DE69629570T2

DE69629570T2 - 3'utr des menschliches prohibitin-gens

Info

Publication number: DE69629570T2
Application number: DE69629570T
Authority: DE
Inventors: T. Robert DELL'ORCO; R. Eldon JUPE; Keith J. MCCLUNG; Xiao-Tie Liu; L. Robert KING
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: DK0837935T3; WO1996040919A1; EP0837935A1; US7259251B1; US5776738A; US5922852A; AU6265396A; CA2224014A1; ATE247709T1; EP0837935B1; AU713814B2; ES2205046T3; DE69629570D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft die 3'-untranslatierte Region des antiproliferativen humanen Prohibitin-Gens. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der 3'-untranslatierten Region als Screening-Werkzeug zur Bestimmung der Suszeptibilität für Krebs und als ein therapeutisches Mittel.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Tumorsuppressorgene sind eine Klasse von Genen, die auf der Grundlage einer Verbindung zwischen Neoplasien und dem Funktionsverlust in beiden Kopien des Gens identifiziert worden sind. Von den 15 bis 20 Tumorsuppressorgenen, die bis heute identifiziert worden sind, sind das Retinoblastom, p53 und der Wilms-Tumor in dem größten Umfang untersucht worden.
Es wird postuliert, dass Prohibitin, ein evolutionär konserviertes Gen, das antiproliferative Aktivität aufweist, ein Tumorsuppressorgen ist, dessen Expression, wenn sie verloren geht, zur Immortalisierung von Zellen aus einer oder mehreren der vier Komplementationsgruppen, die von Pereira-Smith vorgeschlagen worden sind, beiträgt. Jupe et al., Exp Cell Res 218: 577–580 (1995). Seine Sequenz steht jedoch in keiner Beziehung zu jener von irgendeinem anderen zuvor klonierten Tumorsuppressorgen. Nuell et al., Mol Cell Biol 11: 1372–1381 (1991).
Aufgrund der intrazellulären, antiproliferativen Aktivität von dessen Genprodukt und dessen Tumorsuppressorpotential ist das Prohibitin-Gen umfassend untersucht worden. Ein Prohibitin aus der Ratte ist von McClung et al. beschrieben worden. McClung et al., Biochem Biophys Res Comm 164: 1316–1322 (1989). Die erste Prohibitin-cDNA voller Länge war auf der Grundlage einer höheren Expression von Prohibitin-mRNA in sich nicht teilenden Leberzellen der Ratte als in sich regenerierenden Leberzellen der Ratte isoliert worden. Es war nachfolgend berichtet worden, dass Prohibitin-mRNA, welche in eine Zelle durch Mikroinjektion eingeführt wurde, die DNA-Synthese blockierte und dass eine Mikroinjektion eines Antisinn-Oligonukleotids Zellen stimulierte, sich zu teilen. Die Volllängen-Sequenz der Ratten-Prohibitin-cDNA wurde von Nuell et al. beschrieben. Nuell et al., Mol Cell Biol 11: 1372-1381 (1991).
Das humane Prohibitin-Gen wurde unter Verwendung von sowohl einer Kartierung einer hybriden Maus-Mensch-Zelllinie als auch einer in situ-Hybridisierung mit menschlichen Metaphasen-Chromosomen auf dem Chromosom 17q21 lokalisiert. White et al., Genomics 11: 228-230 (1991). Diese Region liegt sehr nahe bei der Lage des Genorts für den familiär gehäuft auftretenden Brustkrebs (BRCA 1), und Prohibitin wurde anfänglich als ein Kandidatengen angesehen (Black, D., und Solomon, E., Trends in Genetics 9: 22–26 (1993)); jedoch haben neuere genetische und zytogenetische Kartierungsstudien Prohibitin als das BRCA 1-Gen ausgeschlossen. Black et al., Am J Hum Genet 52: 702–710 (1993).
Es ist darüber berichtet worden, dass das humane Prohibitin-Gen auf der mRNA-Ebene in normalen menschlichen Zellen als zwei Transkripte von 1,2 kb und 1,9 kb exprimiert wird. Liu et al., Biochem Biophys Res Comm 201: 409–414 (1994). Der Unterschied zwischen den beiden Transkripten ist eine Sequenz von ungefähr 750 Nukleotiden, welche sich 3' des Endes des 1,2 kb-Transkripts befindet. Trotz dieser Unterschiede kodieren beide für das gleiche Protein. Analysen haben gezeigt, dass das 1,9 kb-Transkript in menschlichen Populationen während der G1/S- und S-Phasen des Zellzyklus in einem größeren Ausmaß exprimiert wird (Liu et al., Biochem Biophys Res Comm 201: 409–414 (1994)) und dass dieses Transkript in immortalisierten Zellpopulationen, welche von menschlichen Tumoren abgeleitet worden sind, überexprimiert wird. Jupe et al., Exp Cell Res 218: 577–580 (1995).
Speziell ist Prohibitin offensichtlich an dem Prozess der Immortalisierung bei einer Gruppe von menschlichen Zellen beteiligt, welche in die Komplementationsgruppe B, welche von Olivia Pereira-Smith vorgeschlagen worden ist, eingestuft werden. Zellen, die in diese Gruppe eingestuft werden, zeigen einen einzigartigen Prohibitin-Genotyp. Nach einer Southern-Analyse von EcoRIverdauter DNA unter Verwendung einer Sonde für Intron 4 von Prohibitin zeigte DNA aus Gruppe B-Zellen nur eine Bande bei 5 kb. Auf die gleiche Weise analysierte normale DNA zeigt eines von drei Bandenmustern: zwei Banden, eine bei 5 und eine bei 7 kb; eine Bande bei 5 kb; oder eine Bande bei 7 kb. White et al., Genomics 11: 228–230 (1991); Tokino et al., Internatl J Onco 3: 769-772 (1993); Jupe et al., Exp Cell Res 218: 577–580 (1995). DNA aus in die anderen Gruppen (A, C, D) eingestuften Zellen zeigt eines von zwei Bandenmustern, entweder eine 7 kb-Bande oder eine 7 kbund eine 5 kb-Bande, wobei die 7 kb-Bande ein stärkeres Signal ergibt; jedoch zeigt keine Probe aus diesen Komplementationsgruppen nur die 5 kb-Bande. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Prohibitin als zwei Allele existiert, von denen eines eine zusätzliche EcoRI-Schnittstelle enthält und durch eine 5 kb-Bande bei einer Southern-Analyse gekennzeichnet ist. Da nur in die Gruppe B eingestufte immortalisierte Zellen gleichförmig homozygot für das die 5 kb-Bande ergebende Allel sind, ist dieses Allel als das B-Typ-Allel bezeichnet worden und das andere Allel, welches die 7 kb-Bande ergibt, ist als das Nicht-B-Typ-Allel bezeichnet worden. Dementsprechend erweist sich, dass der Verlust von Heterozygotie eine Rolle bei der zellulären Immortalisierung von Gruppe B-Zellen spielt.
