CN102149823A - 具有用于钴(i)胺素依赖性甲硫氨酸合酶的再激活系统的微生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于通过再激活MetH酶来产生甲硫氨酸的微生物和方法。

Description

具有用于钴(I)胺素依赖性甲硫氨酸合酶的再激活系统的微生物

发明领域

本发明涉及用于产生甲硫氨酸的微生物。本发明特别是涉及棒状细菌如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutanicum)和埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌(Eschericia coli)，它们已经被遗传修饰以产生甲硫氨酸。

发明背景

目前，甲硫氨酸在世界范围的年生产是约500,000吨。甲硫氨酸是禽类家畜和饲料中的第一种限制性氨基酸，并且因为这个原因，其主要作为饲料补充物应用。

与其他工业氨基酸相反，甲硫氨酸几乎独有地作为由化学合成产生的D-和L-甲硫氨酸的外消旋物进行应用。由于动物可以代谢甲硫氨酸的两种立体异构体，可以直接饲喂化学产生的外消旋混合物(D′Mello和Lewis，Effect of Nutrition Deficiencies in Animals：Amino Acids，Rechgigl(编著)，CRC Handbook Series in Nutrition and Food，441-490，1978)。

然而，在以独有地产生L-甲硫氨酸的生物技术方法来替代现有化学生产法方面仍存在巨大的兴趣。这是由于以下事实：在较低的补充水平上，L-甲硫氨酸是比D-甲硫氨酸更好的硫氨基酸来源(Katz和Baker(1975)Poult.Sci.545：1667-74)。1667-74)。另外，化学方法使用相当有害的化学品并产生大量的废物流。化学生产的全部这些缺点都可以通过高效生物技术方法来避免。

精细化学品如氨基酸、芳族化合物、维生素和辅因子的发酵生产如今一般在微生物中进行，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizzosaccharomycs pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

氨基酸如谷氨酸因而使用发酵方法产生。已经证明某些微生物如大肠杆菌(E.coli)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)对于这些目的是特别合适的。通过发酵产生氨基酸也具有以下优点：仅产生L-氨基酸并且避免了造成环境问题的化学品如溶剂，因为它们一般用于化学合成中。

现有技术中一些在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中产生精细化学品如氨基酸、脂类、维生素或糖类的尝试已经试着通过例如增加涉及相应精细化学品生物合成途径的基因的表达来实现这个目标。

通过上调涉及例如赖氨酸产生的生物合成途径的基因表达而增加赖氨酸产生的尝试例如在WO 02/10209、WO 2006008097、WO2005059093或Cremer等人(Appl.Environ.Microbiol，(1991)，57(6)，1746-1752)中描述。

然而，在鉴定代谢途径中可以用来有益地影响微生物如谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸产生的其他靶方面存在着持续的兴趣。

发明目的和概述

本发明的一个目的是提供在微生物中生产L-甲硫氨酸的方法。

本发明的又一个目的是提供生产L-甲硫氨酸的微生物。

将在后续描述中变得明显的本发明的这些及其他目的是通过独立权利要求的主题来达成的。

本发明的一些优选的实施方案在从属权利要求中阐述。

根据本发明的一个方面，考虑了在微生物中生产L-甲硫氨酸的方法，该方法包括培养微生物的步骤，所述微生物通过遗传修饰而衍生自起始生物体，从而所述微生物与所述起始生物体相比具有增加量和/或活性的钴(I)胺素依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)再激活系统。

所述方法可以利用选自包含肠杆菌属(Eneterobacteria)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)微生物的组中的微生物。特别优选使用物种谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。

在本发明生产甲硫氨酸的优选方法之一中，使用了钴(I)胺素依赖性再激活系统，其使用：

至少一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段；和/或

至少一种电子转移还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段。

在这些方法中，所述钴(I)胺素依赖性再激活系统的量和/或活性的增加可以通过增加所述至少一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段或所述至少一种电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性来实现。钴(I)胺素依赖性再激活系统的量和/或活性也可以通过增加至少所述一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段以及所述一种电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性来增加。任意前述因子的量和/或活性增加均可以通过与起始微生物的比较来进行判断。

在一些优选的实施方案中，电子传递蛋白将选自包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的组。电子传递蛋白还原酶将选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的组。

在本说明书中，特定蛋白可以通过编码该蛋白的基因的名称来提及。例如，“fdxC”可以指基因fdxC或由基因fdxC所编码的蛋白。

电子转移蛋白的典型例子包括例如谷氨酸棒杆菌的铁氧还蛋白，即fdxC(SEQ ID No.：1和2)、fdxD(SEQ ID No.：3和4)、fdxA(SEQ ID No.：5和6)、其功能性同系物和/或功能性片段。在大肠杆菌的情形中，电子传递蛋白包括例如fldA(SEQ ID No.：7和8)、fldB(SEQ ID No.：9和10)、其功能性同系物和/或功能性片段。

在例如谷氨酸棒杆菌的情形中，电子转移蛋白还原酶的典型例子将是fprA1(SEQ ID No.：11和12)，fprA2(SEQ ID No.：13和14)、fprA3(SEQ IDNo.：15和16)、fldR1(SEQ ID No.：17和18)、其功能性同系物和/或功能性片段。在例如大肠杆菌的情形中，电子转移蛋白还原酶的典型例子将是fldR(SEQ ID No.：19和20)、其功能性同系物和/或功能性片段。

前述电子转移蛋白和/或电子转移蛋白还原酶的量和/或活性的增加可以通过如下方式实现，即依靠将各自微生物内存在的因子的量和/或活性增加到超过这些因子的内源水平或者依靠源自所讨论微生物之外的其他来源的这些蛋白质。

本发明方法的上述实施方案优选通过培养棒杆菌属和埃希氏菌属的微生物来进行。可特别优选培养谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。可以向例如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌的野生型菌株中引入上述遗传修饰。在一些优选的实施方案中，将向例如已被视为甲硫氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌菌株中引入遗传改变。

另一方面，本发明涉及微生物，该微生物已经通过遗传修饰而衍生自起始微生物以产生增加量和/或活性的钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统。

这些微生物可以进一步表征为：这种钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统包含至少一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段，和/或至少一种电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段。

在这些微生物中，钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的增加可以通过增加至少一种所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段或者至少一种所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性来实现。

在另一个优选的实施方案中，微生物将被修饰以显示出至少一种所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段以及所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性的增加。

一般而言，为评价前述因子的量和/或活性的增加，进行相对于起始微生物的比较。

微生物可以选自前述的组，该组包含肠杆菌属、棒杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属和链霉菌属。物种谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌可以再次是特别优选的。

就电子转移蛋白而言，它可以选自包含黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的组。对于谷氨酸棒杆菌，可以考虑前述包含fdxC、fdxD和fdxA以及它们的同系物和/或片段的组。在大肠杆菌的情形中，可以考虑fldA和fldB以及它们的功能性同系物和/或功能性片段。

就电子传递蛋白还原酶而言，它可以选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶、其功能性同系物和功能性片段的组。在谷氨酸棒杆菌中，可以考虑fprA1、fprA2、fprA3、fldR1、其功能性同系物和/或功能性片段。在大肠杆菌中，可以考虑fldR、其功能性同系物和/或功能性片段。前述因子的量和/或活性的增加可以通过如下方式实现，即将微生物内内源存在的因子的量和/或活性增加至超过其内源水平或引入来自其他来源的这些因子。

本发明还涉及前述微生物用于产生甲硫氨酸的用途。该微生物可以优选衍生自棒杆菌属和埃希氏菌属。特别优选物种谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。可以在例如谷氨酸棒杆菌和/或大肠杆菌的野生型菌株中或在已被视为甲硫氨酸生产菌株的菌株中引入遗传改变。类似原理适用于其他微生物。

发明详述

本发明涉及产生L-甲硫氨酸的方法，包括培养经遗传修饰的微生物和任选地分离甲硫氨酸的步骤。本发明也涉及能够产生L-甲硫氨酸的经遗传修饰的微生物。

本发明基于以下发现：不仅可以通过增加钴(I)胺素依赖性MetH的量和/或活性，还可以通过增加用于钴(I)胺素依赖性MetH的再激活系统的量和/或活性来增加微生物中的甲硫氨酸产生。

在甲硫氨酸的常规生物合成中，甲基从5-甲基四氢叶酸由统称为甲硫氨酸合酶的酶转移至高半胱氨酸的步骤是限速步骤。

甲硫氨酸合酶可以划分为钴(I)胺素依赖性甲硫氨酸合酶I(前述MetH，EC 2.1.1.13)和钴(I)胺素非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE，EC 2.1.1.14)。就钴(I)胺素依赖性甲硫氨酸合酶MetH而言，已经观察到与MetH结合的钴(I)胺素辅因子被氧化成钴(II)胺素(见例如Hall等人(2000)，Biochemistry，39，10，711-719)。

令人惊讶地，本发明人发现钴(II)胺素结合的MetH到钴(I)胺素结合的MetH的钴(I)胺素的还原增加可以导致微生物中甲硫氨酸合成增加。

在大肠杆菌中，钴(I)胺素依赖性MetH的再激活由以下来介导，即向还原性再甲基化供应还原等价物的黄素氧还蛋白以及向再循环黄素氧还蛋白供应还原等价物的NADPH:黄素氧还蛋白氧化还原酶(出于本发明的目的，其又命名为黄素氧还蛋白还原酶)。令人惊讶地，本发明人发现衍生自大肠杆菌的这种再激活系统可以用于棒状细菌如其中钴(I)胺素依赖性MetH的再激活迄今未知的谷氨酸棒杆菌。另外，本发明人已经鉴定出内源性存在于棒状细菌如谷氨酸棒杆菌中的再激活系统。

在详细描述本发明的示例性实施方案之前，提供以下定义。

如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”也包括相应复数形式，除非上下文另外明确说明。

术语“约”和“大约”在本发明通常指本领域技术人员将会理解的精确度的水平或区间从而仍确保所讨论特征的技术效果。就数值而言，这些术语一般表示与所示数值偏离±10％并且优选偏离±5％。

应当理解术语“包含”不是限制性的。出于本发明的目的，将术语“由……组成”视为术语“包含”的优选实施方案。如果下文将一个组定义为包含至少某个数目的实施方案，则这意味它也公开了优选仅由这些实施方案组成的组。

类似地，如果在本发明中将一个组定义为包含“至少一个”实施方案，则这意味它也公开了优选由具体提到的一个实施方案所组成的组。

出于本发明的目的，术语“微生物”指原核生物和低等真核生物。

本发明的微生物因而包含如本领域已知用于产生精细化学品如氨基酸、维生素、酶辅因子等的微生物。它们可以选自如下的组，其包含肠杆菌属、棒杆菌属且优选其谷氨酸棒杆菌、埃希氏菌属且优选其大肠杆菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella，)、芽孢杆菌属且优选其枯草芽孢杆菌、短杆菌属(Brevibacterium)、放线细菌属(actinobacteria)、蓝细菌属(cyanobacteria)、变形菌门(proteobacteria)、盐杆菌属(halobacteria)、甲烷球菌纲(methanococci)、分枝杆菌属(mycobacteria)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、链霉菌属(streptomyceae)、酵母属(Saccharomyces)及优选其酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)及优选其粟酒裂殖酵母(S.Pombe)、毕赤酵母属(Pichia)及优选其巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、阿舒囊霉属(Ashbya)和曲霉属(Aspergillus)。

本发明的优选的实施方案涉及使用选自棒状细菌如棒杆菌属细菌的微生物。特别优选的物种有：谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)和Corynebacterium effiziens。

在本发明的优选实施方案中，宿主细胞可以选自如下组，其包含谷氨酸棒杆菌ATCC13032、醋谷棒杆菌ATCC15806、嗜乙酸棒杆菌ATCC13870、热产氨棒杆菌FERMBP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、Corynebacteriumeffiziens DSM 44547、Corynebacterium effiziens DSM 44549、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactoformentum)ATCC13869、叉枝短杆菌(Brevibacterium divarecatum)ATCC14020、谷氨酸棒杆菌KFCC10065和谷氨酸棒杆菌ATCC21608以及其通过例如经典诱变与选择或通过定向诱变所衍生的菌株。

其他特别优选的谷氨酸棒杆菌菌株可以选自如下组，其包含ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC21492、ATCC21513、ATCC21526、ATCC21543、ATCC13287、ATCC21851、ATCC21253、ATCC21514、ATCC21516、ATCC21299、ATCC21300、ATCC39684、ATCC21488、ATCC21649、ATCC21650、ATCC19223、ATCC13869、ATCC21157、ATCC21158、ATCC21159、ATCC21355、ATCC31808、ATCC21674、ATCC21562、ATCC21563、ATCC21564、ATCC21565、ATCC21566、ATCC21567、ATCC21568、ATCC21569、ATCC21570、ATCC21571、ATCC21572、ATCC21573、ATCC21579、ATCC19049、ATCC19050、ATCC19051、ATCC19052、ATCC19053、ATCC19054、ATCC19055、ATCC19056、ATCC19057、ATCC19058、ATCC19059、ATCC19060、ATCC19185、ATCC13286、ATCC21515、ATCC21527、ATCC21544、ATCC21492、NRRL B8183、NRRL W8182、B12NRRLB12416、NRRLB12417、NRRLB12418和NRRLB11476。

缩写KFCC代表Korean Federaion of Culture Collection，ATCC代表American-Type Strain Culture Collection以及缩写DSM代表DeutscheSammlung von Mikroorganismen。缩写NRRL代表ARS cultures collectionNorthern Regional Research Laboratory，Peorea，IL，USA。

在本发明中，术语“再激活系统”指酶活性组合，其还原钴(II)胺素并允许钴(I)胺素依赖性MetH开始或恢复其酶活性。在本发明中，钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的增加意指形成前述再激活系统的酶活性组合的至少一种因子的量和/或活性增加，从而与未经遗传影响的潜在内源性存在的再激活系统相比确保钴(II)胺素还原成钴(I)胺素的速率和/或水平增加。

如下文将进一步详细指出的那样，钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统一般由以下组成，即优选向钴(I)胺素依赖性MetH的还原性再甲基化供应还原等价物的至少一种电子传递蛋白和优选向再循环电子转移蛋白供应还原等价物的至少一种电子传递蛋白还原酶。

本发明的电子传递蛋白可以优选选自铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、其功能性片段和/或功能性同系物的组。

本领域技术人员会知道，电子转移蛋白如铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白是否可以实际上用来增加钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的问题将取决于特定生物体。因此，下文将会显示出电子传递蛋白用于钴(I)胺素依赖性MetH的再激活的功能可以在大肠杆菌中由例如黄素氧还蛋白来达成，而在谷氨酸棒杆菌中相应的作用可以由铁氧还蛋白来达成。

根据本发明，也可称作电子传递蛋白氧化还原酶的电子传递蛋白还原酶可以选自铁氧还蛋白(氧化)还原酶的组。这些酶也可称作NADPH:铁氧还蛋白(氧化)还原酶。所述电子传递蛋白还原酶也可以选自包含黄素氧还蛋白(氧化)还原酶的组，该黄素氧还蛋白(氧化)还原酶又可以称作NADPH:黄素氧还蛋白(氧化)还原酶。当然，所述电子传递蛋白还原酶也可以选自前述还原酶的功能性同系物和/或功能性片段。

就电子传递蛋白而言，本领域技术人员会理解，例如电子转移蛋白还原酶的量和/或活性的增加是否可以用来增加钴(I)胺素MetH依赖性再激活系统的量和/或活性的问题将在某种程度上取决于特定生物体。因此，在大肠杆菌中，这种功能可以由黄素氧还蛋白(氧化)还原酶来执行，而在谷氨酸棒杆菌中，本发明显示这种功能将由铁氧还蛋白还原酶来达成。不过，可以在谷氨酸棒杆菌中通过例如过表达大肠杆菌黄素氧还蛋白和大肠杆菌黄素氧还蛋白(氧化)还原酶来建立大肠杆菌钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统，而类似地，可以在大肠杆菌中通过过表达谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白和谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白还原酶来建立谷氨酸棒杆菌钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统。

