CN109055289A - 一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产L‑甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌按如下方法构建：应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术在大肠杆菌基因组中将L‑甲硫氨酸合成酶基因启动子分别替换为trc启动子，引入宿主菌基因组，筛选获得高产L‑甲硫氨酸的重组大肠杆菌；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ和metI敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH。提高L‑甲硫氨酸效价最高达到2.8g/L，副产物DAP显著降低60％以上(从1g/L降低到0.4g/L以下)。

Description

一种高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及分子生物学、合成生物学和代谢工程领域的相关技术，具体的说，涉及利用分子生物学技术构建重组表达质粒上调关键酶的表达量，对亲本菌株的调控系统以及代谢途径进行改造，提出全局搜索，基于功能模块化代谢网络及对模块间通量分配优化策略，系统解析L-甲硫氨酸生物合成的限制因素，对亲本菌株的代谢途径进行系统重编程逐层移除限制瓶颈，最终利用所获得的工程菌增强L-甲硫氨酸产量。
(二)背景技术
对动物而言，甲硫氨酸(methionine，又名蛋氨酸)是一种含硫的必需氨基酸，在正常细胞生理过程中发挥着重要作用。除了直接参与蛋白质合成，甲硫氨酸还参与各种甲基转移反应，还会影响硒和锌的生物可利用性。甲硫氨酸主要应用于动物饲料添加剂，保证动物营养的均衡性，提高动物对饲料的营养利用率，加快生长速度，缩短饲养周期。甲硫氨酸还可以直接用于治疗代谢失调如过敏和风湿热。每年全球的Met需求量高达百万吨，所以Met具有十分广阔的市场前景。
现有的Met生产方法是化学合成法，以丙烯醛、甲硫醇、氰化物等为原料，首先甲硫醇和丙烯醛反应生成3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛再与HCN、NH4HCO3合成海因，海因在KHCO3存在的条件下碱水解为甲硫氨酸钾盐，最后酸化得到(D,L)-Met，饲料中的D-Met进入动物体内必须经过代谢脱氨作用以及氨基转移作用首先转化成甲硫氨酸才能被正常利用。综合考虑甲硫氨酸的高吸收利用效率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵绿色生产甲硫氨酸受到越来越多的关注。
随着对微生物代谢细节信息的不断深入理解，以葡萄糖以及矿物质盐等廉价反应物为原料，以更低的成本利用微生物内合适的生物合成途径的可用性发酵制备具有生物活性的L-氨基酸表现出良好的前景。但是，由于野生型菌株因为自身的细胞经济性，胞内的氨基酸生物合成途径受到非常严格的调控。所以有效制造方法的重要条件是在制造预期氨基酸方面产量大幅增加(与亲本微生物相比较)的适当微生物。高产微生物的获得可以通过传统的突变/筛选及/或用新的代谢工程技术。在代谢工程改造中，特别是对于复杂的代谢途径，系统地解析代谢限制瓶颈是最大化发酵水平的一个重要前提。同时，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关联，不同的代谢节点具有不同的性质，往往要结合多种不同的方法才能真正地实现高产。
微生物体内的L-甲硫氨酸生物合成非常复杂，L-甲硫氨酸和L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸同属于天冬氨酸家族，L-天冬氨酸经过天冬氨酸半醛/天冬氨酸酰磷酸转化为L-高丝氨酸。然后在三个酶的催化下经过三步反应，包括(经由O-琥珀酰高丝氨酸及胱硫醚)用一个巯基(该巯基来自半胱氨酸)替代该分子上的羟基，而形成一个高半胱氨酸，再将该巯基加以甲基化后制得L-甲硫氨酸。该甲基供体是衍生自丝氨酸代谢作用。可见，甲硫氨酸的生物合成与天冬氨酸、丝氨酸及半管氨酸的生物合成关系紧密，所以其生物合成调控远较其他氨基酸复杂。除了主要合成途径(天冬氨酸-高丝氨酸-高半胱氨酸)之外，半胱氨酸的生物合成以及氧化态无机硫的固定，C1单位的代谢作用必须要加以最佳协调。但这种优化与通常情况下细胞为获得最大的生长速率的自我协调是矛盾的。基于以上理由，过去对甲硫氨酸的发酵生产尚未有深入细致的研究。但是随着技术理念的发展，以及近年来在丝氨酸及半胱氨酸代谢作用的最适化作用方面已经取得决定性进步，所以甲硫氨酸的发酵法生产也越来越具有可行性。
有关L-甲硫氨酸的发酵法生产，利用下列基因/等位基因可以实现L-甲硫氨酸高产：日本专利JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。metA等位基因编码O-高丝氨酸转琥珀酰酶，催化高丝氨酸和琥珀酰辅酶A合成O-琥珀酰高丝氨酸，该O-高丝氨酸转琥珀酰酶受到L-甲硫氨酸和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)的反馈抑制。通过上调metA的表达量，以及通过定点突变削弱其对L-甲硫氨酸以及SAM(S-腺苷甲硫氨酸)的敏感性，能够较大程度地提高甲硫氨酸的效价。日本专利JP 2000139471A中述及的metJ敲除，metJ基因编码L-甲硫氨酸代谢作用的核心调控因子，参与了L-甲硫氨酸合成代谢支路中几乎所有酶的转录负调控，因此敲除metJ基因有利于代谢支路中关键酶的表达量上调，最终提高发酵液中L-甲硫氨酸的效价。美国专利US 20090298135A1中述及的yjeH等位基因。yjeH等位基因编码的蛋白可能与L-甲硫氨酸分泌有关，该基因的表达上调可以有效提高发酵液中L-甲硫氨酸的效价。除此之外，还有很多关于丝氨酸生成(如serA(编码磷酸甘油酸脱氢酶)，serB(编码磷酸丝氨酸磷酸酶)，serC(编码磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶))，C1单位生成(如metF(编码亚甲基四氢叶酸还原酶)，gcvTHP(编码甘氨酸裂解酶系)，lpd(编码硫辛酰胺脱氢酶)，glyA(丝氨酸羟甲基转移酶)等)，半胱氨酸生成(如cysE(编码丝氨酸乙酰转移酶))，NADPH可用性(如pntAB(编码NAD(P)转氢酶)，udhA(编码NAD(P)转氢酶)等)等相关的有利于提高L-甲硫氨酸发酵效价的专利报道。
(三)发明内容
本发明的目的在于代谢工程和基因编辑技术，通过1)全局搜索中心代谢途径中限制L-甲硫氨酸生物合成的初级限制步骤，2)根据细胞表型变化，提高L-甲硫氨酸合酶和CH3-THF合酶活力，3)根据细胞表型变化，提高胞内O-琥珀酰高丝氨酸可用性，4)根据细胞表型变化，提高胞内丝氨酸可用性，在系统水平解析限制L-甲硫氨酸生物合成限制步骤，并逐步解除限制构建一种L-甲硫氨酸高产的大肠杆菌菌株，利用本发明的代谢工程菌株发酵生产L-甲硫氨酸。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案：
本发明提供一种高产L-甲硫氨酸产量的菌株，所述菌株按如下方法构建：(1)将L-甲硫氨酸合成酶基因启动子分别替换为trc启动子，获得替换启动子后的L-甲硫氨酸合成酶基因；所述L-甲硫氨酸合成酶基因包括：CH3-THF合成基因metF(Gene ID:948432)，高胱氨酸合成基因metBL(Gene ID:948433,948434)，蛋氨酸合酶基因metH(Gene ID:948522)，丝氨酸合成酶基因serA(Gene ID:945258)、serC(Gene ID:945527)、serB(Gene ID:948913)，CH2-THF合成基因glyA(Gene ID:947002)，O-乙酰高丝氨酸合成基因cysE(GeneID:948126)，硫源摄入基因cysPUWA(Gene ID:946883,946882,946881,946880)，半胱氨酸合酶基因cysK(Gene ID:946877)、cysM(Gene ID:946888)；(2)将步骤(1)所述的替换启动子后的L-甲硫氨酸合成酶基因引入宿主菌基因组，筛选获得高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ和metI敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH。
