CN105886449B - 一种重组大肠杆菌及其生产l-甲硫氨酸的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌及其生产L‑甲硫氨酸的应用，所述重组大肠杆菌构建方法为：将大肠杆菌的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因和/或thrB基因构建而成；所相比较于出发菌株E.coli W3110几乎不能在胞外积累L‑甲硫氨酸(<50mg/l)，本发明重组大肠杆菌在含有20ml培养基的摇瓶发酵时最高产量这里可达4.083g/l，在3L工作体积的5L发酵罐中最高效价可达9.752g/l。

Description

一种重组大肠杆菌及其生产L-甲硫氨酸的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种L-甲硫氨酸的制备，特别涉及利用重组大肠杆菌制备L-甲硫氨酸的应用。
(二)背景技术
甲硫氨酸(methionine，以下简称Met)，又名蛋氨酸，是脊椎动物必需的唯一一种含硫氨基酸，Met参与多种生理代谢过程，Met缺乏会导致多种疾病。在动物饲料制造行业，为了保证动物营养的均衡性，提高动物对饲料的营养利用率，加快生长速度，缩短饲养周期，一般会添加5％的Met。目前，每年的Met需求量高达数十万吨，因此Met具有十分广阔的市场前景。
现有的Met生产方法是化学合成法，以丙烯醛、甲硫醇、氰化物等为原料，首先甲硫醇和丙烯醛反应生成3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛再与HCN、NH4HCO3合成海因，海因在KHCO3存在的条件下碱水解为甲硫氨酸钾盐，最后酸化得到(D,L)-Met，饲料中的D-Met进入动物体内必须经过代谢脱氨作用以及氨基转移作用首先转化成L-Met才能被正常利用。
随着对微生物代谢细节信息的不断深入理解，以葡萄糖以及矿物质盐等廉价反应物为原料，以更低的成本利用微生物内合适的生物合成途径的可用性发酵制备具有生物活性的L-氨基酸表现出良好的前景。但是，由于野生型菌株因为自身的细胞经济性，胞内的氨基酸生物合成途径受到非常严格的反馈调控。所以有效制造方法的重要条件是在制造预期氨基酸方面产量大幅增加(与亲本微生物相比较)的适当微生物。高产微生物的获得可以通过传统的突变/筛选及/或用新的代谢工程技术。在代谢工程技术中，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关联，不同的代谢节点具有不同的性质，首先需要识别可以引起氨基酸高产的基因或等位基因。然后将该基因/等位基因引入微生物菌株内或利用分子生物学技术将其加以失活，以实现相应的氨基酸高产。但是往往要结合多种不同的方法才能真正地实现高产。
微生物体内的L-Met生物合成非常复杂，L-Met和L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸同属于天冬氨酸家族，L-天冬氨酸经过天冬氨酸半醛/天冬氨酸酰磷酸转化为L-高丝氨酸。然后在三个酶的催化下经过三步反应，包括(经由O-琥珀酰高丝氨酸及胱硫醚)用一个巯基(该巯基来自半胱氨酸)替代该分子上的羟基，而形成一个高半胱氨酸，再将该巯基加以甲基化后制得L-Met。该甲基是衍生自丝氨酸代谢作用。可见,L-Met的生物合成与天冬氨酸、丝氨酸及半管氨酸的生物合成关系紧密，所以其生物合成调控远较其他氨基酸复杂。除了主要合成途径(天冬氨酸-高丝氨酸-高半胱氨酸)之外，半胱氨酸的生物合成以及无机硫的固定，C1单位的代谢作用必须要加以最佳协调。基于以上理由，过去对L-Met的发酵生产尚未有深入细致的研究。但是随着技术理念的发展，以及近年来在丝氨酸及半胱氨酸代谢作用的最适化作用方面已经取得决定性进步，所以L-Met的发酵法生产也越来越具有可行性。
有关L-Met的发酵法生产，利用下列基因/等位基因可以实现L-Met高产：日本专利JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。metA等位基因编码O-高丝氨酸转琥珀酰酶，催化高丝氨酸和琥珀酰辅酶A合成O-琥珀酰高丝氨酸，该O-高丝氨酸转琥珀酰酶受到L-Met和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)的反馈抑制。通过上调metA的表达量，以及通过定点突变削弱其对L-Met以及SAM(S-腺苷甲硫氨酸)的敏感性，能够较大程度地提高L-Met的效价。日本专利JP2000139471A中述及的metJ敲除，metJ基因编码L-Met代谢作用的核心调控因子，参与了L-Met合成代谢支路中几乎所有酶的转录负调控，因此敲除metJ基因有利于代谢支路中关键酶的表达量上调，最终提高发酵液中L-Met的效价。美国专利US 20090298135A1中述及的yjeH等位基因。yjeH等位基因编码的蛋白可能与L-Met分泌有关，该基因的表达上调可以有效提高发酵液中L-Met的效价。除此之外，还有很多关于C1单位生成(如metF(编码亚甲基四氢叶酸还原酶),gcvTHP(编码甘氨酸裂解酶系),lpd(编码硫辛酰胺脱氢酶),glyA(丝氨酸羟甲基转移酶)等)，半胱氨酸生成(如cysE(编码丝氨酸乙酰转移酶))，NADPH可用性(如PntAB(编码NAD(P)转氢酶),UdhA(编码NAD(P)转氢酶)等)等相关的有利于提高L-Met发酵效价的专利报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种重组大肠杆菌及其在制备L-甲硫氨酸中的应用，本发明通过1)解除关键酶的转录负调控，2)增强目标产物的分泌和/或削弱目标产物的重吸收，3)提高胞内目标代谢产物代谢途径的代谢通量，构建一种L-Met高产的大肠杆菌菌株，并利用本发明的代谢工程菌株发酵生产L-Met。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌构建方法为：将大肠杆菌的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因和/或thrB基因构建而成；所述metA*基因是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第881为丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，获得突变O-高丝氨酸琥珀酰转移酶基因metA*，核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，所述yjeH基因核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，lysA基因核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，thrB基因核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。
