DE10128510A1 - Methode zur Fermentationskontrolle - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Gene und davon codierte Polypeptide aus Corynebacterium glutamicum, welche zur Analyse bzw. Diagnose und insbesondere zur Überwachung von Fermentationsprozessen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden können.

Description

Die Erfindung betrifft Gene und davon codierte Polypeptide aus Corynebacterium glutamicum, welche zur Analyse bzw. Diagnose von Mikroorganismen und insbesondere zur Kontrolle oder Überwachung von Fermentationsprozessen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden können.

Tierfuttermittel werden oftmals mit Aminosäuren, wie etwa L-Lysin, L-Threonin oder L-Tryptophan sublementiert, welche im Allgemeinen über Fermentationsprozesse von Mikroorganismen, wie etwa von Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Für eine optimale Bildung des Produkts ist es wünschenswert, bei der Fermentation die Fermentationsbedingungen und den Zustand des eingesetzten Mikroorganismus überwachen und gegebenenfalls einstellen bzw. regeln zu können.

Als Indikator für die Überwachung kann vorteilhafterweise der bei der Fermentation eingesetzte Mikroorganismus, beispielsweise Corynebacterium glutamicum herangezogen werden.

Verschiedene Gene aus Corynebacterium glutamicum werden beispielsweise in WO 01/02583, WO 01/00842, WO 01/00843, WO 01/00844, WO 01/00845, WO 01/00847, WO 01/00802, WO 01/00804 und WO 01/00805 beschrieben, worin Corynebacterium glutamicum Gene jeweils aufgrund der Funktionen der von ihnen codierten Proteine gruppiert sind.

Eine Aufgabe der Erfindung war es, Gene aus Corynebacterium glutamicum bereitzustellen, welche eine Analyse des Mikroorganismus und insbesondere eine Analyse von mit dem Mikroorganismus durchgeführten Fermentationsvorgängen erlaubt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch einen Array, umfassend mindestens eine Nukleinsäure, welche: (a) eine der in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179 gezeigten Nukleotidsequenzen; (b) eine Nukleotidsequenz, die einer Nukleotidsequenz gemäß (a) innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, (c) eine Nukleotidsequenz, die mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) eine Nukleotidsequenz, die eine Homologie größer als 80%, bevorzugt größer als 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% zu einer Nukleotidsequenz gemäß (a), (b) oder/und (c) aufweist oder/und (e) einen Teil einer der Sequenzen gemäß (a), (b), (c) oder/und (d) mit einer Länge von mindestens 20 Basen umfasst, wobei die mindestens eine Nukleinsäure auf einem festen Träger immobilisiert ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das Genom von Corynebacterium glutamicum bestimmt und 2179 neue, für Polypeptide bzw. Proteine codierende Gene aufgefunden. Zusammen mit den bereits bekannten (beispielsweise aus öffentlichen Datenbanken oder Patentanmeldungen) Genen steht somit die gesamte Genominformation von Corynebacterium glutamicum zur Verfügung. Diese Information kann insbesondere für diagnostische Zwecke, beispielsweise durch die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen bzw. Abschnitten dieser Sequenzen als Sonde auf einem Nukleinsäure-Array (Chip) genutzt werden.

Das Genom weite Überwachen oder Monitoring von Organismen, beispielsweise mittels der DNA-Chip-Technologie ermöglicht die funktionale Analyse von lebenden Organismen im einem bisher nicht gekannten Ausmaß an Komplexität. Mit den nunmehr zur Verfügung gestellten Nukleinsäuren können Genexpressionsmuster im Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum analysiert werden. Dies ist besonders deshalb von Interesse, da es sich um einen Mikroorganismus handelt, mit welchem verschiedene verwertbare Stoffe, wie etwa L-Lysin, produziert werden können. Basierend auf der nunmehr zur Verfügung gestellten Sequenzinformation können Nukleinsäuren, beispielsweise vollständige DNA-Abschnitte oder Fragmente davon des Bacteriums auf einem festen Träger immobilisiert werden. Weiterhin können Transkriptionsprofile des Organismus unter verschiedenen Fermentationsbedingungen durch DNA-Mikro-Array-Experimente analysiert werden.

Zusätzlich zu den klassischen Anwendungsgebieten der DNA-Mikro-Array- Technologie, beispielsweise in der biomedizinischen Forschung, stellt die vorliegende Erfindung DNA-Chips bereit, die zur Überwachung oder/und Beobachtung von Target-Genen genutzt werden können, die bei der Herstellung von fermentativ erhältlichen Verbindungen in Fermentationsprozessen eine Rolle spielen.

