DE68929070T2

DE68929070T2 - Verwendung von dna-proben mit variabler anzahl von tandem-repetitiven stellen zur genetischen identifizierung

Info

Publication number: DE68929070T2
Application number: DE68929070T
Authority: DE
Inventors: Mark Leppert; Yusuke Nakamura; Peter O'connell; Raymond White
Original assignee: University of Utah
Current assignee: University of Utah
Priority date: 1988-02-18
Filing date: 1989-02-17
Publication date: 2000-05-25
Anticipated expiration: 2009-02-18
Also published as: WO1989007658A1; EP0402400B1; DE68929070D1; US5411859A; AU637768B2; CA1339493C; EP0402400A1; JPH05501946A; AU4030789A; ATE184317T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Identifizierung von humanem Nucleinsäure-Polymorphismus. Eine Anwendung der Erfindung ist die Bestimmung des Grades der Ähnlichkeit von Individuen durch einen Vergleich der Art des Polymorphismus der Individuen. Im wesentlichen dient die Art des Polymorphismus in einem Individuum als Identifikationmerkmal oder Tracer dieses Individuums. Spezielle Anwendungen schließen Elternschaftstests, den Einsatz in der Gerichtsmedizin, die Diagnose von Erkrankungen und die Bestimmung von Chimärismus/Mosaizismus beispielsweise zur Unterscheidung der Zygotie oder im Anschluß an eine Transplantation mit ein.

Hintergrund der Erfindung

Eine Variation der Population findet durch Prozesse wie Rekombination und Mutation statt. Variation gibt es auf der Ebene des Organismus, der Zelle oder eines Zellbestandteils. Die biologische Redundanz begünstigt die Variation ohne Schaden für das Überleben. Beispielsweise impliziert die Divergenz verwandter Nucleinsäuresequenzen nicht eine Variabilität der Polypeptide, für die diese Sequenzen codieren.
Der Zustand der Variabilität, insbesondere in bezug auf ein Protein oder eine Nucleinsäure, ist als Polymorphismus bekannt. Bis vor kurzem konzentrierte man sich bei der Untersuchung des Polymorphismus auf Zellmembranproteine, Serumproteine oder intrazelluläre Proteine. Anwendungen schließen die Blutgruppentypisierung, beispielsweise ABO oder HLA, und die Isozym-Analyse ein (Lewontin & Hubby, Genetics (1966) 54, 595). Diese Verfahren beruhen auf Aminosäureveränderungen, die beispielsweise eine Antigen- Determinante oder die molekulare Ladung verändern. Protein-Polymorphismus kann aber "still" sein, weil die Aminosäuresubstitution keine Veränderung bewirkt, die mit diesen Verfahren erkennbar ist. Dies könnte dann eintreten, wenn die Substitution an einer Stelle stattfindet, die normalerweise in der tertiären oder quaternären Struktur des Proteins nicht exponiert ist.
Diese Einschränkungen wurden bei der Beobachtung des Polymorphismus in Nucleinsäuren umgangen. Das Eukaryonten-Genom besteht aus drei Klassen von Sequenzen nur einmal vorhanden, mäßig repetitiv und stark repetitiv. Im allgemeinen sind diese drei Klassen über das ganze Genom verbreitet. Viele dieser Sequenzen haben unbekannte Funktionen und codieren möglicherweise nicht für die erforderlichen RNAs oder Proteine. Von jenen Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie für Proteine codieren, sind die meisten zusammengesetzt aus codierenden und nichtcodierenden Segmenten. Eine Nucleinsäurevariation kann beispielsweise aufgrund von Codon-Degeneration oder an Stellen auftreten, wo ein Mangel an Selektionsdruck einen hohen Grad an Polymorphismus gestattet, wie in Pseudogenen, in hoch repetitiven Sequenzen oder in nichtcodierenden Bereichen struktureller Gene.
Nucleinsäure-Polymorphismus kann nachweisbar sein als Einzelbasenveränderungen innerhalb von Restriktionsstellen. Wyman und White (Proc. Natl Acad Sci USA (1980) 77, 6754) fanden einen Locus oder Ort im menschlichen Genom, in dem Polymorphismus aus einer DNA-Umgruppierung resultierte. In der Folge wurde ermittelt, daß der für den Polymorphismus verantwortliche Mechanismus in der Veränderung der Anzahl einer repetitiven Sequenz an diesem Locus bestand. Andere Stellen, wo Polymorphismus auf Unterschiede in der Kopienzahl zurückgeht, wurden in der Nähe der α-Globin-Gene (Higgs et al., Nucl Acids Res (1981) 9, 4213), des Insulin-Gens (Beil et al., Nature (1982) 225, 31), der Zeta-Globin-Gene (Proudfoot et al., Cell (1982) 31, 553); Goodbourn et al., (Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80, 5022), des c-Ha-ras-1-Locus (Capon et al, Nature (1983) 302, 33) und des Myoglobin-Gens (Weller et al., EMBO J (1984) 3, 439) gefunden.
Glassberg (GB-2135774A) offenbarte ein Verfahren zur genetischen Identifizierung von Individuen durch Analyse von DNA-Längenpolymorphismus, nachgewiesen mittels von Wyman & White, supra, sowie Capon et al., supra, entwickelter Clone. Was den Clon von Wyman & White betrifft, so ist die repetitive Einheit 3 bp, was die Wahrscheinlichkeit von Kreuzreaktivität erhöht, und die Größe von nachgewiesenen genomischen Fragmenten ist 14 kb oder mehr. Größenunterschiede bei großen Fragmenten sind in der Agarosegel- Elektrophorese manchmal schwierig aufzulösen. Die mit dem Capon-Clon nachgewiesenen Fragmentgrößen sind kleiner, es gibt aber wenige Allele an diesem Locus, und bei einer Population von 268 Zufallsindividuen ist jedes dritte Allel zu weniger als 1% vorhanden. (Der Wert eines Locus für Identifikationszwecke steht in direktem Zusammenhang mit der Anzahl an Allelen und der Häufigkeit jedes Allels in der Population.)
Jeffreys (GB-2166445A) fand, daß viele polymorphe Regionen eine Sequenz gemeinsam haben, die er Kernsequenz nannte. Er konstruierte Concatemere von Kern- oder Quasi-Kernsequenzen, die dann kloniert wurden. Bei der Verwendung als Sonden von genomischer DNA hybridisierten diese Clone an eine Vielzahl von Fragmenten. Die mit diesen Clonen verbundene Schwierigkeit besteht in der Interpretation des komplexen Hybridisierungsmusters.
Die Nützlichkeit von Clonen, die hochpolymorphe Orte detektieren, wird von Schriften belegt, die deren Anwendung bei Studien über Krebs (Thein et al., Br J Cancer (1987) 55, 353); in der Gerichtsmedizin (Gill et al.; Electrophoresis (1987) 8, 38; Kanter et al., J For Sci (1986) 31, 403; Giusti et al., J For Sci (1986)31, 409); bei der Zygotiebestimmung (Motomura et al., Jpn J Hum Genet (1987) 32, 9; Jones et al., Eur J Haematol (1987) 39, 144; Hill et al., Lancet (1985)ii, 1394); beim Nachweis von Chimärismus (Wallace et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol (1986) 51, 257; Knowlton et al., Blood (1986) 68, 378); in der Veterinärmedizin (Morton et al., Vet Rec (1987) 121, 592; Jeffreys et al., Anim Genet (1987) 18, 1); Populationsstudien (Wetton et al., Nature (1987) 327, 149); in Kopplungsstudien (Ponder et al., Henry Ford Hosp Med J (1987) 35; 161; Matthew et al., J Med Genet (1987) 24, 524); und für Vaterschaftstests (Jeffreys et al., Nature (1985) 316, 76; Jeffreys et al., Nature (1985) 316, 76) beschrieben.
Donis-Keller et al. (EP-0221633) offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen, die zur Genotypisierung mittels RFLP-Analyse geeignet sind. Die beanspruchten Clone tragen nur einmal vorhandene Sequenz-Inserts und hybridisieren an nicht gekoppelte Orte. Die Clone fallen in zwei Kategorien. Die erste besteht aus Clonen, die Basisveränderungen innerhalb einer Restriktionsstelle nachweisen und die zweite besteht aus Clonen, die Fragmentlängenunterschiede mit mindestens drei Enzymen liefern.
Die obenbeschriebene Technik weist Unzulänglichkeiten auf. Im allgemeinen hybridisieren Clone an eine Mehrzahl von Fragmenten pro Probe. Das erschwert die Interpretation. Manche Clone stammen von Loci, die nicht sehr multiallel sind, oder viele der Allele sind selten. Dadurch verringert sich ihre Nützlichkeit. Manche Clone hybridisieren mit genomischen Fragmenten, die die Tendenz haben, groß und unter Verwendung von Standard- Filterhybridisierung schwierig aufzulösen zu sein. Dies erfordert genomische DNA mit minimalem Abbau. Weiters müssen die Assay-Bedingungen spezifisch sein, um eine unechte Kreuzreaktivität zu minimieren. Schließlich steht jedem Labor eine kleine Gruppe von Clonen zur Verfügung, mit denen gearbeitet wird. Jeder einzelne Clon kann in einem speziellen Fall uninformativ sein. Weiters ist es zwecks Ausschließung von Variabilität aufgrund von denovo-Mutation wichtig, mehr als einen Locus zu analysieren. Es wird bevorzugt, daß die analysierten aufeinanderfolgenden Loci nicht an den ersten Locus gekoppelt sind.
Idealerweise befinden sich sämtliche analysierten Loci auf verschiedenen Chromosomen. So wäre eine Verbesserung des Standes der Technik eine Gruppe von Einzellocus-Clonen, die aus einer großen Anzahl von Clonen bestehen, welche multiallele heterozygote Loci detektieren und kartiert sind.
Eine Modifikation wurde von Jeffreys (GB-2188323A) geoffenbart, wo er eine Bande aus einem Gel schnitt, klonierte und dieses Insert als Sonde verwendete. Dieser Clon hybridisiert an einen einzigen multiallelen Locus und liefert ein Blot, das leichter zu interpretieren ist. Jeffreys durchmusterte auch eine größenlimitierte Bibliothek auf Rekombinanten, die "Kern"-Sequenzen tragen. Inserts aus fünf positiven Plaques hybridisierten unter hoher Stringenz an nur einmal vorhandene Loci und lieferten Blots, die leicht interpretierbar waren. Nichtsdestotrotz waren die erkannten genomischen Fragmente oft groß und führten zu Problemen hinsichtlich der Auflösung und DNA-Qualität.
Nakamura et al. (Science (1987) 235, 1616) nannte eine genetische Sequenz, die Tandem-Repeats an einem einzelnen Ort enthält, einen Locus mit variabler Anzahl an Tandem-Repeats (VNTR). Es wurden Oligonucleotide zur Durchmusterung einer Cosmid- Bibliothek auf VNTR-Sequenzen tragende Rekombinanten verwendet. Positive Clone wurden als Sonde verwendet um festzustellen, ob sie an VNTR-Loci im menschlichen Genom hybridisieren, und wenn ja, um den Grad der Heterozygotie an diesen Stellen zu bestimmen.

Kurzfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis von polymorphen Orten im menschlichen Genom. Die Erfindung lehrt, wie Nucleinsäure- Clone erhalten werden, die Sequenzen tragen, welche aus einem VNTR-Ort stammen oder einen solchen einschließen. Die Clone werden durchgemustert, um Gensequenzen zu detektieren, welche stark heterozygot sind. Darüberhinaus werden Clone selektiert, um über das ganze Genom verteilte nur einmal vorhandene VNTR-Orte nachzuweisen.
VNTR-Clone können Individuen auf Basis der an einem oder mehreren Orten in ihrem Genom getragenen Allele unterscheiden. So können VNTR-Clone zur Elternschaftsbestimmung, in der Gerichtsmedizin, bei der Bestimmung der Zygotie, bei der Bestimmung des Inzuchtgrades, bei der Stammbaumanalyse, bei der Gen-Kartierung oder bei jeder anderen Anwendung eingesetzt werden, bei welcher eine Identifikation eines Organismus, eines Organs, eines Gewebes, einer Zelle, eines subzellulären Bestandteils, eines Teils desselben oder eines Abbauprodukts desselben erforderlich ist.
Es wurde eine Anzahl von VNTR-Clonen charakterisiert, die nachstehend beschrieben sind. Vorteile des VNTR-Clon-Sets sind die Anzahl an informativen Clonen, die Charakterisierung der Clone bezüglich der Kartenstelle und des Grades der Heterozygotie, und die detektierten genomischen Fragmente haben im allgemeinen ein niedrigeres Molekulargewicht. Allele von geringer Größe erleichtern die Auflösung, ermöglichen eine Identifikation ohne Filterhybridisierung und gewährleisten Robustheit bei ihrer Anwendung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 umfaßt ein Paar Autoradiogramme. Die Filme zeigen die Zufallsdurchmusterung von sechs nicht miteinander verwandten Individuen. Als Sonde wurden Cosmide verwendet.
Fig. 2 umfaßt ein Autoradiogramm zusammen mit einem Stammbaum, das die Ergebnisse der Durchmusterung zeigt.
Fig. 3 umfaßt ein Paar Autoradiogramme, die die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, ob nachgewiesene Loci multiallel sind.
Fig. 4 ist ein Autoradiogramm, das die Resultate eines Elternschaftstests unter Verwendung von pJCZ3.1 und HinfI-verdauter DNA zeigt.
Fig. 5 ist ein Autoradiogramm, das die Resultate eines Elternschaftstests unter Verwendung von pJCZ16.2 und HinfI-verdauter DNA zeigt.
Fig. 6. ist ein Autoradiogramm, das die Resultate eines Elternschaftstests unter Verwendung von pYNH24 und AluI-verdauter DNA zeigt.
Fig. 7 umfaßt ein Ideogramm und Kopplungskarten des menschlichen Chromosoms 14.
Fig. 8 umfaßt ein Ideogramm und Kopplungskarten des menschlichen Chromosoms 17.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Sämtliche in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendeten Ausdrücke sind dem Fachmann bekannt. Ungeachtet dessen werden zwecks Schaffung eines klaren und einheitlichen Verständnisses der Beschreibung und der Anspruche, einschließlich des Bedeutungsumfangs solcher Ausdrücke, die folgenden Definitionen zur Verfügung gestellt:
Clon: Rekombinantes Nucleinsäuremolekül mit Vektor-Insert (fremde Nucleinsäure).
Clon-Set: Aneinanderfügung rekombinanter Nucleinsäuremoleküle.
Consensus: Gemeinsamkeit in einer Aneinanderfügung.
cXYZ: Bezeichnung für einen Cosmid-Clon, der an den XYZ-Locus hybridisiert.
DpSg: Wo D und S eine Einzelkopie-DNA-Sequenz darstellen, bedeutet p die Nummer/den Buchstaben des Chromosoms, in dem die DNA kartiert (aus der sie stammt), und q ist eine Zählzahl. Dieses Symbol dient der Identifizierung eines Gen-Locus. Ist der X-gekoppelte Gen-Locus, der als XYZ bekannt ist, die erste auf dem X-Chromosom kartierte Einzelkopie- DNA-Sequenz, dann ist DXS1 somit ein Synonym für XYZ.
Bibliothek oder Bank: Eine Mehrzahl von rekombinanten Clonen, wobei diese Clone Anteile einer fremden Nucleinsäure tragen, die einem Organismus, einer Zelle, einem Chromosom oder einer Nucleinsäure entstammen, die in ihrer Gesamtheit zu groß ist, um geklont zu werden, wobei diese Anteile an fremder Nucleinsäure, wenn sie stückweise zusammengefügt werden, statistisch als ident mit dem Ausgangsmaterial angesehen werden, aus welchem die Stücke erhalten wurden.
Kartieren: Lokalisieren einer Nucleinsäuresequenz innerhalb des Genoms auf einem Chromosom, einem Bereich desselben oder innerhalb der Nucleinsäure, die ein Chromosom enthält. Übliche Methoden und Mittel zum Genkartieren schließen Kopplungsanalyse, Testkreuzungen, somatische Zellhybriden, rekombinante Inzuchtstämme und Sequenzierung ein.
Nucleinsäurefragment: Nucleotidpolymer, das ein Oligonucleotid einschließen kann, das aber im allgemeinen länger als ein Oligonucleotid ist. Wie hierin verwendet, soll Nucleinsäurefragment einen Clon, das VNTR-haltige Fragment eines Clons, eine Nucleinsäure mit im wesentlichen homologer Sequenz zu diesem VNTR-haltigen Fragment und eine Nucleinsäure, die an den vom Clon spezifizierten Einzellocus hybridisieren kann, mit einschließen.
Oligo oder Oligonucleotid: Polymer aus einigen Nucleotidbasen.
Polymorpher Locus oder Ort bzw. polymorphes Gen: Nucleinsäuresequenz, die im diploiden Genom lokalisiert ist, wobei die homologen Kopien nicht identisch sind.
pXYZ: Bezeichnung für einen Plasmid-Clon, der an den XYZ-Locus hybridisiert.
Wesentliche Sequenzhomologie: Wesentliche funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen Nucleotidsequenzen. Funktionelle und/oder strukturelle Unterschiede zwischen Sequenzen mit wesentlicher Sequenzhomologie sind minimal.
VNTR-Locus oder -Ort bzw. -bereich bzw. -sequenz bzw. -gen: Nucleinsäureabschnitt, der zahlreiche Kopien einer im allgemeinen tandemartig organisierten Einheit umfaßt, wobei die Einheit eine Länge von 3 Basenpaaren bis zu 40 Basenpaaren oder mehr besitzen kann, welcher Abschnitt nur einmal vorhandene Sequenzen enthalten kann, die zwischen Anhäufungen von Tandem-Repeats eingestreut sind oder Tandem-Repeats flankieren.
XYZ: Symbol, das einen Locus oder Ort identifiziert, auch als Gensymbol bekannt. Im vorliegenden Beispiel ist der Name des Gens XYZ.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen polymorpher Orte beim Menschen. Die Beschaffenheit der von einem Individuum getragenen Orte offenbart sich bei einer Umsetzung von VNTR-Clonen mit genomischer DNA dieses Individuums. Die Reaktion äußert sich im allgemeinen als Muster von Banden auf einem Membranträger. Ein Muster ist somit charakteristisch für ein Individuum und Muster von Individuen können verglichen werden um festzustellen, ob die Individuen gemeinsame Abstammung haben.
Die VNTR-Clone, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, detektieren nur einmal vorhandene Orte, die überall im menschlichen Genom verstreut sind. Die Orte sind polymorph und die Variabilität geht hauptsächlich auf Unterschiede in der Kopienzahl der Tandem-Repeats zurück. Diese Orte heißen VNTR-Orte (Nakamura et al., supra). Die vorliegende Erfindung lehrt Verfahren zum Identifizieren und Erzeugen von Clonen aus VNTR-Orten in Reagenzmengen. Der Wert eines im Sinne der Erfindung erzeugten Clons steigt direkt mit der Anzahl der an diesem Ort befindlichen Allele und der Häufigkeit jedes Allels. Idealerweise würde man auf eine multiallele Serie hoffen, bei der jedes Allel mit derselben Häufigkeit in einer Population vorhanden ist. Dieses Ziel wird selten erreicht. Um einen vergleichbaren Auflösungsgrad zu erzielen, besteht eine Alternative in der Kombination von Informationen aus mehreren vorzugsweise ungekoppelten Orten. Kurze Ausführungen über Genkartierung, rekombinante DNA und Populationsgenetik finden sich in Botstein et al. (Am J Hum Genet (1980), 12, 314).
Methoden, die angewendet werden, um erfindungsgemäße VNTR-Clone zu erhalten, sind einschlägig bekannt. Geeignete Methoden sind in Molecular Cloning (1982) von Maniatis et al. und in den Bänden 65, 68, 100, 101 und 152 von Methods in Enzymology beschrieben. Eine detailliertere Beschreibung von Verfahren, nach denen in der vorliegenden Erfindung gearbeitet wird, ist auch in Wyman und White, supra, Litt und White (Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82, 6206) und Nakamura et al., supra, zu finden.
Wie auf dem Gebiet bekannt, erfordert die Hybridisierung mit Oligonucleotiden gut definierte Sequenzen und Versuchsbedingungen. Eine Veränderung eines einzigen Nucleotids oder Grads bei der Hybridisierung oder Waschung kann zu Veränderungen der Genauigkeit und Stabilität bei der Paarung führen wie bei Verwendung eines Oligo zur Sondierung eines genomischen Verdaus auf eine nur einmal vorhandene Sequenz. Andererseits besteht das Ziel bei der Verwendung eines Oligos zur Durchmusterung einer Bibliothek insbesondere im Sinne der vorliegenden Erfindung darin, eine vernünftige Anzahl an positiven Clonen zu erhalten. So verringern sich die Homologieerfordernisse, d. h. Oligos können in einem oder mehr Nucleotiden variieren, oder die Stringenz kann herabgesetzt werden, um fehlgepaarte Doppelstränge beizubehalten. VNTR-Clone können durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek mit Oligonucleotiden, die nach bekannten an VNTR-Orten gefundenen Consensus-Sequenzen konfiguriert sind, erhalten werden. Sequenzen einiger der verwendeten Oligos sind in Tabelle 1 angeführt. TABELLE 1
* H = Hybridisierungstemperatur
** W = Waschtemperatur
+ an das identifizierte Gen gekoppelter VNTR-Locus
++ bezogen auf die X-Gen-Region des Hepatitis-B-Virus
Zu Beginn wurde eine menschliche genomische Phagen-Bibliothek mit dem Myoglobin-1 16mer durchgemustert. Niedrig stringente Bedingungen wurden zur Hybridisierung zwecks Nachweis von Hybriden bei einer relativ geringen Homologie zwischen dem Oligonucleotid und genomischen Sequenzen gewählt. Es wurden etwa 50 positive Clone pro Genom-Äquivalent (250.000 Clone) erhalten. Bei der Verwendung zur Sondierung von Restriktionsverdaus von DNA aus nichtverwandten Individuen zeigte jedoch keiner einen VNTR-Polymorphismus. Da Phagen mit repetitiven DNA-Sequenzen in recA&spplus;- Wirten nicht gut wachsen, schien es möglich, daß die in recA&spplus;-Bakterien konstruierte Bibliothek viele Phagen verloren hatte, die VNTR-Sequenzen enthielten.
Die Durchmusterung einer in recA&supmin;-Bakterien wachsenden menschlichen Cosmid- Bibliothek war produktiver. Obwohl die gleichen Bedingungen wie für die Phagen-Durchmusterung verwendet wurden, wurden dreimal so viele positive Clone pro Genom-Äquivalent aus der Cosmid-Bibliothek als aus der Phagen-Bibliothek erhalten (Tabelle 2). Da es unter den in Tabelle 1 aufgelisteten Oligonucleotiden einige Ähnlichkeiten in der Sequenz gibt, ist es wichtig zu vermerken, daß sich die meisten mit einem Oligonucleotid identifizierten Cosmid-Clone von jenen unterscheiden, die mit einem anderen Oligonucleotid identifiziert wurden. Weniger als 4% Cosmid-Clone hybridisierten mit mehr als einem der Oligonucleotide. TABELLE 2
* Durchgemustert wurden ein genomisches Äquivalent (75.000 Kolonien) bis zwei genomische Äquivalente pro Sonde. Es ist die Anzahl an positiven Klonen pro 75.000 Kolonien dargestellt.
** Anzahl der Clone, die an ein Panel von menschlichen genomischen DNAs hybridisiert wurden.
*** Anzahl der Clone, die an einen VNTR-Ort hybridisierten.
**** Mittelwert
Anteil von VNTR-Clonen in den untersuchten Cosmiden.
