CN101356272A

CN101356272A - 甲硫氨酸合成效率增高的微生物

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Publication number: CN101356272A
Application number: CNA200680038507XA
Authority: CN
Inventors: O·策尔德尔; A·赫罗尔德; C·克洛普罗格; H·施罗德; S·哈夫纳; E·海因茨勒; C·维特曼; J·克勒默; J·佩罗; R·约卡姆; T·帕特森; M·威廉姆斯; T·赫尔曼
Original assignee: BASF SE
Priority date: 2005-08-18
Filing date: 2006-08-18
Publication date: 2009-01-28

Abstract

本发明涉及甲硫氨酸合成效率增高的微生物的生产方法。本发明也涉及甲硫氨酸合成效率增高的微生物。此外，本发明涉及确定生物关于甲硫氨酸合成的最优代谢通量的方法。

Description

甲硫氨酸合成效率增高的微生物

技术领域

本发明属于生物产精细化学物领域。具体而言，本发明涉及制备甲硫氨酸合成效率增高的微生物的方法。本发明还涉及甲硫氨酸合成效率增高的微生物。此外，本发明涉及确定微生物甲硫氨酸合成最优代谢通量的方法。

背景技术

氨基酸可用于不同的目的，其应用领域之一是作为人类及动物食品的食品添加剂。甲硫氨酸是必须从食物中摄取的必需氨基酸。除了对蛋白质的生物合成至关重要，甲硫氨酸也是不同代谢物如谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸及生物素的前体。它还作为甲基供体参与多种细胞路径。

目前，全球甲硫氨酸年产量为约500,000吨。甲硫氨酸是家禽家畜饲料中的第一限制性氨基酸，因此主要应用为饲料添加剂。不同于其它工业性氨基酸，甲硫氨酸的施用形式几乎均为化学合成产生的外消旋物(DE 19064 05)。由于甲硫氨酸的两种立体异构体都能被动物代谢，可以直接饲喂化学制备的外消旋混合物(D′Mello和Lewis(1978)Effect of NutritionDeficiencies in Animals：Amino Acids，Rechgigl编辑.CRC Handbook Seriesin Nutrition and Food，441-490)。

然而，用生物技术方法取代现有的化学生产仍得到大量关注。这是由于在添加剂水平较低时，L-甲硫氨酸作为含硫氨基酸来源优于D-甲硫氨酸(Katz和Baker，(1975)Poult.Sci.，545，1667-74)。此外，化学方法使用的是相当有害的化学物，并会产生大量废蒸汽。有效的生物技术方法能够避免所有这些化学生产的缺点。

已知可用发酵方法制备其他氨基酸，如谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸及色氨酸。已经证实某些微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)及谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)特别适用于此。利用发酵产生氨基酸也具有其特定优势，即只产生L-氨基酸，并能避免使用化学合成所用的危害环境的化学物如溶剂等。然而，只有进行甲硫氨酸的商业化生产的价格能与化学生产相当，通过微生物发酵产生甲硫氨酸才能替代化学合成。

以前曾尝试使用微生物如大肠杆菌及谷氨酸棒杆菌生产含硫化合物，后者通常又被称为精细化学物。这些方法包括通过诱变进行经典的菌株选择，以及最优化培养条件(如控制(steering)、供氧、培养基组合等)(Kumar等人.(2005)Biotechnology Advances，23，41-61)。

尚未证实微生物发酵生产甲硫氨酸具有经济效益的原因之一，很可能在于形成甲硫氨酸的生物合成和代谢途径的独特性。一般而言，生物(如大肠杆菌及谷氨酸棒杆菌)中甲硫氨酸合成的基本代谢路径已为公知(如Voet和Voet(1995)Biochemistry，第2版，Jon Wiley和Sons，Inc，及http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html)。然而，谷氨酸棒杆菌及大肠杆菌中甲硫氨酸生物合成的细节仍处于大量研究中，最近由Rückert等人(Rückert等人.(2003)，J.of Biotechnology，104，213-228)及Lee等人(Lee等人.(2003)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，62，459-467)综述。

甲硫氨酸生物合成的关键步骤在于将硫掺入碳骨架中。常规使用的硫源为硫酸盐，必须由微生物摄取。随后微生物需要活化并还原硫酸盐。这些步骤中每分子甲硫氨酸需要消耗7mol ATP及8mol NADPH的能量(Neidhardt等人.(1990)Physiology of the bacterial cell：a molecularapproach，Sunderland，Massachusetts，USA，Sinauer Associates，Inc.)。因此，甲硫氨酸是细胞需要提供能量最多的一种氨基酸。

因此，产甲硫氨酸的微生物进化出在甲硫氨酸合成速率和量上都受到严格控制的代谢路径(Neidhardt F.C.(1996)E.coli and S.typhimurium，ASM Press Washington)。这些调控机制包括如反馈调节机制，即一旦细胞产生了足量甲硫氨酸，产甲硫氨酸代谢路径的活性则受到下调。现有获取可用于工业规模微生物生产甲硫氨酸的微生物的技术，主要致力于通过鉴定涉及甲硫氨酸生物合成的基因来克服上述调节机制。以提高甲硫氨酸产量为最终目的，根据这些基因的相应功能对其进行过量表达或抑制。此处，定义甲硫氨酸的量为，单位量细胞量中得到甲硫氨酸的量，或每单位时间及体积所得的甲硫氨酸量(空间-时间-产量)，或为细胞量和空间-时间-产量两因素的组合。

例如，WO 02/10209描述了过量表达或抑制某些基因以提高甲硫氨酸产量。最近，Rey等人(Rey等人.(2003)，J.Biotechnol.，103，51-65)鉴定了调节涉及甲硫氨酸生物合成的基因表达的转录抑制物McbR，所述基因如metY(编码O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶)、metK(编码S-腺苷-甲硫氨酸合酶)、hom(编码高丝氨酸脱氢酶)、cysK(编码L-半胱氨酸合成酶)、cysI(编码NADPH依赖性亚硫酸盐还原酶)和ssuD(编码烷基磺酸盐单加氧酶)。

虽然这些方法能够构建相对于野生型甲硫氨酸产量增加的微生物菌株，其中所述甲硫氨酸量以单位细胞量或单位时间体积(空间-时间产量)计，目前为止尚未表征具有工业竞争力的产过量甲硫氨酸的生物(Mondal等人.(1996)Folia Microbiol.(Praha)，416，465-72，(Kumar等人.(2005)Biotechnology Advances，23，41-61)。

发明概述

已经发现生物产生甲硫氨酸的量，并非评价某一产甲硫氨酸生物是否能作为经济有利且商业可行的方式取代该氨基酸化学生产的充分指标，其中所述甲硫氨酸的量一般以每千克细胞量或单位时间体积的甲硫氨酸量计算。而成为替代化学合成方法的经济有利方法，需要高效生产甲硫氨酸的生物，即在生产体系能量投入的基础上能提供高水平空间时间甲硫氨酸产量的生物，其中所述能量输入可表现为生产甲硫氨酸所消耗的碳源如葡萄糖的量或输入。

因此，在决定某一产甲硫氨酸的生物是否能取代化学合成时，关键的参数并非单位重量细胞量的甲硫氨酸产量，而是效率，即系统消耗的单位能量输入(如以葡萄糖的形式)所产生的甲硫氨酸摩尔量。

此处，进一步发现为在微生物中高效生产甲硫氨酸，必须在合成甲硫氨酸时最优化利用该生物中直接或间接参与甲硫氨酸合成的代谢路径。因此，为使生物有效生产甲硫氨酸，必须对代谢路径中的代谢通量加以修饰。不仅需要修饰直接涉及甲硫氨酸主干合成的路径，也需要修饰提供其他底物的路径，例如不同氧化状态的硫原子、还原态氮如氨、其他碳前体包括C1-碳源(如丝氨酸、甘氨酸和甲酸盐)、甲硫氨酸前体以及在N5和/或N10位被碳取代的不同的四氢叶酸代谢物。此外，合成甲硫氨酸的路径还可涉及以还原当量的形式存在的能量，如NADH、NADPH、FADH2。因此，可高效生产甲硫氨酸的微生物可能需要甲硫氨酸构建和其前体提供路径上的高代谢通量，但对于如其他氨基酸生物合成路径的代谢通量需求很低。

因此本发明的目的在于鉴定直接或间接涉及甲硫氨酸合成路径的最优代谢通量，以鉴定可能潜在高效合成甲硫氨酸的生物。

本发明的另一目的在于提供能预测某一生物甲硫氨酸合成的多条代谢路径中最理想代谢通量的方法，以实现有效的甲硫氨酸生物合成。

本发明的另一目的在于提供获取甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法。

本发明也涉及合成甲硫氨酸更有效的生物。

这些以及其他目的在以下描述中显而易见，是通过独立权利要求中定义的核心问题来解决。从属权利要求涉及某些本发明的实施方案。

在本发明中使用了代谢路径分析方法(也称为基本通量模式分析或极限路径分析)来研究生物甲硫氨酸合成的代谢特性。虽然上述代谢路径分析已在现有技术的其他细胞体系中得以描述(Papin等人.(2004)TrendsBiotechnol.228，400-405；Schilling等人.(2000)J.Theor.Biol.，2033，229-248；Schuster等人.(1999).Trends Biotechnol.172，53-60)，该类型的分析尚未用于生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的甲硫氨酸生产效率。代谢路径分析通常能够计算出包括某一代谢网络中所有可能的稳态通量分布的解空间。因此能全面考虑所研究代谢网络的化学计量学，包括能量、前体以及辅因子需求。

在本发明中，通过比较主要工业氨基酸生产者如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的代谢网络，首次将该基本通量模式分析用于甲硫氨酸生产效率。为此，构建了谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的生物化学反应模型(见下)。该模型包含涉及甲硫氨酸产生相关所有路径的所有有关硫代谢的路径。这些模型是基于对所研究生物的现有生物化学知识而构建的(见下)。根据这些模型，计算多个路径的最优代谢通量，从而预测应多用或少用哪些通路以提高生产甲硫氨酸的效率。

计算这些模型，得到在某一组指定的条件下(包括外部代谢物如碳源和硫源的存在)甲硫氨酸产量最优的模式生物。

因此，本发明涉及设计甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法。该方法包括以下步骤：通过多种参数的方法描述或参数化初始的甲硫氨酸合成生物，其中所述参数是基于已知的甲硫氨酸合成相关代谢路径而得到，并与这些路径反应的代谢通量相关；然后通过修饰至少一个所述参数和/或引入至少一个其他此类参数，使甲硫氨酸合成效率比初始甲硫氨酸合成生物的甲硫氨酸合成效率增高，从而确定甲硫氨酸合成效率增高的生物。利用该方法，因而可预测能有效合成甲硫氨酸的理论生物。该方法的详细实施将于稍后描述。

在本发明中，结合所涉及代谢网络的单个反应定义这些参数。因此，最优化参数的定义与所用生物中是否存在反应、反应的化学计量学以及反应的可逆性相关。因此，这些参数与该网络多个反应的代谢通量相关。

本发明也涉及用于设计甲硫氨酸合成效率增高的初始生物的装置，所述装置包括经改造可实施上述方法步骤的处理器，所述步骤可用于预测甲硫氨酸合成增加的生物的最优路径。

本发明还涉及计算机可读的存储器，其中载有设计甲硫氨酸合成效率增高的生物的计算机程序。该计算机可读存储器由处理器执行时，能实施上述方法步骤以设计甲硫氨酸合成效率增高的理论最优生物。

本发明还涉及设计甲硫氨酸合成效率增高的生物的程序单元，所述单元由处理器执行时，可实施上述方法步骤。

本发明也涉及产生甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法，利用上述预测通过遗传修饰野生型生物以影响其代谢通量，从而使其与上述方法的预测更相似。这可以通过遗传修饰该生物，提高和/或降低某一反应路径的代谢通量来实现。可以通过重组DNA技术引入遗传修饰。此外，也可以通过其他技术来实现，例如但不限于突变及选择方法，如化学或紫外线诱变，及其后生长于含有底物类似物的培养基上进行选择，从而获得品性改良的抗性株。

本发明也涉及利用上述预测通过对生物进行遗传修饰，产生甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法，所述生物并非野生型生物，而是曾经遗传修饰的生物，优选其甲硫氨酸的量产量和/或时间-空间产量增加。此类生物可能为已知的甲硫氨酸过量生产者，包括如过量表达硫酸盐同化基因、半胱氨酸生物合成基因、及甲硫氨酸合成基因和转化草酰乙酸为天冬氨酸半醛基因的生物。对于此类已经过遗传修饰的生物而言，可实施上述关于增高甲硫氨酸合成效率的预测以影响所述生物的代谢通量，从而使其与上述方法的预测更相似。这可以通过遗传修饰该生物，提高和/或降低某一反应路径的代谢通量来实现。可以通过重组DNA技术引入遗传修饰。此外，也可以通过其他技术来实现，例如但不限于突变及选择方法，如化学或紫外线诱变，及其后生长于含有底物类似物的培养基上进行选择，从而获得品性改良的抗性株。

令人惊异的是，发现在野生型生物中得到的理论预测也可用于提高已携带突变生物的甲硫氨酸合成效率，所述突变位于如甲硫氨酸合成相关路径，或与之相关的附属路径中。因此，似乎并无必要基于相应起始生物计算理论预测，而得自野生型生物的理论预测可能已经足够。然而，本发明自然也考虑基于初始生物计算最优代谢通量的实施方案，所述初始生物已具有某些上述突变，因而该预测可用于进一步遗传修饰该生物。

具体而言，本发明涉及产生甲硫氨酸生产效率增高的棒状杆菌属和埃希菌属微生物，包括增加和/或引入已用于构建上述模型的路径代谢通量的步骤。这些方法可能还包括至少部分减少上述路径的代谢通量的步骤。

本发明也涉及可通过任一上述方法得到的甲硫氨酸合成效率增高的生物。此外，本发明涉及利用此类生物生产甲硫氨酸，以及培养上述生物并分离甲硫氨酸的产甲硫氨酸方法。

附图简述

图1显示了用于基本通量模式分析的谷氨酸棒杆菌野生型生物的化学计量反应网络。

图2显示了谷氨酸棒杆菌及大肠杆菌中甲硫氨酸合成的代谢路径分析。

图3显示了甲硫氨酸理论产量最大的谷氨酸棒杆菌野生型生物的代谢通量分布。

图4显示了甲硫氨酸理论产量最大的大肠杆菌野生型生物的代谢通量分布。

图5显示了谷氨酸棒杆菌利用不同碳源和硫源进行甲硫氨酸合成的代谢路径分析。

图6至9显示了在实施方案的实例中所用的多种载体。

图10显示了谷氨酸棒杆菌菌株中包括其他代谢路径的一个最优代谢通量分布。

发明详述

在详细描述如何实施上述方法以鉴定甲硫氨酸合成效率增高的理论最优生物之前，给出以下定义。

术语“微生物合成效率”用于描述甲硫氨酸的碳产量。该效率是以碳底物形式进入系统的能量输入的百分比计算。除非另有说明，本发明中该值以百分比值((摩尔甲硫氨酸)(摩尔碳底物)^-1×100)表示。

术语“甲硫氨酸合成效率增高”是将通过上述方法理论模型化的生物和甲硫氨酸合成效率相对用于参数化的初始模式生物提高的生物进行比较。

术语“甲硫氨酸合成效率增高”也可用于描述以下情形，相对于相应起始生物而言，经过如遗传修饰的生物的甲硫氨酸合成效率增高。

术语“代谢路径”指作为代谢网络一部分的系列反应，所述网络在上述理论模型中用于设计甲硫氨酸合成改良的生物。

术语“代谢路径”也用于描述发生于真实生物的系列反应。代谢路径中可能包括公知的系列反应，如标准教科书中已知的如呼吸链、糖基化、三羧酸循环等。或者可为本发明的目的独立定义代谢路径。

术语“代谢通量”用于描述以如碳源(如葡萄糖)形式加入系统的能量输入的量，该能量通过生物或上述理论模型的代谢网络的反应。网络的每一反应通常都参与最终的代谢通量。因此，代谢通量可分配至该网络的每一反应。由于基本通量模式的计算是基于网络模型多个反应的化学计量学，通量一般以用能量摄取率(以葡萄糖形式测量)标准化的相对摩尔值表示，即通量以(摩尔底物)×(摩尔葡萄糖)^-1×100)表示。

术语“经修饰的代谢通量”是指经过某一反应的代谢通量或经遗传修饰生物的代谢路径的代谢通量，相对于起始生物增加和/或减少。该术语也指根据上述确定或设计甲硫氨酸合成最优生物的理论方法，通过改变理论代谢网络的参数增加或减少经过代谢网络中某一反应或代谢路径的理论代谢通量。

本发明中所用的术语“模拟代谢通量”，是指对生物进行遗传修饰以增加和/或减少和/或引入甲硫氨酸合成路径的代谢通量，所述路径已用于构建上述理论模型。由于遗传修饰的选择是基于上述模型的预测，相对于相应起始生物而言，经遗传修饰生物的代谢通量应更接近上述最优模型的代谢通量。

术语“表达”是指基因产物(例如本申请中定义并描述的路径或反应的基因的生物合成酶)在某水平的表达，其可使编码蛋白所产生的酶活性或其涉及的路径或反应中，代谢通量能通过表达该基因/路径的生物中的所述路径或反应。可以对如起始生物的微生物进行遗传改造以实施该表达。在某些实施方案中，可以遗传改造(如遗传工程)微生物以使其表达基因产物的水平高于起始微生物或未经改造的相当微生物的表达水平。遗传改造包括但不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如通过添加强启动子、诱导型启动子或多重启动子，或通过移除调控序列从而使表达成为组成型)、修饰特定基因的染色体位置、改变特定基因邻近的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、增加特定基因的拷贝数、修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白、抑制物、增强子、转录活化物等等)，或其他任何利用本领域常规方法去调节特定基因表达的常规方法，包括但不限于如利用反义核酸分子阻断抑制蛋白的表达。

术语“过量表达”是指基因产物(例如甲硫氨酸生物合成酶，或硫酸盐还原路径酶，或半胱氨酸生物合成酶，或本申请中定义并描述的基因或路径或反应)表达的水平，高于遗传改造前的起始微生物中的表达水平。在某些实施方案中，可以遗传改造(如遗传工程)微生物以使其表达基因产物的水平高于起始微生物产生的水平。遗传改造包括但不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如通过添加强启动子、诱导型启动子或多重启动子，或通过移除调控序列从而使表达成为组成型)、修饰特定基因的染色体位置、改变特定基因邻近的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、增加特定基因的拷贝数、修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白、抑制物、增强子、转录活化物等等)，或其他任何利用本领域常规方法去调节特定基因表达的常规方法，包括但不限于如利用反义核酸分子阻断抑制蛋白的表达。在如谷氨酸棒杆菌的生物中过量表达基因的实例见于Eikmanns等人(Gene.(1991)102，93-8)。

在某些实施方案中，可对微生物进行物理或环境改造，以使其表达基因产物的水平相对于起始微生物中该基因产物的表达水平增加或减少。例如，可用已知或怀疑能提高特定基因转录和/或特定基因产物翻译的物质处理或培养微生物，从而增强或提高转录和/或翻译。或者，可在选定的可提高特定基因转录和/或特定基因产物翻译的温度下培养微生物，从而增强或提高转录和/或翻译。

术语“去调节”是指改变或修饰微生物中的至少一个基因，其中所述改变或修饰使该微生物的甲硫氨酸生产效率相对于未改变或未修饰时的甲硫氨酸生产增高。在某些实施方案中，改变或修饰的基因编码生物合成路径中的酶，从而改变或修饰微生物中该生物合成酶的水平或活性。在某些实施方案中，至少改变或修饰一个编码生物合成路径酶的基因，从而使该酶的水平或活性相对于未改变或野生型基因增强或提高。在某些实施方案中，生物合成路径为甲硫氨酸生物合成路径。在另一些实施方案中，生物合成路径为半胱氨酸生物合成路径。去调节也包括改变一个或多个基因的编码区，以产生如抗反馈或特异性活性更高或更低的酶。去调节还包括遗传改造调节甲硫氨酸和/或半胱氨酸生物合成路径中基因表达的转录因子(如活化物、抑制物)的编码基因。

短语“去调节路径或反应”是指生物合成路径或反应，其中至少一个生物合成路径或反应酶的编码基因得以改变或修饰，从而改变或修饰该至少一个生物合成酶的水平或活性。短语“去调节路径”包括生物合成路径，其中改变或修饰多于一个的基因，从而改变相应基因产物/酶的水平和/或活性。在某些情况下，微生物中“去调节”某一路径(例如激活型去调节某一生物合成路径一个以上的基因)的能力，是微生物中的特定现象造成的，即名为“操纵子”的连续基因物质片段中彼此毗邻的基因编码多于一个酶(例如2个或3个生物合成酶)。在另一些情况下，为了去调节某一路径，必须通过一系列顺序的遗传工程步骤去调节多个基因。

术语“操纵子”是指基因物质的协调单元，其中包括启动子以及可能的与一个或多个、优选至少2个结构基因(例如编码酶的基因，如生物合成酶)相关的调控元件。通过如调节蛋白结合于调控元件或通过终止反转录对结构基因的表达，可进行协调调控。结构基因可转录为编码所有结构蛋白质的单个mRNA。由于操纵子中所含基因的协调调控，对于单个启动子和/或调控元件的改变或修饰会改变或修饰该操纵子编码的各个基因产物。对调控元件的改变或修饰包括但不限于，移除内源性启动子和/或调控元件；添加强启动子、诱导型启动子或多重启动子或移除调控序列以改变基因产物的表达；修饰操纵子的染色体位置、改变操纵子邻近或操纵子内部的核酸序列如核糖体结合位点、密码子使用、增加操纵子的拷贝数、修饰涉及操纵子转录和/或操纵子产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白、抑制物、增强子、转录活化物等等)，或其他任何利用本领域常规方法去调节基因表达的常规方法，包括但不限于如利用反义核酸分子阻断抑制蛋白的表达。

在某些实施方案中，对此处所述的重组微生物进行遗传工程操作以过量表达细菌来源的基因或基因产物。术语“细菌来源”及“来源于细菌”，是指天然存在于细菌的基因或由细菌基因编码的基因产物。

本发明中的术语“生物”，是指通常用于产生如甲硫氨酸类的氨基酸的任意生物。具体而言，术语“生物”是指原核生物、低等真核生物和植物。优选的上述生物包括放线菌、蓝藻、变形菌、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)、小小梨形菌菌株1(Pirellula sp.1)、盐细菌和/或甲烷球菌，优选棒状杆菌、分支杆菌、链霉菌、沙门氏菌、大肠杆菌属、志贺菌属(Shigella)和/或假单胞菌属(Pseudomona)。特别优选的微生物选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、杆菌属微生物(特别是枯草杆菌(Bacillus subtilis))，以及链霉菌属微生物。

术语“初始生物”用于描述根据独立权利要求1的用于设置上述模型中初始参数的生物和代谢网络。

术语“起始生物”是指用于遗传修饰以提高甲硫氨酸生产效率的生物。起始生物可为野生型生物或已携带突变的生物。起始生物可与初始生物相同。起始生物可为如甲硫氨酸过量生产者。

术语“野生型生物”，是指未经遗传修饰的生物。术语“甲硫氨酸过量生产者”是指通过遗传操作、通过突变和选择或通过任意其他已知方法改变的生物，所述生物过量产生的甲硫氨酸多于用于获取甲硫氨酸过量生产者的野生型菌株。

然而，本发明的生物也可能包括酵母如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或酿酒酵母(cerevisiae)及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明也涉及用植物生产氨基酸。此类植物可为单子叶或双子叶植物，例如单子叶或双子叶作物、食品植物或饲用植物。单子叶植物的实例为燕麦属植物(燕麦)、小麦属植物(小麦)、黑麦属植物(黑麦)、大麦属植物(大麦)、稻属植物(水稻)、黍属植物、狼尾草属植物、狗尾草属植物、高粱属植物(粟)、玉蜀黍属植物(玉米)等。

双子叶作物尤其包括棉花、豆类如豌豆和特别是苜蓿、大豆、油菜籽、番茄、甜菜、马铃薯、观赏植物和树。其他作物植物包括水果(特别是苹果、梨、樱桃、葡萄、橙、菠萝和香蕉)、油棕榈、茶树、可可树和咖啡树、烟草、剑麻以及相关药用植物萝芙木和毛地黄。特别优选为谷物小麦、黑麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和粟；甜菜、油菜籽、大豆、番茄、马铃薯和烟草。其他作物植物可见US 6,137,030。

术语“代谢物”是指在生物代谢路径中用作前体、中间物和/或终产物的化学化合物。此类代谢物可能不仅是作为化学构架单元，也对酶及其催化活性具有调节活性。文献中已知此类代谢物可能抑制或激活酶的活性(Stryer，Biochemistry，(1995)W.H.Freeman & Company，New York，NewYork)。

本发明中的术语“外部代谢物”包括底物(如葡萄糖、硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、氨、磷酸盐)、金属离子(如Fe²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、MoO²⁺)及氧气等。在某些实施方案中，(外部)代谢物包括所谓的C1-代谢物。后者可作用如甲基供体，包括化合物如甲酸盐、甲醇、甲醛、甲硫醇、二甲基二硫醚等。

术语“产物”包括甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、海藻糖、生物量、CO₂等。

描述本发明具体实施方案之前，大致说明如何通过基本通量分析得到预测。

基本通量分析起始于形成和实施与生长和甲硫氨酸生产相关的所有代谢反应。所需的信息可见于公共数据库如KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)等。然后据此建立模型，该模型反映了野生型生物的天然潜能，并用作进一步产生甲硫氨酸过量生产模型菌株的起点。为得到初始模型，构建甲硫氨酸合成的生物化学反应模型。为此，构建包括中心碳和硫代谢所有相关途径的模型，其中所述途径涉及文献中已知的所有甲硫氨酸产生的相关路径。如果已知某一生物如大肠杆菌的路径在另一生物如谷氨酸棒杆菌中不存在，则仅在特定生物的模型中考虑该生物特异性的路径反应，而在构建其他生物的起始生物模型时并不考虑。得到初始模型后，可考虑如引入已知不存在于模型生物中的其他生物路径，以进一步优化。参与代谢网络的不同生物化学反应可见于如标准教科书、科学文献或互联网链接如http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html。

然后根据文献中所述实施基本通量模式分析(见如Papin等人.(2004)同上，Schilling等人.(2000)同上，Schuster等人.(1999)同上)。在多个反应化学计量学的基础上计算基本通量模式。通常不考虑每一反应的特异动力学。

构建的代谢网络一般包括很多通路循环和可逆反应。因此可能需要采取多个通路途径以得到化合物如甲硫氨酸。因而根据采用的途径，同一网络中产生相同化合物的能量需求可能不尽相同。因此，如果用参数描述网络中的多个反应并用于算法如METATOOL软件(Pfeiffer等人.(1999)Bioinformatics，153，251-257；Schuster等人.(1999)同上)，可以修饰并优化网络以鉴定甲硫氨酸合成最为有效的途径。

本发明利用程序METATOOL进行代谢通路分析。可从互联网址http://www.biozentrum.uni-wuerzburg.de/bioinformatik/computing/metatool/pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/获取本发明所用的版本(meta 4.0.1_double.exe)。该算法的算术细节由Pfeiffer等人描述(Pfeiffer等人.(1999)同上)。如果利用METATOOL程序实施代谢通路分析，对于每一研究情形都会产生数百个基本通量模式。如上所述，以作为底物进入系统的碳的百分比计算这些通量模式中每一个的甲硫氨酸碳产量。通过以碳底物的形式进入系统的能量的百分比计算多个通量模式的生物量的碳产量。因此，这一参数可计算为((摩尔生物量)(摩尔底物)^-1×100)。也可相应考虑葡萄糖以外的共底物，如甲酸盐、甲醛、甲醇、甲硫醇或其二聚体二甲基二硫醚。然后对某一网络中得到的所有此类基本通量模式进行比较分析，能够确定甲硫氨酸合成的理论最大效率。

这样得到了生物代谢网络中最优代谢通量的理论预测值，所述生物的甲硫氨酸合成应当最有效。此类理论代谢通量分析的细节描述于实验部分。

理论确定或设计此类甲硫氨酸合成效率增加的生物的方法，是独立权利要求1的核心问题。

然后可通过遗传修饰相应的生物来增加或减少预测模型鉴定通路中的代谢通量，应用通过这些方法得到的理论预测值。令人惊异的是，也可通过对不同于初始生物的起始生物进行遗传改造，根据模型预测应用理论预测。因此，此类起始生物可能并非野生型生物，而是已经经过遗传修饰的生物。在一个实施方案中，起始生物可为如甲硫氨酸过量生产者，即经过遗传修饰后已知能比相应野生型生物产生更多甲硫氨酸的生物。即使没有计算此类甲硫氨酸过量生产者的理论预测值，仍可基于甲硫氨酸合成效率增加的甲硫氨酸过量生产者构建经遗传修饰的生物。

例如，如果理论预测值提示增加磷酸戊糖通路(PPP)的代谢通量时甲硫氨酸合成最有效，则对生物进行遗传修饰使其如此。可以通过如提高催化PPP中某些步骤的酶的量和/或活性，以使与相同条件下培养的未经遗传修饰生物相比有更多代谢通量通过该路径，从而实现该目的。也可以通过如下调另一平行路径中不可逆反应的酶活性而重新定向代谢通量进入PPP，来增加进入PPP的通量。也可以向涉及PPP循环的酶的蛋白质编码基因中引入特定突变来增加进入PPP的通量，所述突变如Onishi等人所述的丙酮酸羧化酶突变(Appl Microbiol Biotechnol.(2002)，58，217-23)。与所谓野生型菌株中的基因相比，这些改变的基因中含有突变。这些突变可能会改变酶活性或对分子反馈抑制物的灵敏度。

因此，如果理论模型需要进入磷酸戊糖通路的代谢通量减少，可以减少该通路中的酶量和/或活性。

也可使用代谢通量分析将对一种生物产生的结果转移到另一生物。因此，如果基本通量模式分析发现如大肠杆菌中某一通路活性增加对于有效的甲硫氨酸合成至关重要，且如果该通路显然不用于或不存在于另一生物如谷氨酸棒杆菌，则通过将编码该通路酶活性的基因引入相应生物而将该通路引入相应生物。通过该方法，不仅可通过优化微生物内源性代谢通路在甲硫氨酸合成方面优化微生物，也可以引入外源性代谢通路以进一步增强甲硫氨酸合成和/或提高合成效率。

因此，本发明也涉及产生选自原核生物、低等真核生物和植物的生物的方法，所述生物的甲硫氨酸合成效率相对于起始生物增加，该方法包括：

a.实施上述基本通量模式分析，得到甲硫氨酸合成最优的生物中最优代谢通量分布的理论预测值，且

b.对生物进行遗传修饰，其中修饰生物中现有代谢通路，使生物的代谢通量相对于起始生物更接近步骤a)的理论模型和/或

c.对生物进行遗传修饰，其中向生物中引入外源性代谢通路，使生物的代谢通量相对于起始生物更接近步骤a)的理论模型和/或

d.提供能将代谢通量引入b)和c)的代谢通路的足量外部代谢物。

本发明的另一方面涉及通过以下步骤产生选自原核生物、低等真核生物和植物的生物，从而将甲硫氨酸合成最优化生物中的通量分布的理论预测值用于实际的方法：

●通过对生物进行遗传修饰，修饰至少一种以下代谢通路的代谢通量：

●磷酸转移酶体系(PTS)和/或

●磷酸戊糖通路(PPP)和/或

●糖酵解(EMP)和/或

●三羧酸循环(TCA)和/或

●乙醛酸支路(GS)和/或

●回补(AP)和/或

●呼吸链(RC)和/或

●硫同化(SA)和/或

●甲硫氨酸合成(MS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)和/或

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●通路1(P1)和/或

●通路2(P2)和/或

●通路3(P3)和/或

●通路4(P4)和/或

●通路5(P5)和/或

●通路6(P6)和/或

●通路7(P7)，和/或

●通过对生物进行遗传修饰，引入至少一种以下外源性代谢通路的代谢通量：

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

●硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

●甲酸盐转化体系(FCS)和/或

●甲硫醇转化体系(MCS)，和/或

●在存在以下物质时培养生物：

a.硫酸盐和/或

b.亚硫酸盐和/或

c.硫化物和/或

d.硫代磷酸盐和/或

e.含有机硫的化合物和/或

f.C1-代谢物如甲酸盐、甲醛、甲醇、甲硫醇或其二聚体二甲基二硫醚。

经遗传修饰的生物也是本发明的目的之一，其中所述生物经修饰后，可将甲硫氨酸生物合成效率增高的模式生物相关预测用于实际。

如上所述，为计算甲硫氨酸合成代谢网络中的最优代谢通量，使用生物中合成该氨基酸的特异性代谢通路。此外，对于构建的每一代谢网络，都必须考虑该特定生物的特定化学计量学。该化学计量学可获自上述来源。

