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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von hochdichten Feldern
("Arrays") oder Gittern ("Grids") aus genomischen
(oder cDNA-) Bibliotheken zur Identifizierung, Sequenzierung und
Charakterisierung von Genen, die wesentlich für das Wachstum eines Organismus
und besonders spezifisch gegen ein Pathogen sind. Die Bestimmung
dieser wesentlichen Gene und der dadurch codierten Proteine ist
nützlich
in der Entwicklung neuer Therapien gegen solche Pathogene.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung von Genen ist
ein Hauptziel der modernen wissenschaftlichen Forschung. Durch die
Identifizierung von Genen, die Bestimmung ihrer Sequenzen und die Charakterisierung
ihrer biologischen Funktion ist es möglich, die rekombinante Technik
zur Erzeugung großer Mengen
wertvoller Genprodukte, zum Beispiel Proteine und Peptide, einzusetzen.
Zusätzlich
kann das Wissen um Gensequenzen einen Schlüssel zur Diagnose, Prognose
und Behandlung in einer Vielzahl von infektiösen Krankheiten und Krankheitszuständen in
Pflanzen und Tieren bereitstellen, die durch eine unangemessene Expression
und/oder Unterdrückung
ausgewählter
Gene oder durch den Einfluß von äußeren Faktoren,
zum Beispiel Karzinogenen oder Teratogenen, auf die Genfunktion
gekennzeichnet sind.
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Verfahren
wurden zur Identifizierung bestimmter neuer Gensequenzen beschrieben,
die als Expressed Sequence Tags (EST) bezeichnet werden. Adams et
al., Science, 1991, 252:1651-1656. Eine Vielzahl von Techniken wurde
ebenfalls zur Identifizierung besonderer Gensequenzen auf Basis
ihrer Genprodukte beschrieben. Siehe zum Beispiel WO 91/07087, veröffentlicht
am 30. Mai 1991. Zusätzlich
wurden Verfahren zur Amplifikation von gewünschten Sequenzen beschrieben.
Siehe zum Beispiel WO 91/17271, veröffentlicht am 14. November
1991.
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Gene,
die wesentlich für
das Wachstum eines Organismus sind, sind jedoch schwierig in einer
solchen Weise zu identifizieren, daß sie leicht für eine zukünftige Analyse
gewonnen werden. Die derzeit am häufigsten eingesetzte Methodik
zur Identifizierung wesentlicher Gene ist ein mehrstufiger Prozeß, der die
Erzeugung einer konditional letalen Mutantenbibliothek, gefolgt
von der Durchmusterung doppelter Elemente unter den geeigneten permissiven
und nicht-permissiven Bedingungen beinhaltet. Kandidatenmutanten
werden dann mit einer zweiten genomischen Bibliothek transformiert
und die gewünschten
Gene durch Komplementierung des mutierten Phänotyps isoliert. Das komplementierende
Plasmid wird gewonnen, subkloniert und dann erneut getestet. Jedoch
umfaßt
dieses Verfahren mehrere Subklonierungsschritte zur Identifizierung
und Gewinnung der gewünschten
Gene, wodurch es sowohl arbeitsintensiv als auch zeitaufwendig ist.
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Entsprechend
besteht ein Bedarf an einem effizienteren Verfahren zur Identifizierung
von Genen, die wesentlich für
das Wachstum eines Organismus sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren
eines Gens oder von Genen bereit, die wesentlich für das Wachstum
eines Organismus sind, durch die Verwendung von hochdichten Feldern oder
Gittern aus genomischen Bibliotheken. Das Verfahren beinhaltet das
Herstellen einer genomischen Bibliothek eines ausgewählten Organismus
und das Bereitstellen einer Mehrzahl von identischen Gittern, wobei jedes
Gitter eine Oberfläche
umfaßt,
auf der in vordefinierten Regionen auf der Oberfläche eine
Mehrzahl von definierten Materialien immobilisiert ist, die aus
der genomischen Bibliothek stammen. Der ausgewählte Organismus wird dann mutagenisiert,
bevorzugt durch Insertionsmutagenese, und in einer Testkultur unter
einem ausgewählten
Satz definierter Bedingungen kultiviert. Eine Kontrollkultur, die
den nicht-mutagenisierten ausgewählten
Organismus umfaßt,
wird ebenfalls unter dem gleichen Satz definierter Bedingungen kultiviert. Überlebende
Zellen aus den Kulturen werden geerntet, und DNA aus geernteten
Zellen des mutagenisierten Organismus (Testkultur) und RNA oder
DNA aus geernteten Zellen des nicht-mutagenisierten Organismus (Kontrollkultur)
werden extrahiert und isoliert. Markierte Polynukleotidsonden aus
der isolierten DNA der Testkultur und markierte Polynukleotidsonden
aus der isolierten RNA (oder DNA) der Kontrollkultur werden dann erzeugt
und mit identischen Gittern hybridisiert, um ein Testhybridisierungsmuster
bzw. eine Kontrollhybridisierungsmuster zu erzeugen. Hybridisierungsmuster
auf den Gittern werden dann zur Identifizierung von Genen verglichen,
die wesentlich für
das Wachstum des ausgewählten
Organismus sind. Wesentlichkeit des identifizierten Gens für das Wachstum
des ausgewählten
Organismus wird dann bestätigt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann ferner das Kultivieren von zusätzlichen Testkulturen, die
den mutagenisierten Organismus umfassen, und von Kontrollkulturen,
die den nicht-mutagenisierten Organismus umfassen, unter unterschiedlichen
Sätzen
definierter Bedingungen umfassen. Markierte Sonden aus der isolierten
DNA und RNA aus diesen zusätzlichen
Kulturen werden in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben erzeugt,
um Test- und Kontrollhybridisierungsmuster für unter den unterschiedlichen
Sätzen
definierter Bedingungen kultivierte Kulturen zu erzeugen. Gene,
die wesentlich für
das Wachstum des ausgewählten
Organismus sind, werden dann durch Vergleichen der Hybridisierungsmuster
identifiziert, die durch mutagenisierte und nicht-mutagenisierte
Organismen erzeugt wurden, die unter jedem der unterschiedlichen
Sätze definierter Bedingungen
kultiviert wurden.