Die Anzahl der Cosmide, die Stellen-Polymorphismus mit zwei oder mehr Restriktionsenzymen zeigten, ist in Klammern angegeben.
Mehrere der VNTR-Clone wurden unter Verwendung von Standardmethoden, im allgemeinen dem Didesoxy-Verfahren nach Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA (1980) 74, 5463) sequenziert. Eine etwas variable Consensus-Sequenz wurde identifiziert. Diese Sequenz ist GGGNNGTGGGG, oder in einem weiteren Sinn handelt es sich um eine nahezu unveränderliche Sequenz von GNNNGTGGG oder GNNGTGGG. Die Ausnahmen von dieser allgemeinen Regel sind zwei VNTR-Loci mit Consensus-Sequenzen, die ein AT-reiches Motiv aufweisen. Diese Loci sind gekoppelt an Apolipoprotein B und Collagen-Typ II wie in Tabelle 3 aufgelistet. TABELLE 3
1. Capon et al., supra.
2. Silva, persönliche Mitteilung.
3. Jarman et al., EMBO J(1986) 5, 1857.
4. Knott et al., Nucl Acids Res (1986) 14, 9215.
5. Stoker et al., ibid. (1985) 13, 4613.
Die Sequenzdaten bestätigten, daß die Variabilität zum Teil aus den Unterschieden bei der Anzahl an Repeats entsteht. Beispielsweise wurden Teilsequenzen für drei Allele am D17S30-Locus (YNZ22) erhalten. Die Repeat-Einheit ist 70 bp. Das 6A-Allel enthielt vier Repeat-Kopien, das 3A-Allel enthielt drei Repeat-Kopien und das D7-Allel enthielt zwei Repeat-Kopien. Sämtliche Repeat-Einheiten der drei Allele hatten identische 70-bp-Einheiten.
Die Identität der Repeat-Einheiten braucht jedoch nicht absolut zu sein. Ein Allel des DIS80-Locus (MCT118) wurde sequenziert, und es wurden zehn Kopien einer Tandem- Repeat-Einheit gefunden. Die Sequenzen der zehn Einheiten sind wie folgt:
1) CCCAAGG-AAGACAGA
2) CCACAGGCAAGGAGGA
3) CCACCGGAAAGGAAGA
4) CCACCGGAAAGGAAGA
5) CCACCGGAAAGGAAGA
6) CCACAGGCAAGGAGGA
7) CCACCGGAAAGGAAGA
8) CCACCGGCAAGGAGGA
9) CCACCGGCAAGGAGGA
10) CCACCAGGAAGGAGGA
In diesem Fall sind die Repeat-Einheiten nicht genau reproduziert und es stellt sich eine andere Variabilitätsklasse dar. Die Änderungen schließen die Deletion einer Base in der ersten Einheit und Transitionen oder Transversionen ein.
Aufgrund der Verwandtheit von VNTR-Clonen ist es wahrscheinlich, unter Verwendung von Oligonucleotiden, die nach der Consensus-Sequenz gestaltet sind, VNTR- Clone zu erhalten. So kann ein Oligo mit 14 oder mehr Basen, die eine Consensus oder Quasi- Consensus-Sequenz enthalten, wobei die übrigen Basen willkürlich gewählt, aber vorzugsweise Guanin oder Thymidin oder Cytosin sind, zur Durchmusterung einer Bibliothek nach VNTR-Clonen eingesetzt werden. Der Grad der Sequenzhomologie zwischen einem Oligonucleotid und dem Consensus kann 50% oder weniger ausmachen, und es besteht aber weiterhin die Möglichkeit, VNTR-Clone aus einer Bibliothek zu erhalten. Bei einem Versuch identifizierte ein Oligonucleotid mit alternierenden T- und G-Resten VNTR-Clone, von denen einer pMCT 118 ist.
Da VNTR-Loci über das gesamte Genom verstreut sind, können VNTR-Clone willkürlich aus einer Bibliothek durch Selektion und unter Verwendung von Clonen als Sonde für ein Panel genomischer DNAs wie nachstehend beschrieben erhalten werden. Dies kann jedoch eine mühsame und kostspielige und wenig rentable Angelegenheit sein. Eine Alternative besteht in der Verwendung einer Bibliothek, die DNA aus nur einem Teil des Genoms enthält, beispielsweise einer Chromosomen-spezifischen Bibliothek. In diesem Fall wird ein Target-Teil des Genoms geprüft und die Bibliothek enthält weniger Clone.
Somatische Zellhybride (nachstehend auf Seite 12 beschrieben) oder isolierte Chromosome sind eine geeignete Quelle menschlicher DNA für die Konstruktion einer Bibliothek. cTBQ7 wurde auf diese Weise aus einer Bibliothek erhalten, die somatische Zellhybrid-DNA enthielt, wobei die einzigen menschlichen Chromosome der Hybridzelllinie die Chromosome 10 und Y sind. Dieser Cosmid-Clon wurde willkürlich selektiert und als Sonde für ein Panel genomischer DNAs aus nichtverwandten Individuen verwendet um festzustellen, ob der Clon an einen polymorphen Ort auf einem der Chromosome 10 oder Y hybridisierte.
Kandidaten-Cosmid-Clone wurden als Sonde für ein Panel nichtverwandter menschlicher genomischer DNAs verwendet. Clone, die unter hoch stringenten Bedingungen an einen einzigen polymorphen Ort hybridisierten, wurden subkloniert, auch wenn dieser Vorgang nicht unbedingt notwendig war. Die Subklonierung zog im wesentlichen die Fragmentierung des Inserts und die Suche nach einem Fragment oder Fragmenten nach sich, die das gleiche Hybridisierungsmuster erzeugten wie der ursprüngliche Cosmid-Clon. Die zurechtgeschnittenen Fragmente wurden allgemein in Plasmide subkloniert. Zur Bestimmung des Grades der Heterozygotie an dem von einem Clon erkannten VNTR-Ort wurde eine größere Anzahl an DNAs aus nichtverwandten Menschen analysiert. Diese Analyse lieferte nicht nur ein Maß für die Heterozygotie, sondern auch Daten über die Anzahl der Allele, die Allelgröße (auf die Allelgröße wird von der Bandengröße geschlossen) und die Allelhäufigkeit. Die DNAs wurden mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut, um jenes Enzym zu bestimmen, das die größte Anzahl an Allelen und die kleinsten Allele erzeugt.
Die Sequenzhomologie-Erfordernisse verändern sich bei der Verwendung längerer Nucleinsäurefragmente als Sonde für nur einmal vorhandene Sequenzen, weil die Länge und der relative Gehalt an G/C-Paaren des Fragments zur Hybridisierungskinetik und somit zur Genauigkeit der Paarung (siehe z. B. Wetmur und Davidson, J Mol Biol (1968) 31. 349) beitragen. Führt man eine Evolutionsuntersuchung einer Gensequenz durch, würden somit die Hybridisierungsbedingungen modifiziert werden, um einer Sequenzdivergenz aufgrund von Gendrift Rechnung zu tragen. (Dennoch werden die Funktion der Sequenzen und der codierten Polypeptide beibehalten). Andererseits werden, wenn eine Identifizierung von Sequenzen an einem speziellen Ort erwünscht ist, die Hybridisierungsbedingungen so modifiziert, daß ein hoher Grad an Komplementarität der hybridisierenden Bestandteile zur Aufrechterhaltung des Doppelstrangs erforderlich ist. VNTR-Regionen verlangen zusätzliche Überlegungen bei der Bestimmung der erforderlichen Sequenzhomologie. Eine Veränderung der Kopienzahl trägt signifikant zur Heterozygotie bei, doch sind oft nicht alle Repeat- Einheiten an einem Ort identisch. So können Nucleinsäurefragmente, die sich in der Sequenz leicht unterscheiden, dennoch an denselben Ort hybridisieren. Hier kann die Sequenzhomologie in bezug auf jene Nucleinsäurefragmente definiert werden, die an einen nur einmal vorhandenen VNTR-Ort hybridisieren, denn es ist gerade der VNTR-Ort und seine Detektion, die für die vorliegende Erfindung vorrangig sind.
Die VNTR-Clone können auf der menschlichen Genom-Karte fixiert werden. Es gibt mehrere Kartierungsmethoden, einschließlich der Kopplungsanalyse und der Verwendung von somatischen Zellhybriden. Viele der VNTR-Clone wurden mittels Kopplungsanalyse kartiert, d. h. durch Bestimmung der Vererbung des Markers bei großen Stammbäumen und Vergleich des Musters der Anwesenheit/Abwesenheit oder der Größe des betreffenden Markers mit jenem von zuvor innerhalb derselben Stammbäume untersuchten Orten. Die Aussagekraft der Kopplungsanalyse steigt mit der Probengröße und der Anzahl der Orte, die innerhalb individueller Stammbäume untersucht wurden. Stimmen Muster perfekt überein, kann man daraus auf eine enge Kopplung des Markers an das Ankergen bzw. die Ankergene oder die Gleichartigkeit des Markers mit einem Ankergen schließen. Variiert die Musterübereinstimmung, kann man auf eine teilweise Kopplung schließen, und es können Kartenabstände bestimmt werden. Es wird bevorzugt, mehr als ein Ankergen zu verwenden. Für eine Übersicht zur Segregation, zur Kopplungsanalyse und zu den statistischen Grundlagen für diese Behandlungen siehe Cavalli-Sforza & Bodmer, The Genetics of Human Populations (1971).
Somatische Zellhybride sind nützlich für eine rasche Lokalisierung eines Gens an ein Chromosom oder eine Chromosomenregion. Weiss & Green, Proc Natl Acad Sci USA (1967) 58, 1104. Heterokaryonten neigen zur willkürlichen Segregation von Chromosomen mit Ausnahme der Chromosomenregion, die den selektierbaren Marker trägt. So kann ein Panel von Zelllinien, von denen jede eine oder mehr menschliche Chromosome trägt, aufrechterhalten werden. Panels werden so gebildet, daß die Syntänie mit einem beliebigen Chromosom bestimmbar ist. Das Panel wird auf die Expression oder Anwesenheit eines Gens durchgemustert, und die Assoziation mit (einem) speziellen Chromosom(en) wird bestätigt. THH59 wurde unter Verwendung von somatischen Zellhybriden auf dem Chromosom 17 kartiert. Anschließend wurde eine Kopplung von TH59 und TK1 bei einer Familienstudie gefunden. Darüberhinaus ist es möglich, Hybridzelllinien zu erhalten, die menschliche Chromosomenfragmente oder Translokationen tragen. Wenn diese Umgruppierungen identifiziert werden, ist eine Kopplung an eine Chromosomenregion möglich. Eine ähnliche Technologie zur Chromosomen-Lokalisierung besteht in der Verwendung eines Panels von DNAs, die aus flußsortierten Chromosomen erhalten wurden. Deaven et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol (1986) 51, 159.
Familienstudien sind besonders wertvoll für die Kartierung und Clon-Identifizierung. Zelllinien, die aus Mitgliedern weitverzweigter Familien mit vielen Generationen etabliert wurden, dienen als Kartier- und Referenzreagenzien gegenüber Allelen an einem VNTR-Ort. So ist die Vererbung spezifischer Allele an einem Ort auf ausgewählte Mitglieder einer großen Sippe ein Diagnosewerkzeug zur Unterscheidung eines Clons für diesen Ort, von Derivaten dieses Clons oder von Clonen mit wesentlicher Sequenzhomologie, die an Sequenzen an dem Ort hybridisieren. Solche Zelllinien sind erhältlich bei Human Genetic Mutant Cell Repository in Camden, New Jersey, oder bei CEPH in Paris, Frankreich. Beispielsweise stellt die Familie 982, Utah Pedigree K-1331 eine Dreigenerationenfamilie dar, und Zelllinien wurden von 15 Mitgliedern, nämlich den Großeltern mütterlicher- und väterlicherseits, den Eltern und neun Kindern, etabliert. Zur Bestätigung, daß die Spezifizität eines Subclons, eines neu hergestellten Clons oder eines an ein anderes Labor gesandten Clons beibehalten wird, wird er als Sonde für die Zelllinien-DNAs der Familie 982 verwendet und das erhaltene Fragmentmuster mit dem Master-Pattern verglichen, welches gefunden wurde, als von den Familienmitgliedern selbst erhaltene DNAs mit dem Original-Clon analysiert wurden.
Mit dem Zeitpunkt der vorliegenden Anmeldung wurden 45 Clone gefunden, die für die in der Beschreibung ausführlich beschriebenen Zwecke geeignet sind. Informationen über die Clone sind in Tabelle 4 zusammengefaßt und noch genauer in den Tabellen 5-35 dargelegt. In den Tabellen 5-34 ist der Name des Orts, an den der Clon hybridisiert, in Klammem im Titel der Tabellen angeführt. Beispielsweise hybridisiert in Tabelle 5 pYNH24 an den auf dem Chromosom 2 befindlichen D2S44-Ort. Mit anderen Worten, das Insert von pYNH24 stammte von der genomischen DNA am D2S44-Ort des menschlichen Chromosoms 2. Proben von E. coli mit repräsentativen VNTR-Clonen wurden bei The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, wie hierein beschrieben hinterlegt. TABELLE 4

