KR101770150B1

KR101770150B1 - 메티오닌 히드록시 유사체 (mha)의 발효 생산

Info

Publication number: KR101770150B1
Application number: KR1020137020093A
Authority: KR
Inventors: 라이너 피게; 완다 디셰르트
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2017-08-23
Also published as: CN103429748A; US20140017740A1; MX2013007656A; EP2658987B1; ES2528495T3; MY159592A; AR084596A1; BR112013016817A2; CN103429748B; EP2658987A1; PL2658987T3; MX342139B; WO2012090022A1; US9023624B2; KR20130135893A; JP5847840B2; JP2014503215A

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 히드록시메티오닌의 발효 생산 방법에 관한 것이다: 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 메티오닌을 생산하도록 변형된 재조합 미생물을 배양, 배양 배지로부터 히드록시메티오닌을 회수.
특정 실시태양에서, 재조합 미생물은 질소 제한의 조건 하에서 배양된다. 본 발명은 또한 생물학적으로 생산된 히드록시메티오닌 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

메티오닌 히드록시 유사체 (MHA)의 발효 생산{FERMENTATIVE PRODUCTION OF METHIONINE HYDROXY ANALOG (MHA)}

본 발명은 필수 아미노산 메티오닌의 유사체 2-히드록시-4-(메틸티오)부티르산 (HMBA)을 발효에 의해 생산하는 방법에 관한 것이다. 발효는 미생물이 보통 화학적으로 합성되는 목적 생성물을 배양 배지에 제공된 탄소, 황 및 질소를 이용하여 생합성하는 생물학적 방법이다.

흔히 "히드록시메티오닌"으로 불리는 2-히드록시-4-(메틸티오)부티르산 (HMBA)은 필수 아미노산 메티오닌의 유사체이며 중요한 사료 첨가제이다. 상용의 옥수수-대두계 사료 중 메티오닌이 제1 제한 아미노산으로 간주되기 때문에 이것은 흔히 가금 식품에서 이용된다.

메티오닌 히드록시 유사체는 아미노기보다는 메티오닌 분자의 α-탄소에 히드록실 라디칼을 함유한다. HMBA는 다음의 화학식을 가진다:

CH₃SCH₂CH₂CH(OH)COOH

아미노산과 다르게 이것은 단백질 합성에서 유기체에 의해 직접적으로 이용되지는 않는데, 그 자체로 이용되기 위해서는 이것이 아미노산으로 동화작용으로(anabolically) 전환되어야 하기 때문이다. HMBA는 순수한 형태로는 이용되지 않고 다양한 형태로 이용된다, 즉:

- HMBA의 칼슘 및 암모늄염 혼합물 (US 2,745,745 및 US 2,938,053),

- 산성 수용액 (US 4,353,924),

- US 3,175,000에 기술된 방법에 의해 수득된 HMBA의 칼슘염.

화학적 경로에 의한 HMBA의 제조는 오랫동안 알려져 왔다. 노부스 인터내셔널(NOVUS International) (PCT/US98/01595), 몬산토 컴퍼니(MONSANTO Company) (EP0142488), 브리티쉬 텔레콤(BRITISH Telecomm) (EP0143000) 또는 론 플랑크 애니멀 뉴트리션 S.A.(Rhone Poulenc Animal Nutrition S.A.) (US 6,180,359)로부터의 몇몇의 특허는 2-단계 방법에 의한 2-히드록시-4-메틸티오-히드록시부티로니트릴(HMBN)의 HBMA로의 가수분해를 기술한다. 모든 이러한 기술은 거의 동일한 원료 및 핵심 중간체에 의존한다.

제1 단계는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴 (HMBN)을 염산 또는 황산과 같은 무기 강산과 접촉하게 하는 것에 있다. 후속 단계에서 물로 희석한 후 더 높은 온도에서 가수분해가 완료된다. 이후 HMBA는 케톤과 같이 물과 매우 혼화성이 아닌 유기 용매로 추출되며, 이후 용매는 전기천공법으로 제거된다.

아미드 2-히드록시-4-메틸티오-부티로니트릴(HMBN)은 메틸-메르캅토-프로피온알데히드(MMP)와 시안화수소산(HCN) 또는 시안화나트륨(NaCN) 사이의 반응에 의해 합성된다.

지난 몇 년 동안, 효소 또는 생물학적 물질과 관련하여 새로운 방법이 나왔다. 예를 들어 아벤티스 애니멀 뉴트리션 S.A.(Aventis Animal Nutrition S.A.)는 2-히드록시-4-메틸티오부티로니트릴 중간체의 효소적 가수분해에 의한 HMBA의 제조 방법을 기술하여 특허를 받았다. 이 발명은 니트릴라제 활성을 가지는 고정화 생물학적 물질과 분자를 접촉시킨 후의 HMBN의 생물전환에 기초한다(US6,180,359). 유사한 방법이 노부스에 의한 2-히드록시-4-(메틸티오)-부탄니트릴의 2-히드록시-4-(메틸티오)-부탄아미드 또는 2-히드록시-4-(메틸티오)-부탄산 또는 염으로의 효소 전환으로 기술된다 (WO1998032872).

미생물에 의한 메티오닌 생산 향상을 위한 노력으로서, 놀랍게도 발명자들은 히드록시메티오닌이 또한 발효 공정에서 단순 탄소원으로부터 미생물 내에서 생산될 수도 있다는 것을 밝혀냈다. 이것이 메티오닌 히드록시 유사체를 완전히 생물학적으로 생산하는 것에 대한 첫 번째 보고이다.

본 발명은 히드록시메티오닌의 발효 생산 방법에 관한 것이며, 다음의 단계를 포함한다:

- 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 메티오닌을 생산하도록 변형된 재조합 미생물을 배양하는 것,

-배양 배지로부터 히드록시메티오닌을 회수하는 것.

발효 생산은 미생물의 증식에 기초하며, 여기서 단순 탄소원 (대개, 당)은 미생물에 의해 그것의 증식 및 목적하는 화합물의 생합성 둘 모두를 위해 이용된다.

본 발명의 상세한 기술

본 발명은 히드록시메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 메티오닌 생산에 최적화된 재조합 미생물은 탄소원, 황원 및 질소원으로부터 히드록시메티오닌을 생산한다.

생성물

"히드록시메티오닌" 또는 "메티오닌 히드록시 유사체" 또는 "MHA" 또는 "2-히드록시-4-(메틸티오)부티르산" 또는 "2-히드록시-4-(메틸티오)부탄산" 또는 "HMTBA" 또는 "HMBA" 또는 "DL-2-히드록시-4-(메틸메르캅토)부탄산"이라는 용어는 발효 생성물을 명시하기 위해 교대로 사용된다.