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Ein
zusätzlicher
Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes Gen bereit, das wesentlich
für das
Wachstum eines Organismus ist und durch eines der obigen Verfahren
identifiziert wird.
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Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein isoliertes Protein, das
durch Expression der oben identifizierten Gensequenz erzeugt wird.
Solche Proteine sind nützlich
in der Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Zusammensetzungen
oder als Ziele für
die Wirkstoffentwicklung.
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Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Identifizierung von Breitbandantibiotika
oder Antimykotika, die die Expression dieser wesentlichen Gene hemmen.
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In
einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Identifizieren von konditional letalen mutierten Genen eines
ausgewählten
Organismus durch Komplementierung mit einer nicht-mutagenisierten
genomischen Bibliothek des gleichen Organismus bereit. Das Verfahren
beinhaltet das Herstellen einer genomischen Bibliothek in entweder
einem Integrationsvektor oder in einem Expressionsvektor und das
Bereitstellen eines Gitters, das eine Oberfläche umfaßt, auf der in vordefinierten
Regionen auf der Oberfläche
eine Mehrzahl definierter Materialien immobilisiert ist, die aus
der genomischen Bibliothek stammen. Der ausgewählte Organismus wird dann mutagenisiert,
bevorzugt durch chemisch induzierte Punktmutationen, und (in einer
Testkultur) unter permissiven und nicht-permissiven Bedingungen
zur Identifizierung mutagenisierter Organismen kultiviert, die konditional
letale mutierte Gene enthalten. Organismen, die konditional letale
mutierte Gene enthalten, werden mit der hergestellten (d.h. nicht-mutagenisierten)
genomischen Bibliothek transformiert, und die transformierten Organismen
oder Zellen werden unter den gleichen nicht-permissiven Bedingungen
kultiviert, die zur Identifizierung mutagenisierter Organismen verwendet
wurden, die die konditional letalen mutierten Gene enthalten. Überlebende
Zellen werden geerntet, und DNA wird extrahiert und isoliert. Markierte
Polynukleotidsonden aus der isolierten DNA werden dann erzeugt und
mit dem Gitter zur Identifizierung von Genen hybridisiert, die wesentlich
für das
Wachstum des ausgewählten
Organismus sind.
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Andere
Aufgabe, Merkmale, Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung
werden den Fachleuten aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich
werden. Es versteht sich jedoch, daß die nachfolgende Beschreibung
und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindungen angeben, bloß zur
Veranschaulichung angegeben werden. Verschiedene Veränderungen
und Modifikationen im Umfang der offenbarten Erfindung werden den
Fachleuten aus dem Lesen der nachfolgenden Beschreibung und aus
dem Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung leicht
ersichtlich werden.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
biochemische Basis vieler bakterieller Resistenzmechanismen gegen
Antibiotika ist jetzt bekannt. Diese Mechanismen, allein oder zusammen,
sind verantwortlich für
das sich ausweitende Problem der Antibiotikaresistenz, die bei Infektionen
beobachtet wird, die sowohl im Krankenhaus als auch in der Gemeinschaft erworben
wurden. Der prinzipielle Ansatz durch Forscher, um diese Probleme
auszuräumen,
bestand im Suchen nach schrittweisen Verbesserungen bei bestehenden
Wirkstoffen. Obwohl diese Ansätze
etwas zum Kampf gegen Infektionen durch solche resistenten Pathogene
beitragen, sind neue Ansätze
erforderlich.
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Es
wurden jetzt Verfahren zum Identifizieren von Genen und Genprodukten
entwickelt, die wesentlich für
das Überleben
eines Organismus sind. Durch diese Verfahren identifizierte Gene
und Genprodukte sind nützlich
als molekulare Ziele für
die Wirkstoffauffindung. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung
sind nützlich
in der Bestimmung der Wirkung des völligen Fehlens eines Gens oder
Genprodukts auf das Überleben eines
Organismus.
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I. Definitionen
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Mehrere
Wörter
und Begriffe, die in dieser Beschreibung verwendet werden, sind
wie folgt definiert:
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Gen" die genomische Nukleotidsequenz,
aus der eine cDNA-Sequenz abgeleitet wird. Der Begriff Gen bezeichnet
in klassischer Weise die genomische Sequenz, die bei Verarbeitung
unterschiedliche cDNAs erzeugen kann, zum Beispiel durch Spleißungsereignisse.
Jedoch wird zum leichteren Lesen hier auch jede entsprechende cDNA-Sequenz
voller Länge
in Kurzschrift als Gen bezeichnet.
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Mit "Genprodukt" ist jede Polypeptidsequenz
gemeint, die durch ein Gen codiert wird. Der Begriff "genomische Bibliothek" soll ohne Beschränkung Plasmidbibliotheken,
PCR-Produkte aus genomischen Bibliotheken, cDNA-Bibliotheken und bekannte Sequenzen
einschließen.
Verfahren zur Konstruktion solcher Bibliotheken sind den Fachleuten
wohlbekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird eine genomische Bibliothek in einem Suizidvektor
konstruiert. Es ist auch bevorzugt, daß die konstruierte Bibliothek
eingestellt wird, um die Anzahl vollständiger Gene, die in einem einzelnen
genomischen Insert vorhanden sind, auf ca. ein Gen zu minimieren.