TABELLE 5

VNTR-Clon pYNH24 auf Chromosom 2 (D2S44)

Quelle/Beschreibung: Ein 2,0-kb-MspI-Fragment aus cYNH24, isoliert mit dem HBV- 2-Oligonucleotid, wurde in die AccI-Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: MspI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit > 30 Allelen und Banden zwischen 1,0-5,0 kb. TaqI, BglII, PvuII, PstI und BamHI detektieren auch den Polymorphismus. Nicht polymorph mit RsaI.
Häufigkeit: Mit MspI wurde eine 97%ige Heterozygotie bei 120 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: YNH24 wird mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse dem Chromosom 12 zugeordnet, mit Loci (APOB, D2S6), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation von MspI RFLP wurde bei 44 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normal stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet. pYNH24 enthält Einzelstellen für EcoRI und HindIII; ein EcoRI/HindIII-Doppelverdau liefert zwei Fragmente von 2,7 und 2,1 kb; BglII-Verdau liefert 3,6-kb- und 1,1-kb-Fragmente; und PvuII liefert drei Fragmente mit 2, 3, 1,7 und 0,8 kb. TABELLE 5 (Forts.)

TABELLE 6

VNTR-Clon pCMM101 auf Chromosom 14q(D14S13)

Quelle/Beschreibung: Ein 2,2-kb-MspI-Fragment, isoliert mit dem Myoglobin-2- Oligonucleotid, inseriert in die AccI-Stelle von pUC18.
Polymorphismus: HaeIII detektiert einen Polymorphismus mit > 20 Allelen.
Häufigkeit: Mit HinfI wurde eine 84%ige Heterozygotie bei 120 Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Dem Chromosom 14 zugeordnet.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation bei 60 Dreigenerationenfamilien beobachtet. TABELLE 6 (Forts.)

TABELLE 7

VNTR-Clon pYNZ22 auf Chromosom 17p (D17S30)

Quelle/Beschreibung: Ein 2,7-kb-BamHI-Fragment aus cYNZ22, isoliert mit dem Zeta-Globin-Oligonucleotid, wurde in die BamHI-Stelle von pBR322 subkloniert.
Polymorphismus: MspI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und Banden zwischen 0,5 und 1,3 kb. TaqI, RsaI, BamHI, PstI und HindIII detektieren auch den Polymorphismus. BglII und EcoRI lösen den Polymorphismus nicht optimal auf.
Häufigkeit: Eine 86%ige Heterozygotie wurde bei 120 nichtverwandten Kaukasiern bei HinfI beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Der Locus wurde dem Chromosom 17p mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (D17S1, MYH2, D17Z1), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation wurde bei 30 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normalen Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet. pYNZ22 enthält Einzelstellen für HindIII, EcoRI und SalI; PstI setzt 4,3-kb- und 2,7-kb-Fragmente frei. Eine unabhängige Durchmusterung einer Cosmid-Bibliothek identifizierte cJCZ16.2, von dem im Anschluß gezeigt wurde, daß es eine beträchtliche Sequenz-Homologie mit pYNZ22 aufweist.

TABELLE 8

VNTR-Clon cEFD64 auf Chromosom 3 (D3S42 und D3S46)

Quelle/Beschreibung: cEFD64 wurde mit dem HBV-3-Oligonucleotid isoliert.
Polymorphismus: AluI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit 9 Allelen und Banden zwischen 0,5 und 2,5 kb. RsaI, HaeIII, PstI, TaqI, EcoRI, BamHI, HindIII und PvuII identifizieren auch den Polymorphismus. Nicht polymorph für BgIII.
Häufigkeit: Mit RsaI wurde eine 85%ige Heterozygotie bei 80 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: EFDA64 wurde dem Chromosom 3 mittels Kopplungsanalyse mit zuvor auf diesem Chromosom kartiertem APOD zugeordnet.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation von RsaI-RFLP wurde bei 40 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normalen Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet. Zwei TaqI-Insert-Fragmente von cEFD64 wurden in pUC18 subkloniert. Sie sind als pEFD64.1 (D3S42, ATCC # 59354, 14/4/88) und pEFD64.2 (D3S46, ATCC # 57650, 11/6/87) bezeichnet. Beide hybridisieren an den VNTR-Ort.

TABELLE 9

VNTR-Clon pJZ3.1 auf Chromosom 19 (D19S20)

Quelle/Beschreibung: Ein 4,5-kb-PstI-Fragment aus cJCZ3, isoliert mit dem Zeta- Globin-Oligonucleotid, wurde in die PstI-Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: HinfI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit > 10 Allelen und Banden zwischen 1,4-4,0 kb. MspI, TaqI, RsaI, BglII, BamHI, PstI und PvuII identifizieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Mit HinfI wurde eine 84%ige Heterozygotie bei 120 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: JCZ3.1 wurde dem Chromosom 19 mittels Multipunkt- Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (LDLR, APOC2), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation von HinfI-RFLP wurde bei 45 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normal stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet.

TABELLE 10

VNTR-Clon cYNA 13 auf Chromosom 1 (D1S74)

Quelle/Beschreibung: cYNA13 wurde mit dem YNH24-verwandten Oligonucleotid (GGAGCAGTGGGNTACA) aus einer menschlichen genomischen Cosmid-Bibliothek isoliert.
Polymorphismus: MspI identifiziert einen Polymorphismus mit mehr als 20 Allelen und Banden zwischen 2,0 und 7,0 kb. RsaI, TaqI, BglII, PstI und PvuII detektieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Eine 97%ige Heterozygotie wurde bei 106 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Der Locus wurde dem distalen Chromosom 1q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (NRAS, PGM1, RH), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation wurde bei 53 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: Nach kompetitiver Hybridisierung mit menschlicher Gesamt- DNA wurden RFLPs beobachtet. Der Verdau von cYNA13 mit BamHI liefert 3 Fragmente mit 18,0, 5,0 und 4,1 kb.

TABELLE 11

VNTR-Clon pCMM86 auf Chromosom 17q(D17S74)

Quelle/Beschreibung: Ein 4,3-kb-MspI-Fragment aus cCMM86, isoliert mit dem Myoglobin-2-Oligonucleotid, wurde in die AccI-Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: HinfI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und Banden zwischen 1,0 kb und 3,5 kb. HaeIII, TaqI, MspI, RsaI und BglII detektieren auch den Polymorphismus. Nicht polymorph für PstI.
Häufigkeit: Eine 91%ige Heterozygotie wurde bei 604 Personen beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Der Locus wurde dem Chromosom 17 mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (D17S1, MYH2, D17Z1), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation wurde bei 50 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normalen Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet. Es zeigte sich, daß ein Subclon des Cosmids CMM73 beträchtliche Sequenz-Homologie mit pCMM86 aufwies. Ein Beispiel für Redundanz in Bibliotheken.

TABELLE 12

VNTR-Clon pEKMDA21 auf Chromosom 16 (D16S83)

Quelle/Beschreibung: Ein 3,5-kb-RsaI-Fragment von cEKMDA2 wurde in die HincII- Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: HinfI identifizierte einen Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und Banden zwischen 0,8-1,5 kb. TaqI, RsaI, BglII, PstI, EcoRI, BamHI, HindIII und PvuII identifizieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Eine 89%ige Heterozygotie wurde bei 102 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Dem Chromosom 16 durch Kopplung mit HBZP1 zugeordnet.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation wurde bei 50 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs unter normalen Versuchsbedingungen beobachtet. pEKMD2I enthält keine AccI-Stelle; enthält Einzelstellen für EcoRI und HindIII; BamHI- Verdau liefert 3,4-kb- und 2,9-kb-Fragmente; und PstI liefert 3,4-kb- und 1,0-kb-Fragmente.

TABELLE 13

VNTR-Clon pJCZ67 auf Chromosom 7 (D7S396)

Quelle/Beschreibung: Ein 3,4-kb-MspI-Fragment aus cJCZ67, identifiziert mit dem Zeta-Globin-Oligonucleotid, kloniert in die AccI-Stelle von pUC18.
Polymorphismus: RsaI identifiziert mehr als 10 Allele und Banden zwischen 3,0 und 6,0 kb. MspI, PstI, EcoRI, BamHI, BglII, PvuII und TaqI detektieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Mit MspI wurde eine 83%ige Heterozygotie bei 57 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: JCZ67 wurde dem Chromosom 7 mittels Multipunkt- Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (COLIA2, TCRG), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken. Es befindet sich ~30 cm distal zu YNB3.1R auf 7q.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation für den RsaI-Polymorphismus wurde bei 29 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normal stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet.

TABELLE 14

VNTR-Clon cMHZ47 auf Chromosom 13 (D13S52)

Quelle/Beschreibung: Das Cosmid wurde mit dem YNZ22-Oligonucleotid isoliert.
Polymorphismus: MspI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und Banden zwischen 1,5 und 3,0 kb. TaqI, HaeIII, RsaI, PvuII, EcoRI, BamHI und HindIII detektieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Mit MspI wurde eine 83%ige Heterozygotie bei 99 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: MHZ47 wurde dem distalen Chromosom 13q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (D13S6, D13S1, ESD, D13S4), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken. Es befindet sich ~30cM distal zu p9A7 auf 13q.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation wurde bei 50 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden bei Hybridisierung mit menschlicher Gesamt- DNA beobachtet. Der Verdau von cMHZ47 mit den folgenden Enzymen liefert zahlreiche Fragmente: HindIII-5,9 kb (Dublett), 4,4 kb, 3,5 kb, 0,9 kb; EcoRI-8,2 kb, 6,6 kb, 4,6 kb, 3,1 kb; und TaqI-3,8 kb, 2,0 kb, 1,8 kb, 1,5 kb, 1,2 kb.