如将通过以下描述详细解释的那样，本发明主要涉及经遗传修饰以展示出某些酶的量和/或活性的增加的微生物。

术语“遗传修饰”和“遗传改变”以及它们在本发明意义范围内的语法上的变体意指微生物已通过基因技术手段修饰以表达改变量的可以在各自微生物中天然存在的一种或多种蛋白、在各自微生物中并不天然存在的一种或多种蛋白，或者与各自未修饰的微生物蛋白相比具有改变活性的一种或多种蛋白。未修饰的微生物视为“起始生物体”，其遗传改变产生了本发明的微生物。

术语“起始生物体”因此可以指生物体的野生型。在谷氨酸棒杆菌的情形中，这可以例如是ATCC13032。然而出于本发明的目的，术语“起始生物体”也可以指这样的生物体，其与各自物种的野生型生物体相比已经携带遗传改变，但是其随后被进一步遗传修饰以产生本发明的生物体。

在谷氨酸棒杆菌的情形中，起始生物体因此可以是野生型谷氨酸棒杆菌菌株如ATCC13032。然而，该起始生物体可以优选还是例如已经过工程化用于甲硫氨酸生产的谷氨酸棒杆菌菌株。

这种产甲硫氨酸的起始生物体可以例如衍生自野生型棒状细菌及优选衍生自在以下基因ask^fbr、hom^fbr和metH至少一个中含有遗传改变的野生型谷氨酸棒杆菌，其中所述遗传改变引起这些基因任一的过表达，因而相对于缺少遗传改变时所产生的甲硫氨酸，导致甲硫氨酸的生产增加。在优选的实施方案中，这种产甲硫氨酸起始生物体将同时在ask^fbr、hom^fbr和metH中含有遗传改变，因相对于缺少遗传改变时所产生的甲硫氨酸，导致甲硫氨酸的生产增加。

在这些起始生物体中，一般将ask和hom的内源性拷贝变为反馈抗性等位基因，其不再受由赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或这些氨基酸的组合所致的反馈抑制。这可以通过突变和选择来完成或者通过以突变的等位基因对所述基因的指定遗传取代来完成，其中所述突变的等位基因编码反馈抑制减弱或消除的蛋白。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌DSM17322。本领域技术人员将知道针对下文所述那些用于产生谷氨酸棒杆菌DSM17322的可选的遗传改变也可以用来实现ask^fbr、hom^fbr和metH的过表达。

出于本发明的目的，ask^fbr表示反馈抗性天冬氨酸激酶。Hom^fbr表示反馈抗性高丝氨酸脱氢酶。MetH表示维生素B12依赖性甲硫氨酸合酶。

在另一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细菌且优选衍生自在至少一个以下基因：ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)和hsk^mutated中含有遗传改变的野生型谷氨酸棒杆菌，其中所述遗传改变引起这些基因任一的过表达，因而相对于缺少遗传改变时所产生的甲硫氨酸，导致甲硫氨酸的生产增加。在优选的实施方案中，这种产甲硫氨酸的起始生物体将同时在ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)和hsk^mutated中含有遗传改变，因而相对于缺少遗传改造变所产生的甲硫氨酸，导致甲硫氨酸的生产增加。

在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝一般由ask^fbr、hom^fbr和hsk^mutated取代，如上文对ask^fbr和hom^fbr所述那样。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌M2014。本领域技术人员将知道对下文具体所述那些特异地用于产生谷氨酸棒杆菌M2014的可选的遗传改变也可以用来实现ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)和hsk^mutated的过表达。

出于本发明的目的，metA表示来自例如大肠杆菌的高丝氨酸琥珀酰转移酶。MetY表示O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。Hsk^mutated表示已经被突变以显示减弱的酶活性的高丝氨酸激酶。这可以通过在相应于具有Genbank登录号Cgl1184的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的hsk的T190的位置用丝氨酸或丙氨酸替换苏氨酸来实现。可选或另外，可以用TTG起始密码子取代ATG起始密码子。此类突变导致所得的hsk蛋白的酶活性与未突变的hsk基因相比减弱。

在另一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细菌且优选衍生自这样的野生型谷氨酸棒杆菌，其在至少一个以下基因：ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF中含有遗传改变(其中所述遗传改变引起这些基因任一的过表达)并与以下基因serA之一中减少此基因表达的遗传改变组合，其中所述组合导致了相对于缺少该组合的甲硫氨酸生产相比，该微生物的甲硫氨酸生产增加。

在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝如上文所述那样被置换。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌OM469。本领域技术人员将知道对下文具体所述那些用于产生谷氨酸棒杆菌OM469的可选的遗传改变也可以用来实现ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF的过表达以及metQ的减少表达。

在另一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细菌且优选衍生自这样的野生型谷氨酸棒杆菌，其在至少一个以下基因：ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF中含有遗传改变(其中所述遗传改变引起任一这些基因的过表达)并与至少一个以下基因：mcbR和metQ中减少任一这些基因表达的遗传改变组合，其中所述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生产增加。在优选的实施方案中，这种产甲硫氨酸的起始生物体将同时在ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF中含有引起任一这些基因过表达的遗传改变并与mcbR和metQ中减少任一这些基因表达的遗传改变，其中所述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生产增加。

在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝一般如上文所述那样被置换，而mcbR和metQ的内源性拷贝一般被功能性地破坏或缺失。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌OM469。本领域技术人员将知道对下文具体所述那些用于产生谷氨酸棒杆菌OM469的可选的遗传改变也可以用来实现ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF的过表达以及mcbR及metQ的减少表达。

出于本发明的目的，metF表示N5，10-亚甲基-四氢叶酸还原酶(EC1.5.1.20)。McbR表示硫代谢TetR-型转录调节物(Genbank登录号：AAP45010)。MetQ表示在甲硫氨酸输入中发挥功能的D-甲硫氨酸结合脂蛋白。

在又一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细菌且优选衍生自这样的野生型谷氨酸棒杆菌，其在至少一个以下基因：ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated、metF、tkt、tal、zwf和6pgl中含有遗传改变(其中所述遗传改变引起任意这些基因的过表达)且与至少一个以下基因：mcbR、metQ和sda中减少任意这些基因表达的遗传改变组合，其中所述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生产增加。在优选的实施方案中，这种产生甲硫氨酸的起始生物体将同时在ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated、metF、tkt、tal、zwf和6pgl中含有遗传改变(其中所述遗传改变引起任意这些基因的过表达)且与mcbR、metQ和sda中减少任意这些基因表达的遗传改变组合，其中所述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生产增加。

包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌GK1259。本领域技术人员将知道对下文具体所述那些用于产生谷氨酸棒杆菌GK1259的可选的遗传改变也可以用来实现ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated、metF、tkt、tal、zwf和6pgl的过表达以及mcbR、metQ及sda的减少表达。

出于本发明的目的，tkt表示转酮酶，tal表示转醛酶，zwf表示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6pgl表示6-磷酸-葡糖酸内酯酶以及sda表示丝氨酸脱氨酶(见表1)。本领域技术人员理解为了增加zwf的量和/或活性，还要增加充当zwf的结构支架蛋白的opca的量和/或活性。在GK1259中，这通过使用P_SOD启动子来实现，所述P_SOD启动子同时增加包含tkt、tal、zwf和6pgl的磷酸戊糖操纵子的转录。

如上文已经阐述的那样，本发明经遗传修饰的微生物的特征在于至少钴(I)胺素MetH再激活系统的量和/或活性增加。为此，一般增加电子传递蛋白和/或电子传递蛋白还原酶的量和/或活性。为此，可以使用例如铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶、前述因子的功能性同系物和片段。

一般地，与各自的起始生物体相比，这些因子的量在本发明的微生物中增加了至少约2％、至少约5％、至少约10％或至少约20％。在其他优选实施方案中，这些因子的量增加了至少30％、至少50％或至少75％。在涉及微生物的更优选的实施方案中，这些因子的量增加了至少约2倍、至少约5倍或至少约倍10。

与培养没有如下文所述那样经遗传修饰的各自起始生物体的情况相比，本发明的方法和微生物可以用来产生更多的甲硫氨酸。本发明的微生物和方法也可以用来提高甲硫氨酸合成的效率。

术语“甲硫氨酸合成的效率”描述了甲硫氨酸的碳产量。该效率计算为以碳底物形式进入系统的能量输入的百分数。在整个本发明中，这个值以百分值((mol甲硫氨酸)(mol碳底物)^-1×100来给出。术语“提高甲硫氨酸合成的效率”因此涉及在起始生物体与实际的棒状细菌之间的比较，其中至少一个下文所提及的酶的量和/或活性增加。

依照本发明优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。例如，选自包含葡萄糖、果糖、hanose、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素的组的糖可以充当特别优选的碳源。

本发明的方法和微生物也可以用来产生与起始生物体相比更多的甲硫氨酸。

本发明的方法和微生物也可以用来以比起始生物体更快的速率产生甲硫氨酸。例如，如果考虑常见的产生周期，则所述方法和微生物将允许以更快速度产生甲硫氨酸，即与起始生物体相比，相同量的甲硫氨酸将在更早的时间点产生。这尤其适用于对数生长期。

如果在摇瓶培育中培育该微生物，本发明的方法和微生物如谷氨酸棒杆菌允许产生至少约3g甲硫氨酸/1个培养体积。如果在摇瓶培育中培育该微生物，则可以优选是至少约4g甲硫氨酸/1个培养体积、至少约5g甲硫氨酸/1个培养体积或至少约7g甲硫氨酸/1个培养体积的滴度。如果在摇瓶培育中培育该微生物，则更优选的数量值达到至少约10g甲硫氨酸/1个培养体积以及更优选达到至少约20g甲硫氨酸/1细胞群。

如果在使用搅拌式和碳源补料发酵罐的发酵实验中培育该微生物，本发明的方法和微生物如谷氨酸棒杆菌允许产生至少约25g甲硫氨酸/1个培养体积。如果在使用搅拌式和碳源补料发酵罐的发酵实验中培育该菌株，则可以优选为至少约30g甲硫氨酸/1个培养体积、至少约35g甲硫氨酸/1个培养体积或至少约40g甲硫氨酸/1个培养体积的滴度。如果在使用搅拌式和碳源补料发酵罐的发酵实验中培育该微生物，则更优选的数量值达到至少约50g甲硫氨酸/1个培养体积以及更优选地达到至少约60g甲硫氨酸/1细胞群。

在优选的实施方案中，本发明的方法和微生物(如谷氨酸棒杆菌)与起始生物体相比允许甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或甲硫氨酸合成的滴度和/或速率提高至少约2％、至少约5％、至少约10％或至少约20％。在优选的实施方案中，与起始生物体相比，甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或滴度和/或速率增加至少约30％、至少约40％或至少约50％。更优选的是增加至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍和至少约10倍。

术语“标准条件”是指在标准培养基中培养微生物，该标准培养基中对于特定的化合物而言没有富集。温度、pH和培育时间可以变动，将在下文更详细地描述。

微生物的标准培养条件可以取自文献，包括教材如“Sambrook&Russell，Molecular Cloning-A Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory Press，3版(2001)”。

“极限培养基”是仅含有用于野生型或突变细胞生长的必需物质即无机盐、碳源和水的培养基。在突变细胞的情况下，极限培养基可以含有一种或多种基本上纯的化学化合物添加剂以允许在产生此类化学品方面有缺陷的突变细胞的生长。

相反，″富集培养基″被设计为满足特定生物体的全部生长要求，即在极限培养基的成分之外，它们还含有例如氨基酸、生长因子、酶辅因子等。

如上文已经阐述的那样，本发明经遗传修饰的微生物的特征在于至少钴(I)胺素MetH再激活系统的量和/或活性增加。为此，一般增加电子传递蛋白和/或电子传递蛋白还原酶的量和/或活性。为此，可以使用例如铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶、前述因子的功能性同系物和片段。

在优选的实施方案中，本发明的微生物和方法的特征在于额外地，与起始生物体相比，一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性增加：

-metA/X，

-metZ/Y，

-metF，

-metH，

-thrA，

-metE，

和/或与起始生物体相比，一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性减少：

-metK，

-thrB。

此类微生物和方法特别对甲硫氨酸的生产有用。

在特别优选的实施方案中，全部前述因子metA/X、metZ/Y、metF、metH、thrA和metE的量和/或活性增加并且metK和thrB的量和活性减少。

MetA/X指编码酶的基因，所述酶催化乙酰基或琥珀酰基从活化的乙酰辅酶A或各自的琥珀酰辅酶A转移至高丝氨酸的OH基团以产生O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰-高丝氨酸(Genbank登录号：AF052652)。

MetZ/Y指编码酶的基因，所述酶催化硫化物或甲基硫醇(methylmercaptane)转移至O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰-高丝氨酸以产生高半胱氨酸。酶metZ/Y利用磷酸吡哆醛作为辅因子(Genbank登录号：AF220150)。

MetF涉及编码酶的基因，所述酶利用NADPH或NADH作为辅因子和氢负离子供体来催化亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸(EC 1.7.99.5，Genbank登录号：AAH68531)。

MetH涉及编码酶的基因，所述酶利用羟基钴胺素作为辅因子并利用SAM作为第二辅因子催化从甲基四氢叶酸到高半胱氨酸的甲基转移(EC2.1.1.13，Genbank登录号：Cgl1507)。

ThrA(高丝氨酸脱氢酶)涉及编码酶的基因，所述酶利用NADPH或NADH作为辅因子催化天冬氨酸半醛的还原(EC 1.1.1.3，Genbank登录号：Cgl1183、AAT03321、AAH68417、AEB13106)。此酶可以以突变形式使用。

ThrB(高丝氨酸激酶)涉及编码酶的基因，所述酶利用ATP作为辅因子催化高丝氨酸磷酸化成磷酸高丝氨酸(EC 2.7.1.39，Genbank登录号：Cgl1183)。此酶可以以突变形式使用。

MetE涉及编码酶的基因，所述酶利用SAM作为辅因子催化从甲基四氢叶酸到高半胱氨酸上的甲基转移(EC 2.1.1.14，Genbank登录号：Cgl1139)。

MetK涉及编码酶的基因，所述酶利用ATP作为辅因子S-腺苷甲硫氨酸合酶催化S-腺苷残基到甲硫氨酸上的转移(EC 2.5.1.6，Genbank登录号：Cgl1603)。

这些额外的修饰当然也可以引入上述起始生物体中。

在本发明中，术语与起始生物体相比至少一种蛋白质(如铁氧还蛋白)的“量增加”意指起始微生物经遗传修饰以表达更高量的例如上述酶之一。应当理解的是，增加例如一种酶的量是指其中功能性酶的量增加的情况。在本发明中，如果酶如铁氧还蛋白能够催化各自的反应，则它视为是功能性的。

存在各种本领域技术人员所熟知的选择以在微生物如棒状细菌中增加蛋白的量。这些选择包括增加编码各自蛋白质的核酸序列的拷贝数、增加此类核酸序列的转录和/或翻译或其组合。这些各种选择将在下文更详细地讨论。

术语至少一种蛋白质的“活性增加”意指将至少一种突变引入蛋白质各自的野生型序列的情况，其与表达相同量的野生型蛋白质的情况相比，导致更多甲硫氨酸的产生。这可以通过例如使用携带特异突变的酶实现，所述特异突变使得该酶的活性增加。此类突变可以例如使所述酶负责反馈抑制的区域失活。通过例如引入非保守性点突变而使这些位置突变，所述酶可不再提供反馈调节且因此如果例如更多的产物分子产生，则此酶的活性不下调。另外，可以通过引入提高酶的催化周转的突变来增加所述酶的活性。此类突变可以被引入编码各自酶的基因的内源性拷贝中或者其可以通过过表达来自编码此酶的外源核酸序列的相应突变体来提供。此类突变可以包含点突变、缺失或插入。点突变可以是保守性的(将一个氨基酸由具有相类似生物化学和物理化学性质的氨基酸置换)或非保守性的(将一个氨基酸由在生物化学和物理化学性质方面不相类似的另一个氨基酸置换)。另外，所述缺失可以仅包含2或3个氨基酸直至各自蛋白质的完整结构域。

因此，术语至少一种酶的“活性增加”指这样的情况，其中将突变引入各自的野生型序列以减少负调节机制如反馈抑制作用和/或增加酶的催化周转。

蛋白质如酶的量和/或活性的增加可以因此通过不同途径实现，例如通过在转录、翻译或蛋白水平关闭抑制性调节机制，和/或通过与起始生物体相比增加编码这种蛋白质的核酸的基因表达，例如通过诱导内源性基因或通过引入编码该蛋白质的核酸序列。

