DE69738157T2

DE69738157T2 - Polymorphismus und neue gene in der region des menschlichen hemochromatosisgens

Info

Publication number: DE69738157T2
Application number: DE69738157T
Authority: DE
Inventors: John N. San Carlos FEDER; Gregory S. Pacifica KRONMAL; Peter M. San Francisco LAUER; David A. San Francisco RUDDY; Winston J. San Mateo THOMAS; Zenta Menlo Park TSUCHIHASHI; Roger K. Mill Valley WOLFF
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2017-10-01
Also published as: EP0960114A1; DE69738157D1; CA2268771C; AU4803997A; EP1914319A2; JP4017672B2; JP2001525663A; EP0960114B1; EP1914319B1; CA2268771A1; EP1914319A3; DE960114T1; EP0960114A4; WO1998014466A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hereditäre (erbliche) Hämochromatose (HH) ist eine vererbte Störung des Eisenmetabolismus, wobei der Körper einen Überschuss an Eisen akkumuliert. In symptomatischen Individuen führt dieser Überschuss an Eisen zu schädlichen Wirkungen, indem er in einer Reihe von Organen abgelagert wird, was zu deren Versagen führt, und in Zirrhose, Diabetes, Sterilität und anderen schweren Krankheiten resultiert. Das Gen, welches bei dieser Erkrankung defekt ist, wurde in US 6,025,130 , veröffentlicht am 15.02. 2000, offenbart.
Feinstrukturkartierung der Region, der das für HH verantwortliche Gen, HFE (in manchen Veröffentlichungen als HH oder HFE bezeichnet), zugeordnet worden war, ermöglicht die Identifizierung von Kandidatensequenzen, welche das HFE-Gen umfassen, zusammen mit strukturellen Elementen zur Regulation und Expression, und benachbarte Gene.
Für Feinstrukturkartierung ist eine Reihe von Techniken verfügbar, umfassend direkte cDNA-Selektion, Exon-Trapping und Sequenzierung genomischer Proben. Der Ansatz der direkten Selektion (Lovett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9628–9623 (1991)) umfasst die Hybridisierung von cDNA-Fragmenten an genomische DNA. Diese Technik ist extrem empfindlich und ermöglicht, Abschnitte von seltenen Transkripten zu isolieren. Bei Exon-Trapping (Church et al., Nature Genetics 6:98–105 (1994)) werden gespleißte Introns von in vivo exprimierten genomischen DNA-Klonen gewonnen und Kandidaten-Exons erzeugt, ohne dass irgendwelche Vorabkenntnisse der Expression des Target-Gens erforderlich sind. Genomische DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz, mit Vergleich der Sequenzdaten mit Datenbanken von exprimierten Sequenzen wurde ebenfalls verwendet, wie etwa bei der positionellen Klonierung des Werner-Syndrom-Gens (Yu et al., Science 277:258–262 (1996)) und bei der Homologieklonierung des zweiten Alzheimer-Krankheit-Gens auf Chromosom 1 (Levy-Lahad et al., Science 269:973–977 (1995)).
HH wird typischerweise rezessiv vererbt; nach dem derzeitigen Wissensstand sind Homozygote, die zwei defekte Kopien des Gens haben, am häufigsten von der Erkrankung betroffen. Zusätzlich sind Heterozygote für das HFE-Gen anfälliger für sporadische Porphyria cutanea tarda und potenziell für andere Störungen (Roberts et al., Lancet 349:321–323 (1997)). Es wird geschätzt, dass annähernd 10–15% der Kaukasier eine Kopie der HFE-Genmutation aufweisen, und dass es in den Vereinigten Staaten etwa eine Million Homozygote gibt. HH stellt somit eine der häufigsten genetischen Krankheitsmutationen in kaukasischen Individuen dar. Obwohl HH letztlich Schwächesymptome erzeugt, ist die Mehrheit der Homozygoten und Heterozygoten nicht diagnostiziert.
Der Bedarf für eine derartige Diagnostik ist dokumentiert, beispielsweise in Barton, J.C. et al., Nature Medicine 2:394–395 (1996); Finch, C.A., West. J. Med. 153:323–325 (1990); McCusick, V., Mendelian Inheritance in Man, Seiten 1882–1887, elfte Ausgabe (Johns Hopkins University Press, Baltimore (1994)); Report of a Joint World Health Organization/Hemochromatosis Foundation/French Hemochromatosis Association Meeting an the Prevention and Control of Hemochromatosis (1993); Edwards, C.Q. et al., New Engl. J. Med. 328:1616–1620 (1993); Bacon, B.R., New Engl. J. Med. 326:126–127 (1992); Balan, V., et al., Gastroenterology 107:453–459 (1994); Phatak, P.D., et al., Arch. Int. Med 154:769–776 (1994).