虽然此类代谢网络在生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌间可能有所差异，图1显示了以谷氨酸棒杆菌为例的一组用于计算初始代谢网络的反应。由于该组仅为参与甲硫氨酸合成的代谢网络中的最小反应组，对于其他生物如大肠杆菌必须考虑已知存在的其他通路。然而，如果以下制定的参照普遍相对于某一代谢通路或特定的酶，则除非另有说明，这些普遍的参照均与图1所示的反应相关。这一点似乎是合理的，因为在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中这些反应大体相同。在本发明中，将多个反应归类为以下通路组：

●磷酸转移酶体系(PTS)

●磷酸戊糖通路(PPP)

●糖酵解(EMP)

●三羧酸循环(TCA)

●乙醛酸支路(GS)

●回补(AP)

●呼吸链(RC)

●硫同化(SA)

●甲硫氨酸合成(MS)

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)

●甘氨酸裂解体系(GCS)

●转氢酶转化(THGC)

●通路1(P1)

●通路2(P2)

●通路3(P3)

●通路4(P4)

●通路5(P5)

●通路6(P6)

●通路7(P7)

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)

●硫酸盐还原酶体系(SARS)

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)

●甲酸盐转化体系(FCS)

●甲硫醇转化体系(MCS)

可以将单个通路再分为以下由酶(记为Rn)催化的反应。使用缩写定义这些反应。以磷酸转移酶体系为例解释在本发明中理解这些定义的方法。该解释也适用于其他反应。

在本发明中，磷酸转移酶体系(PTS)包括外部葡萄糖变为葡萄糖-6-磷酸(G6P)的反应。该反应由酶R1磷酸转移酶催化。该酶以磷酸烯醇式丙酮酸为磷基团供体(见图1)。本发明中将该反应描述为：

R1以产生更多G6P

因此，通过催化该反应的酶以及反应生成的产物定义上述各个通路的单个反应。此类反应是否需要形式为ATP、NADH和/或NADPH的能量输入或其他辅因子并未指出，但可从图1中得到。也没有指出特定的化学计量学，因为这可能在生物与生物间改变。一般而言，也不会指出反应的引出物和能量输入。这些数据均可以从有关多种生物的标准教科书或科学出版物中得到。

本发明中，磷酸戊糖通路由以下反应表征：

R3以产生GLC-LAC

R4以产生6-P-葡萄糖酸盐

R5以产生RIB-5P

R6以产生XYL-5P

R7以产生RIBO-5P

R8以产生S7P和GA3P

R9以产生E-4p和F6P

R10以产生F6P和GA3P

R2以产生G6P

本发明中，糖酵解通路(EMP)的特征在于以下反应：

R11以产生F-1，6-BP

R13以产生DHAP和GA3P

R14以产生GA3P

R15以产生1，3-PG

R16以产生3-PG

R17以产生2-PG

R18以产生PEP

R19以产生Pyr

本发明中，三羧酸循环(TCA)由以下反应定义：

R20以产生Ac-CoA

R21以产生CIT

R22以产生顺式-ACO

R23以产生ICI

R24以产生2-OXO

R26以产生SUCC-CoA

R27以产生SUCC

R28以产生FUM

R29以产生MAL

R30以产生OAA

本发明中，乙醛酸支路(GS)通路由以下反应定义：

R21以产生CIT

R22以产生顺式-ACO

R23以产生ICI

R31以产生GLYOXY和SUCC

R32以产生MAL

R28以产生FUM

R29以产生MAL

R30以产生OAA

本发明中，回补(AP)通路由以下反应定义：

R34以产生OAA

R33/R36以产生OAA

本发明中，呼吸链(RC)由以下反应定义：

R59催化：2NADH+O_2ex+4ADP＝2NAD+4ATP

R60催化：2FADH+O_2ex+2ADP＝2FAD+2ATP

本发明中，硫同化通路(SA)由以下反应定义：

R55以产生H₂SO₃

R58以产生H₂S

本发明中，甲硫氨酸合成通路(MS)由以下反应定义：

R37以产生Asp

R47以产生ASP-P

R48以产生ASP-SA

R39以产生HOM

R40以产生O-AC-HOM

R46以产生CYSTA

R49以产生HMOCYS

R54以产生HOMOCYS

R52以产生MET

R53以产生MET_ex

本发明中，丝氨酸/半胱氨/甘甘氨酸合成(SCGS)通路由以下反应定义：

R41以产生3-PHP

R42以产生SER-P

R43以产生SER

R44以产生O-AC-SER

R45以产生CYS

R38以产生M-THF和甘氨酸_ex

本发明中，通路1(P1)包括以下反应：

R25以产生GLU

本发明中，通路2(P2)包括以下反应：

R33/R36以产生OAA

R30以产生MAL

R57以产生PYR+CO₂

本发明中，通路3(P3)包括以下反应：

R56催化：ATP＝ADP

本发明中，通路4(P4)包括以下反应：

R62催化：GTP+ADP＝ATP+GDP

本发明中，通路5(P5)由以下反应定义：

R50催化：ATP+乙酸＝ADP+乙酰P

本发明中，通路6(P6)包括以下反应：

R51催化：乙酰P+HCoA＝乙酰CoA

本发明中，通路7(P7)包括以下反应：

R61催化：6231NH_3ex+233SO_4ex+205G6P+308F6P+879RIBO-5P+268E4P+129GA3P+12953-PG+652PEP+2604PYR+3177AC-CoA+1680OAA+12242-OXO+16429NADPH＝生物量_ex+16429NADP+3177H-CoA+1227CO_2ex

如上所列，生物间的化学计量学将彼此不同，并且可以得自文献或上述互联网网页。此外，某些生物如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的代谢网络可能还包括其他反应通路。

本发明中的此类其他通路包括：

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

●硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

●甲酸盐转化体系(FCS)和/或

●甲硫醇转化体系(MCS)

本发明中，甘氨酸裂解体系(GCS)包括以下反应：

R71：以产生M-HPL

R72：以产生亚甲基-THF

本领域技术人员熟知反应R71及R72由至少3个蛋白质催化，即gcvH、P和T(见表1和2)。gcvP催化甘氨酸脱羧基形成CO₂和一个氨甲基，而GcvH是氨甲基的载体(R71)。有关甘氨酸裂解体系的描述可见于Neidhardt E.C.(1996)E.coli and S.typhimurium，ASM Press Washington。gcvT涉及将C1单元从H蛋白转移到四氢叶酸并释放NH₃(R72)。然后，该反应一般由第四个亚基即硫辛酰胺脱氢酶完成。由lpdA编码的硫辛酰胺脱氢酶作用将电子由NAD转移至NADH。该脱氢酶来自多亚基丙酮酸脱氢酶，通常被称为lpdA。本发明中，GCS可概括为：

R71/72：以产生亚甲基-THF

本发明中，GCS也任选包括其他以下反应：

R78：以产生甲基-THF

严格而言，R78并不属于GCS，因为其仅用于提供甲基-THF。然而，在没有R78的生物中，可与GCS的其他反应同时施用R78。在已存在R78的生物中，则并非必需。

本发明中，转氢酶转化体系(THGC)包括以下反应：

R70：以产生NADPH

本发明中，THGC也可包括以下反应：

R81：以产生NADPH

R70的实例可为胞质转氢酶，而R81可为如跨膜转氢酶。

本发明中，硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)包括以下反应：

R73：以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐。

本发明中，TRS还可能包括：

R82：以将胞外H₂S₂O₃运入细胞和/或

R45a：以产生更多的S-磺酸半胱氨酸和/或

R49：以产生更多的S-磺酸半胱氨酸。

R45a和/或R49将硫代硫酸盐转化为S-磺酸-半胱氨酸，因此也属于SRS。

本发明中，硫酸盐还原酶体系(SARS)包括以下反应：

R80：以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐

本发明中，亚硫酸盐还原酶体系(SRS)包括以下反应：

R74以将亚硫酸盐代谢为硫化物

本发明中，甲酸盐转化体系(FCS)包括以下反应：

R75：以产生10-甲酰-THF

R76：以产生亚甲基-THF

R78：以产生甲基-THF

本发明中，甲硫醇转化体系(MCS)包括以下反应：

R77以通过甲硫醇转化为甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸

本发明中，通路8(P8)包括以下反应：

R79以将甲酰-THF降解为甲酸盐和四氢叶酸

下表中列出了上述酶的特定实例。

其他反应可见于下文给出反应的综述。

表1

编号	酶	基因库登陆号	生物
编号	酶	基因库登陆号	生物	R1	磷酸转移酶体系	Cgl1360、Cgl1936、Cgl2642	谷氨酸棒杆菌
R2	G6P-异构酶	Cgl0851	谷氨酸棒杆菌	R1	磷酸转移酶体系	Cgl1360、Cgl1936、Cgl2642	谷氨酸棒杆菌
R2	G6P-异构酶	Cgl0851	谷氨酸棒杆菌	R3	G6P-脱氢酶，OPCA蛋白	Cgl1576、BAB98969Cgl1577	谷氨酸棒杆菌等
R4	内酯酶	Cgl1578	谷氨酸棒杆菌	R3	G6P-脱氢酶，OPCA蛋白	Cgl1576、BAB98969Cgl1577	谷氨酸棒杆菌等
R4	内酯酶	Cgl1578	谷氨酸棒杆菌	R5	葡萄糖酸-脱氢酶	Cgl1452，BAB98845	谷氨酸棒杆菌等
R6	核酮糖-5-P-差向异构酶	Cgl1598	谷氨酸棒杆菌	R5	葡萄糖酸-脱氢酶	Cgl1452，BAB98845	谷氨酸棒杆菌等
R6	核酮糖-5-P-差向异构酶	Cgl1598	谷氨酸棒杆菌	R7	核酮糖-5-P-异构酶	Cgl2423	谷氨酸棒杆菌
R8	转酮酶1	Cgl1574、YP_225858-	谷氨酸棒杆菌等	R7	核酮糖-5-P-异构酶	Cgl2423	谷氨酸棒杆菌
R8	转酮酶1	Cgl1574、YP_225858-	谷氨酸棒杆菌等	R9	转醛酶	Cgl1575	谷氨酸棒杆菌等
R10	转酮酶2	Cgl1574	谷氨酸棒杆菌等	R9	转醛酶	Cgl1575	谷氨酸棒杆菌等
R10	转酮酶2	Cgl1574	谷氨酸棒杆菌等	R11	磷酸果糖激酶	Cgl1250	谷氨酸棒杆菌
R12	果糖二磷酸酶	Cgl1058Cgl1909Cgl2095	谷氨酸棒杆菌等	R11	磷酸果糖激酶	Cgl1250	谷氨酸棒杆菌
R12	果糖二磷酸酶	Cgl1058Cgl1909Cgl2095	谷氨酸棒杆菌等	R13	果糖二磷酸-醛缩酶	Cgl2770	谷氨酸棒杆菌
R14	磷酸丙糖-异构酶	Cgl1586	谷氨酸棒杆菌	R13	果糖二磷酸-醛缩酶	Cgl2770	谷氨酸棒杆菌
R14	磷酸丙糖-异构酶	Cgl1586	谷氨酸棒杆菌	R15	3-磷酸甘油酸酯-激酶	Cgl1587	谷氨酸棒杆菌
R16	PG-激酶	Cgl2080	谷氨酸棒杆菌	R15	3-磷酸甘油酸酯-激酶	Cgl1587	谷氨酸棒杆菌
R16	PG-激酶	Cgl2080	谷氨酸棒杆菌	R17	PG-变位酶	Cgl0438	谷氨酸棒杆菌
R18	PEP-水合酶	Cgl0974	谷氨酸棒杆菌	R17	PG-变位酶	Cgl0438	谷氨酸棒杆菌
R18	PEP-水合酶	Cgl0974	谷氨酸棒杆菌	R19	PYR-激酶	Cgl2089	谷氨酸棒杆菌
R20	PYR-脱氢酶	Cgl2248Cgl2610Cgl1271Cgl1129Cgl0097Cgl0162	谷氨酸棒杆菌	R19	PYR-激酶	Cgl2089	谷氨酸棒杆菌
R20	PYR-脱氢酶	Cgl2248Cgl2610Cgl1271Cgl1129Cgl0097Cgl0162	谷氨酸棒杆菌	R21	CIT-合酶	Cgl0659	谷氨酸棒杆菌
R22	ACO-水解酶	Cgl1315Cgl1540	谷氨酸棒杆菌	R21	CIT-合酶	Cgl0659	谷氨酸棒杆菌
R22	ACO-水解酶	Cgl1315Cgl1540	谷氨酸棒杆菌	R23	顺乌头酸酶	Cgl1315	谷氨酸棒杆菌
R24	异柠檬酸-脱氢酶	Cgl1286Cgl0664	谷氨酸棒杆菌	R23	顺乌头酸酶	Cgl1315	谷氨酸棒杆菌
R24	异柠檬酸-脱氢酶	Cgl1286Cgl0664	谷氨酸棒杆菌	R25	谷氨酸-脱氢酶	Cgl2079	谷氨酸棒杆菌
R26	2-OXO-脱氢酶	Cgl1129	谷氨酸棒杆菌	R25	谷氨酸-脱氢酶	Cgl2079	谷氨酸棒杆菌
R26	2-OXO-脱氢酶	Cgl1129	谷氨酸棒杆菌	R27	SUCC-CoA-合酶	Cgl2565	谷氨酸棒杆菌
R28	SUCC-脱氢酶	Cgl0370	谷氨酸棒杆菌	R27	SUCC-CoA-合酶	Cgl2565	谷氨酸棒杆菌
R28	SUCC-脱氢酶	Cgl0370	谷氨酸棒杆菌	R29	延胡索酸酶	Cgl1010	谷氨酸棒杆菌
R30	MAL-脱氢酶	Cgl2380	谷氨酸棒杆菌	R29	延胡索酸酶	Cgl1010	谷氨酸棒杆菌
R30	MAL-脱氢酶	Cgl2380	谷氨酸棒杆菌	R31	ICI-裂解酶	Cgl0097Cgl2331	谷氨酸棒杆菌
R32	MAL-合酶	Cgl2329	谷氨酸棒杆菌	R31	ICI-裂解酶	Cgl0097Cgl2331	谷氨酸棒杆菌
R32	MAL-合酶	Cgl2329	谷氨酸棒杆菌	R33	PYR-羧化酶	Cgl0689	谷氨酸棒杆菌
R34	PEP-羧化酶	Cgl1585	谷氨酸棒杆菌	R33	PYR-羧化酶	Cgl0689	谷氨酸棒杆菌
R34	PEP-羧化酶	Cgl1585	谷氨酸棒杆菌	R35	PEP-羧激酶	Cgl2863	谷氨酸棒杆菌
R36	OAA-脱羧酶	CE0804	谷氨酸棒杆菌	R35	PEP-羧激酶	Cgl2863	谷氨酸棒杆菌
R36	OAA-脱羧酶	CE0804	谷氨酸棒杆菌	R37	ASP-转氨酶	Cgl0240	谷氨酸棒杆菌

R38	M-THF合成1	Cgl0860 Cgl1600 Cgl0382Cgl0861 Cgl0648 Cgl2171Cgl0881 Cgl0996 Cgl1972	谷氨酸棒杆菌
R38	M-THF合成1		谷氨酸棒杆菌	R39	HOM-脱氢酶	Cgl1183	谷氨酸棒杆菌
R40	HOM-乙酰转移酶	Cgl0652	谷氨酸棒杆菌	R39	HOM-脱氢酶	Cgl1183	谷氨酸棒杆菌
R40	HOM-乙酰转移酶	Cgl0652	谷氨酸棒杆菌	R41	PG-脱氢酶	Cgl1284	谷氨酸棒杆菌
R42	磷酸丝氨酸-转氨酶	Cgl0828	谷氨酸棒杆菌	R41	PG-脱氢酶	Cgl1284	谷氨酸棒杆菌
R42	磷酸丝氨酸-转氨酶	Cgl0828	谷氨酸棒杆菌	R43	磷酸丝氨酸-磷酸酶	Cgl0299	谷氨酸棒杆菌
R44	丝氨酸-乙酰转移酶	Cgl2563	谷氨酸棒杆菌	R43	磷酸丝氨酸-磷酸酶	Cgl0299	谷氨酸棒杆菌
R44	丝氨酸-乙酰转移酶	Cgl2563	谷氨酸棒杆菌	R45	半胱氨酸-合酶	Cgl2136 Cgl0653	谷氨酸棒杆菌
R45a	S-硫代-半胱氨酸-合酶	Cgl2136 Cgl0653	谷氨酸棒杆菌	R45	半胱氨酸-合酶	Cgl2136 Cgl0653	谷氨酸棒杆菌
R45a	S-硫代-半胱氨酸-合酶	Cgl2136 Cgl0653	谷氨酸棒杆菌	R46	胱硫醚-合酶	Cgl2446	谷氨酸棒杆菌
R47	天冬氨酸激酶	Cgl0251	谷氨酸棒杆菌	R46	胱硫醚-合酶	Cgl2446	谷氨酸棒杆菌
R47	天冬氨酸激酶	Cgl0251	谷氨酸棒杆菌	R48	ASP-P-脱氢酶	Cgl0252	谷氨酸棒杆菌
R49	O-Ac-HOM硫化氢解酶	Cgl0653	谷氨酸棒杆菌	R48	ASP-P-脱氢酶	Cgl0252	谷氨酸棒杆菌
R49	O-Ac-HOM硫化氢解酶	Cgl0653	谷氨酸棒杆菌	R50	乙酸盐-激酶	Cg3047	谷氨酸棒杆菌
R51	磷酸乙酰转移酶	Cg3048	谷氨酸棒杆菌	R50	乙酸盐-激酶	Cg3047	谷氨酸棒杆菌
R51	磷酸乙酰转移酶	Cg3048	谷氨酸棒杆菌	R52	MET-合酶(MetE/H)	Cgl1507 Cgl1139	谷氨酸棒杆菌
R53	甲硫氨酸转运体	YP_224558CAF18830	谷氨酸棒杆菌	R52	MET-合酶(MetE/H)	Cgl1507 Cgl1139	谷氨酸棒杆菌
R53	甲硫氨酸转运体	YP_224558CAF18830	谷氨酸棒杆菌	R54	胱硫醚-裂解酶	Ceg2536	谷氨酸棒杆菌
R55	ATP-硫酸化酶	Cgl2814	谷氨酸棒杆菌	R54	胱硫醚-裂解酶	Ceg2536	谷氨酸棒杆菌
R55	ATP-硫酸化酶	Cgl2814	谷氨酸棒杆菌	R56	ATP-水解	不可应用	自发反应
R57	苹果酸酶	Cgl3007	谷氨酸棒杆菌	R56	ATP-水解	不可应用	自发反应
R57	苹果酸酶	Cgl3007	谷氨酸棒杆菌	R58	亚硫酸盐还原酶	Cg3118	谷氨酸棒杆菌
R59	呼吸链1	Cgl1212 Cgl1210 Cgl1211Cgl1209 Cgl1213 Cgl1207Cgl1206 Cgl1208	谷氨酸棒杆菌	R58	亚硫酸盐还原酶	Cg3118	谷氨酸棒杆菌
R59	呼吸链1		谷氨酸棒杆菌	R60	呼吸链2	Cgl1212 Cgl1210 Cgl1211Cgl1209 Cgl1213 Cgl1207Cgl1206 Cgl1208	谷氨酸棒杆菌
R61	生物量形成		量等式	R60	呼吸链2		谷氨酸棒杆菌
R61	生物量形成		量等式	R62	GTP-ATP-磷-转移酶	Cg2603	谷氨酸棒杆菌
R70	转氢酶	AAC76944、NP_214669、NP_334574	大肠杆菌等	R62	GTP-ATP-磷-转移酶	Cg2603	谷氨酸棒杆菌
R70	转氢酶	AAC76944、NP_214669、NP_334574	大肠杆菌等	R71	甘氨酸脱羧酶P蛋白H蛋白	Q8FE66、P0A6T9	大肠杆菌等
R72	氨甲酰转移酶T蛋白H蛋白	CAA52144.1、P0A6T9	大肠杆菌等	R71	甘氨酸脱羧酶P蛋白H蛋白	Q8FE66、P0A6T9	大肠杆菌等
R72	氨甲酰转移酶T蛋白H蛋白	CAA52144.1、P0A6T9	大肠杆菌等	R71/72	甘氨酸裂解体系GcvP，H，T lpda	CAA52144、Q8FE66、P0A9P0、P0A6T9	大肠杆菌等
R73	硫代硫酸盐还原酶由3个亚基组成	NP_461008、NP_461009、NP_461010	鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等	R71/72	甘氨酸裂解体系GcvP，H，T lpda	CAA52144、Q8FE66、P0A9P0、P0A6T9	大肠杆菌等
R73	硫代硫酸盐还原酶由3个亚基组成	NP_461008、NP_461009、NP_461010	鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等	R74	厌氧亚硫酸盐还原酶-由3个亚基组成	AAL21442、AAL21443、NP_804181	鼠伤寒沙门氏菌等
R75	甲酸盐-THF-连接酶	NP_939608	白喉棒杆菌(Cdiphteriae)等	R74	厌氧亚硫酸盐还原酶-由3个亚基组成	AAL21442、AAL21443、NP_804181	鼠伤寒沙门氏菌等
R75	甲酸盐-THF-连接酶	NP_939608	白喉棒杆菌(Cdiphteriae)等	R76	5-甲酰-四氢叶酸环化-连接酶	NCgl0845	谷氨酸棒杆菌等

R77	O-乙酰-高丝氨酸-(甲基)-磺基氢化酶(sulfhydrolase)	NCgl0625	谷氨酸棒杆菌等
R77	O-乙酰-高丝氨酸-(甲基)-磺基氢化酶(sulfhydrolase)	NCgl0625	谷氨酸棒杆菌等	R78	5，10-亚甲基THF还原酶(NAD(P)H亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+)(EC_1.5.1.5)	NCgl2091、NP_601375	谷氨酸棒杆菌
R79	甲酰四氢叶酸去甲酰酶，将甲酰-THF降解为甲酸盐和四氢叶酸	ADD13491	谷氨酸棒杆菌	R78	5，10-亚甲基THF还原酶(NAD(P)H亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+)(EC_1.5.1.5)	NCgl2091、NP_601375	谷氨酸棒杆菌
R79	甲酰四氢叶酸去甲酰酶，将甲酰-THF降解为甲酸盐和四氢叶酸	ADD13491	谷氨酸棒杆菌	R80	硫酸盐还原酶体系	NP_602005、NP_602006、NP_602007、CAF20840、CAF20841	谷氨酸棒杆菌等
R81	跨膜转氢酶	CAA46822	其他	R80	硫酸盐还原酶体系	NP_602005、NP_602006、NP_602007、CAF20840、CAF20841	谷氨酸棒杆菌等
R81	跨膜转氢酶	CAA46822	其他	R82	硫酸盐摄取转运体(ABC转运体)	YP_224929	谷氨酸棒杆菌等

上述登录号为基因库的官方登录号，或为在基因库交叉参考的登录号的同义词。可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/搜索并找到这些编号。

本发明也预见到，通过理论或遗传操作生物，可以改变流经其他通路和反应的代谢通量，从而得到甲硫氨酸合成效率增高的生物；只要在如科学文献中已知所述反应直接或间接参与甲硫氨酸合成。自然，这些通路和反应也可用于理论基本通量模式分析。通过这些方法得到的(经遗传修饰的)生物也是本发明的一部分。

如上所述，根据本发明，生物中的实际代谢通量应接近甲硫氨酸合成增加生物的最优理论通量，后者则根据权利要求1的基本通量模式分析确定。在本发明中，“近似”是指遗传修饰后形成的经遗传修饰生物的代谢通量，相对于起始生物的代谢通量更类似于理论预测的代谢通量。

如上文列出，可以对生物进行遗传修饰影响对起始生物代谢通量的调控，例如通过影响所述网络中催化特定反应的酶的量和/或活性。此外，也可以使用某些养分和外部代谢物如硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐和硫化物以及C1化合物如甲酸盐甲醛、甲醇甲硫醇和二甲基二硫醚等，影响代谢通量。虽然稍后会更详细解释外部代谢物如硫代硫酸盐、甲酸盐或甲硫醇的影响，以下给出生物遗传修饰的一般实例。

以下将就特定的反应解释如何通过对生物的遗传修饰将代谢通量引入某一通路。这些解释可相应用于其他反应。

例如，如果根据本发明方法得到的理论模型或设计的模型生物，预测为实现有效的甲硫氨酸合成应当使代谢通量主要进入PPP，则通过遗传影响上述属于PPP部分的反应的量和/或活性，得到经此通路的代谢通量增加的实际生物。因此，通过增加R3的量和/或活性以形成更多GLC-LAC，可以将代谢通量引入PPP。同样，增加R4、R5、R6、R7、R8、R9或R10的量和/或活性，能增加进入PPP的代谢通量。通过增加R2生成G6P的活性也可以达到同样的目的。

如果根据本发明方法得到的理论模型预测通过TCA的代谢通量减少，则可通过减少以下酶R21、R22、R23、R24、R26、R27、R28、R29或R30的量和/或活性实现。如何增加或减少酶的活性和/或量，对于技术人员显而易见，下文会进行举例解释。

然而，对于一般目的而言，必须注意在代谢通路中(如在图1中)，某些反应可能是不可逆的。虽然几乎某一生物网络中的任何反应都是能够双向进展的平衡反应，一般认为不可逆反应是那些一旦输入如能量后主要向一个方向进行的反应，因此该反应的平衡几乎完全落在反应的一侧。

在PPP中，此类不可逆反应是例如由R3和R5催化的反应，两者都倾向于形成NADPH。本文中所用的其他此类不可逆反应术语实例，如EMP的R16、TCA的R24等。图1中以单向箭头表示不可逆反应。

在本发明中，如说明“通过提高催化该方向的酶的量和/或活性增加了经过某一反应通路的代谢通量”，则必须根据上述如何定义该反应的前后文理解该叙述。提高或减少酶的量和/或活性应结合反应被进一步推进或引导的方向来理解。由于本发明中代谢网络的多个通路的反应是由其酶及该酶形成的产物定义的，本领域技术人员应该清楚理解，提高酶的量和/或活性或减少酶的量和/或活性影响酶的量和/或活性以获得更多或更少的产物。

因此，如果例如提出增加酶R6的活性，则联系上述有关此反应的叙述，这表明通过提高R6的量和/或活性，增加了XYL-5P的量。与之相似，如果提出增加酶R23的量和/或活性，表明酶R23的量和/或活性被增加以产生更多ICI。与之相应，如果例如减少R29的量和/或活性，则表明减少R29的量和/或活性以产生更少的MAL。

如果甲硫氨酸合成效率增高的理论模式生物需要例如增加经过某一通路的代谢通量，在本发明的实施方案中修饰所述反应通路中仅一种酶的量和/或活性即可。或者也可以修饰该代谢通路中多种酶的量和/或活性。例如，如果通过基本通量分析得到的理论模型提示，例如增加通过PPP和TCA的代谢通量而减少RC的代谢通量，可以通过增加PPP和TCA循环中仅一种酶的量和/或活性而减少RC中仅一种酶的活性和/或量来实现之。或者也可同时影响这些通量中多种酶的量和/或活性。

本领域技术人员也清楚知道，上述定义的由单个酶活性实施的酶促反应实际上可能是由多种酶完成的一系列酶促(亚)步骤，其整体而言提供了所示的总体活性(例如亚硫酸盐或硫代硫酸盐还原酶)。所示的总体酶活性(见上述R-数字)也可由多个亚单元组成。在这些情况下，通过修饰催化单个(亚)步骤之一或至少一个亚单元的至少一种酶的活性和/或量可以影响通过上述鉴定反应的代谢通量。因此，可认为(亚)步骤或亚单元的编码基因是总体相应酶活性的部分。

对于甘氨酸裂解体系而言，技术人员知道该体系涉及基因gcvT、和/或H、和/或P和/或L(lpdA)(见表1和2)。因此，可通过如过量表达至少一个上述鉴定基因或其同源物，增加或引入以上由反应R71、R72和R71/72定义的通过该体系的代谢通量。也可通过过量表达所有这4种基因或仅其中2种或3种，增加代谢通量。可在如天然存在的操纵子或利用启动子构建的人工操纵子中同时过量表达这些基因。此外，也可以与基因lpdA一起过量表达基因gcvH、P、T(仍见表1和2)。

对于甲硫氨酸合成体系而言，技术人员知道以下反应：

R47、R48、R39、R40、R46、R49、R52、R53、R54涉及甲硫氨酸的合成。

为过量表达转氢酶(R70和R81)，可过量表达基因udh、pntA和/或pntB或其同源物中至少一种(见表1和2)。这些基因也可在如天然存在的操纵子或利用启动子构建的人工操纵子中同时过量表达。此外，当然也可以过量表达跨膜转氢酶的基因如udhA和/或pntA、B。

为过量表达硫代硫酸盐还原酶(R73、R45a、R49和/或R82)，可单独或联合(如在天然存在的操纵子或利用启动子构建的人工操纵子中)过量表达基因硫代硫酸盐还原酶细胞色素B亚基、硫代硫酸盐还原酶电子转运蛋白和/或硫代硫酸盐还原酶前体。为此可以使用phsA、B和/或C基因或其同源物(见表1和2)。与之相似，可过量表达ABC转运体如YP_224929的基因。

为过量表达磷酸戊糖通路，可在如天然存在的操纵子或利用启动子构建的人工操纵子中单独过量表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、OPCA、转酮酶、转醛酶、6-磷酸葡萄糖酸内酯脱氢酶或其同源物基因(见表1和2)，或任意与2个、3个、4个或更多基因联合过量表达。

为过量表达亚硫酸盐还原体系(R74)，可单独或联合(如在天然存在的操纵子或利用启动子构建的人工操纵子中)过量表达厌氧亚硫酸盐还原酶亚基A、B和C基因。基因dsrA、dsrB和/或dsrC或其同源物(见表1和2)可用于这些目的。

对于甲酸盐转化体系(FCS)，可以通过修饰至少一种选自下组的基因的量和/或活性来修饰、及在某些实施方案中增加或引入代谢通量：甲酸盐-THF-连接酶、甲酰-THF-环化连接酶、亚甲基-THF-脱氢酶、5，10-亚甲基-THF-还原酶、亚甲基-THF-还原酶。也可使用其同源物(见表1和2)。也可通过过量表达这些基因中任一种增加通过FCS的代谢通量。

可以认为硫酸盐还原酶体系(SARS，R80)由硫酸盐腺苷转移酶亚基1(NP_602005)及硫酸盐腺苷转移酶亚基2(NP_602006)组成，构成ATP：硫酸盐腺苷转移酶、腺苷-5’-磷酸硫酸酐激酶(EC：2.7.1.25)、3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸酐(PAPS)还原酶(EC：1.8.4.8，NCgl2717)以及亚硫酸盐还原酶(EC：1.8.1.2，CAF20840)。

对于修饰的优选靶标可能为本发明中认为不可逆的酶的量和/或活性。因此，通过对甲硫氨酸合成效率增加的生物进行代谢通量而得到的理论模型，为本领域技术人员考虑何种遗传操作以得到具有此类优化代谢通量的微生物提供了清晰的指导。本领域技术人员随后可挑选出其从构建的理论代谢网络所熟知的限制性酶，并通过遗传修饰生物来影响这些酶的量和/或活性。如何通过遗传修饰得到此类生物属于本领域的一般性知识。

根据本发明通过遗传修改生物，可以修改这些生物的代谢通量以增加其甲硫氨酸合成的效率，从而使这些生物的特征在于其甲硫氨酸的产生效率至少为10％、至少为15％、至少为20％、至少为25％、至少为30％、至少为35％、至少为40％、至少为45％、至少为50％、至少为55％、至少为60％、至少为65％、至少为70％、至少为75％、至少为80％或至少为85％。

在实验章节的理论部分描述了甲硫氨酸合成效率增加的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中最优代谢通量模式。尽管其中将详细列出如何计算这些模式、考虑了哪些反应并使用了哪些化学计量学，以下还是列出这些模型的一般性结论。因此，以下部分是对本领域技术人员的指导，即应当对哪些代谢通路进行遗传修饰以使这些通路的代谢通量接近从理论模型得到的最优值。在实验章节的实践部分将给出工作流程，以说明对于某些酶应采取哪些特定措施以进行遗传操作。