进一步，所述trc启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述O-乙酰高丝氨酸合成基因cysE突变为核苷酸序列SEQ ID NO.2所示cysEfbr突变体基因(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示)，再将启动子替换为trc启动子，或者所述丝氨酸合成酶基因serA突变为核苷酸序列SEQ ID NO.4所示serAfbr突变体基因(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)，所述serAfbr突变体启动子为原始serA启动子或trc启动子。
进一步，步骤(2)所述替换启动子的L-甲硫氨酸合成酶基因为下列之一：(1)metH；(2)metH和metF；(3)metH、metF和cysE。
进一步，步骤(2)宿主菌敲除lysA基因，即以将大肠杆菌E.coli W3110中metJ、metI和lysA基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH。
进一步，步骤(2)替换启动子的L-甲硫氨酸合成酶基因为下列之一：(1)metH、metF和cysE；(2)metH、metF、cysE和metBL；(3)metH、metF、cysE、serB和serC；(4)metH、metF、cysEfbr、serB和serC，所述cysEfbr核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；(5)metH、metF、cysE、serB、serC和glyA；(6)serAfbr、metH、metF、cysE、serB和serC，所述serAfbr核苷酸序列为SEQID NO.4所示、氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
进一步，宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ、metI和lysA基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
进一步，所述替换为trc启动子的L-甲硫氨酸合成酶基因为下列之一：(1)metH、metF、cysE、serB和serC；(2)metH、metF、cysEfbr、serB和serC；所述cysEfbr核苷酸序列为SEQID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；(3)metH、metF、cysE、serB、serC和glyA。构建获得最优菌株E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrcserB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
本发明还提供一种所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株产L-甲硫氨酸的应用，所述应用为：将所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株接种至含50mg/L Amp的MS培养基中，在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液分离纯化，获得L-甲硫氨酸；所述MS培养基终浓度组成：葡萄糖20g/l、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1mL/L微量元素溶液组成：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、2.5g/L Na3BO3、0.7g/LCoCl2·6H2O、0.25g/L CuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
进一步，所述重组基因工程菌株发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到MS培养基中培养。
本发明基于CRISPR介导的基因编辑和CRISPRi技术代谢工程策略，通过基因编辑上调L-甲硫氨酸合成途径的所有基因，并通过CRISPRi技术敲降中心代谢网络中与L-甲硫氨酸合成以外基因，筛选关键限制步骤：(1)用来自pTrc99A中的启动子，在基因组中置换L-甲硫氨酸合成途径里所有基因的野生型启动子，提高其表达量，筛选对L-甲硫氨酸合成有重要影响的基因。(2)转录出与基因组中特定基因特定位置互补配合的RNA的pTarget质粒文库，每个pTarget质粒转录得到的RNA与基因组中特定区域结合后能够招募没有核酸酶活性dCas9蛋白与RNA-DNA复合体结合，阻遏RNA聚合酶对相应基因的转录，从而降低相应基因的表达，筛选对L-甲硫氨酸合成有重要影响的基因。(3)CRISPR介导的基因编辑和CRISPRi技术进行全局搜索一级限速步骤，然后根据表型变化(包括生长，产物和副产物积累变化)判断限制L-甲硫氨酸产量的因素，找到二级及更高级的限速步骤，特别的，采用一种基于分支途径功能的模块化策略，将不同代谢分支上的基因进行集合，以减小搜索空间，最终逐层移除限速步骤，提高L-甲硫氨酸产量。
本发明改造了大肠杆菌的L-甲硫氨酸调控网络和运输系统，通过敲除L-甲硫氨酸负转录调控基因metJ，破坏甲硫氨酸摄入蛋白复合体MetD，基于质粒过表达对代谢终产物(甲硫氨酸和S-腺苷蛋甲硫氨酸)不敏感的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶基因metAfbr和L-甲硫氨酸分泌蛋白yjeH。通过用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列置换metH，metF和cysE的原有启动子和RBS序列，提高胞内CH3-THF供应和循环，以及半胱氨酸供应。通过敲除lysA基因或用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列置换metL或metBL原有启动子和RBS序列，提高胞内O-琥珀酰高丝氨酸的供应。通过用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列置换磷酸丝氨酸磷酸酶基因serB和磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶基因serC原有启动子和RBS序列，有效减少副产物二氨基庚二酸的积累。通过将来源于E.coli W3110的磷酸甘油酸脱氢酶基因serA基于质粒过表达，核苷酸序列如SEQ ID No.4，是对代谢终产物丝氨酸不敏感的突变体，增强胞内丝氨酸的供应，提高胞内半胱氨酸和CH3-THF供应并最终提高L-甲硫氨酸产量。
优选，本发明根据全局搜索的结果用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中同时置换了metH(编码L-甲硫氨酸合酶)和metF(编码5，10-甲基四氢叶酸还原酶)原有的启动子和RBS序列，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF/pTrc99A/metA*/yjeH。
优选，本发明同时用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中置换了半胱氨酸合成关键基因cysE(编码丝氨酸乙酰基转移酶)原有的启动子和RBS序列，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH。
优选，本发明敲除了lysA基因(编码二氨基庚二酸脱羧酶)，阻断了赖氨酸代谢支路，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH。
优选，本发明根据代谢产物的积累情况提出途径模块化策略，将L-甲硫氨酸生物合成途径基于各自的功能分成三个模块：O-琥珀酰高丝氨酸合成模块，半胱氨酸氨酸合成模块，CH3-THF合成模块。
优选，本发明用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中同时置换了serB(编码磷酸丝氨酸磷酸酶)和serC(编码磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶)原有的启动子和RBS序列，E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
本发明应用基因编辑技术在基因组中对cysE基因(编码丝氨酸乙酰基转移酶)进行了定点突变，核苷酸序列如SEQ ID No.2和氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，使其对相应的代谢终产物半胱氨酸不敏感，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