TABELLE 15

VNTR-Clon pMLJ14 auf Chromosom 14q (D14S13)

Quelle/Beschreibung: Ein 2,4-kb-MspI-Fragment aus cMLJ14, isoliert unter Verwendung von Myoglobin-1-Oligo, wurde in die AccI-Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: RsaI identifiziert einen Polymorphismus mit > 20 Allelen und Banden zwischen 2-13 kb. MspI, AluI, HaeIII, BglII, TaqI, BamHI, EcoRI, HindIII, PvuII und PstI detektieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Mit RsaI wurde eine 95%ige Heterozygotie bei 102 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: MLJ14 wurde dem Chromosom 14 durch Multipunkt- Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (PI, D14S1, MHZ9, GM, IGHC), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation des Polymorphismus wurde bei 54 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden bei der Hybridisierung mit menschlicher Gesamt-DNA beobachtet. Der Verdau von pMLJ14 mit EcoRI und HindIII liefert ein 2,7-kb- und ein 2,4-kb-Fragment, das mit Einzelstellen für jedes Enzym übereinstimmt.

TABELLE 17

VNTR-Clon pCMM66 auf Chromosom 14 (D14S22)

Quelle/Beschreibung: Ein 4,8-kb-TaqI-Fragment aus cCMM66, isoliert mit dem Myoglobin-2-Oligonucleotid, wurde in die AccI-Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: PstI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und einer variablen Bande zwischen 4,0 und 6,0 kb. RsaI zeigt auch Polymorphismus. Nicht polymorph für MspI oder TaqI.
Häufigkeit: Mit PstI beträgt die Heterozygotie des Locus bei 67 nichtverwandten Kaukasiern 85%.
Chromosomen-Lokalisierung: CMM66 wurde dem Chromosom 14q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (D14S1, GM, PI), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation von PstI-RFLP wurde bei 34 Dreigenerationenfamilien beobachtet.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden bei Hybridisierung mit menschlicher Gesamt- DNA beobachtet.

TABELLE 19

VNTR-Clon cEFD52 auf Chromosom 17q (D17S26)

Quelle/Beschreibung: Das Cosmid wurde mit dem HBV-4-Oligonucleotid isoliert.
Polymorphismus: PvuII löst am besten einen VNTR-Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und Banden zwischen 5,0 und 10,0 kb auf. MspI, HaeIII, AluII, TaqI, RsaI, BglII und PstI detektieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Mit PvuII wurde eine 90%ige Heterozygotie bei 96 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: EFD52 wurde dem Chromosom 17q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (D17Z1, TKl, THH59), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation bei 48 Familien nachgewiesen.
Weitere Anmerkungen: cEFD52 wurde vor der Hybridisierung mit einem Überschuß an menschlicher DNA vorassoziiert. Ansonsten wurden RFLPs unter normalen Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet.

BEISPIEL 21

VNTR-Clon pRMU3 auf Chromosom 17q (D17S24)

Quelle/Beschreibung: Ein BamHI-SacI-Fragment aus cRMUI wurde im Anschluß an BamHI-SacI-Doppelverdau von pUC18 in das größere Fragment subkloniert.
Polymorphismus: PvuII identifiziert einen Polymorphismus mit mehr als 10 Allelen und Banden zwischen 0,7 und 1,3 kb. TaqI arbeitet fast genauso gut und liefert > 6 Allele zwischen 2, 2 und 2,7 kb. MspI, RsaI, BamHI detektieren auch den Polymorphismus. PstI und HindIII lösen den Polymorphismus nicht entsprechend auf.
Häufigkeit: Mit TaqI wurde eine 85%ige Heterozygotie bei 96 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Der Locus wurde dem distalen Chromosom 17q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, wobei bekannt ist, daß sich die Loci (D17Z1, TKI, THH59) über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation bei 48 Dreigenerationenfamilien nachgewiesen.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normaler Hybridisierungsstringenz beobachtet.

TABELLE 23

VNTR-Clon pEFD 126.3 auf Chromosom 9 g (D9S7)

Quelle/Beschreibung: Ein 4,2-kb-BamHI-Fragment aus cEFD126, isoliert mit dem HBV-4-Oligonucleotid, wurde in die AccI-Stelle von pUC18 subkloniert.
Polymorphismus: TaqI löst einen VNTR- Polymorphismus mit 5 Allelen zwischen 1,5 und 2,0 kb auf. BglII, MspI, PstI, PvuII und RsaI detektieren auch den Polymorphismus.
Häufigkeit: Bei TaqI wurde eine 71%ige Heterozygotie bei 111 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: EFD 126.3 wurde dem distalen Chromosom 9q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (ABO, ABL, AK1, ORM), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation bei 56 Dreigenerationenfamilien nachgewiesen.
Weitere Anmerkungen: Die Sonde wurde vor der Hybridisierung mit einem Überschuß an menschlicher DNA vorassoziiert. Ansonsten wurden RFLPs unter normal stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet.

TABELLE 28

VNTR-Clon pMHZ13 auf Chromosom 9 g (D9S13)

Quelle/Beschreibung: Ein 3,3-kb-PvuII-Fragment aus cMHZ13, isoliert mit dem YNZ22-Oligonucleotid, wurde in die HincII-Stelle von pGEM4 subkloniert.
Polymorphismus: PstI identifiziert einen VNTR-Polymorphismus mit 8 Allelen, wobei sich die Allele zwischen 1,6 kb und 2,3 kb befinden. HindIII, RsaI und TaqI lösen den Polymorphismus ebenfalls auf. MspI löst den Polymorphismus nicht entsprechend auf.
Häufigkeit: Mit PstI wurde eine 78%ige Heterozygotie bei 72 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: MHZ13 wurde dem Chromosom 9q mittels Multipunkt- Kopplungsanalyse zugeordnet, mit Loci (ABO, AK1, ABL), von denen bekannt ist, daß sie sich über diese Region erstrecken.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation des PstI-VNTR-Polymorphismus wurde bei 31 Dreigenerationenfamilien nachgewiesen.
Weitere Anmerkungen: Die Sonde wurde mit einem Überschuß an menschlicher DNA vor der Hybridisierung vorassoziiert. Ansonsten wurden RFLPs unter normal stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen beobachtet.

TABELLE 33

VNTR-Clon pTHH59 auf Chromosom 17q (D17S4)

Quelle/Beschreibung: Ein 3,8-kb-PstI-Fragment aus cTHH59, identifiziert mit dem HBV-1-Oligonucleotid, wurde in die PstI-Stelle von pBR322 subkloniert.
Polymorphismus: PvuII löst einen VNTR-Polymorphismus mit 6 Allelen mit Banden zwischen 0,8 kb und 1,8 kb auf. TaqI löst das System fast genauso gut auf, u. zw. mit Allelen zwischen 3,0 und 4,0 kb. RsaI, PstI und EcoRI detektieren auch den Polymorphismus. Nicht polymorph für BglII.
Häufigkeit: Bei PvuII wurde eine 76%ige Heterozygotie bei 100 nichtverwandten Kaukasiern beobachtet.
Chromosomen-Lokalisierung: Der Locus wurde dem Chromosom 17 mittels somatischer Zellhybridanalyse und 17q mittels Multipunkt-Kopplungsanalyse zugeordnet, u. zw. mit einem Locus (TK1), von dem bekannt ist, daß er sich in dieser Region des Chromosoms 17 befindet.
Mendelsche Vererbung: Codominante Segregation des VNTR-Polymorphismus wurde bei 50 Dreigenerationenfamilien nachgewiesen.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter normalen Hybridisierungsbedingungen beobachtet.

