DE69034197T2

DE69034197T2 - Genomische Klonierung und Kartographie

Info

Publication number: DE69034197T2
Application number: DE69034197T
Authority: DE
Inventors: Harvey I. Pleasant Hill Miller
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-03-03
Filing date: 1990-02-15
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2010-02-16
Also published as: WO1990010064A1; ATE298795T1; DE69011101D1; EP0461155B1; DK0461155T3; JP3030417B2; JPH04503752A; ES2058893T3; DE69034197D1; EP0593095A1; DK0593095T3; EP0593095B1; EP0461155A1; DE69011101T2; ATE109204T1

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der Europäischen Anmeldung Nr. 90904029.7, die hierin als die Stammanmeldung bezeichnet wird.
Das Gebiet dieser Erfindung ist die In-vitro-Amplifikation von Nucleinsäuren. Insbesondere betrifft diese Erfindung neue Verfahren zum Klonieren und Replizieren von Nucleinsäuren im Laufe des Sequenzierens und physischen Kartierens. Die Erfindung betrifft auch wirksame Verfahren zum physischen Kartieren von hochkomplexen und langen Genomen.
Die Fähigkeit, genomische DNA zu kartieren und zu sequenzieren, hat wichtige Anwendungsbereiche auf dem Gebiet biologischer und medizinischer Wissenschaften. Die Lokalisierung von menschlichen Genen, die für seltene Erkrankungen verantwortlich sind, ist ein wichtiger Ausgangspunkt für Genisolation und Genklonierung sowie die Identifikation relevanter Genprodukte und -mutationen, was schließlich zu einem besseren Verständnis der molekularen Basis einer Erkrankung führt. Durch Identifizieren der Gene oder Regionen menschlicher chromosomaler DNA, die in genetisch vererbliche Formen von Krebs, Alzheimer-Krankheit und anderen Erkrankungen eingebunden sind, können neue Diagnose- und Behandlungsverfahren entwickelt werden.
Kartieren eines Genoms bezieht sich auf das genaue Festlegen der Anordnung von Genen und anderen Eigenschaften von Interesse an bestimmten Chromosomen. Sequenzieren bezieht sich auf das Bestimmen der Anordnung von Nucleotiden auf den Chromosomen. Die zwei Hauptarten an Genomkarten sind Karten genetischer Bindung und physische Karten. Genetische Bindungskarten werden im Allgemeinen durch Untersuchen der Häufigkeit, mit der zwei verschiedene Züge gemeinsam vererbt werden oder aneinander gebunden sind, erstellt. Physische Karten werden hauptsächlich von chemischen Messungen abgeleitet, die an DNA-Molekülen angestellt werden, die das Genom umfassen. Demgemäß können physische Karten mehrere verschiedene Arten aufweisen und umfassen Restriktionskarten sowie Karten mit geringerer Auflösung, die durch In-situ-Hybridisierung erhalten werden. Alle diese Karten teilen ein gemeinsames Ziel: Informationen über Gene gemäß ihren relativen Positionen entlang eines Chromosoms in eine systematische lineare Anordnung zu bringen.
Restriktionskarten basieren auf Stellen in DNA, die durch spezielle, als Restriktionsenzyme bezeichnete Proteine geschnitten werden. Jedes Enzym erkennt eine spezifische kurze Sequenz von Nucleotiden, bezeichnet als "Erkennungssequenz", und schneidet jeden Strang der DNA an einem bestimmten Punkt, der als "Spaltungsstelle" oder "Restriktionsstelle" bezeichnet wird und innerhalb der Erkrennungssequenz oder in einem bestimmten Abstand von ihr entfernt liegt. Da zahlreiche verschiedene Nucleotidsequenzen durch das eine oder andere Restriktionsenzym erkannt werden und diese Sequenzen im Allgemeinen nach dem Zufallsprinzip über ein Genom verstreut sind, kann durch präzises Bestimmen der relativen Anordnungen verschiedener Restriktionsstellen eine physische Karte konstruiert werden.
Das Genom der Bakterie E. coli umfasst etwa 4,7 Millionen Basenpaare. Das kleinste menschliche Chromosom weist die zehnfache Größe auf, wobei das komplette (haploide) menschliche Genom etwa 3 Milliarden Basenpaare umfasst. Aufgrund der großen Größe der meisten Genome sind die Restriktionsenzyme, die zum Restriktionskartieren von besonders großem Wert sind, jene, die Erkennungsstellen aufweisen, die relativ selten auftreten oder die sonst über das Genom hinweg durch große Abstände voneinander getrennt sind, sodass das Genom in relativ große DNA-Fragmente geschnitten werden kann, die vorzugsweise 100.000 bis 2 Millionen oder mehr Basenpaare lang sind. Die Fragmente von DNA, die bei Verdau eines DNA-Substrats mit einem Restriktionsenzym produziert werden, werden als "Restriktionsfragmente" bezeichnet. Im Allgemeinen ist es umso leichter, sie korrekt in einer physischen Karte zu ordnen, je geringer die Anzahl an gebildeten genomischen Restriktionsfragmenten ist.
Das größte Genom, das mit Restriktionsenzymen kartiert wurde, die DNA wenig häufig spaltet, ist das einzige Chromosom von E. coli. Smith et al., Science 236, 1448–1453 (1987). Der in diesem Fall verwendete Ansatz war, intakte chromosomale E.-coli-DNA mit dem Restriktionsenzym Notl zu verdauen, das innerhalb einer acht Nuc leotide langen Erkennungssequenz schneidet, wodurch DNA-Fragmente im Bereich von 15.000 Basenpaaren bis zu 1 Million Basenpaaren produziert wurden. Der Großteil der erforderlichen Information, um die DNA-Restriktionsfragmente zu ordnen, stammte aus Hybridisierungsstudien unter Verwendung von markierten Sonden, die E.-coli-Genen entsprachen, welche davor kloniert und charakterisiert worden waren.
Somit bindet der erste Schritt hin zum Konstruieren einer physischen Karte eines Genoms im Allgemeinen das Isolieren und Klonieren einzelner genomischer DNA-Fragmente ein. Theoretisch ermöglichen empfindliche DNA-Sonden-Technologien, physische Karten zu erstellen und dabei nur einen geringen Bruchteil des Genoms, das kartiert wird, zu klonieren. In der Praxis ist solch ein Ansatz jedoch nur für die gröbsten Ausführungen physischen Kartierens geeignet. Bei höheren Auflösungen wird physisches Kartieren meistens durch Analysieren einer Sammlung sich überlappender DNA-Klone durchgeführt, die das gesamte Genom abdecken. Physisches Kartieren würde das Ordnen der einzelnen DNA-Klone gemäß ihren Positionen im ursprünglichen Genom einbinden. Die einzelnen Klone sind besonders nützlich, da sie eine unerschöpfliche Quelle der DNA aus jeder genomischen Region bereitstellen. Dass man eine Sammlung an genomischen DNA-Klonen zur Verfügung hat, ist auch eine grundlegende Bedingung, um die Nucleotidsequenz des Genoms zu bestimmen, da die Klone die tatsächlichen DNA-Fragmente bereitstellen, die gereinigt und zum Sequenzieren vorbereitet werden.
Die prinzipielle Einschränkung bei der Konstruktion einer hoch aufgelösten physischen Karte eines Genoms aus einer geordneten Sammlung von DNA-Klonen ist der zentrale Fehler vorhandener Verfahren zur Bereitstellung eines Mittels zum Klonieren sehr großer DNA-Fragmente. Bei der Verwendung von herkömmlichen DNA-Rekombinationsverfahren liegt beispielsweise die Größe des größten DNA-Fragments, das durch Klonieren in einer bakteriellen Wirtszelle vermehrt werden kann, bei etwa 50.000 Basenpaaren oder weniger. Dieses Resultat wird typischerweise durch Spleißen des DNA-Fragments in ein Cosmid erreicht, d.h. in einen modifizierten Bakteriophagen-λ-Vektor, der spezifisch entworfen ist, um DNA-Inserts im Bereich von 40.000 bis 50.000 Basenpaaren Länge zu beherbergen.
