CN103282488A - 提高nadph可用性用于甲硫氨酸产生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于甲硫氨酸生产的微生物，其中所述微生物经过修饰以增强PntAB的转氢酶活性。在本发明的一个优选的方面，在所述微生物中转氢酶UdhA的活性弱化了。本发明还涉及通过发酵用于产生甲硫氨酸的方法。

Description

提高NADPH可用性用于甲硫氨酸产生
发明领域
本发明涉及一种提高胞内的产自NADH的NADPH的可用性以增强甲硫氨酸产生的方法。有利的，该提高NADPH水平的方法与一碳代谢的提高相关从而改进甲硫氨酸产生。
发明背景
例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的含硫化合物对于细胞新陈代谢是关键性的，它们以工业生产并被用做食品或饲料添加剂以及药物。特别是甲硫氨酸，一种必需的氨基酸，在许多身体的功能中扮演重要的角色。其不能为动物所合成。除了其在蛋白质生物合成中的角色外，甲硫氨酸还涉及转甲基作用和硒和锌的生物可用性(bioavailability)中。甲硫氨酸还直接用于例如过敏和风湿热的病症的治疗中。大多数生产的甲硫氨酸添加至动物饲料中。
作为BSE和禽流感的结果，随着动物-来源的蛋白使用减少，对于纯甲硫氨酸的需求提高了。在化学上，D,L-甲硫氨酸通常是由丙烯醛、甲基硫醇和氰化氢生产而来的。然而，所述消旋的混合物性能不如纯的L-甲硫氨酸那么好，例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson，C.L.，(1985)British Journal of Nutrition54，621-633)。纯L-甲硫氨酸可以由消旋的甲硫氨酸产生，例如通过酰基转移酶处理N-乙酰基-D,L-甲硫氨酸，不过这急剧地提高了生产成本。对于纯L-甲硫氨酸需求的提高，连同对环境的关注，使得甲硫氨酸的微生物生产有吸引力。
辅助因子对NADPH/NADP+和NADH/NAD+对于所有的生物体都是必需的。在活细胞的很多氧化-还原反应中，它们是还原性等效物的供体和/或受体。虽然NADH和NADPH在化学上很相似，这两种辅助因子有不同的生化功能并且参与在超过100种酶反应中(Ouzonis，C.A.，和Karp，P.D.(2000)Genome Res.10，568-576)。分解代谢的反应一般牵涉到NAD+/NADH而合成代谢的反应一般牵涉到NADP+/NADPH。这些核苷酸对细胞内几乎每一个氧化还原代谢途径都有直接的影响。
许多工业上有用的化合物的生物合成需要辅助因子NADPH，举例而言：在木糖中以酵母生产乙醇(Verho等,(2003)Applied and EnvironmentalMicrobiology69,5892-5897)、(+)-儿茶素的高产量生产(Chemler等,(2007)Applied and Environmental Microbiology77,797-807)、番茄红素在大肠杆菌(E.coli)中的生物合成(Alper,H.等,(2005)Metab.Eng.7,155-164)或赖氨酸在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的生产(Kelle T等,(2005)L-lysine production;In:Eggeling L,Bott M(编)Handbook of corynebacteriumglutamicum.CRC,Boca Raton,pp467-490)。
L-甲硫氨酸在大肠杆菌中的生物工艺学生产需要足够的NADPH汇集物。甲硫氨酸是由氨基酸天冬氨酸衍生而来，但其的合成还需要两条额外的途径的汇聚：半胱氨酸生物合成和C1代谢(N-亚甲基四氢叶酸)。天冬氨酸由一序列的三个反应转化为高丝氨酸。高丝氨酸可随后进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。
产生一分子的L-甲硫氨酸需要8.5摩尔的NADPH。为了在基本培养基上满足大肠杆菌生长和L-甲硫氨酸产生的需求，发明人在这里提出提高转氢酶活性，以达到提高细胞中NADPH的汇集物的目的。
转氢酶反应(下面)可由膜结合的、质子转位酶(PntAB)或者可溶的、不依赖能量的同种型酶(isoform enzyme)(SthA)任一者催化。
Figure BDA00003404532700021
大肠杆菌具有由基因sthA(也称作udhA)和pntAB(Sauer U.等,2004，JBC，279:6613-6619)编码的两个烟酰胺核苷酸转氢酶。在微生物中转氢酶PntAB和SthA的生理学功能分别是产生和重氧化NADPH(Sauer U.等,2004，JBC，279:6613-6619)。膜结合的转氢酶PntAB使用电化学的质子梯度作为驱动力，通过将NADH氧化为NAD+而把NADP+还原为NADPH(Jackson JB，2003，FEBS Lett545:18-24)。
已经采取了几种策略以改进NADPH在整个细胞中的可用性。Moreira dosSantos等(2004)报道了NADP+依赖的来自苹果的酶(malic enzyme)在提高NADPH在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中提高NADPH的细胞质水平的用途。Weckbecker和Hummel(2004)描述了在大肠杆菌中过表达pntAB以改进NADPH依赖的苯乙酮到(R)-苯基乙醇的转化。Sanchez等(2006)描述了在大肠杆菌中过表达可溶的转氢酶SthA以改进聚(3-羟丁酸)的NADPH依赖的产生。
发明人出人意料的发现，通过在细菌中提高PntAB活性和降低SthA催化的反应，甲硫氨酸产生显著地提高了。
此外，通过组合高转氢酶活性和提高亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)活性以增进细胞内的一碳代谢，极大地改进了通过发酵修饰的微生物而进行的L-甲硫氨酸产生。
发明概述
本发明涉及一种产生甲硫氨酸的微生物，其中所述微生物的NADPH产生提高。所述NADPH产生的提高是通过提高PntAB转氢酶活性作为唯一的修饰或与弱化UdhA转氢酶活性组合而达成的。在本发明的一个具体的实施方案中，NADPH产生的提高与一碳代谢的提高相偶联。
本发明也涉及用于在发酵工艺中产生甲硫氨酸的方法，所述发酵工艺包括如下步骤：
-在包括碳源、硫源和氮源的适当的培养基中培养经修饰的产生甲硫氨酸的微生物，以及
-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，
其中在所述微生物中，PntAB的转氢酶活性以这样的方式增强，使得还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的产生提高。
发明详述
本发明涉及产生甲硫氨酸的微生物，其中所述微生物经过修饰以增强PntAB的转氢酶活性。
本发明还涉及用于在发酵工艺中产生甲硫氨酸的方法。
■定义
本发明涉及含有遗传修饰以增强基因表达或蛋白产生或活性的微生物。
本发明的说明书中，以在大肠杆菌中相应基因的命名来鉴定基因和蛋白。然而除非特别说明，这些命名的用途在本发明中具有更加普遍的含义，其包括了在其他生物体中，特别是微生物中，所有对应的基因和蛋白。
PFAM(比对和隐马尔科夫模型的蛋白家族(protein families of alignmentsand hidden Markov model；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表了蛋白质序列对比的大集合。每个PFAM使得可视化多重对比、观看蛋白域、评估不同生物体中的分布、取得其它数据库的访问权和可视化已知的蛋白质结构成为可能。
COG(s)(直向同源群蛋白集群，clusters of orthologous groups of proteins;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是由对比代表38个主要种系发生路线，来自66个完整测序基因组中的蛋白序列获得的。每个COG是由至少三条路线定义的，其允许鉴别前保守结构域。
鉴别同源的序列以及其同源百分比的方法是领域内熟知的，其特别地包括了BLAST程序。所述BLAST程序可以在网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中使用，该网页显示了默认的参数。从中获得的序列可通过例如使用CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN程序(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)而进一步利用(例如序列对比)，所述的网页显示了默认的参数。
通过使用GenBank上给出的已知基因的参考，本领域技术人员可以确定其在其它生物体中的等效基因，例如细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等等。这样的常规工作可以通过与其它微生物进行序列对比而确定共有序列有利的完成，并设计简并探针以在另一种生物体内克隆相应的基因。这样的分子生物学中的常规方法是领域内熟知的，并由例如Sambrook等提出(1989Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第2版Cold Spring HarborLab.，Cold Spring Harbor，New York)。
术语“活性弱化(attenuation of activity)”在本发明中可既以用于酶也可以用于基因，在两种情况下该术语都表示部分或完全的阻抑了对应基因的表达，这样的酶或基因则是被“弱化了(attenuated)”。这样的表达的阻抑可以是对基因的表达的抑制、对基因表达必须的全部或部分的启动子区域的缺失、对基因编码区域的缺失或对野生型启动子以弱的自然或合成启动子的置换。优选地，所述基因的弱化是基本上完全缺失该基因，将其替换为使本发明中菌株的鉴别、分离和纯化更容易的选择标记基因。优选地，以同源重组(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645)的技术使基因失活。
术语“增强的转氢酶PntAB活性”是指比未经过修饰的微生物的酶活性更高的酶活性。本领域技术人员知晓如何测量所述酶的酶活性。在本发明一个优选的实施方案中，所述PntAB活性相比于在未经过修饰的微生物中观察到的活性提高10%；优选地，所述活性提高20%，更优选地，所述活性提高30%，更优选地，所述活性提高50%，更优选地，所述活性提高60%。
本领域的技术人员知晓不同的手段以增强酶活性：修饰蛋白质的催化位点、提高蛋白质的稳定性、提高信使RNA的稳定性、提高编码蛋白质的基因的表达。
本领域知晓的稳定蛋白质的元件(例如GST标签，AmershamBiosciences)，以及稳定mRNA的元件(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)。
术语“提高的基因表达”、“增强的基因表达”或“基因的过表达”在本文中具有相似的意义，并且是可以互换使用的。
为提高基因的表达，本领域技术人员知晓不同的技术：提高基因在微生物中的拷贝数、使用诱导基因高水平表达的启动子、弱化基因的直接或间接转录阻抑物的活性和/或表达。
基因是在染色体上或染色体外编码的。当基因位于染色体上时，可以同过技术人员知晓的重组方法(包括基因置换)在染色体上引入所述基因的几个拷贝。当基因是位于染色体外时，所述基因可以由复制起点不同的不同种类的质粒所携带，因此在细胞中具有不同的拷贝数。取决于质粒的性质，这些质粒以1到5个拷贝，或者大约20个拷贝，或多至500个拷贝存在微生物中：具有严谨复制的低拷贝数质粒(pSC101，RK2)，低拷贝数质粒(pACYC，pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
在本发明特定的实施方案中，以不同强度的启动子表达基因。在本发明的一个实施方案中，所述启动子是可诱导的。这些启动子是同源的或异源的。本领域技术人员知晓哪个启动子是最方便的，例如广泛使用的Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cI。
甲硫氨酸的衍生物：
在本发明中，从培养基中回收的是甲硫氨酸。然而，也可能从培养基中回收的是甲硫氨酸的一些衍生物，其可以在简单的反应中转化成为甲硫氨酸。甲硫氨酸的衍生物是从例如S-酰基甲硫氨酸和N-酰基甲硫氨酸途径的甲硫氨酸的转化和/或分解途径中产生的。特别的，这些产物是S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)和N-乙酰基-甲硫氨酸(NAM)。尤其是NAM，其是容易被回收的甲硫氨酸衍生物，可以将其分离并通过脱酰基作用转化为甲硫氨酸。
微生物
术语“用于甲硫氨酸生产的微生物”或“产生甲硫氨酸的微生物”是指比仅为其内源需求而产生甲硫氨酸的微生物产生更高水平甲硫氨酸的微生物。为甲硫氨酸产生而“优化的”微生物是领域内熟知的，并且已经特别地在专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中公开。
术语“经过修饰的微生物”涉及为改进的甲硫氨酸产生而经过修饰的微生物。根据本发明，微生物产生的甲硫氨酸的量，特别是甲硫氨酸的收率(克/摩尔产生的甲硫氨酸与克/摩尔碳源的比例)，在经过修饰的微生物中要比相应的未经修饰的微生物高。通常的修饰包括通过转化和重组的基因缺失、基因置换以及引入表达异源基因的载体(vector)。
在本发明中使用的微生物是细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更加优选地，所述微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。更加优选地，所述微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
NADPH的提高
根据本发明，经过修饰的微生物在一方面包含改进的甲硫氨酸的产生的修饰，在另一方面包含通过提高PntAB转氢酶活性而改进的可用NADPH产生的修饰。
PntAB是跨膜吡啶核苷酸转氢酶，其通过将NADH氧化为NAD+催化NADP+到NADPH的还原。其包含α和β两个亚基，分别由pntA和pntB基因编码。
提高的PntAB活性增强细胞内可用的NADPH的产生。但这并不自动使得细胞内的NADPH浓度提高，因为可用的NADPH可以直接由NADPH依赖酶所直接消耗。术语“提高的PntAB活性”在该语境下描述了所述转氢酶在胞内的活性的提高，所述转氢酶是由相应的pntA和pntB基因编码的，所述活性的提高可以通过例如提高基因的拷贝数、使用更强的启动子或使用具有提高的活性的等位基因，以及上述手段可能的组合。
在本发明的一个特定的实施方案中，编码pntAB的基因是过表达的。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述pntAB基因是通过使用显示更高强度的启动子过表达的。这样的启动子可以是例如属于Ptrc家族的启动子，其每一个都显示了特定的强度。所述Ptrc启动子是人工的杂合启动子，其显示了典型的大肠杆菌启动子Plac和Ptrp的共有序列，特别是Plac的-35盒和Ptrp的-10盒(Amann等,1983，Gene以及Amann等,1988，Gene)。本发明人通过根据Hawley研究中的启动子比较(Hawley&McClure，1983，NucleicAcids Research)修饰-10盒和-35盒的共有序列而修饰了此人工启动子以获得一系列具有不同强度的启动子。序列与所述共有-10和-35盒越不同，启动子的强度就越低。本发明中使用的Ptrc启动子是以数字加权重的Ptrc命名的：数字越大，人工启动子序列与共有序列之间的区别就越大。
在本发明的一个特定的实施方案中，通过组合提高PntAB活性和弱化UdhA活性而获得了可得的NADPH的提高。UdhA是可溶的吡啶核苷酸转氢酶，其基本上通过将NAD+还原为NADH而催化NADPH到NADP+的氧化。
如上文描述的，可以通过部分的或完全的阻抑相应的udhA基因、通过抑制udhA基因的表达、部分或完全缺失基因表达必须的启动子区域、通过缺失基因的编码区域或通过将野生型启动子置换为更弱的自然或合成启动子以到达弱化UdhA活性的目的。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述UdhA活性的弱化是由通过同源重组完全缺失udhA基因而达到的。
■C1代谢
在本发明的一个优选的实施方案中，在生产甲硫氨酸的微生物中，提高的NADPH是与一碳代谢(又称C1代谢)偶联的。C1代谢是为本领域技术人员所熟知的，其基于叶酸代谢。叶酸还原酶将叶酸还原为二氢叶酸，二氢叶酸还原酶再将二氢叶酸还原为四氢叶酸(又称THF)。THF参与DNA碱基和氨基酸的生物合成。
THF接受源自甘氨酸或丝氨酸的亚甲基并形成亚甲基-THF。就丝氨酸来说，丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)催化亚甲基基团到THF的转移，就甘氨酸来说，是由甘氨酸裂解复合体(GcvTHP)催化的。甘氨酸裂解复合体(GCV)是催化甘氨酸氧化的多酶复合体，催化反应产生二氧化碳、氨、亚甲基-THF和还原的吡啶核苷酸。GCV复合体是由四个蛋白组分组成的：甘氨酸脱氢酶又称P-蛋白(GcvP)、硫辛酰-GcvH-蛋白又称H-蛋白(GcvH)、氨基甲基转移酶又称T-蛋白(GcvT)以及二氢硫辛酰胺脱氢酶又称L-蛋白(GcvL或Lpd)。P-蛋白催化吡哆醛磷酸依赖的从甘氨酸上释放CO2，留下甲胺部分。所述甲胺部分被转移到H-蛋白的硫辛酸基团上，所述硫辛酸基团在甘氨酸脱羧之前结合在P-蛋白上。T-蛋白催化NH3从甲胺基团上的释放并将剩下的C1单位转移到THF上，形成亚甲基-THF。L-蛋白氧化H-蛋白的硫辛酸组分并将电子转移到NAD+，形成NADH。
