CN110684811B

CN110684811B - 一种提高甲硫氨酸产量的方法

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Publication number: CN110684811B
Application number: CN201911103472.9A
Authority: CN
Inventors: 赵嫚; 魏磊; 应向贤; 汪钊
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110684811A

Abstract

本发明公开了一种提高甲硫氨酸产量的方法，所述方法为：将胱硫醚‑γ‑合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因或甲硫氨酸甲基转移酶基因中的一种或多种导入宿主菌构建重组基因工程菌，将重组基因工程菌发酵培养，获得含甲硫氨酸发酵液，发酵液分离纯化获得甲硫氨酸。本发明方法通过增加甲硫氨酸合成过程中甲基的供应和高半胱氨酸的含量，其中工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt‑E1‑CGS‑MMT‑HMT发酵产生甲硫氨酸的产量是0.3g/L，相对于野生型E.coli BL21(DE3)菌株，甲硫氨酸的产量增加了9倍，显著提高了反应效率。

Description

一种提高甲硫氨酸产量的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种来自植物甲硫氨酸合成途径的多酶组合在微生物中发酵合成甲硫氨酸的应用方法，属于基因工程和生物发酵领域。

(二)背景技术

甲硫氨酸(Methionine，Met)是人类的必需氨基酸，必须从食物中获得。在生物体内甲硫氨酸在蛋白翻译起始、调节代谢、重要化合物前体等方面具有重要的生理生化功能。植物和微生物都可以通过从头合成途径-天冬氨酸合成途径合成甲硫氨酸，此外植物还可以通过一条补充途径S-甲基甲硫氨酸循环(SMM循环)在植物种子的发育过程中通过甲基循环大量提供甲硫氨酸。植物中胱硫醚-γ-合酶(CGS)催化O-乙酰-L-高丝氨酸与半胱氨酸合成胱硫醚，进而合成高半胱氨酸，是甲硫氨酸合成的限速酶，受到产物Met和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的反馈抑制。高半胱氨酸甲基转移酶(HMT)和甲硫氨酸甲基转移酶(MMT)是SMM循环中的两个关键酶。HMT将高半胱氨酸在SMM或SAM作为甲基供体时转化成2分子的甲硫氨酸；MMT是将甲硫氨酸与高半胱氨酸共同合成SMM，从而实现SMM循环。SMM循环可以在短期内实现植物种子发育所需Met的大量提供。

甲硫氨酸合成途径已经被解析，但生物体内甲硫氨酸的合成普遍较低，因而工业上甲硫氨酸基本通过化学法合成。化学法合成Met主要以丙烯醛、甲硫醇和氢氰酸为原料合成Met的外消旋体(D-和L-Met)，再通过外消旋体分离获得L-Met。尽管化学法工艺成熟，但仍存在其合成原料有毒，能耗高且过程复杂等问题。目前生物法合成Met的研究还在积极探索。生物法合成Met包括两种即酶法合成和生物发酵。目前酶法合成产量相对较高，约40g/L，但过程较为复杂，先通过发酵合成中间产物高丝氨酸，再通过将酶与发酵细胞产生的高丝氨酸以及底物甲硫醇催化合成Met。生物发酵法主要聚焦于对大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等自身Met合成途径进行改造，通过葡萄糖发酵直接产生Met，具体改造途径包括提高Met的合成前体天冬氨酸、高半胱氨酸等的合成，解除合成途径关键酶的反馈抑制如：天冬氨酸激酶、胱硫醚-γ-合酶等，减少竞争途径如赖氨酸和苏氨酸的合成，减少下游产物S-甲基甲硫氨酸的合成等。目前Huang等2018年最新研究表明，通过对整个代谢途径的改造包括还原力NADPH途径，天冬氨酸前体合成途径，竞争性的赖氨酸和苏氨酸合成途径和甲硫氨酸合成内部途径等多个步骤的改造，并经过在发酵罐中的连续发酵(连续发酵可使产量比摇瓶提高10-20倍以上)，甲硫氨酸的发酵水平已经达到16.86g/L，但是该研究仅局限于对大肠杆菌内部合成通路的改造和酶的过表达。尽管生物发酵法方法简单、能耗低、过程绿色无污染，但是距离工业化生产还有一定的距离。

目前尚未见生物法或酶法将植物中甲硫氨酸合成途径CGS及SMM循环关键酶应用到微生物中发酵合成甲硫氨酸的报道。

(三)发明内容

本发明在现有生物法合成甲硫氨酸的基础上，提供了一种提高甲硫氨酸产量的新的思路方法，具体是将植物甲硫氨酸合成途径特有的多酶组合应用到微生物，通过植物中的特异酶的过表达提高微生物中甲硫氨酸的含量，同时通过将微生物中苏氨酸的合成前体转化为甲硫氨酸，提高甲硫氨酸的含量。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种提高甲硫氨酸产量的方法，所述方法为：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因或甲硫氨酸甲基转移酶基因中的一种或多种导入宿主菌构建重组基因工程菌，将重组基因工程菌发酵培养，获得含甲硫氨酸发酵液，发酵液分离纯化获得甲硫氨酸。所述宿主菌优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

所述胱硫醚-γ-合酶(CGS)基因源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。所述同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)基因源自大豆(Glycine max)，核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示。所述甲硫氨酸甲基转移酶(MMT)基因源自大豆(Glycine max)，核苷酸序列为SEQID No.5所示，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。其中同型半胱氨酸甲基转移酶以及甲硫氨酸甲基转移酶为大豆(Glycine max)SMM循环中酶。

本发明所述重组基因工程菌按如下方法之一构建：(1)单酶体系：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因分别插入到质粒pBlunt-E1上得到重组质粒pBlunt-E1-CGS、pBlunt-E1-HMT和pBlunt-E1-MMT；将重组质粒分别导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得相应的工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT；(2)双酶体系：同时将同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因串联插入到质粒pBlunt-E1上，重组质粒pBlunt-E1-HMT-MMT；将重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT-MMT；(3)三酶体系：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因串联插入质粒pBlunt-E1上，获得重组质粒pBlunt-E1-CGS-HMT-MMT，将重组质粒分别导入大肠杆菌中获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-HMT-MMT。