미생물

본 발명은 히드록시메티오닌의 생산을 위해 메티오닌의 생산에 최적화된 미생물의 사용에 관한 것이다.

"메티오닌의 생산을 위한 미생물" 또는 "메티오닌-생산 미생물" 또는 "메티오닌을 생산하도록 변형된 미생물" 또는 "메티오닌의 생산에 최적화된 미생물"이라는 용어는 그 변형된 미생물이 미생물의 대사에 필요한 것보다 더 많은 메티오닌을 생산할 때, 단지 자신의 내인성 요구를 위해서 메티오닌을 생산하는 비생산 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하는 미생물을 명시한다. 메티오닌 생산에 최적화된 미생물이 당해 분야에 잘 알려져 있으며 특히 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041 및 WO2009/043803에 개시되어 있다.

"재조합 미생물" 또는 "변형된 미생물"이라는 용어는 유전자의 첨가 또는 억제, 또는 일부 유전자의 발현 조절의 변형에 의해 유전자 변형된 미생물을 명시한다.

본 발명에 따라, 재조합 미생물에 의해 생산되는 메티오닌의 양, 특히 메티오닌 수율 (탄소원 그램/몰 당 생산되는 메티오닌 그램/몰의 비율)은 대응하는 변형되지 않은 미생물에 비하여 변형된 미생물에서 더 높다. 보통의 변형은 형질전환 및 재조합에 의한 유전자 결실, 유전자 교체, 및 유전자의 과발현 또는 이종 유전자의 발현을 위한 벡터 도입을 포함한다.

메티오닌 생산에 최적화된 이러한 미생물은 히드록시메티오닌을 동시에 생산할 수 있다. 발명자들은 미생물에 의해 더 많은 메티오닌이 생산된다면, 히드록시메티오닌 역시 더 많이 생산됨을 관찰하였다.

본 발명에서 이용된 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균이다. 바람직하게, 미생물은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 간균과(Bacillaceae), 방선균과(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아과(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 에스처리치아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리아(Corynebacterium)속의 것이다. 훨씬 더 바람직하게는 미생물은 대장균(Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)종이다.

발효

"발효 공정", "배양" 또는 "발효"라는 용어는 단순 탄소원, 황원 및 질소원을 함유하는 적절한 증식 배지상에서의 박테리아의 증식을 나타내기 위해 교대로 사용된다.

본 발명의 발효 공정에서, 탄소원이 다음을 위해 동시에 사용된다:

- 바이오매스 생산: 배지의 그 중에서도 탄소원 전환에 의한 미생물 증식, 및,

- 히드록시메티오닌 및/또는 메티오닌 생산: 바이오매스에 의해 동일 탄소원의 히드록시메티오닌 및/또는 메티오닌으로의 형질전환.

두 단계가 동시에 일어나며 미생물이 이러한 전환을 하게 하는 대사 경로를 포함하기 때문에, 증식을 하도록 미생물에 의해 탄소원을 형질전환하는 것은 배지 중 히드록시메티오닌 및/또는 메티오닌 생산을 야기한다.

발효는 호기성, 미세호기성, 및 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있는 고전적인 공정이다.

발효는 일반적으로 하나 이상의 단순 탄소원, 및 필요하다면 대사산물의 생산을 위한 보조 기질을 함유하는, 이용되는 미생물에 적응된 적절한 배양 배지로 발효조에서 수행된다.

본 발명에서 발효는 유가(fed-batch) 방식으로 이루어진다. 이것은 발효 중에 보충 증식 배지가 가해지지만 배치 끝까지 배양물이 제거되지 않는 (샘플링 및 HPLC/GCMS 분석을 위한 작은 부피는 제외) 발효 유형을 가리킨다. 공정은 주요 두 단계를 포함하며; 첫 번째의 것은 적절한 배치 미네랄 배지 및 유가식 미네랄 배지에서의 일련의 예비배양. 이어서, 목적하는 생산에 따라 상이한 유가식 배지로 배양하기 위해 적절한 최소 배치 배지로 채워진 발효조가 이용된다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 배지의 배양 조건 및 조성을 결정할 수 있다. 특히 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰에 대하여 20 ℃와 55 ℃ 사이, 바람직하게 25 ℃와 40 ℃ 사이, 더욱 바람직하게 약 30 ℃, 그리고 대장균에 대하여 약 37 ℃ 온도에서 발효된다.

대장균에 대한 공지의 배양 배지의 예로써, 배양 배지는 M9 배지 (문헌[Anderson, 1946, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌[Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌[Schaefer et al . (1999, Anal . Biochem. 270: 88-96)]에 의해 정의되는 것과 같은 배지에 동일하거나 유사한 조성을 가질 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 공지의 배양 배지의 예로써, 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌[Liebl et al., 1989, Appl . Microbiol . Biotechnol. 32: 205-210]) 또는 문헌[Riedel et al . (2001, J. Mol . Microbiol . Biotechnol. 3: 573-583)]에 의해 정의되는 것과 같은 배지에 동일하거나 유사한 조성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 "탄소원"이라는 용어는 미생물의 일반 증식을 지지하기 위해 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 사용될 수 있는 임의의 탄소원을 나타내며 이는 글루코스, 갈락토스 또는 락토스와 같은 6탄당; 5탄당; 단당류; 수크로스 (당밀), 셀로비오스 또는 말토스와 같은 이당류; 전분 또는 그 유도체와 같은 올리고당; 헤미셀룰로오스; 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있다. 특히 바람직한 탄소원은 글루코스이다. 다른 바람직한 탄소원은 수크로스이다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 탄소원은 재생가능한 공급원료로부터 얻어진다. 재생가능한 공급원료는 짧은 지연 시간 내에 그것의 목적하는 생성물로의 형질전환을 가능하게 할 만큼 충분한 양으로 재생될 수 있는, 특정 산업 공정에 필요한 원료로 정의된다. 처리되거나 그렇지 않은 식물 바이오매스는 흥미로운 재생가능한 탄소원이다.

탄소원은 발효성이며, 즉, 이것은 미생물에 의한 증식에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 "황원"은 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸술피드 및 다른 메틸-캡핑(capped) 술피드 또는 상이한 공급원들의 조합을 가리킨다. 더욱 우선적으로 배양 배지 중 황원은 술페이트 또는 티오술페이트 또는 이들의 혼합물이다.