Techniken für
diese Einstellung sind dem Fachmann wohlbekannt.
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"Isoliert" bedeutet "durch Menschenhand" aus seinem natürlichen
Zustand verändert;
das heißt
falls es in der Natur vorkommt, wurde es gegenüber seiner ursprünglichen
Umgebung verändert
oder daraus entfernt oder beides. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes
Polynukleotid oder ein Polypeptid, das in natürlicher Weise in einem lebenden
Tier in seinem natürlichen
Zustand ist, nicht "isoliert", aber das gleiche
Polynukleotid oder Polypeptid, das von den koexistierenden Materialien
seines natürlichen
Zustands getrennt ist, ist "isoliert", wie der Begriff
hier eingesetzt wird. Zum Beispiel bedeutet der Begriff isoliert
in bezug auf Polynukleotide, daß sie
vom Chromosom und der Zelle getrennt sind, in der sie in natürlicher
Weise vorkommen.
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Mit "Organismus" ist jeder einzellige
Organismus gemeint. Bevorzugt schließt dies ohne Beschränkung Bakterien
(einschließlich
sowohl Gramnegativer als auch Gram-positiver Spezies), Viren und
niedere eukaryontische Zellen wie Pilze, Hefe, Schimmel und einfache
mehrzellige Organismen ein. Bevorzugt ist der Organismus ein Pathogen.
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Der
Begriff "Pathogen" wird hier als jeder
Organismus definiert, der ein Tier oder eine Pflanze infizieren und
seine Nukleinsäuresequenzen
in den Zellen oder im Gewebe des Tieres oder der Pflanze vervielfältigen kann.
Ein solches Pathogen ist allgemein mit einem Krankheitszustand im
infizierten Tier oder in der infizierten Pflanze assoziiert. Solche
Pathogene können
ohne Beschränkung
Viren, die sich intra- oder extrazellulär vervielfältigen, oder andere Organismen
wie Bakterien, Pilze oder Schimmel einschließen, die allgemein Gewebe oder
das Blut infizieren. Bestimmte Pathogene sind dafür bekannt,
daß sie
in aufeinanderfolgenden und unterscheidbaren Entwicklungsstadien
existieren, zum Beispiel in latenten Stadien, infektiösen Stadien
und Stadien, die symptomatische Krankheiten verursachen. In diesen
unterschiedlichen Stadien wird vorhergesehen, daß das Pathogen auf unterschiedlichen
Genen als wesentlich für
das Überleben
oder für
die Pathogenität
beruht.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "fester Träger" jedes bekannte Substrat, das zur Immobilisierung
einer Mehrzahl von definierten Materialien, die aus einer genomischen
Bibliothek stammen, durch jedes verfügbare Verfahren nützlich ist,
um die detektierbare Hybridisierung der immobilisierten Polynukleotidsequenzen
mit anderen Polynukleotiden in der Probe zu ermöglichen. Unter einer Anzahl
verfügbarer
fester Träger
sind ein wünschenswertes
Beispiel die Träger,
die in WO 91/07087 beschrieben werden, veröffentlicht am 30. Mai 1991.
Beispiele für
andere nützliche
Träger
schließen
ohne Beschränkung
Nitrocellulose, Nylon, Glas, Kieselerde und Pall BIODYNE C ein.
Es wird ebenfalls vorhergesehen, daß an herkömmlichen festen Trägern noch
vorzunehmende Verbesserungen auch in dieser Erfindung eingesetzt
werden können.
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Der
Begriff "Gitter" meint jede allgemein
zweidimensionale Struktur auf einem festen Träger, an dem die definierten
Materialien einer genomischen Bibliothek angebracht oder immobilisiert
sind.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "vordefinierte Region" eine lokalisierte Fläche auf
einer Oberfläche
eines festen Trägers,
auf dem eine oder mehrere Kopien eines besonderen Klons immobilisiert sind
und der die Hybridisierung des Klons in der Position ermöglicht,
falls eine Hybridisierung des Klons mit einem Probenpolynukleotid
erfolgt.
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Mit "immobilisiert" ist beabsichtigt,
die Anbringung der Gene am festen Träger zu bezeichnen. Mittel zur
Immobilisierung sind den Fachleuten bekannt und herkömmlich und
können
vom Typ des verwendeten Trägers
abhängen.
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II. Zusammensetzungen
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Verwendung von hochdichten
Feldern oder Gittern aus genomischen Bibliotheken als Mittel zur
schnellen Identifizierung von Genen, die wesentlich für das Wachstum eines
Organismus sind.
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A. Herstellung genomischer
Bibliotheken
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Für diese
Analyse wird eine statistische genomische Bibliothek für den Zielorganismus
hergestellt. Die genomische DNA wird unter Verwendung von Standardverfahren
für die
Molekularbiologie isoliert, wie zum Beispiel durch diejenigen, die
offenbart werden von Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL, 2. Auf 1., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring
Harbor, New York, 1989. Die genomische Bibliothek wird dann gemäß den von
Fleischmann et al. beschriebenen Verfahren konstruiert, Science, 1995,
269:496-512. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine genomische Bibliothek
eine Plasmidbibliothek, PCR-Produkte aus einer genomischen Bibliothek
oder bekannte Sequenzen umfassen. In einer Ausführungsform wird ein Suizidvektor
für die
Herstellung der genomischen Bibliothek verwendet. Beispiele für Suizidvektoren,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind
allgemein fachbekannt. Siehe zum Beispiel Booker et al., Lett. Appl.