在甲硫氨酸的生物合成中，亚甲基-THF可被亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)还原形成甲基-THF。在甲基转移酶MetE或MetH甲基化高半胱氨酸形成甲硫氨酸的过程中，甲基-THF是甲基的供体。
提高C1代谢导致改进的甲硫氨酸产生
根据本发明，“提高C1新陈代谢”涉及参与在C1代谢中的酶的活性的提高，所述参与在C1代谢中的酶是选自MetF、GcvTHP、Lpd、GlyA、MetE或MetH中的至少一种。对于提高酶活性，可以过表达或在核酸序列上修饰这些不同的酶的对应的基因，所述在核酸序列上的修饰可以使表达的酶的活性改进，或对反馈调控的敏感性降低。
在本发明的优选的实施方案中，通过加强亚甲基四氢叶酸还原酶MetF的活性和/或甘氨酸裂解复合体GcvTHP的活性和/或丝氨酸羟甲基转移酶GlyA的活性以提高一碳代谢。
在本发明的一个具体实施方案中，通过过表达metF基因和/或通过优化其翻译以增强MetF的活性。
在本发明的一个具体实施方案中，通过在属于Ptrc家族启动子的强启动子的控制下过表达metF基因，或在例如申请PCT/FR2009/052520中描述的温度可诱导启动子PR的可诱导启动子的控制下过表达metF基因。
根据本发明的另一个实施方案，通过使用RNA稳定剂达到MetF蛋白翻译的优化。其它过表达基因的手段是为领域内技术人员所知的，其也可用于metF基因的过表达。
■甲硫氨酸生物合成途径的优化：
如上文所述，在本发明中使用的经过修饰的微生物可以包含进一步的可得的NADPH产生和C1代谢的修饰，所述修饰是为了改进的甲硫氨酸产生。
在微生物中参与甲硫氨酸产生的基因是领域内熟知的，其包括了参与甲硫氨酸特定生物合成途径的基因以及参与前体提供途径的基因与参与甲硫氨酸消耗途径的基因。
有效率的甲硫氨酸的生产需要甲硫氨酸特定途径和几个前体提供途径的优化。生产甲硫氨酸的菌株已经在专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中描述。将这些申请通过提述并入本申请。
专利申请WO2005/111202描述了一种产生甲硫氨酸的菌株，其过表达高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因，所述等位基因具有对其抑制子SAM和甲硫氨酸降低的反馈敏感性。本申请也描述了将这些等位基因组合甲硫氨酸阻抑物MetJ的缺失，MetJ负责下调甲硫氨酸调节子。除此之外，申请文件描述了将所述的两个修饰与天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的过表达组合。
对于改进甲硫氨酸的生产，微生物可以表现：
-选自下组的至少一个基因的提高的表达：
cysP，其编码周质硫酸根结合蛋白，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
cysU，其编码硫酸根ABC运输蛋白，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
cysW，其编码膜结合硫酸盐运输蛋白，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
cysA，其编码硫酸根硫酸盐通透酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
cysM，其编码O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
cysI和cysJ，其分别编码亚硫酸盐还原酶的α和β亚基，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述。优选地，cysI和cysJ一起过表达，
cysH，其编码腺苷酰硫酸盐还原酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
cysE，其编码丝氨酸酰基转移酶，在WO2007/077041中描述，
serA，其编码磷酸甘油酸脱氢酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
serC，其编码磷酸丝氨酸转氨酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
metA等位基因，其编码具有对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸高丝氨酸降低的反馈敏感性的琥珀酰转移酶，在WO2005/111202中描述，
thrA或thrA等位基因，其编码具有对苏氨酸抑制降低的反馈的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶,在WO2009/043803和WO2005/111202中描述，
-或者下列基因中至少一种抑制的表达：
pykA，其编码丙酮酸激酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
pykF，其编码丙酮酸激酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
purU，其编码甲酰四氢叶酸去甲酰酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，
yncA，其编码N-乙酰转移酶，在WO2010/020681中描述，
metJ，其编码甲硫氨酸生物合成途径的阻抑物，在WO2005/111202中描述。
在本发明的一个具体实施方案中，基因可以由可诱导启动子所控制。专利申请PCT/FR2009/052520描述了表达thrA等位基因的生产甲硫氨酸的菌株，所述thrA等位基因具有对苏氨酸和cysE降低的反馈抑制，并且其是由可诱导启动子操纵的。通过提述将该申请并入本申请文件。
在本发明的优选的实施方案中，thrA基因或等位基因是在温度可诱导启动子的控制下。在最优选的实施方案中，使用的温度可诱导启动子属于PR启动子家族。
在本发明的另一个方面，丙酮酸羧化酶的活性增强了。通过过表达对应的基因或修饰该基因的核酸序列以表达具有改进的活性的酶而获得提高活性的丙酮酸羧化酶。在本发明的另一个实施方案中，在所述经过修饰的微生物中通过重组将一个或几个拷贝的pyc基因引入染色体，或以至少一个拷贝数的质粒携带pyc基因。所述pyc基因源自埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或棒状杆菌属菌种。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述过表达的基因是在它们在染色体上的天然位置，或整合进非天然的位置。对于最优的甲硫氨酸产生，可以需要几个拷贝数的所述基因，并且这些多拷贝是整合入特定的基因座中，所述基因座的修饰对甲硫氨酸的产生没有负面的影响。
可以整合基因而不扰乱细胞的新陈代谢的基因座的例子有：
Figure BDA00003404532700111
Figure BDA00003404532700121
Figure BDA00003404532700131
Figure BDA00003404532700141
Figure BDA00003404532700151
Figure BDA00003404532700171
Figure BDA00003404532700191
Figure BDA00003404532700201
Figure BDA00003404532700211
本发明还涉及甲硫氨酸的生产的一种方法，其包括以下步骤：
-在包括碳源、硫源和氮源的适当的培养基中培养经过修饰的生产甲硫氨酸的微生物，以及
-从所述培养基中回收甲硫氨酸或一种其的衍生物，
其中所述微生物经过修饰以表现增强的PntAB的转氢酶活性。
培养条件：
术语“发酵过程”、“培养”或“发酵”的使用是可交换的，其表示细菌在包含简单碳源、硫源和氮源的合适的生长培养基中生长。
合适的培养基是合适微生物的培养与生长的培养基。对于需要培养的特定的微生物，这样的培养基是在微生物发酵领域内为人熟知的。
术语“碳源”根据本发明是指任何本领域技术人员可以用于维持微生物的正常生长的碳源，其可以是例如葡萄糖、半乳糖或乳糖的己糖；戊糖；单糖；例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖的二糖；寡糖；糖蜜；淀粉或其衍生物；半纤维素；甘油或其组合。一个特别优选的碳源是葡萄糖。另一个优选的碳源是蔗糖。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述碳源是得自可更新的原料中。可更新的原料的定义是某些工业过程需要的原材料，其可以在短暂的延时后再生并有足够多的量以转化为合意的产物。植物性生物质，无论是处理过的还是没有处理过的，都是令人感兴趣的可更新的碳源。
术语“硫源”根据本发明是指硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲基硫醇、二甲亚砜以及其它甲基加帽的硫化物或所述不同来源的组合。更优选地，所述硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或其的混合物。
术语“氮源”对应铵盐或含氨的气体。以铵(ammonium)或氨(ammoniac)的形式提供氮源。
在本发明的特定的方面，培养是在以下的条件下进行的：限制微生物或使微生物饥饿无机底物，特别是磷酸盐和/或钾。限制微生物无机底物的定义是在该条件下，微生物的生长受到无机盐供给的量支配，仅允许弱的生长。使微生物饥饿无机物质的定义是在该条件下，由于没有所述无机底物，微生物的生长完全停止了。
发酵一般是在罐(fermenters)中使用微生物适应的合适培养基进行的。其含有至少一种简单碳源，并且如需要，含有产生代谢物所需的共-底物。
本领域技术人员可以确定本发明的微生物的培养条件。特别的，在20℃-55℃的温度发酵所述细菌，优选地，在25℃-55℃，以及更加特别的，对于谷氨酸棒杆菌是大约30℃，对于大肠杆菌是大约37℃。
作为已知的大肠杆菌的培养基的例子，所述培养基可以与以下培养基相同或具有相似的组分：M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128)、M63培养基(Miller，1992;A Short Course in Bacterial genetics:ALaboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或Schaefer等所确定的培养基(1999，Anal.Biochem.270:88-96)。
作为已知的大肠杆菌的培养基的例子，所述培养基可以与以下培养基相同或具有相似的组分：BMCG培养基(Liebl等,1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或Riedel等描述的培养基(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)。
甲硫氨酸的回收
“从培养基回收甲硫氨酸”是指回收甲硫氨酸或其衍生物的一种，特别是SAM和NAM以及其它可能有用的衍生物。
本发明还涉及甲硫氨酸的生产的方法，包括发酵培养液和/或生物质的分离甲硫氨酸、甲硫氨酸的前体或甲硫氨酸的衍生物的步骤，任选以一部分或全部量(0-100%)留存在最终产物中。
在发酵后，如有必要，回收并纯化L-甲硫氨酸、其前体或其衍生的化合物。回收和纯化在培养基中产生的例如甲硫氨酸，S-腺苷-甲硫氨酸和N-乙酰基-甲硫氨酸的化合物的方法是领域内熟知的(WO2005/007862，WO2005/059155)。
任选地，在纯化发酵产物中，从0到100%的生物质可以保留，优选至少90%，更优选95%，甚至更优选99%。
任选地，在回收甲硫氨酸前，通过脱酰作用将甲硫氨酸的衍生物N-乙酰基-甲硫氨酸转化成为甲硫氨酸。
实施例
规程
在构建产生甲硫氨酸的菌株时使用了几个规程，将其在下述实施例中描述。
规程1：通过同源重组和选择重组体以进行染色体修饰(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))
通过Datsenko.和Wanner(2000)描述的同源重组方法在特定的染色体基因座中进行等位置换或基因破坏。将侧翼为Flp识别位点的氯霉素(Cm)抗性cat基因，卡那霉素(Km)抗性kan基因或庆大霉素(Gt)抗性gm基因通过PCR分别从作为模板的pKD3、pKD4或p34S-Gm质粒(Dennis et Zyltra，AEM july1998，p2710-2715)中扩增。使用产生的PCR产物转化受体大肠杆菌菌株。所述受体菌株带有表达λRed(γ，β，外)重组酶的质粒pKD46。选择抗生素抗性的转化产物并使用在表2中列出的合适引物通过PCR验证突变基因座的染色体结构。
如Datsenko和Wanner(2000)所述，通过使用质粒pCP20除去所述的cat、kan以及gm–抗性基因，只是将携带pCP20质粒的克隆在37℃在LB上培养，然后在30℃测试抗生素抗性的丢失。用表2中列出的适当引物通过PCR验证抗生素敏感的克隆。
规程2：噬菌体P1的转导
通过P1转导将染色体修饰转移到特定的大肠杆菌菌株。该规程由2步骤组成：(i)在含有所述抗性关联的染色体修饰的供体菌株上制备噬菌体裂解物，以及(ii)以该噬菌体裂解物感染受体菌株。
制备噬菌体裂解物
-接种100μL过夜培养的带有感兴趣的染色体修饰的菌株MG1655到LB10mL+Cm30μg/mL或Km50μg/mL或Gt10μg/mL+葡萄糖0.2%+CaCl25mM。
-在37℃振荡温育30min。
-加入100μL在供体菌株MG1655上制备的P1噬菌体裂解物(约1x109噬菌体/ml)。
-在37℃振荡直到细胞完全裂解。
-加入200μL氯仿并涡旋震荡。
-在4500g离心10min以消除细胞碎片。
-将上清转移到无菌的试管中。
-将裂解物储存在4℃。
转导
-将5mL在LB中大肠杆菌受体菌株的过夜培养物在1500g离心10min。
-将细胞沉淀悬浮到2.5mL MgSO410mM，CaCl25mM中。
-以100μL P1噬菌体感染100μL细胞，所述P1噬菌体是在染色体上带有修饰的菌株MG1655P1噬菌体(试管中)，以及作为对照试管的没有P1噬菌体的100μL细胞和没有细胞的100μL P1噬菌体。
-在30℃不振荡温育30min。
-在每个试管中加入100μL柠檬酸钠，并涡旋震荡。
-加入1mL LB。
-在37℃振荡温育1小时。
-在7000rpm离心3min。
-在LB+Cm30μg/mL或Km50μg/mL或Gt10μg/mL上铺板
-在37℃过夜温育。
接下来选择抗生素抗性的转导体，并用表2中列出的合适的引物通过PCR验证突变的基因座的染色体结构。
表1：在接下来的实施例中出现的中间体菌株和生产者菌株的基因型和对应菌株数。
Figure BDA00003404532700261
Figure BDA00003404532700271
Figure BDA00003404532700281
Figure BDA00003404532700291
表2:用于PCR验证上述所描述的染色体修饰的引物
Figure BDA00003404532700292
Figure BDA00003404532700301
I.实施例1：构建菌株7，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF::Km Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
I.1.构建菌株1
WO2007/077041已经描述了生产甲硫氨酸菌株1，通过提述将其并入本申请。
I.2.构建菌株2
在两个步骤中将TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE片段插入malS基因座。第一步构建质粒pUC18-DmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km，第二步将含有与malS基因座同源的上游和下游的序列的TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km片段引入染色体。接下来，根据规程1除去抗性盒。
以同样的方法描述以下展示的在染色体上不同的基因座中的整合；1)构建含有目的基因座的上游和下游同源物序列、DNA片段和抗性盒的重复载体，2)构建含有目的染色体修饰的的最小菌株(MG1655)，和3)转导进入所述复合体菌株(MG1655已经含有几个修饰)。
I.2.1.pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km质粒的构建