배양은 무기 기질, 특히 포스페이트 및/또는 칼륨에 대하여 미생물이 제한되거나 고갈되는 그러한 조건에서 수행될 수 있다. 유기체가 무기 기질 제한을 받도록 하는 것은, 여전히 약한 증식을 하게 하는 공급된 무기 화학물질의 양에 의해 미생물 성장이 지배되는 조건을 정의한다. 무기 기질에 대해 미생물을 고갈시키는 것은 무기 기질의 부재로 인하여 미생물의 증식이 완전히 멈추는 조건을 정의한다.

"질소원"이라는 용어는 암모늄염 또는 암모니아 기체에 상응한다. 질소는 무기 (예를 들어, (NH₄)₂SO₄) 또는 유기 (예를 들어, 요소 또는 글루타메이트) 공급원으로부터 생긴다. 본 발명에서 배양에서의 질소원은 (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)₂S₂O₃ 및 NH₄OH이다.

본 발명의 특정 측면에서 재조합 미생물은 질소 제한 조건 하에서 배양된다. 실제로, 발명자는 질소 제한 조건이 히드록시메티오닌 생산을 증진시킨다는 것을 관찰하였다.

"질소 제한의 조건"이라는 용어는 제한된 질소 농도를 가지는 배양 배지를 가리키며, 여기서 질소는 무기 (예를 들어, (NH₄)₂SO₄) 또는 유기 (예를 들어, 요소 또는 글루타메이트) 공급원으로부터 공급될 수 있고, "질소 고갈의 조건"이라는 용어는 질소원을 전혀 가지지 않은 배지를 가리킨다.

"질소 제한"은 이용가능한 질소원이 박테리아의 증식 속도 및/또는 바이오매스 수율이 제한되도록 하는 양으로 존재하는 것, 즉, 질소원이 최대 증식 속도 및/또는 바이오매스 수율을 지탱하는 데 필요한 양 미만의 양으로 존재하는 것을 의미한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 히드록시메티오닌의 생산을 유도하기에 적합한 질소의 적절한 제한 농도를 결정할 수 있을 것이다. 실제 "질소 제한량"은 특정 배지 및 이용되는 미생물 균주에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 미생물은 많은 질소를 필요로 하는 메티오닌 및 히드록시메티오닌을 생산하는 재조합 박테리아이다. 배지에 적용되는 질소의 양은 이러한 특성에 따른다. 이것은 상이한 질소원의 농도 하에서의 배지 중 박테리아로의 통상적인 실험으로 결정될 수 있다. 또한, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 발효 동안 배지 중의 이용가능한 질소의 농도를 측정하는 이온 크로마토그래피와 같은 방법 및 이에 따라 제한 조건을 결정하기 위한 잔류 질소 농도를 안다.

일반적인 조건에서의 비변형 대장균 균주의 증식이 약 4.2의 C/N 비 (몰/몰)를 요구한다는 것이 알려져 있다 (문헌[Energetics and kinetics in biotechnology. J.A. Roels. Elsevier Science & Technology (May 1983)]).

본 발명의 특정 실시태양에서, 발효는 배양에서 이용되는 상이한 배지가 약 5보다 크고, 바람직하게는 약 10보다 크며 더욱 바람직하게는 약 20보다 크고 가장 바람직하게는 약 20과 약 25 사이의 C/N 몰비에 이르는 일반적인 조건에서 수행된다 (여기서 C/N 비는 각각의 탄수화물 및 질소원에서 원소 탄소와 원소 질소의 몰비로서 측정된다).

본 발명의 바람직한 실시태양에서 생산 공정은 동일한 배양 배치 배지에서 동일한 미생물로의 연속적인 세 단계를 포함한다:

ㆍ발효성 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 재조합 미생물 증식,

ㆍ상기 적절한 배양 배지에서의 질소 제한 조건 하에서 재조합 미생물 배양,

ㆍ배양 배지로부터 히드록시메티오닌 회수.

발효는 미생물 성능 및 배양 동안 생긴 유가식 배지의 조성에 따라 배양 조건이 진화하는 모든 공정 동안 동일한 본래 배치 배지에서 수행된다.

'증식' 단계는 메티오닌의 생산이 시작되는 제한 없는 최소 배지 조건에서 수행된다. 히드록시메티오닌의 생산이 증진되는 '배양' 단계는 질소 제한 조건 하에서 수행된다.

질소 제한은 미생물이 그 분열 및 생산을 위해 배양 배지에 존재하는 거의 모든 질소를 소비하였을 때 발생한다. 미생물이 더 증식하고 메티오닌을 생산할수록 이것은 더 많은 질소를 사용한다. 따라서 질소 제한 조건은 미생물 및 더 정확하게는 그 증식 및 생산 속도의 특성에 의존한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 재조합 미생물의 특정 요구량을 계산하고 예측할 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서 재조합 미생물은 연속적인 두 단계로 생물반응기 시스템에서 배양된다:

a. 발효성 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 약 10시간 내지 20시간, 바람직하게 약 15시간 내지 20시간 동안 미생물 증식,

b. 상기 적절한 배양 배지 중 질소 제한 조건에서 약 10시간 내지 20시간 동안, 바람직하게 약 10시간 내지 15시간 동안 미생물 배양.

앞에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 공정에서 이용되는 재조합 미생물은 탄소원을 메티오닌 및 히드록시메티오닌으로 전환하도록 유전자 변형된다.

유전자 변형

본 발명의 기술에서 유전자 및 단백질은 대장균에서의 상응 유전자의 명칭을 이용하여 확인한다. 그러나, 다르게 명시하지 않는 한, 이러한 명칭의 이용은 본 발명에 따라 더 일반적인 의미를 가지며 다른 유기체 더욱 특히 미생물에서의 모든 상응 유전자 및 단백질을 아우른다.

PFAM (정렬 및 히든 마코브 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스); http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 대형 모음집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 시각화하고, 단백질 도메인을 확인하고, 유기체 사이에서의 분포를 평가하며 다른 데이터베이스에 접근하는 것과 공지의 단백질 구조를 시각화하는 것을 가능하게 한다.

COG (단백질의 오르토로거스(orthologous) 집단의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 38개의 주요 계통학적 계통을 나타내는 66개의 완전히 서열 분석된 게놈들로부터의 단백질 서열을 비교함으로써 얻을 수 있다. 각각의 COG는 셋 이상의 계통으로부터 정의되며, 이는 이전에 보존된 도메인을 확인하게 한다.

상동성 서열 및 이들의 백분율 상동성을 확인하는 수단은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며 특히 BLAST 프로그램을 포함하는데, 이는 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 이 웹사이트에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 이용될 수 있다. 이 때 예를 들어 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)을 이러한 웹사이트에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 이용하여 얻어진 서열을 활용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.