Es ist über eine humane Prohibitin-cDNA, umfassend 134 Nukleotide unmittelbar 3' des Stopkodons der kodierenden Sequenz, berichtet worden. Zusätzlich wurden Mutationen, die in Exon 4 und Exon 5 dieser Sequenz vorkommen, in Material, welches von vier von dreiundzwanzig sporadischen menschlichen Brusttumoren gewonnen worden war, gefunden. Sato et al., Cancer Res 52: 1643–1646 (1992). Eine Untersuchung der vier am höchstgradigen konservierten Exons des Prohibitin-Gens (Exons 4 bis 7) aus ausgehend von Blutproben von sechsundsiebzig Patienten mit familiär gehäuft auftretendem Brustkrebs gereinigter DNA fand keine Veränderungen in der Prohibitin kodierenden Region, aber sie fanden zwei zusätzliche intronische Polymorphismen, einen in Intron 4 und einen in Intron 5. Es gab jedoch keinen Hinweis darauf, das irgendeiner der Patienten eine Keimbahn-Veränderung der konservierten Prohibitin-Genregion trug. Es wurde geschlossen, dass Mutationen in dem Prohibitin-Gen in keinem Zusammenhang mit der frühzeitig auftretenden, familiär gehäuft auftretenden Form der Krankheit standen. Tokino et al., Internatl J Oncol 3: 769–772 (1993).
Im Rahmen einer umfassenderen Untersuchung wurde ein RNase-Schutz-Assay verwendet, um 120 primäre Brusttumore zu screenen, die einen Verlust von Heterozygotie für den langen Arm von Chromosom 17 zeigten und/oder von Patienten, deren Alter jünger als 35 war, gewonnen worden waren. Dieser Assay wurde auch verwendet, um bei einer Anzahl von Eierstock-, Leber- und Lungentumoren auf Prohibitin-Veränderungen zu testen. Es wurde eine zusätzliche Mutation bei einem der Brusttumore und keine Mutationen bei jeglichen der anderen Proben gefunden. Die Forscher schlossen, dass somatische Mutationen in Prohibitin mit sporadischen Brusttumoren in Zusammenhang stehen könnten, aber bei einer großen Anzahl von anderen Tumoren, einschließlich frühzeitig ausbrechendem Brustkrebs, möglicherweise keinen Faktor darstellen. Sato et al., Genomics 17: 762–764 (1993). Diese Schlussfolgerung wurde durch zwei zusätzliche Untersuchungen bestätigt. Cliby et al. fanden keine Mutationen in den Prohibitin-Exons 4 oder 5 aus zwanzig menschlichen Eierstocktumoren (Cliby et al., Gynecologic Oncology 50: 34–37 (1993)) und Asamoto und Cohen waren nicht in der Lage, Prohibitin-Mutationen in cDNAs aus einer Reihe von Blasentumoren von der Ratte und Tumorzelllinien zu finden (Asamoto, M., und Cohen, S. M., Cancer Let 83: 201–207 (1994)).
Obwohl diese Studien Nachweise präsentierten, die ein Fehlen einer jeglichen Beziehung zwischen vererbtem Brustkrebs und Prohibitin-Mutationen anzeigten, blieb eine unbeantwortete Frage, ob eine Verbindung zwischen Prohibitin-Mutationen und sporadischem oder spät ausbrechendem Brustkrebs besteht. Die berichteten Studien hinsichtlich der Beziehung zwischen Prohibitin-Mutationen und sporadischem oder spät ausbrechendem Brustkrebs konzentrierten sich jedoch auf die kodierende Region des Gens und ob deren Mutation(en) mit der Entwicklung von kanzerösen Tumoren korrespondierte(n).
Es ist jetzt festgestellt worden, dass Mutationen in der 3'-untranslatierten Region (UTR) des B-Typ-Allels die Diagnose einer erhöhten Suszeptibilität für Krebs, insbesondere Brustkrebs, ermöglichen. Demzufolge kann das Vorhandensein (oder das Fehlen) von diesen Mutationen als ein Screening-Werkzeug für den frühzeitigen Nachweis und die Behandlung von Krebs verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann das erneute Einführen einer normalen 3'-UTR in Tumore in einem frühen Stadium als ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein gereinigtes Nukleinsäurefragment, das einen isolierten Abschnitt der 3'-untranslatierten Region (3'-UTR) des Prohibitin-Gens umfasst, wobei der Abschnitt 1 Nukleotid 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens beginnt und 939 Nukleotide 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens endet.
In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein gereinigtes Nukleinsäurefragment, das einen isolierten Abschnitt der 3'-UTR des Prohibitin-Gens umfasst, wobei der Abschnitt 155 Nukleotide 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens beginnt und 939 Nukleotide 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens endet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung bestimmte Nukleinsäurefragmente der Wildtyp- und mutierten 3'-UTR des humanen Prohibitin-Gens.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung die Verwendung der Wildtyp-3'-UTR des Prohibitin-Gens in Assays, welche die Diagnose einer Suszeptibilität für Krebs ermöglichen, und als therapeutische Mittel für die Behandlung von Krebs.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Balkendiagramm, welches die Hemmung des Fortschreitens des Zellzyklus durch Mikroinjektion von Prohibitin-Transkripten in normale und immortalisierte Zellen zeigt. Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts aus wenigstens drei Experimenten. Die Proben sind, wie folgt, bezeichnet: N,CF-3, normale HDF; A,EJ, Blasenkarzinom; B,HeLa, Zervixkarzinom; C,TE85, Osteosarkom; und D,A1698, Blasenkarzinom.
2 ist ein Balkendiagramm, welches den Effekt auf das Fortschreiten des Zellzyklus durch Mikroinjektion von verkürzten Prohibitin-Transkripten in menschliche diploide Fobroblasten (CF-3) zeigt. Schemata der Transkripte sind unter der Figur gezeigt: 1,9 kb vollständige Länge (ausgefüllt); verkürzt, Sinn (sense; horizontale Linien); verkürzt, Antisinn (antisense; leer); Wildtyp-3'-UTR mit 852 Basen (schraffiert); und mutierte 3'-UTR mit 852 Basen aus HeLa (diagonale Linien). Die Werte sind als der Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts von drei separaten Experimenten dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Verteilung des Prohibitin-Genotyps in der allgemeinen Population und dessen Verteilung in Tumoren, vorzugsweise Brusttumoren, kann verwendet werden, um ein zweiteiliges Screening auszuführen, durch welches die Wahrscheinlichkeit eines Individuums, Krebs zu entwickeln, vorhergesagt werden kann. Diese Wahrscheinlichkeiten würden von jenen mit einer sehr geringen Wahrscheinlichkeit bis zu jenen mit einer extrem hohen Wahrscheinlichkeit reichen. Bei Individuen, die hinsichtlich der beiden Prohibitin-Allele heterozygot sind, würde vorhergesagt werden, dass bei diesen ein geringes Risiko besteht, Krebs zu entwickeln. Diese Wahrscheinlichkeit würde für jene, die hinsichtlich des B-Typ-Allels homozygot sind und die einen Defekt in der 3'-UTR von wenigstens einem der Allele aufweisen, zunehmen. Dementsprechend würde das Screening in zwei Teilen erfolgen.