进一步，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因构建而成。
进一步，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除thrB基因构建而成。
进一步，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因和thrB基因构建而成。
进一步，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌为E.coli W3110为出发菌株。
本发明还提供一种所述重组大肠杆菌在生成L-甲硫氨酸中的应用，具体所述的应用为：将重组大肠杆菌接种到含50mg/L的Amp的LB培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，将培养液以体积浓度5％的接种量接种到含50mg/L的Amp的MS培养基中，添加终浓度为100μmol/L IPTG，在30±2℃、100～500rpm(优选30℃、150rpm)培养发酵48h，发酵结束后，获得含L-甲硫氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得L-甲硫氨酸；所述MS培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L、1ml/L微量元素溶液，溶剂为水，pH值自然；其中微量元素溶液组成为：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、2.5g/LNa3BO3、0.7g/L CoCl2·6H2O、0.25g/L CuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为水；当重组大肠杆菌敲除lysA时，向MS培养基中添加终浓度0.02g/L的L-赖氨酸；当重组大肠杆菌敲除thrB基因时，向MS培养基中添加终浓度为0.8g/L的L-苏氨酸；当重组大肠杆菌同时敲除lysA基因和thrB基因时，向培养基中添加终浓度0.02g/L的L-赖氨酸和终浓度为0.8g/L的L-苏氨酸。
本发明以E.coli W3110为出发菌株，首先使用基因敲除技术构建了E.coli W3110ΔmetJ。然后定点突变技术和DNA重组技术从E.coli W3110的基因组中克隆并突变获得抗反馈抑制的O-高丝氨酸琥珀酰转移酶基因metA*，同时也克隆了L-Met输出蛋白基因yjeH，构建了重组表达质粒pTrc99A/metA*/yjeH，并将其转化到宿主菌E.coli W3110ΔmetJ中获得菌株E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH。在此基础上，本发明敲除了与E.coliW3110摄入L-Met相关的基因metI(编码甲硫氨酸透酶，与甲硫氨酸结合酶，ATP合酶共同组成甲硫氨酸摄入系统)，破坏摄入与分泌的平衡，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH。在此基础上，本发明敲除了参与赖氨酸生物合成的关键基因lysA(编码二氨基庚二酸脱羧酶)或参与苏氨酸生物合成的关键基因thrB(编码高丝氨酸激酶)，切断了赖氨酸生物合成支路或苏氨酸生物合成支路，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH和E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH。在此基础上，本发明同时敲除了参与赖氨酸生物合成的关键基因lysA(编码二氨基庚二酸脱羧酶)和参与苏氨酸生物合成的关键基因thrB(编码高丝氨酸激酶)，切断了赖氨酸生物合成支路和苏氨酸生物合成支路，构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysAΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH。
构建获得的菌株接入MS培养基中，对于赖氨酸缺陷菌添加0.02g/l的L-赖氨酸，对于苏氨酸缺陷菌添加0.8g/l的L-苏氨酸，Amp的工作浓度为50mg/L，IPTG的工作浓度为100μmol/L，30℃发酵48h生产L-Met，在含有20ml培养基的摇瓶发酵时最高产量这里可达4.083g/l，在3L工作体积的5L发酵罐中最高效价可达9.752g/l。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：与以往的发明不同，本发明除了考虑解除L-甲硫氨酸生物生成途径中关键酶的转录负调控，上调部分关键酶及分泌因子外，还考虑了削弱L-甲硫氨酸摄入系统，切断竞争代谢支路，进一步实现胞内代谢物流向L-甲硫氨酸代谢支路调动的最大化，以及减少L-甲硫氨酸在胞内的积累，尽可能削弱反馈调控，最终提高L-甲硫氨酸的发酵效价；相比较于出发菌株E.coli W3110几乎不能在胞外积累L-甲硫氨酸(<50mg/l)，本发明重组大肠杆菌在含有20ml培养基的摇瓶发酵时最高产量这里可达4.083g/l，在3L工作体积的5L发酵罐中最高效价可达9.752g/l。
(四)附图说明
图1为重组表达质粒的构建流程；