TABELLE 35

MCT-Serie von VNTR-Clonen

Quelle/Beschreibung: cMCT4, cMCT14, cMCT15, cMCT32, cMCT96, cMCT103, cMC5105, cMCT113, cMCT117, cMCT127, cMCT129, cMCT136, cMCT144 und cMCT164 wurden unter Verwendung eines Oligo mit alternierenden G- und T-Resten erhalten. Häufigkeit: Jeder Clon zeigte einen hohen Grad an Heterozygotie am jeweiligen Locus.
Weitere Anmerkungen: RFLPs wurden unter Standardbedingungen beobachtet. Die Clone der MCT-Serie hybridisieren zu Orten, die Allele enthalten, welche im allgemeinen eine Größe von weniger als 2 kb haben.
Bei den hierin verwendeten Bibliotheksdurchmusterungsverfahren und beim Durchmustern im allgemeinen ist es nicht unüblich, Clone mit einer beträchtlichen Sequenzhomologie zu erhalten. Eine Bibliothek wird aus der DNA von mehr als einer Zelle oder einem Chromosom bereitet, und manche Sequenzen können aus Zufall, aufgrund von physikalischen Merkmalen der Sequenzen selbst, etc. in der Bank unterrepräsentiert oder überrepräsentiert sein. (Zuvor wurde auf die offensichtliche geringe Menge von VNTR- Clonen in der in einem recA&spplus;-Wirt aufrechterhaltenen Phagen-Bibliothek und die große Fülle an VNTR-Clonen in der in einem recA&supmin;-Wirt aufrechterhaltenen Cosmid-Bibliothek hingewiesen). Daraus ergibt sich, daß Clone exakte Duplikate sein können, einander sehr ähnlich sein können mit Ausnahme einer bis zu einer geringen Zahlt von Basenveränderung(en), oder einander überlappen können. Clone mit beträchtlicher Sequenzhomologie, die von einem einzelnen Ort stammen, können durch Filterhybridisierung der Clone aneinander identifiziert werden, wobei Sequenzdaten verglichen, Orte auf Karten verglichen, Cosegregation der Clonsequenzen bei Mehrgenerationenfamilien herausgefunden werden, etc. Es wurde gefunden, daß mehrere Clone beträchtliche Sequenzhomologie aufweisen und tatsächlich denselben Locus identifizieren, z. B. zeigt pMLJ14 eine Cosegregation mit pCMM101.
Es ist einsichtig, daß die Reihe von Oligos nicht auf Sequenzen beschränkt sein muß, die mit den Consensus-Sequenzen von VNTR-Orten nahe Insulin, Zeta-Globin oder Myoglobin oder verwandt mit dem HB-Virus in Beziehung stehen. Consensus-Sequenzen von Clonen der ersten Generation können als Sonde zur Gewinnung weiterer Clone aus einer Bibliothek verwendet werden. Beispielsweise wurde cYNA13 bei der Durchmusterung mit einem Oligo auf der Basis des Consensus von pYNH24 erhalten; und pMHZ13 und pMHZ47 wurden mit einem Oligo auf der Basis des Consensus von pYNZ22 erhalten. Ein Oligo mit einer wesentlichen Sequenzhomologie mit der Consensus-Sequenz kann nämlich zur Durchmusterung einer Bibliothek verwendet werden.
Es ist weiters für den auf dem Gebiet des Klonierens und Genkartierens geübten Fachmann einsichtig, daß unterschiedliche Clone Polymorphismus an einem einzigen Ort detektieren können. Wenn beispielsweise ein Paar von EcoRI-Stellen ein 7-kb-Fragment definieren, welches direkt im Mittelpunkt dieses Fragments 1-kb-Tandem-Repeats enthält, so gibt es 3-kb-Sequenzen, die die Repeats auf jeder Seite flankieren. Sind diese flankierenden Sequenzen nur einmal vorhanden, könnte jedes 3-kb-Segment oder ein Teil desselben als Sonde zum Nachweis des gleichen Polymorphismus bei einem Verdau von genomischer DNA mit EcoRI verwendet werden. Tabelle 36 stellt die charakterisierten Clone der Erfindung und den Gen-Ort, an dem der Clon seinen Ursprung hat, dar. Das in der Tabelle vermerkte Restriktionsfragment stellt das größte bisher beobachtetet Allel dar. Die Wahl des Enzyms und die Größe des Fragments sind nicht als einschränkend zu betrachten, da die Restriktionsstellen asymmetrisch um die Repeats angeordnet sein können oder andere Restriktionsenzyme mit jeden Locus flankierenden Stellen gefunden werden können, die größere Fragmente liefern. TABELLE 36
Dementsprechend könnte jede nur einmal vorhandene Sequenz, die im 13-kb-PvuII- Fragment enthalten ist, das den von pYNH24 erkannten D2S44-Locus trägt, als Sonde für diesen Locus dienen, u. zw. einschließlich Nucleinsäuren, die D2S44-VNTR-Consensus- Sequenzen tragen oder aber Sequenzen tragen, welche zwischen D2S44 und eine PvuII- Restriktionsstelle fallen. Für den Fachmann ist klar, daß nicht alle Sequenzen allumfassende Verwendung finden. So kann ein Einzelsequenz-Clon des 13-kb-PvuII-Fragments, das 12 kb von D2S44 aufweist, diesen polymorphen Locus nachweisen, wenn die genomische DNA mit PvuII verdaut wird, es detektiert aber keine D2S44-Variante, wenn die genomische DNA mit MspI verdaut wird, die VNTR-enthaltende Fragmente mit einer Größe von 4 kb oder weniger an jenem Locus liefert.
Auch wenn Clone der Repeats selbst aufgrund einer günstigen Hybridisierungskinetik gegenüber Einzelkopie-flankierenden Sonden bevorzugt werden, können Einzelkopie flankierende Clone durch eine Kombination mit Amplifikationsverfahren genauso vorteilhaft wie Repeat-Clone sein. Ein bevorzugtes Amplifikationsverfahren ist die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science (1985) 230, 1350). PCR amplifiziert in vitro definierte Nucleinsäurefragmente. Somit sind geringere Mengen an DNA erforderlich, oder es kann hierbei das Signal aus einer PCR-ampliflzierten flankierenden nur einmal vorhandenen Sequenz nach der Hybridisierung ebenso deutlich und rasch erhalten werden wie jenes, das erhalten wird, wenn Nucleinsäurefragmente verwendet werden, die an die Repeats hybridisieren. Kurzgesagt, die Vorgangsweise erfordert die Basissequenz eines flankierenden Fragments und die Synthese von Oligonucleotiden komplementär zu Sequenzen an gegenüberliegenden Strängen, die bis zu 2000 Basenpaare auseinanderliegen. Die Amplifikation erfolgt bei einem Oligonucleotid-Überschuß durch wiederholte Zyklen von Denaturierung, Hybridisierung und Synthese. Das amplifizierte Nucleinsäurefragment ist durch die Sequenzen begrenzt, an die die Oligos hybridisieren. Mullis & Faloona, Meth Enz (1987) 155, 335.
Ein weiterer Vorteil der hierein beschriebenen VNTR-Clone wird erzielt durch die Kombination des PCR-Verfahrens unter Verwendung von Orten, die mit ausgewählten Restriktionsenzymen Allele von nicht mehr als 2000 bp Länge, vorzugsweise nicht mehr als 1000 bp Länge, liefern. Eine PCR funktioniert gut bei der Amplifikation kleinerer DNA- Fragmente. So werden Oligonucleotide nach nur einmal vorhandenen Sequenzen, die unmittelbar jede Seite der Anhäufung von Repeats flankieren, ausgebildet, und Unterschiede in den Allelen können ohne Hybridisierung nachgewiesen werden. Bei Locus-spezifischen Oligos und ausreichender Amplifikation werden Banden auf mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen im Anschluß an die elektrophoretische Auftrennung nachgewiesen. Unter entsprechenden Bedingungen wird die genetische Identifikation eines Individuums mit diesem Verfahren innerhalb eines Tages nach DNA-Extraktion bewerkstelligt.
Während eine PCR die Empfindlichkeit durch Amplifikation der Target-DNA in vitro erhöht, besteht eine alternative Strategie in der Verstärkung des Signals durch eine konzentrierte Markierung der Target-Stelle. Dies ist beispielsweise möglich durch Anbringen von Mehrfach-Reporter-Molekülen am Klon; durch die Verwendung mehrfacher markierter Clone fix eine Target-Sequenz; durch eine Kombination dieser Schritte, nämlich die Anbringung von Mehrfach-Reporter-Molekülen auf Mehrfach-Clonen fix eine Target- Sequenz; durch den Einsatz von markierten Sekundär-Clonen, die spezifisch für nur einmal vorhandene Sequenzen sind, welche für den an eine Target-Sequenz hybridisierenden Primär- Clon ausgelegt wurden (Dunn & Hassel, Cell (1977) 12, 23); oder durch Amplifikation von hybridisierten Clonen, insbesondere rekombinanten RNAs, die als Matrizen für Qβ-Replikase dienen (Chu et al., Nucl Acid Res (1986) 14, 5591).
Beim indirekten oder Sandwich-Assay von Dunn & Hassel wird ein bifunktioneller Clon erzeugt, beispielsweise einer mit YNH24-Sequenzen und SV40-Sequenzen. Der Clon wird an genomische DNA hybridisiert, und die gebundenen Moleküle werden im Anschluß an eine nachfolgende Hybridisierung mit stark markierten SV40-Clonen sichtbar gemacht. Die markierten Clone können selbst als Substrat dienen. Dies würde nämlich zu einem Netz aus hybridisierten Sequenzen führen, von denen jede ein oder mehr Reporter-Moleküle trägt.
Das Qβ-Replikase-System beruht auf der autokatalytischen Vermehrungsfähigkeit der RNA-gerichteten RNA-Polymerase, Qβ-Replikase, mit einem exponentiellen Reaktionsmechanismus eine große Anzahl an RNA-Fragmenten als Produkt aus einer kleinen Anzahl von Matrizensträngen zu synthetisieren. Eine millionenfache Zunahme der RNA ist nicht unüblich. In einem Qβ-Replicon inserierte Fremdsequenzen ermöglichen die Hybridisierung an genomische Target-Sequenzen. Dann wird das Replicon in der RNA-Polymerase-Reaktion amplifiziert und die Produkt-RNAs werden visualisiert. (Lizardi et al., Biotech (1988) 6, 1197).
Zur Bewerkstelligung der Identifikation von Individuen oder Gewebeproben im Rahmen der Erfindung werden ein oder mehr Orte von Interesse unter Verwendung von Standard-Filterhybridisierungstechniken analysiert. Wie zuvor ausgeführt, wird ein VNTR- Ort mit Mehrfach-Allelen, die häufig in der Population auftreten, bevorzugt.
Zur Einleitung des Testverfahrens wird eine Gewebeprobe erhalten. Es ist einsichtig, daß die Probe jegliche Art von Gewebe enthalten kann. Für die meisten Anwendungen wird wahrscheinlich Blut das Gewebe der Wahl sein. Dies wäre der Fall bei Elternschaftstests und dgl. Für spezielle Zwecke können jedoch auch andere Gewebe, einschließlich Haut, Samen, Haare und anderer Körperflüssigkeiten oder -gewebe akzeptabel sein. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nicht mehr als etwa 10 ul Blut erforderlich, um das Testverfahren auszuführen. DNA kann aus irgendeiner kernhaltigen Zelle, die lebend, tot oder konserviert ist, erhalten werden.
Das Testverfahren verlangt im wesentlichen, daß die Zellen der Gewebeprobe lysiert werden und die aus den lysierten Zellen erhaltene DNA isoliert und mit einem Restriktions enzym gespalten wird. Es sollte einsichtig sein, daß, da die Variabilität an einem VNTR-Ort auf Unterschiede in der Anzahl der Kopien von Tandem-Repeats zurückgeht, jede Restriktions-Endonuclease mit die Repeats flankierenden Stellen den Polymorphismus nachweist. Die in der Beschreibung genannten Enzyme sind repräsentative, aber nichteinschränkende Beispiele für Enzyme, die für einen VNTR-Clon verwendet werden können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind Restriktionsenzyme mit Stellen sehr nahe der Anhäufung von Repeats erwünscht. Das Ergebnis sind kleinere Restriktionsfragmente, die auf Agarosegelen leichter zu unterscheiden sind. Die DNA wird dann auf Gel aufgetragen und unter Verwendung weitläufig bekannter und allgemein akzeptierter Verfahren einer Elektrophorese unterzogen. Die DNA wird dann denaturiert, so daß sie in der Einzelstrangform vorliegt.
An dieser Stelle wird die DNA gemäß der Methode von Southern (J Mol Biol (1975) 98, 503), die auf dem Gebiet weitverbreitet und akzeptiert ist, auf eine Membran transferiert. Alternativ könnte eine PCR, eine Qβ-Replikase oder ein anderes Amplifikationsverfahren wie oben besprochen verwendet werden.
Die so isolierte und denaturierte DNA wird mit einem oder mehr VNTR-Clonen vom oben beschriebenen Typ hybridisiert. Mehrere solche Clone werden nachstehend noch weiter im Detail besprochen. Im Anschluß an das Waschen wird unter Verwendung von Techniken wie eines Membranfilter-Autoradiogramms die Lage des markierten Nucleinsäurefragments ermittelt. Es ist einsichtig, daß, auch wenn hierin die Radiomarkierung des Clons hervorgehoben wird, die Markierung mittels anderer Methoden genauso akzeptabel ist. Die Markierung mit fluoreszierenden Färbemitteln oder mit biotinylierten Nucleotiden funktioniert beispielsweise ebenso gut wie radiomarkierte Sonden. Es ist nur notwendig, daß die Lage des hybridisierten Clons bestimmbar ist.
Die spezifische Lage des hybridisierten Doppelstrangs liefert Informationen betreffend die speziellen Merkmale der DNA. Dies ist aus den Autoradiogrammen ersichtlich, die in den angeschlossenen Fig. 1 bis 6 enthalten sind, welche nachstehend noch detaillierter beschrieben sind. Bei der Verwendung von mehrfachen Clonen für mehrfache VNTR-Orte ist es möglich, eine sehr genaue genetische Identifikation eines Individuums, dem die Gewebeproben entnommen wurden, zu liefern. So ist es möglich, die Ergebnisse mit jenem Individuum oder mit möglichen Eltern oder Nachkommen des Individuums zu vergleichen, um nicht nur das Individuum, sondern auch die Elternschaft des Individuums zu identifizieren.
Mit der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der Elternschaft faktisch mit Gewißheit möglich. Dabei können mehrfache Clone von mehrfachen VNTR-Orten eingesetzt werden. Jeder gewählte Locus hat Mehrfach-Allele, die mit hoher Häufigkeit in der Population auftreten. So wird beim Einsatz einer Mehrzahl von Clonen die Möglichkeit, daß zwei Individuen dieselben Daten produzieren, im wesentlichen gleich Null.
Dieselbe Technik wird angewendet, wenn die Zuordnung einer Gewebeprobe zu einem spezifischen Individuum erwünscht ist. Wird beispielsweise eine Probe eines Gewebes oder einer Körperflüssigkeit am Ort eines Verbrechens gefunden, kann diese Probe unter Verwendung der vorliegenden Erfindung genau einem bestimmten Individuum zugeordnet werden.
Desgleichen ist es im Fall von Knochenmarktransplantationen wünschenswert festzustellen, ob die Krebszellen eines Individuums begonnen haben, sich zu regenerieren. So werden Zellen entnommen und erfindungsgemäß analysiert. Stimmen die Ergebnisse für das Knochenmark mit jenen für den Patienten überein, ist ein Wiederauftreten von Krebszellen möglich. Desgleichen ist klar, daß, wenn die Ergebnisse für das Knochenmark nicht mit jenen für den Empfänger übereinstimmen, nur transplantierte Zellen vorhanden sind.
Zahlreiche andere Anwendungen sind ebenfalls möglich, von denen einige oben diskutiert wurden. Diese können beispielsweise die Bestimmung der Monozygotie gegenüber der Dizygotie bei Zwillingen, die Identifikation von potentiellen Organspendern, Anwendungen in der Gerichtsmedizin, die Identifikation von Krankheitsgenen und die Kartierung des Genoms umfassen.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele veranschaulichen Aspekte der vorliegenden Erfindung. In den Beispielen wurden Standardverfahren wie die von Maniatis et al., supra; Meth Enz, supra: Wyman & White, supra; und Litt & White, supra beschriebenen nachgearbeitet.