Das erfindungsgemäße Analysesystem kann insbesondere zur Detektion von Genexpressionsmustern von Mikroorganismen in industriellen Fermentationsanlagen eingesetzt werden. Die erhaltene Information kann insbesondere zur Regelung oder/und Steuerung des Fermentationsprozesses genutzt werden.

Weiterhin kann die Stammentwicklung von Corynebacterium analysiert sowie Stammvergleiche durchgeführt werden. Bei Stammvergleichen können insbesondere produzierende Stämme, z. B. L-Lysin-produzierende Stämme und nicht produzierende Stämme verglichen werden. Ebenso können Fermentationsphasen mit unterschiedlicher Produktivität verglichen werden. Somit können die für die Produktion wesentlichen Gene (herauf- oder herabreguliert) bestimmt werden.

Der Begriff Nukleinsäure, wie hierin verwendet, umfasst insbesondere DNA und RNA, bevorzugt DNA. Die Nukleinsäure ist bevorzugt einsträngig oder zweisträngig.

Der Ausdruck "Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" wird hierin wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) beschrieben, verwendet. Bevorzugt liegt eine stringente Hybridisierung gemäß der vorliegenden Erfindung vor, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfonat) bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C und mehr bevorzugt für 1 Stunde mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugter bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine Nukleotidsequenz, die unter solchen Waschbedingungen mit einer in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179 gezeigten Nukleotidsequenz oder einer damit innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenzen hybridisiert, ist eine Nukleotidsequenz, die erfindungsgemäß eingesetzt werden kann. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der hybridisierenden Sequenz um eine teilweise oder vollständig komplementäre Sequenz.

Erfindungsgemäß kann weiterhin eine Nukleotidsäuresequenz eingesetzt werden, die eine Homologie größer als 80%, bevorzugt größer als 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% zu einer in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179 gezeigten Nukleotidsequenz, einer einer solchen Sequenz innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder einer mit einer solchen Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz aufweist. Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1-V/X].100 definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen der Vergleichsnukleotidsequenz (z. B. einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179) ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist.

Die Erfindung umfasst weiterhin Teilsequenzen der oben genannten Nukleinsäuresequenzen, welche für einzelsträngige Nukleinsäuren bevorzugt eine Länge von ≧ 20 Basen, mehr bevorzugt ≧ 25 Basen, noch mehr bevorzugt ≧ 35 Basen und insbesondere ≧ 50 Basen aufweisen. Bei solchen einzelsträngigen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Oligonukleotidsonden. Für doppelsträngige Nukleinsäuren weisen die Teilsequenzen bevorzugt eine Länge von ≧ 20 Basenpaaren, mehr bevorzugt ≧ 50 Basenpaaren und insbesondere ≧ 100 Basenpaare auf. Solche doppelsträngigen Nukleinsäuren können beispielsweise durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) gewonnen werden.

Die erfindungsgemäßen Arrays, insbesondere DNA-Arrays umfassen einen festen Träger. Als Trägermaterial können beispielsweise poröse Materialien, wie etwa Nylonmembranen oder feste Oberflächen, wie etwa Glasträger eingesetzt werden. Das Aufbringen der Nukleinsäure auf das Trägermaterial wird bevorzugt durch mechanisches Ablegen, z. B. mit Hilfe von speziellen modifizierten Mikronadeln, auf der Basis von Ink-Jet-Printern oder mittels einer On-Chip-Synthese durchgeführt. Während bei dem Ablegen mit Mikronadeln und bei Ink-Jet-Printern kleine Flüssigkeitströpfchen, welche die gewünschten Nukleinsäuren enthalten, auf dem Träger abgelegt werden, werden bei einer On-Chip-Synthese die Oligonukleotide direkt auf dem Chip synthetisiert.

Die Immobilisierung an der Oberfläche kann nach bekannten Methoden erfolgen, wie sie beispielsweise in PCT/EO 99/10977, WO 89/11548, US 5,837,832, EP 0 373 203 oder EP 0 386 229 beschrieben sind. Bevorzugt werden die Nukleinsäuren durch kovalente Bindung, gegebenenfalls über Linkergruppen, an den festen Träger immobilisiert.