本发明应用基因编辑技术在基因组中对serA基因(编码磷酸甘油酸脱氢酶)进行了定点突变，核苷酸序列如SEQ ID No.4和氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，使其对相应的代谢终产物丝氨酸不敏感，构建构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA serAfbr Trc-metHTrc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
本发明用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中置换了serAfbr基因(编码对丝氨酸不敏感的磷酸甘油酸脱氢酶)原有的启动子和RBS序列，构建构建E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serAfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
本发明克隆了来源于E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA serAfbr Trc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH的serAfbr基因片段，序列如SEQ ID No.6所示，并用一步连接试剂盒连接到pTrc99A/metA*/yjeH上，构建pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr，转化到工程菌构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metHTrc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
本发明将pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr转化到工程菌，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
本发明用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中置换了glyA基因(编码对丝氨酸羟甲基转移酶)原有的启动子和RBS序列，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
与以往的发明不同，本发明除了考虑解除L-甲硫氨酸生物生成途径中关键酶的转录负调控，改造L-甲硫氨酸运输系统，尽可能削弱反馈调控外，进一步在基因组中增强了L-甲硫氨酸合酶基因metH和5，10-甲基四氢叶酸还原酶基因metF的表达量，进一步在基因组中增强了丝氨酸乙酰基转移酶基因cysE的表达量，L-甲硫氨酸效价从593.4mg/L提高到839.5mg/L。进一步敲除了lysA基因，L-甲硫氨酸效价最高可达1.9g/L。进一步对所有涉及半胱氨酸和甲基四氢叶酸合成相关基因进行叠加上调，证实应该有选择地上调相关的合成基因才能有效提高L-甲硫氨酸发酵效价，进一步提出基于功能的代谢途径模块化策略将L-甲硫氨酸生物合成途径分成三个模块，进一步在基因组中增强了磷酸丝氨酸磷酸酶基因serB和磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶基因serC的表达量，发现L-甲硫氨酸效价基本不变，但副产物DAP显著降低60％以上(从1g/L降低到0.4g/L以下)。进一步在基因组中对丝氨酸乙酰基转移酶基因cysE进行了定点突变，使丝氨酸乙酰基转移酶CysE对半胱氨酸不敏感，进一步在质粒上增强了对丝氨酸不敏感的磷酸甘油酸脱氢酶基因serAfbr的表达量，进一步在基因组中增强了丝氨酸羟甲基转移酶基因glyA的表达量，证实在serB和serC增强表达的基础上，当且仅当在质粒上提高serAfbr的表达量才能有效地提高L-甲硫氨酸效价最高达到2.8g/L。最终系统解析了限制L-甲硫氨酸生物合成的因素，并逐步移除限速步骤显著提高L-甲硫氨酸的发酵效价。
(四)附图说明
图1为原位基因组启动子置换操作流程；
图2为原位基因组启动子置换后菌株的OD600和L-甲硫氨酸相对效价变化柱形图；
图3为CRISPRi基因敲降操作流程；
图4为CRISPRi基因敲降后菌株的L-甲硫氨酸相对效价变化图；
图5为组合改造结果，A为OD600变化，B为L-甲硫氨酸效价变化；
图6为L-甲硫氨酸代谢途径模块化；
图7为随意组合上调模块II和III中参与基因表达量后L-甲硫氨酸相对效价的影响；
图8为模块II和III中关键基因glyA，serAfbr和cysEfbr表达增强对OD600、L-甲硫氨酸效价和二氨基庚二酸(DAP)积累的影响；
图9为重组质粒构建流程；
图10为模块II和III通量上调后OD600、L-甲硫氨酸效价和二氨基庚二酸(DAP)积累的影响。
图11为实施例19L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸含量图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：全局搜索—L-甲硫氨酸合成基因在基因组中进行原位启动子置换
(1)以E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH(Jiangfeng Huang etal.2016.Metabolic engineering of Escherichia coli for microbial production ofL-methionine.Biotechnology and Bioengineering.114:843-851)为出发菌株，采用全局搜索策略，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System.AppliedEnvironmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组中置换所有参与L-甲硫氨酸生物合成基因的原有启动子，涉及的基因以及相应的途径如表1所示，鉴定在出发菌株中影响L-甲硫氨酸的关键基因。
表1基因编辑涉及的基因及相应途径
(2)使用表2引物构建pTarget质粒。
表2构建用于启动子置换的pTarget质粒的引物
表2中的除pTarget R-common外的引物具有相同的结构特征，前8个碱基表示保护碱基和Bcu I酶切位点，加粗部分20个碱基表示与基因组同源的N20序列，斜体部分20个碱基与模版pTarget质粒(购自addgene)中N20后的序列相同，pTarget R-common引物前5个碱基为保护碱基，中间6个碱基为Bcu I酶切位点，最后13个碱基与模版pTarget质粒相同。用pTarget R-common引物与其余任意一条引物组合，以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，可以扩增获得表1所示基因对应的新的线性pTarget质粒片段，PCR产物经过Dpn I和Bcu I在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，再用T4连接酶连接10h转化到E.coli Top10，壮观酶素平板筛选，测序验证获得表1所示基因相应的pTarget质粒，用于后续基因编辑。
(3)使用表3引物扩增donor DNA片段。
表3构建donor DNA的引物序列