本发明优选以共表达胱硫醚-γ-合酶和同型半胱氨酸甲基转移酶以及甲硫氨酸甲基转移酶的重组基因工程菌进行生物发酵合成甲硫氨酸。在同一反应体系中CGS为甲硫氨酸的合成提供大量的高半胱氨酸前体，HMT与SMM实现甲硫氨酸合成过程中的甲基循环。

本发明所述重组基因工程菌发酵培养方法为：将工程菌接种至发酵培养基中，在28℃、180rpm条件下进行发酵培养(优选摇瓶发酵48h)，获得含甲硫氨酸的发酵液，发酵液离心，分离纯化获得甲硫氨酸；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，NaS₂O₃ 16g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCO₃ 10g/L，FeSO4 0.01g/L，MnSO4 0.01g/L，ZnSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH自然。

本发明所述重组基因工程菌发酵前先进行诱导培养，具体如下：将重组基因工程菌接种于含有终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养过夜，取培养物以体积浓度1-2％的接种量转接于50mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.5mM的IPTG，在25℃，140rpm下诱导培养14h，然后于4℃和5000rpm离心收集湿菌体，并用发酵培养基重悬湿菌体洗涤2次，将湿菌体以1g/50ml的量接种至发酵培养基进行发酵。

本发明针对甲硫氨酸合成途径内部的两个步骤进行改造，首先是实现植物与微生物甲硫氨酸合成途径的整合，将植物中特异的HMT和MMT基因在微生物中过表达，实现植物中甲基循环在微生物中的应用，提高甲基循环；其次，植物中的CGS在微生物中同时利用苏氨酸的合成前体，因而可以将苏氨酸的合成通量部分转换到甲硫氨酸的合成中，提高甲硫氨酸的产量。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：常规的方法基本都在微生物本身进行代谢改造，包括增加甲硫氨酸前体物质的含量，减少甲硫氨酸竞争途径的碳通量，减少甲硫氨酸的代谢以及增加甲硫氨酸向外运输的运输蛋白。本发明提供了一种将植物中多酶组合用于微生物代谢甲硫氨酸合成中，为甲硫氨酸合成提供了一种新思路。所述方法通过增加甲硫氨酸合成过程中甲基的供应和高半胱氨酸的含量，其中工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT发酵产生甲硫氨酸的产量是0.3g/L，相对于野生型E.coliBL21(DE3)菌株，甲硫氨酸的产量增加了9倍，显著提高了反应效率。

(四)附图说明

图1为甲硫氨酸合成途径改造示意图；CGS，源自改造后的Arabidopsis thaliana的胱硫醚-γ-合成酶；HMT，源自Glycine max的同型半胱氨酸甲基转移酶；MMT，源自Glycine max的甲硫氨酸甲基转移酶。

图2为单酶、双酶和三酶表达载体构建示意图；单酶pBlunt-E1-CGS、pBlunt-E1-HMT和pBlunt-E1-MMT；双酶pBlunt-E1-MMT-HMT；三酶：pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT。

图3为表达源自Arabidopsis thaliana的胱硫醚-γ-合成酶编码基因CGS、源自Glycine max的同型半胱氨酸甲基转移酶编码基因HMT和甲硫氨酸甲基转移酶编码基因MMT单酶、双酶和三酶体系基因工程菌的SDS-PAGE胶图。其中1号泳道为Control空菌株E.coliBL21(DE3)，7号泳道为Control空载体E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1诱导前菌体，2号泳道为Control空载体E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1诱导后菌体，3号泳道为E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS诱导后菌体，4号泳道为E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT诱导后菌体，5号泳道为E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT诱导后菌体，6号泳道为标准分子量，8号泳道为E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT-MMT诱导后菌体，9号泳道为E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT诱导后菌体。

图4实施例1甲硫氨酸标准样品的液相色谱分析图。

图5单酶、双酶和三酶体系在大肠杆菌体内发酵产生甲硫氨酸的效价比较，每组分别对应发酵时间12、24、36和48h。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB培养基组成：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH自然。

发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，NaS₂O₃ 16g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄1g/L，CaCO₃ 10g/L，FeSO₄ 0.01g/L，MnSO₄ 0.01g/L，ZnSO₄ 0.01g/L，溶剂为水，pH自然。

实施例1：大肠杆菌单酶体系工程菌的构建及产甲硫氨酸的应用

1、工程菌的构建

(1)拟南芥胱硫醚-γ-合酶(CGS)编码基因经序列优化后连接到pBlunt-E1，得到重组质粒pBlunt-E1-CGS；

根据NCBI数据库登录序列，将源自拟南芥(Arabisopsis thaliana)的胱硫醚-γ-合酶(CGS)编码基因(NM_110977.3)进行密码子优化，合成在pET28b质粒上，利用设计的引物F1和R1(CGS)进行PCR扩增，扩增体系见表1所示。

表1PCR扩增CGS反应体系

引物设计如下：

F1，5′-AGTGATGGTAGTCTGACCGTGC-3′；

R1，5′-CATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATAC-3′。

PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20sec，55℃复性20sec，72℃保持20sec为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。纯化后的PCR产物与载体pBlunt-E1相连，连接产物转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中。利用菌落PCR方法检测并确定阳性重组菌。从阳性重组菌中提取质粒，进行基因测序验证，将所得序列与合成的胱硫醚-γ-合酶基因(CGS，核苷酸序列为SEQ IDNO.1)序列进行比对分析，将含有正确片段的质粒命名为pBlunt-E1-CGS。

(2)大豆同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)编码基因经序列优化后连接到pBlunt-E1得到重组质粒pBlunt-E1-HMT；