공지의 유전자에 대한 진뱅크(GenBank)에서 주어지는 참조를 이용하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 등가 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 통상적인 작업은 다른 유기체로부터 얻어진 유전자로 서열 정렬을 수행함으로써 결정될 수 있는 공통 서열을 이용하여, 그리고 다른 유기체에서의 상응 유전자를 복제하기 위한 축퇴 프로브를 고안하여 유리하게 이루어진다. 분자 생물학의 이러한 통상적인 방법은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)]에서 주장한다.

본 발명에 따른 "활성 약화"라는 용어는 효소 또는 유전자에 사용될 수 있고 각각의 경우에 상응하는 유전자 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 가리키며 이는 이 때 '약화된' 것으로 한다. 이러한 발현 억제는 유전자 발현의 저해, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전체 또는 일부 결실, 유전자 코딩 영역의 결실, 또는 더 약한 천연 또는 합성 프로모터에 의한 야생형 프로모터의 교환일 수 있다. 우선적으로, 유전자 약화는 본질적으로 그 유전자의 완전한 결실이며, 이는 본 발명에 따른 균주의 확인, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선별 마커 유전자에 의해 교체될 수 있다. 유전자는 우선적으로 상동 재조합 기술에 의해 불활성화된다 (문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645]).

"활성 증진"이라는 용어는 비변형 미생물의 효소 활성보다 우수한 효소 활성을 명시한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 효소의 효소 활성을 측정하는 방법을 알고 있다.

효소 활성을 증진하기 위해 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 여러 가지 수단을 알고 있다: 단백질의 촉매 부위 변형, 단백질의 안정성 증가, 메신저 RNA의 안정성 증가, 단백질 코딩 유전자의 발현 증가.

단백질을 안정화하는 요소(예를 들어, GST 태그(tag), 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences) 뿐만 아니라 메신저 RNA를 안정화하는 요소 (문헌[Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64])가 당해 분야에 알려져 있다.

"증가된 유전자 발현", "증진된 유전자 발현" 또는 "유전자 과발현"이라는 용어는 본문에서 교대로 사용되며 유사한 의미를 가진다.

유전자 발현을 증가하기 위해 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 여러 가지 기술을 알고 있다: 미생물에서의 유전자 카피(copy) 수 증가, 높은 수준의 유전자 발현을 유도하는 프로모터 사용, 유전자의 직접 또는 간접 전사 억제인자의 활성 및/또는 발현 약화.

유전자는 염색체로 또는 염색체 외로 코딩된다. 유전자가 염색체 상에 위치할 때, 몇몇의 유전자 카피가 당해 분야의 전문가에게 공지된 재조합 방법 (유전자 교체 포함)에 의해 염색체에 도입될 수 있다. 유전자가 염색체 외로 위치할 때, 유전자는 그 복제 원점에 관하여 및 이에 따라 세포 내에서의 그 카피 수에 관하여 상이한 여러 가지 유형의 플라스미드에 의해 운반된다. 이러한 플라스미드는 그 플라스미드 성질에 따라 1 내지 5 카피 또는 약 20 카피 또는 500 카피까지 미생물에 존재한다: 타이트한 복제로 카피 수가 낮은 플라스미드 (pSC101, RK2), 카피수가 낮은 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 카피수가 높은 플라스미드 (pSK 블루스크립트(bluescript) II).

본 발명의 특정 실시태양에서 유전자는 강도가 상이한 프로모터를 이용하여 발현된다. 본 발명의 한 실시태양에서 프로모터는 유도성이다. 이러한 프로모터는 상동성 또는 이종성이다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 어떠한 프로모터가 가장 편리한지 알고 있으며, 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac 또는 람다 프로모터 cI가 널리 이용된다.

메티오닌 생합성 경로의 최적화:

미생물에서 메티오닌 생산에 관련된 유전자가 당해 분야에 잘 알려져 있으며 메티오닌 특이적 생합성 경로에 관련된 유전자 뿐만 아니라 전구체 제공 경로에 관련된 유전자 및 메티오닌 소비 경로에 관련된 유전자를 포함한다.

메티오닌의 효율적 생산은 메티오닌 특이적 경로 및 몇몇의 전구체 제공 경로의 최적화를 필요로 한다. 메티오닌 생산 균주가 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술되어 있다. 이러한 출원은 본 출원에 참고로 포함된다.

특허 출원 WO2005/111202는 그 억제제 SAM 및 메티오닌에 대해 피드백 감수성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 대립유전자를 과발현하는 메티오닌 생산 균주를 기술한다(metA*로 불림). 이 출원은 또한 메티오닌 레귤론(regulon)의 하향조절을 담당하는 메티오닌 억제인자 MetJ의 결실과 이러한 대립 유전자들의 조합을 기술한다. 또한, 두 변형과 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제의 과발현 (thrA 유전자에 의해 코딩됨)의 조합이 출원에 기술되어 있다.

메티오닌 생산 개선을 위하여 미생물은 다음을 나타낼 수 있다:

- 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 증가:

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 주변세포질 술페이트 결합 단백질을 코딩하는 cysP,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 술페이트 ABC 전달체의 성분을 코딩하는 cysU,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 막에 결합된 술페이트 전달 단백질을 코딩하는 cysW,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 술페이트 투과 효소를 코딩하는 cysA,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 O-아세틸 세린 술프히드랄라제(sulfhydralase)를 코딩하는 cysM,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 술파이트 환원효소의 알파 및 베타 서브유닛을 각각 코딩하는 cysI 및 cysJ. 바람직하게 cysI 및 cysJ 는 함께 과발현된다.

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 아데닐릴술페이트 환원효소를 코딩하는 cysH,

WO2007/077041에 기술된 바와 같이 세린 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 cysE

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 serB,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC,

WO2005/111202에 기술된 바와 같이 S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대해 피드백 감수성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 대립유전자 (metA*),

WO2009/043803 및 WO2005/111202에 기술된 바와 같이 트레오닌에 대해 피드백 억제가 감소된 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 thrA 또는 thrA 대립유전자 (thrA*),

- 또는 아래의 유전자들 중 하나 이상의 발현 억제:

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykA,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykF,

WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같이 포르밀테트라히드로폴레이트 데포르밀라제를 코딩하는 purU,

WO 2010/020681에 기술된 바와 같이 N-아세틸트렌스퍼라제를 코딩하는 yncA,

WO2005/111202에 기술된 바와 같이 메티오닌 생합성 경로의 억제인자를 코딩하는 metJ,

아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 ybdL.

- 또는 개선된 메티오닌 생산을 일으키는 C1 대사의 증가.

