JP4648947B2 - 硫黄含有化合物を生産するための微生物 - Google Patents
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Description
本発明の好ましい実施形態については、従属請求項に記載されている。
NP_601931.1;NP_739184.1;NP_940366.1;NP_962856.1;ZP_00226250.1;NP_214947.1;NP_334857.1;ZP_00058595.1;NP_925240.1;NP_969100.1;ZP_00019148.1;ZP_00199594.1;ZP_00015952.1;ZP_00160492.1;NP_770404.1;NP_866130.1;ZP_00026378.1;NP_280238.1;ZP_00029745.1;ZP_00226340.1;NP_882643.1;NP_459575.1;NP_879442.1;ZP_00213193.1;ZP_00221250.1;NP_806026.1;NP_521417.1;NP_455160.1;ZP_00185946.2;ZP_00203540.1;NP_415113.1;NP_752598.1;NP_286306.1;NP_902574.1;ZP_00052011.1;NP_706431.1;NP_822174.1;NP_745396.1;NP_739496.1(いずれの場合にも、これらの数は、GenBankアクセッション番号に関係する)。
a) 5'→3'方向に次の核酸配列を含むベクターを作製する工程:
・ 微生物中で機能するプロモーター配列、
・ それに機能的に連結されている、配列番号1を有する配列と同一であるかもしくは機能的に相同である核酸配列の5'末端と同一であるかもしくは相同であるDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、耐性遺伝子をコードするDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、配列番号1を有する配列と同一であるかもしくは機能的に相同である核酸配列の3'末端と同一であるかもしくは相同であるDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、微生物中で機能する終止配列;および
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、そのゲノム中にベクターを組み込む工程。
a) 5'→3'方向に次の核酸配列を含むベクターを作製する工程:
・ それぞれの微生物中で機能するプロモーター配列、
・ それに機能的に連結されている、配列番号1またはその機能的相同体に対するアンチセンス配列、
・ それに機能的に連結されている、それぞれの微生物中で機能する終止配列;および
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、該微生物のゲノム中にベクターを組み込む工程。
a) 5'→3'方向に次の核酸配列を含むベクターを作製する工程:
・ それぞれの微生物中で機能するプロモーター配列、
・ それに機能的に連結されている、配列番号1の核酸またはその機能的相同体のmRNAを特異的に認識するリボザイムをコードするDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、それぞれの微生物中で機能する終止配列;および
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、そのゲノム中にベクターを組み込む工程。
a) 5'→3'方向に次の核酸配列を含むベクターを作製する工程:
・ それぞれの微生物中で機能するプロモーター配列、
・ それに機能的に連結されている、配列番号1の配列またはその機能的相同体もしくは一部分に相補的な核酸配列、
・ それに機能的に連結されている、リボヌクレアーゼPをコードするDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、それぞれの微生物中で機能する終止配列;および
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、該微生物のゲノム中にベクターを組み込む工程。
プレハイブリダイゼーション溶液:
0.5% SDS
5×SSC
50mM NaPO4、pH6.8
0.1% ピロリン酸Na
5×Denhardt試薬
100μg/ml サケ精液
ハイブリダイゼーション溶液: プレハイブリダイゼーション溶液
1×106cpm/ml プローブ (5〜10分間、95℃)
20×SSC: 3M NaCl
0.3M クエン酸ナトリウム
HClを添加してpH7にする
50×Denhardt試薬: 5g フィコール
5g ポリビニルピロリドン
5g ウシ血清アルブミン
蒸留水を添加して500mlにする
オプション: 65℃において1×SSC/0.1% SDS中でブロットを30分間洗浄する
プレハイブリダイゼーション: 50〜55℃で少なくとも2時間
ハイブリダイゼーション: 55〜60℃で一晩
洗浄: 5分間 2×SSC/0.1% SDS ハイブリダイゼーション温度
30分間 2×SSC/0.1% SDS ハイブリダイゼーション温度
30分間 1×SSC/0.1% SDS ハイブリダイゼーション温度
45分間 0.2×SSC/0.1% SDS 65℃
5分間 0.1×SSC 室温
通常、アンチセンスストラテジーで導入される核酸は、20〜1,000ヌクレオチド、好ましくは20〜750ヌクレオチド、とくに好ましくは約400〜800および500〜750ヌクレオチドを含む。しかしながら、20〜500ヌクレオチド、同様にとくに好ましくは20〜300ヌクレオチド、なかでもとくに好ましくは20〜150ヌクレオチド、同様になかでもとくに好ましくは20〜75ヌクレオチド、最も好ましくは約20〜50ヌクレオチドを含む核酸を使用することも可能である。また、配列は、わずかに約20または25ヌクレオチドしか含まないこともありうる。