Der erste Teil bestünde in einer Bestimmung des Prohibitin-Genotyps eines Individuums unter Verwendung von z. B. einer der folgenden Techniken: Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifizierung einer 191 bp-Region, welche die Intron 5/Exon 6-Verbindungsstelle umgibt, und eine Einzelstrangkonformationspolymorphismus (SSCP)-Analyse des resultierenden Fragments; PCR-Amplifizierung einer 76 bp-Region, welche die Intron 5/Exon 6-Spleißstelle umgibt und Verdau des resultierenden Fragments mit BsmAI-Endonuklease; und/oder RFLP-Assays von genomischer DNA auf Southern-Blots, wenn ausreichende Mengen DNA zur Verfügung ste hen. Für jene, die als homozygot hinsichtlich des B-Typ-Allels identifiziert worden sind, würde ein zweites Screening auf Veränderungen in der 3'-UTR ausgeführt werden. Beispielsweise würde eine Sequenzierung der 3'-UTR spezielle Rasenveränderungen gegenüber der Wildtyp-Sequenz identifizieren. Alternativ könnte, wenn Sequenzanalysen spezielle Basenveränderungen in der Hauptzahl der Proben identifizieren, eine RFLP-Analyse entwickelt werden, wenn diese Basenveränderungen zu dem Verlust oder dem Hinzukommen einer speziellen Schnittstelle führten. Zusätzlich würden SSCP-Analysen von verschiedenen Abschnitten der gesamten 3'-UTR nach einer PCR-Amplifizierung der Regionen vorgenommen werden.
Wenn ein Screening in jungem Alter vorgenommen wird, wird eine verstärkte Überwachung zu früherem Nachweis, früherer Behandlung und verbessertem Überleben führen. Zusätzlich besteht die Vorstellung, dass das erneute Einführen einer normalen 3'-UTR in Tumoren in frühem Stadium von therapeutischem Wert sein würde.
Um den Prohibitin-Genotyp eines Individuums zu bestimmen, kann genomische DNA, z. B. aus Blutlymphozyten, durch Standardtechniken, wie von Castilla et al. beschrieben (Castilla et al., Nature Genetics 8: 387–391 (1993)), isoliert werden. Nach der Präparation von genomischer DNA, vorzugsweise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird die Region, welche Intron 5/Exon 6 enthält, unter Verwendung von PCR amplifiziert. Die PCR wird vorzugsweise unter den in Beispiel 1 erläuterten Bedingungen ausgeführt. Mehr bevorzugt wird entweder ein .76 bp-Fragment oder ein 191 bp-Fragment, welches Intron 5/Exon 6 umfasst, unter Verwendung der in Beispiel 6 offenbarten Sinn- und Antisinn-Primer erzeugt.
Ist die Intron 5/Exon 6-Region einmal amplifiziert worden, wird der Genotyp unter Verwendung einer Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse und/oder eines Einzelstrangkonforma tionspolymorphismus (SSCP)-Assays bestimmt, vorzugsweise wie in den Beispielen 8 bzw. 9 beschrieben. Alternativ kann der Prohibitin-Genotyp durch Southern-Analyse von menschlicher genomischer DNA, welche mit EcoRI verdaut wird und mit einem markierten Fragment aus Intron 4 als Sonde hybridisiert wird, bestimmt werden. Eine Southern-Analyse identifiziert zwei unterschiedliche Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen in der menschlichen Population. Individuen sind homozygot für ein Allel, welches eine 7 kb-Bande produziert (Nicht-B-Typ-Allel), oder ein Allel, welches eine zusätzliche EcoRI-Stelle in einem Intron aufweist, welches eine 5 kb- und eine 2 kb-Bande produziert (B-Typ-Allel). Genomische DNA aus menschlichen Zellen wird durch Standardmethoden, wie jene, die in Beispiel 1 beschrieben werden, isoliert. Die Restriktionsverdaue werden gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt und unter Verwendung einer Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Intron 4-Sonde kann durch Standard-PCR-Amplifizierung hergestellt werden. In Beispiel 1 werden Vorgehensweisen beschrieben unter Verwendung eines Sinn-Primers, welcher aus den ersten 18 Basen am 5'-Ende eines 230 bp-Segments von Intron 4 besteht (SEQ ID NO: 1), und eines Antisinn-Primers, welcher aus den zu den letzten 18 Basen am 3'-Ende dieses 230 bp-Segments komplementären Basen besteht.
Bei jenen, die als homozygot hinsichtlich des B-Typ-Allels identifiziert worden sind, können Veränderungen in der 3'-UTR bestimmt werden, indem die 3'-UTR durch PCR amplifiziert und diese dann unter Verwendung eines SSCP- und/oder eines RFLP-Assays, vorzugsweise eines SSCP-Assays untersucht wird. Eine PCR-Amplifizierung der 3'-UTR wird vorzugsweise unter den in Beispiel 1 erläuterten Bedingungen unter Verwendung der in Beispiel 4 erläuterten Sinn- und Antisinn-Primer ausgeführt, während die SSCP-Analyse der 3'-UTR vorzugsweise ausgeführt wird, wie in Beispiel 13 beschrieben. Alternativ können Veränderungen in der 3'-UTR durch Sequenzieren der 3'-UTR-Region, vorzugsweise wie in Beispiel 1 beschrieben, bestätigt werden.
Wenn bei einem Individuum auf der Grundlage des oben angegebenen Tests ein hohes Risiko identifiziert wird, kann eine Wildtyp-3'-UTR erneut in die Tumore eingeführt werden, vorzugsweise gemäß Beispiel 11.
Obwohl die Erfindung anhand der in den Beispielen beschriebenen Methoden und Materialien beschrieben worden ist, versteht es sich, dass es ohne weiteres im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet liegt, diese Standardmethoden und -materialien zu modifizieren, so dass diese deren speziellen Anforderungen genügen.