본 발명에 따라 "C1 대사 증가"는 MetF, GcvTHP, Lpd, GlyA, MetE 또는 MetH 중 선택된 C1 대사에 관련된 하나 이상의 효소의 활성 증가에 관한 것이다. 효소 활성 증가를 위해 이러한 상이한 효소의 상응 유전자가 과발현되거나 또는 활성이 개선된 효소를 발현하도록 그 핵산 서열이 변형될 수 있고 또는 피드백 조절에 대한 그 감수성이 감소될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서 메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소 MetF의 활성 및/또는 글리신 절단 복합체 GcvTHP의 활성 및/또는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 GlyA의 활성을 증진함으로써 하나의 탄소 대사가 증가된다.

본 발명의 특정 실시태양에서 MetF의 활성은 metF 유전자의 과발현 및/또는 번역의 최적화에 의해 증진된다.

본 발명의 특정 실시태양에서 유전자 metF의 과발현은 Ptrc 패밀리 프로모터에 속하는 강한 프로모터의 제어 하에서 또는 PCT/FR2009/052520 출원에 기술된 바와 같이 온도 유도성 프로모터 P_R과 같은 유도성 프로모터의 제어 하에서 유전자를 발현함으로써 달성된다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MetF 단백질의 번역의 최적화는 RNA 안정화제를 이용함으로써 달성된다. 유전자 과발현의 다른 수단은 당해 분야의 전문가에게 알려져 있으며 metF 유전자의 과발현에 이용될 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서 유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 특허 출원 PCT/FR2009/052520은 유도성 프로모터의 제어 하에서 cysE 및 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 thrA 대립유전자를 발현하는 메티오닌 생산 균주를 기술한다. 이 출원은 본 출원에 참고로서 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, thrA 유전자 또는 대립유전자는 온도 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 가장 바람직한 실시태양에서, 이용되는 온도 유도성 프로모터는 P_R 프로모터 패밀리에 속한다.

본 발명의 다른 측면에서, 피루베이트 카르복실라제의 활성이 증진된다. 피루베이트 카르복실라제의 활성 증가는 상응 유전자를 과발현하거나 이러한 유전자의 핵산 서열을 활성이 개선된 효소를 발현하도록 변형함으로써 얻어진다. 본 발명의 다른 실시태양에서 pyc 유전자는 재조합에 의해 하나 또는 몇몇의 카피에서 염색체에 도입되거나 변형된 미생물에서 하나의 카피에 적어도 존재하는 플라스미드에 포함된다. pyc 유전자는 리조비움 에틀리(Rhizobium etli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종으로부터 유래한다.

개선된 메티오닌 생산을 야기하는 다른 유전자 변형은 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술된 바와 같이 pntAB의 발현 증가 및/또는 udhA의 약화이다.

본 발명의 특정 실시태양에서 과발현된 유전자는 염색체상 그 본래 위치에 있거나 또는 본래 위치가 아닌 곳에 통합된다. 최적의 메티오닌 생산을 위해 몇몇의 유전자 카피를 필요로 할 수 있으며 이러한 다중 카피가 특정 유전자좌에 통합되고 그 변형은 메티오닌 생산에 부정적 영향을 미치지 않는다.

세포의 대사를 방해하지 않고 유전자가 통합될 수 있는 유전자좌에 대한 예가 다음과 같다:

본 발명은 또한 상기된 방법에 의해 얻는 것과 같이 생물학적으로 생산되는 히드록시메티오닌에 관한 것이다.

본 발명은 또한 생물학적으로 생산된 히드록시메티오닌을 포함하는 동물 영양물에 대한 조성물 및 생물학적으로 생산된 히드록시메티오닌을 포함하는 미용 조성물에 관한 것이다.

히드록시메티오닌의 회수

"배양 배지로부터 히드록시메티오닌 회수" 작용은 히드록시메티오닌을 회수하고 정제하는 작용을 명시한다.

본 발명의 특정 실시태양에서 히드록시메티오닌은 추출에 의해 발효 브로스(broth) (배양 배지)로부터 회수된다.

이 회수는 발효 브로스의 액체-액체 추출로 얻어진다. 바람직하게 이 추출에서 이용되는 용매는 실질적으로 비수혼화성이다. 적절한 용매는 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 아밀 케톤, 메틸 이소아밀 케톤, 메틸 이소프로필 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에틸 부틸 케톤, 디이소부틸 케톤과 같은 케톤; 이소프로필 에테르, 테트라히드로푸란 및 디메톡시에탄과 같은 에테르, 2-프로판올과 같은 2차 알코올, n-부티르알데히드와 같은 알데히드 및 에틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트 및 이소프로필 아세테이트와 같은 에스테르 중에서 선택된다. 바람직한 용매는 케톤, 에테르 및 2차 알코올 중에서 선택된다.

본 발명의 다른 실시태양에서 추출은 액체/액체 추출 및 고체/고체 추출의 병용일 수 있다.

추출로부터 회수되는 히드록시메티오닌은 이후 증류, 바람직하게는 증기 증류 또는 증발에 의해 정제된다.

경우에 따라, 바이오매스의 0부터 100 %, 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 %, 훨씬 더 바람직하게는 99 % 이상이 발효 생성물의 정제 동안 유지된다.

도 1: 발효에 이용되는 세 가지 유가식 용액으로의 균주 1의 배양에 대한 암모늄 잔류 농도.

실시예

실시예 I: 실시예 II 에서 테스트하는 메티오닌 및 히드록시메티오닌 생산 균주의 구축

1. 프로토콜

몇몇의 프로토콜을 메티오닌 및 히드록시메티오닌 생산 균주를 구축하는 데 이용하였으며 다음의 실시예에서 기술한다.

프로토콜 1: 상동 재조합에 의한 염색체 변형 및 재조합체의 선별 (문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)])

명시된 염색체 유전자좌에서의 대립유전자 교체 또는 유전자 파괴를 문헌[Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 상동 재조합에 의해 수행하였다. Flp 인식 부위가 측면에 있는 클로람페니콜 (Cm) 저항성 cat, 카나마이신 (Km) 저항성 kan, 또는 젠타마이신 (Gt) 저항성 gm 유전자를 pKD3 또는 pKD4 또는 p34S-Gm (문헌[Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715]) 플라스미드를 각각 주형으로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생산된 PCR 생성물을 사용하여 λ 레드 (γ, β, 엑소) 리컴비나제를 발현하는 플라스미드 pKD46이 들어 있는 수용체 대장균 균주를 형질전환하였다. 항생제 저항성 형질전환체를 이후 선별하였고 돌연변이된 유전자좌의 염색체 구조를 적절한 프라이머로 PCR 분석에 의해 확인하였다.