当然，可以将增加蛋白质如酶的量和/或活性的方法进行组合。因此，例如，可以将一种棒状细菌的酶的内源性拷贝由编码其反馈不敏感形式的突变体来取代。如果这种经突变的拷贝的转录设在强启动子的控制下，则各自酶的量和活性增加。应当理解在这种情况下，该酶必须仍能够催化其通常参与的反应。

编码蛋白质如酶的核酸序列可以是内源来源或外源来源的。因此，可以例如通过以下方式增加蛋白质如铁氧还蛋白的量，所述方式为通过例如额外核酸序列的染色体整合来增加天然存在于各自起始微生物内的核酸序列的表达，或者通过在内源基因之前使用强启动子。可选或另外地，也可以通过表达编码这种酶来自另一种生物体的同系物的核酸序列来增加蛋白质如铁氧还蛋白的量。将在下文提出后一种方案的例子。

因此，可以例如通过过表达来自自主复制载体或来自额外插入的染色体拷贝的各自的谷氨酸棒杆菌序列来增加谷氨酸棒杆菌中铁氧还蛋白的量(见下文)或者可以使用来自例如Corynebacterium efficiens、杰氏棒杆菌(C.jeikeium)、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)、黄色短杆菌(B.flavum)、乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)等的相应酶并且通过例如使用自主复制载体来过表达该酶。

在一些情况下，可以优选使用内源性酶，因为例如谷氨酸棒杆菌的内源性编码序列对于其在谷氨酸棒杆菌中表达的密码子选择而言已经过优化。

在以下描述中，如果申明某种蛋白质如特定酶的量和/或活性与起始生物体相比应当减少，则上文的定义在经过必要修正后适用。

蛋白质如酶的量和/或活性的减少可以通过以下方式实现，通过部分或完全缺失编码各自蛋白的核酸序列、通过例如引入弱启动子而抑制转录、通过相应地修改密码子选择而抑制翻译、通过将突变引入编码各自蛋白的核酸序列使所述蛋白无功能、和/或其组合。

在以下描述中，将利用术语“功能性同系物”。出于本发明的目的，术语“功能性同系物”涉及这样的事实，即某种酶活性不仅可以由给定氨基酸序列的特定蛋白质来提供，还可以由来自它(不)相关生物体的相似序列的蛋白质提供。

例如，可以在谷氨酸棒杆菌中通过表达编码谷氨酸棒杆菌fdxC(SEQ IDNO.1：核酸序列，SEQ ID NO.2：氨基酸序列，该基因的Genbank登录号：1019087或Ncgl1057及该蛋白质的Genbank登录号：NP_600330.1)的核酸序列或通过其功能性同系物来增加铁氧还蛋白的活性。

来自其他生物体的蛋白质的同系物可以由技术人员通过同源性分析轻易地鉴定。这可以通过确定相似性来完成，即确定推定同系物的氨基酸或核酸序列与所述基因或其编码的蛋白质(例如，fdxC、fdxD、fdxA、fldA、fldB、fprA1、fprA2、fprA3、fldR1、fldR的核酸序列)的序列之间的百分比相同性。

可以例如通过视检或通过使用基于同源性算法来确定百分比相同性。

例如，为确定两个氨基酸序列的百分比相同性，算法将出于最佳比较目的来对所述序列进行比对(例如，为了与另一蛋白氨基酸序列最佳比对，可以在一个蛋白的氨基酸序列中引入缺口)。随后比较在相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当一个序列中的位置由与另一序列中相应位置处相同的氨基酸残基所占据时，则所述分子在这个位置上是相同的。这两个序列之间的百分比相同性是所述序列共有的相同位置数的函数(即％相同性＝相同位置#/位置总#乘以100)。

用于这些目的多种计算机程序是本领域已知的。例如，可以通过使用Devereux等人(1984)Nucl.Acids.Res.，12：387所描述的并且可从Universityof Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)获得的GAP计算机程序比较序列信息来确定两个核酸或氨基酸序列的百分比相同性。也可以通过使用(如Tatusova等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.，174：247所描述的)BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST^TM)程序比对两个核酸或氨基酸序列来确定百分比相同性。

在本专利申请的申请日，可以在NCBI的BLAST网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上找到提供BLAST程序的标准软件包。例如，如果使用任意的前述SEQ ID，则可以执行基于核酸序列或氨基序列的BLAST检索并鉴定出在例如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等中各自酶的密切相关同系物。例如，对于使用BLAST^TM程序的核酸序列比对，默认设置如下：匹配得分是2，错配罚分是-2，开放缺口罚分和延伸缺口罚分分别是5和2，gap.times.dropoff是50，预期是10，字体大小是11，并且过滤程序是OFF。

相当的序列检索和分析可以在EMBL数据库(http://www.embl.org)或Expasy主页(http://www.expasy.org/)进行。全部上述序列检索一般均以其数据库提供者在本申请的申请日所预设的默认参数进行。也可以使用软件程序如美国威斯康辛州Madison的DNA Star，Inc.的Laser Gene软件进行常规的同源性检索，其中所述软件使用CLUSTAL方法(Higgins等人(1989)，Comput.Appl.Biosci.，5(2)151)。

技术人员理解如果两种蛋白质共享如上文所述的某种程度的相同性，它们将可能执行相同功能(例如提供相同的酶活性)。在氨基酸水平上常见的下限一般是至少约25％相同性。在核酸水平上，下限一般是至少50％。

对两种类型的序列优选的相同性分数为至少约50％、至少约60％或至少约70％。更优选的相同性水平是至少约80％、至少约90％或至少约95％。这些相同性水平被认为是显著的。

如本文中所用，术语“同源性”和“同源”不限于指定具有理论上共同遗传祖先的蛋白质，也包括可以在遗传上不相关，却依然演化为执行相似功能和/或具有相似结构的蛋白质。同系物应当是功能性的要求意指本文中所述的同系物涵盖基本上与参考蛋白具有相同活性的同系物。对于具有功能同源性的蛋白质，并不必然要求它们在其氨基酸序列上具有显著相同性，但是，具有功能同源性的蛋白质反而要定义为具有相似或相同活性(例如酶活性)。

优选地，如果来自如宿主棒状细菌之外另一种生物体的酶显示至少明显的相似性，即在氨基酸水平上约50％序列相同性并且与其在棒状细菌中的对应物催化相同的反应，则将认为该酶是功能性同系物。提供相同酶活性并在氨基酸水平上共享更高程度相同性如至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％序列相同性的功能性同系物是进一步优选的功能性同系物。

本领域技术人员知道也可以使用来自例如棒状细菌的前述酶的片段或突变形式及它们在其他生物体中功能性同系物的片段或突变形式，只要这些片段和突变形式显现相同类型的功能活性即可。常见的功能活性片段会显示N-末端和/或C-末端缺失，而突变形式一般包含缺失、插入或点突变。

例如，如果大肠杆菌序列在氨基酸水平上与SEQ ID NO.2显示上述相同性水平并且显现相同酶活性，则会将其视为编码谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白fdxC的功能性同系物。示例可以取自表1。也可以使用这些序列的片段或例如点突变体，只要所得蛋白质仍与全长酶催化相同类型的反应即可。

增加微生物中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性

如上文已经阐述的那样，本发明基于以下发现：钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的增加导致甲硫氨酸生产的改善并且可以用于微生物中甲硫氨酸生产的改善。

上文已经进一步阐述在一些优选的实施方案中可以实现这种钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的增加，所述系统增加电子传递蛋白和/或电子传递蛋白还原酶以及其功能性同系物和/或片段的量和/或活性。进一步已经指出铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白是此类电子转移蛋白的常见例子并且铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原酶是此类电子传递蛋白还原酶的常见例子。

现在将就这些优选实施方案中的一些来论述钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的增加，即在物种如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中过表达前述因子中的一些。本领域技术人员仍然会了解到这些具体例子不应解释为限制性的。本领域技术人员会理解如何分离及鉴定在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌之外其他生物体中参与钴(I)胺素依赖性MetH再激活的酶活性。本领域技术人员会进一步理解根据本说明如何例如在其他微生物中表达本说明书中描述的铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白和它们各自的还原酶。

如将从下文的实施方案实例中弄清楚的那样，微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原酶的序列。在此类微生物中，增加钴(I)胺素MetH再激活系统的量和/或活性可能需要通过例如过表达编码这些酶活性的内源或外源核酸序列来提高这些酶的量和/或活性至超过各自起始生物体的水平。

本发明因此涉及谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌微生物以及此类微生物生产甲硫氨酸的用途，在所述微生物中前述因子的量和/或活性增加。对包括例如铁氧还蛋白，黄素氧还蛋白，铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原酶在内的前述因子的量和/或活性的增加可以通过例如提高编码此类因子的核酸序列的拷贝数、增加编码此类因子的序列的转录和/或翻译、或其组合来实现。

在谷氨酸棒杆菌中，仅内源性因子可以参与钴(I)胺素依赖性MetH的再激活并且因而被用于相应再激活系统量和/或活性的增加。电子传递蛋白包含fdxC、fdxD和fdxA。

就fdxC而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.1中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.2中描述。基因库登录号对于该基因是geneID：1019087或Ncgl1057，对于该蛋白是NP_600330.1。

就fdxD而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.3中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.4中描述。基因库登录号对于该基因是geneID：1020899或NCgl2856，而对于该蛋白质是NP_602147.1。

就fdxA而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.5中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.6中描述。基因库登录号对于该基因是geneID：1018555或NCgl0526，而对于该蛋白质是NP_599787.1。

在谷氨酸棒杆菌中，电子传递蛋白还原酶可以选自fprA1、fprA2、fprA3和fldR1的组，它们全部已经被标注为铁氧还蛋白还原酶。

就fprA1而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.11中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.12中描述。基因库登录号对于该基因是geneID：1020760或NCgl2719，而对于该蛋白质是NP_602009.1。

就fprA2而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.13中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.14中描述。基因库登录号对于该基因是geneID：1020699或NCgl2658，而对于该蛋白质是NP_601949.1。

就fprA3而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.15中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.16中描述。基因库登录号对于该基因是geneID：1020355或NCgl2322，而对于该蛋白质是蛋白质_NP_601606.1。

就fldR1而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.17中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.18中描述。基因库登录号对于该基因是NCgl2301或geneID：1020334，而对于该蛋白质是蛋白质_NP_601585.1。

这些因子的其他同系物可以通过使用例如BLAST算法执行前述同源性检索来加以鉴定。

就大肠杆菌而言，电子传递蛋白可以选自fldA或fldB的组。这些蛋白质已经被标注为黄素氧还蛋白。

就fldA而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.7中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.8中描述。基因库登录号是g1789262或EG10318，以及Swiss-Prot P23243。

就fldB而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.9中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No.10中描述。基因库登录号是g1789262或EG12697，以及Swiss-Prot P41050。

在大肠杆菌中，所述电子传递蛋白还原酶可以由已经被标注为黄素氧还蛋白还原酶的fldR编码。该基因也已经被赋予其他名称，包括fpr、flxR和mvrA。所述蛋白质也已经被称作铁氧还蛋白还原酶。就这种因子而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No.19中描述，而氨基酸序列在SEQ IDNo.20中描述。基因库登录号是g1790359或EG11518，以及Swiss-ProtP28861。

为增加谷氨酸棒杆菌中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性，可以增加谷氨酸棒杆菌中前述内源因子的量和/或活性并因此增加fdxC、fdxD、或fdxA和/或fprA1、fprA2、fprA3、和/或fldR1的量和/或活性。或者，可以过表达外源因子如大肠杆菌因子并因此表达例如fldA和/或fldR。在谷氨酸棒杆菌中，可以优选过表达fdxC和fprA1组合任选与谷氨酸棒杆菌metH组合以及过表达fldA和fldR任选与大肠杆菌metH组合，或前述两个集合的组合。

就大肠杆菌而言，可以再次表达上述内源因子或依赖已知用于例如谷氨酸棒杆菌的外源因子。fldA、fldB，或fldR的过表达可以是足够的。然而，可以优选fldA和fldR过表达。也可以利用例如fdxC和fprA1的过表达。

就本发明涉及谷氨酸棒杆菌而言，其考虑了其中铁氧还蛋白或铁氧还蛋白还原酶并且优选铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的量和/或活性增加的微生物。类似地，本发明考虑了其中来自其他微生物的相应活性(如来自大肠杆菌的黄素氧还蛋白和/或黄素氧还蛋白还原酶)增加的谷氨酸棒杆菌微生物。

就大肠杆菌而言，本发明类似地考虑了其中黄素氧还蛋白或黄素氧还蛋白还原酶并且优选黄素氧还蛋白和黄素氧还蛋白还原酶的量和/或活性增加的微生物。或者，可以使用在谷氨酸棒杆菌中执行相当功能的因子如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。

当然，也可以增加一种内源因子和一种外源因子的量和/或活性。因此，可以考虑在谷氨酸棒杆菌中增加内源性铁氧还蛋白和大肠杆菌黄素氧还蛋白还原酶的量。或者，可以在谷氨酸棒杆菌中增加大肠杆菌黄素氧还蛋白和内源性铁氧还蛋白还原酶的量和/或活性。在大肠杆菌中，可以因此增加外源性谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白和内源性黄素氧还蛋白还原酶的量和/或活性或者可以增加内源性黄素氧还蛋白和外源性谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白还原酶的量和/或活性。

本领域技术人员将意识到本发明的其他实施方案。上文提及的示例已经根据通常编码天然形式的电子传递蛋白和电子传递蛋白还原酶如fdxC和fprA1的序列进行说明。然而，本领域技术人员将理解，无论内源性和/或外源性因子的量和/或活性是否将增加，仍可以使用这些因子的功能性同系物和/或功能性片段。

编码前述因子如fdxC的核酸序列的拷贝数可以在微生物中并且优选在谷氨酸棒杆菌中增加，所述增加通过例如由自主复制质粒表达该序列或通过将各自核酸序列的额外拷贝整合至微生物的基因组并且优选谷氨酸棒杆菌的基因组进行。

在自主复制载体的情形中，这些可以稳定地维持在例如棒状细菌内。用于在谷氨酸棒杆菌中表达多肽和酶如fdxC的典型载体包括pCliK、pB和pEKO，如Bott，M.和Eggeling，L.，eds.，Handbook of Corynebacteriumglutamicum.CRC Press LLC，Boca Raton，FL；Deb，J.K.等人(FEMS Microbiol.Lett.(1999)，175(1)，11-20)、Kirchner O.等人(J.Biotechnol.(2003)，104(1-3)，287-299)、WO2006069711和WO2007012078所述。

在用于增加在棒状细菌中编码多肽的核酸序列拷贝数的另一种方法中，可以将编码此类多肽的核酸序列的额外拷贝整合至谷氨酸棒杆菌的染色体中。染色体整合可以例如在其中各自多肽的内源性拷贝所在的基因座处发生。另外和/或可选地，编码多肽的核酸序列的染色体性倍增可以在棒状细菌基因组中的其他基因座处发生。

在谷氨酸棒杆菌的情形中，存在本领域技术人员已知用于通过染色体整合增加基因拷贝数的各种方法。一种这样的方法例如利用载体pK19sacB并且已经在

A，等人J Bacteriol.1994 176(23)：7309-7319的出版物中详细描述。用于编码多肽的核酸序列的染色体整合的其他载体包括或是如WO2005059093和WO2007011845所述的pCLIK int sacB。

用于在微生物并且特别是谷氨酸棒杆菌中增加前述因子如fdxC的量和/或活性的另一种优选方法是通过使用强启动子来增加编码序列的转录。

如果使用强启动子增加了例如内源性铁氧还蛋白的活性，则术语″强启动子″意指来自新引入的启动子的转录强于来自天然存在的内源性启动子的转录。

然而，在例如未知此类酶的谷氨酸棒杆菌中表达黄素氧还蛋白fldA的情况下，可以使用已知引起谷氨酸棒杆菌的内源性基因强表达的启动子。

在这种背景下的优选启动子是启动子P_SOD(SEQ ID No.21)、P_groES(SEQID No.22)、P_EFTu(SEQ ID No.23)、噬菌体SP01启动子P₁₅(SEQ ID No.38)和有时又称作lambdaP_R的λP_R(SEQ ID No.24)。在谷氨酸棒杆菌中，所述λP_R启动子可以强于所述P_SOD启动子。所述P_SOD启动子可以强于所述P_groES启动子，并且所述P_groES启动子可以弱于所述P_EFTu启动子或所述P₁₅启动子。所述P_EFTu启动子可以强于所述P_SOD启动子。然而，一个启动子在任意生物体中的强度并不必然是该启动子的固有属性，因为启动子强度可以根据通过遗传工程安置该启动子的背景而大幅度变化。