Microbiol. 1995, 21:292-297; M. Steinmeitz und R. Richter, Gene, 1994,
142:79-83; Yu et al., J. Bacteriol. 1994, 176:3627-34; und J. Quandt
und M.F. Hynes, Gene, 1993, 127:15-21. In einer bevorzugten Ausführungsform
kann ein Suizidvektor, der das Erythromycin-(Erm)-Gen für einen
breiten Wirtebereich enthält,
in einem handelsüblichen
Plasmid wie pBluescript (pBS; Stratagene, La Jolla, CA) hergestellt
werden. Das Erm-Gen wird als Taq1-Restriktionsfragment aus dem Vektor
pE194 isoliert (S. Hourinouchi und B. Weisbaum, J. Bacteriology
1982, 150:804-812). Das Erm-haltige Fragment wird direkt in NaeI-verdautes,
CIP-behandeltes pBS ligiert und in HB101-Zellen transformiert. Die
Transformanten werden durch PCR zur Bestimmung der Gegenwart des
Erm-Gens durchmustert. Unter Verwendung dieses Vektors wurden zwei
Erm-positive Isolate durch Sequenzanalyse bestätigt und mit pJMErmA4 und pJMErmD2
bezeichnet. Zur Bibliothekskonstruktion werden genomische Inserte
in den besonderen SmaI-Ort plaziert, der in der Polylinkerregion
vorhanden ist. Es ist auch bevorzugt, daß die konstruierte Bibliothek
zur Minimierung der Anzahl von vollständigen Genen eingestellt wird,
die in einem einzelnen genomischen Insert vorhanden sind. Techniken
zur Durchführung
dieser Einstellung der Bibliothek sind den Fachleuten wohlbekannt.
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B. Herstellung von Gitter
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Eine
Mehrzahl von Materialien, die aus der genomischen Bibliothek stammen,
werden als Gitter auf eine Oberfläche eines festen Trägers an
vordefinierten Orten oder Regionen angebracht, bevorzugt mit 6X-Bedeckung.
Mit "Mehrzahl von
Materialien, die aus der genomischen Bibliothek stammen" ist gemeint, ohne
Beschränkung
Bakterien, die individuelle Klone enthalten, die auf eine Oberfläche des
festen Trägers
in vordefinierten Orten oder Regionen getüpfelt sind und dort kultiviert
werden; oder Plasmidklone, die aus der Bibliothek isoliert sind,
PCR-Produkte, die aus den Inserts aus den Plasmidklonen stammen,
oder Oligonukleotide einzuschließen, die aus der Sequenzierung
der Plasmidklone stammen, die auf der Oberfläche des festen Trägers in
vordefinierten Orten oder Regionen immobilisiert sind.
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Zahlreiche
herkömmliche
Verfahren werden zum Immobilisieren dieser Materialien an Oberflächen einer
Vielzahl fester Träger
eingesetzt. Siehe zum Beispiel Affinity Techniques, Enzyme Purification:
Teil P, Methods in Enzymology, Bd. 34, Hrsg. W. B. Jakoby, M. Wilcheck,
Acad. Press, NY (1971); Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography,
Advances in Experimental Medicine and Biology, Bd. 42, Hrsg. R.
Dunlap, Plenum Press, NY (1974); US-PS 4,762,881; US-PS 4,542,102;
EP 391,608 (10. Oktober 1990);
oder US-PS 4,992,127 (21. November 1989).
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Ein
wünschenswertes
Verfahren zum Anbringen dieser Materialien an einem festen Träger wird
in PCT/US90/06607 (veröffentlicht
am 30. Mai 1991) beschrieben. Kurz gesagt beinhaltet dieses Verfahren
das Bilden von vordefinierten Regionen auf einer Oberfläche eines
festen Trägers,
worin die vordefinierten Regionen die Materialien immobilisieren
können.
Das Verfahren verwendet die Bindung von Substraten, die an der Oberfläche angebracht
sind, die die selektive Aktivierung der vordefinierten Regionen
ermöglichen.
Bei Aktivierung können
diese bindenden Substanzen die aus der genomischen Bibliothek stammenden
Materialien binden und immobilisieren.
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Jedes
der bekannten festen Substrate, die zur Bindung von Nukleotidsequenzen
in vordefinierten Regionen auf ihrer Oberfläche zur Hybridisierung geeignet
sind, und Verfahren zur Anbringung von Nukleotidsequenzen daran
können
durch einen Fachmann erfindungsgemäß eingesetzt werden. In ähnlicher
Weise können
bekannte herkömmliche
Verfahren zum Detektierbarmachen der Hybridisierung der immobilisierten
Materialien, z.B. Fluoreszenz, Radioaktivität, Photoaktivierung, Biotinylierung,
Energietransfer, Festphasenverschaltung und dgl., in dieser Erfindung
verwendet werden.
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C. Herstellung und Kultur
von mutagenisiertem Organismus
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Der
Organismus von Interesse wird durch Transfektion mit entweder einem
zufällig
integrierenden Transposon oder ähnlichen
Insertions- oder transponiblen Elementen bekannter Sequenz (z.B.
Tn, IS, Phage Mu, Ty-Element)
oder mit einem konstruierten Suizidvektor mutagenisiert und unter
einem ausgewählten
Satz definierter Bedingungen kultiviert.
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III. Die Verfahren der
Erfindung
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A. Identifizierung von
Genen
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Die
vorliegende Erfindung setzt die Zusammensetzungen ein, die oben
in Verfahren zum Identifizieren von Genen beschrieben wurden, die
wesentlich für
das Wachstum eines Organismus sind. Diese Verfahren können zum
Detektieren solcher Gene eingesetzt werden, unabhängig vom
Wissenszustand über
die Funktion des Gens.