Beispiel 1

Oligonucleotide wurden entsprechend der Sequenz von Genen synthetisiert, von denen man weiß, daß sie sich wie an Insulin, Zeta-Globin oder Myoglobin gekoppelte VNTR-Orte verhalten, oder mit ausreichender Sequenzhomologie, um sich potentiell wie VNTR-Orte zu verhalten. Die Endmarkierung der Oligos erfolgte gemäß Standardverfahren.
Ein bis zwei Genom-Äquivalente (d. h. 75.000-150.000) einer Cosmid-Bibliothek wurden plattiert und auf Nylonfilter übertragen. Der Hybridisierungspuffer enthielt 5 · SSC, 0,05 M Tris-HCl mit pH 7,4, 1 · Denhardtsche Lösung und 0,01 mg/ml Hefe-tRNA. Die Sequenz- und Versuchsbedingungen für jedes Oligo entsprachen den in Tabelle 1 aufgelisteten.
372 Cosmide, ermittelt mit den Oligonucleotiden, wurden unter Verwendung genomischer DNAs aus sechs nichtverwandten Individuen auf Polymorphismus untersucht. Zu Beginn wurden die Proben mit jeder einer Vielzahl von Restriktionsendonucleasen, einschließlich MspI, TaqI, RsaI, BamHI, BglII, PstI, EcoRI, HindIII, PvuII, HinfI, HaeIII und AluI, verdaut. Das Ziel bestand darin, jenes Restriktionsenzym zu identifizieren, das sowohl die größte Anzahl an Allelen als auch die kleinsten offenbarte und daher DNA-Fragmente am genauesten auflöste. Restriktionsenzym-Verdaus, Agarosegel-Elektrophorese, DNA-Blotting auf eine Nylonmembran, Radiomarkierung von VNTR-Clonen und Filterhybridisierungs- Assays wurden gemäß Standard-Protokollen durchgeführt. Fig. 1 zeigt eine Reproduktion von Autoradiogrammen mit repräsentativen Daten. Die Fotos veranschaulichen Muster, die typisch für einen VNTR-Locus sind, wie sie die Hybridisierung mit einem vollständigen Cosmid hervorbringt.

Beispiel 2

Die Segregation von VNTR-Allelen am YNH24-(D2S44)-Locus in einer Dreigenerationenfamilie ist in Fig. 2 dargestellt. Aus peripherem Blut bereitete DNA-Proben wurden nach Standardverfahren aufgearbeitet. Restriktionsverdaus erfolgten mit MspI. 3 ug jedes Verdaus wurden pro Bahn aufgebracht und die Fragmente getrennt. Die herkömmliche Autoradiographie zeigte die vom Clon detektierten Allele. Das Muster stimmte mit der Segregation eines codominanten Merkmals mit 8 Allelen, das in der Familie vorhanden war, überein.
Beispiel 2 zeigt die Mendelsche Vererbung des von pYNH24 nachgewiesenen Gens. Die Allele und daher die Chromosomenbereiche, innerhalb derer sie eingebettet sind, können eindeutig durch die ganze Familie verfolgt werden. Beispielsweise ist die Großmutter mütterlicherseits heterozygot am YNH24-Locus mit den Allelen 1 und 5. Das Allel 1 wurde von ihrer Tochter geerbt, die es an vier ihrer Kinder weitergibt. Es ist einsichtig, daß, gäbe es ein mit dem YNH24-Locus eng verknüpftes dominantes Krankheitsgen, die Krankheit bei jedem dieser Individuen ausbrechen würde.

Beispiel 3

Beispiel 3 beschreibt die Charakterisierung der Allel-Häufigkeit ausgewählter VNTR- Loci. Clone, die in der Voruntersuchung eine große Anzahl von Allelen detektierten, wurden mit anderen Restriktionsenzymen neuerlich getestet. DNA-Proben aus nichtverwandten Individuen wurden nach den Empfehlungen des Herstellers gespalten. Die verdauten DNA- Proben wurden auf Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylonmembran transferiert. Fig. 3 enthält Autoradiogramme, die die Daten bezüglich JCZ16.2 und EFD52 darstellen. Die Daten zeigen deutlich, daß VNTR-Loci, die von diesen Clonen identifiziert wurden, Mehrfach-Allele tragen. Dementsprechend kann der identifizierte VNTR-Locus mit Mehrfach-Allelen bei der genetischen Identifikation und bei Elternschaftstests nützlich sein.

Beispiel 4

Beispiel 4 zeigt, wie die Vaterschaft unter Verwendung von VNTR-Loci bestimmt werden kann. Zuallererst werden der Vaterschaftsindex und die Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft ermittelt. X bedeutet die Chance eines behaupteten Vaters, der biologische Vater eines Kindes zu sein. Y bedeutet die Chance einer willkürlichen Person, der biologische Vater des Kindes zu sein. Der resultierende Vaterschaftsindex (PI = X/Y) ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit, daß der behauptete Vater der biologische Vater ist. Die Bayessche Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft schließt eine a-priori-Wahrscheinlichkeit von üblicherweise 0,5 ein. Somit ändert sich die Formel auf PI = 1/(1 + Y/X). (Es wird angenommen, daß die Mutter die biologische Mutter ist).
Beim vorliegenden Beispiel wurden eine Mutter, ein Kind und zwei mutmaßliche Väter unter Verwendung von erfindungsgemäßen VNTR-Clonen durchgemustert. Es wurden insbesondere pYNH24, pYNZ22, pCMM101, pJCZ3.1 und pEKMDA21 verwendet. Die unter Verwendung dieser Clone erhaltenen Daten sind nachstehend zusammengefaßt. (Die X- und Y-Werte werden auf Basis der Mendelschen Vererbung der Allele errechnet. Die Allele sind zwecks Identifikation numeriert, somit war die Mutter für die Allele 33 und 86 am YNH24-Locus heterozygot.
Es ist evident, daß Vater 1 mit ziemlicher Sicherheit der Vater des Kindes ist. Die Allele in der linken Spalte für das Kind wurden von der Mutter geerbt. Jedes der Allele in der rechten Spalte wurde vom Vater des Kindes geerbt. So erbte das Kind für YNH24 33 von der Mutter und 35 vom Vater. Vater 1 ist für 35 homozygot und Vater 2 trägt zwei andere Allele an diesem Ort.
Unter Anwendung der oben ausgeführten Berechnungen ist der Vaterschaftsindex X/Y = 2,46 · 10&sup5;. Die Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft ist daher 99,9996%. Die Wahrscheinlichkeit, daß Vater 2 der tatsächliche Vater ist, ist praktisch Null.
Es ist entsprechend einsichtig, daß die vorliegende Erfindung die Möglichkeit einer richtigen und genauen Identifikation der Vaterschaft bietet.

Beispiel 5

VNTR-Clone wurden zur Bestimmung verwendet, ob ein Verdächtiger im Fall einer Vergewaltigung der vermeintliche Vergewaltiger ist.
Bei der Untersuchung einer Vergewaltigung wurden eine Samenprobe und eine Haarprobe genommen. Später wurde ein Verdächtiger verhaftet. Haare, Samen und eine Blutprobe wurden gemäß dem hierin beschriebenen Protokoll durchgemustert. Es wurden die Clone pMLJ 14, pYNH24, pCMM101 und pJCZ3.1 verwendet. Die Ergebnisse der Durchmusterung sind in der folgenden Tabelle dargestellt, wobei die Zahlen speziellen mit den DNA-Clonen nachgewiesenen Allelen entsprechen.
Auf der Basis der Ergebnisse des obigen Tests ist es möglich, den Schluß zu ziehen, daß die Samenproben vom Verdächtigen stammen, nicht aber die Haare. Es ist ersichtlich, daß jedes Allel der Samenprobe mit der Blutprobe des Verdächtigen übereinstimmte, wogegen keines der Allele aus der Haarprobe zum Verdächtigen paßte. Dementsprechend kann festgestellt werden, daß der Verdächtige tatsächlich der Vergewaltiger ist.
Es ist somit einsichtig; daß die vorliegende Erfindung Clone und Verfahren zur Verwendung in der Gerichtsmedizin schafft.

Beispiel 6

Es ist wünschenswert festzustellen, ob sich Krebszellen im Mark des Empfängers einer Knochenmarktransplantation regeneriert haben. Hierzu sind VNTR-Clone nützlich.
Um die Bestimmung durchführen zu können, wurden Blutproben und Markproben genommen. Die DNA der beiden Proben wurden unter Verwendung der Clone pEKMDA21, cEFD64, cYNA13 und pCMM101 durchgemustert. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt.
Daraus kann geschlossen werden, daß es zu keiner signifikanten Regeneration der Krebszellen im Knochenmark gekommen ist.

Beispiel 7

Es wurde ein Vaterschaftstest unter Verwendung des Clons pJCZ3.1 und des Restriktionsenzyms HinfI durchgeführt. DNA-Proben der Mutter, des Fötus und des vermeintlichen Vaters wurden genommen. Das Ergebnis des Vaterschaftstests ist in Fig. 4 veranschaulicht. In der linken Bahn ist das Ergebnis der Analyse der DNA der Mutter, in der mittleren Bahn das Ergebnis der Analyse des Fötus und in der rechten Bahn das Ergebnis der Analyse des Vaters dargestellt. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß der Fötus VNTR-Allele von der Mutter und vom Vater geerbt hat.

Beispiel 8

Es wurde ein Vaterschaftstest unter Verwendung des Clons pJCZ16.2 und des Restriktionsenzyms HinfI durchgeführt. DNA-Proben der Mutter, des Fötus und des vermeintlichen Vaters wurden genommen. Das Ergebnis des Vaterschaftstests ist in Fig. 5 veranschaulicht. In der linken Bahn ist das Ergebnis der Analyse der DNA der Mutter, in der mittleren Bahn das Ergebnis der Analyse des Fötus und in der rechten Bahn das Ergebnis der Analyse des Vaters dargestellt. Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß der Fötus VNTR-Allele sowohl von der Mutter als auch vom Vater geerbt hat.

Beispiel 9

Es wurde ein Vaterschaftstest unter Verwendung des Clons pYNH24 und des Restriktionsenzyms AluI durchgeführt. DNA-Proben der Mutter, des Fötus und des vermeintlichen Vaters wurden genommen. Das Ergebnis des Vaterschaftstests ist in Fig. 6 veranschaulicht. In der linken Bahn ist das Ergebnis der Analyse der DNA der Mutter, in der mittleren Bahn das Ergebnis der Analyse des Fötus und in der rechten Bahn das Ergebnis der Analyse des Vaters dargestellt. Aus Fig. 6 ist zu sehen, daß der Fötus VNTR-Allele sowohl von der Mutter als auch vom Vater geerbt hat.