谷氨酸棒杆菌

本发明的目的之一涉及经遗传修饰的棒状杆菌属微生物，所述遗传修饰使其相对起始生物增加和/或引入至少一条以下通路的代谢通量：

●磷酸转移酶体系(PTS)和/或

●磷酸戊糖通路(PPP)和/或

●硫同化(SA)和/或

●回补通路(AP)和/或

●甲硫氨酸合成(MS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)和/或

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●通路1(P1)和/或

●通路2(P2)和/或

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

●硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

●甲酸盐转化体系(FCS)和/或

●甲硫醇转化体系(MCS)和/或

同时，此类优化微生物应任选的具有通过至少一条以下通路的至少减少的代谢通量：

●糖酵解(EMP)和/或

●三羧酸循环(TCA)和/或

●乙醛酸支路(GS)和/或

●呼吸链(RC)和/或

●通路3(P3)和/或

●通路4(P4)和/或

●通路7(P7)和/或

●R19，以产生更少丙酮酸和/或

●R35，以产生更少PEP和/或

●R79，以产生更少THF。

本发明涉及产生甲硫氨酸合成效率增高的棒状杆菌属微生物的方法，包括以下步骤。

●通过对生物遗传修饰，相对于起始生物，增加和/或引入经过以下至少一条通路的代谢通量：

●磷酸转移酶体系(PTS)和/或

●磷酸戊糖通路(PPP)和/或

●硫同化(SA)和/或

●回补通路(AP)和/或

●甲硫氨酸合成通路(MS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸体系(SCGS)和/或

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●通路1(P1)和/或

●通路2(P2)和/或

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

●硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

●甲酸盐转化体系(FCS)和/或

●甲硫醇转化体系(MCS)和/或

●通过对生物的遗传修饰，相对于起始生物，至少部分的降低经过至少一条以下通路的代谢通量：

●糖酵解(EMP)和/或

●三羧酸循环(TCA)和/或

●乙醛酸支路(GS)和/或

●呼吸链(RC)和/或

●通路3(P3)和/或

●通路4(P4)和/或

●通路7(P7)和/或

●R19，以产生更少丙酮酸和/或

●R35，以产生更少PEP和/或

●R79，以产生更少THF。

本发明的一个实施方案涉及产生甲硫氨酸合成效率增高的棒状杆菌属微生物的方法，其中

对于PTS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R1，以产生更多G6P；和/或

对于PPP而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R3，以产生更多GLC-LAC和/或

b.R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

c.R5，以产生更多RIB-5P和/或

d.R6，以产生更多XYL-5P和/或

e.R7，以产生更多RIBO-5P和/或

f.R8，以产生更多S7P和GA3P和/或

g.R9，以产生更多E-4p和F6P和/或

h.R10，以产生更多F6P和GA3P和/或

i.R2，以产生更多G6P；和/或

对于SA而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R55，以产生更多H₂SO₃和/或

b.R58，以产生更多H₂S和/或

对于AP而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R33，以产生更多OAA和/或

对于MS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R37，以产生更多Asp和/或

b.R39，以产生更多HOM和/或

c.R40，以产生更多O-AC-HOM和/或

d.R46，以产生更多CYSTA和/或

e.R47，以产生更多ASP-P和/或

f.R48，以产生更多ASP-SA和/或

g.R49，以产生更多HOMOCYS和/或

h.R52，以产生更多MET和/或

i.R53，以产生更多MET_ex和/或

j.R54，以产生更多HOMOCYS和/或

对于SCGS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R38，以产生更多M-THF和甘氨酸_ex和/或

b.R44，以产生更多O-AC-SER和/或

c.R45，以产生更多CYS和/或

对于CGS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R71，以产生更多M-HPL和/或

b.R72，以产生更多亚甲基-THF

c.R78，以产生更多亚甲基-THF和/或

对于THGC而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R70，以产生更多NADPH和/或

b.R81，以产生更多NADPH和/或

对于P1而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R25，以产生更多Glu；和/或

对于P2而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R33和/或R36，以产生更多OAA和/或

b.R30，以产生更多MAL和/或

c.R57，以产生更多Pyr；和/或

对于TRS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

b.R82，将更多外部H₂S₂O₃转运入细胞和/或

对于SRS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

对于FCS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R75，以产生10-甲酰-THF和/或

b.R76，以从10-甲酰-THF产生亚甲基-THF和/或

c.R78，以产生更多亚甲基-THF和/或

对于MCS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R77，以通过甲硫醇甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

对于SARS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R80，以产生更多亚硫酸盐和/或

对于EMP而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R11，以产生更少F-1，6-BP和/或

b.R13，以产生更少DHAP和GA3P和/或

c.R14，以产生更少GA3P和/或

d.R15，以产生更少1，3-PG和/或

e.R16，以产生更少3-PG和/或

f.R17，以产生更少2-PG和/或

g.R18，以产生更少PEP和/或

h.R19，以产生更少Pyr；和/或

对于TCA而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R20，以产生更少Ac-CoA和/或

b.R21，以产生更少CIT和/或

c.R22，以产生更少顺式-ACO和/或

d.R23，以产生更少ICI和/或

e.R24，以产生更少2-OXO和/或

f.R26，以产生更少SUCC-CoA和/或

g.R27，以产生更少SUCC和/或

h.R28，以产生更少FUM和/或

i.R29，以产生更少MAL和/或

j.R30，以产生更少OAA；和/或

对于GS而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R21，以产生更少CIT和/或

b.R22，以产生更少顺式-ACO和/或

c.R23，以产生更少ICI和/或

d.R31，以产生更少GLYOXY和SUCC和/或

e.R32，以产生更少MAL和/或

f.R28，以产生更少FUM和/或

g.R29，以产生更少MAL和/或

h.R30，以产生更少OAA；和/或

对于RC而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R60；和/或

相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R19；和/或

相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R35；和/或

对于P3而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R56；和/或

对于P4而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R62；和/或

对于P7而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R61，和/或

对于P8而言，相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R79。

本发明的另一实施方案涉及产生甲硫氨酸合成效率增高的棒状杆菌属微生物的方法，其中

●相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

1.R3，以产生更多GLC-LAC和/或

2.R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

3.R5，以产生更多RIB-5P和/或

4.R10，以产生更多F6P和GA3P和/或

5.R2，以产生更多G6P和/或

6.R55，以产生更多H₂SO₃和/或

7.R58，以产生更多H₂S和/或

8.R71，以产生更多M-HPL和/或

9.R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

10.R78，以产生甲基-THF和/或

11.R76，以产生更多亚甲基-THF和/或

12.R70，以产生更多NADPH和/或

13.R81，以产生更多NADPH和/或

14.R25，以产生更多Glu和/或

15.R33和/或R36，以产生更多OAA和/或

16.R30，以产生更多MAL和/或

17.R57，以产生更多Pyr和/或

18.R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

19.R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

20.R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

21.R82，已将更多的外部H₂S₂O₃转运入细胞和/或

22.R75，以产生10-甲酰-THF和/或

23.R76，以自10-甲酰-THF产生亚甲基-THF和/或

24.R78，以产生更多亚甲基-THF和/或

25.R77，以通过甲硫醇甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

●相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

1.R11，以产生更少F-1，6-BP和/或

2.R19，以产生更少Pyr和/或

3.R20，以产生更少Ac-CoA和/或

4.R21，以产生更少CIT和/或

5.R24，以产生更少2-OXO和/或

6.R26，以产生更少SUCC-CoA和/或

7.R27，以产生更少SUCC和/或

8.R31，以产生更少GLYOXY和SUCC和/或

9.R32，以产生更少MAL和/或

10.R35，以产生更少PEP和/或

10.R79，以产生更少THF。

●相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

1.R3，以产生更多GLC-LAC和/或

2.R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

3.R5，以产生更多RIB-5P和/或

4.R10，以产生更多F6P和GA3P和/或

5.R2，以产生更多G6P和

6.R55，以产生更多H₂SO₃和/或

7.R58，以产生更多H₂S和

8.R71，以产生更多M-HPL和/或

9.R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

10.R78，以产生甲基-THF和/或

11.R76，以产生更多亚甲基-THF和/或

12.R70，以产生更多NADPH和/或

13.R81，以产生更多NADPH和/或

14.R25，以产生更多Glu和/或

15.R33和/或R36，以产生更多OAA

16.R30，以产生更多MAL

17.R57，以产生更多Pyr

18.R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

19.R75，以产生10-甲酰-THF和/或

20.R76，以从10-甲酰-THF产生亚甲基-THF和/或

21.R77，以通过甲硫醇甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

●相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

1.R11，以产生更少F-1，6-BP和/或

2.R19，以产生更少Pyr和/或

3.R20，以产生更少Ac-CoA和/或

4.R21，以产生更少CIT和/或

5.R24，以产生更少2-OXO和/或

6.R26，以产生更少SUCC-CoA和/或

7.R27，以产生更少SUCC和/或

8.R31，以产生更少GLYOXY和SUCC和/或

9.R32，以产生更少MAL和/或

10.R35，以产生更少PEP和/或

11.R79，以产生更少THF。

通过这些方法得到的任意生物均为本发明的内容。

用于这些方法的棒状杆菌微生物可选自以下组成的组谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806，

嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870，

嗜热棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539，及

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965，

谷氨酸棒杆菌KFCC10065，及

谷氨酸棒杆菌ATCC21608

谷氨酸棒杆菌DSM 17322

简写KFCC指韩国培养物保藏局，而简写ATCC是指美国模式培养和保藏所，简写DSM是指德意志微生物保藏中心。

尤其值得关注的是经过遗传修饰的棒状杆菌属生物，其中引入经以下通路的代谢通量：

●甘氨酸裂解体系

●转氢酶转化

●硫代硫酸盐还原酶体系

●硫酸盐还原酶体系

●甲酸盐转化体系

●甲硫醇转化体系

如果将甲硫醇转化体系引入棒状杆菌，则硫代硫酸盐还原酶体系和甲酸盐转化体系可能失用。已经发现这些前述的其他通路体系能显著影响大肠杆菌中有效甲硫氨酸合成的最优代谢通量(见下)。根据理论预测，将这些代谢通路纳入谷氨酸棒状杆菌，会进一步提高谷氨酸棒状杆菌中甲硫氨酸合成的效率。

因此，本发明一方面涉及经遗传修饰以增加经上述任一通路的代谢通量的生物。

根据本发明通过遗传修改谷氨酸棒状杆菌，可以修改这些生物的代谢通量以增高甲硫氨酸合成的效率，从而使这些生物的特征在于其产生甲硫氨酸的效率至少为10％，至少为20％，至少为30％，至少为35％，至少为40％，至少为45％，至少为50％，至少为55％，至少为60％，至少为65％，至少为70％，至少为75％，至少为80％或至少为85％。

就谷氨酸棒状杆菌而言，本发明并不涉及Rey等人(2003)(参考上文)所述的ΔmcbR敲除菌株。

大肠杆菌

本发明的一方面涉及经遗传修饰的埃希菌属微生物，所述遗传修饰相对于起始生物增加和/或引入经至少一条以下通路的代谢通量：

●磷酸转移酶体系(PTS)和/或

●糖酵解(EMP)和/或

●三羧酸循环(TCA)和/或

●乙醛酸支路(GS)和/或

●回补通路(AP)和/或

●甲硫氨酸合成通路(MS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸体系(SCGS)和/或

●通路1(P1)和/或

●硫同化(SA)和/或

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

●硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

●甲酸盐转化体系(FCS)和/或

●甲硫醇转化体系(MCS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)

这些甲硫氨酸合成效率增高的微生物的特征也任选在于，其中相对于起始生物，经至少一条以下通路的代谢通量至少减少，这也可通过遗传修饰实现：

●磷酸戊糖通路(PPP)

●甲硫氨酸合成(MS)和/或

●通路3(P3)和/或

●通路4(P4)和/或

●通路7(P7)和/或

●通路8(P8)。

在某些实施方案中，经PPP的代谢通量可能不减反增。

除了上述埃希菌属微生物外，本发明也涉及产生甲硫氨酸生产效率增高的埃希菌属微生物的方法，包括以下步骤：

●磷酸转移酶体系(PTS)和/或

●糖酵解(EMP)和/或

●三羧酸循环(TCA)和/或

●乙醛酸支路(GS)和/或

●回补通路(AP)和/或

●甲硫氨酸合成通路(MS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸体系(SCGS)和/或

●通路1(P1)和/或

●硫同化(SA)和/或

●甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

●转氢酶转化(THGC)和/或

●硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

●亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

●硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

●甲酸盐转化体系(FCS)和/或

●甲硫醇转化体系(MCS)和/或

●丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)和/或

●通过对生物遗传修饰，相对于起始生物至少部分减少经以下至少一条通路的代谢通量：

●磷酸戊糖通路(PPP)

●通路3(P3)和/或

●通路4(P4)和/或

●通路7(P7)和/或

●R19和/或

●R35和/或

●R79。

本发明的其他方面为产生甲硫氨酸生产效率增高的埃希菌属微生物的方法，其中

a.R1，以产生更多G6P；和/或

对于EMO而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R2，以产生更多F6P和/或

b.R11，以产生更多F-1，6-BP和/或

c.R13，以产生更多DHAP和GA3P和/或

d.R14，以产生更多GA3P和/或

e.R15，以产生更多1，3-PG和/或

f.R16，以产生更多3-PG和/或

g.R17，以产生更多2-PG和/或

h.R18，以产生更多PEP和/或

i.R19，以产生更多Pyr；和/或

对于TCA而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R20，以产生更多Ac-CoA和/或

b.R21，以产生更多CIT和/或

c.R22，以产生更多顺式-ACO和/或

d.R23，以产生更多ICI和/或

e.R24，以产生更多2-OXO和/或

f.R26，以产生更多SUCC-CoA和/或

g.R27，以产生更多SUCC和/或

h.R28，以产生更多FUM和/或

i.R29，以产生更多MAL和/或

j.R30，以产生更多OAA；和/或

a.R33，以产生更多OAA和/或

a.R37，以产生更多Asp和/或

b.R39，以产生更多HOM和/或

c.R40，以产生更多O-AC-HOM和/或

d.R46，以产生更多CYSTA和/或

e.R47，以产生更多ASP-P和/或

f.R48，以产生更多ASP-SA和/或

g.R49，以产生更多HOMOCYS和/或

h.R52，以产生更多MET和/或

i.R53，以产生更多MET_ex和/或

j.R54，以产生更多HOMOCYS和/或

a.R38，以产生更多M-THF和甘氨酸_ex和/或

b.R44，以产生更多O-AC-SER和/或

c.R45，以产生更多CYS和/或

对于GS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R21，以产生更多CIT和/或

b.R22，以产生更多顺式-ACO和/或

c.R23，以产生更多ICI和/或

d.R31，以产生更多GLYOXY和SUCC和/或

e.R32，以产生更多MAL和/或

f.R28，以产生更多FUM和/或

g.R29，以产生更多MAL和/或

h.R30，以产生更多OAA；和/或

R25，以产生更多Glu；和/或

a.R55，以产生更多H₂SO₃和/或

b.R58，以产生更多H₂S；和/或

对于GCS而言，相对于起始生物，增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

a.R71，以产生更多M-HPL和/或

b.R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

c.R78，以产生更多甲基-THF和/或

a.R70，以从NADH产生更多NADPH和/或

b.R81，以从NADH产生更多NADPH和/或

a.R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

b.R82，以将更多外部H₂S₂O₃转运入细胞和/或

a.R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

a.R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

a.R75，以产生10-甲酰-THF和/或

b.R76，以从10-甲酰-THF产生亚甲基-THF和/或

c.R78，以产生更多甲基-THF

a.R77，以通过甲硫醇甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

对于SCGS而言，相对于起始生物，增加以下酶的量和/或活性：

a.R44，以产生更多O-Ac-SER和/或

b.R45，以产生更多CYS；和/或

对于PPP而言，相对于起始生物，增加以下酶的量和/或活性：

a.R3，以产生更多GLC-LAC和/或

b.R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

c.R5，以产生更多RIB-5P和/或

d.R6，以产生更多XYL-5P和/或

e.R7，以产生更多RIBO-5P和/或

f.R8，以产生更多S7P和GA3P和/或

g.R9，以产生更多E-4p和F6P和/或

h.R10，以产生更少F6P和GA3P和/或

i.R2，以产生更多G6P；和/或

对于PPP而言，在某些实施方案中也可相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

j.R3，以产生更少GLC-LAC和/或

k.R4，以产生更少6-P-葡萄糖酸盐和/或

l.R5，以产生更少RIB-5P和/或

m.R6，以产生更少XYL-5P和/或

n.R7，以产生更少RIBO-5P和/或

o.R8，以产生更少S7P和GA3P和/或

p.R9，以产生更少E-4p和F6P和/或

q.R10，以产生更少F6P和GA3P和/或

r.R2，以产生更少G6P；和/或

a.R56；和/或

a.R62；和/或

a.R61。

相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/或活性：

a.R19，以产生更少丙酮酸；和/或

b.R35，以产生更少PEP；和/或

c.R79，以产生更少四氢叶酸。

本发明关于埃希菌属的另一实施方案涉及产生甲硫氨酸合成效率增高的埃希菌属微生物的方法，其中

●相对于起始生物增加和/或引入以下酶的量和/或活性：

1.R1，以产生更多G6P和/或

2.R2，以产生更多F6P和/或

3.R11，以产生更多F-1，6-BP和/或

4.R19，以产生更多Pyr和/或

5.R20，以产生更多Ac-CoA和/或

6.R21，以产生更多CIT和/或

7.R24，以产生更多2-OXO和/或

8.R26，以产生更多SUCC-CoA和/或

9.R31，以产生更多GLYOXY和SUCC和/或

10.R32，以产生更多MAL和/或

11.R25，以产生更多Glu和/或

12.R55，以产生更多H₂SO₃和/或

13.R58，以产生更多H₂S和/或

14.R71，以产生更多M-HPL和/或

15.R72，以产生更多M-THF和/或

16.R78，以产生更多甲基-THF和/或

17.R76，以产生更多亚甲基-THF和/或

18.R70，以产生更多NADPH和/或

19.R81，以产生更多NADPH和/或

20.R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

21.R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

22.R82，以将更多外部H₂S₂O₃转运入细胞和/或

23.R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

24.R75，以产生10-甲酰-THF和/或

25.R76，以自10-甲酰-THF产生亚甲基-THF和/或

26.R77，以通过甲硫醇甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

27.R44，以产生更多O-Ac-SER和/或

28.R45，以产生更多CYS；

●相对于起始生物，至少部分的减少以下酶的量和/活性：

1.R19，以产生更少丙酮酸；和/或

2.R35，以产生更少PEP；和/或

3.R79，以产生更少四氢叶酸。

通过前述任一种方法可得的埃希菌属微生物选自包括如大肠埃希菌在内的微生物。

在某些涉及如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的生物的实施方案中，通过过量表达以下酶活性产生代谢通量：R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58。过量表达前述R数字的任意组合或这些催化活性的部分的任意基因的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌生物，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80与R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58的任意组合，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的一种酶活性与R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性、或过量表达这些催化活性的部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的2种酶活性与R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的3种酶活性与R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的4种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的5种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的6种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的7种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的8种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80细成的组中的9种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少一种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中的任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中的至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少2种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中的至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少3种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中的至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少4种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中的至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少5种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少6种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78，和/或R80组成的组中的至少7种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少8种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒状杆，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少9种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少一种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少一种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少2种酶活性，也是本发明的目的之一。

生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，其中过量表达选自R70、R81、R71/R72、R73、R82、R74、R75、R76、R77、R78和/或R80组成的组中的至少一种酶活性以及R37、R38、R39、R40、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R52、R53、R54和/或R58中任一种酶活性，或过量表达这些催化活性部分的基因；且降低R19、R35及R79组成的组中至少3种酶活性，也是本发明的目的之一。

在优选实施方案中，本发明涉及通过如上述遗传修饰，向其中引入和/或增加经下列通路之一的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS或GCS或MCS或TRS或THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和GCS、FCS和MCS、FCS和TRS，或者FCS和THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和GCS及TRS、FCS和GCS及TRS、或者FCS及GCS和THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和GCS和MCS及TRS、或者FCS和GCS和MCS及THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和GCS和MCS和TRS及THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和MCS及TRS、或者FCS和MCS及THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和MCS和TRS及THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和TRS及THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：FCS和MCS及TRS、或者FCS和MCS及THGC.在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：MCS和TRS、或MCS和THGC.在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：MCS和TRS及THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

在另一优选实施方案中，本发明涉及向其中引入和/或增加经下列通路的代谢通量的谷氨酸棒杆菌生物：TRS和THGC。在本发明的另一优选实施方案中，这些生物还利用硫化物或硫代硫酸盐作为外部硫源生长。

可提高R71和/或R72的表达以对GCS进行遗传操作。对THGS而言可提高R70和/或R81的表达。对TRS而言可提高R73、R45a、R49和/或R82的表达。对MCS而言可提高R77的表达。对FCS而言，可提高R75、R76和/或R78的表达。

图10显示了本发明的一个优选实施方案。在该实施方案中，描述了通过如上述遗传操作相对于起始生物，向该生物中增加和/或引入经以下通路：FCS和GCS和MCS和TRS及THGC的代谢通量。可考虑同时以硫化物和硫代硫酸盐为硫源。

本发明生物优选包括棒状杆菌属的微生物，具体而言为嗜醋酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、钝齿棒杆菌(C.efficiens)、C.jejeki、嗜醋棒杆菌(C.acetophilum)、产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌、百合棒杆菌(C.lilium)、嗜氮川棒杆菌(C.nitrilophilus)或某种棒杆菌。本发明的生物也包括短杆菌属，例如Brevibacterium harmoniagenes、植物短杆菌(Brevibacterium botanicum)、谷氨酸棒杆菌(B.divaraticum)、黄色短杆菌(B.flavam)、B.healil、酮谷短杆菌(B.ketoglutamicum)、酮还原短杆菌(B.ketosoreductum)、乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentum)、扩展短杆菌(B.linens)、B.paraphinolyticum以及短杆菌中某些种。对于埃希菌属而言，本发明涉及大肠杆菌。

如上所述，通过增加或减少催化相应反应的酶的量和/或活性，可以修饰经特定反应或特定代谢通路中的代谢通量。

可以使用本领域已知的增加宿主(如上述生物)中蛋白质量和/或活性的所有方法，来增加酶的量和/或活性。

增加或引入量和/或活性

在量的增加方面应区别两种基本情况。第一种情况是通过表达相应蛋白质的外源版本增加酶的量。另一种情况则是通过影响启动子和/或增强子元件的活性和/或如磷酸化、SUMO化修饰、泛素化等其他调节活性，以在转录、翻译或翻译后水平上调控相应蛋白质活性，增加内源性蛋白质的表达。

除了单纯增加如表1中的酶量外，可以利用带有特定突变从而使活性增强的酶来提高蛋白质的活性。例如，此类突变可使负责反馈抑制的酶的区域失活。通过如引入非保守突变来引发突变，该酶不再提供反馈调节，因此即使产生更多产物该酶的活性也不会被下调。可以将突变引入酶的内源性拷贝，或通过过量表达外源性酶的相应突变形式来提供突变。此类突变可包括点突变、缺失或插入。点突变可为保守性或非保守性。此外，缺失可包含各个蛋白质中从仅2或3个氨基酸直至完整结构域。

因此，可以通过不同途径增加蛋白质的活性和量，所述途径例如关闭转录、翻译及蛋白质水平的抑制性调控机制，或例如通过诱导内源性R3基因或引入编码R3的核酸，相对于起始生物提高这些蛋白质编码核酸的基因表达。

在一个实施方案中，通过提高相应酶编码核酸的基因表达，相对起始生物增加该酶的活性和量。可从相应数据库获取序列，如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL(http://www.embl.org)或Expasy(http://www.expasy.org/)。实例见表1。

在另一实施方案中，将表1中酶的编码核酸引入生物(优选谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌)，增加表1中酶的量和/或活性。

原则上而言，可以使用具有表1所列酶活性的不同生物的每一种蛋白质。对于真核生物来源的此类酶的含内含子基因组核酸序列，当宿主生物没有能力或不能被赋予能力剪切相应mRNA时，可使用经加工的核酸序列如相应cDNA。文中提及的所有核酸可为例如RNA、DNA或cDNA序列。

在本发明中产生甲硫氨酸合成效率增高生物的一种方法中，将上文定义的功能性或无功能性、反馈调节性或不依赖反馈的酶的编码核酸序列分别转运进入微生物如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌中。该转运导致相应酶表达增强，从而使通过所需反应通路的代谢通量增加。

根据本发明，增加或引入蛋白质的量和/或活性一般包括以下步骤：

a)产生自5’至3’方向含有以下核酸序列的载体，所述核酸序列优选DNA序列：

-在本发明生物中有功能的启动子序列

-与之有效连接的编码表1中蛋白质或其功能等效部分的DNA序列

-在本发明生物中有功能的终止子序列

b)将步骤a)的载体转入本发明的生物如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌，并任选的整合入各自基因组。

本发明范围中提及的“酶的功能性等效部分”，是指编码表1中酶的核酸序列的片段，所述片段的表达仍可形成具有相应全长蛋白质酶活性的蛋白质。

根据本发明，无功能酶与功能性酶及其功能性等效部分均具有相同的核酸序列和氨基酸序列，但是在某些位点处存在核苷酸或氨基酸的点突变、插入或缺失，从而导致无功能酶不能或仅能很有限地催化相应反应。这些无功能酶与那些仍能催化相应反应但失去反馈调节的酶不可混为一谈。无功能酶也包括在核酸序列水平或氨基酸序列水平具有点突变、插入或缺失的表1中的酶，从而不能或虽然如此仍能够与原酶的生理性结合对象相互作用。此类生理性结合对象包括如对应底物。无功能变体不能催化变体从其衍生的野生型酶可催化的反应。

根据本发明，术语“无功能酶”不包括那些在氨基酸水平及核酸水平均缺乏与相应功能性酶的基本序列同源性的蛋白质。因此，不能催化相应反应且缺乏与相应酶的基本序列同源性的蛋白质，不符合本发明术语“无功能酶”的定义。本发明范围内，无功能酶也指失活或无活性的酶。

因此，本发明中携带上述点突变、插入和/或缺失的表1的无功能酶，其特征在于具有与本发明表1中野生型酶或其功能性等效部分的基本序列同源性。

根据本发明，基本序列同源性一般是指DNA分子的核酸序列或蛋白质的氨基酸序列分别与表1中蛋白质或其功能性等效部分的核酸序列或氨基酸序列的同一性为至少25％，至少30％，至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，也优选至少70％，也优选至少80％，特别优选至少90％，尤其优选至少95％，而最优选至少98％。

两种蛋白质的同一性是指相应蛋白质全长中氨基酸的同一性，具体而言利用DNA Star，Inc.，Madison，Wisconsin(USA)，运用CLUSTAL方法的Lasergene软件(Higgins等人，(1989)，Comput.Appl.Biosci.，5(2)，151)，进行比较计算该同一性。

也可利用DNA Star，Inc.，Madison，Wisconsin(USA)，运用CLUSTAL方法的Lasergene软件(Higgins等人，(1989)，Comput.Appl.Biosci.，5(2)，151)，计算同源性。

相应的理解DNA序列同一性的含义。

上述方法可用于增加表1功能性或无功能、反馈调节或反馈独立的酶或其功能性等效部分的编码DNA序列的表达。此类含有调控序列如启动子和终止序列的载体的用途为本领域技术人员公知。此外，本领域技术人员知道如何将步骤a)得到的载体转移入生物如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌中，以及能整合入生物基因组的载体必须具备哪些性质。

如果通过转移一种生物(如大肠杆菌)中编码酶的核酸增加另一生物(如谷氨酸棒杆菌)中的酶含量，则最好通过根据遗传密码将多肽序列反翻译为核酸序列(其中主要包括生物特异性密码子使用中使用更频繁的密码子)来转移如来自大肠杆菌的核酸序列编码的氨基酸序列。可通过计算机评估相关生物的其他已知基因，确定密码子的使用。

根据本发明，表1中酶的编码核酸的基因表达以及相应活性的增加，也指操作生物(具体而言谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌)相应内源性酶的表达。可以通过如改变这些酶的编码基因的启动子DNA序列实现之。此类改变可造成这些酶的表达率改变、优选增加，可通过缺失或插入DNA序列来实现。

内源性基因启动子序列的改变通常会造成基因表达量的改变，从而使细胞或生物中检测得活性的改变。

此外，可通过调控蛋白来分别实现内源性基因表达的改变及增加，所述调控蛋白不出现于转化生物，并且其可与这些基因的启动子相互作用。此类调控物可为由DNA结合结构域和转录激活结构域组成的嵌合蛋白质，如WO 96/06166中所述。

另一增加内源性基因的活性和量的可能方法是，通过如过量表达的方法上调涉及内源性基因转录的转录因子。过量表达转录因子的方法为本领域技术人员公知，且本发明范围内也公布了针对表1中酶的方法。

此外，通过对内源性基因拷贝的靶向诱变也可改变内源性基因的活性。

通过影响酶的翻译后修饰，也可改变编码表1中酶的内源性基因。这可以例如，通过如过量表达或基因沉默方法的相应措施，调节涉及酶的翻译后修饰的酶如激酶或磷酸酶的活性而实现。

在另一实施方案中，可改善酶的效率或破坏其变构调控区域，以避免化合物生产的反馈抑制。与之相似，可通过替代、缺失或添加除去或修饰降解性酶，从而降低其对表1中所需酶的降解活性，而不影响细胞的活力。每种情况均可增加这些所需精细化学物之一的总产量或产率。

表1中蛋白质或核苷酸分子的此类改变也可能改善其他精细化学物的生产，如其他含硫化合物如半胱氨酸或谷胱甘肽、其他氨基酸、维生素、辅因子、营养品、核苷酸、核苷及海藻糖。任一化合物的代谢必定与细胞中其他生物合成及降解通路相互交错，而某一通路必要的辅因子、中间产物或底物很可能受另一此类通路提供或限制。因此，调节表1中一种或多种蛋白质的活性，可能会影响到甲硫氨酸合成通路之外的另一精细化学物的生物合成或降解通路的生产或活性效率。

也可基于不同代谢过程中的化合物的细胞水平调节酶的表达和功能；而基础生长所必需分子如氨基酸和核苷酸的细胞水平可能对大规模培养的微生物活力发挥关键作用。因此，调节表1中的氨基酸生物合成酶以使其不再应答反馈抑制或改善其效率或更新，会增加经甲硫氨酸合成通路的代谢通量。本发明的理论方法有助于将这些营养素、代谢物等的效果整合入模型生物中，因而为需要遗传修饰以增高甲硫氨酸合成效率的通路提供了很有价值的指导。

上述这些增加或引入表1中酶的量和/或活性的策略并不具有限制性；这些策略的变动对于本领域普通技术人员而言显而易见。

减少酶的量和/或活性

也有多种策略可减少表1中任一酶的量和/或活性。

例如，可通过表达特异结合于基因启动子序列的适配体，调控表1中内源性酶的表达。根据适配体结合后激活或抑制启动子区域，增加或减少表1中酶的量，进而增加或减少此处酶的活性。

可以设计适配体，使其本身可特异性结合于酶，并能通过如结合于相应酶的催化中心而降低酶的活性。通常通过基于载体的过量表达(见上)实现适配体的表达；而适配体的表达及其设计和选择，均为本领域技术人员熟知(Famulok等人，(1999)Curr Top Microbiol Immunol.，243，123-36)。

此外，可通过本领域技术人员熟知的多种试验方法减少表1中内源性酶的量和活性。这些方法通常可囊括于术语“基因沉默”之下。例如，通过将含有DNA序列的上述载体转入生物如谷氨酸棒杆菌及大肠杆菌中，沉默内源性基因的表达，其中所述DNA序列以反义顺序编码该酶或其部分。这是基于此类载体在细胞中的转录可产生RNA，后者能与内源性基因转录的mRNA杂交，从而阻断其翻译。

可以选择能指导多种细胞类型中反义RNA分子持续表达的、有效连接于反义方向克隆核酸的调控序列，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬粒或减毒病毒，这些载体可在高效调控区域的调控下产生反义核酸，所述调控区域的活性取决于引入载体的细胞类型。关于利用反义基因调控基因表达的讨论，可见Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，Reviews-Trends in Genetics，第1卷(1)1986。

原则上而言，反义策略可与核酶方法联合使用。核酶为具有催化活性的RNA序列，其一旦与反义序列耦联可催化性裂解靶序列(Tanner等人，(1999)FEMS Microbiol Rev.23(3)，257-75)。这样能增加反义策略的有效性。

在植物中，可通过RNA干扰或所谓共抑制的方法实现基因沉默。

其他方法为通过将RNA/DNA寡核苷酸引入生物，而向内源性基因内引入无义突变(Zhu等人，(2000)Nat.Biotechnol.18(5)，555-558)，或利用同源重组产生敲除变体(Hohn等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，8321-8323.)。