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In
einer Ausführungsform
werden ein Gen oder Gene, die wesentlich für das Wachstum eines ausgewählten Organismus
sind, durch die Verwendung von zwei oder mehr identischen hochdichten
Feldern oder Gittern aus genomischen Bibliotheken identifiziert,
die aus dem ausgewählten
Organismus hergestellt sind. Für
diese Analyse werden wenigstens zwei identische hochdichte Gitter
oder Felder hergestellt. Jedes Gitter wird aus einer zufälligen genomischen
Bibliothek für
einen ausgewählten
Organismus hergestellt, bevorzugt in einem Suizidvektor. Eine Mehrzahl
von definierten Materialien, die aus der genomischen Bibliothek
stammen, wird dann gitterförmig
an einem festen Träger
angebracht, bevorzugt mit 6X-Bedeckung. Die Insertgröße dieser
Bibliothek wird eingestellt, um die Anzahl vollständiger Gene
zu minimieren, die in einem einzelnen Insert vorhanden sein könnten. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Zielinsertgröße ein komplettes
Gen. Für Bakterien
beträgt
die durchschnittliche Länge
eines kompletten Gens ca. 1 kb.
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Der
ausgewählte
Organismus wird durch Transfektion mit entweder einem zufällig integrierenden Transposon
oder einem ähnlichen
Isertions- oder transponiblen Element bekannter Sequenz, wie zum
Beispiel Tn, IS, Ty-Element
oder Phage Mu, oder mit dem konstruierten Suizidvektor mutagenisiert.
Der mutagenisierte ausgewählte
Organismus wird dann unter einem ausgewählten Satz definierter Bedingungen
in vitro oder in vivo zur Erzeugung einer Testkultur kultiviert.
Zusätzlich
wird ein nicht-mutagenisierter ausgewählter Organismus ebenfalls
unter dem gleichen Satz definierter Bedingungen zur Erzeugung einer
Kontrollkultur kultiviert. Mit "definierten
Bedingungen" sind
ohne Beschränkung
standardmäßige in-vitro- Kulturbedingungen,
die als normal (d.h. nicht-pathogen) für einen ausgewählten Organismus
anerkannt sind, sowie in-vitro-Bedingungen, die pathogene Umgebungen
(Bedingungen) in vivo widerspiegeln oder nachahmen, wie z.B. Hitzeschock,
Auxotrophie, osmotischer Schock, Antibiotika- oder Wirkstoffauswahl/Zugabe,
variierte Kohlenstoffquellen und aerobe oder anaerobe Bedingungen,
und pathogene Bedingungen in vivo gemeint. Bevorzugt werden solche Bedingungen
vorgegeben, um ein maximales Wachstum des nicht-mutagenisierten Organismus zu erlauben. Die überlebenden
Zellen werden dann geerntet. Das Ernten kann während verschiedener Wachstumsstadien der
Zellen durchgeführt
werden, um die Wesentlichkeit eines besonderen Gens während unterschiedlicher Wachstumsstadien
sicherzustellen. Zum Beispiel kann das Ernten während des frühen logarithmischen Wachstums,
während
des späten
logarithmischen Wachstums, während
des Wachstums der stationären
Phase oder während
des späten
stationären
Wachstums durchgeführt
werden. RNA (oder DNA) wird dann aus den geernteten nicht-mutagenisierten
Zellen der Kontrollkultur extrahiert und isoliert, während DNA
aus den mutagenisierten Zellen der Testkultur extrahiert und isoliert
wird, wobei Standardmethodiken verwendet werden, die den Fachleuten
wohlbekannt sind.
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Aus
den nicht-mutagenisierten Zellen der Kontrollkultur extrahierte
RNA (oder DNA) und aus den mutagenisierten Zellen der Testkultur
extrahierte DNA werden dann zur Erzeugung von markierten Sonden
verwendet. Die extrahierte, isolierte DNA der Testkultur dient als
Matrizen in Primer-Verlängerungsreaktionen
unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die gegen eine Transposon/integrierte
Vektorsequenz gerichtet sind, die sich in benachbarte (d.h. flankierende)
Nukleinsäuresequenz
der (genomischen) DNA erstreckt. Solche Primer werden in Abhängigkeit
vom eingesetzten Mutagenese/Vektorsystem variieren. Zum Beispiel
werden in einer Ausführungsform,
in der die Bibliotheken in den pJMErmA4- oder pJMErmD2-Vektoren
sowohl für die
Gitterbildung als auch die Mutagenese verwendet werden, Primer,
die gegen Sequenzen bestimmt sind, die den SmaI-Klonierungsort flankieren,
verwendet. Beispiele für
solche Primer schließen
ohne Beschränkung ein:
5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAACA-3' (SEQ ID NO:1);
5'-TGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATT
3' (SEQ ID NO:2);
5'-GTAATACGACTCACGGAGGGGCGA-3' (SEQ ID NO:3); und
5'-ACGCCCCTCCGTGAGTCGTATTAG-3' (SEQ ID NO:4).
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Die
Verlängerungsreaktionen
werden unter Verwendung detektierbar markierter, d.h. Radio- oder
Fluoreszenzfarbstoff-markierter oder biotinylierter, Nukleotide
durchgeführt
und so gesteuert, daß die
Ver längerungsprodukte
eine Länge
von ca. 200 Basenpaaren (bp) haben. Eine Anzahl von Verfahren existiert
zur Erzeugung der Primer-Verlängerungsprodukte.