Es gibt zwei wesentliche Nachteile an diesem Cosmid-Kloniersystem zur Erstellung einer physischen Karte eines Genoms. Erstens müssen sehr viele Cosmidklone konstruiert werden, um ein vollständiges Set von sich gegenseitig überlappenden DNA-Fragmenten des gesamten Genoms zu bilden. Im Fall des haploiden menschlichen Genoms beispielsweise wurde geschätzt, dass für eine hoch auflösende physische Karte zwischen 75.000 und 375.000 verschiedener Cosmidklone erforderlich sein würden. Pines, "Mapping the Human" (Howard Hughes Medical Institute, Bethesda, MD (1987)). Zweitens sind Cosmidklone dafür bekannt, dass sie häufig Deletionen akkumulieren, was möglicherweise von der Selektion einer kürzeren Größe zur rascheren Replikation und/oder von Unausgeglichenheiten im Metabolismus, verursacht durch die gesteigerte Dosierung eines bestimmten Gens am Cosmid, das das Wachstum der bakteriellen Wirtszellen beeinflusst, herrührt. Daher sind Cosmidklone, insbesondere jene, die wesentliche Gene enthalten, üblicherweise schwierig zu erhalten.
Erst jüngst wurde ein Verfahren zum Klonieren großer Fragmente exogener DNA in Hefe mittels künstlicher Chromosomenvektoren beschrieben. Burke et al., Science 236, 806–812 (1987). Die Verwendung dieses "künstliche Hefechromosom"- (YAC, yeast artificial chromosome) Kloniersystems bietet darin einen signifikanten Vorteil gegenüber dem Cosmid-Kloniersystem, nämlich dass genomische DNA-Fragmente, die im Bereich bis zu mehreren hunderttausend Basenpaaren liegen, erfolgreich vermehrt werden können. Es gibt jedoch für die Verwendung des YAC-Kloniersystems einige Einschränkungen, insbesondere dann, wenn es zur Genomkartierung eingesetzt wird. Beispielsweise sind bei YAC-Klonieren sowohl die Anzahl an klonierten Molekülen pro Hefezelle als auch die Anzahl an Hefezellen pro Kolonie sehr viel geringer als bei Cosmid-Klonieren in Bakterien, wodurch die Mengen an klonierter DNA, die dann zur Analyse vorhanden ist, eingeschränkt werden. Darüber hinaus können, wie auch bei jedem In-vivo-Klonierverfahren, die in YAC-Vektoren klonierten DNA-Fragmente Neuanordnungen oder Deletionen in der Wirtszelle erfahren, die es schwierig machen können, eine Serie an Klonen zu erhalten, die das gesamte Genom darstellen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zum wirksamen Klonieren großer Fragmente genomischer DNA bereitzustellen, das die Probleme umgeht, die die bestehenden In-vivo-Klonierverfahren mit sich bringen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Amplifikation einer erwünschten Nucleinsäuresequenz, wie z.B. jener, die in einem klonierten genomischen DNA-Fragment vorhanden ist, bereitzustellen und dadurch ausreichende Mengen an Sequenz zur physikalischen oder chemischen Analyse herzustellen. Die Möglichkeit, dieses Verfahren in vitro durchzuführen, macht es im Allgemeinen zum Amplifizieren von Nucleinsäuren aus jeder beliebigen Quelle nützlich, ohne mit den Problemen von Selektivität, Neuanordnungen und Deletionen konfrontiert zu sein, die aus der Vermehrung einer exogenen Nucleinsäuresequenz in einer Wirtszelle resultieren können. Zugleich ist das Verfahren durch die Fähigkeit, Nucleinsäuresequenzen in einem Bereich von bis zu mehreren hunderttausend Basenpaaren oder mehr effizient zu amplifizieren, für Anwendungen wie das Konstruieren einer hoch auflösenden physischen Karte eines komplexen Genoms oder das Isolieren von intakten, medizinisch oder biologisch wichtigen Genen oder Genclustern ideal geeignet.
Die 1a–1b (hiernach als 1 bezeichnet) zeigen 64 Oligonucleotidlinker mit Sequenzen mit kohäsiven Enden, die komplementär zu jedem der möglichen kohäsiven Enden der Restriktionsfragmente sind, die aus dem Verdau eines genomischen DNA-Substrats mit der Restriktions-Endonuclease Sfi I resultieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zum Klonieren genomischer DNA und zum Kartieren genomischer DNA-Restriktionsfragmente. Diese Verfahren können in Verbindung mit oder unabhängig von dem Verfahren zur DNA-Amplifikation verwendet werden, das in der Stammanmeldung beschrieben wird und das die Synthese neuer replizierbarer DNAs, die einen Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung und genomische DNA, die heterolog zu phi29 ist, umfassen, erfordert.
Das Verfahren zum Klonieren genomischer DNA umfasst die folgenden Schritte:

(a) Verdauen genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym, das mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden erzeugt;
(b) Kontaktieren der verdauten genomischen DNA mit einem Linker, wobei der Linker eine Reporternucleotidsequenz und eine Sequenz mit kohäsivem Ende umfasst, die komplementär zu einer Sequenz mit kohäsivem Ende ist, die durch das Restriktionsenzym in Schritt (a) erzeugt wurde, unter Bedingungen, unter denen ein Linker an ein Restriktionsfragment von genomischer DNA gebunden wird; und
(c) Amplifizieren des Produkts aus Schritt (b).

Das Verfahren zum Kartieren genomischer DNA-Restriktionsfragmente umfasst die folgenden Schritte:

(a) Verdauen von genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym, das mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden erzeugt;
(b) Amplifizieren der Restriktionsfragmentprodukte aus Schritt (a);
(c) Bestimmen der Sequenz des kohäsiven Endes der einzelnen Restriktionsfragmente; und in Übereinstimmung damit
(d) vergleichendes Anordnen der Restriktionsfragmente in einer physischen Karte.

Das Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz, beschrieben und beansprucht in der Stammanmeldung, das mit den Verfahren der vorliegenden Anmeldung verwendet werden kann, umfasst die folgenden Schritte:

(a) Synthetisieren einer doppelsträngigen Nucleinsäure, eines Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprungs und einer Nucleotidsequenz, die zu phi29 heterolog ist; und
(b) Synthetisieren von DNA aus dieser doppelsträngigen Nucleinsäure unter der Steuerung des Replikationsursprungs.

Die Vorteile, die im Vergleich mit den auf dem Gebiet der Erfindung bereits bekannten Verfahren unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Klonieren von genomischer DNA und zum Kartieren genomischer DNA-Restriktionsfragmente erzielt werden, sind, dass die vorliegende Erfindung das Klonieren und Kartieren von genomischer DNA von praktisch jeder Länge ermöglicht, ohne auf die mühsamen und fehleranfälligen Schritte des Insertierens der genomischen DNA in spezialisierte Vektoren und des Replizierens dieser in vivo zurückgreifen zu müssen und ohne die Nucleotidsequenz oder die genetische Organisation irgendeines Teils der genomischen DNA vorher kennen zu müssen.