为产生同源重组微生物，制备含有至少部分的表1中酶编码基因的载体，所述基因中已引入了缺失、添加或替代，从而改变(如功能性破坏)内源性基因。

优选的内源性基因为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌基因，但其也可为相关细菌或甚至是酵母或植物来源的同源体。在一个实施方案中，设计该载体以使同源重组后内源性基因被功能性破坏(即不再编码功能性蛋白质；也被称为“敲除”载体)。或者可以设计载体以使同源重组后，内源性基因产生突变或其他改变但仍可编码功能性蛋白质(例如，改变上游调控区域从而改变表1中内源性酶的表达)。在同源重组载体中，内源性基因被改变的部分在其5’及3’末端侧接有该内源性基因的其他核酸，以使载体携有的外源性基因与(微)生物的内源性基因之间可进行同源重组。额外的侧翼内源性核酸的长度足以与内源性基因进行成功的同源重组。一般而言，载体中包括数千碱基的侧翼DNA(5’和3’末端合计)(见如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中有关同源重组载体的描述)。

将载体引入微生物(如通过电穿孔)，并利用领域已知的技术选择其中引入的内源性基因已和表1中内源性酶发生重组的细胞。

在另一实施方案中，破坏宿主细胞中表1中酶的内源性基因(例如同源重组或其他本领域已知的遗传方法)，从而使其蛋白质产物不能表达。在另一实施方案中，通过一个或多个点突变、缺失或转换改变宿主细胞中表1中酶的内源性或引入基因，但使其仍编码功能性蛋白质。在另一实施方案中，改变(微)生物中表1中酶的一个或多个内源性基因调控区域(例如启动子、抑制物或诱导物)(例如通过缺失、截断、转换或点突变)，从而调节内源性基因的表达。本领域普通技术人员应认识到，利用本发明的方法可成熟产生含有一个以上表1中酶的编码基因及蛋白修饰的宿主细胞，也包括在本发明内。

此外，通过特异性DNA结合因子(如锌指转录因子型的因子)也可实现基因抑制(以及基因过量表达)。此外，也可将抑制靶蛋白本身的因子引入细胞。蛋白质结合因子可为如上述的适配体(Famulok等人，(1999)Curr TopMicrobiol Immunol.243，123-36)。

也可考虑其他在生物中表达会导致表1中酶的量和/或活性减少的蛋白质结合因子，如酶特异性抗体。单克隆、多克隆或重组酶特异性抗体的制备依照标准步骤进行(Guide to Protein Purification，Meth.Enzymol.182，663-679页(1990)，M.P.Deutscher编辑)。文献中也已知抗体的表达(Fiedler等人，(1997)Immunotechnology 3，205-216；Maynard和Georgiou(2000)Annu.Rev.Biomed.Eng.2，339-76)。

所述技术为本领域技术人员所熟知。因此，技术人员也知道如反义方法中必须使用何种大小的核酸构建体，以及相应核酸序列必须具备哪些互补性、同源性或同一性。术语“互补性”、“同源性”以及“同一性”为本领域技术人员已知。

本发明范围内，序列同源性和同源性一般是指DNA分子的核酸序列或蛋白质的氨基酸序列，与已知DNA或RNA分子的核酸序列或蛋白质的氨基酸序列的同一性，分别为至少25％，至少30％，至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，也优选至少70％，也优选至少80％，特别优选至少90％，尤其优选至少95％，且最优选至少98％。此处，同源性和同一性的程度均系就编码序列的全长而言。

术语“互补性”描述了核酸分子与另一核酸分子基于两互补碱基间氢键进行杂交的能力。本领域技术人员知道，彼此杂交两个核酸分子间的互补性不必为100％。要与另一核酸序列进行杂交的核酸序列与所述另一核酸序列间的互补性，优选为至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，优选至少70％，特别优选至少80％，也特别优选至少90％，尤其优选至少95％，而最优选至少98或100％。

如果在相同5’-3’方向上具有相同核苷酸，则核酸分子为相同。

反义序列与内源性mRNA序列的杂交一般在体内细胞条件下或体外进行。根据本发明，在体内或体外足以保证特异性杂交的严紧条件下进行杂交。

严紧的体外杂交条件为本领域技术人员已知，可参考文献(见如Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press)。术语“特异性杂交”是指以下情况，其中分子在严紧条件下优先结合于某一核酸序列，所述核酸序列为复合混合物(如DNA或RNA分子)的一部分。

因此，术语“严紧条件”是指在此条件下，核酸序列优先结合于靶序列，而不会(或至少程度显著降低)结合于其他序列。

严紧条件取决于具体情况。较长序列在较高温度下发生特异性杂交。一般而言，选择严紧条件，以使在该条件下确定的离子强度和确定的pH值中，杂交温度低于特定序列熔点(Tm)约5℃。Tm为与靶序列互补的分子中有50％与所述靶序列发生杂交的温度(pH值确定、离子强度确定且核酸浓度确定)。一般而言，严紧条件包括，盐浓度为0.01至1.0M钠离子(或另一种盐的离子)，pH值为7.0至8.3。该温度对于短分子而言至少为30℃(例如包括10至50个核苷酸的分子)。此外，严紧条件可包括添加去稳定剂如甲酰胺。一般杂交和洗涤缓冲液的组分如下。

预杂交溶液：

0.5％SDS

5×SSC

50mM NaPO₄，pH6.8

0.1％焦磷酸钠

5×Denhardt′s试剂

100μg/鲑精

杂交溶液：预杂交溶液

1×10⁶cpm/ml探针(5-10分钟95℃)

20×SSC： 3M NaCl

0.3M柠檬酸钠

用HCl调节pH为7

50×Denhardt′s试剂： 5g聚糖体

5g聚乙烯吡咯烷酮

5g胎牛血清

蒸馏水调整至500ml。

杂交的一般过程如下：

任选的：65℃下、1×SSC/0.1％SDS中洗涤印迹30分钟

预杂交：50-55℃下至少2小时

杂交：55-60℃下过夜

洗涤：5分钟2×SSC/0.1％SDS

杂交温度

30分钟2×SSC/0.1％SDS

杂交温度

30分钟1×SSC/0.1％SDS

杂交温度

45分钟0.2×SSC/0.1％SDS 65℃

5分钟0.1×SSC 室温

术语“正义”和“反义”以及“反义方向”为本领域技术人员已知。此外，本领域技术人员知道，将用于反义方法的核酸分子必需的长度，以及其所必须具有的与相应靶序列间的同源性或互补性。

因此，本领域技术人员也知道用于基因沉默方法的核酸分子必需的长度。对于反义目的而言，100个核苷酸序列长度、80个核苷酸、60个核苷酸、40个核苷酸以及20个核苷酸序列长度的互补性可能已足够。更长的核苷酸长度当然也满足要求。也可考虑上述方法的组合应用。

如果根据本发明，一般可使用与生物中有活性的启动子按5’-3’方向有效连接的DNA序列来构建载体，该载体在转入生物细胞后可过量表达编码序列，或导致内源性核酸序列以及从其表达的蛋白质各自的抑制或竞争和阻断。

也可通过在生物中过量表达某一具体酶的无功能变体，降低该酶的活性。因此，不能催化目标反应但能结合如底物或辅因子的无功能变体，可通过其过量表达来竞争内源性酶从而抑制该反应。减少宿主细胞酶的量和/或活性的其他方法，为本领域技术人员熟知。

载体和宿主细胞

本发明另一方法涉及载体，其含有编码表1中的酶(或其部分)或其组合的核酸，该载体优选表达载体。此处所用的术语“载体”是指能转运与其连接的另一核酸的核酸分子。

载体类型之一为“质粒”，是指可以连入额外DNA片段的环形双链DNA环。另一载体类型是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接入病毒基因组。

某些载体能在其被引入的宿主细胞内自发复制(例如含有细菌复制起点的细菌载体和哺乳动物游离型载体)。其它的载体(例如非游离型哺乳动物载体)则在进入宿主细胞后整合入宿主细胞基因组，因此跟随宿主基因组进行复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。

此处将此类载体称为“表达载体”。

一般而言，可用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒形式。在本发明中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意在包括此类提供等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)。

本发明的重组表达载体可包括表1中的酶的编码核酸，其形式适于在宿主细胞中进行相应核酸的表达，即重组表达载体包括一个或多个有效连接于待表达核酸序列的调控序列，后者是根据用于表达的宿主细胞选择的。

在重组表达载体中，“有效连接”是指目标核苷酸序列与调控序列的连接能使核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译体系中，或引入载体后的宿主细胞中)。术语“调控序列”包括启动子、抑制物结合位点、活化物结合位点、增强子以及其他表达调控元件(例如，终止子、聚腺苷化信号或其他mRNA二级结构元件)。此类调控序列的描述，见于如Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中。调控序列包括那些指导多种宿主细胞类型中核苷酸序列的组成型表达的序列，以及那些仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的序列。优选的调控序列的实例如启动子，例如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp-或e-PL，优选用于细菌中。其他调控序列如酵母和真菌来源的启动子，如ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH；植物启动子如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素启动子或菜豆蛋白启动子。也可以使用人工启动子。本领域普通技术人员认识到，表达载体的设计取决于所选择的待转化宿主细胞、所需蛋白质表达水平等因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由表1中酶的编码核酸所编码的蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽。

可设计本发明的重组表达载体，在原核或真核细胞中表达表1中的酶。例如，可将表1中酶的基因表达于细菌细胞如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、酵母或其他真菌细胞(见Romanos，M.A.等人(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.等人(1991)的More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet & L.L.Lasure编辑，396-428页：Academic Press：San Diego；以及van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)的Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.E.等人编辑，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge)、海藻和多细胞植物细胞(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)Plant Cell Rep.：583-586)。合适宿主细胞的进一步探讨可见于Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。或者可以在体外转录和翻译重组的表达载体，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

最常利用含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子，在原核生物中表达蛋白质。

融合载体中在其内编码的蛋白质上添加了若干氨基酸，通常添加于重组蛋白的氨基端，但也可添加于C-末端或融合于蛋白质中的合适位置。此类融合载体一般行使以下三种功能：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；以及3)作为亲和纯化的配体协助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解裂解位点，以使重组蛋白在融合蛋白质纯化后与融合部分分离。此类酶及其同源识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶

典型的融合表达载体包括与谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A分别融合的pGEX(法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech Inc)；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，Beverly，MA)和pRIT5(法玛西亚(Pharmacia)，Piscataway，NJ)。

合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括，pTrc(Amann等人，(1988)Gene 69：301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-Bl、egtll、pBdCl和pET lld(Studier等人，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)60-89；及Pouwels等人编辑，(1985)CloningVectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。pTrc载体中靶基因的表达取决于杂交trp-lac融合启动子指导下的宿主RNA聚合酶转录。pET lld载体中靶基因的表达取决于共表达病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的T7gn1O-lac融合启动子转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)中含有T7gn1基因的X原噬菌体提供，所述基因受lacUV5启动子的转录调控。为转化其他类细菌，可选用合适的载体。例如，已知质粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361均可用于转化链霉菌，而质粒pUB110、pC194或pBD214适用于杆菌的转化。数种可用于将遗传信息转移入棒杆菌的质粒包括pHM1519、pBLl、pSA77或pAJ667(Pouwels等人编辑.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。

最大化重组蛋白表达的策略之一为，在蛋白水解裂解重组蛋白能力受损的宿主细菌中表达蛋白质(Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，从而使每一氨基酸的个体密码子均为选用于表达的细菌中，如谷氨酸棒杆菌中优选使用的密码子(Wada等人.(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。可通过标准DNA合成技术实施此类对本发明核酸序列的改变。

合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭质粒可见于Eikmanns等人(Gene.(1991)102，93-8)。

在另一实施方案中，蛋白质表达载体为酵母表达载体。在酵母如酿酒酵母中表达用的载体实例包括pYepSec1(Baldari等人，(1987)Embo J.6：229-234)、2i、pAG-1、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene54：113-123)和pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation)，San Diego，CA)。载体及构建适用于其他真菌(如丝状真菌)的载体的方法，包括由vanden Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)详细描述的AppliedMolecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等人编辑，1-28页，CambridgeUniversity Press：Cambridge；以及Pouwels等人编辑，(1985)CloningVectors.Elsevier：New York(IBSN 0 444 904018)。

本发明中的有效连接是指启动子、编码序列、终止子以及任选其他调控元件的顺序排列方式，从而使每一调控元件根据其定义均能在表达编码序列时实现其功能。

在另一实施方案中，可在单细胞植物细胞(例如藻类)或较高等植物(如种子植物如作物)的植物细胞中表达表1中蛋白质。植物表达载体的实例包括详细描述于Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)Plant Mol.Biol.20：1195-1197中；以及Bevan，M.W.(1984)Nucl.Acid.Res.12：8711-8721中的，包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51(Pouwels等人编辑，(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0444 904018)。

其他在原核及真核细胞中均适用的表达体系，可见Sambrook，J.等人.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第3版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003中第16和17章。

本发明中的有效连接是指启动子、编码序列、终止子以及任选其他调控元件的顺序排列的方式，从而使每一调控元件根据其定义均能在表达编码序列时实现其功能。

在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够优选在特定细胞类型中指导核酸表达，例如在植物细胞中(如组织特异性调控元件用于表达核酸)。组织特异性调控元件为本领域已知。

本发明的另一方面涉及插入本发明重组表达载体的生物或宿主细胞。此处术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”可互换使用。应当理解此类术语不仅指特定的个体细胞，也包括此类细胞的子代或可能的子代。由于在连续传代中因为突变或环境影响可能会发生某些改变，这些子代实际上可能与其亲代细胞并不相同，但仍包括在此处所用的术语范围内。

宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，可在细菌细胞如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或植物中表达表1中酶。本领域普通技术人员知道其他合适的宿主细胞。

可通过常规转化或转染技术向原核或真核细胞内引入载体DNA。此处所用的术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”是指将外源核酸(例如线性DNA或RNA(如线性化载体或无载体的基因构建体)或载体形式的核酸(如质粒、噬菌体、噬粒、转座子或其他DNA))引入宿主细胞的一系列领域内公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质体转染、天然感受态、化学介导转移或电穿孔法。转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003)，及其他试验手册。

为鉴定并选择这些整合体，通常与目的基因一并向宿主细胞中引入编码选择标记(例如对抗生素的抗性)的基因。优选的可选择标记包括，可赋予药物(如G418、潮霉素及甲氨蝶呤)抗性者。可利用编码表1中酶的相同载体将编码选择标记的核酸引入宿主细胞，也可使用独立的载体引入。通过药物选择可鉴定由引入的核酸稳定转染的细胞(例如，掺入选择标记基因的细胞存活，而其他细胞死亡)。

在另一实施方案中，可产生含有选择体系的重组微生物，所述选择体系能实现引入基因的调控表达。例如，将表1中基因置于载体中lac操纵子的调控下，能使基因仅当IPTG存在时表达。此类调控体系为本领域熟知。

在一个实施方案中，该方法包括在合适培养基中培养本发明的生物以产生甲硫氨酸，所述生物中引入编码如表1中酶的重组表达载体，或向其基因组中引入编码野生型或改变酶的基因。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离甲硫氨酸。

以上已经说明为调节生物的代谢通量，可以增加或减少表1中催化代谢网络中反应的酶的量和/或活性。然而，为修饰生物的代谢通量以得到甲硫氨酸合成更有效的生物，改变量和/或活性的酶并不限于表1中列出的酶。对于与表1中酶同源且可在另一生物中实施相同功能的任意酶，均可调整其量和/或活性以通过过量表达而影响代谢通量。同源性和同一性的定义如上所述。

下表中给出了与表1内R1至R61中某些酶同源的实例，可以通过其在谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌中的过量表达来增加相应酶的量和/或活性，用于本发明目的：

表2

基因产物名称(EC编码)	功能	登录号	相关/替代蛋白质、活性保留蛋白质的序列登陆号
基因产物名称(EC编码)	功能	登录号	相关/替代蛋白质、活性保留蛋白质的序列登陆号	甘氨酸裂解体系(R71/R72)	甘氨酸的恢复：T-蛋白、氨基甲酰转移酶	CAA52144.1	YP_079782.1；NP_980596.1；YP_021091.1；AA11139.1；YP_148276.1；YP_175989.1；BAB06533.1；NP_464875.1；NP_470723.1；YP_013965.1；ZP_00231385.1；ZP_00538577.1；NP_692823.1；NP_764775.1；YP_188676.1；NP_372059.1；CAG43268.1；YP_253296.1；YP_186433.1；YP_041008.1；NP_621985.1；ZP_00560257.1；AAU84894.1；ZP_00574838.1；YP_075748.1；NP_143816.1；CAB50682.1；NP_662997.1；NP_972230.1；AAL82124.1；ZP_00590815.1；ZP_00528533.1；BAD85568.1；NP_228029.1；ZP_00511104.1；ZP_00591209.1；ZP_00532593.1；ZP_00525162.1；ZP_00355911.1；YP_112880.1；ZP_00399764.1；YP_143792.1；CAD75448.1；YP_004126.1；ZP_00535960.1；ZP_00334892.1；CAG35027.1；CAF23008.1；YP_010643.1；NP_951437.1；NP_840694.1；EAN28088.1；YP_125490.1；YP_094168.1；AAO91208.1；YP_122478.1；NP_110817.1；NP_214308.1；CAC12478.1；ZP_00602311.1；YP_256007.1；EAM94548.1；BAB66249.1；NP_342409.1；YP_023949.1；ZP_00054699.1；AAK25314.1；ZP_00270640.1；YP_169455.1；NP_148400.1；ZP_00577149.1；ZP_00375766.1；ZP_00303628.1；NP_280387.1；AAV46419.1；EAO04791.1；CAC32302.1；CAI36361.1；AAZ12256.1；NP_013914.1；YP_034020.1；BAC74698.1；Q827D7；ZP_00396527.1；EAK92665.1；EAK92694.1；ZP_00292858.1；ZP_00625542.1；NP_298674.1；EAO14274.1；NP_883104.1；NP_887405.1；ZP_00038971.2；NP_778843.1；ZP_00327636.1；EAA72140.1；NP_879086.1；NP_102591.1；CAJ04455.1；CAG61762.1；NP_716412.1；CAG88846.1；ZP_00582521.1；CAD17083.1；AAM36086.1；YP_191522.1；EAM75690.1；CAH00726.1；CAF26479.1；AAF11360.1；YP_202186.1；ZP_00308932.1；EAA47849.1；ZP_00278041.1；CAA81076.1；CAA91000.1；CAA85353.1；EAM85167.1；YP_071681.1；ZP_00638529.1；CAB16911.1；EAN06353.1；BAD35509.1；EAL84525.1；YP_118701.1；AAQ24377.1；YP_223286.1；NP_541539.1；ZP_00634544.1；CAB16916.1；BAD82264.1；AAN47559.1；NP_772393.1；YP_000299.1；CAB16918.1；CAD52982.1；XP_314216.2；NP_930808.1；AAD56281.1；AAQ66378.1；AAO76254.1；AAN33907.1；CAG73659.1；XP_219785.3；ZP_00111607.1；ZP_00585062.1；AAL21928.1；AAH42245.1；AAX66900.1；AAS46734.1；NP_949187.1；NP_989653.1；AAC31228.1；；AAA63798.1；ZP_00004510.1；CAA42443.1；ZP_00555139.1；YP_13299

5.1；NP_251135.1；NP_636487.1；ZP_00213263.1；ZP_00140178.2；ZP_00516950.1AAB82711.1；AAZ27773.1；EAA61388.1；ZP_00167208.2；EAN04068.1；AAO07159.1；NP_936747.1；ZP_00499479.1；NP_806663.1；AAW42121.1；CAG83849.1；NP_923192.1；NP_441838.1；ZP_00593912.1；CAA52146.1；BAA14286.1；Q8XD33；AAA69071.1；EAM28058.1；ZP_00494650.1；ZP_00489316.1；ZP_00470629.1；YP_152074.1；AAM14125.1；AAM91322.1；ZP_00569907.1；ZP_00459442.1；NP_755358.1；ZP_00436271.1；NP_613061.1；CAE59244.1；BAC38022.1；CAA91099.1；ZP_00264533.1；AAC46780.1；AAG58030.1；YP_261725.1；AAL24244.1；NP_708666.1；CAH07776.1；Q8YNF9；YP_099306.1；ZP_00474391.1；AAL57651.1；YP_055456.1；NP_682393.1；NP_893785.1；YP_172756.1；CAH74116.1；ZP_00622638.1；YP_234188.1；NP_791106.1；NP_967658.1；EAN85656.1；ZP_00379711.1；XP_520482.1；AAN66613.1；ZP_00162707.1；ZP_00417692.1；YP_264083.1；AAQ61092.1；NP_216348.1；NP_855515.1；CAE76410.1；AAO39460.1；CAE22343.1；NP_800311.1；YP_206661.1；ZP_00506636.1；ZP_00417032.1；YP_164890.1；XP_760322.1；YP_266091.1；YP_156473.1；CAC46126.1；ZP_00244924.1；EAN91112.1；XP_637330.1；NP_960479.1；YP_160522.1；ZP_00317484.1；ZP_00412767.1；NP_253900.1；AAQ00873.1；NP_532152.1；ZP_00151464.1；EAO09970.1；ZP_00631036.1；ZP_00141690.2；NP_302381.1；CAG08109.1；CAE08889.1；YP_263017.1；AAN70757.1；ZP_00264788.1；XP_538655.1；AAZ27305.1；AAN17423.1；AAO38610.1；CAB85154.1；AAW89976.1；AAO44232.1；NP_789087.1；ZP_00496567.1；AAH57478.1；AAS16361.1；AAL33595.1；ZP_00048418.1；CAA72255.1；XP_598207.1；BAD82265.1；AAK26613.1；AAM93931.1；XP_517277.1；CAB50683.1；NP_143817.1；AAL82123.1；BAD82266.1；EAN80863.1；BAD85569.1；ZP_00574837.1；BAB26854.1；ZP_00560256.1；AAU84893.1；AAD33990.1；YP_175990.1；ZP_00641578.1；NP_390336.1；YP_023948.1；AAK25315.1；CAA38252.1；EAM94547.1；ZP_00530977.1；YP_013964.1；NP_470722.1；NP_464874.1；ZP_00525161.1；NP_148401.1；ZP_00589915.1；YP_079783.1；ZP_00233535.1；ZP_00577150.1；NP_228028.1；ZP_00238490.1；NP_980597.1；YP_021092.1；AAP11140.1；YP_038289.1；BAB06534.1；ZP_00399763.1；YP_148277.1；XP_606427.1；AAL04442.1；YP_075749.1；ZP_00527784.1；NP_692824.1；ZP_00334895.1；CAD75449.1；NP_840693.1；ZP_00591425.1；CAF23007.1；ZP_00054162.1；NP_621986.1；CAC12479.1；NP_662508.1；ZP_00512041.1；AAV46420.1

			；ZP_00375765.1；NP_110816.1；NP_280388.1；BAB66248.1；ZP_00538578.1；NP_951436.1；ZP_00367500.1；YP_169454.1；AAX77943.1；YP_094170.1；YP_122480.1；YP_125492.1；；ZP_00270641.1；YP_178313.1；XP_473181.1；ZP_00535961.1；NP_372060.1；ZP_00602310.1；YP_255986.1；CAE05443.2；CAB72709.1；CAG43269.1；NP_342410.1；BAB95353.1；AAA92036.1；YP_186434.1；YP_041009.1；AAM63785.1；XP_584346.1；AAM51302.1；AAF99780.1；ZP_00563258.1；EAN09988.1；NP_148290.1；YP_253295.1；ZP_00627278.1；YP_256008.1；AAO91209.1；XP_655257.1；ZP_00303629.1；CAC11669.1；NP_394004.1；EAM93962.1；CAB57769.1；CAB50124.1；ZP_00520055.1；ZP_00369709.1；EAN28089.1；CAC12627.1；AAB85605.1；Q9HI38；AAH26135.1；EAM24571.1；AAC03768.1；AAP98645.1；CAJ18422.1；NP_213757.1；CAA05909.1；NP_142859.1；BAD32415.1；BAC31437.1；NP_947805.1；YP_080623.1；CAH93356.1；ZP_00600159.1；NP_775139.1；ZP_00400734.1；CAA09590.2；XP_321361.2；AAL81283.1；BAB81491.1；ZP_00506445.1；ZP_00533640.1；YP_160688.1；NP_764776.1；NP_967201.1；AAH52991.1；AAO38289.1；NP_837365.1；XP_521504.1；NP_371248.1；NP_753970.1；CAG42465.1；AAC74750.1；AAU93791.1；Q7ADI4；1KMK；1JF9；BAA86566.1；YP_170184.1；YP_165179.1；NP_624289.1；AAX77932.1；CAD14721.1；BAD84717.1；ZP_00048472.2；AAF73526.1；XP_641773.1；ZP_00570672.1；ZP_00400089.1；NP_391148.1；NP_001007947.1；CAE08806.1；CAB50330.1；YP_192068.1；ZP_00152262.1；ZP_00502920.1；YP_096188.1；NP_796975.1；YP_254084.1；YP_124440.1；BAD86003.1；CAH04407.1；BAB07188.1；Q9K7A0；XP_313472.2；NP_103175.1；AAF63783.1；AAN58019.1；YP_127437.1；AAM62682.1；CAG90500.1；AAB85857.1；ZP_00387883.1；XP_562557.1；O27433；ZP_00170920.2；CAA63066.1；EAN08419.1；CAB73027.1；ZP_00335679.1；AAB85866.1；ZP_00129032.1；YP_178855.1；YP_145876.1；AAV94639.1；NP_623991.1；YP_040300.1；YP_040204.1；YP_080545.1；YP_253952.1；ZP_00638523.1；NP_371368.1；YP_255707.1；AAU38404.1；NP_085678.1；AAK68403.2；BAB66416.1；XP_624944.1；ZP_00135005.2；ZP_00595047.1；NP_950100.1；ZP_00458730.1；AAQ75173.1；AAP99129.1；YP_004062.1；XP_601722.1；CAC45089.1；CAA07007.1；EAL01528.1；XP_694140.1；NP_770978.1；AAC49935.1；EAA21518.1
				甘氨酸裂解体系(R71/R72)	甘氨酸的恢复：H-蛋白	Q8FE66	NP_391159；YP_152075.1；NP_806664.1；NP_755359.1；Q

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				葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(R3)	为生物化学还原提供还原当量，例如硫酸盐还原为硫化物或亚甲基四氢叶酸到甲基THF	BAB98969	NP_738306.1；NP_939657.1；CAI37158.1；YP_119787.1；NP_215963.1；NP_960110.1；BAC74024.1；EAM76742.1；CAB50762.1；；BAC69479.1；；CAE53636.1；YP_062112.1；；ZP_00294054.1；ZP_00658920.1；ZP_00413483.1；CAA19940.1；；NP_695641.1；；ZP_00120909.1；YP_056264.1；；ZP_00569429.1；ZP_00548313.1；ZP_00600254.1；ZP_00357971.1；CAD28141.1；NP_926124.1；；AAO44440.1；；ZP_00395318.1；YP_172478.1；；ZP_00121962.1；NP_681330.1；；ZP_00326212.1；NP_440771.1；；P29686；AAF11158.1；；ZP_00516458.1；ZP_00519749.1；ZP_00536369.1；P48848；CAF23545.1；；AAP98177.1；；P48992；；ZP_00160727.1；AAA98853.1；AAF73556.1；；NP_924116.1；；AAB41225.1；NP_893191.1；；NP_622656.1；；ZP_00623650.1；CAE21277.1；；AAQ00169.1；；CAE07265.1；；AAU36623.1；；YP_219937.1；；ZP_00399101.1；NP_639332.1；；EAN05140.1；NP_228961.1；；P77809；ZP_00135250.2；AAN03818.1；AAP05283.1；；AAM38916.1；；ZP_00574687.1；NP_948974.1；；YP_199106.1；；ZP_00131780.2；ZP_00123638.1；NP_773400.1；；YP_129655.1；；YP_236060.1；；AAK03633.1；；AAP95731.1；；CAD72806.1；；NP_792913.1；；YP_223238.1；；NP_541491.1；；AAX87606.1；；NP_531301.1；；AAN33959.1；；AAK86411.1；；NP_438715.1；；ZP_00156377.2；ZP_00265291.1；ZP_00416738.1；CAC45276.1；；AAN69632.1；；AAD12043.1；AAC65465.1；；ZP_00128741.1；YP_260249.1；；AAO76328.1；；AAN70916.1；；YP_014595.1；；NP_471419.1；；CAG75379.1；；YP_115360.1；；NP_840485.1；；CAH07618.1；；NP_219689.1；；YP_070566.1；；NP_465502.1；；NP_798089.1；；AAQ57824.1；；NP_107009.1；；ZP_00596515.1；ZP_00278393.1；NP_669553.1；；CAA52858.1；CAC90878.1；；NP_754157.1；；AAG56842.1；；YP_150270.1；；NP_929382.1；；AAX65797.1；；NP_934398.1；；

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				转酮酶(R8)	戊糖磷酸通路，为生物化学还原提供还原当量，如硫酸盐还原为硫化物或亚甲基四氢叶酸还原为甲基THF	YP_225858	NP_738304.1；NP_939655.1；CAI37156.1；YP_119785.1；NP_960112.1；NP_301494.1；NP_855136.1；AAK45759.1；NP_215965.1；ZP_00381421.1；ZP_00413480.1；YP_062115.1；EAM76740.1；ZP_00294057.1；CAB50760.1；BAC74026.1；BAC69477.1；CAA19942.1；AAG12171.2；YP_056980.1；NP_789362.1；AAO44437.1；NP_695899.1；YP_147185.1；AAP10611.1；ZP_00239892.1；NP_980015.1；YP_013921.1；NP_464830.1；NP_470679.1；YP_037757.1；ZP_00234507.1；YP_020383.1；YP_084972.1；Q9KAD7；NP_692593.1；NP_621887.1；ZP_00106110.1；YP_171693.1；ZP_00539439.1；ZP_00396639.1；ZP_00393910.1；AAR39402.1；YP_143374.1；YP_079202.1；YP_005865.1；NP_371866.1；YP_175660.1；YP_040758.1；NP_440630.1；CAA75777.1；ZP_00163127.2；YP_192099.1；NP_389672.1；ZP_00464976.1；BAD08582.1BAB75043.1；NP_979711.1；EAN28966.1；ZP_00590971.1；YP_253480.1；；CAD77853.1；CAA90427.1；YP_037488.1；YP_181386.1；ZP_00235565.1；YP_084669.1；XP_476303.1；ZP_00282112.1；AAN65341.1；1ITZ；ZP_00231883.1；AAK78920.1；YP_020067.1；CAA86609.1；CAA86608.1；NP_662747.1；NP_925243.1；NP_734737.1；YP_188491.1；AAO35896.1；NP_764580.1；NP_937158.1；AAM91794.1；AAK79316.1；XP_471447.1；ZP_00328100.1；AAO29950.1；AAO07501.1；NP_687313.1；AAM62766.1；NP_935655.1；NP_682660.1；AAD10219.1；NP_670609.1；CAE06656.1；NP_801666.1；AAK34434.1；YP_203823.1；NP_566041.2；AAL98225.1；YP_071699.1；NP_954463.1；NP_800691.1；YP_075950.1；YP_060741.1；CAE22131.1；NP_214208.1；AAF11802.1；NP_893727.1；ZP_00527389.1；AAO09963.1；CAB82679.1；AAF93646.1；AAF96525.1；YP

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			63244.1；AAQ20076.1；AAU95206.1；CAB60654.1；CAA13585.1；ZP_00405277.1；ZP_00510627.1；ZP_00374310.1；AAK63246.1；ZP_00574965.1；AAL94500.1；CAC11757.1；YP_076140.1；ZP_00534343.1；NP_228762.1；EAN81253.1；NP_953961.1；AAK17116.1；XP651839.1；AAN50417.1；YP_077731.1；YP_090144.1；ZP_00207814.1；NP_247665.1；ZP_00559948.1；NP_346546.1；XP_734906.1；BAB80002.1；NP_111187.1；ZP_00403604.1；NP_687234.1；CAB71601.1；YP_023469.1；NP_532581.1；NP_988235.1；AAX66248.1；CAB71607.1；CAB71595.1；CAB71613.1；CAB39235.1
				葡萄糖-6-P脱氢酶亚基opcA(R3)	为生物化学还原提供还原当量，如硫酸盐还原为硫化物或亚甲基四氢叶酸还原为甲基THF	YP_225861	CAF21585.1；NP_738307.1；NP_939658.1；CAI37159.1；YP_119788.1；EAM76743.1；NP_855133.1；；NP_215962.1；；ZP_00413484.1；YP_062111.1；；NP_960109.1；；ZP_00294053.1；BAC74023.1；；BAC69480.1；；CAA19939.1；；CAB50763.1；；ZP_00120910.2；NP_695642.1；；ZP_00658921.1；YP_056265.1；；ZP_00548312.1；ZP_00569428.1；NP_301492.1；；ZP_00357972.1；CAF23544.1；；ZP_00519748.1；NP_926125.1；；ZP_00326213.1；ZP_00395319.1；P48971；ZP_00112207.2；AAF11159.1；；YP_172479.1；；Q54709；ZP_00328805.1；ZP_00160728.2；NP_441088.1；；BAB75717.1；；CAE07264.1；；CAE21278.1；；AAQ00170.1；ZP_00516459.1
6-磷酸葡萄糖酸内酯脱氢酶(R5)	为生物化学还原提供还原当量，如硫酸盐还原为硫化物或亚甲基四氢叶酸还原为甲基THF	BAB98845	NP_939570.1；NP_738198.1；CAI37076.1；YP_117384.1；AAK46163.1；YP_177848.1；NP_960491.1；NP_302377.1；CAA15451.1；BAC74960.1；CAC44325.1；NP_695644.1；YP_062600.1；ZP_00120912.2；ZP_00412831.1；EAM73768.1；NP_855527.1NP_691106.1；YP_148197.1；ZP_00283191.1；NP_470749.1；YP_079721.1；NP_464901.1；CAG74354.1；NP_928851.1；YP_056324.1；NP_390267.2；YP_070081.1；NP_669932.1；ZP_00212780.1；ZP_00424035.1；ZP_00462313.1；YP_016771.1；YP_111755.1；AAO44589.1；NP_992794.1；YP_034514.1；ZP_00390566.1；ZP_00236407.1；ZP_00232091.1；YP_081773.1；ZP_00494517.1；EAN09346.1；ZP_00502057.1；ZP_00403921.1；NP_344902.1；ZP_00111860.1；NP_814782.1；AAL67561.1；AAA24492.1；AAG35235.1；AAG35224.1；AAG57088.1；BAB76974.1；AAG35219.1；AAA24490.1；ZP_00163835.2；ZP_00158100.1；AAA24208.1；AAO37703.1；YP_175422.1；AAV74553.1；AAV27335.1；AAA24494.1；AAA23918.1；AAC75090.1；AAG35218.1；；AAA24207.1；YP_172170.1；AAA24495.1；AAA24493.1；AAG35221.1；AAA24209.1；NP_707923.1；AAG35223.1；AAA24489.1；P4157	葡萄糖-6-P脱氢酶亚基opcA(R3)	为生物化学还原提供还原当量，如硫酸盐还原为硫化物或亚甲基四氢叶酸还原为甲基THF	YP_225861