根据NCBI数据库登录序列，对源自Glycine max的大豆同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)编码基因(XM_003554216.4)进行密码子优化，合成在pET28b质粒上，利用设计的引物F2和R2(HMT)进行PCR扩增，扩增体系见表2所示。

表2 PCR扩增HMT反应体系

F2，5′-ATGAGCTCTTTAATTACCGATCTGCT-3′；

R2，5′-TTAAATGCTCTGACTGCTACTTAAAGTGC-3′。

PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20sec，55℃复性20sec，72℃保持20sec为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。纯化后的PCR产物与载体pBlunt-E1相连，连接产物转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中。利用菌落PCR方法检测并确定阳性重组菌。从阳性重组菌中提取质粒，进行基因测序验证，将所得序列与合成的同型半胱氨酸甲基转移酶基因(HMT，核苷酸序列为SEQ IDNO.3)序列进行比对分析，将含有正确片段的质粒命名为pBlunt-E1-HMT。

(3)大豆甲硫氨酸甲基转移酶(MMT)编码基因经序列优化后连接到pBlunt-E1得到重组质粒pBlunt-E1-MMT；

将源自Glycine max的大豆甲硫氨酸甲基转移酶(MMT)的编码基因(NM_001368758.1)进行密码子优化，合成在pET28b质粒上，利用设计的引物F3和R3(MMT)进行PCR扩增，扩增体系见表3所示。

表3 PCR扩增MMT反应体系

F3，5′-ATGAGCTGGATGAGTGTGGATG-3′；

R3，5′-TTAACCCAGTGCAACTTCTTTAAATTTTA-3′。

PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20sec，55℃复性20sec，72℃保持20sec为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。纯化后的PCR产物与载体pBlunt-E1相连，连接产物转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中。利用菌落PCR方法检测并确定阳性重组菌。从阳性重组菌中提取质粒，进行基因测序验证，将所得序列与合成的大豆甲硫氨酸甲基转移酶基因(MMT，核苷酸序列为SEQ IDNO.5所示)的序列进行比对分析，将含有正确片段的质粒命名为pBlunt-E1-MMT。

2、诱导表达

用质粒提取试剂盒分别从各自的Trans-T1重组菌中提取重组质粒pBlunt-E1-CGS、pBlunt-E1-HMT和pBlunt-E1-MMT，并将其分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上，37℃培养箱中培养过夜。挑取阳性重组菌接种于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养12h，作为种子液。然后按体积浓度1％的接种量接种至50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在相同条件下培养至菌液浓度(OD₆₀₀)为0.7时，添加诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.4mM，在25℃和140rpm下继续培养14h诱导过量表达目的蛋白，离心收集诱导后的湿菌体，获得工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS、coliBL21(DE3)pBlunt-E1-HMT和E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT。

同样条件下，以E.coli BL21(DE3)及转化空载体pBlunt-E1的E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1为对照。

重组蛋白检测：将收集的诱导后菌液取1mL于12000rpm离心2分钟后弃上清，加100μL超纯水进行重悬，取18μL与6μL 4×SDS-PAGE Loading Buffer沸水煮10min进行上样。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果见图3中泳道3-泳道5，重组的CGS、HMT和MMT为可溶性蛋白，其分子量大小为43kDa、36.3kDa和120kDa，在目的条带附近有条带加粗，确认重组蛋白已经实现成功诱导。

3、重组菌发酵液的液相分析

分别将诱导后的工程菌E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS、E.coliBL21(DE3)pBlunt-E1-HMT和E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT在4℃、500rpm离心，收集湿菌体，称取1g湿菌体接种至50mL发酵培养基中，在28℃、200rpm下进行摇瓶发酵培养48h，其中每隔12h取发酵液一次进行检测。发酵完成后，将发酵液于12000rpm离心2min，离心后取上清液100μL，先加100μLpH＝9.0的NaHCO₃溶液，再加100μL2,4-二硝基氟苯乙腈，60℃避光水浴反应1h，将反应后的溶液与700μL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液混匀，混合液于12000rpm离心2min，取上清，上清经0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

从发酵的结果来看，E.coli BL21(DE3)生产甲硫氨酸的产量约是0.04g/L，工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS，E.coliBL21(DE3)pBlunt-E1-HMT和E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT生产甲硫氨酸的产量分别是0.14g/L、0.08g/L、0.06g/L，工程菌相对于野生型E.coli BL21(DE3)产量分别增加3.5倍、2倍和1.5倍。

色谱条件：色谱柱Welchrom C18柱(4.6*250mm，5μm)，流动相为0.025M的醋酸钠水溶液与甲醇体积比1：1混合；流速为1mL/min；柱温40℃；检测波长360nm；进样量10μL。

实施例2:工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT的构建及产甲硫氨酸的应用

1、工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT的构建

(1)pBlunt-E1-HMT-MMT载体的构建

设计MMT的同源重组引物F4和R4，将MMT同源重组到载体pBlunt-E1-HMT上，构建pBlunt-E1-HMT-MMT重组载体。具体步骤是以合成的MMT基因为模板，以F4和R4为引物进行PCR扩增，获得MMT基因片段，扩增体系见表4所示。

表4 MMTPCR扩增反应体系

引物设计如下：

F4，

5′-TAAGAAGGAGATATACATATGATGAGCTCTTTAATTACCGATCTGCT-3′；

R4，

5′-AGCAGCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAAATGCTCTGACTGCTACTTA AAGTGC-3′。PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20sec，55℃复性20sec，72℃保持1min为一个循环，重复循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。

提取实施例1中构建的pBlunt-E1-HMT质粒，以Xho I和Nde I限制性内切酶酶切pBlunt-E1-HMT载体，酶切体系如表5所示。

表5pBlunt-E1-HMT酶切体系

将酶切后的pBlunt-E1-HMT载体进行纯化，经NanoDrop 2000c测量，浓度为25ng/μL，上述PCR扩增的MMT基因重组片段，回收浓度为60ng/μL，将两者通过One-Step Clone法进行重组连接，连接体系如表6所示。