Der Vorteil, der durch das Verfahren zur Amplifikation einer heterologen DNA unter der Steuerung eines Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprungs gewonnen wird, ist, dass die In-vitro-Synthese von DNA-Produkten in Gegenwart von phi29-DNA-Polymerase und Desoxyribonucleosidtriphosphaten kontinuierlich stattfindet, wobei als eine Matrize DNA von bis zu 100.000 Basenpaaren oder mehr in der Länge verwendet werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung vermeidet daher die zahlreichen, sehr genauen Primerhybridisierungsreaktionen, die das Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Verfahren von Mullis et al., US-Patent Nr. 4.683.195, erfordert, das auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt ist, sowie die mit dem PCR-Verfahren einhergehenden Einschränkungen, wenn es zur Amplifikation von längeren DNA-Substraten eingesetzt wird.
Die Bezeichnung "genomische DNA" wie hierin verwendet bezieht sich auf jede beliebige DNA, die eine Sequenz umfasst, die normalerweise im Genom einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle oder eines Virus vorhanden ist. Die genomische DNA einer eukaryotischen Zelle umfasst beispielsweise nukleare und extranukleare chromosomale DNA, wie jene, die in Mitochondrien und Chloroplasten vorhanden ist. Unter die Bezeichnung "genomische DNA" fällt auch cDNA, die aus einer Messenger-RNA oder aus dem RNA-Genom eines Virus gewonnen wurde. Verfahren zur Extraktion und/oder Reinigung von genomischen DNA wurden beispielsweise von Gross-Bellard et al., Eur. J. Biochem. 36, 32–38 (1978); Smith et al., Meth. Enzymol. 151, 461–489 (1987); und Moon et al., Nuc. Acids Res. 15, 611–630 (1987), beschrieben. Verfahren zur Herstellung von cDNA sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).
Die Bestimmung "heterolog", wie hierin in Bezug auf eine Nucleinsäuresequenz verwendet, bezeichnet eine Nucleinsäuresequenz, die üblicherweise nicht unter der Steuerung eines Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprungs repliziert wird. Typischerweise umfasst die heterologe Nucleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz, die im nuklearen oder extranuklearen Genom eines prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus vorhanden ist, oder das Genom eines Virus, das nicht Bakteriophage phi29 ist. Die heterologe Nucleinsäuresequenz kann durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, wie z.B. mittels Gewinnung aus einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure unter Verwendung eines Restriktionsenzyms oder mittels In-vitro-Synthese, einschließlich beispielsweise der Synthese einer komplementären DNA (cDNA) aus einer RNA.
Die Bezeichnung "Reportersequenz" wie hierin verwendet bezieht sich auf jede beliebige Nucleinsäuresequenz, durch die es möglich ist, entweder direkt oder indirekt ein anderes Nucleinsäuremolekül zu identifizieren, mit dem die Reportersequenz assoziiert ist. Die Reportersequenz kann eine definierte Sequenz oder eine definierte Funktion oder beides aufweisen. Umfasst beispielsweise die Reportersequenz eine definierte Nucleotidsequenz, so kann das Nucleinsäuremolekül, mit dem sie assoziiert ist, durch ein Hybridisierungsverfahren identifiziert werden, worin die Reportersequenz mit einer komplementären Nucleinsäure hybridisiert, die an einem festen Träger immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann mittels jeglichen geeigneten Verfahrens durchgeführt werden, einschließlich jener, die von Choutelle et al., Gene 3, 113–122 (1978), und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 221 308 (Carrico) beschrieben sind. Alternativ dazu kann die Reportersequenz auch durch ihre Funktion nachgewiesen werden, wobei ihre Sequenz bekannt sein kann oder nicht. Beispiele umfassen das Gen eines nachweisbaren Phänotyps oder vorzugsweise einen Replikationsursprung oder einen Promotor. Umfasst die Reportersequenz beispielsweise einen Replikationsursprung oder einen Promotor, so wird das Nucleinsäuremolekül, mit dem die Reportersequenz assoziiert ist, auf Grundlage seiner Replikation oder Transkription unter der Steuerung der Reportersequenz leicht identifiziert.
Die Bezeichnung "kohäsives Ende" wie hierin in Bezug auf Linker und Restriktionsfragmente verwendet bezieht sich auf eine einzelsträngige Extension am Ende eines doppelsträngigen Nucleinsäuremoleküls, das sich über die Region von Basenpaarung zwischen den komplementären Strängen hinaus erstreckt. Solche einzelsträngigen Extensionen werden als kohäsive Enden benannt, da sie in der Lage sind, mit einer anderen Sequenz durch Basenpaaren von komplementären Nucleotiden zu hybridisieren, wodurch das intramolekulare oder intermolekulare Verbinden von Nucleinsäuren erleichtert wird. Die Nucleotidsequenz der einzelsträngigen Extension wird als "Sequenz mit kohäsivem Ende" bezeichnet. Restriktionsfragmente mit kohäsiven Enden werden vorzugsweise durch Verdau von doppelsträngigen DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym, wie beispielsweise jenen, die nachstehend offenbart werden, erhalten. Linker mit kohäsiven Enden können mittels desselben Verfahrens gewonnen werden oder können synthetisch produziert werden, wie beispielsweise durch Anellieren einzelsträngiger Oligonucleotide.
Die Bezeichnung "Oligonucleotid" wie hierin in Bezug auf Linker und Primer verwendet ist als ein Nucleinsäuremolekül definiert, das aus zwei oder mehr Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden besteht. Ein erwünschtes Oligonucleotid kann durch jedes geeignete Verfahren, wie z.B. durch Reinigung aus einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure oder durch De-novo-Synthese, hergestellt werden. Mehrere Verfahren wurden bereits in der Literatur beschrieben, z.B. für die Synthese von Oligonucleotiden mit definierter Sequenz unter Verwendung verschiedener Verfahren der organischen Chemie. Narrang et al., Meth. Enzymol. 68, 90–109 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154, 287 (1985); Froehler et al., Nuc. Acids Res. 14, 5399–5407 (1986). Oligonucleotide, die durch ein beliebiges Verfahren hergestellt werden, können in weiterer Folge durch Ligation oder auch anders miteinander verbunden werden, um ein einzelnes Oligonucleotid mit jeder beliebigen erforderlichen Länge und Sequenz zu bilden.
Die Bezeichnung "Linker" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Oligonucleotid, unabhängig davon ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, das doppelsträngige DNA umfasst.
Die Bezeichnung "Primer" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Oligonucleotid, unabhängig davon ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, das zu einer ganzen zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz oder zu einem Teil davon im Wesentlichen komplementär oder homolog ist. Der Primer muss ausreichend lang sein, um mit einer Matrizen-Nucleinsäure zu hybridisieren, die die zu amplifizierende Sequenz umfasst, und um die Synthese eines Extensionsprodukts in Gegenwart eines Polymerisationsmittels zu primen. Typischerweise enthält der Primer 15–30 oder mehr Nucleotide, obwohl er auch weniger Nucleotide enthalten kann. Es ist jedoch nicht erforderlich, dass der Primer die exakte Sequenz der zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz oder ihres Komplements widerspiegelt. Beispielsweise können nicht-komplementäre Basen in den Primer eingefügt werden, oder komplementäre Basen können aus dem Primer deletiert werden, vorausgesetzt, dass der Primer in der Lage ist, mit der zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz oder mit ihrem Komplement unter den ausgewählten Bedingungen zu hybridisieren.
Die Bezeichnung "Ursprungsprimer" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Oligonucleotid, unabhängig davon ob von natürlichem oder synthetischem Ursprung, der einen Replikationsursprung, wie noch hierin definiert wird, gebunden an das 5'-Ende eines Primers, umfasst. Unter geeigneten Bedingungen und in Gegenwart eines Polymerisationsmittels ist der Ursprungsprimer in der Lage, als ein Startpunkt eines Ursprungsprimer-Extensionsprodukts zu wirken, das die zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz oder ihre komplementäre Sequenz sowie den Replikationsursprung des Ursprungsprimers umfasst.