质粒pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE是源自已经在专利申请PCT/FR2009/052520中描述过的质粒pSCB-TTadc-cI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE和质粒pUC18-ΔmalS::MCS::Km。简单地，将ApaI/BamHI消化的TTadc-cI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE片段克隆在pUC18-ΔmalS::MCS-Km的ApaI和BamHI位点之间。以DNA测序验证产生的质粒，并命名其为pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km。
I.2.2.菌株MG1655metA*11ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km(pKD4)的构建
为了以TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km DNA片段置换malS基因，以ScaI和EcoRV消化pUC18-DmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km，将剩余的含有与malS基因组同源的上游和下游序列的消化片段TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km根据规程1引入MG1655metA*11pKD46。选择卡那霉素抗性重组体，用引物Ome0826-malS-F(SEQ ID N°1)和Ome0827-malS-R(SEQ ID N°2)(表2)通过PCR验证ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km染色体修饰的存在。命名经过验证和选择的菌株为MG1655metA*11pKD46ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km。
I.2.3.将ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km转导入菌株1以及除去抗性盒
根据规程2，以上面描述的来自菌株MG1655metA*11pKD46ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km的P1噬菌体裂解物将ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km染色体修饰转导至菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA中。选择卡那霉素抗性的转导体，用引物Ome0826-malS-F(SEQ ID N°1)和Ome0827-malS-R(SEQ ID N°2)(表2)通过PCR验证ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km染色体修饰的存在。所产生的菌株具有MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km的基因型。最后，根据规程1除去上述菌株的卡那霉素抗性。用引物Ome0826-malS-F(SEQ ID N°1)和Ome0827-malS-R(SEQ ID N°2)(表2)通过PCR验证卡那霉素抗性盒的丢失。将产生的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE命名为菌株2。
I.3.构建菌株3
I.3.1.质粒pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的构建
质粒pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm源自下面描述的质粒pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11和pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm。
质粒pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA -metA*11的构建
质粒pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11源自在专利申请PCT/FR2009/052520中描述的质粒pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11。
为构建质粒pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11，用引物PR-RBS01_F(SEQ ID N°3)和TTadc-pCL1920_R(SEQ IDN°4)扩增质粒pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11。以DpnI消化PCR产物以消除亲本DNA模板。将剩余的粘性悬突磷酸化并引入大肠杆菌菌株以形成质粒pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11。以DNA测序验证TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的插入，尤其是thrA基因上游的RBS01序列的存在。所述测序使用如下的引物：
PR-RBS01_F(SEQ ID N°3)
ACGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACAATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTT ATAAATGAGAGTGTTGAAGTTCGG
其中
-大写字母序列与lambda噬菌体PR启动子(PlambdaR*(-35)同源(Mermet-Bouvier&Chauvat，1994，Current Microbiology，vol.28，pp145-148;Tsurimoto T，Hase T，Matsubara H，Matsubara K，Mol Gen Gent.1982;187(1):79-86)。
-下划线大写字母序列对应于具有PsiI限制性位点的RBS01序列。
-粗体大写字母序列对是thrA(1-20)的5’末端同源物
TTadc-pCL1920_R(SEQ ID N°4)
TAAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGC
其中
-大写字母序列与TTadc转录终止序列(来自丙酮丁醇梭菌的adc基因的转录终止子，与pSLO1巨大质粒从179847到179807同源)同源，
-粗体大写字母序列与pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11质粒同源。
pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm质粒的构建
为构建ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm片段，通过PCR链接pgaA(uppgaA)的上游区域、TT02转录终止子、多克隆位点(MCS)以及pgaD(downpgaD)的下游区域。接下来扩增氯霉素盒(Cm)并加入前述构建体。
首先，用引物Ome1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F(SEQ ID N°5)和引物Ome1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R(SEQ ID N°6)通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组DNA中扩增uppgaA-TT02。然后，用引物Ome1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F(SEQ ID N°7)和引物Ome1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R(SEQ ID N°8)通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组中扩增TT02-MCS-down-pgaD片段。设计引物Ome1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R(SEQ ID N°6)和引物Ome1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F(SEQ ID N°7)使其在一个36-核苷酸长的区域重叠。最后，通过混合uppgaA-TT02和TT02-MCS-down-pgaD扩增产物并以引物Ome1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F(SEQ ID N°5)和引物Ome1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R(SEQ ID N°8)扩增uppgaA-TT02-MCS-downpgaD片段。以HpaI消化产生的融合PCR产物并克隆进以大肠杆菌DNA聚合酶I的Large(Klenow)片段处理的pUC18质粒的HindIII和EcoRI之间。以DNA测序检验产生的质粒，并将其命名为pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS。
Ome1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F(SEQ ID N°5)
CGTAGTTAACGAATTCGACTAGAAAGTATGTGAGCAACTATCGGCCCCCC
其中
-粗体大写字母序列是HpaI和EcoRI限制位点和额外的碱基。
-大写字母序列与pgaA基因上游序列(1092609-1092576，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
Ome1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R(SEQ ID N°6)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGC CTTTCGTTTTATTTGATGAGGCTGCGCTACGGCACTCACGG
其中
-粗体大写字母序列是BstZ17I限制位点和额外的碱基。
-下划线大写字母序列对应于大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(Orosz A，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov1;201(3):653-9)。
-大写字母序列与pgaA基因上游序列(1091829-1091851，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
Ome1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F(SEQ ID N°7)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTAATTAAGGG CCCGGGCGGATCCCCCAAAACAAAGCCCGGTTCGC
其中
-粗体大写字母序列与大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(Orosz A，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov1;201(3):653-9)的3’末端序列互补。
-下划线大写字母序列含有MCS多克隆位点：BstZ17I、HindIII、PacI、ApaI、BamHI。
-大写字母序列与pgaD基因的上游序列(1085325-1085304，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
Ome1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R(SEQ ID N°8)
CGTAGTTAACGAATTCAGCTGATATTCGCCACGGGC
其中
-粗体大写字母序列是HpaI和EcoRI限制位点和额外的碱基。
-大写字母序列与pgaD基因的上游序列(1084714-1084733，参考序列在http://ecogene.org/上)同源。
最终，用引物Ome1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F(SEQ ID N°9)和引物Ome1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R(SEQ ID N°10)通过PCR从质粒pKD3上扩增氯霉素盒以及FRT序列，并将片段克隆到质粒pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS的BstZ17I和HindIII位点之间。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm。
Ome1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F(SEQ ID N°9)
TCCCCCGGGGTATACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-下划线大写字母序列是BstZ17I和SmaI限制位点以及额外的碱基。
-大写字母序列对应于质粒pKD3的位点引物1(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97:6640-6645)。
Ome1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R(SEQ ID N°10)
GCCCAAGCTTCATATGAATATCCTCCTTAG
其中
-下划线大写字母序列是HindIII限制位点以及额外的碱基。
-大写字母序列对应于pKD3质粒的位点引物2(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97:6640-6645)。
pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-Pga pA-metA*11::Cm的构建。
为构建pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm，将以上描述的从TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11中分离的ApaI/BamHI片段克隆到以上描述的质粒pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm的ApaI和BamHI位点之间。以DNA测序验证产生的质粒，并命名为pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。
I.3.2.菌株MG1655metA*11ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm(pKD46)的构建
为以TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm区域替换pgaABCD操纵子，以SapI和AatII限制性酶消化pUC18-pgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。将剩余的消化片段ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm根据规程1引入菌株MG1655metA*11pKD46。
选择氯霉素抗性的重组体，并用引物Ome1691-DpgaABCD_verif_F(SEQ ID N°11)和引物Ome1692-DpgaABCD_verif_R(SEQ ID N°12)(表2)通过PCR并通过DNA测序验证pgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰的存在。命名经过验证和选择的菌株MG1655metA*11ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm(pKD46)。
I.3.3.将ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm菌株转导至菌株2中。
将ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰转导至以上描述的菌株2(表1)中。所述转导是根据规程2将以上描述的来菌株MG1655metA*11pKD46ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的P1噬菌体裂解物转导至菌株2中。
