す。

表３は、他の生物と比較したコリネバクテリウム・グルタミカムのMetCおよびMetBのK_m値を示す。

結果：
McbRノックアウトに対する生理学的応答
コリネバクテリウム・グルタミカムにおける転写調節因子McbRのノックアウトは、細胞の代謝に著しい影響を与える。McbRのノックアウトだけが野生型とは異なるコリネバクテリウム・グルタミカムM1840株は、0.18[h^-1]という低い増殖速度を示した。対照的に、野生型の増殖速度は0.41[h^-1]であった。さらに、バイオマス収率もM1840では顕著に減少した。野生型が0.55ｇ_Biomass ｇ_Glucose ^-1であったのに対し、M1840は0.36ｇ_Biomass ｇ_Glucose ^-1しか生産しなかった。これらの結果から、細胞代謝はMcbRノックアウトに対し極めて感受性が高いことがわかる。指数増殖中に、コリネバクテリウム・グルタミカムM1840は、細胞内ホモシステインおよびシステイン力価の増加を示した。野生型に比べ、細胞内ホモシステイン濃度は0.1から2.9μmol ｇ_CDW ^-1に増加し、システインは0.3から2.8μmol ｇ_CDW ^-1に増加した。これはそれぞれ29倍および9.3倍の増加にあたる。このことから、McbRのノックアウトにより、重要なメチオニン前駆体の蓄積が起こることが明らかになった。しかし、HPLCおよびGC／MSスペクトルは、ホモランチオニン（図１ｂ）として同定することができる別の強いシグナルをも示した。

ホモランチオニンの同定
ホモランチオニン構造は、追加のメチレン基を含む点がシスタチオニンと異なる（図１ｂ）。天然のホモランチオニンでは、両方のα炭素原子がＳ立体配置を有する。ホモランチオニンは、シスタチオニンについて得られたHPLC較正係数を用いて定量した。同質遺伝子の野生型株ATCC13032の1.3μmol ｇ_CDW ^-1と比較して、指数増殖中のコリネバクテリウム・グルタミカムM1840（＝ATCC13032ΔMcbR）における250μmol ｇ_CDW ^-1の蓄積によって、このアミノ酸は、グルタミン酸（325μmol ｇ_CDW ^-1）のほかに、２番目に重要な細胞内アミノ酸となる。標識実験およびGC／MSフラグメントパターンによりホモランチオニンを同定した。[U¹³C]-グルコース、[¹⁵N]-硫酸アンモニウム、[³⁴S]-硫酸を用いたコリネバクテリウム・グルタミカムM1840の個別培養、その後の細胞抽出、およびGC／MSを用いた標識分析により、観測された代謝物の炭素、窒素および硫黄含量はホモランチオニン（C₈N₂S₁）と一致することが確認された。GC／MSにおけるホモランチオニンの観測されたマスフラグメントm（m/z＝692）、m-15（m/z＝677）、m-57（m/z＝635）は、シスタチオニンの対応物より14質量重かった（図３）が、これは、追加のメチレン基が存在することを示している。さらに、ホモシステイン残基の特徴的なフラグメントm/z＝170、m/z＝244およびm/z＝272が、シスタチオニン、ホモシステインおよびメチオニンにも認めることができた。metBをゲノムから欠失させると、得られたM1840ΔMetB株（ATCC13032ΔMcbRΔMetBに対応する）は、分析の検出限界に近い、わずか約0.33μmol ｇ_CDW ^-1のホモランチオニン蓄積しか示さなかった。この観測結果は、metB欠失によって物質ホモランチオニンの生成および／または蓄積が阻止されることを明確に示しており、従って、metBのようなシスタチオニンγ−シンターゼ活性を有する酵素が、メチオニン生産に有害となりうるホモランチオニン蓄積を支持することを証明している。

細胞代謝におけるホモランチオニンの起原
[U¹³C]-グルコースおよび[U¹³C]-トレオニンおよび自然標識ホモセリンと共にコリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbR, Δhom, Δhsk突然変異体を培養することにより、ホモランチオニンはホモセリンに由来することがはっきりとわかった。ホモセリンとまさに同様に、ホモランチオニンの標識は自然標識パターンを示し、これは、グルコースとトレオニンのいずれも、ホモランチオニン合成に必要な前駆体を提供しないことを示している。別の実験で、ホモセリンの代わりに、メチオニン、シスタチオニンもしくはホモシステインを供給すること以外は同じ条件下で前記菌株を培養した。これらの実験から、この菌株が上記基質を用いて増殖できることはわかったが、シスタチオニンでは増殖低下が認められ、これにより、Ruckertら、2003（前掲参照）の知見が確認された。これら３種類の基質を供給しても、ホモランチオニンの有意な蓄積は起こらなかった。これにより、メチオニン経路におけるこの代謝物の蓄積はホモシステイン形成前に位置付けしなければならないことがわかる。逆方向に作用するMetB、MetZもしくはMetCは、ホモランチオニン生成酵素の有望な候補としてみなすことができる。