表6 重组反应体系

将上述体系加好后，37℃连接30min，将连接后的产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含50μg/mL氨苄霉素的LB抗性平板上，37℃培养箱中培养过夜。挑取阳性重组菌接种于50mL含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养12h，取2mL菌液送公司测序，将测序后序列与合成的大豆甲硫氨酸甲基转移酶(MMT核苷酸序列为SEQ IDNO.5)序列进行比对分析，将含有正确片段的质粒命名为pBlunt-E1-HMT-MMT。将质粒pBlunt-E1-HMT-MM转化到E.coli BL21(DE3)中获得E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT的重组工程菌。

将上述构建成功的工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT接种于50mL含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养12h，作为种子液。

然后按体积浓度2％接种量将工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT接种至50mL含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养至菌液浓度(OD₆₀₀)约为0.7时，添加诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.5mM，在25℃，140rpm下继续培养14h过量表达目的蛋白，然后培养液离心，收集湿菌体。

重组蛋白检测：将收集的诱导后菌液取1mL于12000rpm离心2分钟后弃上清，加100μL超纯水进行重悬，取18μL与6μL 4×SDS-PAGE Loading Buffer沸水煮10min进行上样。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测有目的条带加粗。重组HMT+MMT为可溶性蛋白，其分子量大小表观为36.3kDa、120kDa(图3，泳道8)。工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT已成功诱导表达。

2、工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT的发酵及产甲硫氨酸分析

将成功诱导后的工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT于4℃、500rpm离心后收集湿菌体，称取1g湿菌体接种至50mL发酵培养基中，在28℃、200rpm下进行摇瓶发酵48h，且每隔12h取发酵液一次。将发酵液12000rpm离心2min，取上清液100μL，加100μL pH＝9.0的NaHCO₃溶液，再加100μL 2,4-二硝基氟苯乙腈，60℃避光水浴反应1h，将反应后的溶液与700μL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液混匀，将混合液于12000rpm离心2min，取上清，上清液经0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱条件同实施例1。

液相结果显示，工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT-HMT发酵产生甲硫氨酸的产量是0.09g/L，相对于野生型菌株E.coli BL21(DE3)产量增加了2.2倍。

实施例3:工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT的构建及产甲硫氨酸的应用

(1)工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT的构建

以实施例1和实施例2中的pBlunt-E1-CGS和pBlunt-E1-MMT-HMT质粒为模板，并分别以引物对F1R1和F5R5为引物，分别获取CGS与MMT-HMT基因序列，PCR扩增程序如表7：

表7MMT-HMT扩增体系

引物设计如下：F5，5′-ATTCTGCAAGCTTTAGAAGCCATTTAATAATACGACTCACTATAGGGGAAT TGTGAG-3′；R5，5′-TCAAGATTTTTCTCTTAAAGCATTTGAAATA-3′。PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20sec，59℃复性20sec，72℃保持1min20sec为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。

将上述得到的CGS和MMT-HMT的PCR产物纯化回收，继续通过Overlap PCR扩增以F6、R6引物对为引物将CGS与MMT-HMT连接，具体程序如表8：

表8CGS-MMT-HMToverlap PCR扩增体系

引物设计如下：F6，5′-AGTGATGGTAGTCTGACCGTGCACG-3′；R6，5′-TCAAGATTTTTCTCTTAAAGCATTTGAAATA-3′。PCR反应进程为：95℃预变性2min；之后，以95℃变性20sec，59℃复性20sec，72℃保持1.5min为一个循环，重复循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。

纯化后的PCR产物与载体pBlunt-E1相连，连接产物转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中。利用菌落PCR方法检测并确定阳性重组子，挑取阳性重组子接种于50mL含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养12h，取2mL菌液送公司测序，将测序后序列与合成的胱硫醚-γ-合酶基因(CGS，核苷酸序列为SEQ ID NO.1)、同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT，核苷酸序列为SEQ IDNO.3)、大豆甲硫氨酸甲基转移酶(MMT核苷酸序列为SEQIDNO.5)序列进行比对分析，将同时含有上述三种基因的质粒命名为pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT。

将上述构建成功的质粒pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT转化到E.coli BL21(DE3)，获得工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT的阳性菌株，将该菌株接种于50mL含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养12h，作为种子液。

然后按体积浓度2％的接种量将工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT接种至50mL含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养至菌液浓度(OD₆₀₀)为0.7时，添加诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.5mM，在25℃和140rpm下继续培养14h过量表达目的蛋白。培养液离心，收集湿菌体。

重组蛋白检测：将收集的诱导后菌液取1mL于12000rpm离心2分钟后弃上清，加100μL超纯水进行重悬，取18μL与6μL 4×SDS-PAGE Loading Buffer沸水煮10min进行上样。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测有目的条带加粗。重组的CGS+HMT+MMT均为可溶性蛋白，其分子量大小表观为43.9kDa、36.3kDa、120kDa，重组蛋白诱导表达成功见图3泳道9。

(2)工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT发酵及液相分析

将诱导培养后的工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT于4℃、500rpm离心后收集湿菌体，称取1g湿菌体接种至50mL发酵培养基中，在28℃、200rpm下进行摇瓶发酵48h，每隔12h取发酵液一次。发酵完成后，将发酵液12000rpm离心2min，离心后取上清液100μL，先加100μL pH＝9.0的NaHCO₃溶液，再加100μL 2,4-二硝基氟苯乙腈，60℃避光水浴反应1h，将反应后的溶液与700μL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液混匀，混合液于12000rpm离心2min，取上清，上清液经0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱条件同实施例1。