选择氯霉素抗性的转导体，用引物Ome1691-DpgaABCD_verif_F(SEQID N°11)和引物Ome1692-DpgaABCD_verif_R(SEQ ID N°12)(表2)通过PCR验证pgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰的存在。将所得的菌株metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm命名为菌株3。
I.4.构建菌株4
I.4.1pUC18-uxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km质粒的构建
为构建pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km质粒，用大肠杆菌MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-Km的基因组DNA为模板，通过PCR获得ΔuxaCA::TT07-MCS-Km片段。将其克隆到pUC18(Norrander等,1983，基因26,101-106)中。
菌株MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-Km pKD46的构建
使用规程1将uxaCA区域替换为TT07-MCS-Km片段，但是使用的引物变更为Ome1506-DuxaCA-MCS-F(SEQ ID N°13)和Ome1507-DuxaCA-MCS-R(SEQ ID N°14)。使用该两个引物从pKD4质粒中扩增卡那霉素抗性盒。
Ome1506-DuxaCA-MCS-F(SEQ ID N°13)
GCAAGCTAGCTCACTCGTTGAGAGGAAGACGAAAATGACTCCGTTTATGACTGAAGATTTCCTGTTAGATACCGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCC TTTCTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-斜体大写字母序列与uxaCA基因座上游序列(3242797-3242724，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-下划线大写字母序列是来自噬菌体T7的T7Te转录终止子(HarringtonK.J.，Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr24;98(9):5019-24)序列。
-大写字母序列对应于质粒pKD4的引物位点2(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97:6640-6645)。
Ome1507-DuxaCA-MCS-R(SEQ ID N°14)
TTAACAACTCATTTCGACTTTATAGCGTTACGCCGCTTTTGAAGATCGCCGA ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCATCTCGAGATCCGCGGATGTATAC ATGGGCCCCATATGAATATCCTCCTTAG
其中
-斜体大写字母序列与uxaCA基因座下游序列(3239830-3239879，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-含有限制位点ApaI、BstZ17I、SacII、XhoI、AvaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、ΔRI的多克隆位点区域(下划线大写字母)。
-大写字母对应于质粒pKD4的引物位点1(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97:6640-6645)，
选择卡那霉素抗性重组体，用引物Ome1612-uxaCA_R3(SEQ ID N°15)和引物Ome1774-DuxaCA_F(SEQ ID N°16)(表2)通过PCR和DNA测序验证抗性盒的插入。将所述验证和选择的菌株命名为MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-Km pKD46。
质粒pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS::Km的构建
从上面描述的大肠杆菌MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-Km基因组DNA作为模板，用引物Ome1515-uxaCA-R2(SEQ ID N°17)和Ome1516-uxaCA-F2(SEQ ID N°18)扩增ΔuxaCA::TT07-MCS-Km区域。
Ome1515-uxaCA R2(SEQ ID N°17)
CCCACTGGCCTGTAATATGTTCGG，与uxaCA基因座下游序列(3239021-3239044)同源。
Ome1516-uxaCA F2(SEQ ID N°18)
ATGCGATATCGACCGTATAAGCAGCAGAATAGGC
其中
-下划线大写字母序列是选择性位点EcoRV和额外引物。
-斜体大写字母序列与uxaCA基因座(3243425-3243402)同源。
然后，以限制性酶EcoRV消化生成的PCR产物(通过钝末端DNA聚合酶获得)，并克隆进pUC18的SmaI位点中。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km。
pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Km的构建
为构建pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km，将来自以上描述的pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ApaI/BamH1消化片段克隆到上面描述的pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km的ApaI和BamHI位点中。以DNA测序验证生成的质粒，并将其命名为pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km。
I.4.2.菌株MG1655metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11(pKD46)的构建
为了以TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km区域替换uxaCA操纵子，以BamHI和AhdI消化pUC18-ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km，将剩余的消化片段uxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km根据规程1引入菌株MG1655metA*11pKD46。
选择卡那霉素抗性的重组体，并用引物Ome1612-uxaCA_R3(SEQ ID N°15)和引物Ome1774-DuxaCA_F(SEQ ID N°16)(表2)通过PCR和DNA测序验证ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km染色体修饰的存在。将生成的菌株命名为MG1655metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km(pKD46)。
I.4.3.将ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km转导入菌株3。
根据规程2将ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km的P1噬菌体裂解物转导入上面所述的菌株3。
用引物Ome1612-uxaCA_R3(SEQ ID N°15)和Ome1774-DuxaCA_F(SEQ ID N°16)(表2)通过PCR验证ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km染色体修饰。生成的菌株命名为metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::CmΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km。
最后，根据规程1除去上述菌株的氯霉素和卡那霉素抗性盒。用引物Ome1691-DpgaABCD_verif_F(SEQ ID N°11)、Ome1692-DpgaABCD_verif_R(SEQ ID N°12)、Ome1612-uxaCA_R3(SEQ ID N°15)和Ome1774-DuxaCA_F(SEQ ID N°16)(表2)通过PCR验证氯霉素和卡那霉素抗性盒的丢失。所得的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11命名为菌株4。
I.5.构建菌株5
I.5.1.质粒pMA-DCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km的构建
质粒pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km衍生自上面描述的pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11，以及下面描述的pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Km。
质粒pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Km的构建
首先，由GeneArt(http://www.geneart.com/)合成pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS。将ΔCP4-6::TT02-MCS片段克隆入来自GeneArt的pMA的AscI和PacI位点。其含有鉴定为SEQ ID N°19的以下序列：
ggcgcgccaggcctagggCCGACGATGTACGTCAGGTGTGCAACCTCGCCG ATCCGGTGGGGCAGGTAATCGATGGCGGCGTACTGGACAGCGGCCTGC GTCTTGAGCGTCGTCGCGTACCGCTGGGGGTTATTGGCGTGATTTATGA AGCGCGCCCGAACGTGACGGTTGATGTCGCTTCGCTGTGCCTGAAAAC CGGTAATGCGGTGATCCTGCGCGGTGGCAAAGAAACGTGTCGCACTAA CGCTGCAACGGTGGCGGTGATTCAGGACGCCCTGAAATCCTGCGGCTT ACCGGCGGGTGCCGTGCAGGCGATTGATAATCCTGACCGTGCGCTGGT CAGTGAAATGCTGCGTATGGATAAATACATCGACATGCTGATCCCGCGT GGTGGCGCTGGTTTGCATAAACTGTGCCGTGAACAGTCGACAATCCCG GTGATCACAGGTGGTATAGGCGTATGCCATATTTACGTTGATGAAAGTG TAGAGATCGCTGAAGCATTAAAAGTGATCGTCAACGCGAAAACTCAGC GTCCGAGCACATGTAATACGGTTGAAACGTTGCTGGTGAATAAAAACA TCGCCGATAGCTTCCTGCCCGCATTAAGCAAACAAATGGCGGAAAGCG GCGTGACATTACACGCAGATGCAGCTGCACTGGCGCAGTTGCAGGCAG GCCCTGCGAAGGTGGTTGCTGTTAAAGCCGAAGAGTATGACGATGAGT TTCTGTCATTAGATTTGAACGTCAAAATCGTCAGCGATCTTGACGATGC CATCGCCCATATTCGTGAACACGGCACACAACACTCCGATGCGATCCTG ACCCGCGATATGCGCAACGCCCAGCGTTTTGTTAACGAAGTGGATTCG TCCGCTGTTTACGTTAACGCCTCTACGCGTTTTACCGACGGCGGCCAGT TTGGTCTGGGTGCGGAAGTGGCGGTAAGCACACAAAAACTCCACGCG CGTGGCCCAATGGGGCTGGAAGCACTGACCACTTACAAGTGGATCGGC ATTGGTGATTACACCATTCGTGCGTAACATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTAATAAGGGCCCGGGCGGATCCCACCACGTTTCCTCCTGTGCCGTATTTGTGCCATTGTAACCTTGGCAATTCATCAAAATACTGTTCTGACATCAGGCAGTGCAGGTGCAGACATTTAAGCCAATTGCTGCCGCCATTCTTTGACGTAGTCAATCAGGGCGCGGAGCTTTGGTGCAATATTGCGACGCTGTGGGAAATACAGATAGAAGCCCGGAAATTGTGGAAGAAAGTCATCAAGCAGCGATACAAGTTTACCGCTTTCAATATATGGCCTGAAAGTTTCCTGAGTGGCAATTGTTATTCCTCCGCCGGCAAGAGCCAGCCTCAACATCAGACGCAGATCATTAGTCGTAATCTGCGGTTCAATCGCAAGGTCGAAAGTTCTCCCGTTTTCTTCAAATGGCCAGCGATAAGGCGCAACCTCCGGGGACTGACGCCAGCCGATACACTTATGGGTATTTCCCCCGGAGGCGAGAAAGCACTCTCCACGCCCGGCCGCAAGGATCAGGACGACGGGGGCAGGCATGAATCCTCCTCCTGATGGAGACGTACAGAGGCGACTTCTGCCAGCACGGAGAGTGCCAGAGTATGCGCATCCCGGGCTTTGGGGAATATCCCGACGGGTGCCCGGATTTGCGTTGTTTCCTCCCTGGACCATCCCAGCTCGTGGAGCTTTTGCAGACGTAACGTGTGGGTTCGATAGCTGCCCAATGCGCCGAGATAAAAGGGTTTTGCTTCTCGCGCGGCCTGCAACACTGGCAGCTCCCGGTTGAGATCATGGCACAGCAAAATGACCGCCGTATCGGTATCGATCTGAGCGCTGGCTGAGGCCGGAAAAAGATCGAAGATATGGCTGTCATAGCCTGTGGCTGCTGCAAGACTCGCGGTTGCCTGCGCCTCAAGAGAACGTCCGTAAATCATCAGCCTGACGCATGGCCTGAACCCCACCTCAAAGCCATTGAGATTCCAGCCCGTCCGGGTTTGCGTGGGCAGGCACACCAGCGATTGTGCTTGCGGATCGTAGCGCAGCCCCACCGGTTTTCTCTGTTCCAGGCGGTTCAGCACGGCGAGCAGAGGCTGTGCCGAGCGTAGggtacctcttaattaa
-小写字母对应于AscI、StuI和AvrII限制性位点。
-下划线小写字母与CP4-6基因座的上游序列(260955-261980，http://ecogene.org/)同源。
-粗体大写字母对应于来自大肠杆菌rrnB基因的T1的TT02转录终止子序列(Orosz A，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov1;201(3):653-9)。
-斜体大写字母序列对应于含有BstZ17I、HindIII、ApaI、SmaI和BamH1限制性位点的MCS。
-大写字母与CP4-6基因座的上游序列(296511-297581,http://ecogene.org/)同源。
-下划线小写字母对应于KpnI和PacI限制性位点。
第二，用引物Ome1605-K7_Km_ampl_SmaI_BstZ17I_F(SEQ ID N°20)和Ome1606-K7_Km_ampl_HindIII_R(SEQ ID N°21)从质粒pKD4中扩增卡那霉素盒，并接下来克隆至pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS的BstZ17I和HindIII限制性位点之间。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS-Km。
Ome1605-K7_Km_ampl_SmaI_BstZ17I_F(SEQ ID N°20)
TCCCCCGGGGTATACCATATGAATATCCTCCTTAG
其中
-下划线大写字母序列是BstZ17I和SmaI限制性位点和额外的碱基。
-大写字母序列对应于质粒pKD4的位点引物1(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97:6640-6645)
Ome1606-K7_Km_ampl_HindIII_R(SEQ ID N°21)
GCCCAAGCTTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-下划线大写序列是HindIII限制性位点和额外的碱基。