Die Bezeichnung "Sekundärprimer" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Oligonucleotid, unabhängig davon ob von natürlichem oder synthetischem Ursprung, das unter geeigneten Bedingungen und in Gegenwart eines Polymerisationsmittels in der Lage ist, als ein Startpunkt für ein Sekundärprimer-Extensionsprodukt, das die zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz oder ihre komplementäre Sequenz umfasst, zu wirken.
Die Bezeichnung "Extensionsprodukt" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, dessen Synthese am 3'-OH-Terminus eines Primers initiiert wird, wobei eine Matrize zur Synthese des Nucleinsäuremoleküls, an das der Primer hybridisiert wird, eingesetzt wird.
Die Bezeichnung "Polymerisationsmittel" wie hierin verwendet soll sich auf jedes beliebige Enzym beziehen, das unter Verwendung einer bestehenden Nucleinsäure als eine Matrize die Synthese eines Nucleinsäuremoleküls aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden katalysiert. Beispiele für solche Enzyme umfassen DNA-Polymerase, RNA-Polymerase und reverse Transkriptase.
In manchen ihrer Aspekte ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Klonieren genomischer DNA, das als Anfangsschritt das Verdauen genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym umfasst, das zahlreiche verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden erzeugt. Solche Enzyme sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen beispielsweise die Restriktionsenzyme Bgl I, BstX I, Hga I und Sfi I.
Die voraussagbare Spaltung von doppelsträngiger DNA durch ein Restriktionsenzym resultiert aus der Erkennung einer bestimmten Sequenz von Basenpaaren (Erkennungssequenz) im DNA-Substrat durch das Enzym. Für jedes einzelne Restriktionsenzym ist diese Spezifität charakteristisch und im Wesentlichen invariant bei DNAs. Die Erkennungssequenzen für die meisten Restriktionsenzyme bestehen aus einer spezifischen Sequenz von vier bis acht Basenpaaren oder mehr und können zusätzlich ein oder mehrere zufällig ausgewählte Basenpaare einbinden.
Zusätzlich zur Erkennungssequenz ist ein Restriktionsenzym auch durch die Stellen charakterisiert, an denen es Brüche in die Phosphodiesterbindungen von jedem Strang des DNA-Substrats (Spaltungsstellen) einführt, um einzelne Restriktionsfragmente zu bilden. Die Spaltungsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym kann innerhalb der Erkennungssequenz des Enzyms oder in einem bestimmten Abstand hiervon auftreten. Im Fall eines Restriktionsenzyms, das in der Lage ist, mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden zu bilden, umfasst die Sequenz, die die Spaltungsstellen unmittelbar umgibt, notwendigerweise ein oder mehrere, zufällig ausgewählte Basenpaare.
Beispielsweise umfasst die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym Sfi I eine spezifische Sequenz von vier Basenpaaren, die wie nachstehend gezeigt durch fünf zufällig ausgewählte Basenpaare aus einer spezifischen Sequenz von vier Basenpaaren voneinander getrennt sind:
worin N jedes beliebige der vier Nucleotide A (Adenin), T (Thymin), G (Guanin) oder C (Cytosin) sein kann. Sfi I führt innerhalb der Erkennungssequenz an den Stellen, die durch die senkrechten Pfeile bezeichnet sind, zu versetzten Spaltungen. Demgemäß endet jedes resultierende Sfil-Restriktionsfragment an einem oder an beiden Enden mit einem kohäsiven Ende mit der Struktur
5' ... GGCCNNNN 3'
3' ... CCGGN 5'
worin die Sequenz mit kohäsivem Ende, 5'-NNN-3', jede beliebige der 64 möglichen Trinucleotidsequenzen umfasst.
Im Allgemeinen, sofern die Substrat-DNA ein lineares Molekül ist, sind die Restriktionsfragmente, die aus Verdau der Substrat-DNA mit einem Restriktionsenzym resultieren, das mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden erzeugt, zwei Typen zuzuordnen: Restriktionsfragmenten, die eines der ursprünglichen Enden der linearen Substrat-DNA und ein durch das Restriktionsenzym gebildetes kohäsives Ende umfassen, und sogenannte "interne" Restriktionsfragmente, die zwei durch das Restriktionsenzym gebildete kohäsive Enden umfassen. Ist die Substrat-DNA ringförmig, so umfassen alle Restriktionsfragmente zwei durch das Restriktionsenzym gebildete kohäsive Enden.
Wie aus dieser Beschreibung deutlich hervorgeht, hängt sowohl die Anzahl der verschiedenen Restriktionsfragmente, die bei vollständigem Verdau der Substrat-DNA mit einem Restriktionsenzym entstehen, als auch die Anzahl der verschiedenen Sequenzen mit kohäsiven Enden, die für jene Restriktionsfragmente möglich sind, vom verwendeten Restriktionsenzym ab.
Die Anzahl der verschiedenen Restriktionsfragmente, die bei vollständigem Verdau der Substrat-DNA mit einem Restriktionsenzym gebildet werden, hängt wiederum von der Anzahl des Auftretens der Restriktionsenzym-Erkennungssequenz in der Substrat-DNA ab. Die Anzahl des Auftretens einer spezifischen Erkennungssequenz kann aus der Länge der Restriktionsenzym-Erkennungssequenz und der Größe der Substrat-DNA bestimmt werden. Angenommen, die DNA umfasst vier verschiedene Nucleotide, so wird die statistische Häufigkeit einer spezifischen Erkennungssequenz der Länge n Basenpaare durch die nachstehende Formel bestimmt:
Beispielsweise tritt eine Erkennungssequenz mit vier Basenpaaren erwartungsgemäß mit einer Häufigkeit von 1/256 auf, eine Erkennungssequenz mit fünf Basenpaaren erwartungsgemäß mit einer Häufigkeit von 1/1024, eine Erkennungssequenz mit sechs Basenpaaren erwartungsgemäß mit einer Häufigkeit von 1/4096 usw. Die erwartete Anzahl des Auftretens einer spezifischen Erkennungssequenz in der Substrat-DNA wird dann durch Multiplizieren der berechneten Erkennungssequenz-Häufigkeit mit der Größe der Substrat-DNA in Basenpaaren erhalten.
Die Anzahl verschiedener Sequenzen mit kohäsiven Enden, die unter den Restriktionsfragmenten möglich ist, die durch ein Restriktionsenzym erzeugt werden, das in der Lage ist, mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden zu produzieren, ist eine Funktion der Anzahl an erlaubten Nucleotidvariationen innerhalb der Sequenz mit kohäsivem Ende. Üblicherweise kann jedes der zufällig ausgewählten Nucleotide innerhalb der Sequenz mit kohäsivem Ende jedes beliebige der vier Nucleotide Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin sein, wobei die erwartete Anzahl an verschiedenen Sequenzen mit kohäsiven Enden gleich 4ⁿ beträgt, worin n für die An zahl an zufällig ausgewählten Nucleotiden innerhalb der Sequenz mit kohäsivem Ende steht.
Jedes beliebige Restriktionsenzym, das in der Lage ist, mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsivem Ende zu produzieren, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, obgleich die Auswahl eines Restriktionsenzyms in einer bestimmten Situation vorzugsweise auf Grundlage der Größe und Komplexität der Substrat-DNA erfolgt.