a) 5'→3'方向に次の核酸配列を含むベクターを作製する工程:
・ 微生物中で機能するプロモーター配列、
・ それに機能的に連結されている、NCgl2640のドミナントネガティブ変異体またはその相同体をコードするDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、微生物中で機能する終止配列、
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、該微生物のゲノム中にベクターを組み込む工程。
a) 5'→3'方向に次の核酸配列を含むベクターを作製する工程:
・ 微生物中で機能するプロモーター配列、
・ それに機能的に連結されている、配列番号2の配列を有するタンパク質と同一であるかもしくは相同であるタンパク質に特異的な組換え抗体をコードするDNA配列、
・ それに機能的に連結されている、微生物中で機能する終止配列;および
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、該微生物のゲノム中にベクターを組み込む工程。
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539、および
Corynebacterium melassecola ATCC 17965、
もしくはBrevibacterium属の株、たとえば、
Brevibacterium flavum ATCC 14067、
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869、および
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020;
またはそれらに由来する株、たとえば、
Corynebacterium glutamicum KFCC10065、および
Corynebacterium glutamicum ATCC21608、
であり、それらはまた、所望のファインケミカルまたはその前駆体(1種もしくは複数種)を生産する。
・ ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB(EP 1 108 790;DNA-配列番号3453)、
・ トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA(EP 1 108 790;DNA-配列番号2328)、
・ トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC(EP 1 108 790;DNA-配列番号3486)、
・ メソ-ジアミノピメリン酸-D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh(EP 1 108 790;DNA-配列番号3494)、
・ ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck(EP 1 108 790;DNA-配列番号3157)、
・ グルコース-6-リン酸-6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi(EP 1 108 790;DNA-配列番号950)、
・ ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB(EP 1 108 790;DNA-配列番号2873)、
・ ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA(EP 1 108 790;DNA-配列番号3476)、
・ ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB(EP 1 108 790;DNA-配列番号3477)、
・ ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA(EP 1 108 790 A2;DNA-配列番号3451)、
・ グリコシルトランスフェラーゼ(GenBankアクセッション番号NP_600345)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl1072)、および
・ 乳酸デヒドロゲナーゼ(GenBankアクセッション番号NP_602107)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2817)、
を含む群Iから選択される。
・ アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC(EP 1 108 790 A2;DNA-配列番号281)、
・ アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd(EP 1 108 790 A2;DNA-配列番号282)、
・ グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap(Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ 3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA(EP 1 108 790;DNA-配列番号725)、
・ シスタチオニンγ-シンターゼをコードする遺伝子metB(EP 1 108 790;DNA-配列番号3491)、
・ シスタチオニンγ-リアーゼをコードする遺伝子metC(EP 1 108 790;DNA-配列番号3061)、
・ セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA(EP 1 108 790;DNA-配列番号1110)、
・ O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY(EP 1 108 790;DNA-配列番号726)、
・ メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF(EP 1 108 790;DNA-配列番号2379)、
・ ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC(EP 1 108 790;DNA-配列番号928)、
・ ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB(EP 1 108 790;DNA-配列番号334、DNA-配列番号467、DNA-配列番号2767)、
・ セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE(EP 1 108 790;DNA-配列番号2818)、
・ ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom(EP 1 108 790;DNA-配列番号1306)、
・ メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH(EP 1 108 790;DNA-配列番号1663)、
・ メチオニンシンターゼ(GenBankアクセッション番号NP_600367)をコードする遺伝子metE(GenBankアクセッション番号NCgl1094)、
・ システインシンターゼ(GenBankアクセッション番号NP_601760)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2473)、
・ システインシンターゼ(GenBankアクセッション番号NP_601337)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2055)、
・ 亜硫酸レダクターゼ(GenBankアクセッション番号NP_602008)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2718)、
・ ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(GenBankアクセッション番号NP_602007)をコードする遺伝子cysH(GenBankアクセッション番号NCgl2717)
・ 硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット1(GenBankアクセッション番号NP_602005)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2715)、
・ CysN-硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット2(GenBankアクセッション番号NP_602006)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2716)、
・ フェレドキシンNADPレダクターゼ(GenBankアクセッション番号NP_602009)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2719)、
・ フェレドキシン(GenBankアクセッション番号NP_602010)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2720)、
・ グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(GenBankアクセッション番号NP_600790)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl1514)、および
・ フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(GenBankアクセッション番号NP_601294)をコードする遺伝子(GenBankアクセッション番号NCgl2014)
を含む群IIから選択される。
1.1 細菌株、培地、およびプラスミド
CGXII最少培地(Keilhauer et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 5595-5603)中で常法に従ってC. glutamicum ATCC 14752またはATCC 13032を培養した。トランスポゾン変異体をカナマイシン(15mg・ml-1)の存在下で培養した。E. coli DH5αを標準的クローニングに使用し、プラスミドをC. glutamicum中にトランスフォームする場合、E. coli ET12567をプラスミド増幅に使用した。
プラスミドDNAによるE. coli細胞のトランスフォーメーションは、化学的コンピテントE. coli DH5αまたはET12567を用いて行った。塩化ルビジウム法[http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/]に従って細胞を産生し、Sambrook et al. (vide supra)に記載されるようにトランスフォームした。コンピテントC. glutamicum細胞の産生およびエレクトロトランスフォーメーションは、文献(Ankri (1996), Plasmid, 35, 62-66; Liebl et al., vide supra)に記載されるように行った。