-大写字母序列对应于质粒pKD4的位点引物2(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97:6640-6645)。
为构建pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km，将来自上面描述的pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的ApaI/BamHI消化片段TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11克隆入上面描述的pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS-Km的ApaI和BamHI位点。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km。
I.5.2.菌株MG1655metA*11DCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km(pKD46)的构建
为以TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km片段替换CP4-6操纵子，以KpnI和AvrII消化质粒pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km。根据规程1将剩余的消化片段ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km引入菌株MG1655metA*11pKD46。
选择卡那霉素抗性重组体，用引物Ome1775-DCP4-6_verif_F(SEQ ID N°22)和Ome1776-DCP4-6_verif_R(SEQ ID N°23)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km染色体修饰。生成的菌株命名为MG1655metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km(pKD46)。
I.5.3.将ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km转导至菌株4中并除去抗性盒。
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km的P1噬菌体裂解物将ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km转导入上面描述的菌株4(表1)。
选择卡那霉素抗性的转导物，并用引物Ome1775-DCP4-6_verif_F(SEQ IDN°22)和Ome1776-DCP4-6_verif_R(SEQ ID N°23)(表2)通过PCR验证ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km染色体修饰的存在。生成的菌株命名为MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km。
最终，使用规程1除去上述菌株的卡那霉素抗性盒。用引物Ome1775-DCP4-6_verif_F(SEQ ID N°22)和Ome1776-DCP4-6_verif_R(SEQID N°23)(表2)通过PCR验证卡那霉素抗性盒的丢失。生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11命名为菌株5。
I.6.构建菌株6
为了将分别编码磷酸甘油酸脱氢酶和磷酸丝氨酸氨基转移酶大肠杆菌TT02-serA-serC区域插入treBC基因座，使用了两个步骤的方法。首先，构建pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt；第二，根据规程1，将含有与treBC基因座的上游与下游区域的ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt同源的片段重组进入染色体。
I.6.1.质粒pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt的构建
质粒pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt是从下面描述的pMA-ΔtreBC::TT02-MCS::Gt、p34S-Gm(Dennis et Zyltra,AEM july1998,p2710-2715)以及在专利申请PCT/FR2009/052520中描述的pUC18-serA-serC中衍生的。
首先，由GeneArt(http://www.geneart.com/)合成质粒pMA-ΔtreBC::TT02-MCS。将ΔtreBC::TT02-MCS片段克隆入来自GeneArt的质粒pMA的AscI和PacI位点中。其含有鉴定为SEQ ID N°24的以下序列：ggcgcgccgGCAATCAAAATCCTGATGCAACGGCTGTATGACCAGGGGCAT CGTAATATCAGTTATCTCGGCGTGCCGCACAGTGACGTGACAACCGGTA AGCGACGTCACGAAGCCTACCTGGCGTTCTGCAAAGCGCATAAACTGC ATCCCGTTGCCGCCCTGCCAGGGCTTGCTATGAAGCAAGGCTATGAGA ACGTTGCAAAAGTGATTACGCCTGAAACTACCGCCTTACTGTGCGCAA CCGACACGCTGGCACTTGGCgcaagtaaatacctgcaagagcaacgcatcgacaccttgcaactggcgagcgtcggtaatacgccgttaatgaaattcctccatccggagatcgtaaccgtagatcccggttacgccgaagctggacgccaggcggcttgccagttgatcgcgcaggtaaccgggcgcagcgaaccgcaacaaatcatcatccccgccaccctgtcctgatcgtttcctgaacgataaattgtgatctCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTAATAAGGGCCCGGGCGGATCCGTCTGTCAGTATGTTGTTTTTGTTGATTTTTCAACCAGCAAATTCATTAAAAAATTTACATATCGCTGTAGCGCCCGTCATCCGTACGCTCTGCTTTTTACTTTGAGCTACATCAAAAAAAGCTCAAACATCCTTGATGCAAAGCACTATATATAGACTTTAAAATGCGTCCCAACCCAATATGTTGTATTAATCGACTATAATTGCTACTACAGCTCCCCACGAAAAAGGTGCGGCGTTGTGGATAAGCGGATGGCGATTGCGGAAAGCACCGGAAAACGAAACGAAAAAACCGGAAAACGCCTTTCCCAATTTCTGTGGATAACCTGTTCTTAAAAATATGGAGCGATCATGACACCGCATGTGATGAAACGAGACGGCTGCAAAGTGCCGTTTAAATCAGAGCGCATCAAAGAAGCGATTCTGCGTGCAGCTAAAGCAGCGGAAGTCGATGATGCCGATTATTGCGCCACTGTTGCCGCGGTTGTCAGCGAGCAGATGCAGGGCCGCAACCAGGTGGATATCAATGAGATCCAGACCGCAGTTGAAAATCAGCTGttaattaa
-小写字母对应于AscI限制性位点。
-下划线大写字母是与treBC基因座上游与下游(4460477-4461034)同源的序列
-粗体大写字母对应于来自大肠杆菌rrnB基因T1终止子的TT02转录终止序列(Orosz A,Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov1;201(3):653-9)。
-斜体大写字母对应于含有BstZ17I、HindIII、ApaI、SmaI和BamH1限制性位点的多克隆位点。
-大写字母是与treBC基因座下游序列同源的序列(4464294-4464787)。
-斜体小写字母对应于PacI限制性位点。
为了构建质粒pMA-ΔtreBC::TT02-MCS::Gt，用引物BstZ17I-FRT-Gt-F(SEQ ID N°25)和HindIII-FRT-Gt-R(SEQ ID N°26)，使用p34S-Gm作为模板通过PCR扩增FRT-Gt-FRT抗性盒。
BstZ17I-FRT-Gt-F(SEQ ID N°25)
TCCCCCGGGGTATACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAGATGGGTACCGAGCTCGAATTG
其中
-下划线大写字母序列是SmaI和BstZ17I限制性位点和额外的碱基。
-粗体大写字母序列对应于FRT序列(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
-大写字母序列与位于p34S-Gm的庆大霉素基因的序列(Dennis et Zyltra,AEM July1998,p2710-2715)同源。
HindIII-FRT-Gt-R(SEQ ID N°26)
CCCAAGCTTCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGCGCGGATGGGTACCGAGCTCGAATTG
其中
-下划线大写字母序列是HindIII限制性位点和额外的碱基。
-粗体大写字母序列对应于FRT序列(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
-大写字母序列与位于p34S-Gm的庆大霉素基因的序列(Dennis et Zyltra,AEM July1998,p2710-2715)同源。
将FRT-Gt-FRT PCR产物克隆至pMA-ΔtreB::TT02-MCS的BstZ17I和HindIII位点之间。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gt。
为构建最终质粒pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt，以HindIII消化pUC18-serA-serC，将产生的serA-serC片段克隆入已由HindIII线性化的质粒pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gt中。以DNA测序验证生产的质粒，并命名为pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt。
I.6.2.菌株MG1655metA*11pKD46ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt的构建
为了以TT02-serA-serC::Gt片段替换treBC基因，以ApaI和SalI消化pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt。根据规程1将剩余的消化片段ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt引入菌株MG1655metA*11pKD46。
选择庆大霉素抗性的重组体，并用引物Ome1595-DtreB_verif_F(SEQ IDN°27)和Ome1596-DtreB_verif_R(SEQ ID N°28)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt片段的存在。生成的菌株命名为MG1655metA*11pKD46ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt。
I.6.3.将ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt转导入菌株5
接下来根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt的P1噬菌体裂解物将ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt染色体修饰转导入菌株5中。
选择庆大霉素抗性的转导体，用Ome1595-DtreB_verif_F(SEQ ID N°27)和Ome1596-DtreB_verif_R(SEQ ID N°28)(表2)通过PCR验证DtreBC::TT02-serA-serC::Gt染色体修饰的存在。生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt命名为菌株6。
I.7.将Ptrc36-metF::Km转导入菌株6以构建菌株7
专利申请WO2007/077041已经描述了在菌株MG1655metA*11ΔmetJPtrc36-metF::Km的metF基因座整合人工启动子以过表达metF基因。
根据规程2，用来自菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metF::Km的P1噬菌体裂解物将Ptrc36-metF::Km启动子构建体转导进入菌株6(表1)。
选择卡那霉素抗性转导体，并用引物Ome0726-PtrcmetF-F(SEQ ID N°29)和Ome0727-PtrcmetF-R(SEQ ID N°30)(表2)通过PCR验证Ptrc36-metF::Km启动子构建体的存在。生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc36-metF::Km命名为菌株7。
II.实施例2：构建菌株9，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::Km
II.1.构建菌株8
II.1.1.通过除去卡那霉素抗性盒以构建MG1655metA*11ΔmetJPtrc36-metF。
根据规程1去除了专利申请WO2007/077041中描述的菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metF::Km的卡那霉素抗性。用引物Ome0726-PtrcmetF-F(SEQ ID N°29)和Ome0727-PtrcmetF-R(SEQ ID N°30)(表2)验证了卡那霉素抗性盒的丢失。生成的菌株命名为MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metF。
II.1.2.MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metFΔudhA::Km pKD46的构建
为缺失菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metF中的udhA基因，使用了规程1，只是使用引物Ome0032-DUdhAF(SEQ ID N°31)和Ome0034-DUdhAR(SEQ ID N°32)以从质粒pKD4中扩增卡那霉素抗性盒。
选择卡那霉素抗性重组体，用Oag0055-udhAF2(SEQ ID N°33)和Oag0056-udhAR2(SEQ ID N°34)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证卡那霉素抗性盒的插入。命名生成的菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metFΔudhA::Km pKD46。
Ome0032-DUdhAF(SEQ ID N°31)
GGTGCGCGCGTCGCAGTTATCGAGCGTTATCAAAATGTTGGCGGCGGTTGCACCCACTGGGGCACCATCCCGTCGAAAGCCATATGAATATCCTCCT TAG
其中
-大写字母序列与udhA基因的上游序列(4158729-4158650,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-下划线大写字母序列对应于质粒pKD4的引物位点1(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
Ome0034-DUdhAR(SEQ ID N°32)
CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCACGTTCATGCCGACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCT TCG
-大写字母序列与udhA基因的下游序列(4157588-4157667,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-下划线大写字母序列对应于质粒pKD4的引物位点2(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
II.1.3.将Ptrc36-metFΔudhA::Km共转导到菌株6中