Die Erfindung umfasst sowohl die DNA-Chip- als auch die DNA-Mikro- Array-Technologie. DNA-Chips weisen eine hohe Dichte von mehr als 10.000 Nukleinsäuresonden pro cm² auf, während Mikroarrays weniger als 10.000 Nukleinsäuresonden pro cm² tragen. Die Nukleinsäuren, die auf dem erfindungsgemäßen Array immobilisiert sind, sind bevorzugt Sonden. Als Sonden eignen sich besonders PCR-Fragmente (doppelsträngige DNA), die durch die Polymerasekettenreaktion entstehen und definierte doppelsträngige Amplifikate einer DNA-Matrize darstellen. PCR-Fragmente weisen üblicherweise eine Länge von etwa 100 bis zu mehreren tausend Basenpaaren auf, wobei die Hybridisierungseigenschaften von PCR- Fragmenten beständig und gut bekannt sind. Weiterhin können als Sonden Oligonukleotide verwendet werden, bei denen es sich um kurze, synthetische einzelsträngige Nukleinsäuren handelt. Solche Oligonukleotidsonden können direkt auf dem Chip synthetisiert werden.

Mit den in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Sequenzinformationen ist es möglich, einen vollständigen Überblick über die genetische Ausstattung von Corynebakterium glutamicum zu erhalten. Dies ist die Basis für die Identifizierung funktional zusammenhängender Systeme, wodurch das Verständnis komplexer biologischer Prozesse in lebenden Systemen möglich wird. Insbesondere kann dadurch das Expressionsniveau aller zellulären mRNA's erfasst werden und durch Vergleich verschiedener Expressionsprofile miteinander können Veränderungen in der Transkriptstärke detektiert werden. Auf diese Weise können Regulationsvorgänge auf einer frühen Stufe im Fluss der genetischen Information festgestellt und analysiert werden. Das molekulargenetische Verhalten von Zellen wird dadurch direkt gemessen. Beispiele für Untersuchungen, die mit dem erfindungsgemäßen Array durchgeführt werden können, sind die Koordination des Stoffwechsels, der Einfluss der Umweltbedingungen auf zelluläre Vorgänge, sowie die Überwachung der Produktivität eines Mikroorganismus.

In dem erfindungsgemäßen Array sind unterschiedliche Nukleinsäuren bevorzugt räumlich voneinander getrennt an bekannten Orten aufgebraucht, sodass aufgrund der zweidimensionalen Anordnung der Nukleinsäuren eine Zuordnung der detektierten Nukleinsäure zu bestimmten Sequenzen möglich ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Array Nukleinsäuresonden, die alle Gene von Corynebakterium glutamicum abdecken. Besonders bevorzugt enthält er alle Gene von Corynebakterium glutamicum bzw. alle zu den mRNA's komplementären Sequenzen. Weiterhin ist es bevorzugt, dass ein solcher Array keine Nukleotidsequenzen umfasst, die nicht von Corynebakterium glutamicum abgeleitet sind. Neben einem Array, welcher alle Gene aus Corynebacterium glutamicum abdeckt, sind auch Arrays bevorzugt, welche ≧ 1000, mehr bevorzugt ≧ 2000, noch mehr bevorzugt ≧ 3000 und am meisten bevorzugt ≧ 3500 Gene aus Corynebakterium glutamicum umfassen. Es ist aber möglich, Arrays herzustellen, welche lediglich mindestens 10, bevorzugt mindestens 50, mehr bevorzugt mindestens 100 Gene aufweisen, wobei solche Spezial-Arrays eine bestimmte Wachstumsphase oder/und Medienzusammensetzung charakteristische Muster ergeben. Während es möglich ist, Arrays herzustellen, die ausschließlich Nukleinsäuren, wie in den Ansprüchen 1(a) bis 1(e) definiert umfassen, ist es oftmals auch vorteilhaft, Arrays herzustellen, in denen neben diesen Nukleinsäuren auch Nukleinsäuren enthalten sind, welche auf bereits bekannte Gene von Corynebakterium glutamicum gerichtet sind oder welche Nukleinsäuren enthalten, welche nicht von Corynebakterium glutamicum abgeleitet sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung einen Array von DNA-Sonden, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wobei der Array mindestens 10 Sonden und nicht mehr als 200.000 verschiedene DNA-Sonden aufweist, die jeweils eine Länge von 15 bis 4.000 Nukleotide besitzen, wobei diese Sonden an getrennten, bekannten Stellen des Arrays angeordnet sind, wobei die DNA-Sonden mindestens eine Sonde umfassen, die exakt komplementär zu ausgewählten Referenzsequenzen eines eine gewünschte Verbindung erzeugenden Mikroorganismuses sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind diese DNA- Proben Nukleinsäuren, die einen genomischen Bereich eines Mikroorganismuses abdecken, welche beispielsweise aus einer genomischen Shot-Gun-Bibliothek erhalten werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die DNA-Sonden Nukleinsäuren, die z. B. durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten werden, und welche ein vollständiges genetisches Element, ein internes Fragment eines genetischen Elements oder das genetische Element und zusätzlich flankierende Bereiche davon umfasst.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die DNA-Sonden einzelsträngige Nukleinsäuren, die z. B. durch eine Synthese auf dem Chip oder durch ein Aufbringen von vorsynthetisierten Oligonukleotiden erhalten werden, welche komplementär zu Nukleinsäuren des Mikroorganismus sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Referenzsequenz eine einzelsträngige Nukleinsäure und es befinden sich Sonden, die komplementär zu der einzelsträngigen Nukleinsäure oder zu einer DNA oder RNA-Kopie (cDNA/cRNA) der einzelsträngigen Nukleinsäure der Referenzsequenz in dem Array. Die Referenzsequenz ist insbesondere eine c-Polynukleotidsequenz eines Corynebakterium glutamicum-Stammes oder eines anderen Mikroorganismus, z. B. eines Escherichia coli-Stammes.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Array umfassend mindestens ein Polypeptid, ausgewählt aus den von durch Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1(a) bis 1(e) codierten Polypeptiden.