6；AAD50492.1；AAV34527.1；AAL20985.1；AAA24206.1；BAA28321.1；AAV74381.1；AAX65997.1；NP_804634.1；AAA24488.1；YP_150095.1；P37754；AAD46733.1；BAA77736.1；NP_372035.1；P21577；YP_040985.1；ZP_00384155.1；ZP_00379330.1；YP_253321.1；NP_924063.1；NP_764747.1；NP_266778.1；ZP_00323177.1；NP_681366.1；P96789；ZP_00315559.1；AAC43775.1；P41582；AAC43777.1；AAC43778.1；AAC43807.1；AAC43817.1；P41580；AAC43818.1；AAC43805.1；AAC43793.1；ZP_00326299.1；P41579；AAC43782.1；AAC43811.1；AAC43808.1；AAC43800.1；AAC43798.1；AAC43795.1；NP_785144.1；AAC43806.1；AAC43804.1；AAC43781.1；CAD72844.1；AAC43813.1；AAC43809.1；AAC43803.1；AAC43787.1；P41578；P41574；AAC43786.1；P41581；AAC43797.1；AAC43788.1；AAC43834.1；AAC43810.1；AAC43785.1；AAC43784.1；AAC43812.1；P41577；AAS99175.1；P41575；AAC43799.1；AAC43913.1；AAC43906.1；AAC43828.1；P41583；AAC43794.1；AAC43825.1；AAL76323.1；AAC43902.1；AAC43832.1；AAC43923.1；AAC43916.1；AAC43914.1；AAC43912.1；AAC43911.1；AAC43907.1；AAC43905.1；AAC43824.1；CAA41555.1；AAC43918.1；AAL27335.1；AAC43920.1；AAC43901.1；AAC43831.1；AAC43904.1；AAW29822.1；AAC43908.1；AAC43829.1；AAC43919.1；AAC43910.1；XP_342980.2；YP_114383.1；AAC43830.1；ZP_00319235.1；Q9DCD0；AAH59958.1；AAA74174.1；AAH11329.1；AAA74166.1；AAC43921.1；AAC43915.1；YP_081362.1；CAG32303.1；ZP_00564543.1；NP_694109.1；AAA74172.1；AAA74152.1；AAA74154.1；AAA74149.1；AAA74163.1；AAA74146.1；AAR24280.1；AAA74159.1；CAI95751.1；AAP88742.1；AAL27345.1；AAA74162.1；AAA74157.1；AAA74147.1；AAA27330.1；AAA74173.1；AAA74143.1；AAA74169.1；NP_391888.1；AAA74144.1；P52207；AAA74167.1；AAA74164.1；AAA74158.1；NP_442035.1；AAL76320.1；AAA75302.1；AAA74171.1；ZP_00516323.1；AAL27356.1；AAR97968.1；AAA74145.1；CAF23041.1；CAA42751.1；AAA74151.1；2PGD；ZP_00062611.2；AAA74156.1；YP_129657.1；ZP_00539485.1；AAK51690.1；AAA74161.1；AAA74150.1；AAK64376.1；AAA74168.1；AAA74175.1；AAA74165.1；XP_758724.1；AAA74170.1；AAA74155.1；AAA74160.1；CAG07546.1；AAA74153.1；AAQ13889.1；NP_910282.1；AAO32456.1；AAH44196.1；CAA76734.1；AAF40494.1；AAP92648.1；AAQ13881.1；CAE46650.1；NP_998717.1；AAO42814.1；AAM64891.1；EAL03585.1；O13287；CAA94380.1；AAK49897.1；AAQ13887.1；AAP33506.2；CAH02996.1；XP_625090.1；A

			AA74142.1；NP_798087.1；CAG62903.1；NP_012053.1；AAO11029.1；AAQ13885.1；NP_934400.1；AAO19944.1；AAO19943.1；AAM78095.1；AAL76326.1；AAQ13883.1；AAH95571.1；ZP_00524274.1；AAQ13879.1；CAG86870.1；CAG83189.1；AAC27703.1；NP_239940.1；；CAB61332.1；AAO19942.1；AAO19941.1；ZP_00123635.1；CAB83570.1；AAO19934.1；AAQ13880.1；ZP_00131777.2；ZP_00135245.2；AAQ13888.1；AAQ13882.1；EAL18227.1；NP_011772.1；BAD98151.1；NP_438711.1；AAO32396.1；EAA48517.1；NP_777731.1；AAO32497.1；AAU36620.1；AAM61057.1；AAX87602.1；AAQ13878.1；CAE70848.1；BAD36766.1；EAL88658.1；AAS53500.1；XP_330536.1；ZP_00156373.2；XP_313091.2；AAF96795.1；CAE53864.1；AAB41553.1；CAA22536.1；AAC27702.1；YP_206428.1；BAC06328.1；EAA59263.1；EAL31500.1；AAP95728.1；CAB10974.1；AAQ13886.1；P70718；AAF45732.1；；AAK03638.1；AAC65319.1；EAA67653.1；AAR25841.1；ZP_00152366.1；AAB29396.1；EAN05374.1；P41573；YP_219832.1；CAD80254.1；CAD56883.1；CAC46511.1；AAP05178.1；NP_532215.1；AAQ13884.1；NP_104453.1；AAL27320.1；NP_660459.1；AAO36383.1；AAO76329.1；CAH07617.1；YP_099135.1；NP_542102.1；YP_222920.1；AAF39196.1；AAB20377.1；AAC97362.1；NP_878753.1；CAE07634.1；AAP98300.1；NP_892888.1；NP_228248.1；NP_623516.1；NP_219566.1；CAE20740.1；ZP_00580432.1；AAZ25595.1；NP_717509.1；EAA18974.1；YP_194797.1；BAD36765.1；AAP99887.1；XP_550483.1；AAO37720.1；AAL76318.1；AAV34504.1；NP_965830.1；ZP_00586799.1；AAW29924.1；AAW29923.1；ZP_00383992.1
				转醛酶(R9)	为生物化学还原提供还原当量，如硫酸盐还原为硫化物或亚甲基四氢叶酸还原为甲基THF	CAF21583.1	；NP_738305.1；NP_939656.1；CAI37157.1；NP_960111.1；YP_119786.1；NP_215964.1；NP_855135.1；NP_301493.1；ZP_00413481.1；YP_062114.1；；ZP_00294056.1；BAC69478.1；；ZP_00658918.1；BAC74025.1；；CAB50761.1；；CAA19941.1；；EAM76741.1；ZP_00548314.1；ZP_00569430.1；ZP_00120374.1；NP_695898.1；；ZP_00381422.1；AAL15881.1；AAO44438.1；；NP_789361.1；；ZP_00600251.1；BAD88191.1；ZP_00655611.1；AAP83926.1；AAG16981.1；；AAM64693.1；；ZP_00326211.1；YP_192100.1；；XP_463680.1；；BAB75719.1；；ZP_00333934.1；AAA98852.1；P48983；BAD08583.1；ZP_00160726.2；NP_773398.1；；NP_926323.1；；ZP_00623652.1；YP_159671.1；；NP_948972.1；；EAO16453.1；AAW90238.1；；CAB85348.1；；AAQ58240.2；；Q9K139；ZP_00203717.1；ZP_00522015.1；NP_842140.1；；AAT08720.1；AA

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转氢酶pntB(R70)

嘧啶核苷酸的氧化还原转化

NP_334574

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				甲酸盐四氢叶酸连接酶(EC6.3.4.3)甲酰四氢叶酸合成酶(R75)	将甲酸盐代谢为甲酰四氢叶酸	NP_939608	CAI37045.1；YP_253105.1；NP_764963.1；NP_372256.1；YP_041196.1；YP_186615.1；AAP09070.1；NP_978500.1；YP_036267.1；ZP_00392371.1；YP_018748.1；NP_345695.1；ZP_00237595.1；AAK99912.1；ZP_00412295.1；NP_471324.1；ZP_00234496.1；YP_014498.1；ZP_00231031.1；NP_815430.1；YP_194410.1；AAB49329.1；AAN58771.1；ZP_00332949.1；NP_267091.1；YP_139285.1；AAV62384.1；ZP_00389385.1；NP_735535.1；AAM99936.1；NP_623926.1；ZP_00576302.1；BAB82175.1；ZP_00538881.1；ZP_00504427.1；NP_803035.1；YP_0794

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				甲酰四氢叶酸环连接酶(EC6.3.3.2.)(R76)	将甲酰-THF转化为5，10-次甲基-THF	NP_600108	NP_737565.1；ZP_00655917.1；NP_939225.1；BAC71386.1；CAB59679.1；ZP_00292666.1；YP_121170.1；YP_061656.1；ZP_00545597.1；NP_301256.1；NP_959857.1；ZP_00573419.1；CAI37699.1；NP_214187.1；1SOU；YP_075021.1；NP_696710.1；ZP_00412260.1；ZP_00134730.1；EAM72866.1；ZP_00575597.1；AAO89633.1；NP_215507.1；NP_854676.1；AAK45268.1；EAN27919.1；ZP_00552794.1；NP_882562.1；ZP_00326738.1；YP_115170.1；NP_886754.1；NP_881632.1；NP_534225.1；NP_440379.1；ZP_00626722.1；ZP_00600182.1；YP_079816.1；YP_148302.1；ZP_00519228.1；NP_439018.1；AAO44764.1；NP_266325.1；ZP_00323162.1；ZP_00156713.1；ZP_00110015.2；ZP_00471373.1；ZP_00534935.1；ZP_00159040.2；ZP_00171408.2；ZP_00398486.1；YP_190665.1；ZP_00396530.1；YP_009590.1；AAQ66843.1；YP_125990.1；AAR37522.1；YP_270316.1；YP_094629.1；YP_122981.1；AAL00707.1；NP_930816.1；BAB82030.1；ZP_00155857.2；YP_222388.1；ZP_00269658.1；AAX87904.1；AAL51496.1；YP_233427.1；CAG35375.1；AAK79064.1；BAB76524.1；NP_794958.1；AAN70768.1；AAO09973.1；AAO79363.1；ZP_00585069.1；AAN48446.1；ZP_00538598.1；ZP_00417043.1；EAO24395.1；ZP_00638539.1；AAQ58176.1；ZP_00403498.1；YP_144877.1；AAX66908.1；

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				O-乙酰-高丝氨酸巯基化酶O-琥珀酰-高丝氨酸巯基化酶O-乙酰-高丝氨酸甲基-巯基化酶O-琥珀酰-高丝氨酸甲基-巯基化酶(R77)	将甲硫醇转移至O-乙酰-高丝氨酸或O-琥珀酰-高丝氨酸	CAF19359	NP_737289.1；NP_939004.1；CAI37871.1；NP_962391.1；NP_217857.1；YP_119808.1；ZP_00411842.1；ZP_00381377.1；EAM75402.1；YP_062728.1；AAP21657.1；ZP_00547645.1；ZP_00293095.1；ZP_00570235.1；ZP_00570237.1；AAK80727.1；YP_146137.1；ZP_00504479.1；NP_464123.1；NP_469947.1；YP_013229.1；YP_173935.1；BAB06322.1；NP_623710.1；AAO77494.1；ZP_00388850.1；AAV62566.1；YP_076611.1；ZP_00526270.1；NP_693970.1；YP_098691.1；AAP51117.1；CAH07057.1；YP_252508.1；YP_001801.1；NP_785969.1；AAN49261.1；ZP_00656265.1；NP_696109.1；NP_266229.1；ZP_00382492.1；AAP21659.1；ZP_00319952.1；AAN58864.1；CAA71732.1；ZP_00064071.1；ZP_00358038.1；ZP_00499571.1；ZP_00576077.1；EAM27331.1；YP_133082.1；ZP_00629666.1；ZP_00217525.1；NP_887601.1；AAN68137.1；ZP_00107219.1；ZP_00462048.1；NP_253712.1；ZP_00551474.1；ZP_00141499.1；NP_952236.1；ZP_00506665.1；YP_076510.1；ZP_00160457.2；NP_228690.1；YP_242180.1；YP_269261.1；NP_638415.1；NP_797008.1；ZP_00208451.1；AAL76402.1；ZP_00595723.1；ZP_00512971.1；CAE10117.1；ZP_00242385.1；ZP_00536577.1；AAR38305.1；NP_948106.1；ZP_00398593.1；ZP_00654525.1；ZP_00531189.1；NP_946915.1；NP_930734.1；NP_66150

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				丙酮酸激酶(R19)	催化从磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的步骤	YP_226326
甲酰四氢叶酸脱甲酰化酶(R79)	将甲酰THF降解为甲酸盐和四氢叶酸	ADD13491		丙酮酸激酶(R19)	催化从磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的步骤	YP_226326
甲酰四氢叶酸脱甲酰化酶(R79)	将甲酰THF降解为甲酸盐和四氢叶酸	ADD13491		磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(GTP)(R35)	将草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸	NP_602055

大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的培养-培养基及培养条件

本领域技术人员熟悉常见微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的培养。因此，以下给出有关培养谷氨酸棒杆菌的一般性教导。大肠杆菌培养的相关信息可见于其标准教科书。

大肠杆菌菌株常规分别生长于MB和LB肉汤中(Follettie，M.T.，Peoples，0.，Agoropoulou，C.和Sinskey，A J.(1993)J.Bacteriol.175，4096-4103)。大肠杆菌的基本培养基为分别为M9和改良的MCGC(Yoshihama，M.，Higashiro，K.，Rao，E.A.，Akedo，M.，Shanabruch，W G.，Follettie，M.T.，Walker，G.C.，和Sinskey，A.J.(1985)J.Bacteriol.162，591-507)。可加入葡萄糖使其终浓度为1％。按以下量添加抗生素(微克每毫升)：氨苄西林，50；卡那霉素，25；萘啶酸，25。按以下量添加氨基酸、维生素及其他添加剂：甲硫氨酸9.3mM；精氨酸，9.3mM；组氨酸，9.3mM；硫胺素，0.05mM。大肠杆菌细胞常规生长于37℃。

一般在合成或天然的生长培养基中培养经遗传修饰的棒杆菌。多种不同的棒杆菌生长培养基为熟知且容易获得的(Lieb等人.(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32：205-210；von der Osten等人.(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；专利号DE 4,120,867；Liebl(1992)″TheGenus Corynebacterium，The Procaryotes第II卷中，Balows，A.等人编辑.Springer-Verlag)。

这些培养基由一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素及微量元素组成。优选的碳源为糖、例如单-、双-或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素均可作为优质碳源。

也可以通过复合化合物如糖蜜或其他糖精制的副产品为培养基供糖。提供不同碳源的混合物可能也是有利的。其他可能的碳源为醇类和有机酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常为有机或无机氮化合物，或含有这些化合物的材料。氮源的实例包括氨气或铵盐，例如NH₄C1或(NH₄)₂SO₄、NH₄OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉类提取物等。

可以使用不同的硫源过量生产甲硫氨酸。可以使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐以及更多的还原的硫源如H₂S和硫化物及衍生物。也可使用有机硫源如甲硫醇、巯基乙酸盐、硫氰酸盐和硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸，以及其他含硫化合物，以有效生产甲硫氨酸。与其他C1源例如甲醇或甲醛等一样，甲酸盐也可作为添加剂。特别适合的是甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚。

培养基中可含有无机盐化合物，包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。可向培养基中添加螯合化合物以使金属离子保持于溶液中。特别有用的螯合化合物包括苯二酚如儿茶酚或原儿茶酸，或有机酸如柠檬酸。一般培养基中也含有其他生长因子，例如维生素或促生长物，后者的实例包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐通常来自复合培养基组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。培养基化合物的确切成分很大程度上取决于随即的试验，视每一特定情况个体而定。有关培养基优化的信息可见于教科书“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach(P.M.Rhodes，P.E.Stanbury编辑，IRL Press(1997)，53-73页，ISBN 0 19 9635773)。也可选择商业出售的生长培养基，如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。

所有培养基成分均需经过灭菌，可通过热(在1.5个大气压、121℃下20分钟)或无菌过滤进行。这些成分可以被一起灭菌，或必要时也可分别进行。

可在生长开始时就具备所有培养基成分，或者任选持续或批量加入。分别定义每一试验的培养条件。

温度范围应处于15℃至45℃间。可以保持温度恒定或在试验过程中改变温度。培养基的pH范围为5至8.5，优选位于7.0左右，可通过向培养基中添加缓冲物维持该pH值。具有此用途的缓冲物实例为磷酸钾缓冲液。可替代或同时使用如MOPS、HEPES、ACES等合成缓冲物。也可以通过在生长过程中添加NaOH或NH₄OH来维持恒定的培养pH。如果使用复合培养基成分如酵母提取物，由于很多复合化合物都具有高度缓冲能力，对于其他缓冲物的需求有所降低。如果使用发酵罐培养微生物，也可使用气体氨来控制pH。

孵育时间的范围通常为数小时至数日。选择该时间以使产物在培养基中积累量为最大。可在多种容器中实施公开的生长试验，如微滴定板、玻璃试管、玻璃烧瓶或大小不等的玻璃或金属发酵罐。为筛选大量克隆，应当在带或不带挡板的微滴定板、玻璃试管或振荡烧瓶中培养微生物。优选使用100ml振荡烧瓶，其中填充10％(体积比)所需的生长培养基。在旋转振荡器上以100-300’rpm的速率范围振荡烧瓶。通过保持湿润的大气以降低蒸发损耗；或者对蒸发损耗进行算术校正。

如果测试经遗传修饰的克隆，同时也应当测试未经修饰的对照克隆或携带不含任何插入的基本质粒的对照克隆。利用琼脂板上生长的细胞接种培养基至OD600为0.5-1.5，所述琼脂板如CM板(10g/l葡萄糖、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、10g/l聚蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l肉提取物、22g/l琼脂，用2M NaOH调整pH 6.8)，其被置于30℃下培养。

通过加入CM板上谷氨酸棒杆菌细胞的盐水悬浮液，或者加入该菌的液态预培养物，来接种培养基。

下面将通过多个实施例对本发明进行说明。然而这些实施例并不在于限制本发明。

实施例

本发明中的实施方案为本公开的实施方案提供了说明，而不在于限制其范围。技术人员已经知道本发明包括许多其他实施方案。本公开中所有引用的出版物和专利，以及登录号或数据库参考号定义的序列均以其整体引用作为参考。如果所引用的材料与本说明矛盾或不一致，则以本说明为准。此处对任意参考的引用并非承认所述参考是先于本公开的技术。

除非另有说明，所有迄今为止用于本说明(包括权利要求书)中的用于表示成分量、细胞培养和处理条件的数字，均应理解为以术语“约”修饰。因此，除非另有与之相反的说明，数字参数均为约数，根据期望通过本发明获得的所需性质而有所不同。

除非另有说明，位于系列单元之前的术语“至少”应理解为针对该系列中的每一单元而言。本领域技术人员仅通过常规试验，就知道或能认识到此处描述的本发明具体实施方案的多种当量。此类当量也包括于以下权利要求中。

A)对甲硫氨酸合成效率增高生物的最优代谢通量的理论预测

构建谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的代谢网络

谷氨酸棒杆菌网络.分别以葡萄糖和硫酸盐为碳源和硫源，建立谷氨酸棒杆菌野生型的基本代谢网络(http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html)。该网络包括通过磷酸转移酶体系(PTS)、糖酵解(EMP)、戊糖磷酸通路(PPP)、三羧酸(TCA)循环、回补和呼吸链进行葡萄糖摄取。硫酸盐的同化包括摄取及随后转化为硫化氢(Schiff(1979)，Ciba Found Symp，72，49-69)。化学计量模型中的硫同化通路可归为2个反应：将硫酸盐还原为亚硫酸盐(需要2ATP和1NADPH)，以及将亚硫酸盐还原为硫化物(需要3NADPH)。完整的模型由59个内部及8个外部代谢物组成。外部代谢物包括底物(葡萄糖、硫酸盐、氨、氧气)和产物(生物量、CO₂、甲硫氨酸、甘氨酸)。由于甘氨酸一旦形成为副产物，就不能被谷氨酸棒杆菌再度利用，故认为其为外部代谢物，(http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html)。总体而言，代谢网络包括62个代谢反应，其中19个是可逆的。为在呼吸链中产生ATP，设定为2(产生NADH)和1(产生FADH)的P/O比(Klapa等人.(2003)Eur.J.Biochem.，27017，3525-3542)。生物量形成所需的前体参考文献(Marx等人.(1996)Biotechnol.Bioeng.，49(2)，111-129)。由生物量中不同氨基酸的含量计算生物量所需的硫酸盐和氨。谷氨酸棒杆菌模型见图1大肠杆菌网络。根据文献(Carlson等人.(2004)，Biotechnol.Bioeng.，851，1-19)和数据库(http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html)构建野生型大肠杆菌的核心代谢的模型。生长和基于葡萄糖和硫酸盐生产甲硫氨酸的模型包括葡萄糖的PTS摄取、EMP、PPP、TCA循环、回补、呼吸链和硫酸盐同化。该代谢网络包括64个代谢反应，其中20个为可逆。葡萄糖、硫酸盐、氨和氧气为外部底物、生物量、CO₂和甲硫氨酸为外部产物。为进行NADH和NADPH间的相互转化，考虑可逆的转氢酶(Yamaguchi等人.(1995)，J.Biol.Chem.，27028，166653-9)。此外，认为大肠杆菌是通过琥珀酰化而不是乙酰化(R40)来活化高丝氨酸的(Sekowska等人.(2000)，J.Mol.Micorbiol.Biotechnol.，22，145-177)。此外使用甘氨酸裂解体系(R71、R72)。为在呼吸链中产生ATP，设定为2(产生NADH)和1(产生FADH)的P/O比(Carlson等人.(2004)，同上)。生物量形成所需的前体参考文献(Edwards等人.(2000)；Weber等人.，(2002))。

网络修饰。修饰上述化学计量网络进行进一步模拟。该修饰包括除去或加入与提高甲硫氨酸产量潜在相关的不同反应和通路。此外，改变碳源和硫源以研究其对甲硫氨酸生产的影响。

代谢通路的分析。利用METATOOL(Pfeiffer等人，(1999)，Bioinformatics，153，251-7，Schuster等人.(1999)Trends Biotechnol.，172，53-60)分析代谢通路。所用的版本(meta4.0.1_double.exe)可获自互联网http://www.biozentrum.uni-wuerzburg.de/bioinformatik/computing/metatool/pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/)。该算法的算术细节描述于Pfeiffer等人(同上)中，在此处引用其作为METATOOL软件使用方法的参考。

代谢通路分析会对每一研究的情形产生数以百计的基本通量模式。对于其中每一通量模式，以底物形式进入体系的碳的百分比计算生物量的碳产量(Y_X/S)和甲硫氨酸的碳产量(Y_Met/S)。整个过程给出的是百分比值((C-摩尔)(C-摩尔底物)^-1×100)。相应的，也考虑共底物如甲酸盐或甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚。对某一网络情形得到的所有基本模式进行比较分析，从而可确定最大理论产量Y_X/S，max和Y_Met/S，max。

结果及模型的推断

对谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌生产甲硫氨酸的对比

两种最有希望用于生物技术生产甲硫氨酸的生物为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。为评价这两种生物的潜能，如上所述实施代谢通路分析。

首先研究野生型网络。如野生型谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌所示，得到了大量生物量碳产量和甲硫氨酸碳产量各异的基本通量模式(图2A、B)。这些得到的模式中，主要是完全产生生物量或甲硫氨酸的极端模式。其在图形的两条轴上被给出。此外也产生了同时产生生物量和甲硫氨酸的通量模式。谷氨酸棒杆菌的最优理论生物量产量为88.5％，因此略低于大肠杆菌的91.7％。两种生物均具有生产甲硫氨酸的高度潜力。谷氨酸棒杆菌的最优甲硫氨酸理论碳产量为48.6％(图2A)。大肠杆菌的值呈现显著更高为56.2％(图2B)。大肠杆菌野生型的潜力更高可能提示其代谢网络具有优势特性。在其他模拟中对该方面进行了研究(见下)。

更近一步的审视集中于两个反应，即甘氨酸裂解体系和转氢酶，两者均有助于增加甲硫氨酸产量。实际上谷氨酸棒杆菌野生型的最优方案伴有甘氨酸的大量形成，所述甘氨酸不能被重复利用；而大肠杆菌野生型的最优甲硫氨酸生产中则无甘氨酸累积。对于每一甲硫氨酸的8个NADPH的高需求，大肠杆菌中转氢酶对NADH和NADPH相互转化的能力也有助于获得较高效率。

为进一步研究这些反应在甲硫氨酸生产中的重要性，实施对基本代谢网络进行不同遗传修饰的进一步模拟(见下)。

最优甲硫氨酸生产条件下谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的代谢通量

首先更细致地研究两种生物的代谢网络，以鉴定可用通路中哪些涉及最优甲硫氨酸生产而哪些是不必要的。为此，计算谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的最优基本模式(即甲硫氨酸理论产量最高的模式)的代谢通量分布。此处所有通量均以相对摩尔值表示，所述相对摩尔值如通常的代谢通量分析一样对葡萄糖摄取率进行校正。注意通量(以摩尔(摩尔)^-1×100给出)与用于描述最优表现的碳产量(以C-摩尔(C-摩尔)^-1×100)不同。此外，将基本模型(图1)中在相应模式中无活性的反应从图3和4中去除。两种生物最优甲硫氨酸生产的通量分布差别显著(图3、4)。

谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸合成最优通量为58.3％。为此，谷氨酸棒杆菌具有高度的PPP活性，通过PPP氧化反应的通量为250％。这可能是由于对NADPH的需求所致，因为甲硫氨酸合成需要提供8个NADPH，主要用于硫还原。进入PPP的通量显著高于葡萄糖的摄取通量。作用于糖异生方向的葡萄糖6-磷酸异构酶，对PPP的碳供应也有显著作用。TCA循环则完全被关闭，因此异柠檬酸盐脱氢酶对NADPH形成并无作用。此外谷氨酸棒杆菌还利用两种重要的代谢循环。第一种循环仅涉及可在高通量时互相转化的2-氧代戊二酸和谷氨酸，以同化氨并将之用于所需的氨化反应。这些为合成甲硫氨酸本身以及合成丝氨酸作为甲基-THF合成的甲基供体，因而经过该循环的通量恰好是甲硫氨酸通量的两倍。另一代谢循环包括丙酮酸、草酰乙酸和苹果酸的集合。其具有两种主要功能：几乎有半数在氧化PPP中丢失的CO₂均通过高活性CO₂固定重新进入代谢网络(125％通量)。此外，该循环涉及的三种酶的组合如转氢酶并完成NADH至NADPH的相互转化(25％通量)起作用。由此谷氨酸棒杆菌能在某种程度上弥补不具转氢酶的缺陷。

大肠杆菌中最优甲硫氨酸生产的甲硫氨酸通量为67.5％。与谷氨酸棒杆菌相反，PPP不具活性，而TCA循环的通量高达近100％。然而，以修饰的方式实施TCA循环。从琥珀酰CoA到琥珀酸的步骤由甲硫氨酸生物合成中产生琥珀酸的相应反应桥接。有意思的是最优甲硫氨酸产生需要乙醛酸旁路的高度活性(31％通量)。最显著的是通过转氢酶从NADH到NADPH的达574％的巨大通量。这突出了该酶在大肠杆菌有效生产甲硫氨酸中的重要性。如上所示，当缺失该酶时，甲硫氨酸的最大理论产量显著下降(图2D)。两种生物中，丙酮酸激酶对于最优甲硫氨酸的产生均非必要。因此，从PEP至丙酮酸的通量基本是由PTS耦联葡萄糖摄取而提供的。显然ATP产生并不需要丙酮酸激酶。该酶的敲除可能是值得关注的靶位，因为它可能会限制经丙酮酸合成的通量从而导致TCA循环的过量代谢物流。

总而言之，两种生物的最优通量分布具有根本的不同。通过对甲硫氨酸合成的基本通量模式分析，可以得到能增高甲硫氨酸合成效率的遗传修饰预测。

遗传修饰对甲硫氨酸生产的潜在改善

为更详细地研究某些关键反应的影响，实施其他改良代谢网络的模拟。向谷氨酸棒杆菌中引入转氢酶导致甲硫氨酸理论产量增加至51.9％(图2C)。而敲除大肠杆菌中的转氢酶显著降低其产生甲硫氨酸的能力(图2D)。这强调了NADH到NADPH活性互换对甲硫氨酸产生的益处。

向谷氨酸棒杆菌中引入甘氨酸裂解体系可使甲硫氨酸最大理论产量增至56.5％(图2E)。与之相似，敲除大肠杆菌中甘氨酸裂解体系或转氢酶使甲硫氨酸最大理论产量减少(图2F、D)。注意转氢酶也会影响生物量最大理论产量。谷氨酸棒杆菌中的插入使Y_X/S，max增加，而大肠杆菌中缺失使其减少。

至于碳产量，所有通量模式均位于三角形空间内，处于起点和生物量形成最大及甲硫氨酸形成最大的两个极端通量模式之间(图2A-F)。此处两种极端模式间的连接体现了最优线，其给出了不同生长方案下甲硫氨酸的最大可能产量。该线上的所有模式及模式的线性组合代表了生产过程的解。真实的生产过程往往总与某些生物量的形成相关。

硫源对甲硫氨酸产生的影响

可清楚鉴定遗传修饰可能的有益影响。实施其他模拟以更进一步增高理论可能的甲硫氨酸合成效率。在这点上，研究替换的营养素的影响。此处硫源可能起到核心作用，以谷氨酸棒杆菌为例显示得到的结果。

常规的硫源为硫酸盐，如上述野生型通路分析中所用。然而，硫酸盐同化有2个ATP和4个NADPH的高需求。尤其是对还原能力的高度需求，提示硫源的还原状态可能是关键点。因此，使用硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化物进行代谢通路分析。为使用硫代硫酸盐，向模型中加入硫代硫酸盐还原酶(Schmidt等人(1984)同上，Heinzinger等人(1995)J.Bacteriol.，177：2813-2820，Fong等人(1993)J.Bacteriol.，175：6368-6371)。该酶能将硫代硫酸盐裂解为亚硫酸盐和硫化物，因此将甲硫氨酸合成中对NADPH的总需求下降约25％。应当注意，就我们所知在谷氨酸棒杆菌中尚未见到消耗硫代硫酸盐中的两个硫原子。另一从进一步还原形式的硫产生硫化物的可能性是所谓的厌氧亚硫酸盐还原酶(Huang等人.(1991)Journal ofBacteriology.173(4)：1544-53)。