基因udhA和metF在大肠杆菌染色体上靠的很近，分别在89.61分钟和89.03分钟。由于噬菌体P1可以包装2min的大肠杆菌染色体，基因udhA和metF可以共转导。因此根据规程2，通过使用来自上面描述的菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metFΔudhA::Km pKD46的P1噬菌体裂解物将上面描述的Ptrc36-metF启动子修饰和ΔudhA::Km缺失共转导入菌株6(表1)。
选择卡那霉素抗性转导体。用引物Ome0726-PtrcmetF-F(SEQ ID N°29)和Ome0727-PtrcmetF-R(SEQ ID N°30)通过PCR和通过DNA测序验证ΔudhA::Km缺失的存在。将生成的菌株metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtΔudhA::Km命名为菌株8。
II.2.构建菌株9
II.2.1.菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc01-pntAB::Cm的构建
为了提高吡啶核苷酸转氢酶α和β亚基，即PntA和PntB的表达，根据规程1将组成型人工trc01启动子添加到菌株MG1655metA*11pKD46的pntAB操纵子的上游，只是用引物Ome1149-Ptrc-pntAF(SEQ ID N°35)和Ome1150-Ptrc-pntAR(SEQ ID N°36)从质粒pKD3中扩增氯霉素抗性盒。用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证人工启动子Ptrc01的存在。产生的菌株命名为MG1655metA*11pKD46Ptrc01-pntAB::Cm。
Ome1149-Ptrc-pntAF(SEQ ID N°35)
GCTCGTACATGAGCAGCTTGTGTGGCTCCTGACACAGGCAAACCATCATCAATAAAACCGATTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTC TGCCATATGAATATCCTCCTTAG
其中
-大写字母序列与pntA基因上游序列(1676002-1675941参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-下划线大写字母序列是来自噬菌体T7的T7Te转录终止子序列(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr24;98(9):5019-24.)。
-斜体大写字母序列对应于质粒pKD3的引物位点1(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
Ome1150-Ptrc-pntAR(SEQ ID N°36)
GCTGCAACACGGGTTTCATTGGTTAACCGTTCTCTTGGTATGCCAATTCGCATGATATTCCCTTCCTTCCACACATTATACGAGCCGGATGAT TAATTGTCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-大写字母序列与pntA基因的上游的序列(1675875-1675940,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-斜体大写字母对应于质粒pKD3的引物位点2(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
II.2.2.将Ptrc01-pntAB::Cm转导进入菌株8
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc01-pntAB::Cm的P1噬菌体裂解物将Ptrc01-pntAB::Cm启动子修饰转导入菌株8(表1)。
选择氯霉素抗性转导体，并用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证Ptrc01-pntAB::Cm染色体修饰的存在。产生的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::Km命名为菌株9。
III.实施例3：构建菌株10，MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC
III.1.构建菌株pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
质粒pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm衍生自上面描述的质粒pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11和下面描述的质粒pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS::Cm。
III.1.1.构建质粒pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS::Cm
为构建DwcaM::TT02-MCS::Cm片段，在wcaM上游区域(upwcaM)、TT02转录终止子、多克隆位点(MCS)和wcaM下游区域(downwcaM)之间进行了重叠的PCR，将氯霉素盒(Cm)扩增并随后克隆。
首先，用引物Ome1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F(SEQ ID N°39)和Ome1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R(SEQ ID N°40)通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组DNA中扩增upwcaM-TT02片段。然后用引物Ome1705-DwcaM-MCS-BstZ17I-F(SEQ ID N°41)和Ome1706-DwcaM-EcoRI-R(SEQ ID N°42)通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组DNA中扩增TT02-MCS-downwcaM片段。设计引物Ome1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R(SEQID N°40)和Ome1705-DwcaM-MCS-BstZ17I-F(SEQ ID N°41)，使之由36个核苷酸长的重叠。最后，通过混合upwcaM-TT02和TT02-MCS-downwcaM扩增子并用引物Ome1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F(SEQ ID N°39)和Ome1706-DwcaM-EcoRI-R(SEQ ID N°42)扩增upwcaM-TT02-MCS-downwcaM片段。以HpaI消化生成的融合PCR产物并克隆到以大肠杆菌DNA聚合酶Large(Klenow)片段处理的pUC18质粒的HindIII和EcoRI位点之间。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS。
Ome1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F(SEQ ID N°39)
CGTAGTTAACGAATTCCTGCGCCACCGAGCCAGCCAGACCTTGCGC
其中
-下划线大写字母序列是HpaI和EcoRI限制性位点以及额外的碱基。
-大写字母序列与wcaM基因的下游序列(2114909-2114938,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
Ome1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R(SEQ ID N°40)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGC CTTTCGTTTTATTTGATGGCGTTCTCCTCTATAAAGCCTGCAGCAAGC
其中
-粗体大写字母序列是BstZ17I限制性位点和额外碱基，
-下划线大写字母对应于大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(Orosz A,BorosI和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov1;201(3):653-9)的序列
-大写字母序列与wcaM基因的下游序列(2113921-2113950,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
Ome1705(DwcaM-MCS-BstZ17I-F)(SEQ ID N°41)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTAATTAAGGG CCCGGGCGGATCCATTTGCGACCATTCCTGGAAAAATGGAGTC
其中
-粗体大写字母序列与大肠杆菌rrnB的转录终止子T1的3’末端序列(roszA,Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov1;201(3):653-9)互补，
-下划线大写字母序列含有多克隆位点：BstZ17I、HindIII、PacI、ApaI、BamHI，
-大写字母序列与wcaM基因的上游序列(2112496-2112525,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
Ome1706(DwcaM-EcoRI-R)(SEQ ID N°42)
CGTAGTTAACGAATTCCGCCCCTTCTTTCAGGTTGCGTAGGCCATAC
其中
-粗体大写字母序列是HpaI和EcoRI限制性位点和额外的碱基，
-大写字母序列与wcaM基因的上游序列(2111497-2111527,参照序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
最后，使用上面描述的引物Ome1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F(SEQ ID N°9)和Ome1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R(SEQ ID N°10)从质粒pKD3中扩增氯霉素盒。接着将所述盒克隆到质粒pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS的BstZ17I和HindIII位点之间。以DNA测序验证产生的质粒，并命名为pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cm。
III.1.2.构建质粒pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
为构建pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm，将上面描述的来自pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的ApaI/BamHI消化片段TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11克隆到上面描述的pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cm的ApaI和BamHI位点之间。以DNA测序验证获得的质粒，并命名为pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。
III.2.构建菌株MG1655metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm pKD46
为了以TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm区域替换wcaM基因，以BspHI消化质粒pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm，根据规程1将剩余的消化片段ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm引入菌株MG1655metA*11pKD46。
选择氯霉素抗性重组体，并用引物Ome1707-DwcaM_verif_F(SEQ IDN°43)和Ome1708-DwcaM_verif_R(SEQ ID N°44)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰。经过验证和选择的菌株命名为MG1655metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm(pKD46)。
III.3.将DwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm转导入菌株6以及除去抗性盒
构建规程2用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的P1噬菌体裂解物将ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰转导入上面描述的菌株6。
选择氯霉素抗性转导体，并用Ome1707-DwcaM_verif_F(SEQ ID N°43)和Ome1708-DwcaM_verif_R(SEQ ID N°44)(表2)通过PCR验证ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰的存在。生成的菌株命名为metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。
根据规程1除去上述菌株的庆大霉素盒和氯霉素盒。分别用引物Ome1595-DtreB_verif_F(SEQ ID N°27)和Ome1596-DtreB_verif_R(SEQ ID N°28)以及primers Ome1707-DwcaM_verif_F(SEQ ID N°43)和Ome1708-DwcaM_verif_R(SEQ ID N°44)(表2)验证庆大霉素抗性盒和氯霉素抗性盒的丢失。产生的菌株metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC命名为菌株10。
IV.实施例4：构建菌株12，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm pCL1920-PgapA-pycre-TT07
IV.1.将Ptrc01-pntAB::Cm转导入菌株10以产生菌株11
根据规程2，以P1噬菌体裂解物将上面描述的Ptrc01-pntAB::Cm启动子修饰转导至菌株10(表1)。所述P1噬菌体裂解物来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc01-pntAB::Cm。
选择氯霉素抗性转导体，并用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证Ptrc01-pntAB::Cm染色体修饰的存在。生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm命名为菌株11。
IV.2.构建pCL1920-PgapA-pycRe-TT07并引入菌株11
为了过表达来自埃特里根瘤菌的丙酮酸羧化酶基因，构建了pCL1920-PgapA-pycRe-TT07，其源自质粒pCL1920(Lerner&Inouye,1990,NAR18,15p4631)。
为了构建PgapA-pycRe-TT07插入物，使用了gapA启动子、其核糖体结合位点以及来自埃特里根瘤菌的pycRe基因之间的重叠PCR。
首先，用引物PgapA-SalI-F(SEQ ID N°45)和PgapA-pycRe-R(SEQ IDN°46)通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组DNA中扩增gapA启动子和RBS区域(对应于gapA启动密码子上游的-156到-1区域)。然后用引物PgapA-pycRe F(SEQ ID N°47)和pycRe-TT07-SmaI-R(SEQ ID N°48)从埃特里根瘤菌CFN42染色体DNA中扩增pycRe基因。设计引物PgapA-pycRe-R(SEQ ID N°46)和PgapA-pycRe F(SEQ ID N°47)使之通过42个核苷酸长的区域重叠。最后，通过混合gapA promoter-RBS和pycRe扩增子并用引物PgapA-SalI-F(SEQ IDN°45)和pycRe-TT07-SmaI-R(SEQ ID N°48)扩增得到PgapA-RBSgapA-pycRe-TT07片段。将生成的融合PCR产物克隆到质粒pCL1920的SalI和SmaI位点之间。以DNA测序验证生成的质粒，并命名为pCL1920-PgapA-pycRe-TT07。
PgapA-SalI-F(SEQ ID N°45)