从液相结果看，工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-MMT-HMT发酵产生甲硫氨酸的产量是0.3g/L，相对于野生型E.coli BL21(DE3)菌株，甲硫氨酸的产量增加了9倍。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种提高甲硫氨酸产量的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agtgatggta gtctgaccgt gcacgccggt gaacgtttag gtcgcggtat tgtgaccgac 60

gccatcacaa ccccggtggt gaataccagc gcctattttt tcaagaaaac cgccgagctg 120

attgatttta aagaaaaacg cagcgttagc tttgagtacg gccgttacgg taatccgacc 180

accgtggtgc tggaagacaa aattagcgct ttagaaggtg cagagagcac tttagttatg 240

gccagcggta tgtgcgcaag caccgttatg ctgctggctt tagttccggc cggtggtcac 300

attgtgacca ccaccgactg ctatcgcaag acccgtatct tcatggaaaa ctttttaccg 360

aagctgggca tcacagtgac agtgatcgat ccggcagata ttgccggttt agaggccgca 420

gtgaatgagt ttaaagtttc tctgttcttt accgaaagcc cgaccaaccc gtttctgcgc 480

tgcgtggata tcgagctggt gagcaaaatt tgccacaaac gcggcacttt agtgtgtatt 540

gatggcacct tcgcaacccc tctgaaccag aaagccttag cactgggtgc cgatctggtg 600

gtgcacagcg ccaccaaata tatcggcggc cataatgacg tgctggctgg ttgcatctgc 660

ggttctttaa aactggtgag cgaaatccgc aatttacatc atgttctggg cggtacttta 720

aatccgaacg ccgcctatct gatcatccgc ggtatgaaaa ctttacattt acgtgtgcag 780

cagcagaata gcaccgcatt ccgtatggcc gaaattttag aagcccatcc gaaagtttct 840

cacgtgtatt atccgggttt acctagtcat ccggagcatg aattagccaa gcgtcagatg 900

accggctttg gcggcgttgt tagtttcgag atcgacggcg acatcgagac aaccattaaa 960

tttgtggatt ctttaaaaat cccgtacatc gccccgagtt tcggtggttg cgaaagcatc 1020

gtggatcagc cggccattat gagctattgg gatctgccgc aagaggaacg tctgaaatac 1080

ggcatcaagg acaatttagt gcgcttcagc ttcggcgttg aggatttcga ggacgtgaag 1140

gccgacattc tgcaagcttt agaagccatt taa 1173

<210> 2

<211> 390

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Ser Asp Gly Ser Leu Thr Val His Ala Gly Glu Arg Leu Gly Arg Gly

1 5 10 15

Ile Val Thr Asp Ala Ile Thr Thr Pro Val Val Asn Thr Ser Ala Tyr

20 25 30

Phe Phe Lys Lys Thr Ala Glu Leu Ile Asp Phe Lys Glu Lys Arg Ser

35 40 45

Val Ser Phe Glu Tyr Gly Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Val Val Leu

50 55 60

Glu Asp Lys Ile Ser Ala Leu Glu Gly Ala Glu Ser Thr Leu Val Met

65 70 75 80

Ala Ser Gly Met Cys Ala Ser Thr Val Met Leu Leu Ala Leu Val Pro

85 90 95

Ala Gly Gly His Ile Val Thr Thr Thr Asp Cys Tyr Arg Lys Thr Arg

100 105 110

Ile Phe Met Glu Asn Phe Leu Pro Lys Leu Gly Ile Thr Val Thr Val

115 120 125

Ile Asp Pro Ala Asp Ile Ala Gly Leu Glu Ala Ala Val Asn Glu Phe

130 135 140

Lys Val Ser Leu Phe Phe Thr Glu Ser Pro Thr Asn Pro Phe Leu Arg

145 150 155 160

Cys Val Asp Ile Glu Leu Val Ser Lys Ile Cys His Lys Arg Gly Thr

165 170 175

Leu Val Cys Ile Asp Gly Thr Phe Ala Thr Pro Leu Asn Gln Lys Ala

180 185 190

Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile

195 200 205

Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Cys Ile Cys Gly Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Val Ser Glu Ile Arg Asn Leu His His Val Leu Gly Gly Thr Leu

225 230 235 240

Asn Pro Asn Ala Ala Tyr Leu Ile Ile Arg Gly Met Lys Thr Leu His

245 250 255

Leu Arg Val Gln Gln Gln Asn Ser Thr Ala Phe Arg Met Ala Glu Ile

260 265 270

Leu Glu Ala His Pro Lys Val Ser His Val Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro

275 280 285

Ser His Pro Glu His Glu Leu Ala Lys Arg Gln Met Thr Gly Phe Gly

290 295 300

Gly Val Val Ser Phe Glu Ile Asp Gly Asp Ile Glu Thr Thr Ile Lys

305 310 315 320

Phe Val Asp Ser Leu Lys Ile Pro Tyr Ile Ala Pro Ser Phe Gly Gly

325 330 335

Cys Glu Ser Ile Val Asp Gln Pro Ala Ile Met Ser Tyr Trp Asp Leu

340 345 350

Pro Gln Glu Glu Arg Leu Lys Tyr Gly Ile Lys Asp Asn Leu Val Arg

355 360 365

Phe Ser Phe Gly Val Glu Asp Phe Glu Asp Val Lys Ala Asp Ile Leu

370 375 380

Gln Ala Leu Glu Ala Ile

385 390

<210> 3

<211> 1002

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgagctctt taattaccga tctgctgcgt cagaccggtg gcaccgcagt gattgatggt 60