In einer Ausführungsform
werden die Primer-Verlängerungsreaktionen
unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Eine Probe, die 15 pmol
eines geeigneten Primers oder geeigneter Primer, 5 pmol extrahierte
DNA, 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM dATP, 0,1
mM 32P-dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 0,25
mM ddATP, 0,25 mM ddCTP, 0,25 mM ddGTP und Wasser auf 135 μl enthält, wird
hergestellt. Diese Probe wird dann bei 75°C für 15 Minuten; 50°C für 30 Minuten und
37°C für 15 Minuten
inkubiert. Klenow-Polymerase (75 Einheiten in einem Gesamtvolumen
von 15 μl)
wird dann hinzugegeben, und die Probe wird für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
EDTA wird auf 20 mM hinzugegeben. Die Probe wird dann jeweils einmal
mit Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von
einer zweiten Extraktion mit Chloroform und Isoamylalkohol. Das
Produkt wird dann mit Ethanol ausgefällt.
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Wenn
RNA (oder DNA) aus dem nicht-mutagenisierten Organismus zur Erzeugung
der Sonden verwendet wird, wird isolierte RNA (oder DNA) gemäß Standardverfahren
unter Verwendung von zufälligen
Primern, bevorzugt Hexameren, und reverser Transkriptase markiert.
Solche Verfahren werden routinemäßig von den
Fachleuten durchgeführt.
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Diese
markierten Produkte werden dann als Hybridisierungssonden gegen
die identischen hochdichten Gitter verwendet. Markierte Sonden,
die aus DNA hergestellt werden, die aus mutagenisierten Zellen der Testkultur
extrahiert wurde, werden mit einem identischen Gitter hybridisiert,
während
markierte Sonden aus der RNA, die aus den nicht-mutagenisierten
Zellen der Kontrollkultur extrahiert wurde, mit einem zweiten identischen
Gitter hybridisiert werden. Die erzeugten Testhybridisierungsmuster
und Kontrollhybridisierungsmuster werden dann verglichen. Gene,
die wesentlich für
das Wachstum des ausgewählten
Organismus sind, werden durch Bestimmung von Unterschieden in den
vordefinierten Regionen der Gitter zwischen dem Testhybridisierungsmuster
und dem Kontrollhybridisierungsmuster, die unter dem ausgewählten Satz
definierter Bedingungen kultiviert wurden, identifiziert.
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Alternativ
werden zusätzliche
Testkulturen, die den mutagenisierten ausgewählten Organismus umfassen,
und Kontrollkulturen, die den nicht-mutagenisierten ausgewählten Organismus
umfassen, unter unterschiedlichen Sätzen definierter Bedingungen
in vitro und in vivo kultiviert. Hybridisierungsmuster für markierte Polynukleotidsonden,
hergestellt aus DNA der zusätzlichen
Testkulturen und RNA der zusätzlichen
Kontroll kulturen, werden dann gemäß den hier beschriebenen Verfahren
erzeugt. Gene, die wesentlich für
das Wachstum des Organismus sind, werden dann durch Vergleichen
der Hybridisierungsmuster der Test- und Kontrollkulturen für jeden
Satz definierter Bedingungen miteinander identifiziert. In einer
Ausführungsform
werden die Gene, die wesentlich für das Wachstum des Organismus
sind, diejenigen sein, die allen Hybridisierungsmustern für alle Zellen
gemeinsam sind. In einer anderen Ausführungsform werden Gene, die
wesentlich für
das Wachstum eines ausgewählten
Organismus sind, unter einem Satz von Wachstumsbedingungen hybridisieren und
werden unter einem unterschiedlichen Satz von Wachstumsbedingungen
nicht hybridisieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann eine Ansammlung konditional letaler Mutanten des Organismus
erzeugt und mit einer zweiten (genomischen) Bibliothek transformiert
werden, die in einem Transposon/Integrationsbasierten Vektor konstruiert
wurde. Transformanten werden erneut unter den ursprünglichen
konditional letalen Bedingungen selektiert und die geretteten, überlebenden
Isolate für
die Sondenerzeugung und Hybridisierungsanalyse wie oben beschrieben
verwendet. Zum Beispiel wird eine temperaturempfindliche (ts) mutierte
Bibliothek gemäß Standardverfahren
hergestellt und unter permissiven gegenüber nicht-permissiven Bedingungen
zur Identifizierung von konditional letalen Mutanten durchmustert.
Die identifizierten konditional letalen ts-Mutanten werden vereinigt
und mit einer zweiten genomischen Bibliothek transformiert, die
in einem Transposon/Integrations-basierten Vektor konstruiert wurde,
der sowohl ein konditionales als auch ein selektierbares Markersystem
enthält.
Beispiele für
Vektoren für
diese zweite Bibliothek schließen
ohne Beschränkung
pMAK705 (Bloomfield et al., Mol. Microbiol. 1991, 5:1447-1457) und
pG+host5 (Biswas et al., J. Bacteriol. 1993, 175:3628-3635) ein.
Die resultierenden Transformanten werden erneut getestet oder unter
der ursprünglichen
Temperaturselektion für
Letalität/Wesentlichkeit
kultiviert. Überlebende
stellen Isolate dar, die integrierten Vektor plus komplementierende
genomische Sequenzen enthalten. DNA aus diesen Überlebenden wird dann isoliert,
und Sonden werden wie in den vorhergehenden Absätzen beschrieben erzeugt, wobei
hybridisierende Klone wesentliche Gene von Interesse identifizieren.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
wird eine konditional letale mutierte Bibliothek gemäß Standardverfahren
hergestellt, in einem Expressionsvektor konstruiert und mit einer
selektierbaren genomischen Bibliothek transformiert. Die genomische
Bibliothek wird unter Standard techniken der Molekularbiologie konstruiert,
so daß die
Expression der inserierten genomischen DNA unter der Kontrolle von
im Vektor befindlichen Promotorsequenzen steht, und enthält bevorzugt
selektierbare und konditionale Marker. Beispiele für Vektoren,
die induzierbare Promotorsysteme enthalten, schließen ohne
Beschränkung
pFL10 (Lopez de Felipe et al., FEMS Microbiol. Lett. 1994, 122:
289-295) und pUB110 (E. Zyprian und H. Matzura, DNA 1986, 5:219-225) ein.