プラスミドpCGL0040をE. coli ET12567から単離した。続いて、エレクトロポレーションによりC. glutamicum ATCC 14752をプラスミドでトランスフォームした。20μg・ml-1のカナマイシンを含むLBHISにプレーティングすることにより、トランスポゾン挿入変異体を選択した。得られた変異体をすべてプールし、滅菌された0.9% NaClで2回洗浄し、合わせたプールの106稀釈液の100μlアリコートの形態で、カナマイシン(20μg・ml-1)およびエチオニン(7.5g・l-1)を含むCGXII培地にプレーティングした。最も増殖の速いクローンを選択し、詳しい分析に供した。
2つのプライマー対2640-SacB1(5' GAGAGGGCCCATCAGCAGAACCTGGAACC-3')/2640-SacB2(5' GATCCAGAGGTCCACAACC-3')および2640-SacB3(5' GATGGTTCAAGACGAACTCC-3')/2640-SacB4(5' GAGAGTCGACCAGAATCAATTCCAGCCTTC-3')により、NCgl2640の上流領域および下流領域をC. glutamicum ATCC13032の染色体DNAからPCRにより増幅した。得られた断片をApaI/XbaIまたはSpeI/SalIで消化し、ApaI/SalIで消化された非複製ベクターpClik-SacB中に連結クローニングし、それによりプラスミドpSdel-NCgl2640を得た。次に、エレクトロポレーションによりC. glutamicum ATCC13032を非複製プラスミドpSdel-NCgl2640でトランスフォームした。カナマイシンに対して耐性のあるクローンは、染色体に組み込まれたプラスミドを含有していた。続いて、Schaeferら(Schaefer et al. (1994) Gene 145:69-73)の方法に準拠してスクロースに対して耐性のある変異体に関してスクリーニングすることにより、プラスミド喪失に関して選択を行った。次に、PCR分析およびサザンブロッティングにより欠失を確認した。
C. glutamicumの選択された変異株を、pClikプラスミドH185、H187、およびH217、またはNCgl2640で相補されたそれらの誘導体で、相補した(表1参照)。10mM L-メチオニンの存在下または不在下において、カナマイシン(20μg・ml-1)およびクロラムフェニコール(15μg・ml-1)を含むCGXII最少培地中でトランスフォーマントを培養した。初期対数期(OD600=1〜2)まで細胞を培養し、Sambrook et al. (Sambrook et al., vide supra)に記載されるようにβ-gal活性に関して調べた。アッセイは、4つの独立した試験系列でそれぞれ3回行った。
磁気ビーズを用いてDNAアフィニティークロマトグラフィーによりDNA結合タンパク質を単離する原理は、Gabrielsen et al. (1993), Methods Enzymol., 218, 508-225に実質的に記載されており、C. glutamicumに対する詳細なプロトコルは、入手可能である。Rey et al. (vide supra)を参照されたい。ごくわずかな例外を除いて、ここでは、後者のプロトコルを利用した。溶出緩衝液を除いて、緩衝剤はすべて、2.5mM L-メチオニンと混合した。細胞破壊の直後、プロテアーゼ阻害剤(PMSF、アプロチニン、ロイペプチン(Rosenberg et al. (1996) Protein Analysis and Purification. Benchtop Techniques, Boston, Birkhaeuser))により、粗抽出物をタンパク質分解から保護した。粗抽出物の超遠心分離(200,000g、40分間、40℃)に続いて、タンパク質溶液をゲル濾過(Sephadex G25)により脱塩した。ビオチン化PCR増幅プロモーターDNAをストレプトアビジン被覆Dynabeads(登録商標)M270(Dynal Biotech.)上に固定した。陰性対照断片として、C. glutamicumに由来するgroES遺伝子の上流領域から460bp断片を増幅した。洗浄緩衝液は、多量の非特異的コンペティターDNA(サケ精子DNA、0.4mg・ml-1、Sigma)を含有していた。4%スタッキングゲルおよび12%ランニングゲル(Schaegger et al. (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379)を用いてI D-SDS-PAGEを行い、コロイド状Coomassie Brilliant Blue G-250でタンパク質を染色した。トリプシン消化およびMALDI-TOF分析に対するプロトコルは、実質的にHermann et al. (2001) Electrophoresis, 22, 1712-1723に記載のプロトコルに対応する。
HPLCによりメチオニンをそのo-フタルジアルデヒド誘導体の形態で定量した(Molnar-Perl et al. (2001), J. Chromatogr. 913, 283-302)。50〜100mlの培養容積を有する500ml振盪フラスコ内において30℃かつ225rpmで定常期までC. glutamicumを培養した。遠心分離(10,000g、10分間、4℃)により細胞を除去し、メチオニン濃度をHPLC分析により決定した。細胞内メチオニン濃度を決定するために、細胞を液体から取り出し、ケイ素油遠心分離により賦活した(Ebbighausen et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 184-190)。続いて、超音波処理またはブルーキャップリボライザー(FastPrep(登録商標) Q-Biogene)により、細胞を溶解させた。上清中の可溶性タンパク質をBradfordアッセイに従って決定した。C. glutamicum中の可溶性タンパク質の細胞内含有量は、実験に基づいて250mg・ml-1と決定された。HPLC分析の後でメチオニン濃度を決定できるように、この値を基にしてサンプルの全内部細胞体積を計算した。