Beispiele
Der Beziehung zwischen Homozygotie bezüglich des B-Typ-Allels, d. h. des 5 kb-Allels, und Zellen, welche als zugehörig zu der Komplementationsgruppe B eingestuft werden, wurde nachgegangen unter Verwendung einer Einzelstrangkonformationspolymorphismus (SSCP)-Analyse nach einer PCR-Amplifizierung der kodierenden Region des humanen Prohibitin-Gens aus mehreren immortalisierten Populationen, einschließlich der folgenden vier Zelllinien, welche als zugehörig zur Gruppe B eingestuft werden: Zervixkarzinom, transformierte Hautfibroblasten, Glioblastom und Blasenkarzinom (Tabelle 1). Die Daten zeigen, dass der EcoRI-RFLP-Marker genetisch verknüpft ist mit einem anderen Marker, welcher anfänglich als ein Einzelstrangkonformationspolymorphismus (SSCP) in PCR-Produkten, welche Exon 6 und einen Teil von den dieses flankierenden Introns enthalten, nachgewiesen worden ist. (Siehe Beispiel 9). Eine Sequenzierung zeigte, dass die kodierende Region aus diesen Populationen identisch war mit jener der kodierenden Region von normaler menschlicher DNA, welche ausgehend von norma len Zelllinien und ausgehend von zugekauften normalen Gewebeproben erhalten worden ist (Tabellen 2, 3, 4 und 5).
Eine ähnliche Analyse von ausgewählten Regionen des Prohibitin-Gens aus einer begrenzten Anzahl von Brustkrebs-Zelllinien (Tabelle 6) zeigte ebenfalls, dass die Protein-kodierende Region des Prohibitin-Gens in diesen Zellen offensichtlich unverändert war; jedoch zeigten alle DNA-Proben, welche so eingestuft werden, dass sie von hinsichtlich des B-Typ-Allels homozygoten Zellen stammen, eine Bandenverschiebung, wenn eine PCR-Amplifizierung von Exon 6 analysiert wurde. Klonierung und DNA-Sequenzierungsanalyse dieser Region zeigten, dass diese Bandenverschiebung das Ergebnis eines Basenunterschieds in Intron 5 (c/g), welcher 12 Nukleotide 5' der Intron/Exon-Verbindungsstelle mit Exon 6 auftritt, ist. In dem B-Typ-Allel fehlt eine BsmAI-Schnittstelle, während die Stelle in dem Nicht-B-Typ-Allel vorhanden ist. Das B-Typ-Allel wird durch zwei Marker, das Vorhandensein der zusätzlichen Intron-EcoRI-Stelle und das Fehlen der Intron-BsmAI-Stelle, definiert. Im Gegensatz dazu fehlt Nicht-B-Typ-Allelen die EcoRI-Stelle und diese haben die BsmAI-Stelle.
Obwohl beide dieser RFLPs zuvor erkannt worden sind, war weder ihre genetische Verknüpfung noch ihre Relevanz hinsichtlich der Immortalisierung von Zellen ermittelt worden. Die Bedeutung dieser Prohibitin-Marker für Brustkrebs war im Rahmen einer Reihenuntersuchung von 17 Brustkrebs-Zelllinien unter Verwendung der oben beschriebenen EcoRI- und BsmAI-RFLPs untersucht worden (Jupe et al., Proc Am Assoc Cancer Res 36: 569 (1995)). Diese Reihenuntersuchung identifizierte 14 homozygote B-Typ-Linien und 3 nichthomozygote Nicht-B-Typ-Linien. Keine der Brustkrebs-Zelllinien hatte einen heterozygoten Genotyp.
In einer anderen Studie erwiesen sich siebzehn von zweiundzwanzig Brustkrebs-Zelllinien, welche von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten worden waren, als homozygot hinsichtlich des Allels, welches für Zellen, welche zu der Komplementationsgruppe B gehören, charakteristisch ist. (Siehe Tabelle 7) Keine erwies sich hinsichtlich der beiden Prohibitin-Allele als heterozygot. Im Gegensatz dazu sind ungefähr 50% der normalen Individuen (200 untersucht) heterozygot hinsichtlich der beiden Allele. Nur Zellen, die hinsichtlich des B-Typ-Allels homozygot sind, sprechen auf die antiproliferative Aktivität von Prohibitin an. Jupe, E. R., et al., Exp Cell Res (im Druck).
Aufgrund der Beziehung zwischen der Homozygotie des B-Typ-Allels in Gruppe B-Zellen, der 80%-igen Inzidenz dieses Genotyps in Brustkrebs-Zelllinien und der Zunahme der Expression des 1,9 kb-Transkripts in immortalisierten Zellen wurde eine Analyse der 3'-UTR, bestehend aus der vollständigen Nukleotidsequenz 3' des Endes der das 1,2 kb-Transkript kodierenden Sequenz, vorgenommen. Anfängliche Sequenzierungsdaten zeigen, dass diese Region aus He-La-Zellen (SEQ ID NO: 2), welche als Gruppe B eingestuft werden, vier Basenveränderungen zeigt im Vergleich zu Klonen derselben Region aus den Folgenden: (1) einer normalen menschlichen Fibroblasten-Zelllinie, IMR-90, welche hinsichtlich des Wildtyp-B-Typ-Allels homozygot ist (SEQ ID NO: 3); und (2) einer immortalisierten Zelllinie, CMV-Mj-HEL-1, welche in Gruppe C eingestuft wird und hinsichtlich des Nicht-B-Typ-Allels homozygot ist. Die mutierten Nukleotide der HeLa-Zellen befanden sich an den Positionen 353, 355, 384 und 602 (SEQ ID NO: 2).
Es wurden auch Nukleotidsequenzinformationen ausgehend von drei Zelllinien, die von Brusttumoren abgeleitet worden waren, erhalten. Jede dieser Zelllinien, BT-20, MCF-7 und SK-BR-3, ist homozygot hinsichtlich des B-Typ-Prohibitin-Allels und wird dement sprechend in die Komplementationsgruppe B eingestuft. Zusätzlich zeigt jede 3'-UTR-Sequenzen, die sich von dem Wildtyp-Prohibitin-Gen unterscheiden. Mutierte Basen wurden bei MCF-7 an den Positionen 236 und 729 (SEQ ID NO: 4) und in BT-20 an den Positionen 758 und 814 (SEQ ID NO: 5) gefunden. In SK-BR-3-Zellen wurden 35 Basenveränderungen nachgewiesen. (Siehe Tabelle 8).