In dieser Ausführungsform
werden temperaturempfindliche letale Mutanten unter temperaturempfindlicher Selektion
und unter Induktionsbedingungen für die im Vektor befindlichen
Promotorsequenzen durchmustert. Überlebende
Isolate stellen Klone dar, in denen die Transkription des exogenen
Plasmidinserts den mutierten Phänotyp
komplementiert. Sonden werden gegen die Plasmidinserte erzeugt und
gegen die Gitter hybridisiert.
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Die
Wesentlichkeit des Gens für
den Organismus wird durch Inaktivieren des identifizierten Gens
im ausgewählten
Organismus bestätigt,
bevorzugt unter Verwendung eines Einzelgen-Unterbrechungsverfahrens,
wie zum Beispiel mit einem Knock-Out-Experiment, und durch Kultivieren
des ausgewählten
Organismus unter den gleichen definierten Bedingungen.
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Durch
die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierte Klone können direkt
zur Sequenzanalyse und für
Knock-Out-Experimente zur Bestätigung
ihrer Wesentlichkeit für
das Wachstum des Organismus verwendet werden. Alternativ kann eine
Gensequenz aus dem identifizierten Klon in einen geeigneten Vektor
für Knock-Out-Experimente
subkloniert werden, wie es üblich
auf diesem Gebiet ist. Die Sequenzanalyse wird unter Verwendung
von Standardmethodiken durchgeführt,
die den Fachleuten wohlbekannt sind. Die anfängliche Sequenzierung kann
unter Verwendung von universellen Vorwärts- und universellen reversen
Sequenzierungsprimern M13 durchgeführt werden, die den multiplen
Klonierungsort des Vektors flankieren. Die resultierenden Sequenzen
werden unter Verwendung von herkömmlichen
Computerprogrammen analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden
in der Bestimmung der potentiellen Brauchbarkeit der individuellen
Klone als antimikrobielle Ziele verwendet.
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Für Knock-Out-Experimente
wird Plasmid-DNA aus den identifizierten Isolaten gereinigt und
in einem nicht-mutagenisierten Organismus unter Verwendung von Standardtechniken
der Molekularbiologie transformiert. Die transformierten Zellen
werden unter Antibiotikaselektion für die Vektorsequenz kultiviert. Überlebende
Zellen stellen ortsspezifische Insertionsereignisse in Gene dar,
die nicht wesentlich für
das Wachstum sind, da der Knock-Out eines wesentlichen Gens zu keinen
lebensfähigen
Transformanten führen
würden.
DNA wird aus den überlebenden
Zellen isoliert und als Matrize zur Erzeugung von Sonden gemäß den zuvor
beschriebenen Verfahren verwendet, und die Gitter werden erneut
zur Analyse sondiert. Zusätzliche Gen-Knock-Out-Experimente
können
gemäß den Verfahren
durchgeführt
werden, die zum Beispiel beschrieben werden von Guiterrez et al.,
J. Bacterol. 1996, 178:4166-4175. Gen-Knock-Out-Experimente stellen
somit Informationen über
die Wirkung der völligen
Abwesenheit des Genprodukts bereit.
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B. Andere Verfahren der
Erfindung
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Wie
es einem Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung offensichtlich sein
wird, können
die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung auch für andere ähnliche
Zwecke verwendet werden. Zum Beispiel kann dieses Verfahren in einer
Ausführungsform
zur Überwachung
der Wirkung von potentiellen Wirkstoffen auf die wesentliche Genexpression
sowohl in Labors als auch während
klinischer Versuche mit Tieren, speziell Menschen, verwendet werden.
Weil das Verfahren leicht durch Veränderung der Kulturbedingungen
oder des Stadiums, in dem die Zellen geerntet werden, angepaßt werden
kann, kann es im wesentlichen eingesetzt werden, um wesentliche
Gene jedes Organismus, in jedem Entwicklungsstadium und unter dem
Einfluß jedes Faktors
eingesetzt werden, der die Genexpression beeinflussen kann.
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IV. Die identifizierten
Gene und Proteine
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Die
Anwendung der Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung wie
oben beschrieben stellt auch andere Zusammensetzungen bereit, wie
zum Beispiel jede isolierte Gensequenz, die wesentlich für das Wachstum
eines Organismus ist. Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung
ist jede isolierte Pathogen-Gensequenz, die als wesentlich für das Überleben
des Pathogens in einem Wirt festgestellt wird. In einer ähnlichen
Weise ist eine Ausführungsform
der Erfindung jede Gensequenz, die durch die hier beschriebenen Verfahren
identifiziert wird.
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Diese
Gensequenzen können
in herkömmlichen
Verfahren zur Erzeugung von dadurch codierten isolierten Proteinen
eingesetzt werden. Zur Erzeugung eines Proteins dieser Erfindung
werden die DNA-Sequenzen eines gewünschten Gens der Erfindung
oder Teile davon, die durch Verwendung der Verfahren dieser Erfindung
identifiziert wurden, in ein geeignetes Expressionssystem inseriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein rekombinantes Molekül
oder ein Vektor konstruiert, in dem die Polynukleotidsequenz, die
das Protein codiert, funktionsfähig
mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verbunden ist,
die die Expression des humanen Proteins erlaubt. Zahlreiche Typen
geeigneter Expressionsvektoren und Wirtszellsysteme sind fachbekannt
für die
Säuger-
(einschließlich
humane), Insekten-, Hefe-, pilzliche und bakterielle Expression.