表3中的除TrcV外的引物具有相同的结构特征，引物1是待上调基因原始启动子-35区上游500bp位置的一段20nt的引物，引物2中下划线部分序列为Trc启动子序列，其余部分与基因原始启动子-35区上游20nt的序列互补，引物3中下划线部分序列为Trc启动子序列，其余部分与基因开放阅读框的前20nt相同，引物4与距离基因起始密码子(ATG)500bp的一段20nt序列互补，引物V为基因原始启动子-35区上游1000bp位置一段20nt的引物，引物TrcV为Trc启动子-10到-35区之间的一段互补序列。以E.coli W3110基因组为模版，引物1与引物2为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，引物3和引物4为引物扩增获得donorDNA的下游部分(F2)，胶回收纯化PCR片段，然后以引物1和引物4为引物，F1和F2为模版，拼接PCR扩增获得表3所示基因的完整donor DNA片段，用于后续基因编辑。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110ΔmetJΔmetI(Jiangfeng Huang et al.2016.Metabolic engineering of Escherichia coli formicrobial production of L-methionine.Biotechnology and Bioengineering.114:843-851)中，单克隆接种到LB试管中，30℃过夜培养，再以体积浓度1％的接种量接种到含50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm，30℃培养至OD600 0.4～0.6，4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition,99-102)的描述。
(6)取5μl表3基因对应的donor DNA，1μl表2基因对应的pTarget质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1ml LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5ml离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h，以引物V和TrcV为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段1000bp左右的片段，则证明是阳性菌落，构建一系列不同基因型的菌株(表4)。
表4启动子置换构建的新型菌株
实施例2：全局搜索—L-甲硫氨酸合成基因在基因组中进行原位启动子置换菌株的摇瓶发酵测试
将实施例1构建的一系列不同基因型菌株(如表4所示)接种到10ml含50mg/l的Amp的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物，其中E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH为阴性对照。8-12h后，接种1ml预培养物到装有20ml含50mg/L Amp的MS培养基的500ml摇瓶中。然后在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养48h，发酵结束后取1ml发酵液测定OD600；取1ml发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释100倍，用全自动氨基酸分析仪(SYKAM S-433D，德国)分析氨基酸效价。OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图2所示，筛选得到metH，cysPUWAM，cysK，cysE和serC上调能够有效提高发酵效价(20％)。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、CaCO310g/L(单独灭菌)，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1mL/L微量元素溶液组成：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、2.5g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2·6H2O、0.25g/L CuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3：全局搜索—中心代谢途径中不参与L-甲硫氨酸蛋氨酸合成的基因表达量下调
为了在基因组中实现对中心代谢途径中不参与L-甲硫氨酸蛋氨酸生物合成的基因表达量下调，以E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH为出发菌，实施了CRISPR-dCas9介导的序列特异性基因表达干扰技术(CRISPRi)(Qi LS.et al.RepurposingCRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of GeneExpression.Cell.2013.152(5):1173-1183)，该技术可以使dCas9蛋白结合到基因编码序列的特定位置，通过阻遏RNA聚合酶的移动而降低基因的表达量。为了实现该过程，使用了下述引物(表6)用于构建pTarget质粒，pdCas质粒。
使用CRISPRi技术对中心代谢途径中不参与L-甲硫氨酸蛋氨酸生物合成的基因进行敲降，涉及的基因及相应的途径如表5所示，构建一系列不同基因型的菌株，筛选对L-甲硫氨酸生物合成具有重要影响的基因，解析限制L-甲硫氨酸生物合成的瓶颈。
表5 CRISPRi涉及的基因及相应的途径
表6用于CRISPRi筛选的pTarget质粒的引物
表6中的引物pTarget R-common与表2的pTarget R-common序列相同，除pTargetnull以外其余引物的结构与表2中的描述相同。pTarget null引物中N20序列缺失，目的是让转录出来的RNA不能结合到基因组中，作为阴性对照。用pTarget R-common引物与其余引物分别组合，以pTarget F(Addgene Plasmid#62226)为模版，可以扩增获得表6基因对应的新的线性pTarget质粒片段，PCR产物经过Dpn I和Bcu I在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，再用T4连接酶连接10h转化到E.coli Top10，壮观酶素平板筛选，测序验证获得相应的pTarget质粒，然后pTarget和dCas9质粒共转化到E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH中，用含0.05mg/L氨苄青霉素，0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的三抗LB平板筛选，阳性菌株(表7所示)用于后续CRISPRi筛选。
表7应用CRISPRi技术构建的新型菌株
实施例4：全局搜索—中心代谢途径中不参与L-甲硫氨酸蛋氨酸合成的基因表达量下调菌株的摇瓶测试
将实施例3构建的一系列生产菌株(如表7所示)按照实施例2方法进行摇瓶测试。发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图4所示。结果表明这些基因敲降对L-甲硫氨酸效价的影响较小，仅有ptsI，ptsG，crr，ptsH和dapE能够提高L-甲硫氨酸效价(～20％)。但是进一步研究表明，CRISPRi系统本身可能引起代谢负担而减少L-甲硫氨酸效价，如图5所示，提示在本案例中CRISPRi系统本身只能作为初筛工具，不能直接应用。因此我们选择将ptsI，ptsG，crr和ptsH等四个基因敲除并考察其对菌株生长和L-甲硫氨酸效价的影响。如图5所示，基因敲除也不能提高L-甲硫氨酸效价，基于以上结果我们认为在限速因子暂时没有被包含在不参与L-甲硫氨酸合成的代谢途径中，或者对于其余对L-甲硫氨酸效价有提高作用的必需基因还需要进一步用更加精细的方式进行调控。
实施例5：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli的正常生理代谢过程中，四氢叶酸(THF)和甲基四氢叶酸(CH3-THF)的平衡具有十分重要的作用，如图2所示，在E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH中metF上调会显著影响细胞生长和L-甲硫氨酸生产，我们推测metF上调能够显著增加胞内CH3-THF并降低THF含量，而迄今胞内消耗CH3-THF的反应只有L-甲硫氨酸生物合成的最后一步由L-甲硫氨酸合酶MetH催化的甲基化反应。在实施例1的基础上，在E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH菌株中同时上调metF和metH基因，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF/pTrc99A/metA*/yjeH，重新恢复胞内THF/CH3-THF平衡，恢复细胞生长并提高L-甲硫氨酸的发酵效价。用与实施例1相同的方法，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例6：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中L-甲硫氨酸生物合成过程中，半胱氨酸的供应非常重要，而cysE基因(编码丝氨酸乙酰基转移酶)是决定半胱氨酸合成通量的关键基因。