ggtctggcca ccgaactgga gcgccacggt gccgatctga atgatccgct gtggagcgca 120

aagtgtttat ttagcttccc gcatctgatc cgtcaagttc atttagatta tttagaaaac 180

ggcgccgaca tcattatcac agccagctac caagctacca tccaaggttt taaagccaaa 240

ggctacagcg acgaagagag cgaagcttta ctgcgcagca gcgtggaaat cgcccgtgaa 300

gcccgcgaag tgtactacaa aaactgcgcc ggttgtcgca gcggtgatgg tgatgatgat 360

ggccgcattt taaagcagcg cccgatttta gttgccgcaa gtgtgggtag ctatggtgcc 420

tatctggccg atggcagcga atatagcggt gactatggcg atgccatcac cgtggagaca 480

ctgaaggatt ttcatcgtcg ccgcgtgcag attttagccg atagtggtgc cgatttactg 540

gcctttgaga ccgtgccgaa taagctggag gccgaagcat atgcccagct gctggaagaa 600

gaagatatca aaatcccggc ttggtttagc ttcaacagca aggatggcgt gaacgttgtg 660

agcggtgatt ctttaatgga atgcggtagc atcgcagaga gctgtaacaa ggtggttgcc 720

gttggcatca attgcacccc gccgcgcttc attcatggct taatcgtgct gctgaagaaa 780

gtgaccacca agccgatcgt gatctatccg aacagcggcg agacctatga cgcagatctg 840

aaggaatggg tgcagaatac cggtgtgacc gacgaagatt ttattagtta tgttaacaaa 900

tggtgcgaac tgggcgccag cttagttggt ggttgctgcc gtaccacacc ggataccatc 960

cgcaagatct atcgcacttt aagtagcagt cagagcattt aa 1002

<210> 4

<211> 333

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ser Ser Leu Ile Thr Asp Leu Leu Arg Gln Thr Gly Gly Thr Ala

1 5 10 15

Val Ile Asp Gly Gly Leu Ala Thr Glu Leu Glu Arg His Gly Ala Asp

20 25 30

Leu Asn Asp Pro Leu Trp Ser Ala Lys Cys Leu Phe Ser Phe Pro His

35 40 45

Leu Ile Arg Gln Val His Leu Asp Tyr Leu Glu Asn Gly Ala Asp Ile

50 55 60

Ile Ile Thr Ala Ser Tyr Gln Ala Thr Ile Gln Gly Phe Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gly Tyr Ser Asp Glu Glu Ser Glu Ala Leu Leu Arg Ser Ser Val Glu

85 90 95

Ile Ala Arg Glu Ala Arg Glu Val Tyr Tyr Lys Asn Cys Ala Gly Cys

100 105 110

Arg Ser Gly Asp Gly Asp Asp Asp Gly Arg Ile Leu Lys Gln Arg Pro

115 120 125

Ile Leu Val Ala Ala Ser Val Gly Ser Tyr Gly Ala Tyr Leu Ala Asp

130 135 140

Gly Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Tyr Gly Asp Ala Ile Thr Val Glu Thr

145 150 155 160

Leu Lys Asp Phe His Arg Arg Arg Val Gln Ile Leu Ala Asp Ser Gly

165 170 175

Ala Asp Leu Leu Ala Phe Glu Thr Val Pro Asn Lys Leu Glu Ala Glu

180 185 190

Ala Tyr Ala Gln Leu Leu Glu Glu Glu Asp Ile Lys Ile Pro Ala Trp

195 200 205

Phe Ser Phe Asn Ser Lys Asp Gly Val Asn Val Val Ser Gly Asp Ser

210 215 220

Leu Met Glu Cys Gly Ser Ile Ala Glu Ser Cys Asn Lys Val Val Ala

225 230 235 240

Val Gly Ile Asn Cys Thr Pro Pro Arg Phe Ile His Gly Leu Ile Val

245 250 255

Leu Leu Lys Lys Val Thr Thr Lys Pro Ile Val Ile Tyr Pro Asn Ser

260 265 270

Gly Glu Thr Tyr Asp Ala Asp Leu Lys Glu Trp Val Gln Asn Thr Gly

275 280 285

Val Thr Asp Glu Asp Phe Ile Ser Tyr Val Asn Lys Trp Cys Glu Leu

290 295 300

Gly Ala Ser Leu Val Gly Gly Cys Cys Arg Thr Thr Pro Asp Thr Ile

305 310 315 320

Arg Lys Ile Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Ser Gln Ser Ile

325 330

<210> 5

<211> 3276

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atgagctgga tgagtgtgga tgaattttta gttcagtgta agaaaagtgg cgatgccgcc 60