本发明因此也涉及包括培养上述微生物及任选分离甲硫氨酸的方法。

下文将详细描述用于增加蛋白质的量和/或活性的方法。这些方法当然也可以应用于因子如fdxC、fprA1和fldA。

优选的实施方案涉及谷氨酸棒杆菌微生物，其显现出一种或多种铁氧还蛋白如fdxC、fdxD、或fdxA的量和/或活性以及一种或多种铁氧还蛋白还原酶如fprA1、fprA2、fprA3、和fldR1的量和/或活性的增加。本发明也优选涉及这些谷氨酸棒杆菌生物体在甲硫氨酸生产中的用途。

可以用作起始生物体的常见谷氨酸棒杆菌菌株将是野生型菌株如ATCC13032。然而，可以优选使用已经过遗传修饰的起始生物体以确保甲硫氨酸生产的增加。这种生物体可以显现出DSM17323的特征并且因而显现出ask^fbr、hom^fbr和metH的量和/或活性增加。优选的起始菌株也可以具有M2014的特征并且显现出ask^fbr、hom^fbr、metH、metA、metY和hsk^mutated的量和/或活性增加。其他优选的起始生物体可以具有OM469的特征并且显现出ask^fbr、hom^fbr、metH、metA、metY、hsk^mutated和metF的量和/或活性增加并显现出mcbR和metQ的量和/或活性减少。另外其他优选的起始生物体可以具有GK1259的特征并且显现出ask^fbr、hom^fbr、metH、metA、、metY、hsk^mutated、tkt(和任选地g6pdh、zwfa和6pgl)和metF的量和/或活性增加并显现出mcbR、metQ和sda的量和/或活性减少或者具有M2616的特征并且显现出ask^fbr、hom^fbr、metH、metA、、metY、hsk^mutated、tkt(和任选地g6pdh、zwfa和6pgl)和metF的量和/或活性增加并显现出mcbR和metQ的量和/或活性减少。

如上文已经说明的那样，本发明优选将前述遗传改变不仅引入野生型生物体中，还引入已经就甲硫氨酸生产而进行了优化的起始生物体中。本发明一个特别优选的实施方案涉及起始生物体，其中钴(I)胺素依赖性MetH的量和/或活性通过任意上述方法如利用编码钴(I)胺素依赖性MetH的序列的拷贝数来增加。

下表提供了在上文更详细地讨论过的一些酶的概览。提到的基因库登录号指GenBank或其他可以在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/找到或登录的公共数据库。如本领域所熟知那样，可以通过使用在相同网址上存在的“BLAST”程序使用来自下表的序列作为“查询”找到下表中所列的任意基因或蛋白质的许多同系物。

上述登录号是Genbank的官方登录号或是在Genbank具有交叉援引的登录号的同义语。这些编号可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/检索并找到。

下文给出如何在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中增加和减少多肽和基因的量和/或活性的总体概览。然而，本领域技术人员会明白用于通过执行合适的数据库检索而鉴定表1酶的新同系物和/或改变这些酶在棒状细菌或埃希氏菌属细菌之外的其他生物体中表达的其他技术和方法。

增加或引入量和/或活性

对于增加量，可以区分出两种基本方案。在第一种方案中，通过表达各自蛋白的外源形式来增加酶量。在另一种方案中，通过影响例如启动子和/或增强子元件的活性和/或其它在转录、翻译或翻译后水平上调节各自蛋白质活性的调节活性来增加内源性蛋白的表达。

因此，蛋白质的量和/或活性的增加可以通过不同途径实现，例如通过在转录、翻译或蛋白质水平关闭抑制性调节机制或通过与起始生物体相比增加编码这些蛋白质的核酸的基因表达例如通过强启动子诱导内源性铁氧还蛋白和/或通过引入编码铁氧还蛋白的核酸进行。

在一个实施方案中，通过将编码表1酶的核酸引入微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中来实现表1中酶的量和/或活性的增加。

原则上，可以使用具有表1中所列蛋白的酶活性的不同生物体的任何蛋白质。对于此类酶来自真核来源的含有内含子的基因组核酸序列，在宿主生物体不能或不可能使其能够剪接相应mRNA的情况下，将使用已经加工过的核酸序列如相应的cDNA。本描述中提及的全部核酸可以例如是RNA、DNA或cDNA序列。

根据本发明，增加或引入蛋白质的量一般包括以下步骤：

a)产生以5′-3′方向包含以下核酸序列、优选DNA序列的载体：

-在本发明生物体中有功能的启动子序列

-与其可操纵地连接的编码例如表1蛋白质的DNA序列、其功能性同系物、功能性片段或功能性突变形式

-任选地，在本发明生物体中有功能的终止序列

b)将步骤a)的载体转移至本发明的生物体如谷氨酸棒杆菌，并且任选地整合至各自的基因组中。

如上所述，功能性片段涉及编码例如表1酶的核酸序列的片段，其表达仍产生具有与各自全长蛋白基本上相似的酶活性的蛋白。

上述方法可以用于增加编码例如表1酶或其功能性片段的DNA序列的表达。像启动子和终止序列一样，包含调节序列的此类载体的用途是本领域技术人员已知的。另外，本领域技术人员知道如何可以将步骤a)的载体转移至生物体如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌以及载体必须具有哪种特性以便能够整合至其基因组中。

如果生物体如谷氨酸棒杆菌中的酶含量通过转移编码另一种生物体如大肠杆菌的酶的核酸而增加，则可取的是转入由例如来自大肠杆菌的根据遗传密码通过将多肽序列回译为主要包含因生物体特异性密码子选择而更经常使用的那些密码子的核酸序列而获得的核酸序列编码的氨基酸序列。所述密码子选择可以借助计算机评价相关生物体的其他已知基因来确定。

根据本发明，增加编码表1酶的核酸的基因表达也理解为操纵生物体尤其谷氨酸棒杆菌的各自内源性酶表达。这可以通过例如改变编码这些酶的基因的启动子DNA序列来实现。这种引起这些酶的表达速率改变、优选增加的改变可通过以强启动子取代和通过缺失和/或插入DNA序列来实现。

内源性基因启动子序列的改变通常引起该基因表达量的改变并且因此还引起在该细胞或生物体中可检测活性的改变。

另外，可以通过调节蛋白分别实现内源性基因表达的改变和增加，所述调节蛋白在转化的生物体中不存在或已经被缺失并且与这些基因的启动子相互作用。这种调节物可以是由DNA结合结构域和转录激活结构域组成的嵌合蛋白，如WO 96/06166中所述。

增加内源性基因的活性和含量的又一种可能性是上调例如通过过表达参与该内源性基因转录的转录因子。用于转录因子过表达的措施是本领域技术人员已知的。

内源性酶如表1的那些酶的表达可以例如通过与所述基因的启动子序列特异性结合的适配体的表达进行调节。取决于结合至刺激或阻抑启动子区的适配体，表1酶的量可以例如是增加的。

另外，内源性基因活性的改变可以通过内源性基因拷贝的定向诱变来实现。

编码例如表1酶的内源性基因的改变也可以通过影响所述酶的翻译后修饰来实现。这可例如通过相应措施如过表达或基因沉默而调节参与所述酶翻译后修饰的酶如激酶或磷酸酶的活性来实现。

在另一个实施方案中，可以改善酶的效率，或破坏该酶的变构调控区从而阻止对该化合物生产的反馈抑制。类似地，可以将降解酶缺失或通过替换、缺失或添加进行修饰，从而使其对所需的表1酶的降解活性减弱，而不削弱细胞的活力。在每种情况下，甲硫氨酸的总体产量、产生速率或量均增加。

前述这些用于增加或引入表1酶的量和/或活性的策略并不意图是限制性的；这些策略的变化对本领域普通技术人员是显而易见的。

减少酶的量和/或活性

上文已经阐述可以优选地使用已经过工程化用于产生甲硫氨酸的起始生物体。在谷氨酸棒杆菌中，可以例如下调metQ的活性以获得合适的起始生物体。

为减少酶的量和/或活性，多种策略是可用的。

内源性酶如表1那些酶的表达可以例如通过与所述基因的启动子序特异性结合的适配体的表达来调节。取决于结合至刺激或阻抑启动子区的适配体，表1酶的量并且因此在此情况下其活性可以例如被减少。

适配体也可以如此方式设计，从而与酶本身特异性结合并通过例如结合至各自酶的催化中心来减少所述酶的活性。适配体的表达通常通过基于载体的过表达(见上文)实现并且与适配体的设计和选择一起都是本领域技术人员所熟知的(Famulok等人，(1999)Curr Top Microbiol Immunol.，243，123-36)。

另外，表1的内源性酶的量和活性的减少可以通过本领域技术人员熟知的多种实验措施实现。这些措施通常由术语“基因沉默”所概括。例如，可以通过将上文提及的载体转移至生物体如谷氨酸棒杆菌中来沉默内源性基因的表达，其中所述载体具有以反义顺序编码酶或其部分的DNA序列。这基于以下事实；这种载体在细胞中的转录产生RNA，所述RNA可以与内源性基因所转录出的mRNA杂交并因此阻止其翻译。

原则上，反义策略可以与核酶方法结合。核酶是有催化活性的RNA序列，如果与反义序列偶联，该RNA序列催化性地裂解靶序列(Tanner等人，(1999)FEMS Microbiol Rev.23(3)，257-75)。这可以增强反义策略的效率。

为产生同源重组微生物，制备了含有编码表1酶基因至少一部分的载体且已经向其中引入缺失、添加或替换以因而改变例如功能性地破坏该内源性基因。

在一个实施方案中，如此设计载体，从而当同源重组时，内源性基因被功能性地破坏(即不再编码功能性蛋白质)。或者，可以如此设计载体，从而当同源重组时，内源性基因被突变或改变但仍编码功能性蛋白质，例如，上游调节区可以被改变以因而改变表1内源酶的表达。这种方法可能具有以下优点：酶的表达没有完全取消，但是减少至所要求的最低水平。技术人员知道哪种载体可以用来置换或缺失内源性序列。下文提供了在谷氨酸棒杆菌中破坏染色体序列的具体描述。

另外，可以通过减少转录因子的量而进行基因阻抑。

也可以将抑制靶蛋白本身的因子引入细胞中。蛋白质结合因子可以例如是上文提及的适配体(Famulok等人(1999)Curr.Top Microbiol.Immunol.243：123-36)。

可以考虑作为其他蛋白质结合因子的酶特异性抗体，其表达可以引起表1酶的量和/或活性减少。重组酶特异性抗体如单链抗体的产生是本领域已知的。抗体的表达也从文献中已知(Fiedler等人，(1997)Immunotechnology3，205-216；Maynard和Georgiou(2000)Annu.Rev.Biomed.Eng.2，339-76)。

所提及的技术是本领域技术人员熟知的。因此，技术人员也知道用于例如反义方法的核酸构建体所必须具有的典型大小和各自的核酸序列必须具有哪种互补性、同源性或相同性。术语“互补性”、“同源性”和“相同性”是本领域技术人员已知的。

术语互补性描述了核酸分子与另一核酸分子由于两个互补碱基之间的氢键而杂交的能力。本领域技术人员知道两个核酸分子为能够相互杂交不是必须显现100％互补性的。要与另一个核酸序列杂交的核酸序列分别与所述另一核酸序列优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、优选至少70％、特别优选至少80％，更特别优选至少90％、尤其优选至少95％并且最优选地至少98或100％互补。

反义序列与内源性mRNA序列的杂交一般在体内于细胞条件下或在体外发生。根据本发明，杂交在足够严格以确保特异性杂交的条件下在体内或体外实施。

严格体外杂交条件是本领域技术人员已知的并且可以取自文献(见例如Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press(2001))。术语“特异性杂交”是指这样的情况，其中如果某核酸序列是例如DNA或RNA分子的复杂混合物的一部分，则一个分子在严格条件下优先与该核酸序列结合。

术语“严格条件”因此指这样的条件，在所述条件下核酸序列优先与靶序列结合，但不与其他序列结合或至少以明显减少的程度与其他序列结合。

严格条件取决于环境。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，可以如此方式挑选严格条件，从而在给定的离子强度和给定的pH下使杂交温度位于所述特定序列的解链温度(T_m)以下约5℃。T_m是(在给定的离子强度、给定的pH值和给定的核酸浓度下)互补于靶序列的分子的50％与所述靶序列杂交的温度。一般而言，严格条件包含0.01M至1.0M钠离子(或另一种盐离子)之间的盐浓度和7.0至8.3之间的pH值。该温度对于短分子(例如对于包含10至50个核苷酸之间的此类分子)是至少30℃。此外，严格条件可以包含添加去稳定剂如甲酰胺。常见的杂交和洗涤缓冲液具有以下组成：

预杂交溶液：

0.5％SDS

5×SSC

50mM NaPO₄，pH 6.8

0.1％焦磷酸钠

5x Denhardt试剂

100μg/鲑精

杂交溶液：预杂交溶液

1×10⁶cpm/ml探针(5-10min 95℃)

20×SSC： 3M NaCl

0.3M柠檬酸钠

用HCl调节至pH 7

50×Denhardt试剂

5g Ficoll

5g聚乙烯吡咯烷酮

5g牛血清白蛋白

ad 500ml A.dest。

用于杂交的常见过程如下：

任选的：  在65℃于1×SSC/0.1％SDS中洗涤Blot 30min

预杂交：  在50-55℃至少2h

杂交：    在55-60℃过夜

洗涤：    0.5min  2×SSC/0.1％SDS

杂交温度：

30min   2×SSC/0.1％SDS

杂交温度：

30min    1×SSC/0.1％SDS

杂交温度：

45min   0.2xSSC/0.1％SDS    65℃

5min    0.1×SSC            室温

出于反义目的，在100个核酸、80个核酸、60个核酸、40个核酸和20个核酸的序列长度上的互补性可能足够。更长的核酸长度也必定足够。上文所提及方法的联合应用也是可以想到的。

根据本发明，如果使用以5′-3′方向与所述生物体中有活性的启动子可操纵地连接的DNA序列，通常可以构建载体，所述载体在转移至该生物体的细胞后允许编码序列过表达或分别引起对内源性核酸序列和由其所表达的蛋白的阻抑或竞争和阻断。

也可以通过在该生物体中过表达特定酶的无功能突变体来减少该酶的活性。因而不能够催化所讨论的反应但是能够结合例如底物或辅因子的无功能突变体可以通过过表达而竞争超过该内源性酶并因此抑制该反应。旨在减少酶在宿主细胞中量和/或活性的其他方法是本领域技术人员熟知的。

根据本发明，无功能酶分别具有与功能性酶及其功能性片段基本上相同的核酸序列和氨基酸序列，但是在一些位置具有核酸或氨基酸的点突变、插入或缺失，它们具有如此作用：使无功能酶不能够或仅能够在极有限程度上催化各自的反应。这些无功能酶不可以与仍能够催化相应反应但不再受反馈调节的酶混杂。根据本发明，术语“无功能酶”不包括与各自的功能性酶分别在氨基酸水平和核酸水平上不具有明显序列同源性的那些蛋白。按照定义，本发明的术语“无功能酶”因此不意指那些不能够催化各自反应并且与各自酶不具有明显序列同源性的蛋白质。在本发明的范围内，无功能酶也称作失活或无活性酶。

因此，本发明携带上文所提及点突变、插入和/或缺失的例如表1的无功能酶的特征是与本发明表1的野生型酶或其功能性等价部分具有明显序列同源性。为确定明显序列同源性，将使用上述的相同性评分。

载体和宿主细胞

本发明的一个方面是关于含有如上文所提及核酸序列的载体，优选表达载体。如本文中所用，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够转运已经与其连接的另一个核酸。

一种类型的载体是“质粒”，其是指可以向其中连入额外DNA节段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA节段可以被连接到病毒基因组中。

某些载体能够在其所被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在被引入宿主细胞时整合到该宿主细胞的基因组中，并因而随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它们可操纵地连接的基因的表达。