프로토콜 2: P1 파지 형질도입

염색체 변형물을 P1 형질도입에 의해 소정의 대장균 수용체 균주로 전달하였다. 프로토콜은 2 단계를 포함한다: (i) 저항성과 관련된 염색체 변형을 함유하는 공여체 균주 상에서의 파지 용해물의 제조 및 (ii) 이 파지 용해물에 의한 수용체 균주의 감염.

파지 용해물의 제조

- 목적하는 염색체 변형을 가지는 균주 MG 1655의 밤새 배양물 100 ㎕를 10 ml의 LB + Km 50 ㎍/ml + 글루코스 0.2 % + CaCl₂ 5 mM에 (구조의 저항성 카세트(cassette)에 대응하는 항생제와 함께) 접종한다.

- 진탕하면서 30분 동안 37 ℃에서 인큐베이션한다.

- 제조된 P1 파지 용해물 100 ㎕를 공여체 균주 MG1655 상에 첨가한다 (약 1 x 10⁹ 파지/ml).

- 세포가 완전히 용해될 때까지 3시간 동안 37 ℃에서 진탕한다.

- 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고 와동시킨다.

- 10분 동안 4500 g에서 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한다.

- 상청액을 멸균 튜브로 옮긴다.

- 용해물을 4 ℃에서 보관한다.

형질도입

- LB 배지에서 배양된 대장균 수용체 균주의 밤새 배양물 5 ml를 10분 동안 1500 g에서 원심분리한다.

- 세포 펠릿을 2.5 ml의 MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 5 mM에 현탁시킨다.

- 100 ㎕ 세포를 염색체상 변형이 있는 균주 MG1655의 P1 파지 용해물 100 ㎕로 감염시키고 (테스트 튜브) 및 대조군 튜브로서는 P1 파지 용해물이 없는 세포 100 ㎕ 및 세포가 없는 P1 파지 용해물 100 ㎕이다.

- 진탕하지 않고 30분 동안 30 ℃에서 인큐베이션한다.

- 각각의 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕를 첨가하고, 와동시킨다.

- LB 1 ml를 첨가한다.

- 진탕 하지 않고 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.

- 7000 rpm에서 3분 동안 원심분리한다.

- LB + Km 50 ㎕/ml (또는 저항 카세트에 대응하는 항생제)상에 평판배양한다.

- 밤새 37 ℃에서 인큐베이션한다.

표 1: 다음 실시예에서 나타나는 생산 균주의 유전자형 및 상응 번호

2. 균주 1의 구축

리조비움 에틀리의 피루베이트 카르복실라제 유전자를 과발현하기 위하여 pJB137-PgapA-pycRe 플라스미드를 구축하였으며 이는 p블루스크립트-SK (문헌[Alting - Mees et al, Nucleic Acids Res. 17 (22), 9494 (1989)]) 및 pJB137 플라스미드 (문헌[Blatny et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 370-379, 1997])로부터 얻는다.

PgapA - pycRe 삽입물을 구축하기 위해 두 플라스미드를 구축하였다; pSK-PgapA 및 pSK-PgapA-pycRe .

우선, 프라이머 Ome 0053-gapA F (서열 1) 및 Ome 0054-gapA R (서열 2)를 사용하여 PCR에 의해 gapA 프로모터 및 그 RBS 서열을 대장균 MG1655 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 생산된 PCR 생성물을 HindIII로 소화시키고 플라스미드 pSK의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 수득한 플라스미드를 DNA 서열 분석으로 확인하였고 pSK-PgapA로 칭하였다.

두 번째로, pycRe 유전자를 프라이머 Ome 0057-PycR (서열 3) 및 Ome058-PycF (서열 4)를 사용하여 리조비움 에틀리 CFN 42 게놈 DNA로부터 증복시켰다. 생산된 PCR 생성물을 SmaI 및 NdeI 제한 효소로 소화시키고 pSK-PgapA 플라스미드의 SmaI 및 NdeI 부위 사이에 클로닝하였다. 수득된 플라스미드를 DNA 서열 분석으로 확인하였고 pSK-PgapA-pycRe로 칭하였다.

마지막으로 pSK-PgapA-pycRe를 SmaI 및 PsiI 제한 효소로 소화시키고 생산되는 PgapA-pycRe 소화된 단편을 pJB137 플라스미드의 SmaI 부위 사이에 클로닝하였다. 수득된 플라스미드를 DNA 서열 분석으로 확인하였고 pJB137-PgapA-pycRe로 칭하였다.

Ome 0053-gapA F(서열 1)

ACGTAAGCTTCGTTTAAACAAGCCCAAAGGAAGAGTGAGGC

- 밑줄친 대문자 서열은 HindIII 및 PmeI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것.

- 대문자 서열은 gapA 프로모터 서열 (1860640-1860661, 웹사이트 http://ecogene.org/상의 참조 서열)과 상동성.

Ome 0054-gapA R (서열 2)

ACGTAAGCTTACCGGTCACGTGTCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAG

- 밑줄친 대문자 서열은 HindIII, AgeI, AflIII 및 NdeI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것.

- 대문자 서열은 gapA 프로모터 서열 (1860772-1860791, 웹사이트 http://ecogene.org/상의 참조 서열)과 상동성.

Ome 0057-PycR (서열 3)

ACGTCCCGGGCAAGGACGGGCGAACGAAACC

- 밑줄친 대문자 서열은 SmaI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것.

- 대문자 서열은 리조비움 에틀리 피루베이트 카르복실라제 (pycRe) 유전자 (4240368-4240388, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/상의 참조 서열)에 상동성.

Ome 0058-PycF (서열 4)

ACGTACGTAGCATATGCCCATATCCAAGATACTC

- 밑줄친 대문자 서열은 SnaBI, NdeI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것.

- 대문자 서열은 pycRe 유전자의 GTG 개시 코돈이 ATG로 교체된 것을 제외하고는 리조비움 에틀리 피루베이트 카르복실라제 (pycRe) 유전자 (4236889-4236908, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/상의 참조 서열)에 상동성.

pJB137-PgapA-pycRe를 전기천공법에 의해 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB △metJ △ pykF △ pykA △ purU △ yncA △ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE △p gaAB CD:: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 △uxaCA　::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ treBC :: TT02 - serA - serC 로 도입하였으며, 이는 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술되어 있다. pJB137-PgapA-pycRe의 존재를 확인하였으며 선별한 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB △metJ △ pykF △ pykA △ purU △ yncA △ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE △p gaAB CD:: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 △uxaCA　::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC pJB137-PgapA-pycRe를 균주 1로 칭하였다 (표 1).

3. 균주 2의 구축

메티오닌 및 히드록시메티오닌 생산자 균주 2 (표 1)는 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술되어 있으며 이는 이 출원에 참고 문헌으로 삽입된다.