Die Bedeutung dieser Basenveränderungen wird betont durch Ergebnisse, welche ausgehend von klinischen Brusttumorproben erhalten worden sind. DNA aus vier Brusttumoren, erhalten von Dr. F. Schaefer vom Chapman Institute aus Tulsa, OK, und aus Brusttumoren und entsprechendem normalem Gewebe aus vier Patienten isolierte DNA, erhalten vom Cooperative Human Tissue Network der National Institutes of Health, wurden hinsichtlich ihres Prohibitin-Genotyps analysiert [Chapman Sample Numbers (Probennummern): BC 102, BC 103, BC 104, BC 105; Cooperative Human Tissue Network Sample Numbers (Probennummern): 4001490-H (Tumor) und 4001490-Q (normal), 4001536-AT (Tumor) und 4001536-AY (normal), 94-09-C214 (Tumor) und 94-09-C217 (normal), 94-10-B009 (Tumor) und 94-10B008 (normal)]. Alle Proben, sowohl aus Tumoren als auch aus normalem Gewebe, erwiesen sich als homozygot hinsichtlich des B-Typ-Allels. Wenn die Nukleotidsequenz der 3'-UTR aus einer Tumorprobe (BC 102) bestimmt wurde (SEQ ID NO: 6), wurde festgestellt, dass sie sich von dem Wildtyp an Base 729 unterschied. Die Tumorprobe enthielt eine Basenveränderung von C zu T, was identisch ist mit einer der zwei Veränderungen, welche bei der Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 nachgewiesen worden sind. Wenn zusätzlich die 3'-UTR-Sequenz aus einer zweiten Tumorprobe (4001536-AT) bestimmt wurde (SEQ ID NO: 7), unterschied sie sich ebenfalls von der Wildtyp-Sequenz durch eine einzige Base. In dieser Probe war Base 821 von A zu G verändert.
Diese Sequenzierungdaten legen nahe, dass es zwei Bereiche gibt, bei denen die höchste Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie mutiert werden. Sie erstrecken sich von ungefähr Nukleotid 200 bis ungefähr Nukleotid 400 und von ungefähr Nukleotid 600 bis ungefähr Nukleotid 852.
Das Auftreten dieser Basenveränderungen in der 3'-UTR von Brustkrebszellen, welche aufgrund ihrer Homozygotie hinsichtlich des B-Typ-Prohibitin-Allels als zugehörig zu der Komplementationsgruppe B eingestuft werden, kombiniert mit dem Genotyp und 3'-UTR-Sequenzanalysen ausgehend von Patienten mit Brusttumoren bestätigt, dass der Prohibitin-Genotyp und die 3'-UTR-Sequenz zumindest als Screening-Merkmale für die Suszeptibilität für Brustkrebs und als ein therapeutisches Mittel für die Behandlung von Krebs verwendet werden können.
Zusätzlich ist festgestellt worden, dass nur normale Zelllinien und Gruppe B-Zelllinien (Tabelle 1) am Fortschreiten durch den Zellzyklus durch die Mikroinjektion des 1,9 kb-Transkripts von dem Gen gehemmt werden konnten. (Siehe z. B. 1). Es wurde des weiteren bestimmt, dass nur normale Zellen durch die Mikroinjektion des humanen 1,2 kb-Transkripts gehemmt werden konnten.
In vier Experimenten zeigten normale CF-3-Zellen, bei denen eine Mikroinjektion mit dem humanen 1,2 kb-Transkript vorgenommen worden war, eine 47,8 ± 2,1%-ige Hemmung, während HeLa-Zellen aus der Gruppe B eine nicht signifikante Hemmung von 6,3 ± 1,8% zeigten. Wir haben auch festgestellt, dass vierzehn von siebzehn Zelllinien, welche von menschlichen Brustkrebsspezies abgeleitet worden waren, den gleichen Prohibitin-Genotyp wie Zellen aus der Komplementationsgruppe B hatten. Es wurden drei Brustkrebs-Zelllinien mit dem Gruppe B-Prohibitin-Genotyp. (BT20, SK-BR-3 und MCF-7) getestet und bei diesen wurde das Fortschreiten durch den Zellzyklus durch die Mikroinjektion des 1,9 kb-Transkripts in einem Ausmaß von 57,7, 43,6 bzw. 25,4 gehemmt, während eine Brustkrebs-Zelllinie (BT549), welche den Genotyp einer anderen Komplementationsgruppe aufweist, nicht gehemmt wurde. Die drei Brustkrebs-Zelllinien, welche den B-Typ-Genotyp exprimieren, wurden durch Olivia Pereira-Smith als zugehörig zu der Gruppe B eingestuft, während die eine Zelllinie, die hinsichtlich des Nicht-B-Typ-Allels homozygot war, auf der Grundlage der Zellen-Mortalin-Anfärbungsmuster in Gruppe D eingestuft wurde. Wadhwa et al., Exp Cell Res 216: 101–106 (1995).
Die antiproliferative Aktivität von verkürzten Wildtyp-RNAs und 3'-UTR-spezifischen Wildtyp- und mutierten RNAs wurde ebenfalls unter Verwendung des Mikroinjektionsassays in CF-3-Zellen untersucht. (Siehe Beispiel 14). Transkripte wurden sowohl in der Sinn- als auch der Antisinn-Orientierung ausgehend von einem verkürzten Klon, welchem ungefähr 150 bp vom 5'-Ende der ProhibitinmRNA fehlten, der 852 Basen-Wildtyp-3'-UTR und der mutierten 852 Basen-HeLa-3'-UTR hergestellt. Dem verkürzten Sinn-Transkript fehlen Translationssignale wie auch die AUG-Startstelle und die die ersten 40 Aminosäuren des Prohibitin-Proteins kodierende RNA. Das Sinn-Transkript von diesem Klon war in der Lage, das Fortschreiten durch den Zellzyklus stark zu hemmen, während das Antisinn-Transkript im wesentlichen keine Wirkung hatte. Die verkürzte RNA, welche nur die 3'-UTR-Sequenz enthält, beginnt ungefähr 80 Basen stromabwärts des UGA-Stopkodons. Die Wildtyp-3'-UTRspezifische RNA hemmt die Zellproliferation in einem ähnlichen Ausmaß zu jenem, das bei der 1,9 kb-Volllängen-mRNA und dem Sinn-Transkript der längeren vekürzten RNA festgestellt wird. Die mutierte 3'-UTR aus HeLa hatte jedoch wenig oder keine inhibitorische Aktivität. Dementsprechend zeigen diese funktionalen Assays, dass die Wildtyp-Prohibitin-3'-UTR allein eine signifikante inhi bitorische Aktivität aufweist und dass Mutationen in dieser Region diese Aktivität beseitigen. (Siehe 2).