在实施例5构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF/pTrc99A/metA*/yjeH基础上上调cysE基因，增强半胱氨酸供应，提高L-甲硫氨酸的发酵效价，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetITrc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH。用与实施例1相同的方法，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetI Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例7：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中赖氨酸，L-甲硫氨酸和苏氨酸都属于天冬氨酸族氨基酸，三条途径之间在代谢通量上存在竞争。在实施例6构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metHTrc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH基础上敲除lysA基因，用与实施例1相同的方法，所用引物如表8所示，用VlysA up和VlysA down为引物进行菌落PCR验证阳性克隆，若能扩增出1400bp左右的条带变为阳性克隆。最后测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH。
表8 lysA敲除用的引物
实施例8：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrc-metBL/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中，葡萄糖经过代谢转化为O-琥珀酰高丝氨酸的限速因子是天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双工能酶(由thrA，metL编码)的活力，而metL与metB在同一个基因座。在实施例7构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH基础上上调metBL，增强O-琥珀酰高丝氨酸的供应，最终提高L-甲硫氨酸的发酵效价，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-metBL/pTrc99A/metA*/yjeH。用与实施例1相同的方法，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-metBL/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例9组合上调菌株的摇瓶测试
将实施例5-8构建的一系列生产菌株(如表9所示)，以E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH为对照，按照实施例2的描述进行摇瓶测试。发酵48小时后OD600和发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图6所示。结果显示metH，metF和cysE组合上调能够在一定程度上促进L-甲硫氨酸合成(从初始的593.4mg/L提高到839.3mg/L)，且对OD600影响不大。但敲除lysA基因以后，OD600下降近50％，L-甲硫氨酸效价提高约150％(1.9g/L)。进一步上调metBL又使L-甲硫氨酸效价出现下降(1.5g/L)，表明从高丝氨酸到L-甲硫氨酸的代谢通路上存在限速步骤，很可能是L-半胱氨酸和CH3-THF的供应。
表9组合上调构建的新型菌株
实施例10L-甲硫氨酸代谢途径的模块化
根据实施例9的结果，经过组合上调，L-甲硫氨酸效价显著提高，但同时也出现了二氨基庚二酸(赖氨酸前体)，高丝氨酸和苏氨酸的积累，表明L-甲硫氨酸合成途径中最后三步反应是限制L-甲硫氨酸效价的限速步骤，而且进一步研究表明并不是催化这三步反应的酶活力不足，而是相应的辅底物半胱氨酸和CH3-THF供应不足引起的。要提高胞内半胱氨酸和CH3-THF的供应，涉及众多基因，为了缩小搜索空间，找到限速步骤，不考虑ATP，NADPH等辅因子的供应情况，根据不同代谢分支的功能我们将L-甲硫氨酸代谢途径分成3个模块，模块化方式如图7所示。模块I表示从葡萄糖到O-琥珀酰高丝氨酸的代谢途径，模块II表示从3-磷酸甘油酸到半胱氨酸的代谢途径，模块III表示从丝氨酸出发的C1单位循环。
实施例11顺序组合上调模块II和III参与基因表达量
根据实施例9，在E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH的基础上，我们顺序组合上调了参与L-半胱氨酸和CH3-THF生物合成的基因，构建了一系列菌株如表10所示。按照实施例2的描述进行摇瓶测试。发酵48小时后发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图8所示，顺序叠加组合上调模块II和III参与基因表达量都会显著降低L-甲硫氨酸效价，证明模块II和III的代谢通量调控机制比较复杂，不仅仅受酶的表达量控制。
表10顺序组合上调模块II和III参与基因表达量构建的新型菌株
实施例12构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中，为了要增加胞内丝氨酸的合成，serA，serB，serC基因都需要上调。在实施例7构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE/pTrc99A/metA*/yjeH基础上，同时上调serB和serC，提高胞内丝氨酸可用性，最终提高L-甲硫氨酸发酵效价，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。用与实施例1相同的方法，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例13构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中，半胱氨酸合成途径中cysE基因(编码丝氨酸乙酰基转移酶)会受到代谢终产物半胱氨酸的反馈抑制。在实施例12构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysATrc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH基础上，使用基因编辑技术使cysE基因发生点突变(突变引物见表11)，突变为cysEfbr(核苷酸序列如SEQID No.2所示，A499G，G733A；氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，T167A，G245S)，突变后的丝氨酸乙酰基转移酶的活力对胞内半胱氨酸浓度敏感型降低。用与实施例1相同的方法，使用的引物如表11所示。以cysEfbr2-1为测序引物，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
表11 cysE定点突变所用的引物