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Die
Transfektion dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen, ob aus Säuger, Bakterium,
Pilz oder Insekt, oder in geeignete Viren führt zur Expression der ausgewählten Proteine.
Geeignete Wirtszellen, Zellinien zur Transfektion und Viren sowie
Verfahren zur Konstruktion und Transfektion solcher Wirtszellen
und Viren sind wohlbekannt. Geeignete Verfahren zur Transfektion,
Kultur, Amplifikation, Durchmusterung und Produkterzeugung und -reinigung
sind ebenfalls fachbekannt.
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In
einer Ausführungsform
können
die dadurch codierten wesentlichen Gene und Proteine, die durch diese
Erfindung identifiziert wurden, als diagnostische Zusammensetzungen
eingesetzt werden, die nützlich
in der Diagnose einer Krankheit oder Infektion durch herkömmliche
diagnostische Tests sind. Zum Beispiel kann ein diagnostisches Reagens
entwickelt werden, das detektierbar auf eine Gensequenz oder ein
Protein dieser Erfindung in einer biologischen Probe eines Tieres
abzielt. Ein solches Reagens kann eine komplementäre Nukleotidsequenz,
ein Antikörper
(monoklonal, rekombinant oder polyklonal) oder ein chemisch abgeleiteter
Agonist oder Antagonist sein. Alternativ können die wesentlichen Gene
dieser Erfindung und dadurch codierte Proteine, Fragmente davon
oder dazu komplementäre
Sequenzen selbst als diagnostische Reagentien verwendet werden.
Diese Reagentien können
gegebenenfalls markiert werden, zum Beispiel mit einem Radioisotop
oder einem kolorimetrischen Enzym. Die Auswahl eines geeigneten
diagnostischen Testformats und Detektionssystems ist im Können des
Fachmanns, und es kann leicht ausgewählt werden, ohne zusätzlicher
Erläuterung durch
Rückgriff
auf das Fachwissen auf dem diagnostischen Gebiet zu bedürfen.
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Zusätzlich können gemäß dieser
Erfindung identifizierte Gene und Proteine therapeutisch verwendet werden.
Zum Beispiel können
Gene, die als wesentlich gemäß diesem
Verfahren identifiziert wurden, und dadurch codierte Proteine als
Ziele zur Durchmusterung und Entwicklung von natürlichen oder synthetischen chemischen
Verbindungen dienen, die Nutzen als therapeutische Wirkstoffe zur
Behandlung von Krankheitszuständen
haben, die mit dem Organismus assoziiert sind. Zum Beispiel kann
eine Verbindung, die an ein Protein binden kann, das durch ein wesentliches
Gen codiert wird, wodurch seine biologische Aktivität verhindert wird,
nützlich
als Wirkstoffkomponente sein, die Krankheiten oder Störungen vorbeugt,
die aus dem Wachstum eines besonderen Organismus resultieren. Alternativ
wird angenommen, daß Verbindungen,
die die Expression eines wesentlichen Gens inhibieren, auch therapeutisch
nützlich
sind. Zusätzlich
können
Verbindungen, die die Expression von Genen steigern, die wesentlich
für das
Wachstum eines Organismus sind, auch verwendet werden, um das Wachstum
eines besonderen Organismus zu fördern.
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Herkömmliche
Tests und Techniken können
zur Durchmusterung und Entwicklung solcher Wirkstoffe verwendet
werden. Zum Beispiel kann ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen,
die spezifisch an Proteine binden oder diese inhibieren, die durch
diese Gensequenzen codiert werden, einfach die Schritte des Inkontaktbringens
eines ausgewählten
Proteins oder Genprodukts mit einer Testverbindung, um die Bindung der
Testverbindung an das Protein zu erlauben; und die Bestimmung der
Menge an Testverbindung, falls überhaupt,
die an das Protein gebunden wird, einschließen. Ein solches Verfahren
kann die Inkubation der Testverbindung und des auf einem festen
Träger
immobilisierten Proteins beinhalten. Weitere andere herkömmliche
Verfahren zur Wirkstoffdurchmusterung können den Einsatz eines geeigneten
Computerprogramms zur Bestimmung von Verbindungen mit ähnlicher
oder komplementärer
Struktur zu derjenigen des Genprodukts oder von Teilen davon und
das Durchmustern dieser Verbindungen auf kompetitive Bindung an
das Protein beinhalten. Identifizierte Verbindungen können in
einer geeigneten therapeutischen Formulierung aufgenommen werden,
allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen. Verfahren zum
Formulieren von therapeutischen Zusammensetzungen sowie geeignete
pharmazeutische Träger
und dgl. sind den Fachleuten wohlbekannt.
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Entsprechend
wird angenommen, daß die
vorliegende Erfindung durch die Verwendung solcher Verfahren Verbindung
bereitstellt, die mit diesen Genen oder codierten Proteinen oder
Fragmenten davon Wechselwirken können
und die biologische Aktivität
nach Wunsch entweder steigern oder verringern. Daher sind diese
Verbindungen auch von dieser Erfindung umfaßt.
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Zahlreiche
Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in
der oben angegebenen Beschreibung eingeschlossen, und es wird erwartet,
daß sie
naheliegend für
einen Fachmann sind. Es wird angenommen, daß solche Modifikationen und
Veränderungen
an den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung
vom Umfang der anhängenden
Ansprüche
umfaßt
sind. SEQUENZPROTOKOLL