显然，硫源是生产方法中与理论碳产量相关的关键点。与硫酸盐相比(图2A)，使用替代的硫源显著提高最优理论产量(图3A、B)。从硫酸盐(48.6％)到硫代硫酸盐(57.8％)，到硫化物(63.4％)的增加，深刻突出在甲硫氨酸生产中使用替代的营养素的高度潜力。此外，它显示了还原力(NADPH)对最优甲硫氨酸生物合成的高度重要性。谷氨酸棒杆菌中NADPH主要在氧化性PPP中产生，有一些则产生于TCA循环中NADP-依赖性的异柠檬酸脱氢酶。生长于硫酸盐时，野生型每合成一摩尔甲硫氨酸，通过直接巯基化需要8摩尔NADPH，通过硫化转化通路合成则需要9摩尔NADPH(Hwang等人(2002)，J.Bacteriol.，1845，1277-86)。硫代硫酸盐网络生产甲硫氨酸需要6摩尔NADPH，因此低25％。消耗硫化物的网络仅为需要硫酸盐的NADPH需求的50％。该NADPH需求每次25％的逐步减少，对应于以硫化物代替硫代硫酸盐时从Y_Met/S，max仅为5.6％到为9.2％的逐步增加。这对于后续方法发展很重要因为硫化物具有高度的毒性和挥发性。

C₁源对甲硫氨酸生产的影响

改善谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸产生的主要靶位之一在于C₁代谢。最优甲硫氨酸生产伴有等摩尔量甘氨酸的累积，通常其不能再利用(图3)。如图所示，可通过引入甘氨酸裂解体系进行弥补(图2E)。另一选择则是除葡萄糖之外使用C₁碳源。此处，研究涉及代谢网络不同延伸分支的甲酸盐。其中包括加入如多种生物中所述(例如杆菌(E.C.6.3.4.3))能催化从甲酸盐、ATP及THF合成10-甲酰-THF的酶。实施其他将10-甲酰-THF转化为甲基-THF的不同步骤。所有反应归为将10-甲酰-THF转化为亚甲基-THF的总反应，同时伴有1个NADPH和1个NADH的氧化。甲酸盐和葡萄糖的联合使用相对于仅使用葡萄糖的情况能使甲硫氨酸最大理论产量增加3.3％。此外，当提供甲酸盐时，不再累积额外的甘氨酸。

组合使用不同硫源和C₁源对甲硫氨酸生产的影响

以上显示了C₁-和硫源在甲硫氨酸的生物技术生产中对于最大化最大理论碳产量至关重要。因此，如果能结合C₁和硫源的益处将很有意义。这些研究涉及硫代硫酸盐和甲酸盐的组合以及硫化物和甲酸盐的组合。硫代硫酸盐和甲酸盐的组合可使最大理论碳产量提高至63.0％(图3D)。该产量仍略低于消耗硫化物的最大理论产量(图3B)。然而，与硫化物相反，甲酸盐和硫代硫酸盐为无毒化学物且很可能降低方法安全性相关的影响。组合使用硫化物和甲酸盐可使Y_Met/S，max增至69.6％。这比仅消耗硫化物的最大理论产量高6.2％。

甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚作为组合的硫和C₁源对甲硫氨酸生产的影响

有趣的是可能提供还原态硫并通过加入甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚解决甘氨酸累积问题。已知谷氨酸棒杆菌能在某些条件下产生甲硫醇(Bonnarme等人(2000)，Appl.Environ.Microbiol.，6612，5514-7)。此处假设它也能消耗甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚。也假设二聚体二甲基二硫醚能被上述生物裂解为甲硫醇，例如但不限于谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。向网络中添加推定的反应，所述反应利用甲硫醇直接甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸。这一新提出的反应绕开同型半胱氨酸且直接产生甲硫氨酸。甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚的应用极大地将甲硫氨酸最大理论产量增至83.3％(图3F)。这显示该底物潜在非常适用于甲硫氨酸的生物技术生产。硫代谢和MTHF形成涉及的通路对于甲硫氨酸生产而言并非必要。大肠杆菌中使用甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚的甲硫氨酸最大理论产量为71.4％，因而远低于谷氨酸棒杆菌。原因在于该生物中甲硫氨酸生产需要琥珀酰-CoA。这需要TCA循环的高度活性，从而伴有通过CO₂的相应碳丢失。相对于谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌中这些条件下的CO₂形成几乎为两倍之高。最终可通过向具有甲硫醇代谢的谷氨酸棒杆菌模型中整合入转氢酶，进一步改善最大理论产量。在这些条件下，谷氨酸棒杆菌能够从甲硫醇及其二聚体二甲基二硫醚以及葡萄糖生产甲硫氨酸，其最大碳产量为85.5％。

因此，上述分析显示具体而言甘氨酸或其他甲基源在甲硫氨酸合成中的用途，为最优化谷氨酸棒杆菌的甲硫氨酸生产提供了重要的潜力。此外，也说明与谷氨酸棒杆菌相比，大肠杆菌中甲硫氨酸的合成更依赖于有活性的转氢酶。

B)用以增加甲硫氨酸合成效率的谷氨酸棒杆菌的遗传修饰

以下试验的目的在于应用上述理论发现的提示，以获得甲硫氨酸合成效率增高的谷氨酸棒杆菌生物。

材料和方法

一般方法的程序可见于Handbook on Corynebacterium glutamicum，(2005)编辑：L.Eggeling，M.Bott.，Boca Raton，CRC Press、见于Martin等人.(Biotechnology(1987)5，137-146)、Guerrero等人(Gene(1994)，138，35-41)、Tsuchiya和Morinaga(Biotechnology(1988)，6，428-430)、Eikmanns等人(Gene(1991)，102，93-98)、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(Biotechnology(1991)，9，84-87、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology(1994)，60，126-132)、LaBarre等人(Journal ofBacteriology(1993)，175，1001-1007)、WO 96/15246、Malumbres等人(Gene(1993)，134，15-24)、见于JP-A-10-229891、见于Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering(1998)，58，191-195)、Makrides(Microbiological Reviews(1996)，60，512-538)以及公认的遗传及分子生物学教科书。

菌株、培养基和质粒

例如，可选取下列菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，

醋谷棒杆菌ATCC 15806，

嗜醋酸棒杆菌ATCC 13870，

嗜热棒杆菌FERM BP-1539，

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965，

黄色短杆菌ATCC 14067，

乳酸发酵短杆菌ATCC 13869，以及

谷氨酸棒杆菌ATCC 14020或自其衍生的菌株如谷氨酸棒杆菌KFCC10065

DSM 17322或

谷氨酸棒杆菌ATCC21608

重组的DNA技术

程序可见于：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.的MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，第1、2、3卷，以及Handbook on Corynebacteriumglutamicum(2005)L.Eggeling，M.Bott.，Boca Raton编辑，CRC Press。

氨基酸及甲硫氨酸中间产物的定量

该分析是利用保护柱及Synergi 4μm柱(MAX-RP

150×4.6mm)(Phenomenex，Aschaffenburg，德国)，实施HPLC(Agilent 1100，Agilent，Waldbronn，德国)而完成。注射前以邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇(2-MCE)为还原剂衍生分析物。此外用碘乙酸封闭巯基。利用40mM NaH₂PO₄(洗脱液A，NaOH调整pH＝7.8)为极性相而甲醇水混合物(100/1)为非极性相(洗脱液B)，以1ml/分钟的流速进行分离。应用下述梯度：起始时0％B；39分钟时39％B；70分钟时64％B；100％B持续3.5分钟；2分钟0％B用以平衡。如下所述自动完成室温下衍生。先用0.5μl含0.5％2-MCE的N，N-(2-羟乙基)甘氨酸溶液(0.5M，pH 8.5)混合0.5μl细胞提取物。然后加入1.5μl含50mg/ml碘乙酸的N，N-(2-羟乙基)甘氨酸溶液(0.5M，pH 8.5)，随后加入2.5μl N，N-(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(0.5M，pH 8.5)。加入0.5μl溶于1/45/54v/v/v的2-MCE/甲醇/N，N-(2-羟乙基)甘氨酸(0.5M，pH 8.5)的10mg/ml OPA试剂，完成衍生。最后用32μl H₂O稀释混合物。在上述每一移液步骤之间均有1分钟等待时间。然后将总体积37.5μl注入柱内。注意，如果在样品制备过程中(例如在等待时间内)或样品制备后定期清洁自动加样针，能显著改善分析结果。利用荧光检测器(激发光340nm，发射光450nm，Agilent，Waldbronn，德国)实施检测。使用α-氨基丁酸(ABA)作为内部标准来定量。

重组操作的定义

以下将描述如何实施上述预测的发现构建甲硫氨酸生产效率增高的谷氨酸棒杆菌菌株。在描述菌株构建之前，给出以下将用到的有关重组事件/过程的定义。

此处所用的“坎贝尔插入(Campbell in)”是指原始宿主细胞的转化株，其中含有通过单次同源重组事件(事件中的杂交)整合入染色体的完整环状双链DNA分子(例如质粒)，从而有效将所述环状DNA分子的线性版本插入染色体的第一DNA序列，后者与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源。“被坎贝尔插入的(Campbelled in)”是指该整合入“坎贝尔插入”转化株染色体的线性DNA序列。“坎贝尔插入”含有第一同源DNA序列的副本，其每一拷贝包括并包围着同源重组交叉点的拷贝。该名称来自首次提出此类重组的Alan Campbell教授。

此处所用的“坎贝尔去除(Campbelled out)”，是指来自“坎贝尔插入”转化株的子代细胞，其中在“被坎贝尔插入的”DNA的线性插入DNA中所含的第二个DNA序列以及染色体来源的第二个DNA序列之间发生了第二次重组事件(杂交去除事件)，所述染色体来源的DNA序列与所述线性插入的第二个DNA序列同源。第二次重组事件产生了整合DNA序列的部分的缺失(删除)，但重要的是也在染色体中保留了部分(可能少至仅一个碱基)整合的“坎贝尔插入”DNA，从而使“坎贝尔去除”细胞相对于起始宿主细胞而言，含有一个或多个染色体人为改变(例如单碱基替代、多碱基替代、插入异源基因或DNA序列、插入另一拷贝或多拷贝的同源基因或经修饰的同源基因，或者插入含有一个以上上述所列实例的DNA序列)。

通常但并非必然，通过对“被坎贝尔插入的”DNA序列的部分(待删除的部分)中所含的基因进行反选择，获得“坎贝尔去除”细胞或菌株；所述基因例如枯草杆菌sacB基因，该基因在约5％至10％蔗糖的存在中生长的细胞内表达具有致死性。无论具有或不具有反选择，都可以利用任意可筛选的表型筛选所需细胞，得到或鉴定需要的“坎贝尔去除”细胞，所述表型例如但不限于菌落形态、菌落颜色、是否具有抗生素抗性、是否存在聚合酶链式反应得到的给定DNA序列、是否存在营养缺陷型、是否存在某种酶、菌落核酸杂交、抗体筛查等。术语“坎贝尔插入”和“坎贝尔去除”也可作为不同时态的动词用以指代上述方法或过程。

已知导致“坎贝尔插入”或“坎贝尔去除”的同源重组事件可发生于同源DNA序列中的一段DNA碱基范围内，且由于该范围内至少有部分的同源序列彼此相同，通常不太可能确定该交换事件究竟发生于何处。换言之，无法精确限定哪些序列来源于插入DNA，而哪些序列来源于染色体DNA。此外，第一同源DNA序列以及第二同源DNA序列间往往由部分非同源的区域分开，也正是该非同源区域在“坎贝尔去除”细胞的染色体中得以保留。

对于实用而言，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一和第二同源DNA序列至少长约200碱基对，最多可长达数千碱基对，但更短或更长的序列也可完成该过程。例如，第一和第二同源序列的长度范围可为约500至2000碱基，而将第一及第二同源序列安排为大致相同的长度，有助于从“坎贝尔插入”获得“坎贝尔去除”，优选其差异小于200碱基对，而最优选两序列中短者的碱基对长度至少为长者的70％。

产甲硫氨酸菌株的构建

实施例1：产甲硫氨酸起始菌株M2014菌株的建立

利用DNA A(也称为pH273)(SEQ ID NO：1)和“被坎贝尔插入的”转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032，得到“坎贝尔插入”菌株。图6为质粒pH273的示意图。然后“经坎贝尔去除(Campbelled out)”该“坎贝尔插入”菌株，得到“坎贝尔去除”菌株M440，其中含有编码具反馈抗性的高丝氨酸脱氢酶基因(hom^fbr)。得到的高丝氨酸脱氢酶蛋白中含有S393到F393的氨基酸改变(称为Hsdh S393F)。

然后用DNA B(也称为pH373)(SEQ ID NO：2)转化菌株M440，得到“坎贝尔插入”菌株。图6为质粒pH373的示意图。然后“坎贝尔插入”该“坎贝尔插入”菌株，得到“坎贝尔去除”菌株M603，其含有编码具反馈抗性的天冬氨酸激酶基因(Ask^fbr)(由lysC编码)。在形成的天冬氨酸激酶蛋白质中，T311变为I311(称为LysC T311I)。

已经发现菌株M603产生约17.4mM赖氨酸，而ATCC13032菌株产生的赖氨酸量低于可检测限。此外，M603菌株产生约0.5mM高丝氨酸，而ATCC13032菌株产生的量则低于检测限，如表3所总结。

表3：ATCC13032和M603菌株的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸产量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	ATCC13032	0.0	0.4	0.0	0.0
M603	0.5	0.7	0.0	17.4	ATCC13032	0.0	0.4	0.0	0.0

用DNA C(也称为pH304，其示意图见图6)(SEQ ID NO：3)转化菌株M603，得到“坎贝尔插入”菌株，随后“经坎贝尔去除”得到“坎贝尔去除”菌株M690。M690菌株中在metH基因上游含有PgroES启动子(称为P₄₉₇metH)。P₄₉₇启动子的序列见SEQ ID NO：11。M690菌株产生约77.2mM赖氨酸和约41.6mM高丝氨酸，如下表4所示。

表4：M603和M690菌株的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸产量。

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M603	0.5	0.7	0.0	17.4
M690	41.6	0.0	0.0	77.2	M603	0.5	0.7	0.0	17.4

然后如下诱变M690菌株：在BHI培养基(BECTON DICKINSON)中生长的M690过夜培养，用pH 5.5的50mM柠檬酸盐缓冲液洗涤，用N-甲基-N-亚硝基胍(10mg/ml溶于50mM柠檬酸盐pH 5.5)在30℃处理20分钟。处理后再次用pH 5.5的50mM柠檬酸盐缓冲液洗涤细胞，并铺板于含有以下成分的培养基中：(所有提及的量均按500ml培养基计算)10g(NH₄)₂SO₄；0.5g KH₂PO₄；0.5g K₂HPO₄；0.125g MgSO₄＊7H₂O；21g MOPS；50mg CaCl₂；15mg原儿茶酸；0.5mg生物素；1mg硫胺素；以及5g/lD，L-乙硫氨酸(希格玛化学(SIGMA CHEMICALS)，目录号E5139)，用KOH调节pH为7.0。此外，该培养基中还含有0.5ml微量金属溶液，包括10g/l FeSO₄＊7H₂O；1g/l MnSO₄＊H₂O；0.1g/l ZnSO₄＊7H₂O；0.02g/lCuSO₄；以及0.002g/l NiCl₂＊6H₂O，均溶于0.1M HCl中。通过过滤法灭菌最终培养基，并向其中加入40ml无菌50％葡萄糖溶液(40ml)和终浓度为1.5％的无菌琼脂。将最终含有琼脂的培养基倾倒于琼脂板上，并标记为最小乙硫氨酸培养基。将诱变的菌株散布于板上(最小乙硫氨酸)，并在30℃下孵育3-7天。分离在此培养基上生长的克隆，并重铺于同一最小乙硫氨酸培养基上。选择若干克隆用于甲硫氨酸生产分析。

如下分析甲硫氨酸生产。令菌株在30℃的CM-琼脂培养基中生长2天，所述培养基中含有：10g/l D-葡萄糖、2.5g/l NaCl；2g/l尿素；10g/l蛋白胨(DIFCO)；5g/l酵母提取物(DIFCO)；5g/l牛肉提取物(DIFCO)；22g/l琼脂(DIFCO)；并于约121℃下高压灭菌20分钟。

菌株生长后，刮下细胞并重悬浮于0.15M NaCl中。对于主要培养物，起始OD 600nm处向约1.5至10ml的II号培养基(见下)中加入刮下细胞的悬浮液及0.5g固体高压灭菌CaCO₃(RIEDEL DE HAEN)，并于30℃下约200rpm的轨道式振荡平台上、100ml无隔板振荡烧瓶中孵育细胞72小时。II号培养基含：40g/l蔗糖；60g/l糖蜜来源的全糖(计算糖含量)；10g/l(NH₄)₂SO₄；0.4g/l MgSO₄＊7H₂O；0.6g/l KH₂PO₄；0.3mg/l硫胺素＊HCl；1mg/l生物素；2mg/l FeSO₄；以及2mg/l MnSO₄。用NH₄OH调整培养基的pH为7.8，并于约121℃下高压灭菌约20分钟。高压灭菌并冷却后，加入过滤灭菌的维生素B₁₂(氰钴胺素)贮存液(200μg/ml)(希格玛化学(SIGMA CHEMICALS))，至终浓度为100μg/l。

从培养基中取样并测定其氨基酸含量。利用Agilent氨基酸法在Agilent 1100系列LC系统HPLC(AGILENT)上确定产生的氨基酸包括甲硫氨酸。样品的邻苯二甲醛柱前衍生能在Hypersil AA-柱(AGILENT)分离后定量所产生的氨基酸。

分离甲硫氨酸滴度至少为在M690中的2倍的克隆。用于进一步试验的一个这样的克隆被命名为M1197，并于2005年5月18日收藏于DSMZ菌种保藏中心，菌株号DSM 17322。将该菌株的氨基酸产量与菌株M690进行比较，如下表5所总结。

表5：M690和M1197菌株的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸产量。

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M690	41.6	0.0	0.0	77.2
M1179	26.4	1.9	0.7	79.2	M690	41.6	0.0	0.0	77.2

用DNA F(也称为pH399，其示意图见图7)(SEQ ID NO：4)转化菌株M1197，产生“坎贝尔插入”菌株，随后“经坎贝尔去除”得到菌株M1494。该菌株含有高丝氨酸激酶基因的突变，导致所产生的高丝氨酸激酶中发生T190到A190的氨基酸改变(称为HskT190A)。将菌株M1494产生的氨基酸与菌株M1197的生产进行比较，如下表6所总结。

表6：M1197和M1494菌株的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸产量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M1197	26.4	1.9	0.7	79.2
M1494	18.3	0.2	2.5	50.1	M1197	26.4	1.9	0.7	79.2

用DNA D(也称为pH484，其示意图见图7)(SEQ ID NO：5)转化菌株M1494，产生“坎贝尔插入”菌株，随后“经坎贝尔去除”得到菌株M1990。该M1990菌株利用groES-启动子和EFTU(延伸因子Tu)-启动子过量表达metY等位基因(记作P₄₉₇P₁₂₈₄metY)。P₄₉₇P₁₂₈₄的序列如SEQ ID NO：13所列。将菌株M1494产生的氨基酸与菌株M1990的生产进行比较，如下表7所总结。

表7：M1494和M1990菌株的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸产量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M1494	18.3	0.2	2.5	50.1
M1990	18.2	0.3	5.6	48.9	M1494	18.3	0.2	2.5	50.1

用DNA E(也称为pH491，其示意图见图7)(SEQ ID NO：6)转化菌株M1990，产生“坎贝尔插入”菌株，随后“经坎贝尔去除”得到“坎贝尔去除”菌株M2014。该M2014菌株利用超氧化物歧化酶启动子过量表达metA等位基因(记作P₃₁₁₉metA)。P₃₁₁₉的序列如SEQ ID NO：12中所列。将菌株M2014产生的氨基酸与菌株M1990的生产进行比较，如下表8所总结。

表8：M1990和M2014菌株的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸产量。

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M1990	18.2	0.3	5.6	48.9
M2014	12.3	1.2	5.7	49.2	M1990	18.2	0.3	5.6	48.9

实施例2：振荡烧瓶试验及HPLC测定

使用标准糖蜜培养基的振荡烧瓶试验，进行菌株的一式两份或四份的试验。每1升糖蜜培养基中含有：40g葡萄糖、60g糖蜜、20g(NH₄)₂SO₄、0.4g MgSO₄＊7H₂O、0.6g KH₂PO₄、10g酵母提取物(DIFCO)、5ml的400mM苏氨酸、2mg FeSO₄.7H₂O、2mg MnSO₄.H₂O，以及50g CaCO₃(Riedel-de Haen)，其余体积由ddH₂O补足。用20％NH₄OH调节pH至7.8。将20ml持续搅拌的培养基(为保持CaCO₃为悬浮状态)加入250ml隔板Bellco振荡烧瓶中，并高压灭菌烧瓶20分钟。高压灭菌后，在每升基础培养基中加入4ml“4B溶液”(或80μl/培养瓶)。每升该“4B溶液”含有：0.25g盐酸硫胺素(维生素B1)、50mg氰钴胺素(维生素B12)、25mg生物素、1.25g盐酸吡哆醇(维生素B6)，并以pH 7.0的12.5mM KPO₄缓冲以溶解生物素，过滤灭菌。培养物于28℃或30℃下，在橡皮筋固定的覆有Bioshield纸的有挡板的烧瓶中生长48小时，并且以200或300rpm在NewBrunswick Scientific平台振荡器中振荡。在24小时和/或48小时取样。通过离心除去细胞，然后用等量的60％乙腈稀释上清液，随后利用Centricon0.45μm旋转柱对溶液进行膜过滤。利用HPLC测定滤过物中甲硫氨酸、甘氨酸及高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及其他提及氨基酸的含量。

为进行HPLC测定，用0.45μm过滤的1mM Na₂EDTA1∶100稀释滤过的上清液，取1μl溶液用OPA试剂(AGILENT)于硼酸盐缓冲液(80mMNaBO₃、2.5mM EDTA、pH 10.2)中衍生，并注入200×4.1mm Hypersil 5μAA-ODS柱上，在装有G1321A荧光检测器(AGILENT)的Agilent 1100系列HPLC上运行。激发波长为338nm，而监测的发射波长为425nm。色谱法测定氨基酸标准溶液，用于确定多种氨基酸的保留时间和标准峰面积。利用Agilent提供的附赠软件包Chem Station进行仪器调控、数据获取和数据处理。硬件为支持微软服务组件(SP6a)更新的Microsoft Windows NT4.0的HP奔腾4计算机。

实施例3：产生含有去调节的硫酸盐还原通路的微生物

利用质粒pOM423(SEQ ID NO：7)产生去调节的硫酸盐还原通路的菌株。具体而言，使用大肠杆菌噬菌体λP_L和P_R背离(divergent)启动子构建体取代天然硫酸盐还原调节子异向启动子。用pOM423转化菌株M2014并利用卡那霉素抗性选择之(坎贝尔插入)。sacB反选择后，从转化株(坎贝尔去除)中分离出卡那霉素敏感的衍生物。然后用PCR分析这些菌株，确定硫酸盐还原调节子的启动子结构。命名含有P_L-P_R背离启动子的分离株为OM429。利用DTNB条带测试测定4个OM429分离株中的硫酸盐还原，振荡烧瓶测定测定甲硫氨酸的产生。为利用DTNB条带测试估计相对的硫化物产生，将一条滤纸浸于Ellman’s试剂(DTNB)溶液中，并悬浮于待测试的菌株振荡烧瓶培养物上48小时。生长培养物所产生的硫化氢还原DTNB，产生的黄色与生成H₂S的量大致成比例。因此，产生颜色的强度可用于粗略估计多种菌株的相对硫酸盐还原活性。结果(表10)显示4个分离株中有2株硫酸盐还原水平相对较高。同样是这2个分离株产生的甲硫氨酸水平也最高。培养物在标准蜜糖培养基中生长48小时。

表10.OM429分离株在振荡烧瓶培养中的甲硫氨酸生产及硫酸盐还原

试验4：含有大肠杆菌甘氨酸裂解(gcy)操纵子的菌株

通过从葡萄糖生物合成甲硫氨酸所必需的GlyA酶(R38)，从丝氨酸产生亚甲基四氢叶酸，也会产生副产品甘氨酸。在过量生成甲硫氨酸的菌株中，产生甘氨酸的量将大于蛋白质合成的所需。因此，根据上述模式，向谷氨酸棒杆菌中加入GCS将增高甲硫氨酸合成的效率。

在大肠杆菌和枯草杆菌中，如果甘氨酸的量大于蛋白质合成所需者，则甘氨酸被甘氨酸裂解酶体系裂解以提供亚甲基四氢叶酸的第二当量。大肠杆菌的甘氨酸裂解体系包括4种不同的蛋白质。其中3种由gcvTHP操纵子编码。第4种亚基为硫辛酰胺脱氢酶，借自多亚基的丙酮酸脱氢酶。谷氨酸棒杆菌似乎并没有甘氨酸裂解体系。虽然谷氨酸棒杆菌确实具有通常的多亚基丙酮酸脱氢酶，在谷氨酸棒杆菌基因组中尚未发现大肠杆菌Gcv蛋白的同源物。因此，谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸的产生会同时导致产生甘氨酸，后者存在于培养物上清液中。因此尝试在谷氨酸棒杆菌中补充GCS，和如大肠杆菌和枯草杆菌一样将甘氨酸回收形成亚甲基四氢叶酸。

完成该目的的第一步，是以PCR扩增大肠杆菌的gcvTHP操纵子而不含有天然启动子，并从P₄₉₇启动子下游将其克隆入pOM218，后者为设计用于在谷氨酸棒杆菌的bioB处整合表达盒的低拷贝大肠杆菌载体。假设宿主生物谷氨酸棒杆菌可以提供丙酮酸脱氢酶中必要的第四亚基。将产生的质粒pOM229(图8，SEQ ID No：8)，转化入起始生物菌株M2014，并成功的经坎贝尔去除以形成命名为OM212的菌株。然后培养这些菌株。

使用以下培养基：40g/l葡萄糖、60g/l糖含量为45％的糖蜜、10g/l(NH₄)₂SO₄、0.4g/l MgSO₄＊7H₂O、2mg/l FeSO₄、2mg/l MnSO₄、1.0mg/l硫胺素、1mg/l生物素。用30％NH₄OH调节pH为pH 7.8，并高压灭菌培养基20分钟。高压灭菌后：每20ml培养基中200mg/l B12、2mM L-苏氨酸、2ml 0.5g/ml CaCO₃。从2M贮存液中添加pH 7.2的磷酸盐缓冲液至200mM。

振荡烧瓶培养物中，如上所述分析1个分离株OM212-1。结果见表11，显示甲硫氨酸生成增加，以及甘氨酸及高丝氨酸生成减少。

表11生长于蜜糖+CaCO₃培养基的振荡培养瓶内，含在bioB处整合从P₄₉₇gcvTHP(大肠杆菌)的M2014衍生物中甲硫氨酸生成

观测到菌株M2014的碳产量为0.0103摩尔甲硫氨酸/摩尔糖，而菌株OM212-1的碳产量为0.011摩尔甲硫氨酸/摩尔糖。

在另一实施方案中，从宿主大肠杆菌中克隆出甘氨酸裂解体系中非gcvTHP操纵子编码的亚基，即编码硫辛酰胺脱氢酶的lpdA基因(SEQ IDNo：10)。不用天然启动子而加入P₄₉₇启动子扩增该基因。除gcvTHP操纵子外，将产生的片段克隆入大肠杆菌谷氨酸棒杆菌穿梭载体pOM229。

试验5：功能性甘氨酸裂解体系的体内测定

通过PCR产生谷氨酸棒杆菌serA基因，并克隆入Swa I切开的pCINT以产生质粒pOM238。然后将谷氨酸棒杆菌P497表达的含有革兰氏阳性大观霉素抗性基因(spc)的钝性片段，连入Ale I切开的pOM238。命名与serA相同顺序含有spc基因的分离株为pOM253(见图9，SEQ IDNO：9)。pOM253可用于在任意谷氨酸棒杆菌菌株的serA基因中创建中断缺失(interruption-deletion)。

将pOM253转化入谷氨酸棒杆菌菌株M2014，选择其卡那霉素抗性，得到“经坎贝尔插入的”菌株OM264K。通过选择蔗糖抗性(BHI+5％蔗糖)和大观霉素抗性(BHI+100mg/l大观霉素)，“经坎贝尔去除”OM264K以形成菌株OM264，后者为丝氨酸、苏氨酸和生物素的营养缺陷型。

可用质粒pOM229或其他可提供甘氨酸裂解通路(Gcv)的质粒转化菌株OM264。如果甘氨酸裂解通路具有活性，则产生的serA^-、Gcv⁺菌株能够在含有甘氨酸、苏氨酸和生物素的基本培养基中生长，因为甘氨酸裂解体系会产生亚甲基四氢叶酸，且glyA基因的产物丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)能够以甘氨酸和亚甲基四氢叶酸为底物，反向进行SHMT反应以形成丝氨酸。

如有必要，可将编码硫辛酰胺脱氢酶的基因如大肠杆菌lpd基因(也称为lpdA；Seq No：10)克隆并转化入上述菌株中，以提供甘氨酸裂解体系必需的第四亚基。也可如上述通过PCR或互补克隆编码除大肠杆菌外其他生物甘氨酸裂解体系的基因，并用于提供谷氨酸棒杆菌中功能性甘氨酸裂解体系。例如，可以使用在枯草杆菌中编码五亚基甘氨酸裂解体系的枯草杆菌基因gcvH、gcvPA、gcvPB、gcvT和pdhD(枯草杆菌中甘氨酸脱羧酶由gcvPA和gcvPB编码的两个亚基组成，而在大肠杆菌中这两项功能组合为由gcvP编码的一个亚基)，或任何其他合适的一组基因。唯一的要求是该系统在谷氨酸棒杆菌中的功能水平足以将多余的甘氨酸(甲硫氨酸生物合成结果所致)转化为亚甲基四氢叶酸。

试验6：谷氨酸棒杆菌中丙酮酸激酶的敲除

基本模式分析提示，丙酮酸激酶(R19)的下调可能增高甲硫氨酸合成的效率(见如图3)。

为研究丙酮酸激酶敲除的影响，分析产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株。如果确实观察到赖氨酸产生增加，这也提示甲硫氨酸合成增加，因为赖氨酸形成前有天冬氨酸盐、天冬氨酸磷酸盐等的形成。因此，赖氨酸产量的增加必然在如天冬氨酸盐的产量增加之后。由于天冬氨酸盐也是甲硫氨酸产生的前体之一，天冬氨酸盐量的增加也会导致甲硫氨酸合成增加。

对谷氨酸棒杆菌lysC^fbr和谷氨酸棒杆菌lysC^fbr Δpyk进行菌株比较。谷氨酸棒杆菌lysC^fbr为天冬氨酸激酶编码基因中具有点突变的变体(Kalinowski等人.(1991)，Mol.Microbiol.5(5)，1197-1204)。然后用该菌株缺失丙酮酸激酶(谷氨酸棒杆菌lysC^fbrΔpyk)。

在振荡烧瓶的基本培养基中培养两种菌株，确定其生物量、赖氨酸和副产品的碳产量。根据两个独立试验的平均值，发现丙酮酸激酶敲除株的赖氨酸产量由7.5％增加至12.1％。等同于增加了约62％。

总言之，丙酮酸激酶敲除能增加赖氨酸的合成，从而也导致甲硫氨酸合成增加。然而，并不能预期利用丙酮酸激酶敲除菌株生产甲硫氨酸能够增加甲硫氨酸的合成，因为如果考虑代谢网络的一般知识，甲硫氨酸本身也有赖于有活性的丙酮酸激酶。

试验7：对所用不同硫源摄取的比较

令人惊异的是，基本模式分析显示甲硫氨酸合成效率取决于硫源的还原状态。如上所述，每节省1个NADPH，甲硫氨酸合成效率可提高4.6％。然而，目前对于谷氨酸棒杆菌在不同硫源中生长和利用的数据仍然是初步的而欠全面。

为了测试在不同碳源中培养谷氨酸棒杆菌是否真能导致甲硫氨酸合成效率的水平增加，进行以下试验。

在振荡烧瓶的硫酸盐和硫代硫酸盐上培养谷氨酸棒杆菌野生型菌株及ΔmcbR变体。为此，以等摩尔浓度将相应硫源加入不含硫的CG12¹/₂基本培养基。

每升CG12¹/₂-培养基中含有：20g葡萄糖、16g K₂HPO₄、4g KH₂PO₄、20g(NH₄)₂SO₄、300mg 3，4-二羟基苯甲酸、10mg CaCl₂、250mg MgSO₄7H₂O、10mg FeSO₄＊7H₂O、10mg MnSO₄＊H₂O、2mg ZnSO₄＊7H₂O、200μgCuSO₄＊5H₂O、20μg NiCl₂＊6H₂O、20μg Na₂MoO₄＊2H₂O、100μg氰钴胺素(维生素B₁₂)、300μg硫胺素(维生素B₁)、4μg磷酸吡哆醛(维生素B₆)以及100μg生物素(维生素B₇)。