2.1 エチオニン耐性トランスポゾン変異体の選択および同定
本発明の範囲内では、C. glutamicumによるメチオニン生合成のレギュレーションに関与していると思われる推定のリプレッサーを不活性化することにより達成しうるメチオニン過剰産生を介してエチオニン耐性を達成しうるという仮説に基づく推定を行った。この理由は、エチオニンが代謝不可能なメチオニンの構造類似体であるので高濃度のメチオニンの挙動をするという事実に依拠する。その結果、メチオニン生合成は、通常、ダウンレギュレートされ、生物は、メチオニンの欠如が原因となって最終的に死滅する。
株14752::2640中のトランスポゾン挿入部位が推定のタンパク質のC末端側半分の位置2918026/2918027(GenBankアクセッション番号NC 003450)に位置することを観測することができた。NCgl2640はNCgl2639から7塩基対だけ離れているので、両方の遺伝子はおそらく1つのオペロン内に組織化されているであろう。NCgl2639は、推定のヒドロラーゼまたはアセチルトランスフェラーゼとしてデータベース(GenBank)中に注釈が付されている(図2参照)。NCgl2640は、42kDaのタンパク質をコードする。相同性を介して、有意な相同性(e値<2e-20)を有する25種超の推定の細菌タンパク質を同定することができた。これらはいずれも、これまで機能的なものとして注釈が付されていないものである。保存ドメインを検索することにより、グルタミン酸システインリガーゼファミリーに特有であるタンパク質ファミリーデータベース(PFAM)のモチーフ04107の場合と同様に、高い有意性で、未知機能を有するタンパク質のコンセンサスパターン(COG2170)を同定することができた。それ以上のコンセンサスモチーフを同定することはできなかった。とくに、DNA結合タンパク質を同定することはできなかった。
次に、7.5g・l-1(変異体)または3.8g・l-1(野生型)のD,L-エチオニンの存在下または不在下において3g・l-1のグルコースを含むCGXII培地中で、C. glutamicum ATCC 14752および変異株を培養した。エチオニンの存在下における変異体の増殖は、エチオニンを用いない増殖およびエチオニンを用いない野生型の増殖のいずれとも識別できなかった。しかしながら、実質的により低い亜致死濃度のエチオニンの存在下における野生型の増殖は、有意に阻害された(図3参照)。
次に、メチオニン生合成の主要な過程である硫黄同化の通常の厳格なレギュレーションがNCgl2640変異体において改変されるかどうかを調べた。NCgl2640がC. glutamicumによる硫黄化合物の生合成の主要なレギュレーターであれば、それは硫黄の同化に関与する遺伝子の発現をレギュレートし、エチオニンに対する耐性の原因となりうる増大された量のメチオニンの発現が起こるはずであるという仮説に基づく推定を行った。metY、cysK、およびスルフェートオペロン遺伝子の発現レベルに及ぼすNCgl2640ノックアウトの影響に基づいて、前記仮説を検査した。この目的のために、NCgl2640が欠失している株14752::2640および野生型を、lacZレポータープラスミドpClik-PcysK、pClik-PmetY、およびpClik-Psulfatでトランスフォームした(表1も参照されたい)。次に、10mM L-メチオニンの添加を行ってまたは行わずにCGXII培地中で対数期(OD600=3)までATCC 14752野生型および変異株を培養し、lacZ活性により遺伝子発現を決定した。
本発明の範囲内で、cysK、スルフェートオペロン、さらにはmetYの発現が、主に、NCgl2640によりレギュレートされることを明らかにすることができた。NCgl2640の配列中に古典的DNA結合モチーフを同定することができなかったので、NCgl2640が前記遺伝子のそれぞれのプロモーター領域に結合しうるかどうか検査するために、いわゆるプルダウンアッセイのDNAアフィニティー精製を利用した。PCRにより増幅されてビーズ上に固定されたプロモーターを、10mM L-メチオニンの存在下または不在下で培養されたC. glutamicum細胞の粗抽出物と共に2.5mM L-メチオニンの存在下でインキュベートした。高い塩濃度(>200mM)でプロモーターから溶出するタンパク質を1D-SDS-PAGEにより分離し、MALDI-TOFにより分析した。
したがって、多量のエチオニンに対するC. glutamicum 14752::2640の耐性は、L-メチオニンの生合成の増大の結果であると思われる。前記仮説を確認するために、野生型および変異体におけるL-メチオニンの生産をCGXII最少培地バッチ培養で検討した。
配列番号1(GenBankアクセッション番号NCgl2640):
ATGGGCATTGAGTTTAAGCGTTCACCGCGACCCACCCTGGGCGTTGAGTGGGAAATTGCACTTGTTGATCCAGAAACACGTGATCTAGCCCCGCGCGCTGCAGAAATACTAGAGATTGTGGCCAAGAACCACCCTGAGGTGCACCTCGAGCGCGAATTCCTCCAAAACACCGTGGAGCTTGTCACCGGAGTGTGCGACACCGTCCCCGAAGCGGTGGCAGAGCTTTCCCACGATCTAGATGCGCTGAAAGAAGCAGCGGATTCTCTCGGGCTTCGGTTGTGGACCTCTGGATCCCACCCATTTTCGGATTTCCGCGAAAACCCAGTATCTGAAAAAGGCTCCTACGACGAGATCATCGCGCGCACCCAATACTGGGGAAACCAGATGTTGATTTGGGGCATTCACGTCCACGTGGGCATCAGCCATGAAGATCGCGTGTGGCCGATCATCAATGCGCTGCTGACAAATTACCCACATCTGTTGGCACTTTCTGCAAGCTCTCCAGCATGGGACGGACTTGATACCGGTTATGCCTCCAACCGGACGATGCTCTACCAACAGCTGCCTACAGCCGGACTGCCATACCAATTCCAAAGCTGGGATGAATGGTGCAGCTACATGGCGGATCAAGATAAATCCGGTGTCATCAACCACACCGGATCCATGCACTTTGATATCCGCCCCGCATCCAAATGGGGAACCATCGAAGTCCGCGTGGCCGATTCTACCTCCAACCTGCGGGAACTGTCTGCCATCGTGGCGTTGACCCACTGTCTCGTGGTGCACTACGACCGCATGATCGACGCTGGCGAAGAGCTTCCCTCCCTGCAACAATGGCACGTTTCGGAAAATAAATGGCGCGCGGCTAGGTATGGTCTGGATGCCGAAATCATCATTTCCAGAGACACCGATGAAGCGATGGTTCAAGACGAACTCCGCCGACTAGTAGCGCAATTGATGCCTCTAGCCAACGAACTCGGCTGCGCTCGTGAGCTTGAACTTGTGTTGGAAATCCTGGAACGTGGTGGTGGATACGAACGCCAACGCAGAGTGTTTAAAGAAACTGGCAGTTGGAAAGCTGCAGTTGATTTAGCCTGCGACGAACTCAACGACCTCAAAGCACTGGACTAA
配列番号2(GenBankアクセッション番号NP_601931):
MGIEFKRSPRPTLGVEWEIALVDPETRDLAPRAAEILEIVAKNHPEVHLEREFLQNTVELVTGVCDTVPEAVAELSHDLDALKEAADSLGLRLWTSGSHPFSDFRENPVSEKGSYDEIIARTQYWGNQMLIWGIHVHVGISHEDRVWPIINALLTNYPHLLALSASSPAWDGLDTGYASNRTMLYQQLPTAGLPYQFQSWDEWCSYMADQDKSGVINHTGSMHFDIRPASKWGTIEVRVADSTSNLRELSAIVALTHCLVVHYDRMIDAGEELPSLQQWHVSENKWRAARYGLDAEIIISRDTDEAMVQDELRRLVAQLMPLANELGCARELELVLEILERGGGYERQRRVFKETGSWKAAVDLACDELNDLKALD
配列番号3(McbR):
GTGGCTGCTAGCGCTTCAGGCAAGAGTAAAACAAGTGCCGGGGCAAACCGTCGTCGCAATCGACCAAGCCCCCGACAGCGTCTCCTCGATAGCGCAACCAACCTTTTCACCACAGAAGGTATTCGCGTCATCGGTATTGATCGTATCCTCCGTGAAGCTGACGTGGCGAAGGCGAGCCTCTATTCCCTTTTCGGATCGAAGGACGCCTTGGTTATTGCATACCTGGAGAACCTCGATCAGCTGTGGCGTGAAGCGTGGCGTGAGCGCACCGTCGGTATGAAGGATCCGGAAGATAAAATCATCGCGTTCTTTGATCAGTGCATTGAGGAAGAACCAGAAAAAGATTTCCGCGGCTCGCACTTTCAGAATGCGGCTAGTGAGTACCCTCGCCCCGAAACTGATAGCGAAAAGGGCATTGTTGCAGCAGTGTTAGAGCACCGCGAGTGGTGTCATAAGACTCTGACTGATTTGCTCACTGAGAAGAACGGCTACCCAGGCACCACCCAGGCGAATCAGCTGTTGGTGTTCCTTGATGGTGGACTTGCTGGATCTCGATTGGTCCACAACATCAGTCCTCTTGAGACGGCTCGCGATTTGGCTCGGCAGTTGTTGTCGGCTCCACCTGCGGACTACTCAATTTAG
配列番号4(GenBankアクセッション番号NP_602128):
MAASASGKSKTSAGANRRRNRPSPRQRLLDSATNLFTTEGIRVIGIDRILREADVAKASLYSLFGSKDALVIAYLENLDQLWREAWRERTVGMKDPEDKIIAFFDQCIEEEPEKDFRGSHFQNAASEYPRPETDSEKGIVAAVLEHREWCHKTLTDLLTEKNGYPGTTQANQLLVFLDGGLAGSRLVHNISPLETARDLARQLLSAPPADYSI
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Claims (11)
- L-メチオニンを生産するための微生物であって、該微生物がCorynebacteriaであり、該微生物の野生型と比較して、配列番号1の配列を有する核酸と少なくとも90%同一である核酸によりコードされるタンパク質の含有量および/または活性が低減されていることを特徴とする、上記微生物。
- 前記微生物の野生型と比較して、さらに、L-メチオニンの生合成経路の少なくとも1種のタンパク質の含有量および/もしくは活性が増大されていること、ならびにL-メチオニンの生合成経路の該タンパク質をコードする核酸が、
・ メチオニンシンターゼ(meth)をコードする核酸、
・ アスパラギン酸キナーゼ(lysC)をコードする核酸、
・ グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gap)をコードする核酸、
・ 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)をコードする核酸、
・ ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)をコードする核酸、
・ トリオースリン酸イソメラーゼ(tpi)をコードする核酸、
・ ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(metA)をコードする核酸、