tatgcctctt tacgcagttt actggaacgt ttagataatc cggaaacccg tagccaagct 120

cgcatctttt taagccatct gcagaaacgc ttccctacca aagacagttg tgaccagtgc 180

ttcgagacct accacttccg catcgaggat gttagtctgg gccagtatga aggtcaccat 240

ggccgcaaca agctgacaat gatggtgatc ccgagcatct ttttaccgga agattggagc 300

ttcacctttt acgagggtat caaccgccac cccgatagca tctttaagga gcgcaccgtg 360

gccgaactgg gctgtggtaa cggttggatc agcattgcca tggccgagaa atggctgccg 420

tataaggtgt atggtttaga catcaatccg cgcgccgtga aagtgagctg gattaactta 480

tatctgaatg ctttagatga aaatggccag ctgatttatg atgaggaaaa caagacactg 540

ctggatcgcg tggaattcca cgagagtgat ctgctgagct actgccgcga gaaagacatt 600

cagctggagc gtatcgtggg ttgcatcccg cagattctga acccgaaccc ggacgcaatg 660

agcaaaatga tcaccgaaaa cgccagcgag gaatttctgc acagtctgag taattactgc 720

gctttacaag gttttgtgga ggatcagttc ggtctgggct taatcgcccg cgcagtggaa 780

gaaggtattg ccgttattaa accgaccggt atcatgatct tcaatatggg cggccgtccg 840

ggccaagctg tttgcaaacg tttatttgag cgccgcggtt ttcgcattac aaagctgtgg 900

cagacaaaga ttatccaagc tggcgatacc gatatcgagg cactggtgga aatcgagaag 960

aacagcccgc accgtttcga gttctttatg ggtttaagtg gtgatcagcc gatctgtgcc 1020

cgtaccgcat ggacctatgg taaaagcggc ggcagtatta gccatgcttt aagcgtgtat 1080

agctgtcagc tgcgccaccc gaatcaagtt aaagccattt ttgactttct gaaacatggc 1140

tttcaagaga tcggcagctc tttagatctg agcttcgaag acgatagcgt ggccgacgag 1200

aaaattccgt ttttagccta tctggccagc cgtctgaaaa ataatagtta tttcccgtac 1260

gaaccgccgg ccggtagcaa acatttccgc aatttaatcg ctggttttct gaagacctac 1320

caccacattc cgctgaccag tgacaatgtg gttattttcc cgagccgcac agccgcaatt 1380

gagcatgctt tacgtttatt tagcccgcgt ctggccgttg ttgacgagca tctgacccgt 1440

catttaccgc gtcagtggct gaccagcagc actttagaga aaaacgccgg tacaattgac 1500

tctttagatg ataccatgat ggtgatcgaa gccccgcgcc agagcgattt aatgatcgaa 1560

ctgattaaaa agctgaaacc gaaggtggtg gttactggta ttgcccactt cgaagccgtg 1620

accagtagtg cctttgtgca tctgctggac acaacccgcg atattggcag ccgtttattt 1680

ttagacatca gcgaccactt tgaactgagc tctttacccg gtagtaatgg cgtgctgaag 1740

tatttaagcg gtaccccgtt accgagccac gccgccatta tctgcggtct ggttaagaat 1800

aaagtgtacc cggacttaga agtggccttc gtgatcagtg aggaagaatc tttactgaac 1860

gctttaagca agaccgttga gctgctggaa ggcaacaccg ctttaatcag ccagtattac 1920

tatggttgca ttttccatga actgctggcc ttccagctgg cagaccgtca cgcacccgct 1980

aaacgtaatt gcgaaaacgt gaaaagtgtt gatatgattg gttttgcacg tagcgcaacc 2040

agtgtgctga gcaacgccga actgagcatt gacggcgttg aaaatgagag cttaattcat 2100

atggatgttg accagatctt tttaccggtg ccgagcccgg ttaaagcagc catctttgag 2160

agcttcgccc gccagaatat gagcgagagc gaaaccgacg ttacagccag catcaaaggt 2220

tttgttaaaa gcaattatgg cttcccgacc gatagcagta ccgagttcat ctacgccgat 2280

aacagcaaag cattatttaa taaactggtt ctgtgctgta tcaaagaggg tggtacttta 2340

tgcttcccgg ctggtagtaa cggcaattat gttagcagtg cacgcttttt aaaagccgac 2400

attgtgacag tgccgaccga cgttaacgtg ggcttcaagt tcacagagaa aactttaacc 2460

ggcattttag gcaccgtgaa aaatccgtgg gtgtacatca gcggcccgac cgttaacccg 2520

accggtttaa tttatagtaa taacgaaatg gtggaaattt taagcacttg tgcacgcttt 2580

ggtgcacgcg tgattattga caccgccagc agtggtttag agttcgattg tgagggctgg 2640

ggcggctggg acatcgaagg ctgtttaagc aagctgaata gcagcatcaa gccgagcttc 2700

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tttttaattt taaatcagcc tattttagtg gacaccttct atagctaccc gggcttaagc 2820

aaacctcata ccacagcacg ctatgccacc aaaaagctgc tggaacgtcg tgaacagaag 2880

ccgagcagtc tgagcgatgc aatcgtggag cacacccaga ttttaaaaac acgcagtaag 2940

tgtttaaaag aggttttaca gaagagcggc tgggatgtgc tggaaagttg cgccggtgtg 3000

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<210> 6

<211> 1091

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Met Ser Trp Met Ser Val Asp Glu Phe Leu Val Gln Cys Lys Lys Ser

1 5 10 15

Gly Asp Ala Ala Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Leu Glu Arg Leu Asp

20 25 30

Asn Pro Glu Thr Arg Ser Gln Ala Arg Ile Phe Leu Ser His Leu Gln

35 40 45

Lys Arg Phe Pro Thr Lys Asp Ser Cys Asp Gln Cys Phe Glu Thr Tyr

50 55 60

His Phe Arg Ile Glu Asp Val Ser Leu Gly Gln Tyr Glu Gly His His

65 70 75 80

Gly Arg Asn Lys Leu Thr Met Met Val Ile Pro Ser Ile Phe Leu Pro

85 90 95

Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Ile Asn Arg His Pro Asp

100 105 110

Ser Ile Phe Lys Glu Arg Thr Val Ala Glu Leu Gly Cys Gly Asn Gly

115 120 125

Trp Ile Ser Ile Ala Met Ala Glu Lys Trp Leu Pro Tyr Lys Val Tyr

130 135 140

Gly Leu Asp Ile Asn Pro Arg Ala Val Lys Val Ser Trp Ile Asn Leu

145 150 155 160

Tyr Leu Asn Ala Leu Asp Glu Asn Gly Gln Leu Ile Tyr Asp Glu Glu

165 170 175

Asn Lys Thr Leu Leu Asp Arg Val Glu Phe His Glu Ser Asp Leu Leu

180 185 190

Ser Tyr Cys Arg Glu Lys Asp Ile Gln Leu Glu Arg Ile Val Gly Cys

195 200 205

Ile Pro Gln Ile Leu Asn Pro Asn Pro Asp Ala Met Ser Lys Met Ile

210 215 220

Thr Glu Asn Ala Ser Glu Glu Phe Leu His Ser Leu Ser Asn Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Leu Gln Gly Phe Val Glu Asp Gln Phe Gly Leu Gly Leu Ile Ala