图2为重组表达质粒的表达验证；
图3为最优高产菌株的发酵进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述亲本菌株E.coli W3110保藏于耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli GeneticStock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1,US 2010/0248311 A1中公开。
实施例1：构建表达重组质粒pTrc99A/metA*
将E.coli W3110在LB平板(2％琼脂，下同)上划线分离单菌落，挑取单克隆接种到LB试管中，200rpm，37℃培养过夜。取1.5ml过夜培养的菌液，12000rpm，室温离心1min，弃上清，重复操作一次。获得菌体后，用SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)提取E.coli W3110基因组DNA，0.9％琼脂糖凝胶电泳验证。
E.coli W3110来源的O-高丝氨酸琥珀酰转移酶基因metA是L-甲硫氨酸合成支路的第一个关键酶，其核苷酸序列见SEQ ID No.1，氨基酸序列见SEQ ID No.2，设计两条特异性引物P1和P2(见表1)，以E.coli W3110基因组为模板扩增获得metA基因，上下游分别带有Nco I和Sac I两个酶切位点，胶回收纯化后将metA基因克隆到pGEM-T easy上，获得pGEM-Teasy/metA。
根据报道，metA881th A->G有利于降低其对L-Met的敏感性，从而抵抗反馈抑制，核苷酸序列见SEQ ID No.3，氨基酸序列见SEQ ID No.4(SEQ ID No.2氨基酸第881位A突变为G)。因此设计引物P3和P4(见表1)对pGEM-T easy/metA进行定点突变，具体流程参考(Current Protocols in Protein Science.2011,26.6.1-26.6.10；AnalyticalBiochemistry.2008,375:376-378)的描述，获得pGEM-T easy/metA*。用Nco I和Sac I处理pTrc99A和pGEM-T easy/metA*，胶回收纯化后用T4DNA ligase连接，获得重组表达质粒pTrc99A/metA*。
实施例2：构建表达重组质粒pTrc99A/metA*/yjeH
E.coli W3110yjeH基因是L-甲硫氨酸的重要分泌因子，其核苷酸序列见SEQ IDNo.5，氨基酸序列见SEQ ID No.6，设计特异性引物P5，P6(见表1)，以E.coli W3110基因组为模板(见实施例1)扩增获得yjeH基因，上下游分别带有BamH I和Hind III两个酶切位点，P5的BamH I位点和yjeH的起始密码子ATG之间加一段RBS序列：AAGGAGATATAC。胶回收纯化后，连接pGEM-T easy(同实施例1)后测序，结果表明克隆到的yjeH序列和GenBank公布的序列一致。用Sac I和Hind III处理pGEM-T easy/yjeH和pTrc99A/metA*后T4DNA ligase连接，构建获得pTrc99A/metA*/yjeH重组表达质粒。
实施例3：构建E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中metJ基因与L-Met生物合成有十分重要的作用，所以本发明首先要构建一个metJ基因敲除菌，解除其对L-Met生物合成途径中众多关键酶的转录抑制。基因敲除技术参考(Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology.2006)的描述，具体过程如下：
为了敲除E.coli W3110中的metJ基因，设计引物P7，P8(见表1)扩增获取线性打靶片段，胶回收纯化后，再经过一步醇沉浓缩，使DNA浓度>1μg/μl。
将pKD46转化到E.coli W3110中，单克隆接种到LB试管中，30℃过夜培养，再以体积浓度1％的接种量接种到含50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并加入500μl 1mol/l的L-阿拉伯糖，150rpm，30℃培养至OD600 0.4～0.6，4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition,99-102)的描述。
取5μl线性打靶片段与40μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mlLB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5ml离心管中，37℃复苏2-3h后涂布含0.05mg/l Kan(卡那霉素)的LB平板，37℃倒置培养12-16h。
根据GenBank公布的序列，设计两条位于metJ基因外侧的引物P9，P10(见表1)，以及位于kan抗性基因内部的引物k1和k2(见表1)，以P9和k2为一对引物，k1和P10为一对引物，P9和P10为一对引物，E.coli W3110的基因组(见实例1)为阴性对照，对筛选平板上长出的菌落进行菌落PCR检验，其中阴性对照不能用P9和k2以及P10和k1扩增出条带，而能用P9和P10扩增与GenBank公布的序列大小一致的条带。而阳性对照则可以用三对引物同时扩增能出条带，而且前两对引物扩增出的条带长度之和等于第三对引物扩增所得的条带长度。
回收以阳性菌落为模板，P9和P10为引物扩增得到的PCR产物，测序验证，结果表明E.coli W3110中的metJ基因被两端带有FRT位点的kan片段成功替换。
制备E.coli W3110metJ::kan化转感受态，转化辅助质粒pCP20，涂布含Amp的抗性平板，30℃培养过夜。用P9和P10对单克隆进行菌落PCR检验，以E.coli W3110的基因组为阴性对照，理论上阳性克隆可以扩增出比对照小的片段。得到的阳性克隆接种LB试管，37℃培养8-10h，然后42℃培养10-12h，然后再无抗LB平板上划线分离单菌落，37℃倒置培养，得到的单菌落分别在含Amp和含Kan的LB平板上检验抗性，同时丧失Amp(氨苄青霉素)和Kan(卡那霉素)抗性的单菌落为阳性菌落，即E.coli W3110ΔmetJ，将以阳性克隆为模板，P9和P10为引物的扩增产物胶回收纯化后，送样测序，结果表明metJ已经成功敲除。