Grundsätzlich kann ein solcher Protein-Array mit den gleichen Prinzipien, wie oben für den Nukleinsäure-Array beschrieben, hergestellt werden. Die Proteinsonden zeigen dann spezifische Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und niedermolekularen Substanzen, sodass funktionelle Assays durchgeführt werden können, beispielsweise zur Bestimmung der Funktion eines bestimmten Proteins bzw. zur Auffindung von Inhibitoren für die Proteine.

Es ist auch möglich, auf dem Array Moleküle, beispielsweise Biomoleküle oder kleine organische oder anorganische Moleküle zu binden, welche mit einer Nukleinsäure oder einem Peptid, wie oben definiert, bindefähig sind. Beispielsweise kann ein solcher Array Inhibitoren für das Polypeptid enthalten.

Die erfindungsgemäßen Assays eignen sich insbesondere für die Analyse von Corynebakterium glutamicum. Da Corynebakterium glutamicum im industriellen Maßstab zur Herstellung verschiedener Verbindungen, wie beispielsweise L-Lysin eingesetzt wird, können die erfindungsgemäßen Arrays insbesondere zur Überwachung des Fermentationsprozesses von Corynebakterium glutamicum eingesetzt werden. Dabei wird bevorzugt das Expressionsniveau von zellulärer mRNA von Corynebakterium analysiert und daraus ein Genexpressionsmuster bzw. ein Genexpressionsprofil erstellt. Solche Genexpressionsmuster können beispielsweise zur Differenzierung zwischen unterschiedlichen Stämmen aber auch zur Bestimmung von Umgebungsbedingungen verwendet werden. Weiterhin ist es möglich durch Auswahl geeigneter Sonden den jeweiligen Zustand, beispielsweise Wachstumszustand von Corynebakterium glutamicum zu bestimmen. Die auf diese Weise gewonnenen Daten lassen sich insbesondere zur Einstellung der Lebensbedingungen oder/und des Fermentationsprozesses nutzen, um eine Optimierung an gewünschtem Produkt zu erhalten.

Die erfindungsgemäßen Arrays können insbesondere auch zu einem Mustervergleich bzw. zu einer Mustererkennung verwendet werden. Die fermentative Herstellung von L-Lysin, wie sie z. B. im U.S. Patent 6,133,000 beschrieben ist, kann in mehrere Phasen unterteilt werden. Hinsichtlich des Verfahrensablaufes und nutzbarer Stämme wird auf das U.S. Patent 6,133,000 verwiesen.