实施例14构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrc-serB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中，丝氨酸羟甲基转移酶(由glyA基因编码)是胞内亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)的主要来源。在实施例11构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metHTrc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH基础上上调glyA基因，提高胞内CH2-THF可用性，最终提高L-甲硫氨酸发酵效价，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH。用与实施例1相同的方法，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysATrc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例15构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA serAfbr Trc-metH Trc-metFTrc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中，丝氨酸合成途径中serA基因(编码磷酸甘油酸脱氢酶)会受到代谢终产物丝氨酸的反馈抑制。在实施例12构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metHTrc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH基础上，使用基因编辑技术使serA基因发生点突变(突变引物见表12，突变后serAfbr核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，C1030G，A1031C，A1036G，A1037C，A1090G，A1091C；氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，H344A，N346A，N364A)，突变后的磷酸甘油酸脱氢酶的活力对胞内丝氨酸浓度敏感型降低。用与实施例1相同的方法，使用的引物如表12所示。以serAfbr2-1为测序引物，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH serAfbr Trc-metF Trc-cysE Trc-serBTrc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
表12 serA定点突变所用的引物
实施例16构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysETrc-serAfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH
在实施例15构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH serAfbr Trc-metFTrc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH的基础上对serAfbr进行原位启动子置换。用与实施例1相同的方法，测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysATrc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serAfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例17cysEfbr，glyA，serAfbr筛选摇瓶测试
将实施例12构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH(图9中IJAHFEBC/pA*H)，实施例13构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH(图9中IJAHFEfbrBC/pA*H)，实施例14构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH(图9中IJAHFEBCgA/pA*H)，实施例16构建的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serAfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH(图9中IJAHFEAfbrBC/pA*H)按照实施例2的描述进行摇瓶测试，以E.coliW3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH为对照。发酵48小时后测定了OD600，发酵液上清中的L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸含量，结果如图9所示。结果表明，E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH的OD600，L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸含量基本没有变化。E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serAfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH的L-甲硫氨酸效价出现了显著下降，而E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysATrc-metH Trc-metF Trc-cysEfbr Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH的OD600，L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸效价极显著地下降。
实施例18重组质粒pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr构建
为了进一步提高胞内丝氨酸的供应，需要进一步提高serAfbr基因的表达量。将E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA serAfbr Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serBTrc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH在LB平板(2％agar，下同)上划线分离单菌落，挑取单克隆接种到LB试管中，200rpm，37℃培养过夜。取1.5ml过夜培养的菌液，12000rpm，室温离心1min，弃上清，重复操作一次。获得菌体后，用SPIN Kit for Soil(MPBiomedicals)提取菌体基因组DNA，0.9％琼脂糖凝胶电泳验证。
E.coli W3110来源的丝氨酸乙酰基转移酶基因serAfbr的核苷酸序列见SEQ IDNo.6，设计两条特异性引物P1和P2(见表13)，以E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA serAfbrTrc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH基因组为模板扩增获得serAfbr基因。设计两条特异性引物P3和P4(见表13)，以质粒pTrc99A/metA*/yjeH为模版扩增获得线性pTrc99A/metA*/yjeH片段，经过Dpn I消化后Clean up回收。最后将serAfbr片段一步克隆到pTrc99A/metA*/yjeH构建pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。详细构建过程如图10所示。将该质粒转化到宿主菌中构建获得E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysATrc-metH Trc-metF Trc-cysE TrcserB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr和E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE TrcserB Trc-serC Trc-glyA/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
表13构建pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr所用的引物
实施例19模块II和III中不同组合上调新菌株的摇瓶测试
将实施例12，14，16，18中新构建的一系列生产菌株(如表14所示)按照实施例2的描述进行摇瓶测试。发酵48小时以后测定OD600，发酵液上清中的L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸含量，结果如图11所示。结果显示，E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr(IJAHFEBC/pA*HAm)L-甲硫氨酸效价相比于对照(IJAEFH/pA*H)能够显著提高(最高达到2.8g/L)，同时OD600基本不变，副产物二氨基庚二酸仍然维持在较低的水平。