将重组表达质粒pTrc99A/metA*/yjeH(见实施例2)转化到E.coli W3110ΔmetJ中构建获得E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例4：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli中存在两套L-Met摄入系统(transport system)：MetD和MetP，其中MetD为主要的摄入系统，由metD基因座编码，其中包含metI(编码甲硫氨酸透酶)，metN(编码ATP合酶)和metQ(编码甲硫氨酸结合酶)三个基因。本发明旨在E.coli W3110ΔmetJ的基础上通过基因敲除破坏L-Met摄入系统，破坏摄入与分泌的平衡，提高L-Met的发酵效价。用与实施例3相同的方法，设计线性打靶片段扩增引物P11和P12(见表1)，检验引物P13和P14(见表1)。测序表明成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例5：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*
/yjeH
L-Met和L-赖氨酸都以L-天冬氨酸为前体，在代谢通量上存在相互竞争的关系。本发明在E.coli W3110ΔmetJΔmetI的基础上，用实施例3相同的方法，设计线性片段扩增引物P15和P16，检验引物P19和P20，敲除了lysA基因，核苷酸序列见SEQ ID No.7，切断了L-赖氨酸生物合成途径，成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例6：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH
L-Met和L-苏氨酸都以L-天冬氨酸为前体，在代谢通量上存在相互竞争的关系。本发明在E.coli W3110ΔmetJΔmetI的基础上，用实施例3相同的方法，设计线性片段扩增引物P17和P18，检验引物P21和P22，敲除了thrB基因，核苷酸序列见SEQ ID No.8，切断了L-苏氨酸生物合成途径，成功构建了E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH。
表1引物
实施例7：构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysAΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH
在E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA的基础上，继续实施例5相同的方法敲除thrB基因，同时切断L-赖氨酸和L-苏氨酸生物合成途径，成功构建E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysAΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH。
实施例8:摇瓶发酵及效价比较
将生产菌株(包括E.coli W3110、E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A、E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH、E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysAΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH)接种到10ml含50mg/L Amp的LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为水，pH值自然)中，37℃、200rpm培养用作预培养物，其中E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A为阴性对照。8-12h后，接种1ml预培养物到装20ml含50mg/L的MS培养基(葡萄糖20g/L、(NH4)2SO416g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1ml/L微量元素溶液，溶剂为水，pH值自然；其中微量元素溶液组成为：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、2.5g/L Na3BO3、0.7g/LCoCl2·6H2O、0.25g/L CuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为水)的500ml摇瓶中，添加终浓度为100μmol/L IPTG，然后在30℃、150rpm培养发酵48h，发酵结束后，取1ml发酵液，12000rpm，室温离心3min，将发酵上清稀释100倍，用全自动氨基酸分析仪(SYKAM S-433D，德国)分析氨基酸效价。发酵液上清中的L-Met含量如表2所示。E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH向MS培养基中添加终浓度0.02g/L的L-赖氨酸；E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH向MS培养基中添加终浓度为0.8g/L的L-苏氨酸；E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysAΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH向培养基中添加终浓度0.02g/L的L-赖氨酸和终浓度为0.8g/L的L-苏氨酸。