Diese Studien zeigen, dass der Prohibitin-Genotyp und die 3'-UTR-Sequenz sich als nützlich als ein generisches Krebs-Suszeptibilitäts-Screeningmerkmal und als ein therapeutisches Mittel für eine Anzahl von Krebsarten zusätzlich zu deren Nützlichkeit als ein Suszeptibilitäts-Screeningmerkmal und therapeutisches Mittel für Brustkrebs erweisen sollten. Tabelle 1 – Gruppe B-Zelllinien

Bezeichnung	Herkunft
1.HeLa	Zervixkarzinom
2. GM2096SV9	Durch SV-40 mit "origin"-Defekt immortalisierte Fibroblasten aus Xeroderma pigmentosum-Haut
3. T98G	Glioblastom
4. J82	Blasenkarzinom

Tabelle 2 – Normale menschliche Fibroblasten-artige Zelllinien

Bezeichnung	Herkunft
1.CF-1	Vorhaut von Neugeborenem
2. CF-2	Vorhaut von Neugeborenem
3. HFMD	Vorhaut von Neugeborenem
4. AG4525	Embryonale Haut
5. IMR90	Embryonale Lunge
6. IMR91	Embryonale Lunge
7. JAS	Vorhaut von Neugeborenem
8. FeSin	Embryonale Haut
9. WLW	Vorhaut von Erwachsenem
10. GM-1	Haut von Erwachsenem
11. GM-2	Haut von Erwachsenem
12. GM970B	Haut von Neugeborenem
13. SW1427	Embryonale Lunge
14. OS38A	Vorhaut von Erwachsenem
15. OS40A	Vorhaut von Erwachsenem
16. OS53A	Vorhaut von Erwachsenem
17. OSFP	Fötale Haut
18. CF-3	Vorhaut von Neugeborenem
19. WI-38	Embryonale Lunge

Tabelle 3 – DNA-Proben aus normalem menschlichem Gewebe
Tabelle 4 – DNA-Proben aus Lymphozytenkulturen aus ausgedehnten Familien-Stammbäumen

Tabelle 5 – DNA aus Blutproben

Bezeichnung	Herkunft
1. CF154	Blut
2. CF148-1	Blut
3. CF142-3	Blut
4. CF147	Blut
5. CF140	Blut
6. CF152-1	Blut
7. CF155	Blut
8. CF156-1	Blut
9. CF158	Blut
10. CF139	Blut
11. CF153	Blut
12. CF138	Blut
13. CF150-1	Blut
14. CF151-1	Blut
15. CF143	Blut
16. CF137	Blut
17. CF145-2	Blut
18. CF159	Blut
19. CF146-1	Blut
20. CF157	Blut

Tabelle 6 – Menschliche Brustkrebszelllinien

Bezeichnung	Herkunft
1. BT-20	Solider Tumor – duktales Karzinom
2. BR-474	Solider Tumor – duktales Karzinom
3. BR-483	Solider Tumor – duktales Karzinom
4. MCR-7	Pleuraerguss – Adenokarzinom
5. Hs 578T	Solider Tumor – duktales Karzinom
6. SK-BR-3	Pleuraerguss – Adenokarzinom
7. T-47D	Pleuraerguss – Adenokarzinom
8. UACC-812	Solider Tumor – duktales Karzinom
9. ZR-75-30	Aszitesflüssigkeit – duktales Karzinom
10. ZR-75-1	Aszitesflüssigkeit – duktales Karzinom
11. MDA-MB-330	Pleuraerguss – lobuläres Karzinom
12. MDA-MB-361	Gehirnmetastasen – Adenokarzinom
13. MDA-MB-415	Pleuraerguss – Adenokarzinom
14. MDA-MB-453	Pleuraerguss – Adenokarzinom
15. MDA-MB-435S	Pleuraerguss – duktales Karzinom
16. BT-549	Lymphknoten – duktales Karzinom
17. MDA-MB-436.	Pleuraerguss – Adenokarzinom

Tabelle 7 – Prohibitin-Genotyp von Brustkrebs-Zelllinien¹
Tabelle 8 – Prohibitin-3'-UTR-Mutationen in drei homozygoten B-Brustkrebs-Zelllinien
Die Sequenz der Brustkrebs-Zelllinien wurde mit der Wildtyp-Sequenz von normalen humanen diploiden Fibroblasten (4, GenBank Auf. #U49725) verglichen. Sowohl in den BT-20- als auch den MCF7-Zellen sind zwei Basenveränderungen vorhanden, aber in den SK-BR3-Zellen werden 35 Basenveränderungen (einschließlich einer Deletion von 3 Basen) nachgewiesen. Fünfundsiebzig Prozent der Veränderungen treten in den letzten 200 Basen der Sequenz auf und 36% der Basenveränderungen sind C- zu T-Übergänge.
Beispiel 1 – Isolierung der 3'-UTR des humanen Prohibitin-Gens
Die 3'-UTR des humanen Prohibitin-Gens wurde basierend auf dem hohen Konservierungsausmaß zwischen den Genen aus der Ratte und dem Menschen identifiziert und isoliert. Oligonukleotide, welche ausgehend von der hochgradig konservierten nicht-kodierenden Exon 7-Region des Gens aus der Ratte und des humanen Gens gestaltet worden waren, wurden als 5'-Primer (SEQ ID NO: 8) zusammen mit einem 3'-Primer, welcher ausgehend von der veröffentlichten Sequenz aus der Ratte gestaltet worden war (SEQ ID NO: 9), verwendet. Das spezielle 3'-UTR-Fragment wurde unter Verwendung der unter Standardreaktionsbedingungen unter Verwendung der Empfehlungen des Herstellers für Stoffel-Polymerase (Perkin Elmer) ausgeführten Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science 230: 1350-1354 (1985)) (welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) synthetisiert. Genomische DNA aus normalen menschlichen diploiden Fibroblasten (IMR-90), welche durch Standardmethoden (Groos-Bellard et al., Eur J Biochem 36: 32) (welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) isoliert wurde, wurde als Matrize für die PCR verwendet. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95°C für 2 min erfolgten 35 Zyklen von 95°C, 55°C und 72°C für jeweils eine Minute in einem Perkin Elmer 480-Thermal Cycler-Gerät. Die Reaktionsprodukte wurden auf Spezifität durch Analyse auf mit Ethidiumbromid angefärbten und unter Verwendung von ultraviolettem Licht sichtbar gemachten Agarosegelen überprüft.
Die ausgehend von den anfänglichen Wildtyp-Proben und nachfolgenden mutierten Proben gewonnenen PCR-Produkte wurden allesamt in den TA-Klonierungsvektor pCR-II^TM (Invitrogen Corp., San Diego, CA) kloniert, indem den Anweisungen des Herstellers gefolgt wurde, und es wurden unter Verwendung von Standard-Antibiotikaselektionsprotokollen, welche mit dem pCRII^TM (Invitrogen Corp., San Diego, CA)-Klonierungskit bereitgestellt worden waren, rekombinante Klone gewonnen. Diese Plasmide weisen auch die M13-Vorwärts- und -Rückwärts-Primerstellen für eine bequeme Sequenzierung von Klonen auf.