MetBおよびMetCの単離および特性決定
メチオニン経路におけるホモランチオニン蓄積に関する問題点をさらに解明するために、MetBおよびMetCを大腸菌において過剰発現させ、単離した。単離したタンパク質を酵素アッセイで特性決定した。それらの天然基質であるシステインおよびシスタチオニンに対するK_m値は、それぞれ、他の生物の対応酵素について見出されたものと同じ範囲にある（表３）。システインに対するMetBのK_m値は258μMであるのに対し、ホモシステインに対するK_m値は541μMで、２倍以上であった。コリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbRにおけるホモシステインおよびシステインの細胞内濃度が等しいとすれば、観測されたK_m値から、両方の基質がMetBによりin vivoで用いられていると考えられる。シスタチオンに対するMetCのK_m値は107μMで、これは大腸菌とサルモネラシスタチオニナーゼのK_m値の間にある値である（表３）。純粋なホモランチオニンがないため、この基質に対するK_m値を決定することはできなかった。しかし、4.5mMの大腸菌シスタチオニアーゼの対応する値（表２）から、ホモランチオニンの切断は非常に弱いことがわかった。O-アセチル-ホモセリンおよびシステインまたはホモシステインのそれぞれとのインキュベーションによりMetBをさらに詳しく特性決定した。システイン（図２Ａ）およびホモシステイン（図２Ｂ）の消費を測光により追跡した。さらに、酵素アッセイからのサンプルを０分、80分および205分で抜き取り、HPLCにより分析した。MetBは、システインとO-アセチル-ホモセリンを効果的にシスタチオニンに変換した。これをO-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインと一緒にインキュベートすると、ホモランチオニンを形成した。80分後にアッセイから、限外ろ過によりMetBを除去し、MetCを添加した。MetCの添加により、シスタチオニンの完全な切断が起こり、その結果、ホモシステインが蓄積されたが、これは、測光分析における吸光増加にも表れていた（図２Ａ）。MetCによりホモランチオニンは弱く切断されたにすぎず、これにより、ホモシステインのわずかな増加とホモランチオニン濃度のわずかな減少が起こった。切断は弱すぎて、光度計で追跡できなかった。これは、ホモランチオニンに対するMetCのK_m値が大腸菌におけると同じくらい高い可能性があることを示すものであった。実際、シスタチオニン（40μM）とホモランチオニン（4.5mM）に対する大腸菌のMetCのK_m値（Dwivedi, C.M.ら、Biochemistry 1982, 2113, 3064-9）は、MetCによるホモランチオニンの切断が低速であることを示している。同様の結果がUren（Uren, J.R., Methods Enzymol 1987, 143, 483-6）により見いだされた。興味深いことに、シスタチオニンの切断とホモシステインの蓄積により、ホモランチオニンの少量の蓄積も起こった。これは、MetCがホモランチオニンを形成できることも示している。しかし、最初にMetBを含まなかったO-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインを用いた対照では、MetCを添加したとき、ホモランチオニンが生成されなかった。これは、MetCがこれらの基質を用いてホモランチオニンを生成できないことを示している。シスタチオニンの切断中に蓄積するホモシステインは、シスタチオニン-β-シンターゼ（CysM）反応のためにMetCにより使用されると考えられる。セリンの代わりに、MetCは、O-アセチル-ホモセリンからの不純物としてアッセイ中に存在するホモセリンを使用し、これによりホモランチオニンを生成すると考えられる。O-アセチル-ホモセリンまたはホモシステインを単独で用いた対照アッセイと、O-アセチル-ホモセリンの代わりにホモセリンを用いた対照では、MetBまたはMetCを用いていずれの産物も得られなかった。加えて、MetCによるホモランチオニンの加水分解切断により、ホモシステインの形成だけではなく、シスタチオニン切断から類推して、アンモニアと2-オキソブタン酸も生成されるはずである。後者はイソロイシンの前駆体である。これにより、既知の唯一のイソロイシン源であるトレオニンを回避して、メチオニン生合成からイソロイシン生成への代謝経路がもたらされると考えられる。