245 250 255

Arg Ala Val Glu Glu Gly Ile Ala Val Ile Lys Pro Thr Gly Ile Met

260 265 270

Ile Phe Asn Met Gly Gly Arg Pro Gly Gln Ala Val Cys Lys Arg Leu

275 280 285

Phe Glu Arg Arg Gly Phe Arg Ile Thr Lys Leu Trp Gln Thr Lys Ile

290 295 300

Ile Gln Ala Gly Asp Thr Asp Ile Glu Ala Leu Val Glu Ile Glu Lys

305 310 315 320

Asn Ser Pro His Arg Phe Glu Phe Phe Met Gly Leu Ser Gly Asp Gln

325 330 335

Pro Ile Cys Ala Arg Thr Ala Trp Thr Tyr Gly Lys Ser Gly Gly Ser

340 345 350

Ile Ser His Ala Leu Ser Val Tyr Ser Cys Gln Leu Arg His Pro Asn

355 360 365

Gln Val Lys Ala Ile Phe Asp Phe Leu Lys His Gly Phe Gln Glu Ile

370 375 380

Gly Ser Ser Leu Asp Leu Ser Phe Glu Asp Asp Ser Val Ala Asp Glu

385 390 395 400

Lys Ile Pro Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Lys Asn Asn Ser

405 410 415

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420 425 430

Ile Ala Gly Phe Leu Lys Thr Tyr His His Ile Pro Leu Thr Ser Asp

435 440 445

Asn Val Val Ile Phe Pro Ser Arg Thr Ala Ala Ile Glu His Ala Leu

450 455 460

Arg Leu Phe Ser Pro Arg Leu Ala Val Val Asp Glu His Leu Thr Arg

465 470 475 480

His Leu Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser Ser Thr Leu Glu Lys Asn Ala

485 490 495

Gly Thr Ile Asp Ser Leu Asp Asp Thr Met Met Val Ile Glu Ala Pro

500 505 510

Arg Gln Ser Asp Leu Met Ile Glu Leu Ile Lys Lys Leu Lys Pro Lys

515 520 525

Val Val Val Thr Gly Ile Ala His Phe Glu Ala Val Thr Ser Ser Ala

530 535 540

Phe Val His Leu Leu Asp Thr Thr Arg Asp Ile Gly Ser Arg Leu Phe

545 550 555 560

Leu Asp Ile Ser Asp His Phe Glu Leu Ser Ser Leu Pro Gly Ser Asn

565 570 575

Gly Val Leu Lys Tyr Leu Ser Gly Thr Pro Leu Pro Ser His Ala Ala

580 585 590

Ile Ile Cys Gly Leu Val Lys Asn Lys Val Tyr Pro Asp Leu Glu Val

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Ala Phe Val Ile Ser Glu Glu Glu Ser Leu Leu Asn Ala Leu Ser Lys

610 615 620

Thr Val Glu Leu Leu Glu Gly Asn Thr Ala Leu Ile Ser Gln Tyr Tyr

625 630 635 640

Tyr Gly Cys Ile Phe His Glu Leu Leu Ala Phe Gln Leu Ala Asp Arg

645 650 655

His Ala Pro Ala Lys Arg Asn Cys Glu Asn Val Lys Ser Val Asp Met

660 665 670

Ile Gly Phe Ala Arg Ser Ala Thr Ser Val Leu Ser Asn Ala Glu Leu

675 680 685

Ser Ile Asp Gly Val Glu Asn Glu Ser Leu Ile His Met Asp Val Asp

690 695 700

Gln Ile Phe Leu Pro Val Pro Ser Pro Val Lys Ala Ala Ile Phe Glu

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Ser Ile Lys Gly Phe Val Lys Ser Asn Tyr Gly Phe Pro Thr Asp Ser

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755 760 765

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Leu Asn Gly Val Leu Arg Phe Gly Phe Leu Ile Leu Asn Gln Pro Ile

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Val Leu Glu Ser Cys Ala Gly Val Ser Val Val Ala Lys Pro Ser Ala

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1010 1015 1020

Ser His Gly Ser Ala Thr Lys Glu Ile Lys Leu Asp Asp Ser Asn Ile

1025 1030 1035 1040

Arg Thr Val Ile Leu Lys Ala Thr Gly Leu Cys Ile Asn Ser Gly Ser

1045 1050 1055

Trp Thr Gly Ile Pro Gly Tyr Cys Arg Phe Asn Ile Ala Leu Glu Glu

1060 1065 1070

Asn Asp Phe Lys Lys Ala Leu Asp Cys Ile Leu Lys Phe Lys Glu Val

1075 1080 1085

Ala Leu Gly

1090

Claims

1.一种提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述方法为：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因或甲硫氨酸甲基转移酶基因中的一种或多种导入宿主菌构建重组基因工程菌，将重组基因工程菌发酵培养，获得含甲硫氨酸发酵液，发酵液分离纯化获得甲硫氨酸；所述胱硫醚-γ-合酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述同型半胱氨酸甲基转移酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述甲硫氨酸甲基转移酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

2.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

3.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌按如下方法之一构建：(1)单酶体系：将胱硫醚-γ-合酶编码基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因分别插入到质粒pBlunt-E1上得到重组质粒pBlunt-E1-CGS、pBlunt-E1-HMT和pBlunt-E1-MMT；将重组质粒分别导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得相应的工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT；(2)双酶体系：同时将同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因串联插入到质粒pBlunt-E1上，重组质粒pBlunt-E1-HMT-MMT；将重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT-MMT；(3)三酶体系：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因串联插入质粒pBlunt-E1上，获得重组质粒pBlunt-E1-CGS-HMT-MMT，将重组质粒分别导入大肠杆菌中获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-HMT-MMT。

4.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌为共表达胱硫醚-γ-合酶和同型半胱氨酸甲基转移酶以及甲硫氨酸甲基转移酶的重组基因工程菌。

5.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌发酵培养方法为：将工程菌接种至发酵培养基中，在28℃、180rpm条件下进行发酵培养，获得含甲硫氨酸的发酵液，发酵液离心，分离纯化获得甲硫氨酸；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，NaS₂O₃ 16g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCO₃ 10g/L，FeSO₄0.01g/L，MnSO₄ 0.01g/L，ZnSO₄0.01g/L，溶剂为水，pH自然。

6.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌发酵前先进行诱导培养，具体如下：将重组基因工程菌接种于含有终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养过夜，取培养物以体积浓度1-2％的接种量转接于含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.5mM的IPTG，在25℃，140rpm下诱导培养14h，然后于4℃和5000rpm离心收集湿菌体，并用发酵培养基重悬湿菌体洗涤2次，将湿菌体以1g/50ml的量接种至发酵培养基进行发酵。