此类载体在本文称作“表达载体”。

通常，重组DNA技术中使用的表达载体经常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包括发挥同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本发明的重组表达载体可以包含如上文所述经修饰的核酸，所述核酸是适于各自核酸在宿主细胞中表达的形式，这意指该重组表达载体包含基于要用于表达的宿主细胞而选择的的一个或多个调节序列，其可操纵地与待表达核酸序列连接。

在重组表达载体内，“可操纵地连接”意指目的核酸序列与调节序列以允许该核酸序列表达的方式连接(例如在体外转录/翻译系统中或当该载体引入宿主细胞时在宿主细胞中)。术语“调节序列”意图包括启动子、阻抑物结合位点、激活物结合位点、增强子和其它表达控制元件(例如终止子、多腺苷酸化信号或mRNA二级结构的其他元件)。此类调节序列例如在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。调节序列包括指导核酸序列在许多类型宿主细胞中组成性表达的那些以及指导该核酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些。优选的调节序列例如是启动子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、噬菌体λP_R、噬菌体λP_L、噬菌体SP01 P₁₅、噬菌体SP01P₂₆、pSOD、EFTu、EFTs、GroEL、MetZ(来自谷氨酸棒杆菌的last 5)，它们优选用于细菌中。另外的调节序列是例如来自酵母和真菌的启动子如ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH、ENO2，来自植物的启动子如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素-或菜豆蛋白-启动子。也可能使用人工启动子。本领域普通技术人员会理解表达载体的设计可取决于如待转化细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞从而产生由上文所述经修饰的核酸序列编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。

蛋白质在原核生物中的表达最经常用含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体来实施。

融合载体向其中所编码的蛋白质添加众多氨基酸，通常添加至重组蛋白的氨基端，但是也添加至C-端或融合于该蛋白质中的合适区域内。此类融合载体一般用于4种目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的可溶性；3)通过在亲和纯化中充当配体来辅助该重组蛋白的纯化4)为该蛋白质的后续检测提供“标签”。在融合表达载体中往往在融合部分与重组蛋白的接合处引入蛋白酶裂解位点从而使得在该融合蛋白纯化后能够将重组蛋白与该融合部分分开。此类酶及其同族(cognate)识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。

典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合了谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A。

合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等人，(1988)Gene 69：301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、egt11、pBdCl和pET 11d(Studier等人，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；和Pouwels等人eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。来自pTrc载体的靶基因表达依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET 11d载体的靶基因表达依赖于来自由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)所介导的T7gn1O-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从定居(resident)X原噬菌体提供，其中所述原噬菌体携带处于lacUV 5启动子转录控制下的T7gn1基因。为了细菌其他变种的转化，可以选择适宜的载体。例如，质粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361已知用于转化链霉菌，而质粒pUB110、pC194或pBD214适用于芽孢杆菌物种的转化。用于将遗传信息转移至棒杆菌的几种质粒包括pHM1519、pBL1、pSA77或pAJ667(Pouwels等人eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0444 904018)。

合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭载体的例子是例如pClik5aMCS(WO2005059093)或可以在Eikmanns等人(Gene.(1991)102，93-8)中找到。

用于操作棒杆菌的合适载体的例子可以在Handbook ofCorynebacterium(Eggeling和Bott编著，ISBN 0-8493-1821-1，2005)中找到。可以找到大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体的列表(表23.1)、大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体的列表(表23.2)、可以用于将DNA整合至谷氨酸棒杆菌染色体中的载体列表(表23.3)、用于整合至谷氨酸棒杆菌染色体中的表达载体的列表(表23.4.)以及用于位点特异性整合至谷氨酸棒杆菌染色体中的载体的列表(表23.6)。

在另一个实施方案中，蛋白表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等人(1987)Embo J.6：229-234)、2i、pAG-1、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。构建适合用于其他真菌如丝状真菌中的载体和方法包括在：van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)在：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy，等人，eds.，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge，和Pouwels等人，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York(IBSN 0 444 904018)中详述的那些。

出于本发明的目的，可操纵的连接应理解为启动子、编码序列、终止子和任选地另外的调节元件以如此方式顺序排列，从而当表达编码序列时，每种调节元件可以根据其定位实现其功能。

用于原核细胞和真核细胞的其他合适表达系统见Sambrook，J.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003的第16和17章。

载体DNA可以通过常规转化或转染技术被引入原核生物。如本文中所用，术语“转化”和“转染”、“接合(conjugation)”和“转导”意指用于将外来核酸(例如线形DNA或RNA(例如线性化载体或单独的无载体的基因构建体)或载体形式的核酸(例如质粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其他DNA)引入宿主细胞的各种现有技术已认可的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE葡聚糖介导的转染、脂染、天然感受态法(natural competence)、化学品介导的转移、或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook，等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，2003)和其他实验室手册中找到。

为了鉴定并选择这些整合体，编码可选择标记(例如抗生素抗性)的基因通常连同目的基因一起被引入宿主细胞中。优选的可选择标记包括赋予针对药物的抗性的那些选择标记，所述药物如但不限于G418、潮霉素、卡那霉素、四环素、新霉素氨苄青霉素(和其他青霉素类)、头孢菌素类、氟喹诺酮类、萘啶酸(naladixic a id)、氯霉素、壮观霉素、红霉素、链霉素和甲氨蝶呤。其他可选择标记包括可以弥补宿主或起始菌株中等价基因的突变形式的野生型基因。例如，对于极限培养基上生长必需的基因可以在如上文所述的本发明谷氨酸棒杆菌起始或宿主菌株的基因组中被突变或缺失以产生丝氨酸营养缺陷型。随后，含有这种基因的野生型或其他功能性拷贝的载体可以用来选择转化体或整合体。可以将编码可选择标记的核酸在与编码上文所述经修饰的核酸序列的载体相同的载体上或在独立的载体上来引入宿主细胞中。可以例如通过药物选择来鉴定已稳定地转染了所引入的核酸的细胞(例如已经整合了可选择标记基因的细胞存活，而其余细胞死亡)。

当使用没有复制起点和两种不同标记基因的质粒(例如pClik int sacB)时，还可能产生具有插入物部分插入了基因组中的无标记菌株。这通过两个连续同源重组事件来实现(也见Becker等人，Applied and EnvironmentalMicrobilogy，第8587-8596页)。质粒pClik int sacB的序列可以在WO2005059093；SEQ ID 24中找到；该质粒在此文件中称作pCIS。

在另一个实施方案中，可以产生含有所选择的系统的重组微生物，所述系统允许所引入的基因受调节地表达。例如，将上文提及的核酸序列之一纳入使其置于lac操纵子控制下的载体上使该基因仅在IPTG存在时表达。此类调节系统是本领域熟知的。

本发明的另一方面是关于已经向其中引入本发明重组表达载体的生物体或宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换地使用。应当理解此类术语不仅指具体的对象细胞(subject cell)，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可以因突变或环境影响而在后续世代中出现，故而此类后代实际上可以与亲代细胞不完全相同，但仍包含于如本文中所用的该术语的范围内。

大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的生长-培养基和培养条件

本领域技术人员熟悉常见微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的培养。因而，下文将给出关于培养谷氨酸棒杆菌的一般教导。对于大肠杆菌的培养的相应信息可以从标准教材取得。

大肠杆菌菌株常规分别培养于MB和LB培养液中(Follettie等人(1993)J.Bacteriol.175，4096-4103)。用于包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌在内的细菌的若干最低极限培养基是本领域熟知的。用于大肠杆菌的极限培养基分别包括但不限于E培养基、M9培养基和改良MCGC(Yoshihama等人(1985)J.Bacteriol.162，591-507)。葡萄糖可以按约0.2％至1％之间的终浓度添加。抗生素可以按以下量(微克每毫升)添加：氨苄青霉素，5至1000；卡那霉素，25；萘啶酸，25；氯霉素，5至120；壮观霉素，50至100；四环素，5至120。氨基酸、维生素和其他补充物可以例如按以下量添加：甲硫氨酸，9.3mM；精氨酸，9.3mM；组氨酸，9.3mM；硫胺素，0.05mM。大肠杆菌细胞常规分别在18℃至37 44℃生长，取决于所进行的具体实验或过程。

遗传修饰的棒杆菌一般在合成或天然生长培养基中培养。许多不同的棒杆菌生长培养基是熟知的并且是轻易可获得的(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol。Biotechnol.，32：205-210；yon der Osten等人(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；专利DE 4,120,867；Liebl(1992)″The GenusCorynebacterium，在：The Procaryotes，Volume II，Balows，A。等人，eds.，Springer-Verlag)。也可以在Handbook of Corynebacterium(Eggeling和Bott编著，ISBN 0-8493-1821-1，2005)中找到指导。

这些培养基由一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素组成。优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、棉子糖、淀粉或纤维素充当了极好的碳源。

也可能通过复杂化合物如糖蜜或来自糖精炼的其他副产品来向培养基供应糖。供应不同碳源的混合物也可以是有利的。其它可能的碳源是醇和有机酸，如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。示例的氮源包括氨气或铵盐，如NH₄Cl或(NH₄)₂SO₄、NH₄OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂氮源，如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉浸汁和其它等。

使用不同的硫源，过量产生甲硫氨酸是可能的。可以使用硫酸盐/酯、硫代硫酸盐/酯、亚硫酸盐/酯以及另外更为还原的硫源如H₂S和硫化物和衍生物。有机硫源如甲基硫醇、硫基乙醇酸盐/酯、硫氰酸盐/酯、及硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其他含硫化合物也可以用来实现高效的甲硫氨酸生产。甲酸盐/酯以及其他Cl源如甲醇或甲醛也可作为补充物。

可以包含在培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化-、磷酸-或硫酸盐。可以向培养基添加螯合化合物以使金属离子维持在溶液中。特别有用的螯合化合物包括二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸盐/酯(protocatechuate)，或有机酸如柠檬酸。常见的是培养基也含有其他生长因子，如维生素或生长促进剂，其例子包括例如氰钴胺素(或维生素B12的其他形式)、生物素、核黄素、硫胺、叶酸、烟酸、泛酸盐/酯和吡哆醇(pyrridoxin)。生长因子和盐常常源自复杂培养基组分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆和其他等。培养基化合物的确切组成强烈地取决于当前的实验并且对每种具体情况单独决定。关于培养基优化的信息存在于教材“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(编者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN 0 19 9635773)中。也可选择来自商业供应者的生长培养基，如standard 1(Merck)或BHI(grainheart infusion，DIFCO)或其他。

全部培养基组分应当通过加热(在1.5bar和121℃，20min)或通过无菌过滤进行灭菌。所述组分可以一起灭菌或根据需要分别灭菌。

全部培养基组分可以在培养伊始存在，或它们可以任选被连续地或分批地添加。对每个实验单独给定培养条件。

温度通常应当在15℃至45℃之间的范围内，但是该范围可以更高，对于嗜热生物体直至105℃。在实验期间温度可以保持恒定或可以改变。培养基的pH可以在5至8.5的范围内，优选大约7.0，并且可以通过向该培养基添加缓冲液予以维持。用于该目的的示例性缓冲液是磷酸钾缓冲剂。可以选择性地或同时使用合成缓冲液如MOPS、HEPES、ACES及其它。也可通过在生长期间添加酸或碱如乙酸、硫酸、磷酸、NaOH、KOH或NH₄OH来维持恒定的培养pH。如果使用复杂培养基组分如酵母提取物，可以减少额外缓冲液的必要性，原因在于许多复杂化合物具有高缓冲能力的事实。如果发酵罐用于培养微生物，也可以使用气态氨控制pH。

培育时间通常是在几小时至几日的范围内。选择该时间旨在允许最大量的产物累积于培养液中。公开的生长实验可以在多种容器如不同尺寸的微量滴定平板、玻璃管、玻璃烧瓶或玻璃或金属发酵罐中进行。为筛选大量克隆，微生物应当在具备或不具备挡板(baffle)的微量滴定平板、玻璃管或摇瓶中培养。优选使用充以约10％(按体积)的所需生长培养基的100ml或250摇瓶。该烧瓶应当在旋转摇床上(振幅约25mm)使用约100-300rmp的速度范围摇动。可以通过维持湿润空气以减少蒸发损耗；或者，应当进行蒸发损耗的数学校正。

如果测试经遗传修饰的克隆，也应当测试未经修饰的对照克隆或含有无任何插入物的基础质粒的对照克隆。使用在琼脂平板上生长的细胞，接种培养基至OD₆₀₀0.5-1.5，所述琼脂平板如已经在30℃培育的CM平板(10g/l葡萄糖，2,5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨(polypeptone)，5g/l酵母提取物，5g/l肉浸汁，22g/l(NH₄)₂SO₄，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉浸汁，22g/l琼脂，以2M NaOH调节pH为约6.8至7.2)。通过引入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐水悬液或添加这种细菌的液体预培养物来完成培养基的接种。

一般方法

用于一般方法的方案可以在Handbook on Corynebacterium glutamicum，(2005)编者：L.Eggeling，M.Bott.，Boca Raton，CRC Press中、在Martin等人(Biotechnology(1987)5，137-146)、Guerrero等人(Gene(1994)，138，35-41)、Tsuchiya和Morinaga(Biotechnology(1988)，6，428-430)、Eikmanns等人(Gene(1991)，102，93-98)、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(Biotechnology(1991)，9，84-87、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology(1994)，60，126-132)、LaBarre等人(Journal ofBacteriology(1993)，175，1001-1007)、WO 96/15246、Malumbres等人(Gene(1993)，134，15-24)、在JP-A-10-229891中、在Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering(1998)，58，191-195)，Makrides(Microbiological Reviews(1996)，60，512-538)中以及在公知的遗传学和分子生物学教材中找到

菌株、培养基和质粒

菌株可以例如取自但不限于以下列表：

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，

醋谷棒杆菌ATCC 15806，

嗜乙酸棒杆菌ATCC 13870，

热产氨棒杆菌FERM BP-1539，

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965，

黄色短杆菌ATCC 14067，

乳糖发酵短杆菌ATCC 13869，和

叉枝短杆菌ATCC 14020或已经由其衍生的菌株如谷氨酸棒杆菌KFCC10065，DSM 17322或

谷氨酸棒杆菌ATCC21608

Corynebacterium efficiens DSMZ44547、44548、44549

重组DNA技术

方案可以在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，第1、2、3卷和Handbook on Corynebacterium glutamicum(2005)eds.L.Eggeling，M.Bott.，Boca Raton，CRC Press中找到。

氨基酸和甲硫氨酸中间体的定量

通过具有保护套(guard cartridge)的HPLC(Agilent 1100，Agilent，Waldbronn，德国)和Synergi 4μm柱(MAX-RP 80

150*4.6mm)(Phenomenex，Aschaffenburg，德国)来进行分析。在注射前，使用邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇作为还原剂(2-MCE)来衍生化分析物。另外，用碘乙酸封闭巯基。使用40mM NaH₂PO₄(洗脱液A，pH＝7.8，用NaOH调节)作为极性相和甲醇水混合物(100/1)作为非极性相(洗脱液B)以流速1ml/min实施分离。应用以下梯度：始于0％B；39分钟39％B；70分钟64％B；100％B持续3.5分钟；2分钟0％B用于平衡。在室温的衍生化如下文所述进行自动化。首先，在N-二(羟乙基)甘氨酸(0.5M，pH 8.5)中0.5μl的0.5％2-MCE与0.5μl细胞提取物混合。随后，添加在N-二(羟乙基)甘氨酸(0.5M，pH 8.5)中的1.5μl的50mg/ml碘乙酸，随后添加2.5μl N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(0.5M，pH 8.5)。通过添加溶解于1/45/54v/v/v的2-MCE/MeOH/N-二(羟乙基)甘氨酸(0.5M，pH 8.5)中的0.5μl的10mg/ml OPA试剂进行衍生化。最后，用32μl H₂O稀释该混合物。在上述每个抽吸步骤之间存在1min的等待时间。随后将总体积37.5μl注射到所述柱上。注意，如果在样品制备期间(例如在等待时间内)和之后定期清洁自动采样器针头则可以明显地改善分析结果。通过荧光探测器(340nm激发，发射450nm，Agilent，Waldbronn，德国)进行检测。为定量，使用α-氨基丁酸(ABA)或D，L-正缬氨酸作为内标准。