Kandidatenklone für die humane Prohibitin-cDNA, welche den 3'-UTR-Abschnitt des Transkripts in voller Länge enthielten, wurden gleichfalls ausgehend von einem cDNA-Bibliotheks-Screening unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde (SEQ ID NO: 9) isoliert. Suggs et al., Proc Natl Acad Sci 78: 6613 (1981), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Ausgehend von dem Screening isolierte positive Klone wurden durch Restriktionskartierung charakterisiert. Humane Klone ausgehend von dem genomischen PCR-Produkt und cDNAs, welche Transkripte repräsentierten, welche die vollständige 3'-UTR enthalten, wurden unter Verwendung des "ABI Tag cycle sequencing"-Protokolls (Perkin Elmer, Norwalk, CT) sequenziert. Ein Alignment der Sequenzen erfolgte unter Verwendung der GCG-Pakete der University of Wisconsin. Die cDNA- und genomischen Sequenzen waren identisch, wodurch gezeigt wird, dass die vollständige 3'-UTR (SEQ ID NO: 10) ausgehend von dem Genom ohne Introns transkribiert wird.
Beispiel 2 – Isolierung von 1,2 und 1,9 kb-Prohibitin-Transkripten
Die zwei humanen Prohibitin-Transkripte wurden anfänglich durch Northern-Analyse nachgewiesen und ihre Expressionsniveaus charakterisiert. Liu et al., Biochem Biophy Res Comm 201: 409–414 (1944), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird; Jupe et al., Exp Cell Res 218: 577–580 (1995), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Die Klonierung und Isolierung der cDNAs ausgehend von den 1,9 kb-Transkripten wird oben in Beispiel 1 beschrieben. Im Verlauf dieser Screenings wurden unabhängig davon Klone des 1,2 kb-Transkripts, die dem zuvor beschriebenen humanen Klon entsprechen, erhalten. Sato et al., Cancer Res 52: 1643–1646 (1992).
Beispiel 3 – Präparation von humaner Prohibitin-cDNA
Die humanen Prohibitin-cDNAs wurden isoliert und charakterisiert, wie in Beispiel 1 oben beschrieben. Alle in dieser Anmeldung beschriebenen Plasmidklone wurden unter Verwendung einer Standard-Präparation mit einer Lyse mittels Kochen (Holmes und Quigley, Anal Biochem 114: 193–197 (1981), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) oder der alkalischen Lyse-Methode, kombiniert mit einer Anionenaustauschersäulen-Reinigung unter Verwendung von Quiagen Tips (Quiagen, Incorporated, Chatsworth, CA) gereinigt.
Beispiel 4 – PCR-Amplifizierung der 3'-UTR
Die PCR-Bedingungen für eine Amplifizierung der 3'-UTR werden in Beispiel 1 beschrieben. Der Primersatz, der erfolgreich verwendet worden war, um diese 852 bp-Region ausgehend von allen Wildtypund mutierten Proben zu klonieren, war, wie folgt:
Sinn-Primer: 5'-CCCCAGAAATCACTGTG-3' (SEQ ID NO: 8)
Antisinn-Primer: 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (SEQ ID NO: 9)
Beispiel 5 – Sequenzierung
Alle Sequenzierungsreaktionen erfolgten unter Verwendung einer automatisierten Sequenzierung durch die ABI-Methoden (siehe Beispiel 1 oben).
Beispiel 6 – PCR-Amplifizierung von Exon 6
Die PCR-Reaktionen wurden unter den gleichen Temperatur- und Zyklusbedingungen, die in Beispiel 1 erläutert worden sind, ausgeführt. Die Primer, die verwendet wurden, um ein 191 bp-Fragment zu erzeugen, waren, wie folgt:
Sinn-Primer: 5'-CAATCACACTGCCTCATC-3' (SEQ ID NO: 11)
Antisinn-Primer: 5'-TGAGTGCCGGAGAAAGGG-3' (SEQ ID NO: 12)
Die Primer, die verwendet wurden, um ein 76 bp-Fragment zu erzeugen, waren, wie folgt:
Sinn-Primer: 5'-CAATCACACTGCCTCATC-3 (SEQ ID NO: 11)
Antisinn-Primer: 5'-CCGCTTCTGTGAACTCC-3' (SEQ ID NO: 13)
Beispiel 7 – Klonierung und Sequenzierung von Exon 6
Die Produkte von Exon 6-PCR-Reaktionen wurden in den in Beispiel 1 oben beschriebenen TA-Klonierungsvektor kloniert. Die Sequenzierung dieser klonierten Produkte wie auch die direkte Sequenzierung von Exon 6-PCR-Produkten sind ausgeführt worden, wie in Beispiel 5 oben beschrieben.
Beispiel 8 – RFLP-Assay von Exon 6
Der in Exon 6 identifizierte Sequenzpolymorphismus führt zu einer unterschiedlichen Spaltung durch das Restriktionsenzym BsmAI, welches von New England Biolabs (Beverly, MA) erhältlich ist. Das B-Typ-Allel wird durch das Enzym nicht gespalten, wohingegen das Nicht-B-Typ-Allel dies wird. Diese Verdaue wurden an den in Beispiel 6 beschriebenen PCR-Produkten gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt und unter Verwendung einer Agarosegelelektrophorese auf 4%-igen NuSieve-Gelen, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert.
Beispiel 9 – SSCP-Analyse von Exon 6
Ursprünglich wurde ein Einzelstrangkonformationspolymorphismus (SSCP)-Screening verwendet, um Exon 6-Polymorphismen in Prohibitin nachzuweisen. Jupe et al., Exp Cell Res 218: 577–580 (1995), welche in dieser Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Die verwendete Methode war ein kaltes SSCP-Protokoll. Hongyo et al., Nuc Acids Res 21: 3637–3642 (1993), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. PCR-Produkte wurden synthetisiert und überprüft, wie oben beschrieben, und nur jene, die eine einzelne vorhergesagte Bande zeigten, wurden für eine SSCP-Analyse ausgewählt. Die DNA-Produkte für eine SSCP-Analyse wurden dann einer Denaturierung in Formamidlösung bei 95°C unterworfen und schnell auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden dann auf 10 oder 20%-Polyacrylamidgelen aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht.
Beispiel 10 – Isolierung und Sequenzierung von DNA aus zusätzlichen 3'-UTR-Proben
Die bei der Identifizierung, Klonierung, Isolierung und Sequenzierung aller zusätzlichen 3'-UTR-Sequenzen verwendeten Methoden waren, wie in Beispiel 1 oben beschrieben.