在无硫CG12¹/₂培养基中，所有的硫酸盐均以氯化物代替，其所用浓度使相应阳离子浓度不变。使用以下盐：MgCl₂＊6H₂O(SO₄ ^2-＜0.002％，希格玛(Sigma))；ZnCl₂(SO₄ ^2-＜0.002％，希格玛)；NH₄Cl(SO₄ ^2-＜0.002％，Fluka)；MnCl₄＊4H₂O(SO₄ ^2-＜0.002％，希格玛)以及FeCl₂＊4H₂O(SO₄ ^2-＜0.01％，希格玛)。

在30℃和以250upm在振荡柜中有刻度的振荡烧瓶内培养谷氨酸棒杆菌(Multitron，Infors AG，Bottmingen，瑞士)。为防止氧气受限，培养瓶中至多填充10％的培养基。

已知谷氨酸棒杆菌ΔmcbR过量表达半胱氨酸合酶CysK(R45和R45a)以及胱硫醚-γ-合酶MetB(R46)(Rey等人(2003)同上)。

发现两种菌株均能在硫酸盐及硫代硫酸盐中生长。最高生长率见于野生型，其在硫酸盐上μ_max＝0.44小时^-1。因此，硫酸盐似乎为谷氨酸棒杆菌的优选硫源。谷氨酸棒杆菌也使用硫代硫酸盐，其生长率稍低为μ_max＝0.31小时^-1。

然而，如用硫代硫酸盐代替硫酸盐，则发现野生型的生物量从0.35gg^-1增至0.60gg^-1。对于ΔmcbR敲除株而言，用硫代硫酸盐代替硫酸盐后生物量产量更是从0.42gg^-1增至0.51gg^-1。这对应于其产量分别增加13％和21％。因此，用硫代硫酸盐代替硫酸盐实际上能够减少ATP和NADPH，从而对碳产量起促进作用。

由于生物量的产生需要的糖/葡萄糖的量较少，更多的糖/葡萄糖可用于甲硫氨酸生产。因此，将硫酸盐变为硫代硫酸盐实际上能使甲硫氨酸产量增加，如果结合通过遗传操作增加优选代谢通路的代谢通量，则以硫代硫酸盐为硫源的上述效应更为显著。

附图说明：

图1：用于基本模式分析的谷氨酸棒杆菌野生型的化学计量反应网络。双向箭头表示可逆反应。灰框内显示外部代谢物。

图2：谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的生成甲硫氨酸的代谢通路分析：从以下生物获得的基本模式的生物量碳产量和甲硫氨酸，所述生物为：谷氨酸棒杆菌野生型(A)、大肠杆菌野生型(B)、具有有活性的转氢酶的谷氨酸棒杆菌变体(C)、转氢酶缺失的大肠杆菌变体(D)、具有有活性的甘氨酸裂解体系的谷氨酸棒杆菌变体(E)、甘氨酸裂解体系缺失的大肠杆菌变体(F)。给出的数字提示每一情况中甲硫氨酸的最大理论碳产量。直线连接最大生物量及最大甲硫氨酸产量的模式。

图3：具有最大甲硫氨酸理论碳产量的谷氨酸棒杆菌野生型的通量分布。所有的通量均以对葡萄糖摄取的相对摩尔通量表示。

图4：具有最大甲硫氨酸理论碳产量的大肠杆菌野生型的通量分布。所有的通量均以对葡萄糖摄取的相对摩尔通量表示。

图5：对使用不同碳源和硫源的谷氨酸棒杆菌的甲硫氨酸生产代谢通量分析：从使用硫代硫酸盐(A)、硫代硫酸盐和甲酸盐(B)、硫化物(C)、硫化物和甲酸盐(D)、甲酸盐(E)及甲硫醇或其二聚体二甲基二硫醚(F)的谷氨酸棒杆菌获得的基本模式的生物量碳产量及甲硫氨酸。给出的数字提示每一情况中甲硫氨酸的最大理论碳产量。直线连接具有最大生物量产量及最大甲硫氨酸产量的模式。

图6显示载体pH273、pH373及pH304

图7显示载体pH399、pH484及pH491

图8显示载体pOM229。

图9显示载体pOM253。

图10显示关于甲硫氨酸合成的最优代谢通量的一个优选的实施方案。

简写：

G6P＝葡萄糖-6-磷酸盐

F6P＝果糖-6-磷酸盐

F-16-BP＝果糖-1，6-二磷酸盐

ASP＝天冬氨酸

ASP-P＝天冬氨酰磷酸盐

ASP-SA＝天冬氨酸半醛

HOM＝高丝氨酸

O-AC-HOM＝O-乙酰-高丝氨酸

HOMOCYS＝同型半胱氨酸

3-PHP＝3-磷酰基氧代丙酮酸盐(Phosphonooxypyruvate)

SER-P＝3-磷酸丝氨酸

SER＝丝氨酸

O-AC-SER＝O-乙酰-丝氨酸

CYS＝半胱氨酸

CYSTA＝胱硫醚

GA3P＝甘油醛3-磷酸盐

DAHP＝磷酸二羟丙酮

13-PG＝1，3-二磷酸甘油

3-PG＝3-磷酸甘油

2-PG＝2-磷酸甘油

AC-CoA＝乙酰辅酶A

PYR＝丙酮酸盐

PEP＝磷酸烯醇丙酮酸盐

CIT＝柠檬酸

OAA＝草酰乙酸盐

顺式-ACO＝顺乌头酸盐

ICI＝异柠檬酸

2-OXO＝2-酮戊二酸盐

GLU＝谷氨酸盐

SUCC-CoA＝琥珀酰辅酶A

SUCC＝琥珀酸盐

FUM＝延胡索酸盐

MAL＝苹果酸盐

GLYOXY＝乙醛酸盐

H₂SO₃＝亚硫酸盐

H₂S＝硫化氢

6-P-葡萄糖酸盐＝6-磷酸葡萄糖酸盐

GLC-LAC＝6-磷酸葡萄糖酸-1，5-内酯

RIB-5P＝核酮糖5-磷酸盐

RIBO-5P＝核糖5-磷酸盐

XYL-5P＝木酮糖5-磷酸盐

S7P＝景天庚酮糖7-磷酸盐

E-4P＝赤藓糖4-磷酸盐

MET＝L-甲硫氨酸

NADP＝氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐

NADPH＝还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐

ACETAT＝乙酸盐

H-CoA＝辅酶A

FAD＝氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸

FADH＝还原型黄素腺嘌呤二核苷酸

ATP＝腺苷5′-三磷酸

ADP＝腺苷5′-二磷酸

NAD＝氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

NADH＝还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

M-THF＝5-甲基四氢叶酸盐

THF＝四氢叶酸盐

GDP＝鸟苷5′-二磷酸

GTP＝鸟苷5′-三磷酸

GLC＝葡萄糖

MET_ex＝分泌的甲硫氨酸

O₂＝氧气

NH₃＝氨

CO₂＝二氧化碳

SO₄＝硫酸盐

GLYCINE＝甘氨酸

HPL＝H-蛋白-硫辛酰赖氨酸

甲基-HPL＝H-蛋白-S-氨甲基二氢硫辛酰赖氨酸

反应

以下反应由酶R1至R80完成：

R1：PEP+GLC＝PYR+G6P.

R2：G6P＝F6P.

R3：G6P+NADP＝GLC-LAC+NADPH.

R4：GLC-LAC＝6-P-葡萄糖酸盐.

R5：6-P-葡萄糖酸盐+NADP＝RIB-5P+CO₂+NADPH.

R6：RIB-5P＝XYL-5P.

R7：RIB-5P＝RIBO-5P.

R8：S7P+GA3P＝RIBO-5P+XYL-5P.

R9：S7P+GA3P＝E-4P+F6P.

R10：F6P+GA3P＝E-4P+XYL-5P.

R11：ATP+F6P＝ADP+F-16-BP.

R12：F-16-BP＝F6P.

R13：F-16-BP＝GA3P+DAHP.

R14：DAHP＝GA3P.

R15：GA3P+NAD＝13-PG+NADH.

R16：ADP+13-PG＝ATP+3-PG.

R17：3-PG＝2-PG.

R18：2-PG＝PEP.

R19：PEP+ADP＝PYR+ATP.

R20：PYR+H-CoA+NAD＝AC-CoA+NADH+CO₂.

R21：AC-CoA+OAA＝CIT+H-CoA.

R22：CIT＝顺式-ACO.

R23：顺式-ACO＝ICI.

R24：ICI+NADP＝2-OXO+CO₂+NADPH.

R25：2-OXO+NH₃+NADPH＝GLU+NADP.

R26：2-OXO+NAD+H-CoA＝SUCC-CoA+NADH+CO₂.

R27：SUCC-CoA+GDP＝SUCC+H-CoA+GTP.

R28：SUCC+FAD＝FUM+FADH.

R29：FUM＝MAL.

R30：MAL+NAD＝OAA+NADH.

R31：ICI＝GLYOXY+SUCC.

R32：GLYOXY+AC-CoA＝MAL+H-CoA.

R33：PYR+ATP+CO₂＝OAA+ADP.

R34：PEP+CO₂＝OAA.

R35：OAA+ATP＝PEP+ADP+CO₂.

R36：OAA+ADP＝PYR+CO₂+ATP.

R37：OAA+GLU+NADPH＝ASP+2-OXO+NADP.

R38：THF+SER＝MTHF+GLYCINE.

R39：ASP-SA+NADPH＝HOM+NADP.

R40：HOM+SUCC-CoA＝O-SUCC-HOM+H-CoA.

R41：3-PG+NAD＝3-PHP+NADH.

R42：3-PHP+GLU＝SER-P+2-OXO.

R43：SER-P＝SER.

R44：SER+AC-CoA＝O-AC-SER+H-CoA.

R45：O-AC-SER+H₂S＝CYS+ACETAT.

R45a：H₂S₂O₃+O-Ac-SER＝S-硫胱氨酸+ACETAT

R46：CYS+O-SUCC-HOM＝CYSTA+SUCC.

R47：ASP+ATP＝ASP-P+ADP.

R48：ASP-P+NADPH＝ASP-SA+NADP.

R49：O-乙酰-高丝氨酸+H₂S＝高丝氨酸+乙酸

R50：ATP+ACETAT＝ADP+乙酰磷酸.

R51：乙酰磷酸+H-CoA＝AC-CoA.

R52：HOMOCYS+MTHF＝MET+THF.

R53：MET＝MET_ex.

R54：CYSTA＝HOMOCYS+NH₃+PYR.

R55：SO₄+2ATP+NADPH＝H₂SO₃+2ADP+NADP.

R56：ATP＝ADP.

R57：MAL+NADP＝PYR+CO₂+NADPH.

R58：H₂SO₃+3NADPH＝H₂S+3NADP.

R59：2NADH+O₂+4ADP＝2NAD+4ATP.

R60：2FADH+O₂+2ADP＝2FAD+2ATP.

R61：6965NH₃+233SO₄+206G6P+72F6P+627RIBO-5P+361E-4P+129GA3P+13383-PG+720PEP+2861PYR+2930AC-CoA+1481OAA+10782-OXO+16548NADPH＝生物量+16548NADP+2930H-CoA+1678CO₂.

R62：ADP+GTP＝ATP+GDP.

R70：NADPH+NAD＝NADP+NADH.

R71：GLYCINE+HPL＝甲基-HPL+CO₂.

R72：甲基-HPL+THF＝HPL+MTHF+NH₄.

R73：1硫代硫酸盐(S₂O₃ ^2-)+1NAD(P)H＝1亚硫酸盐+1硫化物+1NAD(P)

R74：亚硫酸盐+3NAD(P)H＝硫化物+3NAD(P)

R75：ATP+甲酸盐+THF＝ADP+正磷酸+10-甲酰-THF

R76：5，10-亚甲酰-THF+NADPH＝5，10-亚甲基-THF+NADP

R77：O-乙酰-高丝氨酸+甲硫醇＝甲硫氨酸+乙酸

R78：5，10-亚甲基-THF+NADP(H)＝甲基-THF

R79：甲酰四氢叶酸＝甲酸盐+四氢叶酸

R80：硫酸盐+1NAD(P)H+1ATP+1G(A)TP＝亚硫酸盐+1NAD(P)，1PP_i，1G(A)DP+腺苷酸+P

R81：3NADH+3NADP⁺+ATP＝3NAD⁺+3NADPH

R82：H₂S₂O_3外部+ATP＝H₂S₂O_3内部+ADP

野生型谷氨酸棒杆菌模型(对照图1)-反应及酶：

R1：磷酸转移酶体系

R2：G6P-异构酶

R3：G6P-DH

R4：内酯酶

R5：葡萄糖酸-DH

R6：核糖-5-P-差向异构酶

R7：核糖-5-P-异构酶

R8：转酮酶1

R9：转醛酶

R10：转酮酶2

R11：磷酸果糖激酶

R12：果糖二磷酸酶

R13：果糖二磷酸醛缩酶

R14：磷酸丙糖异构酶

R15：3-磷酸甘油激酶

R16：PG-激酶

R17：PG-变位酶

R18：PEP-水解酶

R19：PYR-激酶

R20：PYR-DH

R21：CIT-合酶

R22：ACO-水解酶

R23：乌头酸酶

R24：异柠檬酸-DH

R25：谷氨酸-DH

R26：2-OXO-DH

R27：SUCC-CoA-合酶

R28：SUCC-DH

R29：延胡索酸酶

R30：MAL-DH

R31：ICI-裂解酶

R32：MAL-合酶

R33：PYR-羧化酶

R34：PEP-羧化酶

R35：PEP-羧化激酶

R36：OAA-脱羧酶

R37：ASP-转氨酶

R38：M-THF合成1

R39：HOM-DH

R40：HOM-转乙酰基酶

R41：PG-DH

R42：磷酸丝氨酸转氨酶

R43：磷酸丝氨酸磷酸酶

R44：丝氨酸转乙酰基酶

R45：半胱氨酸合酶

R46：胱硫醚合酶

R47：天冬氨酸激酶

R48：ASP-P-DH

R49：O-Ac-HOM巯基酶

R50：ACETAT-激酶

R51：磷酸转乙酰基酶

R52：MET-合酶(MetE/H)

R53：甲硫氨酸运出体

R54：胱硫醚-□-裂解酶

R55：ATP-硫酸化酶

R56：ATP-水解酶

R57：苹果酸酶

R58：亚硫酸盐还原酶

R59：呼吸链1

R60：呼吸链2

R61：生物量形成

R62：GTP-ATP-磷酸转移酶

反应类型(可逆或不可逆)

可逆：

R2r R6r R7r R8r R9r R10r R13r R14r R15r R17r R18r R22r R23rR28r R29r R30r R37r R41r R42r

不可逆：

R1 R3 R4 R5 R11 R12 R16 R19 R20 R21 R24 R25 R26 R27 R31 R32R33 R34 R35 R36 R38 R39 R40 R43 R44 R45 R46 R47 R48 R49 R50 R51R52 R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R60 R61 R62

代谢物(内部或外部)：

内部：

G6P F6P F-16-BP ASP ASP-P ASP-SA HOM ATP O-AC-HOMHOMOCYS 3-PHP SER-P SER O-AC-SER CYS CYSTA GA3P DAHP13-PG 3-PG 2-PG AC-CoA PYR PEP CIT OAA顺式-ACO ICI 2-OXOGLU SUCC-CoA SUCC FUM MAL GLYOXY H2SO3 H2S 6-P-葡萄糖酸盐GLC-LAC RIB-5P RIBO-5P XYL-5P S7P E-4P MET NADP NADPH乙酰磷酸盐ACETAT H-CoA FAD FADH ADP NADH NAD MTHF THFGDP GTP

外部：

生物量GLC MET_ex O₂ NH₃ CO₂ SO₄甘氨酸

反应化学计量学：

R1：PEP+GLC＝PYR+G6P.

R2r：G6P＝F6P.

R3：G6P+NADP＝GLC-LAC+NADPH.

R4：GLC-LAC＝6-P-葡萄糖酸盐.

R5：6-P-葡萄糖酸盐+NADP＝RIB-5P+CO₂+NADPH.

R6r：RIB-5P＝XYL-5P.

R7r：RIB-5P＝RIBO-5P.

R8r：S7P+GA3P＝RIBO-5P+XYL-5P.

R9r：S7P+GA3P＝E-4P+F6P.

R10r：F6P+GA3P＝E-4P+XYL-5P.

R11：ATP+F6P＝ADP+F-16-BP.

R12：F-16-BP＝F6P.

R13r：F-1，6-BP＝GA3P+DAHP.

R14r：DAHP＝GA3P.

R15r：GA3P+NAD＝13-PG+NADH.

R16：ADP+13-PG＝ATP+3-PG.

R17r：3-PG＝2-PG.

R18r：2-PG＝PEP.

R19：PEP+ADP＝PYR+ATP.

R20：PYR+H-CoA+NAD＝AC-CoA+NADH+CO₂.

R21：AC-CoA+OAA＝CIT+H-CoA.

R22r：CIT＝顺式-ACO.

R23r：顺式-ACO＝ICI.

R24：ICI+NADP＝2-OXO+CO₂+NADPH.

R25：2-OXO+NH3+NADPH＝GLU+NADP.

R26：2-OXO+NAD+H-CoA＝SUCC-CoA+NADH+CO₂.

R27：SUCC-CoA+GDP＝SUCC+H-CoA+GTP.

R28r：SUCC+FAD＝FUM+FADH.

R29r：FUM＝MAL.

R30r：MAL+NAD＝OAA+NADH.

R31：ICI＝GLYOXY+SUCC.

R32：GLYOXY+AC-CoA＝MAL+H-CoA.

R33：PYR+ATP+CO₂＝OAA+ADP.

R34：PEP+CO₂＝OAA.

R35：OAA+ATP＝PEP+ADP+CO₂.

R36：OAA+ADP＝PYR+CO₂+ATP.

R37r：OAA+GLU+NADPH＝ASP+2-OXO+NADP.

R38：THF+SER＝MTHF+甘氨酸.

R39：ASP-SA+NADPH＝HOM+NADP.

R40：HOM+AC-CoA＝O-AC-HOM+H-CoA.

R41r：3-PG+NAD＝3-PHP+NADH.

R42r：3-PHP+GLU＝SER-P+2-OXO.

R43：SER-P＝SER.

R44：SER+AC-CoA＝O-AC-SER+H-CoA.

R45：O-AC-SER+H₂S＝CYS+ACETAT.

R46：CYS+O-AC-HOM＝CYSTA+ACETAT.

R47：ASP+ATP＝ASP-P+ADP.

R48：ASP-P+NADPH＝ASP-SA+NADP.

R49：O-AC-HOM+H₂S＝HOMOCYS+ACETAT.

R50：ATP+ACETAT＝ADP+乙酰磷酸.

R51：乙酰磷酸+H-CoA＝AC-CoA.

R52：HOMOCYS+MTHF＝MET+THF.

R53：MET＝MET_ex.

R54：CYSTA＝HOMOCYS+NH₃+PYR.

R55：SO4+2ATP+NADPH＝H₂SO₃+2ADP+NADP.

R56：ATP＝ADP.

R57：MAL+NADP＝PYR+CO₂+NADPH.

R58：H2SO3+3NADPH＝H₂S+3NADP.

R59：2NADH+O₂+4ADP＝2NAD+4ATP.

R60：2FADH+O₂+2ADP＝2FAD+2ATP.

R61：6231NH₃+233SO₄+205G6P+308F6P+879RIBO-5P+268E-4P+129GA3P+1295 3-PG+652PEP+2604PYR+3177AC-CoA+1680OAA+1224 2-OXO+16429NADPH＝生物量+16429NADP+3177H-CoA+1227CO₂.

R62：ADP+GTP＝ATP+GDP.

野生型大肠杆菌模型-反应及酶：

R1：磷酸转移酶体系

R2：G6P-异构酶

R3：G6P-DH

R4：内酯酶

R5：葡萄糖酸-DH

R6：核糖-5-P-差向异构酶

R7：核糖-5-P-异构酶

R8：转酮酶1

R9：转醛酶

R10：转酮酶2

R11：磷酸果糖激酶

R12：果糖二磷酸酶

R13：果糖二磷酸醛缩酶

R14：磷酸丙糖异构酶

R15：3-磷酸甘油激酶

R16：PG-激酶

R17：PG-变位酶

R18：PEP-水解酶

R19：PYR-激酶

R20：PYR-DH

R21：CIT-合酶

R22：ACO-水解酶

R23：乌头酸酶

R24：异柠檬酸-DH

R25：谷氨酸-DH

R26：2-OXO-DH

R27：SUCC-CoA-合酶

R28：SUCC-DH

R29：延胡索酸酶

R30：MAL-DH

R31：ICI-裂解酶

R32：MAL-合酶

R33：PYR-羧化酶

R34：PEP-羧化酶

R35：PEP-羧化激酶

R36：OAA-脱羧酶

R37：ASP-转氨酶

R38：M-THF合成1

R39：HOM-DH

R40：HOM-转乙酰基酶

R41：PG-DH

R42：磷酸丝氨酸转氨酶

R43：磷酸丝氨酸磷酸酶

R44：丝氨酸转乙酰基酶

R45：半胱氨酸合酶

R46：胱硫醚合酶

R47：天冬氨酸激酶

R48：ASP-P-DH

R50：ACETAT-激酶

R51：磷酸转乙酰基酶

R52：MET-合酶(MetE/H)

R53：甲硫氨酸运出体

R54：胱硫醚-□-裂解酶

R55：ATP-硫酸化酶

R56：ATP-水解酶

R57：苹果酸酶

R58：亚硫酸盐还原酶

R59：呼吸链1

R60：呼吸链2

R61：生物量形成

R62：GTP-ATP-磷酸转移酶

R70：转氢酶

R71：甘氨酸裂解1

R72：甘氨酸裂解2

反应类型(可逆或不可逆)

可逆：

R2r R6r R7r R8r R9r R10r R13r R14r R15r R17r R18r R22r R23rR28r R29r R30r R37r R41r R42r R70r

不可逆：

R1 R3 R4 R5 R11 R12 R16 R19 R20 R21 R24 R25 R26 R27 R31 R32R33 R34 R35 R36 R38 R39 R40 R43 R44 R45 R46 R47 R48 R50 R51 R52R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R60 R61 R62 R71 R72

代谢物(内部或外部)：

内部：

G6P F6P F-16-BP ASP ASP-P ASP-SA HOM ATP O-SUCC-HOMHOMOCYS 3-PHP SER-P SER O-AC-SER CYS CYSTA GA3P DAHP13-PG 3-PG 2-PG AC-CoA PYR PEP CIT OAA顺式-ACO ICI 2-OXOGLU SUCC-CoA SUCC FUM MAL GLYOXY H2SO3 H2S 6-P-葡萄糖酸盐GLC-LAC RIB-5P RIBO-5P XYL-5P S7P E-4P MET NADP NADPHH-CoA FAD FADH ADP NADH NAD MTHF THF GDP GTP ACETAT乙酰磷酸盐HPL甲基-HPL甘氨酸

外部：

生物量GLC MET_ex O₂ NH₃ CO₂ SO₄

反应化学计量学：

R1：PEP+GLC＝PYR+G6P.

R2r：G6P＝F6P.

R3：G6P+NADP＝GLC-LAC+NADPH.

R4：GLC-LAC＝6-P-葡萄糖酸盐.

R5：6-P-葡萄糖酸盐+NADP＝RIB-5P+CO₂+NADPH.

R6r：RIB-5P＝XYL-5P.

R7r：RIB-5P＝RIBO-5P.

R8r：S7P+GA3P＝RIBO-5P+XYL-5P.

R9r：S7P+GA3P＝E-4P+F6P.

R10r：F6P+GA3P＝E-4P+XYL-5P.

R11：ATP+F6P＝ADP+F-16-BP.

R12：F-16-BP＝F6P.

R13r：F-16-BP＝GA3P+DAHP.

R14r：DAHP＝GA3P.

R15r：GA3P+NAD＝13-PG+NADH.

R16：ADP+13-PG＝ATP+3-PG.

R17r：3-PG＝2-PG.

R18r：2-PG＝PEP.

R19：PEP+ADP＝PYR+ATP.

R20：PYR+H-CoA+NAD＝AC-CoA+NADH+CO₂.

R21：AC-CoA+OAA＝CIT+H-CoA.

R22r：CIT＝顺式-ACO.

R23r：顺式-ACO＝ICI.

R24：ICI+NADP＝2-OXO+CO₂+NADPH.

R25：2-OXO+NH₃+NADPH＝GLU+NADP.

R26：2-OXO+NAD+H-CoA＝SUCC-CoA+NADH+CO₂.

R27：SUCC-CoA+GDP＝SUCC+H-CoA+GTP.

R28r：SUCC+FAD＝FUM+FADH.

R29r：FUM＝MAL.

R30r：MAL+NAD＝OAA+NADH.

R31：ICI＝GLYOXY+SUCC.

R32：GLYOXY+AC-CoA＝MAL+H-CoA.

R33：PYR+ATP+CO₂＝OAA+ADP.

R34：PEP+CO₂＝OAA.

R35：OAA+ATP＝PEP+ADP+CO₂.

R36：OAA+ADP＝PYR+CO₂+ATP.

R37r：OAA+GLU+NADPH＝ASP+2-OXO+NADP.

R38：THF+SER＝MTHF+甘氨酸.

R39：ASP-SA+NADPH＝HOM+NADP.

R40：HOM+SUCC-CoA＝O-SUCC-HOM+H-CoA.

R41r：3-PG+NAD＝3-PHP+NADH.

R42r：3-PHP+GLU＝SER-P+2-OXO.

R43：SER-P＝SER.

R44：SER+AC-CoA＝O-AC-SER+H-CoA.

R45：O-AC-SER+H₂S＝CYS+ACETAT.

R46：CYS+O-SUCC-HOM＝CYSTA+SUCC.

R47：ASP+ATP＝ASP-P+ADP.

R48：ASP-P+NADPH＝ASP-SA+NADP.

R52：HOMOCYS+MTHF＝MET+THF.

R53：MET＝MET_ex.

R54：CYSTA＝HOMOCYS+NH₃+PYR.

R55：SO4+2ATP+NADPH＝H₂SO₃+2ADP+NADP.

R56：ATP＝ADP.

R57：MAL+NADP＝PYR+CO₂+NADPH.

R58：H₂SO₃+3NADPH＝H₂S+3NADP.

R59：2NADH+O₂+4ADP＝2NAD+4ATP.

R60：2FADH+O₂+2ADP＝2FAD+2ATP.

R61：6965NH₃+233SO₄+206G6P+72F6P+627RIBO-5P+361E-4P+129GA3P+13383-PG+720PEP+2861PYR+2930AC-CoA+1481OAA+10782-OXO+16548NADPH＝BIOMASS+16548NADP+2930H-CoA+1678CO₂.

R62：ADP+GTP＝ATP+GDP.

R50：ATP+ACETAT＝ADP+乙酰磷酸.

R51：乙酰磷酸+H-CoA＝AC-CoA.

R70r：NADPH+NAD＝NADP+NADH.

R71：GLYCINE+HPL＝甲基-HPL+C0₂.

R72：甲基-HPL+THF＝HPL+MTHF+NH₃.

序列表

图1

图2

图3

图4

图5

图6

图7

图8

图9

图10

<110>巴斯夫欧洲公司

<120>甲硫氨酸合成效率增高的微生物

<130>B8004

<140>PCT/EP2006/065460

<141>2006-08-18

<150>EP 05107609.9

<151>2005-08-18

<150>EP 06114543.9

<151>2006-05-24

<160>13

<170>专利版本3.3

<210>1

<211>7070

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>质粒pH273

<400>1

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttgg agaatcatga 60

cctcagcatc tgccccaagc tttaaccccg gcaagggtcc cggctcagca gtcggaattg 120

cccttttagg attcggaaca gtcggcactg aggtgatgcg tctgatgacc gagtacggtg 180

atgaacttgc gcaccgcatt ggtggcccac tggaggttcg tggcattgct gtttctgata 240

tctcaaagcc acgtgaaggc gttgcacctg agctgctcac tgaggacgct tttgcactca 300

tcgagcgcga ggatgttgac atcgtcgttg aggttatcgg cggcattgag tacccacgtg 360

aggtagttct cgcagctctg aaggccggca agtctgttgt taccgccaat aaggctcttg 420

ttgcagctca ctctgctgag cttgctgatg cagcggaagc cgcaaacgtt gacctgtact 480

tcgaggctgc tgttgcaggc gcaattccag tggttggccc actgcgtcgc tccctggctg 540

gcgatcagat ccagtctgtg atgggcatcg ttaacggcac caccaacttc atcttggacg 600

ccatggattc caccggcgct gactatgcag attctttggc tgaggcaact cgtttgggtt 660

acgccgaagc tgatccaact gcagacgtcg aaggccatga cgccgcatcc aaggctgcaa 720

ttttggcatc catcgctttc cacacccgtg ttaccgcgga tgatgtgtac tgcgaaggta 780

tcagcaacat cagcgctgcc gacattgagg cagcacagca ggcaggccac accatcaagt 840

tgttggccat ctgtgagaag ttcaccaaca aggaaggaaa gtcggctatt tctgctcgcg 900

tgcacccgac tctattacct gtgtcccacc cactggcgtc ggtaaacaag tcctttaatg 960

caatctttgt tgaagcagaa gcagctggtc gcctgatgtt ctacggaaac ggtgcaggtg 1020

gcgcgccaac cgcgtctgct gtgcttggcg acgtcgttgg tgccgcacga aacaaggtgc 1080

acggtggccg tgctccaggt gagtccacct acgctaacct gccgatcgct gatttcggtg 1140

agaccaccac tcgttaccac ctcgacatgg atgtggaaga tcgcgtgggg gttttggctg 1200

aattggctag cctgttctct gagcaaggaa tcttcctgcg tacaatccga caggaagagc 1260

gcgatgatga tgcacgtctg atcgtggtca cccactctgc gctggaatct gatctttccc 1320

gcaccgttga actgctgaag gctaagcctg ttgttaaggc aatcaacagt gtgatccgcc 1380

tcgaaaggga ctaattttac tgacatggca attgaactga acgtcggtcg taaggttacc 1440

gtcacggtac ctggatcttc tgcaaacctc ggacctggct ttgacacttt aggtttggca 1500

ctgtcggtat acgacactgt cgaagtggaa attattccat ctggcttgga agtggaagtt 1560

tttggcgaag gccaaggcga agtccctctt gatggctccc acctggtggt taaagctatt 1620

cgtgctggcc tgaaggcagc tgacgctgaa gttcctggat tgcgagtggt gtgccacaac 1680

aacattccgc agtctcgtgg tcttggctcc tctgctgcag cggcggttgc tggtgttgct 1740

gcagctaatg gtttggcgga tttcccgctg actcaagagc agattgttca gttgtcctct 1800

gcctttgaag gccacccaga taatgctgcg gcttctgtgc tgggtggagc agtggtgtcg 1860

tggacaaatc tgtctatcga cggcaagagc cagccacagt atgctgctgt accacttgag 1920

gtgcaggaca atattcgtgc gactgcgctg gttcctaatt tccacgcatc caccgaagct 1980

gtgcgccgag tccttcccac tgaagtcact cacatcgatg cgcgatttaa cgtgtcccgc 2040

gttgcagtga tgatcgttgc gttgcagcag cgtcctgatt tgctgtggga gggtactcgt 2100

gaccgtctgc accagcctta tcgtgcagaa gtgttgccta ttacctctga gtgggtaaac 2160

cgcctgcgca accgtggcta cgcggcatac ctttccggtg ccggcccaac cgccatggtg 2220

ctgtccactg agccaattcc agacaaggtt ttggaagatg ctcgtgagtc tggcattaag 2280

gtgcttgagc ttgaggttgc gggaccagtc aaggttgaag ttaaccaacc ttaggcccaa 2340

caaggaaggc ccccttcgaa tcaagaaggg ggccttatta gtgcagcaat tattcgctga 2400

acacgtgaac cttacaggtg cccggcgcgt tgagtggttt gagttccagc tggatgcggt 2460

tgttttcacc gaggctttct tggatgaatc cggcgtggat ggcgcagacg aaggctgatg 2520

ggcgtttgtc gttgaccaca aatgggcagc tgtgtagagc gagggagttt gcttcttcgg 2580

tttcggtggg gtcaaagccc atttcgcgga ggcggttaat gagcggggag agggcttcgt 2640

cgagttcttc ggcttcggcg tggttaatgc ccatgacgtg tgcccactgg gttccgatgg 2700

aaagtgcttt ggcgcggagg tcggggttgt gcattgcgtc atcgtcgaca tcgccgagca 2760

tgttggccat gagttcgatc agggtgatgt attctttggc gacagcgcgg ttgtcgggga 2820

cgcgtgtttg gaagatgagg gaggggcggg atcctctaga cccgggattt aaatcgctag 2880

cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 2940

ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 3000

aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 3060

gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 3120

actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 3180

agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 3240

ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 3300

atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 3360

tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 3420

cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 3480

tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 3540

tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 3600

tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 3660

tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 3720

ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 3780

tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 3840

gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 3900

gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 3960

gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat 4020

gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta 4080

tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg 4140

ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa 4200

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 4260

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 4320

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 4380

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 4440

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 4500

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 4560

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 4620

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 4680

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 4740

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 4800

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 4860

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 4920

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 4980

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 5040

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 5100

ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg gccgcggccg ccatcggcat tttcttttgc 5160

gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg 5220

ttttcttgcc tttgatgttc agcaggaagc tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt 5280

agaatcctct gtttgtcata tagcttgtaa tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta 5340

cagcgaagtg tgagtaagta aaggttacat cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa 5400

ggccagtttt gttcagcggc ttgtatgggc cagttaaaga attagaaaca taaccaagca 5460

tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga 5520

acaggtacca tttgccgttc attttaaaga cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg 5580

tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa 5640

tcataccgag agcgccgttt gctaactcag ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt 5700

tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag 5760

attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt 5820

ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt 5880

tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg 5940

atttataatc ctctacaccg ttgatgttca aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt 6000

gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac 6060

ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta 6120

ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc 6180

agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg 6240

catttttagg atctccggct aatgcaaaga cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag 6300

tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga 6360

tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt 6420

cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg 6480

gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag 6540

taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa actttttgat gttcatcgtt catgtctcct 6600

tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt 6660

tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact 6720

ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac 6780

ttttcgacct cattctatta gactctcgtt tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt 6840

gtttgataga aaatcataaa aggatttgca gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta 6900

tctgtttctt ttcattctct gtatttttta tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc 6960

tttttaatca caattcagaa aatatcataa tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg 7020

caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg gcggccgctc gatttaaatc 7070