Im Allgemeinen ist es wünschenswert, dass die Erkennungssequenz des ausgewählten Restriktionsenzyms relativ selten in der Substrat-DNA auftritt, um die Anzahl an produzierten DNA-Restriktionsfragmenten zu reduzieren, die darauf folgender Manipulation und/oder Analyse unterzogen werden. In Kartierungsstudien von prokaryotischer oder eukaryotischer chromosomaler DNA beispielsweise ist üblicherweise ein Restriktionsenzym mit einer Erkennungssequenz von zumindest sechs Basenpaaren, vorzugsweise zumindest acht Basenpaaren, erforderlich, damit die resultierenden Restriktionsfragmente eine durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 10.000 Basenpaaren bis 100.000 Basenpaaren oder mehr aufweisen. Gegebenenfalls kann durch Einstellen der Bedingungen, unter denen die Substrat-DNA mit dem Restriktionsenzym kontaktiert wird (z.B. Reaktionsdauer oder -temperatur), die Anzahl an Restriktionsfragmentprodukten reduziert (und die mittlere Größe demnach gesteigert) werden, sodass das DNA-Substrat nur teilweise verdaut wird, wobei eine oder mehrere der Restriktionsenzym-Spaltungsstellen ungespaltet bleiben.
Zugleich ist es wünschenswert, dass das Restriktionsenzym in der Lage ist, Restriktionsfragmente der Substrat-DNA mit einer ausreichenden Anzahl an verschiedenen Sequenzen mit kohäsivem Ende zu produzieren. Im Allgemeinen gilt, dass, je größer die Anzahl an Sequenzen mit kohäsivem Ende ist, die durch das Restriktionsenzym gebildet werden, desto größer die Wahrscheinlichkeit ist, die resultierenden Restriktionsfragmente auf Grundlage ihrer Sequenzen mit kohäsivem Ende voneinander zu unterscheiden, und dass es wiederum desto einfacher ist, die einzelnen DNA-Restriktionsfragmente zu klonieren und/oder sie in einer physischen Karte anzuord nen. Zum Verdau von prokaryotischer oder eukaryotischer chromosomaler DNA beispielsweise ist das ausgewählte Restriktionsenzym üblicherweise eines, das in der Lage ist, zumindest 64 verschiedene Sequenzen mit kohäsivem Ende zu bilden und das einer Sequenz mit kohäsivem Ende entspricht, die mindestens drei zufällig ausgewählte Nucleotide umfasst.
Nach Verdauen von genomischer DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym umfasst das Verfahren zum Klonieren genomischer DNA als nächsten Schritt das Kontaktieren des/der resultierenden DNA-Restriktionsfragments(e) mit einem Oligonucleotid-Linker, der eine Reportersequenz und eine Sequenz mit kohäsivem Ende umfasst, die komplementär zu einer der mehreren verschiedenen Sequenzen mit kohäsivem Ende ist, die durch das Restriktionsenzym gebildet wurden.
Der Oligonucleotid-Linker und das/die DNA-Restriktionsfragmente) werden wünschenswerterweise zusammen unter solchen Bedingungen inkubiert, dass das kohäsive Ende des Oligonucleotid-Linkers spezifisch mit dem komplementären kohäsiven Ende eines Restriktionsfragmentes hybridisiert. Der Linker und ein DNA-Restriktionsfragment, mit dem er hybridisiert ist, werden dann kovalent unter Verwendung jedes beliebigen geeigneten Verfahrens verbunden, vorzugsweise mittels Ligation mit DNA-Ligase. Die Gegenwart der Reportersequenz liefert das Mittel zur Identifikation des resultierenden Produkts aus einem Gemisch an DNA-Restriktionsfragmenten und liefert vorzugsweise das Mittel zur Isolation und/oder selektiven Amplifikation des resultierenden Produkts.
Liefert der Verdau der genomischen DNA ein Gemisch verschiedener Restriktionsfragmente umfassend verschiedene Sequenzen mit kohäsivem Ende, so kann jedes unterschiedliche Restriktionsfragment des Gemisches leicht gemäß der vorliegenden Erfindung durch Kontaktieren des Gemisches mit einer Kombination von zwei oder mehr Linkern mit Sequenzen mit kohäsiven Enden, die komplementär zu jenen der verschiedenen Restriktionsfragmente sind, kloniert werden.
Da die Sequenzen mit kohäsivem Ende der verschiedenen Restriktionsfragmente des Gemisches üblicherweise nicht mit Bestimmtheit bekannt sind, ist es unter solchen Umständen wünschenswert, dass die Kombination von Linkern eine Bibliothek von Linkern umfasst, die Sequenzen mit kohäsivem Ende aufweisen, die komplementär zu im Wesentlichen jeder möglichen Sequenz mit kohäsivem Ende sind, die durch das bestimmte verwendete Restriktionsenzym produziert wurde. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass im Wesentlichen jedes Restriktionsfragment mit kohäsivem Ende mit einem Linker verbunden ist. Je nach Anzahl der verschiedenen Restriktionsfragmente, die aus dem Verdau der genomischen DNA resultieren, kann es weiters wünschenswert sein, dass einzelne Aliquoten des Gemisches separat mit jedem einzelnen Linker aus einer Bibliothek von Linkern in separaten Reaktionsgefäßen, wie z.B. den separaten Wells einer Mikrotiterplatte, kontaktiert wird, wobei vorzugsweise zwei oder mehr Linker verschiedene Sequenzen mit kohäsivem Ende umfassen. Auf diese Weise kann die Anzahl an verschiedenen Restriktionsfragmenten, die mit Linkern in jeder möglichen Reaktion verbunden werden, reduziert werden, wodurch wiederum der Bedarf an einem zusätzlichen Schritt zum Trennen eines jeden einzelnen Restriktionsfragmentes, eines vom anderen, vom anderen reduziert oder nichtig gemacht wird, um das Klonieren jedes einzelnen genomischen DNA-Restriktionsfragmentes zu erreichen.
Der letzte Schritt des Verfahrens zum Klonieren genomischen DNA ist die Amplifikation eines genomischen DNA-Restriktionsfragmentes, an das ein Linker und eine Reportersequenz durch jedes beliebige geeignete Mittel gebunden wurden, entweder in vivo, wie z.B. durch Replikation in einer Wirtszelle, oder in vitro. In-vitro-Amplifikation eines Restriktionsfragmentes, an das eine Reportersequenz mit definierter Sequenz gebunden ist, kann beispielsweise durch die von Mullis et al., s.o., oder Miller et al., PCT-Veröffentlichung Nummer WO 89/06700, veröffentlicht am 27. Juli 1989, offenbarten Verfahren unter Verwendung eines Primers, der eine Sequenz umfasst, die zu jener der Reportersequenz komplementär ist, erfolgen. Keines dieser Verfahren ist jedoch besonders gut geeignet für die Amplifikation von längeren DNA-Fragmenten. Beispielsweise ist das Verfahren von Mullis et al. im Allgemeinen aufgrund der langsamen Verfahrensdurchführung und der relativ hohen Fehlerquote der in der Amplifi kationsreaktion verwendeten DNA-Polymerase auf die Amplifikation von DNA-Fragmenten eingeschränkt, die nicht länger als mehrere tausend Basenpaare sind. Higuchi et al., Nuc. Acids Res. 16, 7351–7367 (1988); Saiki et al., Science 239, 487–491 (1988). Darüber hinaus erfordert das Verfahren von Mullis et al. mehrere Zyklen an Nucleinsäure-Denaturierung und Primerhybridisierung, was zu hohen Arbeits- und Automationskosten führt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die zum Klonieren von genomischer DNA verwendete Reportersequenz einen Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung, und Amplifikation des Restriktionsfragmentes, an das es gebunden wird, erfolgt in vitro unter Verwendung von Bakteriophagen-phi29-DNA-Polymerase.