Die Fermentation kann grundsätzlich in folgende Phasen unterteilt werden:

• 1. Batch-Phase:
  In dieser Phase wird üblicherweise aus einem Vorfermenter gewonnenes Material in den Kessel eingebracht, mit konzentrierter Nährlösung und Sauerstoff versetzt, so dass ein Zellwachstum stattfindet. In dieser Phase wachsen also die Zellen, d. h. der Biokatalysator wird bereit gestellt. Das Wachstum erfolgt üblicherweise bis zu einer bestimmten Zelldichte, welche z. B. durch die zugegebene Nährlösung eingestellt werden kann.
• 2. Übergangsphase:
  In dieser Phase ist der anfänglich zugegebene Zucker durch die Biomasse Bildung und den Stoffwechsel der Zellen verbraucht worden. Dies resultiert für die Zellen in einer Zuckerlimitierung. Zusätzlich wird die Temperatur im Fermenter üblicherweise um ca. 2°C erhöht.
• 3. Feed-Phase:
  In dieser Phase wird den Zellen dosiert Zucker zugefüttert, so dass eine Lysin Bildung erfolgt. Der Zucker wird durch den Stoffwechsel der Bakterien in das Produkt L-Lysin umgewandelt.

Der Fermentationsverlauf kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Arrays, insbesondere mit Hilfe von DNA-Chips überprüft, überwacht oder/und kontrolliert werden. Dies geschieht beispielsweise durch einen Vergleich von Genexpressionsmustern aus einer laufenden Fermentation mit bekannten Genexpressionsmustern. Die Erfindung stellt insbesondere Markergene für die einzelnen Phasen bereit, die in den Tabellen 1-4 aufgelistet sind. Tabelle 1 zeigt Gene, die in der Batch-Phase bezogen auf die Gesamtfermentation verstärkt exprimiert sind. Ein Array zur Überwachung des Zellwachstums ist bevorzugt auf die Erkennung mindestens eines, bevorzugt mindestens zehn, insbesondere mindestens zwanzig und am meisten bevorzugt aller dieser Gene gerichtet.

Tabelle 2 zeigt Gene, deren Expression in der Übergangsphase stärker wird, während Tabelle 3 Gene zeigt, deren Expression in der Übergangsphase schwächer wird. Ein Array zur Überwachung der Übergangsphase ist deshalb bevorzugt auf die Erkennung mindestens eines, mehr bevorzugt mindestens zehn, am meisten bevorzugt mindestens zwanzig und noch mehr bevorzugt aller Gene aus Tabelle 2, aus Tabelle 3 oder aus Tabelle 2 und Tabelle 3 gerichtet. Gerade in der Übergangsphase, in der eine Adaption der Zellen stattfindet, treten viele Änderungen auf, so dass hier eine Überwachung vorteilhafterweise durchgeführt werden kann.

Tabelle 4 schließlich zeigt Gene, die in der Feed-Phase verstärkt exprimiert sind. Ein Array zur Überwachung der L-Lysin Produktion ist deshalb bevorzugt auf die Erkennung mindestens eines, mehr bevorzugt mindestens zehn, am meisten bevorzugt mindestens zwanzig und noch mehr bevorzugt aller in Tabelle 4 angegebener Gene gerichtet.

Während es erfindungsgemäß möglich ist, Arrays bereitzustellen, die speziell zur Überwachung oder Kontrolle des Zellwachstums, der Zelladaption oder der L-Lysin Produktion angelegt sind (also Phasenarrays zur Überwachung der einzelnen Phasen) ist es auch möglich und bevorzugt, einen Array bereitzustellen, mit dem mindestens zwei der Phasen und bevorzugt alle Phasen überwacht werden können. Ein solcher Array ist bevorzugt auf die Erkennung mindestens eines Gens, mehr bevorzugt mindestens jeweils fünf Gene, noch mehr bevorzugt mindestens jeweils zehn Gene aus der Tabelle 1, aus der Tabelle 2 oder 3 und aus der Tabelle 4 gerichtet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Array auf die Erkennung aller in den Tabellen 1, 2, 3 und 4 angegebener Gene gerichtet.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Analysierung einer Polynukleotidsequenz eines Mikroorganismuses, beispielsweise Corynebakterium glutamicum durch die Verwendung eines Arrays von DNA-Sonden, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wobei die verschiedenen DNAs verschiedene Bereiche oder Zellen des Arrays belegen, wobei das Verfahren das Markieren der Polynukleotidsequenz oder Fragmente davon, Aufbringen der Polynukleotidsequenz oder Fragmente davon unter Hybridisierungsbedingungen auf den Array und Beobachten des Ortes der Markierung auf der Oberfläche, die mit bestimmten Mitgliedern der aufgebrachten DNAs assoziiert ist. Als Markierung werden insbesondere Fluoreszenzmarkierungen oder/und radioaktive Markierungen eingesetzt.