イソロイシン代謝への影響
イソロイシンは、C₄-前駆体（トレオニン）とC₃-前駆体（ピルビン酸）から形成される。最終分子において、イソロイシンの２個の炭素原子はピルビン酸に由来する。C₄-前駆体が非標識で、ピルビン酸が標識されていれば、２の質量シフトが認められる。GC／MSで検証したイソロイシンフラグメントは、イソロイシン骨格の炭素２から６を含んでいた。トレオニンとグルコースを十分に標識した場合には、m/z＝200での質量シフトはm+5となるはずである。しかし、ホモセリン由来のC₄がイソロイシンの形成に用いられた場合には、標識ピルビン酸に由来する、m+2のシフトが観測されるはずである。実際、トレオニンとは別の前駆体からのイソロイシン形成がMcbR-ノックアウト株で観察された。コリネバクテリウム・グルタミカムΔMcbR, Δhom, Δhskにおける約13％のタンパク質生成イソロイシンは、自然標識ホモセリン由来の前駆体から形成されたもので、培地に供給された標識トレオニンからではなかった（表３）。これは、イソロイシン（m/z＝200）のm+2質量アイソトポマーの13％存在量として観測された。タンパク質生成トレオニンは、細胞外トレオニンおよびアラニンが細胞外グルコース標識と同じピルビン酸標識を反映したのと同様に標識された。コリネバクテリウム・グルタミカムは、トレオニンとは無関係に、イソロイシンを産生できることが明らかである。別のイソロイシン前駆体は、メチオニン代謝から誘導された2-オキソブタン酸である可能性が極めて高い。通常、この有機酸は、トレオニンアンモニア−リアーゼを介してトレオニンの脱アミノ化によりイソロイシン代謝において形成される。メチオニン代謝には、2-オキソブタン酸を形成することが可能な別の反応がある。メチオニンメタンチオール−リアーゼ（EC 4.4.1.11）、ホモシステイン水素−硫化物−リアーゼ（EC 4.4.1.2）もしくはシスタチオニンシステイン−リアーゼ（EC 4.4.1.1）が、2-オキサブタン酸形成に関与している可能性がある。メチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンのいずれかと同時に、完全に炭素標識したグルコースとトレオニンを突然変異体に供給することにより、これらの可能性を排除した（表２）。さらに、これらの試験では、イソロイシン標識の変化がホモランチオニンの蓄積に関連しており、これは、ホモランチオニンのMetC切断が、トレオニン非依存性イソロイシン合成に関与している可能性が高いことを示している。

コリネバクテリウム・グルタミカムのような微生物におけるL-メチオニン生合成の経路のモデルである。関与する酵素は、MetA（ホモセリントランスアセチラーゼ）、MetB（シスタチオニン-γ-シンターゼ）、MetZ（O-アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ）、MetC（シスタチオニン-β-リアーゼ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）である。 L-ホモランチオニン(S-[(3S)-3-アミノ-3-カルボキシプロピル]-L-ホモシステイン)の構造を示す図である。 MetCアッセイ（図２ａ）およびMetBアッセイ（図２ｂ）の様々な時点で、412nmでの遊離SH基の光度測定のスペクトルを示す図である。80から140分の間にあるｘ軸の破断は、限外ろ過によるMetB分離の時間に等しい。MetCの添加は、グレーの破線の矢印で示してある。HPLCで測定した、対応する基質および産物濃度をそれぞれ表３ａおよび表３ｂに示す。 MBDSTFA誘導体化シスタチオニン（Ａ）およびホモランチオニン（Ｂ）のGC／MS質量スペクトルを示す図である。m/z＝678およびm/z＝672は、それぞれシスタチオニンおよびホモランチオニンのm-シグナルに等しい。特徴的なm-15、m-57およびm-302も14の質量シフトとともに観察することができる。m/z＝170、m/z＝244およびm/z＝272は、両方の分子におけるホモシステイン残基の特徴的なフラグメントである。 プラスミドpH430ΔMcbRを示す図である。 プラスミドpH238Δhom／Δhsdh-hskを示す図である。 プラスミドpSL315を示す図である。

Claims (31)

1. メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、L-メチオニン過剰産生微生物。
2. 野生型微生物と比較して、転写調節タンパク質McbRの含量および／または生物活性が低減した、請求項１に記載の微生物。
3. McbRをコードする遺伝子を破壊した、好ましくは排除した、請求項１または２に記載の微生物。
4. 破壊されたmcbR遺伝子が、機能的McbRタンパク質の発現を阻止する、請求項３に記載の微生物。
5. 野生型微生物と比較して、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）の含量および／または生物活性を低減することにより、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
6. MetBをコードする遺伝子を破壊した、好ましくは排除した、請求項５に記載の微生物。
7. 破壊されたmetB遺伝子が、機能的MetBタンパク質の発現を阻止する、請求項６に記載の微生物。
8. ホモランチオニンをホモシステインに効率的に変換することができるシスタチオニン-β-リアーゼ（MetC）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入することにより、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
9. O-アセチル-ホモセリンおよびシステインをシスタチオンに効率的に変換することができ、かつ、O-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインをホモランチオニンに変換することができない、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入することにより、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物。
10. 野生型微生物と比較して、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）からなる群より選択されるタンパク質の含量および／または生物活性を増大した、請求項１〜９のいずれか１項に記載の微生物。
11. 野生型微生物と比較して、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）の活性を有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を増強および／または過剰発現させた、請求項10に記載の微生物。
12. 前記微生物が、コリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトミセス、サルモネラ、大腸菌、シゲラ、バチルス、セラチアおよびシュードモナスからなる群より選択される、請求項１〜11のいずれか１項に記載の微生物。
13. 前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、または枯草菌である、請求項12に記載の微生物。
14. L-メチオニンの調製方法であって、
    − L-メチオニンを産生し、好ましくは過剰産生し、しかも、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した微生物を培養および／または発酵させるステップ、および
    − L-メチオニンを単離するステップ
    を含む、上記方法。
15. 野生型微生物と比較して、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）の含量および／または生物活性を低減した微生物を培養する、請求項14に記載の方法。
16. MetBをコードする遺伝子を破壊した、好ましくは排除した、微生物を培養する、請求項15に記載の方法。
17. 破壊されたmetB遺伝子が、培養微生物における機能的MetBタンパク質の発現を阻止する、請求項16に記載の方法。
18. 野生型微生物と比較して、転写調節タンパク質McbRの含量および／または生物活性が低減した、微生物を培養する、請求項14〜17のいずれか１項に記載の方法。
19. McbRをコードする遺伝子を破壊した、好ましくは排除した、微生物を培養する、請求項18に記載の方法。
20. 破壊されたmcbR遺伝子が、機能的McbRタンパク質の発現を阻止する、請求項19に記載の方法。
21. ホモランチオニンをホモシステインに効率的に変換することができるシスタチオニン-β-リアーゼ（MetC）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入した、微生物を培養する、請求項14〜20のいずれか１項に記載の方法。
22. O-アセチル-ホモセリンおよびシステインをシスタチオンに効率的に変換することができ、かつ、O-アセチル-ホモセリンおよびホモシステインをホモランチオニンに変換することができない、シスタチオニン-γ-シンターゼ（MetB）突然変異体をコードする異種遺伝子を導入した、微生物を培養する、請求項14〜20のいずれか１項に記載の方法。
23. 野生型微生物と比較して、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）の活性を有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質の含量および／または生物活性を増大した、微生物を培養する、請求項14〜22のいずれか１項に記載の方法。
24. 野生型微生物と比較して、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドロラーゼ（MetZ）、コブ(I)アラミン依存性メチオニンシンターゼI（MetH）およびコブ(I)アラミン非依存性メチオニンシンターゼII（MetE）の活性を有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を増強および／または過剰発現させた、微生物を培養する、請求項23に記載の方法。
25. 前記微生物が、コリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトミセス、サルモネラ、大腸菌、シゲラ、バチルス、セラチアおよびシュードモナスからなる群より選択される、請求項14〜24のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、または枯草菌である、請求項25に記載の方法。
27. 前記微生物の培地または細胞においてL-メチオニンを濃縮する、請求項14〜26のいずれか１項に記載の方法。
28. 発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の調製方法であって、
    − 所望のL-アミノ酸を産生、好ましくは過剰産生し、しかも、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した、微生物を発酵培地で培養および発酵させるステップ、
    − L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去するステップ、
    − 発酵中に形成されたバイオマスの０〜100重量％の量を除去するステップ、および
    − 発酵ブロスを乾燥させることにより、粉末または顆粒形態の動物飼料用添加物を取得するステップ
    を含む、上記方法。
29. 請求項１〜13のいずれか１項に記載の微生物を培養する、請求項28に記載の方法。
30. L-メチオニンの生産のための、メチオニン経路におけるホモランチオニンの生成および／または蓄積を低減および／または阻止した微生物の使用。
31. 前記微生物が請求項１〜13のいずれか１項に記載の微生物である、請求項30に記載の方法。

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