4. 균주 3의 구축

4.1 MG1655 metA *11 pKD46 △ ybdL :: Km 의 구축

균주 MG1655 metA *11 pKD46에서 ybdL 유전자를 결손시키기 위하여, 프라이머 Ome 0589-DybdLF (서열 5) 및 Ome 0590-DybdLR (서열 6)을 이용하여 플라스미드 pKD4로부터의 카나마이신 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.

Ome 0589-DybdLF (서열 5)

CACCGACAGCGGAATCGCCGCTACGCCGTGCTCCTGCGTCAGCCACTGGCAAAACTCAACATCATCCAGGGTAGAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

- 대문자 서열은 ybdL 유전자 하류 서열 (633791-633870, 웹사이트 http://ecogene.org/상의 참조 서열)과 상동성

- 밑줄친 대문자 서열은 pKD4 플라스미드의 프라이머 부위 1 (문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응

Ome 0590-DybdLR (서열 6)

GGTACAATAAAAATGACAAATAACCCTCTGATTCCACAAAGCAAACTTCCACAACTTGGCACCACTATTTTCACCCAGCATATGAATATCCTCCTTAG

- 대문자 서열은 ybdL 유전자 상류 서열 (632797-632874, 웹사이트 http://ecogene.org/상의 참조 서열)과 상동성

- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 2 (문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응

카나마이신 저항성 재조합체를 선별하였다. 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Ome 0591-ybdLR (서열 7) 및 Ome 0592-ybdLF (서열 8)로 PCR에 의해 그리고 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 확인하고 선별한 균주를 MG1655 metA *11 △ybdL :: Km pKD46으로 칭하였다.

Ome 0591-ybdLR　(서열 7)

ybdM 유전자 상류 서열 (634054-634035, 웹사이트 http://ecogene.org/상의 참조 서열)과 상동성인 CGAAGTGCTGCGCCTGAAGC

Ome 0592-ybdLF (서열 8)

ybdH 유전자 하류 서열 (632663-632683, 웹사이트 http://ecogene.org/상의 참조 서열)과 상동성인 GCCGGGCCGACGACCACGCGG

4.2. △ ybdL 형질도입

이후 △ybdL :: Km 결실을 4.1절에서 상기된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 △ybdL::Km로부터의 P1 파지 용해물 (프로토콜 2)을 사용하여 MG1655 metA *11 Ptrc -metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB △m e tJ △ pykF △ pykA △ purU △ yncA △ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1-cysE △ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 △uxaCA　::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ treBC :: TT02 - serA - serC로 형질도입하였으며, 이는 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술되어 있다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하였고 △ybdL :: Km 염색체 변형의 존재를 Ome 0591-ybdLR (서열 7) 및 Ome 0592-ybdLF (서열 8)로 PCR에 의해 확인하였다. 생산된 균주는 다음의 유전자형 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF -cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB △ metJ △ pykF △ pykA △purU △ yncA △ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE △ pgaABCD :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ uxaCA :: TT07 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ CP4 -6:: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC DybdL :: Km을 가진다.

특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술된 pCL1920-PgapA-pycRe-TT07를 전기천공법에 의해 그 균주로 도입하였다. pCL1920-PgapA-pycRe-TT07의 존재를 확인하였으며 생산된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB △ metJ △ pykF △ pykA △ purU △yncA △ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE △ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ uxaCA :: TT07 - TTadc -PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ CP4 -6:: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 △ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC DybdL :: Km pCL1920-PgapA - pycRe -TT07를 균주 3으로 칭하였다 (표 1).

실시예 II : 질소 제한 하에서의 유가식 공정으로 발효에 의한 히드록시메티오닌 생산

이어서 플라스크에서 상당한 양의 목적하는 대사산물을 생산한 균주를 유가식 전략을 이용하여 2.5 L 발효조 (피에르 게랑(Pierre Guerin))에서의 생산 조건 하에서 테스트하였다. 사용된 상이한 배지의 조성은 표 02 내지 05에 있다.

간략하게, 10 mL LB 배지에서 2.5 g.L^-1 글루코스로 증식한 24 시간 배양물을 사용하여 최소 배지 (B1a) 내 24 시간 예비배양물에 접종하였다. 회전식 진탕기 (200 RPM) 내의 50 mL 최소 배지 (B1a)를 함유하는 500 mL 배플형(baffled) 플라스크에서 이러한 인큐베이션을 수행하였다. 제1 예비배양물은 30 ℃의 온도에서 수행하였으며 제2 예비배양물은 34 ℃의 온도에서 수행하였다.

3 mL 농축 예비배양물이 1.2 g.L^-1의 바이오매스 농도로 접종된 200 mL의 최소 배지 (B1b)로 채워진 생물반응기 (식스포스(Sixfors))에서 제3 예비배양 단계를 수행하였다. 예비배양 온도를 34 ℃로 일정하게 유지하였고 10 % NH₄OH 용액을 사용하여 pH를 자동으로 6.8의 값으로 조정하였다. 공기 공급 및/또는 교반으로 용존 산소 농도를 공기 분압 포화도 30 %의 값으로 계속 조정하였다. 배치 배지로부터의 글루코스 고갈 후, 초기 유속 0.7 mL.h^-1로 유가식 배양을 시작하였고 약 18 g.L^-1의 최종 세포 농도를 얻기 위하여 0.13 h^-1의 증식 속도로 24 시간 동안 지수적으로 증가시켰다.

표 2: 예비배양 배치 미네랄 배지 조성 (B1a 및 B1b).

표 3: 예비배양 유가식 미네랄 배지 조성 (F1)

표 4: 배양 배치 미네랄 배지 조성 (B2).

표 5: 배양 유가식 배지 조성 (F2, F3 및 F4).

상이한 배지에서 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 카나마이신을 최종 농도 50 mg.L^-1, 클로람페니콜을 30 mg.L^-1, 카르베니실린(carbenicillin)을 100 mg.L^-1 및 젠타마이신을 10 mg.L^-1로 필요한 경우 첨가하였다.

이어서, 2.5 L 발효조 (피에르 게랑)을 600 mL의 최소 배지 (B2)로 채웠고 55 내지 70 mL 사이에 이르는 예비배양물 부피로 2.1 g.L^-1의 바이오매스 농도로 접종하였다.