Die DNA-Chips der Erfindung können verwendet werden, um verschiedene RNA-Sequenzen oder Fragmente davon zu untersuchen und nachzuweisen. Zu diesem Zweck werden die Polynukleotidsequenzen oder Fragmente davon oder eine Kopie der Polynukleotidsequenz oder Fragmente davon des zu untersuchenden Mikroorganismus auf den DNA-Chip unter Hybridisierungsbedingungen aufgebracht.

Die Sequenzen geeigneter Mikroorganismen, welche gewünschte Verbindungen erzeugen, beispielsweise Corynebakterium, können in verschiedenen Datenbanken gefunden werden, z. B. der Datenbank NCBI (National Center For Biotechnology Information). Die Datenbank ist zu finden in der National Liabory of Medicine, Building 38A, Room 8N 805, Bethesda, MD 20894 USA (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov).

Eine weitere Datenbank, in welcher entsprechende Sequenzen abgerufen werden können, ist die Swiss Prot und Trembl-Datenbank vom Swiss Institute of Bioinformatics CMO-Rue Michelle-ser ve 1, 1211 Geneve 4, Switzerland (http:/ / www.expasy.ch).

Eine weitere Datenbank ist die Datenbank PIR, die Protein Information Researse Database of the National Biomedical Research Foundation, 3900 Reservoir Road, NW. Washington, DC 20007, USA (http:/ / www.nbrf.georgetown.edu/pirwww/pirhome.shtml).

Weitere Gene von Corynebacterium sind in WO 01/02583, WO 01/00842, WO 01/00843, WO 01/00844, WO 01/00845, WO 01/00847, WO 01/00802, WO 01/00804 und WO 01/00805 beschrieben.

Aus den Datenbanken bekannten Referenzsequenzen sind im Folgenden angegeben:

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Arrays zur Überwachung oder/und zum Monitoring des Transkriptionsstatus von Zellen während einer Fermentation verwendet. Weiterhin können die Arrays zum Monitoring des Transkriptionsstatus eine diagnostische Teilmenge von Genen während einer Fermentation verwendet werden.

Die Arrays gemäß der Erfindung werden bevorzugt in einem Verfahren zum Überwachen eines Fermentationsverfahrens eingesetzt, bei dem Polynukleotidsequenzen oder Fragmente davon eines eine gewünschte Verbindung erzeugenden Mikroorganismuses analysiert werden. Bevorzugt wird ein Array verwendet, der DNA-Sonden umfasst, von denen mindestens eine exakt komplementär zu ausgewählten Referenzsequenzen des Mikroorganismuses sind. Die Sonden werden auf einen festen Träger immobilisiert, wobei unterschiedliche Sonden-DNAs unterschiedliche Zellen oder Bereiche des Arrays belegen. Bei dem Verfahren wird die Referenzpolynukleotidsequenz oder Fragmente davon markiert, die Polynukleotidsequenz oder Fragmente davon unter Hybridisierungsbedingungen auf den Array aufgebracht und der Ort und die Intensität der Markierung auf den mit bestimmten Mitgliedern der Sonden- DNA assoziierten Oberflächen beobachtet.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Polynukleotidsequenz eines Corynebakterium glutamicum Stammes analysiert, wobei die Mikroorganismen bevorzugt aus einer Fermentationsbrühe abgetrennt wurden. Es ist aber möglich, eine Sequenz eines Escherichia coli Stammes zu analysieren.

Der Array kann weiterhin verwendet werden, um Targetgene eines Mikroorganismus zu überwachen, der in einem Fermentationsprozess eine Rolle spielt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Fermentationsprozess durch folgende Schritte überwacht:

• a) Fermentation von Bakterien, welche L-Aminosäuren, Vitamine, Metaboliten, Antioxidantien, zelluläre oder segregierte Proteine, Pigmente, Nukleotide, Zucker oder/und Peptide erzeugen,
• b) Isolieren der Mikroorganismen-Zellen während der Fermentation und Herstellen der zellulären Ribonukleinsäure (RNA),
• c) Markieren der isolierten RNA mit einer bekannten Technik, wie etwa einer Direktmarkierungsmethode oder einer Inkorporation von markierten Nukleotiden während der Erzeugung einer Kopie der isolierten RNA (z. B. in eine cDNA/cRNA),
• d) anschließend Hybridisieren der markierten RNA/cDNA/cRNA auf einen Array, welcher einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuresonden für den Nachweis von Transkripten von Coryneform oder Coli-Formbakterien umfasst,
• e) Detektion des Hybridisierungsmusters der Signale durch bekannte Verfahren,
• f) Vergleich der erhaltenen Hybridisierungsmuster und
• g) Verwendung der erhaltenen Ergebnisse der Verbesserung des Verfahrens und der Produktivität.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure, bei welcher es sich um ein Corynebacterium glutamicum Gen handelt, welches für ein Polypeptid codiert, umfassend: (a) eine der in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179 gezeigten Nukleotidsequenzen, (b) eine Nukleotidsequenz, die einer Nukleotidsequenz gemäß (a) innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, (c) eine Nukleotidsequenz, die mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) eine Nukleotidsequenz, die eine Homologie größer als 80% zu einer Nukleotidsequenz gemäß (a), (b) oder/und (c) aufweist oder/und (e) einen Teil einer der Sequenzen gemäß (a), (b), (c) oder/und (d) mit einer Länge von mindestens 20 Basen umfasst.

Die Funktionen der von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide bzw. Proteine sind in Tabelle 5 angegeben.

Die Erfindung umfasst weiterhin einen Vektor, insbesondere einen rekombinanten Vektor der mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, bevorzugt in operativer Verknüpfung mit Expressionskontrollsequenzen (z. B. Promotor, Operator, Enhancer etc.) enthält, sowie eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Vektor transformiert ist. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle, insbesondere eine natürlich nicht vorkommende Zelle, in der eine ursprünglich vorhandene Nukleinsäure, wie sie hierin definiert ist, inaktiviert ist. Besonders bevorzugt handelt es sich bei einer solchen Zelle um eine Corynebacterium glutamicum Zelle. Für diese Ausführungsform wird eine Zelle, in welcher natürlicherweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäure vorliegt, verändert, indem die Nukleinsäure inaktiviert wird. Die Inaktivierung kann auf bekannte Weise, beispielsweise durch Insertion von Transposons oder Interposons oder durch Deletion mindestens eines Teils der Sequenz durchgeführt werden.

Schließlich betrifft die Erfindung noch die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierten Polypeptide. Bevorzugt sind Polypeptide mit den in Tabelle 5 aufgelisteten Funktionen.

Tabelle 1 Futtermitteladditive

Die Batch-Phase zeichnet sich dadurch aus, dass im Rahmen dieser Phase die Gene mit folgendem ORF-Identification Code, bezogen auf die Gesamtfermentation, verstärkt exprimiert sind:
1
31
59
99
228
271
425
435
457
493
513
523
576
588
592
601
643
701
802
814
894
927
975
1014
1016
1237
1308
1385
1400
1403
1510
1517
1536
2142
2144
2160
2185
2251
2441
2545
2923
2947
2974
2984
3054
3102
3150
3190

Tabelle 2 Futtermitteladditive

Die Übergangs-Phase zeichnet sich dadurch aus, dass die Expression der Gene mit folgender ORF-ID stärker wird:
47
84
90
101
104
106
177
178
193
203
205
206
212
228
242
271
274
307
311
320
328
338
356
403
406
425
435
458
482
514
523
527
531
549
552
554
567
592
594
596
601
632
637
643
732
737
746
782
792
801
803
812
860
894
911
936
944
975
976
992
997
1000
1018
1022
1044
1046
1049
1050
1070
1077
1101
1113
1140
1183
1190
1202
1217
1243
1254
1255
1276
1281
1297
1301
1308
1309
1312
1322
1325
1327
1331
1337
1374
1400
1403
1448
1495
1507
1514
1517
1536
1679
1816
1860
2062
2119
2183
2185
2400
2457
2458
2520
2545
2548
2564
2587
2648
2731
2744
2759
2923
2947
2984
3028
3045
3079
3102
3150
3190
3233
3300