重组方案的定义

在下文将描述如何可以构建具有提高的甲硫氨酸产生效率以执行上述预测的发现的谷氨酸棒杆菌菌株。在描述该菌株的构建之前，给出了将用于下文中的重组事件/方案的定义。

如本文中所用，“Campbell in”指初始宿主细胞的转化体，其中一个完整环状双链DNA分子(例如基于pCLIK int sacB的质粒)已经通过单一同源重组事件(交叉入事件(cross-in event))整合到染色体中，并且这有效地导致所述环状DNA分子的线性化形式被插入到该染色体的第一DNA序列中，其与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源。“Campbelled in”指已经整合至“Campbell in”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbell in”含有第一同源DNA序列的重复，其每个拷贝包括并环绕同源重组交换点(crossover point)的拷贝。此名称来自首先提出这种类型重组的AlanCampbell教授。

如本文中所用，“Campbell out”指从“Campbell in”转化体繁衍下来(descending)的细胞，其中第二同源重组事件(交叉出事件(cross out event))已经在被包含在“Campbelled in”DNA的线性插入DNA上的第二DNA序列与染色体起点的第二DNA序列(其与所述线性化插入物的第二DNA序列同源)之间发生，第二重组事件导致整合的DNA序列的一部分缺失(抛弃jettisoning)，但是重要地是还导致整合的Campbelled in DNA的一部分(该部分可以小到只有单碱基)仍留在该染色体中，从而与原始宿主细胞相比，所述“Campbell out”细胞在该染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单碱基替换、多碱基替换、异源基因或DNA序列的插入、同源基因或经修饰的同源基因的额外一或多个拷贝的插入、或包含多于一个上文所述的例子的DNA序列的插入)。

“Campbell out”细胞或菌株通常但并不必然通过针对基因的反选择而获得，所述基因包含在“Campbelled in”DNA序列的一部分中(即希望抛弃的部分)，例如在约5％至10％蔗糖存在下生长的细胞中表达时是致死的枯草芽孢杆菌sacB基因。借助或不借助反选择，可以通过使用任何可筛选表型来筛选所需细胞而获得或鉴定想要的“Campbell out”细胞，所述表型如但不限于菌落形态、菌落颜色、存在或不存在抗生素抗性、通过聚合酶链反应存在或不存在给定的DNA序列、存在或不存在营养缺陷、存在或不存在酶、菌落核酸杂交、抗体筛选等。术语“Campbell in”和“Campbell out”也可以用作各种时态下的动词以提及上文所述的方法或过程。

应当理解导致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重组事件可以在同源DNA序列内的某DNA碱基范围内发生，并且由于所述同源序列在至少此范围的部分会是彼此相同的，故通常是不可能确切说明交换事件在何处发生。换句话说，不可能确切说明哪个序列源自插入的DNA而哪个序列源自染色体DNA。另外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常被部分非同源的区域分开，并且正是这个非同源区域仍保持留存于“Campbellout”细胞的染色体中。

出于实用性考虑，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一和第二同源DNA序列至少为约200碱基对长，并且可以直至几千碱基对长，然而可以用更短或更长的序列进行所述过程。例如，第一和第二同源序列的长度可以是从约500至2000个碱基，并且通过使得第一和第二同源序列具有大致相同的长度来促进从“Campbell in”获得“Campbell out”，优选二者具有少于200碱基对的差异且最优选二者中较短者是较长者碱基对长度的至少70％。“Campbell In和Campbell-Out方法”在WO2007012078中描述。

实施例

以下实验示范了铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白和黄素氧还蛋白还原酶在微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中的过表达是怎样使得MetH再激活和改善了甲硫氨酸产生。然而，这些实施例无论如何并不意图以任何方式限制本发明。

在下文给出的实施例中，用本领域熟知的方法来构建质粒和大肠杆菌菌株并用来使用“Campbelling in”和Campbelling out”方法(见上文)构建含有复制性质粒和/或多种染色体插入、缺失和替换的谷氨酸棒杆菌菌株。附于菌株名称的后缀“-X”(其中X是一个数字)是指明来自具体菌株构建的一个或多个分离株并且它们是彼此相同或相似的。例如，OM403-4和OM403-8均是M2014的ΔmcbR衍生物(见下文)，源自同一构建实验。

除非另外说明，对甲硫氨酸原养型和辅源营养的全部试验以及对甲硫氨酸原养型的全部选择均是在含有命名为“无甲硫氨酸培养基”或“MF”的化学限定培养基、添加或不添加终浓度100mg/l的甲硫氨酸的琼脂培养平板上进行的。下文给出MF的配方。全部原液通过高压灭菌20min或通过Nalgene 0.2微米过滤元件过滤而灭菌。

大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的原养型菌株将在不添加甲硫氨酸的MF培养基上良好生长。大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的营养缺陷菌株将仅在添加了充足(通常约5至100mg/l)甲硫氨酸的MF培养基上良好生长。

无甲硫氨酸培养基

以得到总共约1升：

20g琼脂

785ml蒸馏水

高压灭菌，并且在混合物仍是热的时候添加并混合：

100ml的100g/l Difco^TM Methionine Assay Medium，过滤除菌

100ml的10X Spizizen盐

6ml的50％葡萄糖，高压灭菌

5ml的400mM L-苏氨酸，过滤除菌

5ml的10g/l L-半胱氨酸HCl，过滤除菌

4ml的“4B”溶液

5ml的2％CaCl₂二水合物，高压灭菌

倾倒25ml至每个100mm培养平板中

4B溶液

以得到总共约100ml：

25mg硫胺素HCl(维生素B₁)

5mg氰钴胺素(维生素B₁₂)

2.5ml的1mg/ml生物素，溶于50mM磷酸钾，pH 7.0

125mg吡哆醇HCl(维生素B6)

蒸馏水至100ml，过滤除菌

10X Spizizen盐：

以得到总共约1升：

20g硫酸铵

174g磷酸氢二钾(三水合物)

60g磷酸二氢钾(无水)

10g柠檬酸钠

2g硫酸镁(七水合物)

蒸馏水至1升

1ml微量营养溶液***

高压灭菌后，添加3.5ml过滤除菌的4g/l FeCl₃·6H₂O

***微量营养溶液：

以得到总共1升：

0.15g Na₂MoO₄·2H₂O

2.5g  H₃BO₃

0.7g  CuSO₄·5H₂O

1.6g  MnCl₂·4H₂O

0.3g  ZnSO₄·7H₂O

蒸馏水至100ml，过滤除菌

脑心浸液培养基(BHI)，又叫做用于谷氨酸棒杆菌生长的“丰富培养基”：

37.5g Bacto^TM Brain Heart Infusion(Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD)

15g琼脂

蒸馏水至1升

高压灭菌，冷却至60℃，根据需要添加抗生素(例如2.5ml的10mg/ml硫酸卡那霉素，过滤除菌)

倾倒25ml至每个100mm培养平板中

除非另外说明，谷氨酸棒杆菌的常规转化是通过以下完成的，即按制造商推荐使用Bio Rad电穿孔仪(型号1652076 Gene Pulser连同型号1652098 Pulse Controller)进行电穿孔并在补加了适宜抗生素例如25mg/l硫酸卡那霉素的BHI(脑心浸液)培养基(见下文)上对谷氨酸棒杆菌的抗生素抗性转化体进行选择。

除非另外说明，本文中所述的对甲硫氨酸生产的全部试验使用采用糖蜜培养基的“标准摇瓶”方案。所述糖蜜培养基含有添加的2mM苏氨酸并且将烧瓶在30℃摇动约48h。

摇瓶实验和HPLC测定：

采用标准糖蜜培养基，摇瓶实验以一式两份或一式四份的菌株进行。糖蜜培养基在1升培养基中含有：40g葡萄糖；60g糖蜜；20g(NH₄)₂SO₄；0.4g MgSO₄*7H₂O；0.6g KH₂PO₄；10g酵母提取物(DIFCO)；5ml的400mM苏氨酸；2mgFeSO₄.7H₂O；2mg的MnSO₄.H₂O；和50g CaCO₃(Riedel-deHaen)，用ddH₂O补足体积。pH用20％NH₄OH调节至7.8。将20ml连续搅拌的培养基(旨在使CaCO₃保持悬浮)添加至250ml有挡板的Bellco摇瓶并将该摇瓶高压灭菌20min。在高压灭菌之后，每升基础培养基添加4ml“4B溶液”(或80μl/烧瓶)。该“4B溶液”每升含有：0.25g的盐酸硫胺素(维生素B1)，50mg的氰钴胺素(维生素B12)，25mg生物素，1.25g盐酸吡哆醇(维生素B6)并用12.5mM KPO₄，pH 7.0缓冲以溶解生物素，并进行过滤除菌。将培养物在用橡皮带固定的Bioshield纸所覆盖的有挡板的烧瓶中于约28℃或30℃以及在200或300rpm的New Brunswick Scientific立式摇床(floorshaker)上生长约48h。一般在约24小时和/或约48小时取样品。通过离心除去细胞，随后将上清液用等体积的60％乙腈或60％乙醇稀释并且继而使用Centricon 0.45μm离心柱对该溶液混合物进行膜过滤。使用HPLC对滤液分析甲硫氨酸、甘氨酸加高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和其它指定的氨基酸的浓度。

对于所述HPLC分析，过滤的上清液用经过0.45μm过滤的1mMNa₂EDTA作1∶100稀释并且将1μl该溶液用OPA试剂(AGILENT)在硼酸盐缓冲液(80mM NaBO₃，2.5mM EDTA，pH 10.2)中衍生化并将其注射至200x4.1mm Hypersil 5μ AA-ODS柱上，其中所述柱在配备了G1321A荧光检测仪(AGILENT)的Agilent 1100系列HPLC上运行。激发波长是338nm而所监测的发射波长是425nm。将氨基酸标准溶液层析并用来确定各种氨基酸的停留时间和标准峰面积。Agilent提供的附带软件包Chem Station被用于仪器控制、数据获取和数据处理。硬件是HP奔腾4计算机，其支持升级至微软服务包(SP6a)的Microsoft Windows NT 4.0。

实验1：菌株M2014的产生

将谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032用DNA A(也称作pH273)(SEQ IDNO：25)转化并进行“Campbell in”以产生“Campbell in”菌株。该“Campbell in”菌株随后进行“Campbelled out”以产生“Campbell out”菌株M440，其含有编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的基因(hom^fbr)。所得高丝氨酸脱氢酶蛋白包括其中S393被改变成F393的氨基酸变化(称作Hsdh S393F)。

随后将该菌株M440用DNA B(也称作pH373)(SEQ ID NO：26)转化以产生“Campbell in”菌株。该“Campbell in”菌株随后进行“Campbelled out”以产生“Campbell out”菌株M603，其含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶的基因(Askfbr)(由lysC编码)。在所得的天冬氨酸激酶蛋白中，T311被改变成I311(称作LysC T311I)。

发现菌株M603产生约17.4mM赖氨酸，而ATCC13032菌株未产生可测量量的赖氨酸。此外，与未产生可测量量的ATCC13032菌株相比，M603菌株产生约0.5mM高丝氨酸，如表2中所总结的。

表2：由菌株ATCC13032和M603所产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

将所述菌株M603用DNA C(也称作pH304)(SEQ ID NO：27)转化以产生“Campbell in”菌株，随后对其进行“Campbelled out”以产生“Campbell out”菌株M690。该M690菌株在metH基因上游含有PgroES启动子(称作P₄₉₇metH)。P₄₉₇启动子的序列在SEQ ID NO：22中描述。该M690菌株产生约77.2mM赖氨酸和约41.6mM高丝氨酸，如下表3中所述。

表3：由菌株M603和M690所产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

随后对M690菌株进行如下诱变：将在BHI培养基(BECTONDICKINSON)中生长的M603过夜培养物在50mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中洗涤，在30℃用N-甲基-N-亚硝基胍(10mg/ml于50mM柠檬酸盐中，pH5.5)处理20min。处理后，将细胞在50mM柠檬酸盐缓冲液pH5.5中再次洗涤并涂布在含有以下成分的培养基上(所提及的全部量以500ml培养基计算)：10g(NH₄)₂SO₄；0.5g KH₂PO₄；0.5g K₂HPO₄；0.125g MgSO₄*7H₂O；21gMOPS；50mg CaCl₂；15mg原儿茶酸；0.5mg生物素；1mg硫胺；和5g/lD，L-乙硫氨酸(SIGMA CHEMICALS，CATALOG#E5139)，用KOH调节至pH7.0。此外，培养基含有由以下组成的0.5ml微量金属溶液：10g/lFeSO₄*7H₂O；1g/l MnSO₄*H₂O；0.1g/l ZnSO₄*7H₂O；0.02g/l CuSO₄；和0.002g/l NiCl₂*6H₂O，全都溶于0.1M HCl中。最终培养基通过过滤除菌并向该培养基添加40ml无菌50％葡萄糖溶液(40ml)和无菌琼脂至终浓度1.5％。将含有琼脂的最终培养基倾倒至琼脂平板并标记为极限-乙硫氨酸培养基。将经过诱变的菌株铺在该平板(极限-乙硫氨酸)上并在30℃培育3-7日。将生长在该培养基上的克隆分离并在相同的极限-乙硫氨酸培养基上再划线。选择几个克隆用于甲硫氨酸生产分析。

如下分析甲硫氨酸生产。将菌株在30℃于CM-琼脂培养基上生长2日，所述CM-琼脂培养基含有：10g/l D-葡萄糖，2.5g/l NaCl；2g/l尿素；10g/l BactoPeptone(DIFCO)；5g/l酵母提取物(DIFCO)；5g/l牛肉提取物(DIFCO)；22g/l琼脂(DIFCO)并在约121℃高压灭菌20min。

在菌株生长后，将细胞刮下并重悬于0.15MNaCl中。对于主要培养物，连同0.5g固体和高压灭菌的CaCO₃(RIEDEL DE HAEN)一起，将刮下的细胞悬液以600nm的起始OD添加到约1.5至10ml培养基II(见下文)中，并且将该细胞于30℃在轨道振荡平台上的100ml无挡板摇瓶中以约200rpm培育72h。培养基II含有：40g/l蔗糖；60g/l来自糖蜜的总糖(对糖含量计算)；10g/l(NH₄)₂SO₄；0.4g/l MgSO₄*7H₂O；0.6g/l KH₂PO₄；0.3mg/l硫胺素*HCl；1mg/l生物素；2mg/l FeSO₄；和2mg/l MnSO₄。将该培养基用NH₄OH调节至pH 7.8并在约121℃高压灭菌约20min。高压灭菌并冷却后，从过滤除菌原液(200μg/ml)添加维生素B12(氰钴胺素)(SIGMA CHEMICALS)至终浓度100μg/l。

从培养基取样品并分析氨基酸含量。使用Agilent氨基酸方法在Agilent1100 Series LC System HPLC(AGILENT)上确定所产生的氨基酸，包括甲硫氨酸。该样品用邻苯二甲醛进行的柱前衍生化允许在Hypersil AA-column(AGILENT)上分离后对所产生的氨基酸定量。

分离了显示出至少两倍于M690中的甲硫氨酸滴度的克隆。用于进一步实验的这样一个克隆被命名为M1197并在2005年5月18日以菌株编号DSM 17322保藏于DSMZ菌株保藏中心。将该菌株的氨基酸产生与菌株M690的氨基酸产生进行比较，如下文表4中总结。

表4：由菌株M690和M1197所产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

将菌株M1197用DNA F(也称作pH399，SEQ ID NO：28)进行转化以产生“Campbell in”菌株，随后将该“Campbell in”菌株进行“Campbelled out”以产生菌株M1494。此菌株在高丝氨酸激酶的基因中含有突变，其在所得的高丝氨酸激酶中导致从T190至A190(称作HskT190A)的氨基酸改变。将该菌株M1494的氨基酸产生与菌株M1197的氨基酸产生进行比较，如下文表5中总结。

表5：由菌株M1197和M1494所产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

将所述菌株M1494用DNA D(也称作pH484，SEQ ID NO：29)进行转化以产生“Campbell in”菌株，随后将该“Campbell in”菌株进行“Campbelledout”以产生M1990菌株。该M1990菌株使用groES-启动子和EFTU(延伸因子Tu)启动子过表达metY等位基因(称作P₄₉₇P₁₂₈₄metY)。P₄₉₇P₁₂₈₄启动子的序列在SEQ ID NO：30中描述。将菌株M1494的氨基酸产生与菌株M1990的氨基酸产生进行比较，如下文表6中总结。