Die Bezeichnung "Replikationsursprung" bezieht sich im Allgemeinen auf eine Sequenz in DNA, an der DNA-Synthese durch ein Polymerisationsmittel initiiert wird. Gutierrez et al., Nuc. Acids Res. 16, 5895–5914 (1988), offenbart, dass die Mindestanzahl an phi29-Replikationsursprüngen, die durch phi29-DNA-Polymerase verwendet werden, innerhalb der letzten 12 Basenpaare an jedem Ende von phi29-DNA angeordnet sind. Der so genannte "linke Replikationsursprung" umfasst die Sequenz 5'-AAAGTAAGCCCC-3', und der "rechte Replikationsursprung" umfasst die Sequenz 5'-AAAGTAGGGTAC-3', wobei die Replikation wie gezeigt in 5'-3'-Richtung abläuft. Da jedoch Nucleotidveränderungen an einer oder mehreren Positionen innerhalb dieser Sequenzen vorgenommen werden können, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen, sind alle solche Sequenzvarianten ebenso vom Umfang der Bezeichnung "Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung", wie hierin verwendet, umfasst.
Blanco et al., Gene 29, 33–40 (1984), und Blanco & Salas, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 5325–5329 (1984), beschreiben zusammen die Reinigung von Bakteriophagen-phi29-DNA-Polymerase aus E.-coli-Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid transformiert sind, das das phi29-DNA-Polymerasegen enthält. Garcia et al., Gene 21, 65–76 (1983), und Prieto et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 1639–1643 (1984), beschreiben zusammen die Reinigung von terminalem Protein des Bakteriophagen phi29 aus E.-coli-Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid transformiert sind, das das phi29-Gen für das terminate Protein enthält.
Blanco & Salas, Proc. Nat. Acad. Sci. 82, 6404–6408 (1985), und Blanco et al., in: "EMBO Workshop – Gene Organization and Expression in Bakteriophages", S. 63 (1988), beschreiben die Replikation von Bakteriophagen-phi29-DNA in Gegenwart von gereinigtem terminalem phi29-Protein und phi29-DNA-Polymerase. Die Replikation von doppelsträngiger Bakteriophagen-phi29-DNA wird an den Replikationsursprüngen, die an beiden Enden der DNA vorhanden sind, durch einen Protein-Primingmechanismus initiiert. In Gegenwart von terminalem phi29-Protein, phi29-DNA-Polymerase und den vier Desoxynucleosidtriphosphaten wird ein dAMP-Initiationskomplex des terminalen Proteins gebildet, der durch phi29-DNA-Polymerase durch einen Strangverdrängungsmechanismus zu einer Volllängen-phi29-DNA verlängert werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird ein Amplifikationsverfahren zur Amplifikation von heterologen DNA-Sequenzen in der Größenordnung von 10.000 Basenpaaren bis 100.000 Basenpaaren oder mehr in der Länge sowie von heterologen DNA-Sequenzen von weniger als 10.000 Basenpaaren in der Länge verwendet, wobei das Verfahren einen Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung und hoch-progressiv arbeitende Bakteriophagen-phi29-DNA-Polymerase verwendet. Gemäß der in der Stammanmeldung beschriebenen Erfindung ist es nun möglich, jede beliebige DNA-Sequenz durch Inkorporieren eines Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprungs an ein oder an beide Enden davon zu amplifizieren. Somit stellt die in der Stammanmeldung beschriebene Erfindung neue DNA-Konstrukte bereit, die nicht natürlich vorkommen und die unter der Steuerung eines Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprungs repliziert werden können.
Der Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung kann aus natürlichen Quellen gewonnen oder kann synthetisch hergestellt werden und kann an das Ende eines heterologen DNA-Fragments in einer Ligationsreaktion mit DNA-Ligase gebunden oder anders angrenzend in eine DNA-Sequenz, die durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren amplifiziert wird, wie z.B. mittels ortsgerichteter Mutagenese, oder durch die Verwendung eines Ursprungs-Primers gemäß den Verfahren, die im Allgemeinen von Mullis et al., s.o., beschrieben werden, eingeführt werden.
Amplifikation einer heterologen DNA-Sequenz unter der Steuerung eines Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprungs erfolgt typischerweise in vitro in einer gepufferten wässrigen Lösung in Gegenwart von terminalem Protein des Bakteriophagen phi29, Bakteriophagen-phi29-DNA-Polymerase und den vier Desoxynucleosidtriphosphaten und unter geeigneten Bedingungen bezüglich Temperatur, Salzkonzentration (z.B. Mg²⁺, NH₄ ⁺) und pH, sodass zahlreiche Volllängenkopien der heterologen DNA synthetisiert werden.
Da die Replikation aus einem Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung unter Verwendung eines Strangs einer doppelsträngigen DNA als Matrize in eine Richtung erfolgt, wird die Amplifikation einer doppelsträngigen heterologen DNA durch Binden eines Linkers, der einen Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung umfasst, an beide DNA-Enden durchgeführt, sodass beide Stränge der DNA-Matrize repliziert werden. Demgemäß erfolgt die Amplifikation eines genomischen DNA-Restriktionsfragmentes vorzugsweise durch Binden von Linkern, die einen Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung umfassen, an beide Enden des Restriktionsfragmentes. Ein Linker, der einen Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprung umfasst, wird passenderweise als ein "phi29-Ursprungslinker" bezeichnet.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das genomische DNA-Restriktionsfragment zwei durch das Restriktionsenzym gebildete kohäsive Enden, und die phi29-Ursprungslinker weisen vorzugsweise jeweils eine Sequenz mit kohäsivem Ende auf, das komplementär zu einem der Enden des genomischen DNA-Restriktionsfragments ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das genomische DNA-Restriktionsfragment eines der ursprünglichen Enden des genomischen DNA-Substrats und ein durch Restriktionsenzym gebildetes kohäsives Ende. Typischerweise ist das ursprüngliche Ende des genomischen DNA-Substrats ein stumpfes Ende, wobei in diesem Fall die Amplifikation des genomischen DNA- Restriktionsfragments vorzugsweise durch Binden eines phi29-Ursprungslinkers mit einem stumpfen Ende an das ursprüngliche Ende und durch Binden eines phi29-Ursprungslinkers mit einem komplementären kohäsiven Ende an das durch Restriktionsenzym gebildete kohäsive Ende erfolgt. Die Bezeichnung "stumpfes Ende" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Ende einer doppelsträngigen Nucleinsäure, dem jeglicher einzelsträngige Überhang fehlt. Ist das ursprüngliche Ende des genomischen DNA-Substrats kein stumpfes Ende, so wird es vorzugsweise zu einem stumpfen Ende umgesetzt, beispielsweise durch Entfernen eines vorhandenen einzelsträngigen Überhangs mit SI-Nuclease oder jede andere geeignete, einzelsträngige Exonuclease, oder durch Auffüllen der ursprünglichen Enden gemäß bekannter Verfahren. Siehe beispielsweise Maniatis et al., s.o.
Werden in einem Amplifikationsschritt zwei oder mehr verschiedene genomische DNA-Restriktionsfragmente in derselben Reaktion amplifiziert, so wird es erforderlich sein, die verschiedenen Restriktionsfragmente voneinander zu trennen, um einzelne genomische DNA-Klone zu produzieren. Die Trennung der verschiedenen Restriktionsfragmente kann nach der Amplifikation durch jedes der bekannten Verfahren zum physischen Trennen von Nucleinsäuren durchgeführt werden, wie z.B. mittels Chromatographie, Zentrifugation oder Elektrophorese. Längere DNA-Moleküle in einem Größenbereich von etwa 10.000 Basenpaaren bis etwa 100.000 Basenpaaren oder mehr werden vorzugsweise durch das Verfahren der Gelelektrophorese mit gepulstem Feld getrennt. Carle & Olson, Nuc. Acids Res. 12, 5647–5664 (1984); Smith et al., Genetic Engineering 8, 45–70, Plenum Press, New York (1986). Die getrennten DNA-Moleküle können dann auf jede bekannte Weise isoliert werden, und, sofern erwünscht, können die isolierten DNA-Moleküle wiederum amplifiziert werden, um zahlreiche Kopien jedes einzelnen genomischen DNA-Klons zu produzieren.