ACGCGTCGACGGTATCGATAAGCTTCGTTTAAACAAGCCCAAAGGAAGAGTGA
-下划线大写字母序列是SalI、ClaI、HindIII和PmeI限制性位点和额外的碱基，
-粗体大写字母序列与gapA启动子序列(1860640-1860658,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
PgapA-pycRe-R(SEQ ID N°46)
GTATCTTGGATATGGGCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAG
其中
-粗体大写字母序列与gapA基因的启动子(1860772-1860791,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源，
-大写字母序列与pycRe基因同源，除了将pycRe的GTG起始密码子替换为ATG(4236889-4236906,参考序列在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上)。PgapA-pycRe F(SEQ ID N°47)
CTAACAAATAGCTGGTGGAACATATGCCCATATCCAAGATAC
其中
-粗体大写字母序列与与gapA基因的启动子(1860772-1860791，参考序列在网站http://ecogene.org/上)
-大写字母序列与pycRe基因同源，除了将pycRe的GTG起始密码子替换为ATG(4236889-4236906,参考序列在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上)。
pycRe-TT07-SmaI-R(SEQ ID N°48)
TCCCCCCGGGGATCCGAATTCGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGCTCGAGGGCAAGGACGGGCGAACGAAACCTTTCGTGCCGTTCGCTCATCCGCCGTAAACCGCCAG
其中
-下划线大写字母序列是SmaI、BamHI和EcoRI限制性位点和额外的碱基，
-大写字母序列对应于来自T7噬菌体的T7Te转录终止子序列(HarringtonK.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr24;98(9):5019-24)，
-斜体大写字母序列是XhoI限制性位点和额外的碱基，
-粗体大写字母序列与pycRe的下游序列(4240332-4240388,参考序列在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上)同源。
然后通过电穿孔将pCL1920-PgapA-pycRe-TT07引入菌株11(表1)中。验证质粒pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在，生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm pCL1920-PgapA-pycRe-TT07命名为菌株12。
V.实施例5：构建菌株13，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::Km
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metFΔudhA::Km pKD46的P1噬菌体裂解物将之前描述的ΔudhA::Km缺失转导入菌株11(表1)。。
选择卡那霉素抗性的转导体。用引物Ome0726-PtrcmetF-F(SEQ ID N°29)和Ome0727-PtrcmetF-R(SEQ ID N°30)(表2)通过PCR和DNA测序验证Ptrc36-ARNmst17-metF启动子修饰的存在，用引物Oag0055-udhAF2(SEQ IDN°33)和Oag0056-udhAR2(SEQ ID N°34)(表2)通过PCR验证ΔudhA::Km缺失的存在。生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::Km命名为菌株13。
VI.实施例6：构建菌株14，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::Km
基因udhA和metF在大肠杆菌的染色体上靠得很近，分别在89.61分钟和89.03分钟处。由于噬菌体P1可以包装2min的大肠杆菌染色体，基因udhA和metF是可以共转导的。因此，根据规程2，通过来自上面描述的菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metFΔudhA::Km pKD46的P1噬菌体裂解物将Ptrc36-metF启动子修饰和ΔudhA::Km缺失共转导入菌株11(表1)。
选择卡那霉素抗性转导体。用引物Ome0726-PtrcmetF-F(SEQ ID N°29)和Ome0727-PtrcmetF-R(SEQ ID N°30)通过PCR和通过DNA测序验证ΔudhA::Km缺失的存在。产生的菌株MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::Km命名为菌株14。
VII.实施例7：构建菌株15，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07
将之前描述的pCL1920-PgapA-pycRe-TT07通过电穿孔引入菌株13(表1)。验证质粒pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在，生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株15。
VIII.实施例8：构建菌株18，MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07
VIII.1.通过除去菌株13的抗性盒构建菌株16
根据规程1，将上面描述的菌株13的卡那霉素和氯霉素抗性盒除去。用引物Oag0055-udhAF2(SEQ ID N°33)、Oag0056-udhAR2(SEQ ID N°34)、Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证卡那霉素和氯霉素抗性盒的丢失。生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntABΔudhA pCL1920-PgapA-pycRe-TT07命名为菌株16。
VIII.2.构建菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc30-pntAB::Cm
为提高吡啶核苷酸转氢酶α和β亚基，PntA和PntB的表达水平，根据规程1在菌株MG1655metA*11pKD46中pntA-pntB操纵子的上游添加组成型人工trc30启动子，只是使用引物Ome2104Ptrc30-pntAR(SEQ ID N°49)和Ome1150-Ptrc-pntAF(SEQ ID N°36)从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。
选择氯霉素抗性的重组体。用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证人工启动子trc30的存在和抗性盒的插入。选择和验证的菌株命名为MG1655metA*11pKD46Ptr30-pntAB::Cm。
Ome2104Ptrc30-pntA R(SEQ ID N°49)
GCTGCAACACGGGTTTCATTGGTTAACCGTTCTCTTGGTATGCCAATTCGCATGATATTCCCTTCCTTCCACACAGTATACGAGCCGGATGATTAATCG TCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-大写字母序列与pntA基因的上游序列(1675875-1675940,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-下划线大写字母序列是trc30启动子序列。
-斜体字母序列对应于pKD3质粒的引物位点2(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
VIII.3.通过将Ptrc30-pntAB::Cm转导入菌株16构建菌株17
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc30-pntAB::Cm的P1噬菌体裂解物将Ptrc30-pntAB::Cm启动子修饰转导入菌株16(表1)。
选择氯霉素抗性转导体并用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证Ptrc30-pntAB::Cm染色体修饰的存在。将经过验证和选择的菌株metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::CmΔudhA命名为菌株17。
VIII.4.通过将pCL1920-PgapA-pycre-TT07引入菌株17构建菌株18
通过电穿孔将前面描述的pCL1920-PgapA-pycRe-TT07引入菌株17(表1)。验证质粒pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在并将生成的菌株metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株18。
IX.实施例9：构建菌株20，MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc97-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07
IX.1.构建菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc97-pntAB::Cm
为提高吡啶核苷酸转氢酶α和β亚基，PntA和PntB的表达水平，根据规程1在菌株MG1655metA*11pKD46中pntA-pntB操纵子的上游添加组成型人工trc97启动子，只是使用引物Ome2105Ptrc97-pntAR(SEQ ID N°50)和Ome1150-Ptrc-pntAF(SEQ ID N°36)从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。
选择氯霉素抗性转导体并用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证人工启动子trc97的存在以及抗性盒的插入。将经过验证和选择的菌株命名为MG1655metA*11pKD46Ptr97-pntAB::Cm。
Ome2105Ptrc97-pntAR(SEQ ID N°50)
GCTGCAACACGGGTTTCATTGGTTAACCGTTCTCTTGGTATGCCAATTCGCATGATATTCCCTTCCTTCCACACATTTTACGAGCCGGATGATTAATAG CCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-大写字母序列与pntA基因的上游序列(1675875-1675940,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源，
-下划线大写字母序列是trc97启动子序列，
-斜体大写字母序列对应于pKD3质粒的引物位点2(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
IX.2.通过将Ptrc97-pntAB::Cm引入菌株16构建菌株19
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc97-pntAB::Cm的P1噬菌体裂解物将Ptrc97-pntAB::Cm启动子修饰转导入菌株16(表1)。
选择氯霉素抗性转导体，并用Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证Ptrc97-pntAB::Cm染色体修饰的存在。将经过验证和选择的菌株MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc97-pntAB::CmΔudhA命名为菌株19。
IX.3.通过将pCL1920-PgapA-pycre-TT07引入菌株19构建菌株20
将前面描述的pCL1920-PgapA-pycRe-TT07通过电穿孔引入菌株19(表1)中。验证质粒pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在并将生成的菌株metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc97-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株20。
X.实施例10：构建菌株22，MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07
X.1.构建菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc55-pntAB::Cm
为提高吡啶核苷酸转氢酶α和β亚基，PntA和PntB的表达水平，根据规程1在菌株MG1655metA*11pKD46中pntA-pntB操纵子的上游添加组成型人工trc55启动子，只是使用引物Oag0699-Ptrc55-pntAB R(SEQ ID N°51)和Ome1150-Ptrc-pntAF(SEQ ID N°36)从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。
选择氯霉素抗性转导体并用引物Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证人工启动子trc55的存在以及抗性盒的插入。将经过验证和选择的菌株命名为MG1655metA*11pKD46Ptr55-pntAB::Cm。
Oag0699-Ptrc55-pntAB R(SEQ ID N°51)
GCTGCAACACGGGTTTCATTGGTTAACCGTTCTCTTGGTATGCCAATTCGCATGATATTCCCTTCCTTCCACACACTATACGAGCCGGATGATTAATGG TCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其中
-大写字母序列与pntA基因的上游序列(1675875-1675940,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源，
-下划线序列是trc55启动子序列，
-斜体大写字母序列对应于pKD3质粒的引物位点2(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。
X.2.将Ptrc55-pntAB::Cm转导至菌株16中
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11pKD46Ptrc55-pntAB::Cm的P1噬菌体裂解物将Ptrc55-pntAB::Cm启动子修饰转导入菌株16(表1)。
选择氯霉素抗性转导体，并用Ome1151-pntAF(SEQ ID N°37)和Ome1152-pntAR(SEQ ID N°38)(表2)通过PCR验证Ptrc55-pntAB::Cm染色体修饰的存在。将经过验证和选择的菌株MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc55-pntAB::CmΔudhA命名为菌株21。
X.3.将pCL1920-PgapA-pycre-TT07引入菌株21以构建菌株22
将前面描述的pCL1920-PgapA-pycRe-TT07以电穿孔引入菌株21(表1)中。验证质粒pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在，并将生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株22。
XI.实施例11：构建菌株24，MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serCΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
XI.1.将ΔudhA::Km转导至菌株10中以构建菌株23
根据规程2，用来自上面描述的菌株MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc36-metFΔudhA::Km pKD46的P1噬菌体裂解物将之前描述的ΔudhA::Km缺失转导入菌株10(表1)中。