・ シスタチオニン-γ-シンターゼ(metB)をコードする核酸、
・ シスタチオニン-γ-リアーゼ(metC)をコードする核酸、
・ セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(glyA)をコードする核酸、
・ O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(metY)をコードする核酸、
・ ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(serC)をコードする核酸、
・ ホスホセリンホスファターゼ(serB)をコードする核酸、
・ セリンアセチルトランスフェラーゼ(cysE)をコードする核酸、
・ ホモセリンデヒドロゲナーゼ(hom)をコードする核酸、
・ メチオニンシンターゼ(metE)をコードする核酸、
・ システインシンターゼをコードする核酸、
・ 亜硫酸レダクターゼをコードする核酸、
・ ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(cysH)をコードする核酸、
・ 硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット1をコードする核酸、
・ CysN硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット2をコードする核酸、
・ フェレドキシンNADPレダクターゼをコードする核酸、
・ フェレドキシンをコードする核酸、
・ グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、および/または
・ フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする核酸、
から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の微生物。 - 前記微生物の野生型と比較して、さらに、L-メチオニンの生合成経路の少なくとも1種のタンパク質の含有量および/または活性が低減されていること、ならびにL-メチオニンの生合成経路のタンパク質をコードする前記核酸が、
・ ホモセリンキナーゼ(thrB)をコードする核酸、
・ トレオニンデヒドラターゼ(ilvA)をコードする核酸、
・ トレオニンシンターゼ(thrC)をコードする核酸、
・ メソ-ジアミノピメリン酸-D-デヒドロゲナーゼ(ddh)をコードする核酸、
・ ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(pck)をコードする核酸、
・ グルコース-6-リン酸-6-イソメラーゼ(pgi)をコードする核酸、
・ ピルビン酸オキシダーゼ(poxB)をコードする核酸、
・ ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)をコードする核酸、
・ ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)をコードする核酸、
・ ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)をコードする核酸、
・ グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、および/または
・ 乳酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、
から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の微生物。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の微生物の培養を含む、微生物によるL-メチオニンの生産方法。
- L-メチオニンを培地中および/または微生物の細胞中で富化しかつ該培地または細胞から単離する発酵過程が関係することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記微生物がCorynebacterium glutamicumであることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 配列番号1の配列を有する核酸と少なくとも90%同一である核酸によりコードされるタンパク質の含有量および/または活性が、対応するゲノム核酸配列(単数または複数)の破壊および/または欠失により低減されることを特徴とする、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
- 配列番号1の配列を有する核酸と少なくとも90%同一である核酸によりコードされるタンパク質の含有量および/または活性が、以下の工程:
a) 5'→3'方向に、次の核酸配列:
・ 前記微生物中で機能するプロモーター配列、
・ 該プロモーター配列に機能的に連結されている、耐性遺伝子をコードするDNA配列、
・ 該DNA配列に機能的に連結されている、配列番号1の配列の5'末端と同一であるDNA配列、
を含むベクターを作製する工程、および
b) a)のベクターを微生物に導入し、場合により、そのゲノム中にベクターを組み込む工程
により低減されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。 - 配列番号1の配列を有する核酸と同一である核酸の機能的発現が、微生物の野生型と比較して完全に抑制されることを特徴とする、請求項4〜8のいずれかに記載の方法。
- L-メチオニンを生産するための、請求項1〜3のいずれかに記載の微生物の使用。
- L-メチオニンを生産するための、配列番号1の配列を有する核酸と少なくとも90%同一である核酸の使用。
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