Alternativ dazu können die verschiedenen DNA-Restriktionsfragmente mit Gruppierungen, die in der Lage sind, entweder direkt oder indirekt verschiedene nachweisbare Signale zu produzieren, markiert werden, beispielsweise durch Inkorporieren solcher Gruppierungen in die verschiedenen Linker, die mit den DNA-Restriktionsfragmenten verbunden sind, und durch physikalisches Trennen der DNA-Restrik tionsfragmente auf Grundlage jener verschiedenen Signale. Somit kann beispielsweise die nachweisbare Gruppierung ein Fluorophor sein, und die DNA-Restriktionsfragmente werden durch Durchflusszytometrie getrennt. Gray et al., Science 238, 323–329 (1987).
In wiederum einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung wirksame Mittel zum physischen Kartieren genomischer DNA-Restriktionsfragmente mit mehreren verschiedenen Sequenzen mit kohäsiven Enden. Nach Verdauen genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym, das in der Lage ist, mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden zu bilden, werden die relativen Positionen der resultierenden Restriktionsfragmente innerhalb der genomischen Substrat-DNA durch Bestimmen der Sequenz an einem oder beiden Enden jedes unterschiedlichen Restriktionsfragmentes, einschließlich zumindest der Sequenz von jedem kohäsiven Ende, ermittelt. Vorausgesetzt, die Sequenzen mit kohäsivem Ende unterscheiden sich zwischen den unterschiedlichen Restriktionsfragmenten, kann ein vergleichendes Anordnen der Restriktionsfragmente durch Profitieren von der Tatsache, dass Restriktionsfragmente, die innerhalb des genomischen DNA-Substrats benachbart sind und daher gemeinsame Spaltungsstellen haben, komplementäre Sequenzen mit kohäsiven Enden aufweisen, leicht durchgeführt werden.
Die Nucleotidsequenz am Ende eines genomischen DNA-Restriktionsfragmentes kann direkt durch jedes bekannte Verfahren des Nucleinsäuresequenzierens, beispielsweise durch das chemische Abbauverfahren von Maxam & Gilbert, Meth. Enzymol. 65, 499–560 (1980), oder durch das Kettenabbruchverfahren von Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 74, 5463–5467 (1977), bestimmt werden oder kann indirekt aus der Sequenz mit kohäsivem Ende eines oder mehrerer Linker bestimmt werden, die an das Restriktionsfragment gebunden sind.
Manipulation und Analyse von gesammelten Sequenzdaten, insbesondere das vergleichende Anordnen einzelner genomischer DNA-Restriktionsfragmente in einer physischen Karte, erfolgen auf einfache Weise unter Verwendung eines Computerverfahrens. Staden, Nuc. Acids Res. 10, 4731–4751 (1982), beispielsweise be schreibt ein Computerverfahren zur Bearbeitung von DNA-Sequenzinformation und zum vergleichenden Anordnen von DNA-Restriktionsfragment-Klonen, die miteinander durch Überlappung ihrer Sequenzen verbunden sind.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung bereitgestellt und sind auf keine Weise als Einschränkung der Erfindung zu verstehen. Alle hierin beschriebenen Patent- und Literaturverweise sind ausdrücklich hierin aufgenommen.
Beispiele
Verdau von Adenovirus-2-DNA mit Sfi I
Gereinigte Adenovirus-2-DNA (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) wird mit Restriktionsendonuclease Sfi I (New England BioLabs, Beverly, MA) in einer Reaktion, die aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 100 μg/ml Rinderserumalbumin, 20 μg/ml Adenovirus-2-DNA und 5 Einheiten Sfi I mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl besteht, 1 Stunde lang bei 50°C verdaut.
Entfernen von terminalem Protein des Adenovirus 2
Adenovirus-2-DNA enthält ein Virus-kodiertes Protein, das kovalent an den 5'-Terminus von jedem Strang des linearen DNA-Moleküls gebunden ist und dessen Entfernung erforderlich ist, um Enden zu produzieren, die in der Lage sind, mit Linkern Ligationen zu bilden. Stillman et al., Cell 23, 497–508 (1981); Tamanoi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 79, 2221–2225 (1982). Um das 5'-terminate Protein von der Adenovirus-2-DNA zu trennen, wird 20 μg/ml Adenovirus-2-DNA in 10 mm Tris-HCl (pH 7,5) mit einem gleichen Volumen an 1 M Piperidin vermischt, 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert, dann lyophilisiert, in Wasser aufgelöst und neuerlich lyophilisiert.
Oligonucleotidsynthese
Das einzelsträngige 12-mer-Oligonucleotid 5'-GGGGCTTACTTT-3' und jedes der 64 verschiedenen einzelsträngigen 15-mer-Oligonucleotide mit der allgemeinen Sequenz 5'-AAAGTAAGCCCCNNN-3', worin N jedes beliebige der vier Nucleotide Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin ist, werden an einem DNA-Synthesegerät von Biosearch, Modell 8600, gemäß dem Verfahren von Froehler et al., s.o., synthetisiert. Um Linker herzustellen, wird jedes der verschiedenen 15-mer-Oligonucleotide mit dem komplementären 12-mer-Oligonucleotid in Hybridisierungspuffer, der aus 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 20 mM NaCl besteht, bei einer Temperatur zwischen 25°C und 30°C anelliert. Die Nucleotidsequenzen von den 64 Linkerprodukten mit der allgemeinen Struktur
5' AAAGTAAGCCCCNNN 3'
3' TTTCATTCGGGG 5'
sind in 1 gezeigt.
Klonieren des Adenovirus-2-Genoms
Das terminale Protein des Adenovirus 2 wird von den Enden von Adenovirus-2-DNA wie zuvor beschrieben entfernt. Linker, die zwei linke Bakteriophagen-phi29-Replikationsursprünge in einer End-zu-End-Ausrichtung umfassen und die Sequenz
5' AAAGTAAGCCCCGGGGCTTACTTT 3'
3' TTTCATTCGGGGCCCCGAATGAAA 5'
aufweisen, werden dann an die resultierenden stumpfen Enden der Adenovirus-2-DNA unter Verwendung von 100 pmol Linker pro μg Adenovirus-2-DNA in Ligationspuffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 2 mM Dithiothreit, 1 mM ATP, 1 mM Spermidin und 50 μg/ml Rinderserumalbumin, gebunden. 2 Einheiten von T4-DNA-Ligase (New England BioLabs, Beverly, MA) werden dann pro μg Adenovirus-2 im Reaktionsgemisch zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird dann bei 15°C eine Stunde lang inkubiert.
Nach Ligation der Bakteriophagen-phi29-Ursprungslinker an die ursprünglichen Enden der Adenovirus-2-DNA wird die Adenovirus-2-DNA mit Sfi I wie zuvor beschrieben verdaut. Das Klonieren der resultierenden Sfi-I-Restriktionsfragmente erfolgt dann einfach gemäß den Verfahren der Erfindung in den einzelnen Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten.