选择卡那霉素抗性转导体。用引物Ome0726-PtrcmetF-F(SEQ ID N°29)和Ome0727-PtrcmetF-R(SEQ ID N°30)通过PCR(理由在实施例6中解释)和以DNA测序验证Ptrc36-ARNmst17-metF启动子修饰的存在；用引物Oag0055-udhAF2(SEQ ID N°33)和Oag0056-udhAR2(SEQ ID N°34)(表2)通过PCR和通过DNA测序验证ΔudhA::Km缺失的存在。将生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔudhA::Km命名为菌株23。
XI.2.将pCL1920-PgapA-pycre-TT07引入菌株23以构建菌株24
将前面描述的pCL1920-PgapA-pycRe-TT07通过电穿孔引入菌株23(表1)。验证质粒pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在，并将生成的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株24。
XII.实施例12：通过在摇瓶中发酵生产L-甲硫氨酸
在小型锥形瓶中评估生产菌株。将5.5mL预培养物在30℃在混合培养基(具有2.5g.L-1葡萄糖的10%LB培养基(LB Broth Miller25g/L)和90%基本培养基PC1)中生长21小时。使用其接种50mL的PC1培养基直到OD600到达0.2。有必要时加入抗生素，其浓度分别为：卡那霉素和壮观霉素50mg.L-1，氯霉素30mg.L-1以及庆大霉素10mg.L-1。将培养温度在37℃保持两小时，42℃两小时然后37℃直至培养结束。当培养物OD600达到5到7时，在OPA/Fmoc衍生化(OPA/Fmoc derivatization)之后以HPLC定量胞外氨基酸；在硅烷化之后，以带有折射检测(refractometric detection)(有机酸和葡萄糖)和GC-MS的HPLC分析其它相关的代谢物。对于每一个菌株都做了几次重复。
表3:基本培养基组成(PC1)
化合物 浓度(g.L-1)
ZnSO4.7H2O 0.0040
CuCl2.2H2O 0.0020
MnSO4.H2O 0.0200
CoCl2.6H2O 0.0080
H3BO3 0.0010
Na2MoO4.2H2O 0.0004
MgSO4.7H2O 1.00
柠檬酸 6.00
CaCl2.2H2O 0.04
K2HPO4 8.00
Na2HPO4 2.00
(NH4)2HPO4 8.00
NH4Cl 0.13
NaOH4M 调节到pH6.8
FeSO4.7H2O 0.04
硫胺 0.01
葡萄糖 15.00
硫代硫酸铵 5.60
维生素B12 0.01
MOPS 15.00
表4:甲硫氨酸产率(Ymet)，由不同菌株在批培养物种产生的%g甲硫氨酸每g葡萄糖。甲硫氨酸/葡萄糖产率的定义见下方。SD是指基于几次重复(N=重复次数)的产率计算的标准偏差。
Figure BDA00003404532700671
Figure BDA00003404532700681
在OPA/Fmoc衍生化后以HPLC定量胞外的甲硫氨酸浓度。以带有折射检测的HPLC分析残余的葡萄糖浓度。以以下方式表示甲硫氨酸产率：
Figure BDA00003404532700682
如表4中可见，当pntAB过表达和/或udhA缺失时(菌株9和14相比于与菌株7，以及菌株12、13、15和24相比于菌株10)甲硫氨酸/葡萄糖产率(Ymet)提高了。
所述产率的改进甚至比metF基因的过表达更好。菌株13含有在metF基因之前mRNA稳定序列以及pntAB和udhA过表达和udhA缺失，菌株14没有C1途径的强过表达，菌株13比菌株14的产率更高。
XIII.实施例13：转氢酶和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性
对转氢酶和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性的分析确认了实施例12和表4中描述的结果。其中转氢酶和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性分别由PntAB和MetF实现。在小型锥形瓶中，在过表达的情况下两者的活性均提高。
表5:在上面描述的的菌株中测定转氢酶(TH，PntAB)和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，MetF)的活性，并以mUI/mg蛋白(N=独立的锥形瓶培养物的数目)给出
Figure BDA00003404532700683
Figure BDA00003404532700691
对于体外测定酶活性，将大肠杆菌菌株以上面描述的方法培养。在抽提方法之前，通过离心从培养液中收获细胞。将沉淀重悬到冷20mM磷酸钾(pH7.2)缓冲溶液中并用Precellys(Bertin Technologies;2x10s，5000rpm，在两步之间在冰上2分钟)以珠子搅打(bead beating)裂解，之后在12000g(4℃)下离心30分钟。将上清脱盐并用于分析。以Bradford鉴定试剂测定蛋白的浓度。以前描述的方法(Amagushi和Stout，2003)鉴定转氢酶活性(TH)。在37℃以色谱仪在375nm下鉴定环状转氢酶活性30分钟，其中反应混合物含有50mMMES-KOH缓冲溶液(pH6.0)、0.2mM NADH、含有或不含有10μM NADPH的0.2mM AcPyAD以及6μg的未加工的细胞抽提物。所有的结果都是至少三次测量的平均数。
以之前描述的方法鉴定5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性(MTHFR)(Matthews，1986)，方法有一些修改。以公式(1)显示所述方法：
(1)甲基-THF+甲萘醌→亚甲基-THF+甲萘二酚
使用甲基-THF作为底物，通过测量亚甲基-THF的酸分解测量亚甲基-THF的形成，所述亚甲基-THF的酸分解产出甲醛。产生的甲醛与指示剂NBDH反应生成在530nm高度发荧光的腙衍生物。在37℃鉴定5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性30min，反应混合物含有50mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.7)、0.3mM EDTA、0.2%(w/v)牛血清白蛋白、在20%甲醇/80%水中饱和的甲萘醌溶液以及20μg未加工的细胞抽提物。在温育后，加入醋酸钠缓冲溶液(pH4.7)并将试管放置于100℃的加热块(heater block)中2分钟以终止反应。在10000g离心5分钟后，通过加入95%乙醇/6%磷酸中的0.001%NBDH，以在FLx800Fluorescence Microplate Reader(Biotek)中测量产生的甲醛。
XIV.实施例14：通过在生物反应器中发酵产生L-甲硫氨酸
接下来使用补料分批策略在生产条件下在2.5L发酵罐(Pierre Guerin)中测试产生大量目的代谢物的菌株。
简单的说，培养物在具有2.5g.L-1葡萄糖10mL LB培养基中生长24小时。将其在基本培养基(B1a)中接种24小时预培养物。这些温育是在含有50mL基本培养基(B1a)的500mL带挡板的摇瓶中，在旋转摇床(200rpm)中实现的。第一步预培养是在30℃实现的，第二步是在34℃。
第三步预培养是在装有200mL基本培养基(B1b)的生物反应器中实现的：接种5mL浓预培养物，培养直至生物质东都到达1.2g.L-1。将预培养物的温度维持在恒定的34℃，并以10%NH4OH溶液将pH自动调节到6.8。通过供给空气和/或搅拌，将溶氧浓度持续的调节至30%空气分压饱和值(a value of30%of the partial air pressure saturation)。在葡萄糖从批式培养基中耗尽后，开始补料分批，初始流量为0.7mL.h-1。培养物以指数提高24小时，维持生长率在0.13h-1以获得大约18g.L-1的最终细胞浓度(increased exponentially for24hours with a growth rate of0.13h-1in order to obtain a final cellularconcentration of about18g.L-1)。
表6:预培养批次矿物培养基组分(B1a和B1b)
Figure BDA00003404532700701
表7:预培养批次补料分批矿物培养基组分(F1)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.H2O 0.0104
CuCl2.2H2O 0.0012
MnCl2.4H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
柠檬酸Fe(III)H2O 0.0424
EDTA 0.0067
MgSO4 5.00
(NH4)2SO4 8.30
Na2SO4 8.90
(NH4)2S2O3 24.80
硫胺素 0.01
葡萄糖 500.00
维生素B12 0.01
NH4OH28% 调节至pH6.8
表8:培养批次矿物培养基组分(B2)。
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0130
CuCl2.2H2O 0.0015
MnCl2.4H2O 0.0150
CoCl2.6H2O 0.0025
H3BO3 0.0030
Na2MoO4.2H2O 0.0025
柠檬酸Fe(III)H2O 0.1064
EDTA 0.0084
MgS2O3.6H2O 1.00
CaCl2.2H2O 0.08
柠檬酸 1.70
KH2PO4 2.97
K2HPO4.3H2O 1.65
(NH4)2HPO4 0.72
(NH4)2S2O3 3.74
硫胺素 0.01
维生素B12 0.01
生物素 0.10
葡萄糖 10
NH4OH28% 调节至pH6.8
表9:培养批次培养基组分(F2)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0104
CuCl2.2H2O 0.0012
MnCl2.4H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
柠檬酸Fe(III)H2O 0.0524
EDTA 0.0067
MgS2O3.6H2O 10.20
(NH4)2S2O3 55.50
硫胺素 0.01
维生素B12 0.01
生物素 0.10
葡萄糖 500
接下来，在2.5L发酵罐(Pierre Guerin)中装入600mL矿物培养基(B2)，并以范围在55到79mL的预培养物接种至生物质浓度2.1g.L-1。
将培养温度维持在恒定37℃，并通过自动加入NH4OH溶液(NH4OH10%9小时，NH4OH28%直至培养结束)将pH维持在工作值(6.8)。在批式相(batchphase)时将初始搅拌速率设定为200rpm，并在补料分批相(fedbatch phase)时提高至1000rpm。批式相将初始气流速率设定为40NL.h-1并在补料分批相的开始提高至100NL.h-1。通过提高搅拌将溶氧浓度值维持在20-40%，优选30%饱和。
当细胞量(cell mass)达到接近5g.L-1的浓度时，以初始流速5mL.h-1开始补料分批。根据S型概貌(sigmoid profile)注射补料溶液(feeding solution)，在26小时生长后流速达到24mL.h-1。以如下公式计算精确的补料条件：
Q ( t ) = p 1 + p 2 1 + e - p 3 ( t - p 4 )
其中Q(t)是补料流速，单位是mL.h-1。对于600mL的批式容积，p1=1.80，p2=22.40，p3=0.270，p4=6.5。
在26小时后，停止补料分批的补料溶液泵，培养在葡萄糖耗尽后最终结束。
在OPA/Fmoc衍生化(OPA/Fmoc derivatization)之后以HPLC定量胞外氨基酸；在硅烷化之后，以带有折射检测(有机酸和葡萄糖)和GC-MS的HPLC分析其它相关的代谢物。
表10:在补料分批培养物种，不同菌株的最大甲硫氨酸产率(Ymet最大)。表示为%g甲硫氨酸每g葡萄糖产生。甲硫氨酸/葡萄糖产率的定义见下方。SD是指基于几次重复(N=重复次数)的产率计算的标准偏差
Figure BDA00003404532700731
*菌株10和13在补料分批培养基中分别是在49.1和55.5g.L-1的硫代硫酸铵和5g.L-1的硫酸镁中培养的，而不是硫代硫酸镁。对于该两种菌株，批式培养基中含有1g.L-1的硫酸镁，而不是硫代硫酸镁。
如同之前在烧杯实验中观察到的，以同样方式，在生物反应器中，甲硫氨酸/葡萄糖产率在pntAB过表达和/或udhA缺失时提高了(比较表10的菌株10和13)。
此外，我们还显示了由于pntAB过表达而改进的甲硫氨酸产生的精密调控，这在上面表10中菌株12、15、18、20和22中可以看到。甲硫氨酸产生是由pntAB基因的水平调整的，我们显示了pntAB基因适度的过表达使其更好。
发酵罐容积是通过以下方法计算的：在初始容积上加上调节pH的溶液和给培养物补料的量并减去用于取样和蒸发损失的体积。
通过称量补料原料以连续的追踪补料批次的体积。然后基于注射的重量、溶液的密度和通过Brix([葡萄糖])的方法测定的葡萄糖浓度，计算注射进的葡萄糖的量。以下面的方式表示甲硫氨酸产率：
Figure BDA00003404532700741
这里呈示每个菌株在培养中获得的最大产率。
其中甲硫氨酸0和甲硫氨酸1分别是初始和最终甲硫氨酸浓度，V0和Vt是初始和即时的容积。
以下面方式计算消耗的葡萄糖：
注射的葡萄糖t=补料容积t*[葡萄糖]
消耗的葡萄糖t=[葡萄糖]0*V0+注射的葡萄糖–[葡萄糖]残余*Vt，其中[葡萄糖]0、[葡萄糖]和[葡萄糖]残余分别表示初始、补料和残余的葡萄糖浓度。
XV.实施例15：转氢酶活性
通过分析PntAB实现的转氢酶活性，确认了实施例14和表10描述的结果(表11)。如之前的烧瓶实验观察到的，当pntAB过表达时，转氢酶活性提高(见表11中菌株10和13)。此外，如参考表11菌株18可见的，精密调控的pntAB过表达将转氢酶活性降低大约10倍。
表11:在以上描述的菌株中测定转氢酶(TH，PntAB)活性，单位为mUI/mg蛋白(N=独立的发酵罐培养物中的至少两个点)。
Figure BDA00003404532700743
Figure BDA00003404532700751
以之前在实施例13中描述的方法鉴定转氢酶活性(TH)。所有的结果都是至少三次测量的平均值。
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Figure IDA00003404533100011
Figure IDA00003404533100041
Figure IDA00003404533100051
Figure IDA00003404533100061
Figure IDA00003404533100071
Figure IDA00003404533100081
Figure IDA00003404533100091
Figure IDA00003404533100101
Figure IDA00003404533100111

Claims (15)

1.一种用于甲硫氨酸的产生的微生物，其中所述微生物经过修饰以增强PntAB的转氢酶活性。
2.权利要求1的微生物，其中编码PntAB的基因过表达。
3.权利要求1或2的微生物，其中其经过修饰以弱化转氢酶UdhA的活性。
4.权利要求3的微生物，其中编码UdhA的基因被缺失。
5.权利要求1-4中任一项的微生物，其中其经过修饰以提高一碳代谢。
6.权利要求5的微生物，其中以下活性中至少一项增强：
a.亚甲基四氢叶酸还原酶MetF的活性；
b.甘氨酸裂解复合体GcvTHP和Lpd的活性；
c.丝氨酸羟甲基转移酶GlyA的活性；
d.甲基转移酶MetH或MetE的活性。
7.权利要求6的微生物，其中MetF的活性通过过表达metF基因和/或通过优化其翻译而增强。
8.权利要求7的微生物，其中metF基因在属于Ptrc家族启动子的强启动子的控制下。
9.权利要求1-8中任一项的微生物，其中以下至少一种基因的表达提高：cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysI、cysJ、cysH、cysE、serA、serB、serC、具有降低的反馈敏感性的metA等位基因、具有降低的反馈敏感性的thrA等位基因或thrA。
10.权利要求9的微生物，其中至少一种列出的基因在可诱导启动子的控制下。
11.权利要求1-10中任一项的微生物，其中编码丙酮酸羧化酶的基因的表达增强。
12.权利要求1-11中任一项的微生物，其中所述微生物的以下基因的至少一种的表达弱化：pykA、pykF、purU、yncA或metJ。
13.权利要求1-12中任一项的微生物，其中所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。
14.权利要求13的微生物，其中所述微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。
15.一种用于甲硫氨酸的产生的方法，包括以下步骤：
-在包含碳源、硫源和氮源的适当的培养基中培养经修饰的产生甲硫氨酸的微生物，以及
-从所述培养基中回收甲硫氨酸或一种它的衍生物，
其中所述微生物经修饰以表现增强的PntAB的转氢酶活性。
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