表14模块II和III中不同组合上调新菌株
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，如以其他属于大肠杆菌属的微生物作为出发菌株，对另一套摄入系统MetP的破坏，其他分泌因子(如ygaZH)的表达上调，硫源的摄入和还原增强，C1单位的供应增强，ATP和NADPH等辅因子的供应增强，以及发酵过程优化、补料工艺开发均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 822
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atgtcgtgtg aagaactgga aattgtctgg aacaatatta aagccgaagc cagaacgctg 60
gcggactgtg agccaatgct ggccagtttt taccacgcga cgctactcaa gcacgaaaac 120
cttggcagtg cactgagcta catgctggcg aacaagctgt catcgccaat tatgcctgct 180
attgctatcc gtgaagtggt ggaagaagcc tacgccgctg acccggaaat gatcgcctct 240
gcggcctgtg atattcaggc ggtgcgtacc cgcgacccgg cagtcgataa atactcaacc 300
ccgttgttat acctgaaggg ttttcatgcc ttgcaggcct atcgcatcgg tcactggttg 360
tggaatcagg ggcgtcgcgc actggcaatc tttctgcaaa accaggtttc tgtgacgttc 420
caggtcgata ttcacccggc agcaaaaatt ggtcgcggta tcatgcttga ccacgcgaca 480
ggcatcgtcg ttggtgaagc ggcagtgatt gaaaacgacg tatcgattct gcaatctgtg 540
acgcttggcg gtacgggtaa atctggtggt gaccgtcacc cgaaaattcg tgaaggtgtg 600
atgattggcg cgggcgcgaa aatcctcggc aatattgaag ttgggcgcgg cgcgaagatt 660
ggcgcaggtt ccgtggtgct gcaaccggtg ccgccgcata ccaccgccgc tggtgtgcct 720
gcgcgcatcg taagtaaacc agacagcgat aagccatcaa tggatatgga ccagcatttc 780
aacggtatta accatacatt tgagtatggg gatgggatct aa 822
<210> 3
<211> 273
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu
1 5 10 15
Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His
20 25 30
Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met
35 40 45
Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg
50 55 60
Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp
85 90 95
Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln
100 105 110
Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu
115 120 125
Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile
130 135 140
His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr
145 150 155 160
Gly Ile Val Val Gly Glu Ala Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile
165 170 175
Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg
180 185 190
His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile
195 200 205
Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser
210 215 220
Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro
225 230 235 240
Ala Arg Ile Val Ser Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met
245 250 255
Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly
260 265 270
Ile
<210> 4
<211> 1233
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60
caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120
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gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600
ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660
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ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780
gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840
ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900
caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960
acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020
atgcacatcg ccgaggcccg tccaggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgcggag 1080
cagggtgtag gcattgcggc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140
attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200
ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233
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<211> 410
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val
1 5 10 15
Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr
20 25 30
Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys
35 40 45
Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly
65 70 75 80
Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys
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100 105 110
Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro
115 120 125
Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly
145 150 155 160
His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr
165 170 175
Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr
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Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser
195 200 205
Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys
210 215 220
Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
225 230 235 240
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys
245 250 255
His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr
260 265 270
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275 280 285
Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile
290 295 300
Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser
305 310 315 320
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325 330 335
Gly Arg Arg Leu Met His Ile Ala Glu Ala Arg Pro Gly Val Leu Thr
340 345 350
Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Gly Ile Ala Ala Gln
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Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile
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<212> DNA
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cgacgaagac gttgccgaaa aagcgctgca ggcaatgaaa gctattccgg gtaccattcg 1260
cgcccgtctg ctgtactaa 1279

Claims (10)

1.一种高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌按如下方法构建：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术在大肠杆菌基因组中将L-甲硫氨酸合成酶基因启动子分别替换为trc启动子，获得替换启动子后的L-甲硫氨酸合成酶基因；所述L-甲硫氨酸合成酶基因包括：CH3-THF合成基因metF，高胱氨酸合成基因metBL，蛋氨酸合酶基因metH，丝氨酸合成酶基因serA、serC、serB，CH2-THF合成基因glyA，O-乙酰高丝氨酸合成基因cysE，硫源摄入基因cysPUWA，半胱氨酸合酶基因cysK、cysM；(2)将步骤(1)替换启动子后的L-甲硫氨酸合成酶基因引入宿主菌基因组，筛选获得高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ和metI敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH。
2.如权利要求1所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于所述trc启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于所述O-乙酰高丝氨酸合成基因cysE突变为核苷酸序列SEQ ID NO.2所示cysEfbr突变体基因，或者所述丝氨酸合成酶基因serA突变为核苷酸序列SEQ ID NO.4所示serAfbr突变体基因，所述serAfbr突变体启动子为原始serA启动子或trc启动子。
4.如权利要求1所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于步骤(1)替换为trc启动子的L-甲硫氨酸合成酶基因为下列之一：(1)metH；(2)metH和metF；(3)metH、metF和cysE。
5.如权利要求1-4之一所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于步骤(2)宿主菌敲除lysA基因。
6.如权利要求5所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于步骤(1)替换为trc启动子的L-甲硫氨酸合成酶基因为下列之一：(1)metH、metF和cysE；(2)metH、metF、cysE和metBL；(3)metH、metF、cysE、serB和serC；(4)metH、metF、cysEfbr、serB和serC，所述cysEfbr核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；(5)metH、metF、cysE、serB、serC和glyA；(6)serAfbr、metH、metF、cysE、serB和serC，所述serAfbr核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
7.如权利要求6所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ、metI和lysA基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH/serAfbr。
8.如权利要求7所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株，其特征在于所述替换为trc启动子的L-甲硫氨酸合成酶基因为下列之一：(1)metH、metF、cysE、serB和serC；(2)metH、metF、cysEfbr、serB和serC；所述cysEfbr核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；(3)metH、metF、cysE、serB、serC和glyA。
9.一种权利要求1所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株产L-甲硫氨酸的应用，其特征在于所述应用为：将所述高产L-甲硫氨酸产量的菌株接种至含50mg/L Amp的MS培养基中，在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清，获得L-甲硫氨酸粗品；所述MS培养基终浓度组成：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1mL/L微量元素溶液组成：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、2.5g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2·6H2O、0.25g/L CuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述重组基因工程菌株发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到MS培养基中培养。
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