表2不同高产菌株的效价
菌株 L-Met效价(g/l)
E.coli W3110 0
E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A 0
E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH 0.498
E.coli W3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH 0.594
E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH 4.083
E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH 0.313
E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysAΔthrB/pTrc99A/metA*/yjeH 4.098
实施例9：最优菌株E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH 5L罐分批补料发酵
在实施例8基础上，对最优高产菌株E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH进行了5L发酵罐放大。具体过程如下：
将生产菌株(E.coli W3110、E.coli W3110ΔmetJ/pTrc99A、E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH)接种到10ml含有50mg/l的Amp的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作一级种子。8-12h后，接种0.5ml到含有50ml LB培养基的250ml摇瓶中，共接3瓶，37℃、200rpm培养作为二级种子。6-8h后，将3瓶种子液混合后接种到含有3L MS培养基(其中的葡萄糖为30g/l，添加终浓度0.02g/L的L-赖氨酸)的5L发酵罐中，添加终浓度为100μmol/L IPTG，31℃，搅拌转速500rpm，通气量为2l/min，pH 7.0，用氨水或磷酸调节pH，发酵48h，每6h取一次样，当发酵液中的葡萄糖浓度降低到5g/l以下，加入100ml补料培养基(葡萄糖500g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 12.5g/L、L-lysine 4.357g/L、Na2S2O3 23.83g/L、酵母提取物1g/L、Vb12 0.02g/L、溶剂为水，pH值自然)，使葡萄糖达到20g/L。样品处理方式如实施例8所述，结果表明阴性对照在整个发酵过程中发酵液中的甲硫氨酸效价都小于50mg/l，而E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH的发酵进程见图3，发酵效价随着菌体干重的增加而增加，发酵42h，发酵效价即可达到9.417g/l，最高发酵效价可达9.752g/l。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，如以其他属于大肠杆菌属的微生物作为出发菌株，对另一套摄入系统MetP的破坏，其他分泌因子(如ygaZH)的表达上调，以及实施例中提到的最优菌的发酵过程优化、补料工艺开发均在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌构建方法为下列之一：（1）将大肠杆菌E. coli W3110的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因构建而成；（2）将大肠杆菌E. coli W3110的metJ基因敲除后，转入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因和thrB基因构建而成；所述metA*基因是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第881位丙氨酸突变为甘氨酸，获得突变O-高丝氨酸琥珀酰转移酶基因metA*，所述yjeH基因核苷酸序列为SEQ ID No. 5所示。
2.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在生成L-甲硫氨酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将重组大肠杆菌接种到含50mg/L的Amp的 LB培养基中，37℃、200 rpm培养8-12 h，将培养液以体积浓度5%的接种量接种到含50 mg/L的Amp的MS培养基中，添加终浓度为100 μmol/L IPTG，在30 ± 2 ℃、100~500 rpm培养发酵48 h，发酵结束后，获得含L-甲硫氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得L-甲硫氨酸；所述MS培养基终浓度组成为：葡萄糖 20 g/L、(NH4)2SO4 16 g/L、KH2PO4 1 g/L、酵母提取物 2 g/L、CaCO3 10 g/L、1 ml/L微量元素溶液，溶剂为水，pH值自然；其中微量元素溶液组成为：0.15 g/L Na2MoO4·2H2O、2.5 g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2·6H2O、0.25g/LCuSO4·5H2O、1.6 g/L MnCl2·4H2O、0.3 g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为水；当重组大肠杆菌敲除lysA时，向MS培养基中添加终浓度0.02 g/L的L-赖氨酸；当重组大肠杆菌同时敲除lysA基因和thrB基因时，向培养基中添加终浓度0.02 g/L的L-赖氨酸和终浓度为0.8 g/L的L-苏氨酸。
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