Tabelle 3 Futtermitteladditive

Die Übergangs-Phase zeichnet sich ebenso dadurch aus, dass die Expression der Gene mit folgender ORF-ID schwächer wird:
3
5
28
93
96
138
219
230
330
352
431
457
460
461
510
535
566
696
699
704
779
781
813
821
838
876
903
912
913
924
1009
1043
1054
1141
1142
1176
1201
1252
1253
1270
1292
1326
1350
1389
1440
1521
1559
1615
1619
1631
1639
1757
1765
1801
1909
1932
1937
1976
1984
1996
2005
2097
2163
2301
2319
2350
2384
2397
2426
2440
2441
2448
2453
2500
2604
2662
2667
2679
2682
2684
2685
2690
2715
2721
2778
2810
2894
2906
2954
3034
3066
3078
3143
3297
3301
3303

Tabelle 4 Futtermitteladditive

Die Feed-Phase zeichnet sich dadurch aus, dass im Rahmen dieser Phase die Gene mit folgender ORF-ID bezogen auf die Gesamtfermentation verstärkt exprimiert sind:
74
78
169
205
206
290
340
376
495
572
642
698
715
719
747
800
895
911
913
936
988
995
1049
1101
1264
1276
1295
1318
1323
1325
1337
1339
1359
1373
1411
1448
1534
1876
1986
2397
2420
2501
2548
2597
2620
2640
2651
2702
2750
2754
3000

Tabelle 5

Claims (16)

1. Array, umfassend mindestens eine Nukleinsäure, welche:

• a) eine der in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179 gezeigten Nukleotidsequenz,
• b) eine Nukleotidsequenz, die einer Nukleotidsequenz gemäß (a) innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht,
• c) eine Nukleotidsequenz, die mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
• d) eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine Homologie größer als 80% zu einer Nukleotidsequenz gemäß (a), (b) oder/und (c) aufweist oder/und
• e) einen Teil einer der Sequenzen gemäß (a), (b), (c) oder/und (d) mit einer Länge von mindestens 20 Basen

umfasst, wobei die mindestens eine Nukleinsäure auf einem festen Träger immobilisiert ist.

2. Array nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1(e) mit einer Länge von mindestens 18 Basen, insbesondere mindestens 35 Basen umfasst.

3. Array nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nukleinsäure um einsträngige oder/und zweisträngige Nukleinsäuren handelt.

4. Array nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er ausschließlich von Corynebacterium glutamicum abgeleitete Nukleotidsequenzen umfasst.

5. Array, umfassend mindestens ein Polypeptid, ausgewählt aus den von durch Nukleinsäuren gemäß Ansprüche 1(a) bis 1(e) codierten Polypeptiden.

6. Array, umfassend mindestens ein Molekül, welches mit einer Nukleinsäure, wie in Anspruch 1(a) bis 1(e) definiert oder einem Polypeptid, wie in Anspruch 5 definiert, bindefähig ist.

7. Verwendung eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Analyse von Corynebacterium glutamicum.

8. Verwendung nach Anspruch 7 zur Überwachung eines Fermentationsprozesses.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8 für die Analyse des Expressionsniveaus von zellulärer mRNA von Corynebacterium glutamicum.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Analyse von Genexpressionsmustern von Corynebacterium glutamicum, zur Differenzierung zwischen unterschiedlichen Stämmen, zur Bestimmung von Zuständen von Corynebacterium glutamicum oder/und zur Bestimmung von Umgebungsbedingungen.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die erhaltenen Analyseergebnisse zur Einstellung der Lebensbedingungen oder/und des Fermentationsprozesses herangezogen werden.

12. Nukleinsäure, bei welcher es sich um ein Corynebacterium glutamicum Gen handelt, welches für ein Polypeptid codiert, umfassend:

• a) eine der in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 2179 gezeigten Nukleotidsequenz,
• b) eine Nukleotidsequenz, die einer Nukleotidsequenz gemäß (a) innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht,
• c) eine Nukleotidsequenz, die mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
• d) eine Nukleotidsequenz, die eine Homologie größer als 80% zu einer Nukleotidsequenz gemäß (a), (b) oder/und (c) aufweist oder/und
• e) einen Teil einer der Sequenzen gemäß (a), (b), (c) oder/und (d) mit einer Länge von mindestens 20 Basen umfasst.

13. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 12 enthält.

14. Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 12 oder einem Vektor nach Anspruch 13 transformiert ist.

15. Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass eine darin ursprünglich vorhandene Nukleinsäure nach Anspruch 12 inaktiviert ist.

16. Polypeptid, codiert durch eine Nukleinsäure nach Anspruch 12.