表6：由菌株M1494和M1990所产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

将菌株M1990用DNA E(也称作pH491，SEQ ID NO：31)进行转化以产生“Campbell in”菌株，随后将该“Campbell in”菌株进行“Campbelled out”以产生“Campbell out”菌株M2014。该M2014菌株使用超氧化物歧化酶启动子过表达metA等位基因(称作P₃₁₁₉metA)。P₃₁₁₉启动子的序列在SEQ ID NO：21中描述。将该菌株M2014的氨基酸产生与菌株1990的氨基酸产生进行比较，如下文表7中总结。

表7：由菌株M1494和M1990所产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

实验2-从M2014缺失mcbR

使用含有RXA00655缺失的质粒pH429(SEQ ID NO：32)以通过整合和切除将mcbR缺失引入谷氨酸棒杆菌(见WO 2004/050694A1)。

用卡那霉素抗性选择将质粒pH429转化到M2014菌株中(Campbell in)。使用sacB反选择，将转化菌株的卡那霉素敏感性衍生物分离，其已经因切除作用可假定地丧失整合的质粒(Campbell out)。转化的菌株产生了形成小菌落和较大菌落的卡那霉素敏感性衍生物。将两种大小的菌落均通过PCR进行筛选以检测mcbR缺失的存在。较大的菌落均不含有该缺失，而60-70％的小菌落含有预期的mcbR缺失。

在将原始分离株于BHI平板上划线为单菌落时，出现了微菌落和小菌落的混合。在将微菌落于BHI上再划线时，又一次出现了微菌落和小菌落的混合。在将小菌落于BHI上再划线时，菌落大小通常是小且均一的。选择两个名为OM403-4和OM403-8的单个小菌落分离物用于进一步研究。

摇瓶实验(表8)示出OM403-8产生至少亲代M2014的两倍量的甲硫氨酸。此菌株也产生少于M2014的五分之一量的赖氨酸，表明碳流(carbon flux)从天冬氨酸半醛至高丝氨酸的转向。第三个明显差异是OM403相对于M2014增加大于10倍的异亮氨酸积累。培养物在标准糖蜜培养基中生长48小时。

表8：在以新鲜生长细胞接种的摇瓶培养物中由OM403菌株分离物的氨基酸产生

如表9中也显示的那样，OM403相对于M2014有大于15倍降低的O-乙酰高丝氨酸积累。对于此结果的最可能解释是M2014中积累的大部分O-乙酰高丝氨酸在OM403中正转化成甲硫氨酸、高半胱氨酸和异亮氨酸。培养物在标准糖蜜培养基中生长48小时。

表9：在以新鲜生长细胞接种的摇瓶培养物中OM403的两个分离物的氨基酸产生

菌株	缺失ΔmcbR	Met	OAc-Hse	Ile
							(g/l)	(g/l)	(g/l)
M2014	无	0.4	3.4	0.1
							0.4	3.2	0.1
OM403-4	ΔRXA0655	1.7	0.2	0.3
							1.5	0.1	0.3
OM403-8	ΔRXA0655	2.2	＜0.05	0.6
							2.5	＜0.05	0.6

实验3-甲硫氨酸合酶是甲硫氨酸合成中的限制步骤

将已经被工程化以产生甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株OM403-8用过表达metE_Cg基因的复制型质粒pH447(SEQ ID No.：33)转化以产生菌株OM419或用过表达metH_Cg的pH170(SEQ ID No.：34)转化以产生菌株OM418。使用我们的标准摇瓶方案，对该两个菌株及其用空载体pCLIK转化的亲代进行甲硫氨酸产生的测试，结果在下表10中显示。

表10：在摇瓶培养物中过表达metE_Cg或metH_Cg的OM403转化体的甲硫氨酸产生。

OM418和OM419中甲硫氨酸合酶的增加均导致甲硫氨酸滴度增加，表明甲硫氨酸合酶是OM403-8中的限制步骤。

然而，基于由考马斯蓝染色的蛋白质凝胶所估计的OM418中MetH_Cg浓度增加至少5倍，则来自OM418的甲硫氨酸滴度增加的程度或多或少地小于预计。

实验4-大肠杆菌MetH自身在谷氨酸棒杆菌中没有功能

首先通过使用质粒pH469(SEQ ID No.：35)缺失metE的一部分并随后通过使用质粒pH300(SEQ ID No.：36)缺失metH的一部分来从菌株M2014构建谷氨酸棒杆菌菌株OM246C。如预期那样，OM246C是甲硫氨酸营养缺陷的。

如预期那样，当用含有P₄₉₇metE_Cg的复制型质粒(pH447，SEQ ID No.：33)或含有P₄₉₇metH_Cg的复制型质粒(pH170，SEQ ID No.：34)转化时，所得的转化体是甲硫氨酸原养型。后一种转化体依赖于培养基中的氰钴胺素，而前者不是。

然而，当用设计用来在bioAD_Cg处整合的含有P₁₅metH_Ec的整合型质粒(pOM232，SEQ ID No.：37)转化OM246C时，名为OM292的所得转化体在氰钴胺素存在时仍是营养缺陷体，即便可以在考马斯蓝染色的蛋白质凝胶上看到MetH_Ec蛋白。P₁₅(SEQ ID No.：38)是衍生自枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1的组成型强启动子。然而，在将大肠杆菌metE、metH突变体、RY714B(对于RY714B见实施例5)用pOM232(其作为附加型质粒在大肠杆菌中复制)转化时，所得的转化体是原养型，表明pOM232上的metH_Ec基因是有功能的。来自此实施例的令人吃惊的发现是MetH_Ec自身在谷氨酸棒杆菌中并不必然是有功能的。

实验5-谷氨酸棒杆菌MetH自身在大肠杆菌中没有功能

通过安置metE_Ec::Tn10等位基因并缺失metH_Ec的一部分而从菌株YMC9(ATCC 33927)构建大肠杆菌菌株RY714B。如预期那样，RY714B是甲硫氨酸营养缺陷型。

当用含有P₄₉₇metE_Cg的复制型质粒(pH447，SEQ ID No.：33)转化RY714B时，转化体成为甲硫氨酸原养型，但是当用从P₁₅启动子表达metH_Cg的P₄₉₇metH_Cg(pH170，SEQ ID No.：34)或pOM240(SEQ ID No.：39)转化RY714B时，所得的转化体仍是甲硫氨酸营养缺陷型，即使在氰钴胺素存在下以及即便可以在考马斯蓝染色的蛋白质凝胶上看到MetH_Cg蛋白也是如此。然而，作为阳性对照，当RY714B用在大肠杆菌中由pSC101复制起点复制并携带P₁₅metH_Ec的质粒(pOM232，SEQ ID No.：37)转化时，所得的转化体在氰钴胺素存在时是原养型。来自此实施例的令人吃惊的发现是MetH_Cg自身在大肠杆菌中并不必然是有功能的。

实验6-大肠杆菌黄素氧还蛋白可以在谷氨酸棒杆菌中再激活大肠杆菌MetH

谷氨酸棒杆菌菌株OM292(见实施例4)是缺失了metE_Cg和metH_Cg的OM246C的衍生物，但是含有整合的metH_Ec。然而，OM292是甲硫氨酸营养缺陷型。

通过在crtEb_Cg基因座插入P₁₅fldA_Ec盒的Campbelling in和out过程用整合型质粒pOM324(SEQ ID No.：40)转化OM292。

名为OM182的所得菌株是甲硫氨酸原养型，表明大肠杆菌黄素氧还蛋白(FldA_Ec)足以在谷氨酸棒杆菌中再激活MetH_Ec。由于OM182缺少大肠杆菌黄素氧还蛋白还原酶(FldR_Ec)，则假设谷氨酸棒杆菌含有可以发挥作用以再循环(再还原)大肠杆菌黄素氧还蛋白的还原酶似乎是合理的。

实验7-大肠杆菌MetH再激活系统在谷氨酸棒杆菌中的重构

使用“Campbelling in”和Campbelling out”过程用pOM154(SEQ ID No.：41)转化来自前面实验6的谷氨酸棒杆菌菌株OM182。质粒pOM154设计用于在marR_Cg基因座处整合P₁₅fldR_Ec盒。名为OM190的所得菌株含有表达metH_Ec、fldA_Ec和fldR_Ec的盒。在我们的标准摇瓶方案中用糖蜜培养基对菌株OM190及其使用天然MetH_Cg再激活系统的前辈菌株M2014的甲硫氨酸产生进行测试(见下表11)。

表11：由OM246C衍生的、含有整合在bioAD处的P₁₅metH_Ec并在摇瓶中的糖蜜培养基内生长48小时的菌株的甲硫氨酸产生。

OM190分离株产生远比(用空载体转化的)祖代OM246C多的甲硫氨酸以及与对照菌株M2014几乎同样多的甲硫氨酸，表明在谷氨酸棒杆菌中重构时，大肠杆菌MetH_Ec系统可以几乎与天然谷氨酸棒杆菌系统同样好地发挥功能。可以增加大肠杆菌MetH_Ec表达盒的拷贝数以提高大肠杆菌MetH_Ec的水平并因此增加其活性。

实验8-谷氨酸棒杆菌FprA1具有对甲硫氨酸生物合成重要的功能

谷氨酸棒杆菌含有背驰转录(divergently transcribed)的操纵子，该操纵子编码许多(若非全部)参与用于半胱氨酸及甲硫氨酸生物合成的硫酸盐还原成硫化物的基因。该操纵子的左侧如常规所绘制那样可能仅含有一个编码蛋白质的基因fprA1_Cg，其中所述的蛋白质被标注为假定在硫酸盐还原中发挥作用的铁氧还蛋白蛋白质还原酶。构建名为pOM413(SEQ ID No：42)的质粒来将此操纵子的受调节的天然趋异启动子(divergent promoter)替换为在谷氨酸棒杆菌中不受调节的不同的趋异启动子。pOM413含有大肠杆菌噬菌体λP_RM/P_R趋异启动子来替代所述的天然硫酸盐还原调节子趋异启动子，其中相对弱的P_RM启动子驱动fprA1_Cg基因的表达而相对较强的λP_R启动子驱动硫酸盐还原操纵子多基因部分的表达。

将菌株M2014用pOM413转化，选择卡那霉素抗性。在sacB反选择后，从衍生自每种质粒的转化体中分离卡那霉素敏感性衍生物。通过PCR分析这些以确定所述硫酸盐还原调节子的启动子结构。大约50％衍生自pOM413的分离株含有P_RM/P_R趋异启动子区，表明在剪切该质粒期间没有发生畸偏(bias)。将含有P_RM/P_R趋异启动子区的分离株命名为OM404。

OM404的菌落在大小上与M2014亲代菌株的那些菌落没有明显不同，并且没有OM404比M2014生长更慢的迹象。使用我们的标准摇瓶方案，对OM404的6个分离株测试了氨基酸产生。结果(表12)显示OM404的全部分离株产生的甲硫氨酸滴度少于M2014产生的甲硫氨酸滴度的一半。

表12：摇瓶培养物中OM404分离株的甲硫氨酸产生

组成型趋异启动子的引入明显对甲硫氨酸生产具有负作用，但不清楚是否是一种转录物或另一种转录物或两者都造成该作用。

对这些结果的一种解释可能是某一种已经通过替代天然启动子而削弱了硫酸盐还原途径并因而限制了甲硫氨酸产生。

为了独立评估所述菌株的硫酸盐还原活性，采用了用来评估相对硫化物产生的技术。将滤纸条浸泡在用0.1M磷酸钾pH 7.2缓冲的Ellman试剂(DTNB)的5mM溶液中，随后干燥。将一张这种干燥的条悬于待测试48小时的菌株的每份摇瓶培养物液体上方的空气空间中。由生长的培养物所产生的硫化氢还原DTNB，产生其强度大致与所产生H₂S的量成正比的黄色直至一个极限。因此，所产生颜色的强度可以用来获得各个菌株的相对硫酸盐还原活性的粗略估计。使用这种方法测试菌株M2014、OM403(M2014ΔmcbR)和OM404。结果在下表13中显示。

表13：M2014和衍生物的硫酸盐还原活性的Ellman试剂测试

结果(表13)表明OM403具有最大的硫酸盐还原活性，M2014具有最小的硫酸盐还原活性。菌株OM404显示中等水平的活性，OM404具有大于M2014的活性。因此，所述结果多少有点矛盾：与OM2014相比，在OM404中硫酸盐还原明显上升，但是甲硫氨酸产生下降。这是令人惊讶的结果，因为在文献中据报道fprA1_Cg基因(在该参考文献中名为fpr2)的缺失产生与野生型相似的表型，换句话说，基于硫酸盐作为唯一硫来源时没有辅源营养和相似的生长速率(Ruckert等人(2005)BMC Genomics，6，121)。

对这些结果的一种解释可能是fprA1_Cg从λP_RM启动子的表达弱于来自天然启动子的表达，并且fprA1_Cg参与甲硫氨酸合成中与硫酸盐还原分开的方面，即便它仍可能还在硫酸盐还原方面发挥作用。

FprA1_Cg被假设为可以是用于再循环MetH_Cg再激活的氧化还原组分的还原酶。即便被标注为铁氧还蛋白还原酶，FprA1_Cg可以因而是用于再激活MetH_Ec的FldR_Ec的功能性等价物。

pOM413也用来将趋异λP_RM/P_R启动子整合至菌株OM403-4中以产生名为OM406的菌株。如同OM404的情况，使用标准摇瓶方案，OM406分离株产生比其亲代少的甲硫氨酸，如下表14中所示。

表14：OM406的两个分离株的甲硫氨酸产生

此外，在考马斯蓝染色的蛋白质凝胶上，从OM403-4的提取物可见到具有FprA1_Cg预测大小的条带，但从OM406分离株则见不到。这些数据支持此假设：FprA1_Cg对甲硫氨酸合成是重要的得到了进一步支持。

随后如下再向OM406-6中引入高水平的FprA1_Cg。

构建了在谷氨酸棒杆菌中复制并含有以高水平从λP_R启动子表达fprA1_Cg的盒的质粒。该质粒命名为pOM429(SEQ ID No：43)。用pOM429转化的OM406-6的分离株命名为OM454。

在摇瓶培养物中，OM454分离株产生远比亲代OM406多的甲硫氨酸(见下表15)，几乎与祖代OM403-4同样多。

表15：OM454的甲硫氨酸产生

此外，在用考马斯蓝染色的SDS PAGE蛋白质凝胶上运行的OM454的全细胞提取物在FprA1_Cg的预期大小处显示出明显条带，表明高水平FprA1_Cg合成已经由pOM429在OM454中恢复。因此，驱动fprA1_Cg表达的强λP_R与驱动硫酸盐还原操纵子(OM454)多基因分支的表达的λP_R的组合与产生低得多水平的FprA1_Cg(OM406)的等基因菌株相比导致更高的甲硫氨酸产生。此结果进一步显示FprA1_Cg在硫酸盐还原之外的步骤中或替代硫酸盐还原的步骤中对于甲硫氨酸产生是重要的。因此，对于FprA1_Cg在MetH_Cg再激活方面发挥作用的假设又有了进一步的支持。

实验9-铁氧还蛋白可能在谷氨酸棒杆菌的MetH再激活中发挥作用

对亚麻短杆菌基因组的一个区域检验编码参与硫酸盐还原的酶的基因，发现操纵子(SEQ ID No.：44)含有与谷氨酸棒杆菌的硫酸盐还原操纵子的那些基因相似的基因(Ruckert et al.，见上)。

然而，亚麻短杆菌操纵子结构的细节不同于相关的谷氨酸棒杆菌硫酸盐还原操纵子。特别地，亚麻短杆菌硫酸盐还原操纵子是单向的，并且亚麻短杆菌fprA1_Bl基因(FprA1_Bl是FprA1_Cg的密切同系物)连同其他硫酸盐还原基因一起转录。此外，标注为“铁氧还蛋白”的基因存在于该亚麻短杆菌硫酸盐还原操纵子中，就在fprA1_Bl基因的上游(Ruckert等人，见上文)。

在谷氨酸棒杆菌基因组中，与来自亚麻短杆菌硫酸盐还原操纵子的铁氧还蛋白最密切的同系物是标注为编码“铁氧还蛋白3”的两个基因。这两个基因在本文中命名为fdxC和fdxD。在谷氨酸棒杆菌基因组中，fdxC_Cg和fdxD_Cg均不位于也不接近硫酸盐还原操纵子并且也不接近已知参与甲硫氨酸生物合成的任何其他基因。