<210>2

<211>7070

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>质粒pH373

<400>2

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttgg agaatcatga 60

cctcagcatc tgccccaagc tttaaccccg gcaagggtcc cggctcagca gtcggaattg 120

cccttttagg attcggaaca gtcggcactg aggtgatgcg tctgatgacc gagtacggtg 180

atgaacttgc gcaccgcatt ggtggcccac tggaggttcg tggcattgct gtttctgata 240

tctcaaagcc acgtgaaggc gttgcacctg agctgctcac tgaggacgct tttgcactca 300

tcgagcgcga ggatgttgac atcgtcgttg aggttatcgg cggcattgag tacccacgtg 360

aggtagttct cgcagctctg aaggccggca agtctgttgt taccgccaat aaggctcttg 420

ttgcagctca ctctgctgag cttgctgatg cagcggaagc cgcaaacgtt gacctgtact 480

tcgaggctgc tgttgcaggc gcaattccag tggttggccc actgcgtcgc tccctggctg 540

gcgatcagat ccagtctgtg atgggcatcg ttaacggcac caccaacttc atcttggacg 600

ccatggattc caccggcgct gactatgcag attctttggc tgaggcaact cgtttgggtt 660

acgccgaagc tgatccaact gcagacgtcg aaggccatga cgccgcatcc aaggctgcaa 720

ttttggcatc catcgctttc cacacccgtg ttaccgcgga tgatgtgtac tgcgaaggta 780

tcagcaacat cagcgctgcc gacattgagg cagcacagca ggcaggccac accatcaagt 840

tgttggccat ctgtgagaag ttcaccaaca aggaaggaaa gtcggctatt tctgctcgcg 900

tgcacccgac tctattacct gtgtcccacc cactggcgtc ggtaaacaag tcctttaatg 960

caatctttgt tgaagcagaa gcagctggtc gcctgatgtt ctacggaaac ggtgcaggtg 1020

gcgcgccaac cgcgtctgct gtgcttggcg acgtcgttgg tgccgcacga aacaaggtgc 1080

acggtggccg tgctccaggt gagtccacct acgctaacct gccgatcgct gatttcggtg 1140

agaccaccac tcgttaccac ctcgacatgg atgtggaaga tcgcgtgggg gttttggctg 1200

aattggctag cctgttctct gagcaaggaa tcttcctgcg tacaatccga caggaagagc 1260

gcgatgatga tgcacgtctg atcgtggtca cccactctgc gctggaatct gatctttccc 1320

gcaccgttga actgctgaag gctaagcctg ttgttaaggc aatcaacagt gtgatccgcc 1380

tcgaaaggga ctaattttac tgacatggca attgaactga acgtcggtcg taaggttacc 1440

gtcacggtac ctggatcttc tgcaaacctc ggacctggct ttgacacttt aggtttggca 1500

ctgtcggtat acgacactgt cgaagtggaa attattccat ctggcttgga agtggaagtt 1560

tttggcgaag gccaaggcga agtccctctt gatggctccc acctggtggt taaagctatt 1620

cgtgctggcc tgaaggcagc tgacgctgaa gttcctggat tgcgagtggt gtgccacaac 1680

aacattccgc agtctcgtgg tcttggctcc tctgctgcag cggcggttgc tggtgttgct 1740

gcagctaatg gtttggcgga tttcccgctg actcaagagc agattgttca gttgtcctct 1800

gcctttgaag gccacccaga taatgctgcg gcttctgtgc tgggtggagc agtggtgtcg 1860

tggacaaatc tgtctatcga cggcaagagc cagccacagt atgctgctgt accacttgag 1920

gtgcaggaca atattcgtgc gactgcgctg gttcctaatt tccacgcatc caccgaagct 1980

gtgcgccgag tccttcccac tgaagtcact cacatcgatg cgcgatttaa cgtgtcccgc 2040

gttgcagtga tgatcgttgc gttgcagcag cgtcctgatt tgctgtggga gggtactcgt 2100

gaccgtctgc accagcctta tcgtgcagaa gtgttgccta ttacctctga gtgggtaaac 2160

cgcctgcgca accgtggcta cgcggcatac ctttccggtg ccggcccaac cgccatggtg 2220

ctgtccactg agccaattcc agacaaggtt ttggaagatg ctcgtgagtc tggcattaag 2280

gtgcttgagc ttgaggttgc gggaccagtc aaggttgaag ttaaccaacc ttaggcccaa 2340

caaggaaggc ccccttcgaa tcaagaaggg ggccttatta gtgcagcaat tattcgctga 2400

acacgtgaac cttacaggtg cccggcgcgt tgagtggttt gagttccagc tggatgcggt 2460

tgttttcacc gaggctttct tggatgaatc cggcgtggat ggcgcagacg aaggctgatg 2520

ggcgtttgtc gttgaccaca aatgggcagc tgtgtagagc gagggagttt gcttcttcgg 2580

tttcggtggg gtcaaagccc atttcgcgga ggcggttaat gagcggggag agggcttcgt 2640

cgagttcttc ggcttcggcg tggttaatgc ccatgacgtg tgcccactgg gttccgatgg 2700

aaagtgcttt ggcgcggagg tcggggttgt gcattgcgtc atcgtcgaca tcgccgagca 2760

tgttggccat gagttcgatc agggtgatgt attctttggc gacagcgcgg ttgtcgggga 2820

cgcgtgtttg gaagatgagg gaggggcggg atcctctaga cccgggattt aaatcgctag 2880

cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 2940

ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 3000

aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 3060

gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 3120

actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 3180

agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 3240

ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 3300

atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 3360

tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 3420

cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 3480

tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 3540

tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 3600

tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 3660

tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 3720

ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 3780

tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 3840

gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 3900

gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 3960

gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat 4020

gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta 4080

tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg 4140

ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa 4200

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 4260

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 4320

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 4380

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 4440

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 4500

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 4560

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 4620

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 4680

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 4740

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gaaaacagcg gcgcttttat tgaacgccat atcggaccgg acgccgcgca acagcaagaa 2460

atgctgaatg ccgttggtgc acaatcgtta aacgcgctga ccggccagat tgtgccgaaa 2520

gatattcaac ttgcgacacc accgcaggtt ggcgcaccgg cgaccgaata cgccgcactg 2580

gcagaactca aggctattgc cagtcgcaat aaacgcttca cgtcttacat cggcatgggt 2640

tacaccgccg tgcagctacc gccggttatc ctgcgtaaca tgctggaaaa tccgggctgg 2700

tataccgcgt acactccgta tcaacctgaa gtctcccagg gccgccttga agcactgctc 2760

aacttccagc aggtaacgct ggatttgact ggactggata tggcctctgc ttctcttctg 2820

gacgaggcca ccgctgccgc cgaagcaatg gcgatggcga aacgcgtcag caaactgaaa 2880

aatgccaacc gcttcttcgt ggcttccgat gtgcatccgc aaacgctgga tgtggtccgt 2940

actcgtgccg aaacctttgg ttttgaagtg attgtcgatg acgcgcaaaa agtgctcgac 3000

catcaggacg tcttcggcgt gctgttacag caggtaggca ctaccggtga aattcacgac 3060

tacactgcgc ttattagcga actgaaatca cgcaaaattg tggtcagcgt tgccgccgat 3120

attatggcgc tggtgctgtt aactgcgccg ggtaaacagg gcgcggatat tgtttttggt 3180

tcggcgcaac gcttcggcgt gccgatgggc tacggtggcc cacacgcggc attctttgcg 3240

gcgaaagatg aatacaaacg ctcaatgccg ggccgtatta tcggtgtatc gaaagatgca 3300

gctggcaata ccgcgctgcg catggcgatg cagactcgcg agcaacatat ccgccgtgag 3360

aaagcgaact ccaacatttg tacttcccag gtactgctgg caaacatcgc cagcctgtat 3420

gccgtttatc acggcccggt tggcctgaaa cgtatcgcta accgcattca ccgtctgacc 3480

gatatcctgg cggcgggcct gcaacaaaaa ggtctgaaac tgcgccatgc gcactatttc 3540

gacaccttgt gtgtggaagt ggccgacaaa gcgggcgtac tgacgcgtgc cgaagcggct 3600

gaaatcaacc tgcgtagcga tattctgaac gcggttggga tcacccttga tgaaacaacc 3660

acgcgtgaaa acgtaatgca gcttttcaac gtgctgctgg gcgataacca cggcctggac 3720

atcgacacgc tggacaaaga cgtggctcac gacagccgct ctatccagcc tgcgatgctg 3780

cgcgacgacg aaatcctcac ccatccggtg tttaatcgct accacagcga aaccgaaatg 3840

atgcgctata tgcactcgct ggagcgtaaa gatctggcgc tgaatcaggc gatgatcccg 3900

ctgggttcct gcaccatgaa actgaacgcc gccgccgaga tgatcccaat cacctggccg 3960

gaatttgccg aactgcaccc gttctgcccg ccggagcagg ccgaaggtta tcagcagatg 4020

attgcgcagc tggctgactg gctggtgaaa ctgaccggtt acgacgccgt ttgtatgcag 4080

ccgaactctg gcgcacaggg cgaatacgcg ggcctgctgg cgattcgtca ttatcatgaa 4140

agccgcaacg aagggcatcg cgatatctgc ctgatcccgg cttctgcgca cggaactaac 4200

cccgcttctg cacatatggc aggaatgcag gtggtggttg tggcgtgtga taaaaacggc 4260

aacatcgatc tgactgatct gcgcgcgaaa gcggaacagg cgggcgataa cctctcctgt 4320

atcatggtga cttatccttc tacccacggc gtgtatgaag aaacgatccg tgaagtgtgt 4380

gaagtcgtgc atcagttcgg cggtcaggtt taccttgatg gcgcgaacat gaacgcccag 4440

gttggcatca cctcgccggg ctttattggt gcggacgttt cacaccttaa cctacataaa 4500

actttctgca ttccgcacgg cggtggtggt ccgggtatgg gaccgatcgg cgtgaaagcg 4560

catttggcac cgtttgtacc gggtcatagc gtggtgcaaa tcgaaggcat gttaacccgt 4620

cagggcgcgg tttctgcggc accgttcggt agcgcctcta tcctgccaat cagctggatg 4680

tacatccgca tgatgggcgc agaagggctg aaaaaagcaa gccaggtggc aatcctcaac 4740

gccaactata ttgccagccg cctgcaggat gccttcccgg tgctgtatac cggtcgcgac 4800

ggtcgcgtgg cgcacgaatg tattctcgat attcgcccgc tgaaagaaga aaccggcatc 4860

agcgagctgg atattgccaa gcgcctgatc gactacggtt tccacgcgcc gacgatgtcg 4920

ttcccggtgg cgggtacgct gatggttgaa ccgactgaat ctgaaagcaa agtggaactg 4980

gatcgcttta tcgacgcgat gctggctatc cgcgcagaaa ttgaccaggt gaaagccggt 5040

gtctggccgc tggaagataa cccgctggtg aacgcgccgc acattcagag cgaactggtc 5100

gccgagtggg cgcatccgta cagccgtgaa gttgcggtat tcccggcagg tgtggcagac 5160

aaatactggc cgacagtgaa acgtctggat gatgtttacg gcgaccgtaa cctgttctgc 5220

tcctgcgtac cgattagcga ataccagtaa ttcactgatt cgactatttt ctaaaggcgc 5280

ttcggcgcct ttttagtcag atgacaaagt acaaaagtgc tcagacagtc ccctcgccgg 5340

atccgccctc ccgcaaagcg tgcgggaggg cggtacctgc gcgttcctat ttccctgaag 5400

ttgtcaccac tcatacatgg gaagagcgcc gcgaaacttt gcgcctggtg gcagaagctg 5460

gaatggaagt ctgttccggc ggaatcttag gaatgggcga aactttagag cagcgcgccg 5520

agtttgccgt gcagctggcg gagcttgatc cgcacgaagt ccccatgaac ttccttgatc 5580

ctcgcccggg caccccattt gccgataggg aattgatgga cagccgtgac gctctgcgct 5640

ctattggtgc gttccgcctt gcgatgcctc acaccatgct tcgttttgct ggcggtcgcg 5700

agctgacttt gggcgacaag ggttccgagc aagccctcct gggaggcatc aatgcgatga 5760

tcgtcggaaa ctacctgact acgctcggcc gcccaatgga agatgacctc gacatgatgg 5820

atcgtctcca gctgcccatc aaagtcctta ataaggacgc gtcccgggat ttaaatcgct 5880

agcgggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc 5940

ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa 6000

gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt tatggacagc 6060

aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 6120

aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca 6180

agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 6240

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 6300

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 6360

cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 6420

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 6480

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 6540

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 6600

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 6660

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 6720

caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 6780

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 6840

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 6900

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 6960

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa 7020

atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc 7080

tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc 7140

Claims

1.用于确定甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法，其中所述方法包括以下步骤

a.基于已知的甲硫氨酸合成相关代谢路径，通过多种参数对初始甲硫氨酸合成生物的代谢通量进行参数化；

b.通过修饰多个参数的至少一个和/或引入至少一个其他的此类参数，使甲硫氨酸合成效率与初始甲硫氨酸合成生物的甲硫氨酸合成效率相比提高，从而确定甲硫氨酸合成效率增加的生物的理论模型。

2.确定甲硫氨酸合成效率增高的生物的装置，所述装置包括适于实施以下方法步骤的处理器

a.基于已知的甲硫氨酸合成相关代谢路径，通过多种参数对初始甲硫氨酸合成野生型生物的代谢通量进行参数化；

b.通过修饰所述参数的至少一个和/或引入至少一个其他的此类参数，使甲硫氨酸合成效率与初始甲硫氨酸合成生物的甲硫氨酸合成效率相比提高，从而确定甲硫氨酸合成效率增加的生物的理论模型。

3.计算机可读的介质，其中储存有用于确定甲硫氨酸合成效率增高的生物的计算机程序，所述计算机可读介质当由处理器执行时，适于实施以下方法步骤

4.用于确定甲硫氨酸合成效率增高的生物的程序单元，所述单元由处理器执行时，适于实施以下方法步骤

5.用于生产相对于起始生物其甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法，所述生物选自原核生物、低等真核生物及植物，包括以下步骤

b.通过修饰所述参数的至少一个和/或引入至少一个其他的此类参数，使甲硫氨酸合成效率与初始甲硫氨酸合成生物的甲硫氨酸合成效率相比提高，从而确定甲硫氨酸合成效率增加的生物的理论模型；

c.遗传修饰起始生物，从而修饰生物中至少一条存在的代谢通路，使该生物的代谢通量接近该生物的理论模型，和/或

d.遗传修饰起始生物，从而在生物中引入至少一个外源的代谢通路，使该生物的代谢通量接近该生物的理论模型，和/或

e.提供至少一个外部的代谢产物，使所述代谢产物的量足以将代谢通量引入在步骤c中被修饰的和/或在步骤d中被引入的代谢通路中。

6.权利要求5的方法，其中通过对生物进行遗传修饰以修饰通过至少一条存在的代谢通路的代谢通量，所述代谢通路选自以下组成的组，

磷酸转移酶体系(PTS)

磷酸戊糖通路(PPP)

糖酵解(EMP)

三羧酸循环(TCA)

乙醛酸支路(GS)

回补(AP)

呼吸链(RC)

硫同化(SA)

甲硫氨酸合成(MS)

丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)

甘氨酸裂解体系(GCS)

转氢酶转化(THGC)

通路1(P1)

通路2(P2)

通路3(P3)

通路4(P4)

通路5(P5)

通路6(P6)

通路7(P7)

通路8(P8)，

和/或通过遗传修饰该生物引入至少一条外源性代谢通路的代谢通量，所述代谢通路选自以下组成的组，

甘氨酸裂解体系(GCS)

转氢酶转化(THGC)

硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)

亚硫酸盐还原酶体系(SRS)

硫酸盐还原酶体系(SARS)

甲酸盐转化体系(FCS)

甲硫醇转化体系(MCS)，

和/或在外部代谢物存在下培养生物，所述外部代谢物选自以下组成的组，

硫酸盐

亚硫酸盐

硫化物

硫代硫酸盐

C1-代谢物如甲酸盐、甲醛、甲醇、甲硫醇或其二聚体二甲基二硫醚。

7.用于生产相对于起始生物其甲硫氨酸合成效率增高的生物的方法，所述生物选自原核生物、低等真核生物及植物，该方法包括以下步骤

a.通过遗传修饰该生物来修饰通过至少一条代谢通路的代谢通量，所述代谢通路选自以下组成的组，

磷酸转移酶体系(PTS)

磷酸戊糖通路(PPP)

糖酵解(EMP)

三羧酸循环(TCA)

乙醛酸支路(GS)

回补(AP)

呼吸链(RC)

硫同化(SA)

甲硫氨酸合成(MS)

丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)

甘氨酸裂解体系(GCS)

转氢酶转化(THGC)

通路1(P1)

通路2(P2)

通路3(P3)

通路4(P4)

通路5(P5)

通路6(P6)

通路7(P7)

通路8(P8)

和/或

b.通过遗传修饰该生物引入至少一种外源性代谢通路的代谢通量，所述代谢通路选自以下组成的组

甘氨酸裂解体系(GCS)

转氢酶转化(THGC)

硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)

亚硫酸盐还原酶体系(SRS)

硫酸盐还原酶体系(SARS)

甲酸盐转化体系(FCS)

甲硫醇转化体系(MCS)，

和/或

c.在至少一种外部代谢物的存在下培养该生物，所述外部代谢物选自以下组成的组

硫酸盐

亚硫酸盐

硫化物

硫代硫酸盐

有机硫源

8.通过权利要求5至7的任一方法可获得的相对于起始生物其甲硫氨酸合成效率增高的生物，所述生物选自原核生物、低等真核生物及植物。

9.权利要求8的生物，其中所述生物选自棒杆菌属、短杆菌属、埃希菌属的微生物、酵母及植物组成的组。

10.产生甲硫氨酸合成效率增高的棒杆菌属微生物的方法，其包括以下步骤

a.通过对生物遗传修饰，相对于起始生物增加和/或引入经过至少一条通路的代谢通量，所述通路选自以下组成的组：

磷酸转移酶体系(PTS)和/或

磷酸戊糖通路(PPP)和/或

硫同化(SA)和/或

回补(AP)和/或

甲硫氨酸合成(MS)和/或

丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)和/或

甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

转氢酶转化(THGC)和/或

通路1(P1)和/或

通路2(P2)和/或

硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

甲酸盐转化体系(FCS)和/或

甲硫醇转化体系(MCS)

和/或

b.通过对生物遗传修饰，相对于起始生物至少部分的降低经过至少一条通路的代谢通量，所述通路选自以下组成的组：

糖酵解(EMP)和/或

三羧酸循环(TCA)和/或

乙醛酸支路(GS)和/或

呼吸链(RC)和/或

R19和/或

R35和/或

R79和/或

通路3(P3)和/或

通路4(P4)和/或

通路7(P7)。

11.权利要求10的方法，其中相对于起始生物增加和/或引入选自以下组成的组的酶的量和/或酶的活性：

R1，以产生更多G6P和/或

R3，以产生更多GLC-LAC和/或

R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

R5，以产生更多RIB-5P和/或

R6，以产生更多XYL-5P和/或

R7，以产生更多RIBO-5P和/或

R8，以产生更多S7P和GA3P和/或

R9，以产生更多E-4p和F6P和/或

R10，以产生更多F6P和GA3P和/或

R2，以产生更多G6P和/或

R55，以产生更多H₂SO₃和/或

R58，以产生更多H₂S和/或

R71，以产生更多M-HPL和/或

R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

R70，以产生更多NADPH和/或

R81，以产生更多NADPH和/或

R25，以产生更多谷氨酸和/或

R33和/或R36，以产生更多OAA和/或

R30，以产生更多MAL和/或

R57，以产生更多Pyr和/或

R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

R82，将更多外部硫代硫酸盐运输进入细胞和/或

R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

R75，以产生更多10-甲酰-THF和/或

R76，以产生更多亚甲基-THF和/或

R78，以产生更多甲基-THF和/或

R77，以使用甲硫醇来甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

R47和/或

R48和/或

R39和/或

R46和/或

R49和/或

R52和/或

R54

和/或，相对于起始生物至少部分的减少选自以下组成的组的酶的量和/或酶的活性：

R11，以产生更少F-1，6-BP和/或

R13，以产生更少DHAP和GA3P和/或

R14，以产生更少GA3P和/或

R15，以产生更少1，3-PG和/或

R16，以产生更少3-PG和/或

R17，以产生更少2-PG和/或

R18，以产生更少PEP和/或

R19，以产生更少Pyr和/或

R20，以产生更少Ac-CoA和/或

R21，以产生更少CIT和/或

R22，以产生更少顺式-ACO和/或

R23，以产生更少ICI和/或

R24，以产生更少2-OXO和/或

R26，以产生更少SUCC-CoA和/或

R27，以产生更少SUCC和/或

R28，以产生更少FUM和/或

R29，以产生更少MAL和/或

R30，以产生更少OAA和/或

R21，以产生更少CIT和/或

R22，以产生更少顺式-ACO和/或

R23，以产生更少ICI和/或

R31，以产生更少GLYOXY和SUCC和/或

R32，以产生更少MAL和/或

R28，以产生更少FUM和/或

R29，以产生更少MAL和/或

R30，以产生更少OAA和/或

R60和/或

R56和/或

R62和/或

R61和/或

R19和/或

R35和/或

R79。

12.权利要求11的方法，其中相对于起始生物增加和/或引入选自以下组成的组的酶的量和/或酶的活性：

R3，以产生更多GLC-LAC和/或

R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

R5，以产生更多RIB-5P和/或

R10，以产生更多F6P和GA3P和/或

R2，以产生更多G6P和/或

R55，以产生更多H₂SO₃和/或

R58，以产生更多H₂S和/或

R71，以产生更多M-HPL和/或

R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

R70，以产生更多NADPH和/或

R81，以产生更多NADPH和/或

R25，以产生更多谷氨酸和/或

R33和/或R36，以产生更多OAA和/或

R30，以产生更多MAL和/或

R57，以产生更多Pyr和/或

R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

R82，已将更多的外源硫代硫酸盐运输进入细胞和/或

R75，以产生10-甲酰-THF和/或

R76，以产生更多亚甲基-THF和/或

R78，以产生更多甲基-THF和/或

R77，以使用甲硫醇甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

R47和/或

R48和/或

R39和/或

R46和/或

R49和/或

R52和/或

R54和/或

R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

相对于起始生物至少部分的减少选自以下组成的组的酶的量和/或酶的活性：

R11，以产生更少F-1，6-BP和/或

R19，以产生更少Pyr和/或

R20，以产生更少Ac-CoA和/或

R21，以产生更少CIT和/或

R24，以产生更少2-OXO和/或

R26，以产生更少SUCC-CoA和/或

R27，以产生更少SUCC和/或

R31，以产生更少GLYOXY和SUCC和/或

R32，以产生更少MAL和/或

R19，以产生更少丙酮酸和/或

R35，以产生更少PEP和/或

R79，以产生更少THF。

13.权利要求11的方法，其中相对于起始生物增加和/或引入选自以下组成的组的酶的量和/或酶的活性：

R3，以产生更多GLC-LAC和/或

R4，以产生更多6-P-葡萄糖酸盐和/或

R5，以产生更多RIB-5P和/或

R10，以产生更多F6P和GA3P和/或

R2，以产生更多G6P和/或

R55，以产生更多H₂SO₃和/或

R58，以产生更多H₂S和/或

R71，以产生更多M-HPL和/或

R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

R78，以产生更多甲基-THF和/或

R70，以产生更多NADPH和/或

R81，以产生更多NADPH和/或

R25，以产生更多谷氨酸和/或

R33和/或R36，以产生更多OAA和/或

R30，以产生更多MAL和/或

R57，以产生更多Pyr和/或

R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

R82，已将更多的外源硫代硫酸盐运输进入细胞和/或

R75，以产生10-甲酰-THF和/或

R76，以产生亚甲基-THF和/或

R77，以使用甲硫醇来甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

R47和/或

R48和/或

R39和/或

R46和/或

R49和/或

R52和/或

R54和/或

R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

R11，以产生更少F-1，6-BP和/或

R19，以产生更少Pyr和/或

R20，以产生更少Ac-CoA和/或

R21，以产生更少CIT和/或

R24，以产生更少2-OXO和/或

R26，以产生更少SUCC-CoA和/或

R27，以产生更少SUCC和/或

R31，以产生更少GLYOXY和SUCC和/或

R32，以产生更少MAL和/或

R19，以产生更少丙酮酸和/或

R35，以产生更少PEP和/或

R79，以产生更少THF。

14.通过权利要求10-13的任一方法得到的棒杆菌属微生物，优选所述微生物选自嗜醋酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、嗜醋棒杆菌、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、百合棒杆菌、嗜氮川棒杆菌或某种棒杆菌，且优选谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、醋谷棒杆菌ATCC 15806、嗜醋酸棒杆菌ATCC 13870、嗜热棒杆菌FERM BP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965、谷氨酸棒杆菌KFCC10065或谷氨酸棒杆菌ATCC21608及谷氨酸棒杆菌DSM 17322。

15.用于产生甲硫氨酸生产效率增加的埃希菌属微生物的方法，其包括以下步骤

通过对生物进行遗传修饰，相对于起始生物增加和/或引入经至少一条通路的代谢通量，所述通路选自以下组成的组：

磷酸转移酶体系(PTS)和/或

糖酵解(EMP)和/或

三羧酸循环(TCA)和/或

乙醛酸支路(GS)和/或

通路1(P1)和/或

硫同化(SA)和/或

回补(AP)和/或

甲硫氨酸合成(MS)和/或

丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸(SCGS)和/或

甘氨酸裂解体系(GCS)和/或

转氢酶转化(THGC)和/或

硫代硫酸盐还原酶体系(TRS)和/或

亚硫酸盐还原酶体系(SRS)和/或

硫酸盐还原酶体系(SARS)和/或

甲酸盐转化体系(FCS)和/或

甲硫醇转化体系(MCS)和/或

丝氨酸/半胱氨酸/甘氨酸合成(SCGS)

和/或，通过对生物进行遗传修饰，相对于起始生物至少部分的减少经至少一条通路的代谢通量，所述通路选自以下组成的组：

磷酸戊糖通路(PPP)和/或

R19，以产生更少丙酮酸盐和/或

R35，以产生更少PEP和/或

R79，以产生更少THF

通路3(P3)和/或

通路4(P4)和/或

通路7(P7)。

16.权利要求15的方法，其中相对于起始生物增加和/或引入酶的量和/或活性，所述酶选自以下组成的组：

R1，以产生更多G6P和/或

R2，以产生更多F6P和/或

R11，以产生更多F-1，6-BP和/或

R13，以产生更多DHAP和GA3P和/或

R14，以产生更多GA3P和/或

R15，以产生更多1，3-PG和/或

R16，以产生更多3-PG和/或

R17，以产生更多2-PG和/或

R18，以产生更多PEP和/或

R19，以产生更多Pyr和/或

R20，以产生更多Ac-CoA和/或

R21，以产生更多CIT和/或

R22，以产生更多顺式-ACO和/或

R23，以产生更多ICI和/或

R24，以产生更多2-OXO和/或

R26，以产生更多SUCC-CoA和/或

R27，以产生更多SUCC和/或

R28，以产生更多FUM和/或

R29，以产生更多MAL和/或

R30，以产生更多OAA；和/或

R21，以产生更多CIT和/或

R22，以产生更多顺式-ACO和/或

R23，以产生更多ICI和/或

R31，以产生更多GLYOXY和SUCC和/或

R32，以产生更多MAL和/或

R28，以产生更多FUM和/或

R29，以产生更多MAL和/或

R30，以产生更多OAA和/或

R25，以产生更多谷氨酸和/或

R55，以产生更多H₂SO₃和/或

R58，以产生更多H₂S和/或

R71，以产生更多M-HPL和/或

R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

R78，以产生更多甲基-THF和/或

R70，以产生更多NADPH和/或

R81，以产生更多NADPH和/或

R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

R82，以将更多外部硫代硫酸盐运输进入细胞和/或

R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

R75，以产生更多10-甲酰-THF和/或

R76，以从10-甲酰-THF产生更多亚甲基-THF和/或

R77，以使用甲硫醇来甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

R44，以产生更多O-Ac-SER和/或

R45，以产生更多CYS

和/或，相对于起始生物至少部分减少酶的量和/或活性，所述酶选自以下组成的组：

R3，以产生更少GLC-LAC和/或

R4，以产生更少6-P-葡萄糖酸盐和/或

R5，以产生更少RIB-5P和/或

R6，以产生更少XYL-5P和/或

R7，以产生更少RIBO-5P和/或

R8，以产生更少S7P和GA3P和/或

R9，以产生更少E-4p和F6P和/或

R10，以产生更少F6P和GA3P和/或

R2，以产生更少G6P和/或

R49，以产生更少HOMOCYS和/或

R19，以产生更少丙酮酸和/或

R35，以产生更少PEP和/或

R79，以产生更少THF和/或

R56和/或

R62和/或

R61。

17.权利要求16的方法，其中相对于起始生物增加和/或引入酶的量和/或活性，所述酶选自以下组成的组：

R1，以产生更多G6P和/或

R2，以产生更多F6P和/或

R11，以产生更多F-1，6-BP和/或

R19，以产生更多Pyr和/或

R20，以产生更多Ac-CoA和/或

R21，以产生更多CIT和/或

R24，以产生更多2-OXO和/或

R26，以产生更多SUCC-CoA和/或

R31，以产生更多GLYOXY和SUCC和/或

R32，以产生更多MAL和/或

R25，以产生更多谷氨酸和/或

R55，以产生更多H₂SO₃和/或

R58，以产生更多H₂S和/或

R71，以产生更多M-HPL和/或

R72，以产生更多亚甲基-THF和/或

R78，以产生更多甲基-THF和/或

R70，以产生更多NADPH和/或

R81，以产生更多NADPH和/或

R73，以将硫代硫酸盐代谢为硫化物和亚硫酸盐和/或

R82，以将更多外部硫代硫酸盐运输进入细胞和/或

R74，以将亚硫酸盐代谢为硫化物和/或

R75，以产生更多10-甲酰-THF和/或

R76，以产生更多亚甲基-THF和/或

R77，以使用甲硫醇来甲基巯基化O-乙酰-高丝氨酸和/或

R80，以将硫酸盐代谢为亚硫酸盐和/或

R44，以产生更多O-Ac-SER和/或

R45，以产生更多CYS

R3，以产生更少GLC-LAC和/或

R4，以产生更少6-P-葡萄糖酸盐和/或

R5，以产生更少RIB-5P和/或

R10，以产生更少F6P和GA3P和/或

R19，以产生更少丙酮酸盐和/或

R35，以产生更少PEP和/或

R79，以产生更少THF。

18.可通过权利要求15至17的任一方法得到的埃希菌属的微生物，优选选自大肠杆菌组成的组。

19.权利要求8、9、14或18的生物，其特征在于其产生甲硫氨酸具有的甲硫氨酸与葡萄糖输入的摩尔比率为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％。

20.权利要求8、9、14、18或19的任一项的生物在生产甲硫氨酸中的用途。

21.生产甲硫氨酸的方法，其包括以下步骤：

a.培养权利要求8、9、14、18或19的生物，

b.分离甲硫氨酸。

22.权利要求21的方法，其中在合适的培养基和任选的硫代硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物和/或C1-化合物例如甲酸盐或甲硫醇中进行培养。