배양 온도는 37 ℃로 일정하게 유지하였고 pH는 NH₄OH 용액의 자동 첨가 (9시간 동안 NH₄OH 10 % 및 이후 배양 종료시까지 28 %)에 의해 작동값 (6.8)으로 유지하였다. 배치 단계 동안 최초 교반 속도를 200 RPM으로 설정하였고 유가식 단계 동안 1000 RPM으로 증가시켰다. 배치 단계 동안 최초 공기 유속을 40 NL.h^-1로 설정하였고 유가식 단계를 시작할 때 100 NL.h^-1로 증가시켰다. 용존 산소 농도는 20 내지 40 % 사이, 바람직하게는 교반을 증가시킴으로써 30 % 포화도의 값으로 유지하였다.

세포 덩어리가 5 g.L^-1에 가까운 농도에 도달하였을 때 유가식 배양을 5 mL.h^-1의 최초 유속으로 시작하였다. 26 시간 후에 24 mL.h^-1에 도달하도록 유속을 증가시키면서 S자형 프로파일로 공급 용액 (본 실험에 따른 F2, F3 또는 F4)을 주입하였다. 정확한 공급 조건을 다음의 식으로 계산하였다:

여기서 Q(t)는 p1 = 1.80, p2 = 22.40, p3 = 0.270, p4 = 6.5인 600 mL의 배치 볼륨에 대한 mL.h^-1로의 공급 유속이다.

26 시간의 유가식 배양 후 공급 용액 펌프를 정지하였고 글루코스가 고갈된 후 배양이 멈추었다.

세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC로 정량하였고 기타 관련 대사산물을 굴절측정 검출과의 HPLC (유기산 및 글루코스) 및 실릴화 후 GC-MS를 사용하여 분석하였다.

히드록시메티오닌 생산을 증진하기 위해 우리는 질소 제한 하에서 유가식 발효를 수행하였다. 배양은 증가된 암모늄 농도를 함유하는 상기된 바와 같이 F2, F3 및 F4로 불리는 상이한 유가식 배지로 수행하였다 (표 5의 조성물 참조).

F2 배지의 경우 질소 제한은 배양 시간 약 15시간 정도에 일어나는 반면, F3 배지의 경우는 질소 제한이 배양 시간 약 19시간 정도에 일어난다. F4 유가식 용액의 경우는 세포들이 질소 제한 환경에 있지 않았다.

F2 및 F3 배지에서 최종 잔류 암모늄 농도는, 아래 도 1에 나타난 이온 크로마토크래피 측정에 의해 확인되듯이 거의 0에 가까웠다.

표 6에 있는 결과는 메티오닌 및 히드록시메티오닌을 생산하도록 유전자 변형된 세 가지 재조합 균주에 의해 생산된 히드록시메티오닌의 레벨을 보여준다 (표 1의 유전자형 참조).

표 6: 상이한 유가식 용액으로 배양된 균주 1, 2 및 3에 대해서 최종 메티오닌 및 히드록시메티오닌 농도가 mM로 나타나 있다. 괄호 안의 숫자는 배양 반복수를 나타낸다.

이로써 볼 수 있듯이 배양 중 질소 제한이 더 일찍 일어나면 일어날수록 히드록시메티오닌 생산이 더 증가한다. 유가식 배지 F2에서 배양된 균주 1 및 3은 10 mM가 넘는 히드록시메티오닌을 생산하지만 F4에서는 단지 1 mM만을 생산한다.

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> Fermentative production of methionine hydroxy analog <130> 357383 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 acgtaagctt cgtttaaaca agcccaaagg aagagtgagg c 41 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 acgtaagctt accggtcacg tgtcatatgt tccaccagct atttgttag 49 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 acgtcccggg caaggacggg cgaacgaaac c 31 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 acgtacgtag catatgccca tatccaagat actc 34 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 caccgacagc ggaatcgccg ctacgccgtg ctcctgcgtc agccactggc aaaactcaac 60 atcatccagg gtagaaaccg tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 6 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 ggtacaataa aaatgacaaa taaccctctg attccacaaa gcaaacttcc acaacttggc 60 accactattt tcacccagca tatgaatatc ctccttag 98 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 cgaagtgctg cgcctgaagc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 gccgggccga cgaccacgcg g 21

Claims

- 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 배양 배지에서 메티오닌을 생산하도록 변형된 장내세균과(Enterobacteriaceae) 박테리아인 재조합 미생물을 배양하는 단계,
- 배양 배지로부터 히드록시메티오닌을 회수하는 단계
를 포함하며, 재조합 미생물이 질소 제한 조건 하에서 배양되고, 배양 배지의 C/N 몰비가 5 초과인, 히드록시메티오닌의 발효 생산 방법.
제1항에 있어서, 배양 배지의 C/N 몰비가 10 초과인 방법.
제2항에 있어서, 배양 배지의 C/N 몰비가 20 초과인 방법.
제3항에 있어서, C/N 몰비가 20 내지 25 사이인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,
- 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 배양 배지에서 재조합 미생물을 증식시키는 단계,
- 상기 배양 배지에서 질소 제한 조건 하에 재조합 미생물을 배양하는 단계,
- 배양 배지로부터 히드록시메티오닌을 회수하는 단계
의 연속적인 단계를 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 미생물이 생물반응기 시스템에서
- 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 배양 배지에서 10시간 내지 20시간 동안 미생물을 증식시키는 단계,
- 배양 배지에서 질소 제한 조건에서 10시간 내지 20시간 동안 미생물을 배양하는 단계
의 연속적인 두 단계로 배양되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 탄소원, 황원 및 질소원을 포함하는 배양 배지에서 미생물을 증식시키는 단계가 15시간 내지 20시간 동안 수행되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 배양 배지에서 질소 제한 조건에서 미생물을 배양하는 단계가 10시간 내지 15시간 동안 수행되는 것인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물이
- metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serB, thrA*, cysE, serA, serC 유전자의 발현 증가,
- metJ, pykF, pykA, purU, yncA, ybdL 유전자의 발현 약화
의 유전자 변형 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 재조합 미생물이
- pntAB 및/또는 pyc 유전자의 발현 증가;
- udhA 유전자의 발현 약화
의 변형 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 발효성 탄소원이 글루코스 또는 수크로스인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 안의 황원이 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트 또는 상이한 공급원의 조합물인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시메티오닌이 추출에 의해 배양 배지로부터 회수되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 재조합 미생물이
- metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serB, thrA*, cysE, serA, serC 유전자의 발현 증가,
- metJ, pykF, pykA, purU, yncA, ybdL 유전자의 발현 약화
의 유전자 변형 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 발효성 탄소원이 글루코스 또는 수크로스인 방법.
제6항에 있어서, 배양 배지 안의 황원이 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트 또는 상이한 공급원의 조합물인 방법.
제6항에 있어서, 히드록시메티오닌이 추출에 의해 배양 배지로부터 회수되는 것인 방법.
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