Beispiel 10

Ein flankierender Clon, der die Tandem-Repeats nicht enthält, kann einen VNTR- Locus nachweisen, wenn das Restriktionsfragment die nur einmal vorhandene flankierende Sequenz und die Anhäufung von Repeats enthält. pCMM101 und pCMM66 stammten von demselben Cosmid. pMLJ14 stammte von einem anderen Cosmid. Die Kartierungsdaten offenbarten, daß alle drei Clone auf dem Chromosom 14 liegen, und tatsächlich cosegregierten die Clone in Dreigenerationenfamilien. Eine anschließende Restriktionskartierung und Sequenzierung der Clone ergaben die Identität von pCMM101 und pMLJ14. Die Inserts dieser Clone tragen Repeat-Sequenzen. pCMM66 trägt jedoch keine Repeat- Sequenzen und stammte aus einer die Anhäufung von Tandem-Repeats flankierenden Region. Während pCMM101 und pMLJ14 den Polymorphismus in MspI-verdauter genomischer DNA detektieren, tut pCMM66 dies nicht. Der Grund dafür liegt darin, daß die von pCMM66 erkannte flankierende Sequenz außerhalb der kleineren MspI-VNTR-haltigen Fragmente fällt.

Beispiel II

Ein Ideogramm und geschlechtsspezifische Kopplungskarten von HSA14 (menschliches Chromosom 14) sind in Fig. 7 dargestellt. Durch eine Kombination von Techniken wurden 10 Gene an 14q32.1-tel kartiert. Die Gene PI und MCOC12 begrenzen diese Region, die wahrscheinlich mehr Gene enthält als in der Figur dargestellt sind. Die relativen Abstände zwischen den Genen stehen mit der Wahrscheinlichkeit eines Crossover zwischen den Genen in Verbindung. Je näher beisammen die Gene, desto geringer die Wahrscheinlichkeit eines Crossover zwischen diesen Genen. D14S22, das durch pMLJ14 definiert ist, befindet sich 19cM von PI und 2cM von CMM62. Im unteren Teil ist ein Diagramm, das die wahrscheinlichste Gen-Reihenfolge, wie sie aus der Segregationsanalyse dieser Gene in veränderlichen Kombinationen innerhalb von Familien ermittelt wurde, zeigt. Die nebeneinanderliegende Gene überbrückenden Verhältniszahlen stellen die Chancen dar, daß die dargestellte Gen-Reihenfolge stimmt.

Beispiel 12

Ein Ideogramm und geschlechtsspezifische Kopplungskarten von HSA17 sind in Fig. 8 dargestellt. In diesem Fall sind die Gen-Loci nicht auf eine spezifische Region beschränkt, sondern erstrecken sich entlang der Chromosomenlänge. So kartiert 144-D6(21) zu 17p13, 3.6(11) zur centromeren Region und KKA35(14) nahe dem Telomer von 17q. 5 VNTR-Loci kartieren zum Chromosom 17 - D17S30 (YNZ22), D17S74 (CMM86), D17S4 (THH59), D17S26 (EFD52) und D1724 (RMU3).

Beispiel 13

Eine partielle Basissequenz eines CMM101-Allels wurde erhalten, indem eine Reihe von DNase-I-Deletionsfragmenten erzeugt und die gegenüberliegenden Stränge durch das Kettenterminationsverfahren von Sanger et al., supra, sequenziert wurden. Im folgenden ist eine Teilsequenz von einem der Fragmente angeführt: Polylinker -
Die Repeat-Einheiten sind unterstrichen und durch Abstände voneinander getrennt. Es sei bemerkt, daß die Einheit 14 oder 15 Basen enthält und daß manche Monomere ein zusätzliches Dinucleotid enthalten. Der Consensus des von dem obengenannten Fragment abgeleiteten komplementären Strangs und anderer Fragmente ist 5'-

Beispiel 14

Eine partielle Basissequenz eines EFD126.3-Allels ist wie folgt: flankierende
Das Repeat an diesem Ort ist eine 28- 30bp-Einheit mit einer sichtbaren hierarchischen Reihenfolge. Jede Einheit besteht selbst aus zwei Einheiten, einer konservierten 14bp-Region, die durch die obigen Abstände begrenzt ist, und einer divergenten 14-16bp-Region, die oben durch Abstände begrenzt und unterstrichen ist. Ein Beispiel für die konservierte Region einer der Einheiten ist 5'-
Die danebenliegende divergente Region dieser Einheit ist

Zusammenfassung

Die meisten der in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallenden VNTR-Clone wurden aus Cosmid-Bibliotheken durch Hybridisierung mit speziellen Oligonucleotidsonden isoliert. Beispiele für die Oligonucleotide schließen jene mit ein, die auf den Consensus- Sequenzen von VNTR-Orten nahe Zeta-Globin, Myoglobin und Insulin und mit Bezug zum Hepatitis-B-Virus basieren.
Die Clone der vorliegenden Erfindung identifizieren spezielle Loci innerhalb des Genoms. Durch die Auswahl der Clone, die Stellen mit Mehrfach-Allelen identifizieren, welche häufig in der Population auftreten, wird auf einfache Weise ein System entwickelt, mit dem ein Individuum oder ein Teil desselben mit ziemlicher Gewißheit identifiziert werden kann. Beispielsweise wird erwartet, daß bei Verwendung von fünf verschiedenen Loci mit zehn Allelen in einer panmiktischen Population, in der jedes Allel eine Häufigkeit von etwa 0,1 hat, die Häufigkeit von Individuen mit einem spezifischen Muster nicht größer als 1 in 300 Millionen ist. Infolgedessen ist eine falsche Identifikation unwahrscheinlich.
Die genaue Methode der genetischen Bestimmung ist in mehreren unterschiedlichen Zusammenhängen von Nutzen. Wie oben erwähnt, ist die spezifische genetische Identifikation nützlich zur Bestimmung der Elternschaft. Andere Bereiche, in denen das System der vorliegenden Erfindung seine Anwendung findet, schließen die Bestimmung der Monozygotie gegenüber Heterozygotie bei Zwillingen, die Überwachung von Knochenmarktransplantationen, die Gerichtsmedizin, die Identifikation von Krankheitsgenen und die Genkartierung ein. In jedem dieser Zusammenhänge ist eine Identifikation mit ziemlicher Gewißheit möglich.
Es ist einsichtig, daß die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen in Form unterschiedlicher Ausführungsformen, von denen nur einige oben veranschaulicht und beschrieben wurden, zum Umsatz gelangen können. Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne von der Idee oder den wesentlichen Merkmalen derselben abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsformen sind in jeder Hinsicht nur als illustrativ und nicht als einschränkend zu betrachten. Der Umfang der Erfindung ist daher in den angeschlossenen Ansprüchen und nicht in der voranstehenden Beschreibung aufgezeigt. Sämtliche Änderungen, die innerhalb der Bedeutung und den Bereich der Äquivalenz der Ansprüche fallen, sollen vom Rahmen der Erfindung umschlossen sein.

Claims

1. DNA-Sequenz, die einen Nucleinsäureabschnitt enthält, der Mehrfachkopien einer im allgemeinen tandemartig organisierten Einheit anfaßt, wobei die Einheit eins Länge von 3 Basenpaaren bis zu 40 Hasenpaaren oder mehr besitzen kann (abgekürzt als VNTR), und die Teil eines Clons ist, wobei der Clon aus der Gruppe bestehend aus pCMM66 (ATCC 59370), pJCZ16.2 (ATCC 57658), pJCZ67 (ATCC 59362), pCMM101 (ATCC 59372), pEFD126.3 (ATCC 57624), cMHZ47 (ATCC 59366), pMHZ13 (ATCC 59278), cYNA13 (ATCC 59364), pYNH24 (ATCC 57570), pYNZ22 (ATCC 57574), pRMU3 (ATCC 57564), pEKMDA21 (ATCC 57554) und den 14 in der Probe enthaltenen Clonen, die bei der ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer ATCC 67881 erhalten hatte, ausgewählt ist.

2. Nucleinsäuresequenz, die eine variable Anzahl von Tandem- Repeats enthält und die unter hoch stringenten Bedingungen an einen einzelnen Ort, der durch die VNTR-enthaltenden DNA- Sequenzen von Anspruch 1 spezifiziert ist, hybridisieren.

3. Kit zur Identifizierung eines Individuums, das mindestens zwei DNA-Sequenzen wie in Anspruch 1 spezifiziert enthält.

4. Kit zur Identifizierung eines Individuums, das mindestens zwei Nucleinsäuresequenzen umfaßt, wobei jede Sequenz unter hoch stringenten Bedingungen an verschiedene einzelne Orts, die durch die DNA-Sequenzen von Anspruch 1 spezifiziert sind, hybridisiert.

5. Verfahren zur Identifizierung eines Individuums, umfassend die Stufen

a) Erhalt einer DNA-Probe von einem Individuum; und

b) Analyse der DNA, indem man daran eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 2 hybridisiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5 zur Identifizierung eines Individuums, umfassend weiter die Stufen der Analyse einer von einem unbekannten Individuum stammenden DNA-Probe und vergleichen der Ergebnisse dieser Analyse mit den Ergebnissen der Analyse von dem bekannten Individuum erhaltenen DNA, um zu bestimmen, ob beide DNA-Proben von dem gleichen Individuum stammen.

7. Verfahren zur genetischen Identifizierung von Individuen, umfassend die Stufen

a) Erhalt einer Gewebeprobe;

b) Isolieren der DNA aus dieser Gewebeprobe;

c) Zugabe eines Restriktionsenzyms zu des isolierten DNA, so daß die DNA an den DNA-Restriktionsspaltstellen gespalten wird;

d) Auftrennen der so erhaltenen DNA-Fragmente;

e) Denaturieren der DNA-Fragmente, so daß sie in einzelsträngiger Form vorliegen;

f) Hybridisieren der DNA-Fragmente an ein markiertes einzelsträngiges Nucleinsäurefragment, wobei das Fragment eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 2 umfaßt; und

g) Nachweis dar Lokalisierung des markierten Nucleinsäurefragments.

8. Verfahren zur Identifizierung eines Menschen unter Verwendung einer Probe menschlicher DNA, umfassend die Stufen

a) Erhalt einer Probe menschlicher DNA und Spalten der Probe an ihren Restriktionsspaltstellen;

b) Auftrennen der so erhaltenen DNA-Fragmente;

c) Hybridisieren der DNA-Fragmente an eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 2 in markierter Form; und

g) Nachweis der Lokalisierung der Sonde.

9. Verfahren zur Bestimmung der Elternschaft, umfassend die Stufen

a) Erhalt einer DNA-Probe, die von dem möglichen Elternteil isoliert wurde,

b) Erhalt einer DNA-Probe, die von den möglichen Rind isoliert wurde,

c) Analyse mindestens eines spezifischen VNTR-Orts in jeder DNA-Probe durch Hybridisieren der DNA an eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 2; und

d) Vergleichen der Ergebnisse der Analyse, um zu bestimmen, ob der VNTR-Ort des möglichen Kindes von dem möglichen Elternteil beigesteuert werden konnte.

10. Clon-Zusammensetzung, die einen oder mehrere der Clone pCMM66 (ATCC 59370), pJCZ16.2 (ATCC 57658), pJCZ67 (ATCC 59362), pCMM101 (ATCC 59372), pEFD126.3 (ATCC 57624), cMHZ47 (ATCC 59366), pMHZ13 (ATCC 59278), cYNA13 (ATCC 59364) und die 14 in der Probe- enthaltenen Clone, die bei dar ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer ATCC 67881 erhalten hatte, umfaßt.

11. Clon-Zusammensetzung, die einen oder mehrere der Clone pYNH24 (ATCC 57570) und pYNZ22 (ATCC 57574) umfaßt.

12. Clon-Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, Wobei nicht mehr als ein Clon einen chromosomalen Arm abbildet.