然而，一些微生物包括但不限于谷氨酸棒杆菌被假设为可以在MetH再激活中使用FdxC和/或FdxD或其密切同系物。

构建了名为pOM327的质粒(SEQ ID No.：45)，该质粒使用pACYC177复制起点在大肠杆菌中复制并且该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、在非诱导条件下从称作Ptet的四环素调节启动子表达非致死水平FprA1_Cg的表达盒以及从质粒pH170亚克隆的P₄₉₇metH_Cg盒。质粒pOM327也含有名为tetR基因的拷贝，该基因编码Ptet启动子的阻抑物，但是其允许在无诱导剂时自Ptet的低水平渗漏表达。

随后，使用谷氨酸棒杆菌基因组DNA质粒文库，通过在大肠杆菌中的互补作用来克隆fdxC_Cg基因。该质粒文库名义上由谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA片段的8千碱基(kb)插入物组成，其中所述插入物来自Sau 3A1的部分(不完全)消化，连接到pCLIK的BamHI位点，所述pCLIK是在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中均复制的质粒载体。将约100ng文库DNA转化到RY714B/pOM327中，并在无甲硫氨酸的培养基上选择甲硫氨酸原养型。来自该文库的两个独特克隆从该选择中被分离出来，并且两者均含有fdxC_Cg基因。将含有fdxC_Cg基因、dapC_Cg基因和一些侧翼DNA的约1744碱基的片段亚克隆到质粒pH170(SEQ ID No.：34)或质粒pH382(SEQ ID No.：46)的Sma I位点中，其中所述pH170是含有P₄₉₇metH_Cg盒的复制型质粒，所述pH382是在P₄₉₇metH_Cg盒之外还含有表达metY_Cg和metX_Cg的盒的复制型质粒。衍生自pH382并且以“正向”方向(与P₄₉₇metH_Cg以相同方向转录)含有一个拷贝fdxC_Cg亚克隆的分离株命名为为pOM160(SEQ ID No.：47)。衍生自pH170并且均以“正向”方向(与P₄₉₇metH_Cg以相同方向转录)含有两个拷贝fdxC_Cg亚克隆的分离株命名为pOM161(SEQ ID No.：48)。

当将所述质粒pOM327和pOM160或pOM327和pOM161转化到天然RY714B中时，转化体是甲硫氨酸原养型。该原养型是氰钴胺素依赖性的。当将pOM160或poM161却没有pOM327转化到RY714B中并且将转化体混合物直接涂布在无甲硫氨酸平板上时，没有转化体生长。

因此，来自pOM160和pOM161的原养型是由fprA1_Cg和fdxC_Cg基因、dapC_Cg基因或后两者的组合所赋予的。

由于已经建立了dapC基因来编码参与赖氨酸生物合成的熟知的酶，即N-琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶，DapC_Cg直接参与甲硫氨酸合成或MetH再激活是很不可能的。然而，可以通过缺失来自pOM160和pOM161的dapC基因的大部分来显示dapC不是MetH_Cg激活所必需的。通过如此方式完成这一点，即注明dapC_Cg基因含有两个SalI位点、进行每种质粒的部分SalI消化、分离适当大小片段(来自pOM160的12,702bp和来自pOM161的9811bp)、连接、用在dapC基因中两个Sal I位点之间切割一次的Mfe I切割之后、转化RY714B并筛选已经缺失了位于dapC内部的810bp Sal I片段的质粒。随后在RY714B中测试所得质粒的甲硫氨酸辅源营养的互补作用。

实验10-本发明推广至其他MetH再激活系统

上述实验中公开的方法和材料可以用来鉴定、测试或确认来自除谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌之外的其他生物体如来自棒杆菌属、埃希氏菌属、短杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属等的物种的钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的组分。可以通过PCR、诱变性PCR引物和本领域熟知的技术将pOM327中的metH_Cg编码序列用编码MetH的密切同系物的DNA或cDNA序列置换以产生名为pHYP1的质粒。随后在转化入RY714B后，对所得质粒pHYP1测试其赋予甲硫氨酸原养型的能力。如果pHYP1不能够赋予原养型，则MetH再激活系统的一种或多种组分可能丢失。使用来自metH基因所分离自的生物体(或其密切亲属)中的DNA片段或cDNA片段的库(pool)在与pOM327衍生物pHYP1相容的适宜载体(例如pCLIK)中构建了适宜的基因组DNA文库(或cDNA或DNA表达文库)。若适宜或需要，该文库载体的克隆位点将毗邻于启动子(例如P₄₉₇)以及正好在启动子(例如P₄₉₇)下游，所述启动子以中等水平在大肠杆菌中发挥作用。随后将该文库转化到RY714B/pHYP1中，并且直接在MF培养基上选择甲硫氨酸原养型，或者间接地从含有适宜抗生素的丰富平板汇集转化体之后随后在MF培养基上选择或筛选。赋予原养型的文库分离株将含有编码所需再激活因子的一或多个基因。编码该再激活蛋白质的基因可以通过亚克隆实验来鉴定。

类似地，可以将pOM327或pHYP1的fprA1_Cg基因编码序列用含有疑为编码MetH再激活系统组分(例如FprA1_Cg或FldR_Ec的密切同系物)的基因的编码序列的DNA或cDNA序列来取代以产生pHYP2，并且RY714B/pHYP2可以用来从文库中选择或筛选编码再激活因子的基因。

在已经如上所述那样鉴定或证实与特定MetH一起发挥作用的再激活因子后，则该再激活系统的一种或多种组分可以在同源宿主生物体中过表达或在异源宿主生物体中重构并且测试其改善的甲硫氨酸产生。使用这种方法可以例如在谷氨酸棒杆菌中过表达fdxC和fprA1。

实验11-FdxC的密切同系物

在2006年1月18日进行的NCBI非冗余(nr)氨基酸GenBank序列数据库(全部翻译的编码序列)的BLASTp检索中，FdxC_Cg的氨基酸序列(SEQ IDNo.：1)被用作查询项。网页地址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

使用该网站提供的默认参数。如预期的那样，输出结果表中的第一项是查询项本身FdxC_Cg。后续几项是来自与谷氨酸棒杆菌密切相关的棒杆菌物种中的密切同系物。可以在该表中找到FdxC_Cg的众多其他密切同系物。该表中的第五项是来自NCBI GenBank谷氨酸棒杆菌ATCC 13032经标注的基因组的标注为“铁氧还蛋白3”的第二个基因的氨基酸序列。编码这种密切同系物的这个基因已经被命名为fdxD_Cg以使之区别于fdxC_Cg。

FdxD可以使用本领域熟知的方法克隆。例如，可以使用PCR将其连同上游和下游侧翼DNA序列一起克隆。有用引物的例子是RY842(5’-pGATAGGTCGCAGCGGTGATCTGTT-3’)(SEQ ID No.：49)和RY841(5’-pAGTGGATCCTCGCACTCTTGGTGGTGATTTGGTCAATGAT-3’)(SEQID No.：50)，其中“5’-p”意指在合成引物5’端处的磷酸残基。如制造商所推荐使用Pfu聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.)并以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板。头4个循环的引物复性在54℃进行，随后在58℃进行另外25个循环，在72℃进行1分钟延伸。将所得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化并克隆到质粒pH382或pH170的Sma I位点中以分别产生质粒pOM352和pOM350(SEQ ID NO.：51和60)。可以如上文所述那样进行再激活功能的测试。

或者，可以通过PCR克隆无任何上游侧翼DNA序列和一些下游侧翼序列或无下游侧翼序列的fdxD编码区以用于将其安置到表达载体如pOM324(SEQ ID No.：40)中，从而用fdxD_Cg编码区替代fldA_Ec编码区。用于该方法有用的引物的例子是RY843(5’-pTTATTCTAGAAGGAGGAGAAAACATGACCTACACAATCGCCCAGCCCT)(SEQ ID No.：52)和RY847(5’-pCCATCACTATGAGGATCCAGGAACAACTATTGGTACGAG)(SEQ IDNo.：53)。

如上文那样，Pfu聚合酶如制造商所推荐那样用于总计29个循环，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板。头4个循环的引物复性在54℃进行，在72℃进行1分钟延伸，随后后续25个循环的复性温度升高到58℃，而其余循环参数不变。使用为此目的设计的Qiagen离心柱来将得到的所需PCR DNA产物从其他反应物中纯化出来。接着，将该PCR产物用Xba I和Bam HI切割以产生粘性末端并连接到pOM322或pOM324的Xba I至Bam H1主链以分别产生质粒pOM355(SEQ ID No.：54)和pOM356(SEQ ID No.：55)。所得质粒可以继而用来如上文所述那样测试再激活功能。也可以如上对FdxC和FprA1那样测试FdxD或FdxA与FprA1之外的还原酶(如FprA2、FprA3、FldR1等)发挥作用以再激活MetH_Cg的能力。

以下实施例描述了一些有用起始生物体的制备。

实验12-减少metQ表达

为了减少OM403-8中甲硫氨酸的输入，将metQ基因的启动子和5’部分缺失。所述metQ基因编码甲硫氨酸输入复合体的亚单位，其是复合体发挥作用所需的。这通过使用标准Campbelling in和Campbelling out技术用质粒pH449(SEQ ID NO：56)来完成。在摇瓶测定法中测定OM403-8和OM456-2的甲硫氨酸产生。结果(表16)显示OM456-2比OM403-8产生了更多的甲硫氨酸。培养物在标准糖蜜培养基中生长48小时。

表16：OM456-2的摇瓶测定

实验13-OM469的构建

通过在OM456-2中用噬菌体λP_R启动子取代metF启动子构建了称作OM469的菌株，其包括metQ的缺失和metF的过表达。这通过使用标准Campbelling in和Campbelling out技术用质粒OM427(SEQ ID NO.：57)来完成。在摇瓶培养测定中测定OM469的4个分离株的甲硫氨酸产生，其中它们均比OM456-2产生更多的甲硫氨酸，如表17中所示。培养物在含有2mM苏氨酸的标准糖蜜培养基中生长48小时。

表17：OM469(含有替代了metF启动子的噬菌体λP_R启动子的OM456-2衍生物)的摇瓶测定

实验14-M2543的构建

用SEQ ID No.：58所示质粒pCLIK5A PSOD TKT通过电穿孔法转化菌株OM469-2。这通过使用标准Campbelling in和Campbelling out技术完成。

在摇瓶培养测定中测定标记为M2543的OM 469 PSOD TKT分离株的甲硫氨酸产生，其中它们比OM456-2产生更多的甲硫氨酸。菌株M2543的结果在表18中显示。

表18：OM469和M2543的摇瓶测定

实验15-GK1259的构建

为减少丝氨酸脱氨酶(Sda)的产生，将sda基因的一部分缺失。这通过使用标准Campbelling in和Campbelling out技术用质粒pH626 int SacB deltasdaA(SEQ ID NO：59)完成。为此，通过电穿孔法用质粒pH626 int SacB deltasdaA转化菌株M2543。所得的菌株命名为GK1259。

使用本发明描述的组分(即编码MetH、黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白、和黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白还原酶的基因)可以在含有MetH酶的任何产甲硫氨酸菌株中组装设计用于激活或再激活MetH酶的成套组件，例如在上文所述的产甲硫氨酸菌株如OM469-2、GK1259或M2543中。例如，过量产生MetH_Cg和FprA1的任意这些示例菌株可以用过量产生FdxC的pOM160或pOM161转化。或者，例如，任意这些示例菌株可以依次用pOM232、pOM324和pOM154转化，在每个步骤选择适宜的“Campbell outs”以产生使用MetH_Ec酶和再激活系统的菌株。当然，这些示例并不意图是限制性的。本领域任何技术人员可以从这里给出的实例中了解以鉴定和克隆其他MetH酶的基因以及再激活它们的因子。

Claims (21)

1.在微生物中产生甲硫氨酸的方法，包括至少以下步骤：

-培养一种微生物，其中该微生物通过遗传修饰而衍生自起始生物体，从而与所述起始微生物相比，所述微生物显示了钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性增加。

2.权利要求1的方法，

其中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统至少包含：

-选自包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白及其功能性同系物和/或功能性片段的组中的一种电子传递蛋白；和

-选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶及其功能性同系物和/或功能性片段的组中的一种电子转移蛋白还原酶；

并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述一种电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性与所述起始微生物相比增加。

3.权利要求2的方法，

其中所述至少一种电子传递蛋白和/或所述至少一种电子转移蛋白还原酶内源性存在于所述微生物中和/或衍生自另一种生物体。

4.权利要求1至3任一项的方法，

其中所述微生物选自包含如下属的组：肠杆菌属(Eneterobacteria)、棒杆菌属(Corynebacterium)且优选其谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、埃希氏菌属且优选其大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella，)、芽孢杆菌属(Bacillus)且优选其枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短杆菌属(Brevibacterium)、放线菌属(actinobacteria)、蓝细菌属(cyanobacteria)、变形菌门(proteobacteria)、盐杆菌属(halobacteria)、甲烷球菌纲(methanococci)、分枝杆菌属(mycobacteria)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、链霉菌属(streptomyceae)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、阿舒囊霉属(Ashbya)和曲霉属(Aspergillus)。

5.权利要求4的方法，

其中所述微生物选自包含如下物种的组：谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)和Corynebacterium efficiens，优选谷氨酸棒杆菌。

6.权利要求5的方法，

其中

-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fdxC、fdxD、fdxA及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fprA1、fprA2、fprA3、fldR1及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始微生物相比增加。

7.权利要求6的方法，

其中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性和/或至少fprA1、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始微生物相比增加，优选在谷氨酸棒杆菌中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fprA1、其功能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。

8.权利要求4的方法，

其中

-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fldA、fldB及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fldR及其功能性同系物和/或功能性片段的组；

并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生物相比增加。

9.权利要求8的方法，

其中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性和/或至少fldR、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生物相比增加，优选在谷氨酸棒杆菌中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fldR、其功能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。

10.权利要求1至9任一项的方法，

其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性增加：

-metA/X，

-metZ/Y，

-metF，

-metH，

-thrA，

-metE，

和/或其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性减少：

-thrB，

-metK。

11.微生物：

其中所述微生物通过遗传修饰而衍生自起始微生物，从而与所述起始微生物相比，所述微生物具有增加量和/或活性的钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统。

12.权利要求11的微生物，

其中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统包含至少：

-选自包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白及其功能性同系物和/或功能性片段的组中的一种电子传递蛋白；和

-选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶及其功能性同系物和/或功能性片段的组中的一种电子转移蛋白还原酶；

并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性与所述起始微生物相比增加。

13.权利要求11或12的微生物，

其中所述至少一种电子传递蛋白和/或所述至少一种电子转移蛋白还原酶内源地存在于所述微生物中和/或衍生自另一种生物体。

14.权利要求11至13任一项的微生物，

其中所述微生物选自包含以下属的组：肠杆菌属、棒杆菌属且优选其谷氨酸棒杆菌、埃希氏菌属且优选其大肠杆菌、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属且优选其枯草芽孢杆菌、短杆菌属、放线菌属、蓝细菌属、变形菌门、盐杆菌属、甲烷球菌纲、分枝杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、链霉菌属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、阿舒囊霉属和曲霉属。

15.权利要求14的微生物，

其中所述微生物选自包含以下物种的组：谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、嗜乙酸棒杆菌、热产氨棒杆菌、杰氏棒杆菌、栖糖蜜棒杆菌和Corynebacterium effiziens，优选谷氨酸棒杆菌。

16.权利要求15的微生物，

其中

-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fdxC、fdx、fdxA及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fprA1、fprA2、fprA3、fldR1及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始微生物相比增加。

17.权利要求16的微生物，

其中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段和/或至少fprA1、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始微生物相比增加，优选在谷氨酸棒杆菌中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fprA1、其功能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。

18.权利要求17的微生物，

其中

-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fldA、fldB及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fldR及其功能性同系物和/或功能性片段的组；和

并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生物相比增加。

19.权利要求18的微生物，

其中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段和/或至少fldR、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生物相比增加，优选谷氨酸棒杆菌中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fldR、其功能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。

20.权利要求11至19任一项的微生物，

其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性增加：

-metA/X，

-metZ/Y，

-metF，

-metH，

-thrA，

-metE，

和/或其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性减少：

-thrB，

-metK。

21.权利要求11至20任一项的微生物用于产生甲硫氨酸的用途。