Zu jedem einzelnen Well der Mikrotiterplatten werden 100 pmol von jeweils zwei verschiedenen Linkern aus 1 zugesetzt, sodass jede mögliche Kombination von zwei verschiedenen Linkern aus 1 in einem oder einem anderen Mikrotiterwell enthalten ist. Die Anzahl an verschiedenen Kombinationen der 64 Linker aus 1 und somit die Anzahl an Mikrotiterwells, die zum Klonieren von Sfi-I-Restriktionsfragmenten vorbereitet werden müssen, beträgt 2016. Im Allgemeinen kann die Anzahl der verschiedenen Kombinationen von N verschiedenen Linkern gemäß der folgenden Formel bestimmt werden:
1 μg von Sfi-I-verdauter Adenovirus-2-DNA wird dann zu jedem einzelnen Mikrotiterwell in 25 μl Ligationspuffer zusammen mit 2 Einheiten von T4-DNA-Ligase (New England BioLabs, Beverly, MA) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 15°C eine Stunde lang inkubiert, um die Ligation von Linkern an die kohäsiven Enden der Adenovirus-2-DNA-Restriktionsfragmente zu ermöglichen. Die Ligationsreaktion wird durch 15-minütiges Erhitzen bei 68°C gestoppt.
Nach der Ligation von Linkern an die Adenovirus-2-DNA-Restriktionsfragmente erfolgt Amplifikation der Adenovirus-2-Restriktionsfragmente durch Zusatz von 20 μM jeweils von dATP, dTTP, dGTP und dCTP, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 5 Vol.-% Glycerin, 300 ng gereinigtem terminalem Protein des Bakteriophagen phi29 und 20 ng Bakteriophagen-phi29-DNA-Polymerase zum Reaktionsgemisch in jeden Mikrotiterwell. Nach 2-stündiger Inkubation bei 30°C wird die DNA-Synthesereaktion durch den Zusatz von 10 mM EDTA und 10-minütiges Erhitzen bei 68°C gestoppt.
Nach Polyacrylamidgelelektrophorese der DNA-Synthesereaktionsgemische wird jedes der amplifizierten Adenovirus-2-DNA-Restriktionsfragmente durch Färben des Gels mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht und dann aus dem Gel durch Elektroelution gereinigt. Sequenzieren der Enden von jedem Strang der Restriktionsfragmente wird gemäß dem Verfahren von Maxam & Gilbert, s.o., unter Verwendung von α³²P-Cordycepin-5'-triphosphat zum 3'-Endmarkieren durchgeführt. Tu et al., Gene 10, 177–183 (1980).
Physisches Kartieren des Adenovirus-2-Genoms
Verdau von Adenovirus-2-DNA mit Sfi I erzeugt vier Restriktionsfragmente in einem Größenbereich von etwa 1.000 Basenpaaren bis etwa 16.000 Basenpaaren. Die Nucleotidsequenz an den 3'-Enden von jedem der Restriktionsfragmente lautet wie folgt:
Vergleichendes Anordnen der Restriktionsfragmente in einer physischen Karte erfolgt durch Analysieren der Nucleotidsequenz von jedem Restriktionsfragment auf komplementäre 3'-Endsequenzen. Demgemäß sind die vier Sfi-I-Restriktionsfragmente von Adenovirus-2-DNA wie folgt vergleichend angeordnet:
Klonieren eines inneren Sfi-I-Fragments von Adenovirus-2-DNA
Dieses Beispiel veranschaulicht eine Ausführungsform der Erfindung, worin ein genomisches DNA-Restriktionsfragment mit einer vorbestimmten Sequenz mit kohäsivem Ende kloniert wird.
Adenovirus-2-DNA wird mit Sfi I wie zuvor beschrieben verdaut. Aufgrund der bekannten Nucleotidsequenz des Adenovirus-2-Genoms, Roberts et al., in "Adenovirus DNA", W. Doerfler (Hrsg.), Martinus Nijhoff Publishing, Boston, MA (1986), kann vorausgesagt werden, dass eines der resultierenden Restriktionsfragmente, das sich von Nucleotid 17305 bis Nucleotid 23046 des Adenovirus-2-Genoms erstreckt, die folgende Struktur aufweisen wird:
5' CGGC ... GCCGGAC 3'
3' GACGCCG ... CGGC 5'.
Als erster Schritt beim In-vitro-Klonieren dieses Restriktionsfragmentes wird 1 μg von Sfi-I-verdauter Adenovirus-2-DNA mit 100 pmol Oligonucleotidlinker mit der Sequenz
5' AAAGTAAGCCCCCTG 3'
3' TTTCATTCGGGG 5'
und mit 100 pmol Oligonucleotidlinker mit der Sequenz
5' AAAGTAAGCCCCGTC 3'
3' TTTCATTCGGGG 5'
in 25 μl Ligationspuffer vermischt. 2 Einheiten von T4-DNA-Ligase werden dann dem Gemisch zugesetzt, und die Ligationsreaktion wird eine Stunde lang bei 15°C laufen gelassen.
Nach Ligation der Linker an die komplementären kohäsiven Enden des erwünschten Adenovirus-2-DNA-Restriktionsfragmentes erfolgt Amplifikation des Restriktionsfragmentes durch Zusatz von 20 μM jeweils von dATP, dTTP, dGTP und dCTP, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 5 Vol.-% Glycerin, 300 ng gereinigtem terminalem Protein des Bakteriophagen phi29 und 20 ng Bakteriophagen-phi29-DNA-Polymerase zum Ligations-Reaktionsgemisch. Nach 20-minütiger Inkubation bei 30°C wird die DNA-Synthesereaktion durch Zusatz von 10 mM EDTA und 10-minütiges Erhitzen bei 68°C gestoppt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Klonierung von genomischer DNA, umfassend: (a) Verdauen von genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym, das mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden erzeugt; (b) Kontaktieren der verdauten genomischen DNA mit einem Linker, wobei der Linker eine Reporternucleotidsequenz und eine Sequenz mit einem kohäsiven Ende umfasst, die komplementär zu einer Sequenz mit kohäsivem Ende ist, die durch das Restriktionsenzym in Schritt (a) erzeugt wurde, unter Bedingungen, unter denen ein Linker an ein Restriktionsfragment von genomischer DNA gebunden wird; und (c) Amplifizieren des Produkts aus Schritt (b).
Verfahren nach Anspruch 1, worin die verdaute genomische DNA in Schritt (b) mit zwei oder mehr verschiedenen Linkern kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sequenzen mit kohäsiven Enden, die durch das Restriktionsenzym in Schritt (a) erzeugt werden, gleich lang sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Restriktionsenzym in Schritt (a) Sfi I ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Schritte (b) und (c) zumindest einmal wiederholt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Produkt aus Schritt (b) vor oder nach Schritt (c) von der verdauten genomischen DNA abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Produkt aus Schritt (b) durch Elektrophorese abgetrennt wird.
Verfahren zur Kartierung von Restriktionsfragmenten genomischer DNA, Folgendes umfassend: (a) Verdauen von genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym, das mehrere verschiedene Sequenzen mit kohäsiven Enden erzeugt; (b) Amplifizieren der Restriktionsfragmentprodukte aus Schritt (a); (c) Bestimmen der Sequenz des kohäsiven Endes der einzelnen Restriktionsfragmente, und in Übereinstimmung damit (d) vergleichendes Anordnen der Restriktionsfragmente in einer physischen Karte.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Verfahren vor oder nach Schritt (b) weiters das Voneinander-Trennen der Restriktionsfragmentesprodukte aus Schritt (a) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Verfahren vor oder nach Schritt (b) weiters das Voneinander-Trennen der Restriktionsfragmentprodukte aus Schritt (a) mittels Gelelektrophorese umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die genomische DNA aus Schritt (a) eukaryotisch ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die genomische DNA aus Schritt (a) menschlich ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Restriktionsenzym in Schritt (a) Sfi I ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Sequenz des kohäsiven Endes der einzelnen Restriktionsfragmente indirekt aus der Sequenz des kohäsiven Endes eines Linkers bestimmt wird, der an das jeweilige Restriktionsfragmente gebunden ist.