Beispiel 11 – Erneutes Einführen von Wildtyp-3'-UTR
Die humanen Volllängen-Transkripte oder Abschnitte, welche nur die 3'-UTR enthalten, liegen in dem oben beschriebenen pCRII^TM-Vektor vor. Diese Sequenzen stehen für einen Transfer in geeignete Säugetiervektoren für einen Gentransfer zur Verfügung. Die gegenwärtige Technologie für die Gentherapie beim Menschen entwickelt sich rasch und es werden gegenwärtig geeignete Vektoren für diese Anwendungen entwickelt. Siehe z. B. Deisseroth et al., Proc Am Assoc Can Res 36: 655–656 (1995), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird.
Beispiel 12 – SSCP-Analyse des Prohibitin-Gens
Die für die SSCP-Analyse des Prohibitin-Gens verwendete Methode war, wie in Beispiel 9 oben beschrieben. Die SSCP-Analyse der üb rigen Exons (Nr. 2–5 und 7) erfolgte unter Verwendung der Bleichen Methoden und geeigneter Primersätze für jedes Exon, wie folgt
Beispiel 13 – SSCP-Analyse der 3'-UTR
Eine SSCP-Analyse der 3'-UTR oder von Regionen davon kann ausgeführt werden, wie in Beispiel 9 oben beschrieben. Die Auswahl und Konstruktion der geeigneten Primer für die PCR-Amplifizierung der 3'-UTR oder eines Abschnitts davon liegen ohne Weiteres im Vermögen eines Fachmanns auf diesem Gebiet angesichts der hier bereitgestellten Sequenz der 3'-UTR.
Beispiel 14 – Mikroinjektionsassay
Die antiproliferative Aktivität von Prohibitin wurde nach der Mikroinjektion von verschiedenen in vitro erzeugten RNA-Transkripten bestimmt. Nuell, M. J., et al., Mol Cell Biol. 11: 1372–1381 (1991). Kurz zusammengefasst, wurden Zellen in der frühen G1-Phase mit Lovastatin (bereitgestellt von A. W. Alberts von Merck, Sharp and Dohme Research Pharmaceuticals, Rahway, NJ) durch die Methode von Keyomarsi et al., Keyomarsi, K., et al., Cancer Res. 51: 3602–3609 (1991), synchronisiert. Bei synchronisierten Zellen (200–300 pro Experiment) aus allen der oben beschriebenen Linien wurde eine Mikroinjektion von in vitro erzeugtem Transkript in einer Konzentration von 1 mg/ml unter Verwendung eines Mikroinjektors, Modell 5242 von Eppendorf, vorgenommen.
Die 1,9 Kilobasen (kb)-Volllängen-cDNA und mehrere verkürzte cDNAs, die entweder in pBSIISK+ (Stratagene, La Jolla, CA) oder pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert worden waren, wurden verwendet, um in vitro Transkripte unter Verwendung der mMESSAGE mMACHINE (Ambion, Inc., Austin, TX) zu synthetisieren. Es wurden verkürzte Transkripte eingesetzt, die sowohl in der Sinn- als auch der Antisinn-Orientierung ausgehend von einem Klon, welchem ungefähr 150 bp des 5'-Endes der cDNA fehlten, synthetisiert worden waren. Dem Sinn-Transkript fehlten Translationssignale wie auch die AUG-Startstelle und die die ersten 40 Aminosäuren des Prohibitin-Proteins kodierende Region. Transkripte, die nur 3'-UTR-Sequenzen enthielten, wurden in diesem Assay ebenfalls getestet. Diese 850 Basen-Transkripte beginnen ungefähr 80 Basen stromabwärts des UGR-Stopkodons und wurden ausgehend von einem 3'-UTR-Klon mit Wildtyp-Sequenz und einem Klon mit mutierter Sequenz (HeLa) erzeugt. Zellen, bei denen eine Mikroinjektion vorgenommen worden war, wurden stimuliert, so dass sie den Zellzyklus in Gegenwart von [³H]-Thymadin durchliefen, und nach einer Autoradiographie wurde die inhibitorische Aktivität berechnet. Nuell, M. J., et al., Mol. Cell Biol. 11: 1372–1381 (1991).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes Nukleinsäurefragment, das einen isolierten Abschnitt der 3'-untranslatierten Region des humanen Prohibitin-Gens umfaßt, wobei das Prohibitin-Gen ein Stopkodon am 3'-Ende der kodierenden Region hat, wobei der Abschnitt der 3'untranslatierten Region ein Nukleotid 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens beginnt und 939 Nukleotide 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens endet.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, bei dem die Nukleotidsequenz der 3'-untranslatierten Region so ist, wie in SEQ ID NO: 10 zwischen Nukleotid 4 und 942 dargestellt.
Gereinigtes Nukleinsäurefragment, das einen isolierten Abschnitt der 3'-untranslatierten Region des Prohibitin-Gens umfaßt, wobei das Prohibitin-Gen ein Stopkodon am 3'-Ende der kodierenden Region hat, wobei der Abschnitt der 3'-untranslatierten Region 155 Nukleotide 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens beginnt und 939 Nukleotide 3' des Stopkodons der kodierenden Region des Prohibitin-Gens endet.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 3, bei dem die Nukleotidsequenz der 3'-untranslatierten Region so ist, wie in SEQ ID NO: 10 zwischen Nukleotid 158 und 942 dargestellt.
Nukleinsäurefragment, das die Sequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.
Nukleinsäurefragment, das die Sequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Nukleinsäurefragment, das die Sequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist.
Nukleinsäurefragment, das die Sequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 5 dargestellt ist.
Nukleinsäurefragment, das die Sequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
Nukleinsäurefragment, das die Sequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist.
Säuger-Expressionsvektor, der das Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 umfaßt.
Säuger-Expressionsvektor, der das Nukleinsäurefragment nach Anspruch 3 umfaßt.
Diagnostischer in vitro-Assay zum Bestimmen der Suszeptibilität eines Individuums, Krebs zu entwickeln, der die Schritte umfaßt: (a) Bestimmen des Prohibitin-Genotyps des Individuums; und (b) Screenen auf Mutationen in der 3'-untranslatierten Region des humanen Prohibitin-Gens.
Diagnostischer Assay nach Anspruch 13, bei dem die Bestimmung des Prohibitin-Genotyps des Individuums erreicht wird durch eine PCR/SSCP-Analyse von Intron 5/Exon 6, eine PCR/- Restriktionsanalyse von Intron 5/Exon 6 oder einen RFLP-Assay genomischer DNA.
Diagnostischer Assay nach Anspruch 14, bei dem das Screenen nach Mutationen in der 3'-untranslatierten Region erreicht wird durch eine PCR/SSCP-Analyse, Sequenzierung oder den Verlust oder das Hinzukommen von Restriktionsstellen in der 3'untranslatierten Region.
Verwendung der Wildtyp 3'-untranslatierten Region des humanen Prohibitin-Gens zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Verwendung der gesamten Wildtyp 3'-untranslatierten Region des humanen Prohibitin-Gens zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.