Eine einzige Mutation im HFE-Gen, bezeichnet als 24d1 in der ebenfalls anhängigen U.S.S.N. 08/630,912 , ist verantwortlich für die Mehrzahl der Krankheit-verursachenden Chromosomen, welche heutzutage in der Population vorhanden sind. Diese wird hierin als die "allgemeine" oder "anzestrale" oder "allgemeine anzestrale" Mutation bezeichnet. Diese Begriffe werden untereinander austauschbar verwendet. Es scheint, dass etwa 80% bis 90% aller HH-Patienten mindestens eine Kopie der allgemeinen anzestralen Mutation haben, welche eng verknüpft ist mit spezifischen Allelen bestimmter genetischer Marker nahe dieses anzestralen HFE-Gendefekts. Diese Marker sind, als eine erste Annäherung, in der allelischen Form, in der sie zum Zeitpunkt, an dem die anzestrale HFE-Mutation auftrat, vorlagen. Siehe beispielsweise Simon, M., et al., Am. J. Hum. Genet. 41:89–05 (1987); Jazwinska, E.C., et al., Am. J. Hum. Genet. 53:242–257 (1993); Jazwinska, E.C., et al., Am. J. Hum. Genet. 56:428–433 (1995); Worwood, M., et al., Brit. J. Hematol. 86:863–866 (1994); Summers, K.M., et al., Am. J. Hum. Genet. 45:41–48 (1989).
Verschiedene polymorphe Marker in der HFE-Region wurden beschrieben, und es wurde gezeigt, dass sie Allele haben, die mit der HH-Erkrankung assoziiert sind. Diese Marker umfassen die veröffentlichten Mikrosatellit-Marker D6S258, D6S306 (Gyapay, G., et al., Nature Genetics 7:246–339 (1994)), D6S265 (Worwood, M., et al., Brit. J. Hematol. 86:833–846 (1994)), D6S105 (Jazwinska, E.C., et al., Am. J. Hum. Genet. 53:242–257 (1993)); Jazwinska, E.C., et al., Am. J. Hum. Genet. 56:428–433 (1995)), D6S1001 (Stone, C., et al., Hum. Molec. Genet. 3:2043–2046 (1994)), D6S1260 (Raha-Chowdhury et al., Hum. Molec. Genet. 4:1869–1874 (1995)), sowie zusätzliche Mikrosatelliten und Einzelnukleotid-Polymorphismus-Marker, welche in der ebenfalls anhängigen PCT-Anmeldung WO 96/06583 offenbart sind. Zusätzlich offenbarte U.S.S.N. 08/630,912 die zusätzlichen Marker 24d2 und 24d7.
Die Symptome von HH sind oftmals denen von anderen Zuständen ähnlich, und die schwerwiegenden Wirkungen der Erkrankung treten oftmals nicht unmittelbar auf. Demgemäß wäre es wünschenswert, ein Verfahren bereitzustellen, um Personen zu identifizieren, welche veranlagt sein könnten, symptomatisch zu werden, um rechtzeitig einzugreifen, um eine exzessive, mit Überbeladung an Eisen assoziierte Gewebeschädigung zu verhindern. Ein Grund für das Fehlen einer Frühdiagnose ist die Unzulänglichkeit der derzeit verfügbaren Diagnoseverfahren, festzustellen welche Individuen dem Risiko ausgesetzt sind, insbesondere während derartige Individuen vorsymptomatisch sind.
Obwohl Bluteisenparameter als ein Werkzeug zum Screening verwendet werden können, verwendet eine bestätigte Diagnose oftmals eine Leberbiopsie, die unerwünscht invasiv und teuer ist, und ein Mortalitätsrisiko beinhaltet. Somit besteht ein klarer Bedarf für die Entwicklung eines kostengünstigen und nicht-invasiven Diagnosetests für die Detektion von Homozygoten und Heterozygoten, um eine Diagnose bei symptomatischen Individuen zu erleichtern, um eine vorsymptomatische Detektion bereitzustellen, um ein Eingreifen zur Verhinderung von Organschädigung zu lenken, und zur Identifizierung von heterozygoten Trägern.
Weiterhin besteht ein Bedarf sowohl für Verfahren zur Feinstrukturkartierung als auch für eine Feinstrukturkarte der Region des Chromosoms, welcher der HH-Lokus zugeordnet wurde. Diese und andere Bedürfnisse werden von der vorliegenden Erfindung angegangen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Oligonukleotid, welches aus mindestens 8 bis ungefähr 100 aufeinander folgenden Basen aus der Sequenz der SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement besteht, einschließlich der polymorphen Stelle (site) an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 ("polymorphe Stelle C182.1G7").
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Oligonukleotidpaar, welches aus SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41 besteht, zur Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement, welche die polymorphe Stelle an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 ("polymorphe Stelle C182.1G7") enthält.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein in vitro Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der allgemeinen Genmutation der hereditären Hämochromatose (HFE) in einer Probe von DNA oder RNA, welches umfasst:
Untersuchung der DNA oder RNA auf Anwesenheit oder Abwesenheit eines Haplotyps, welcher das Allel der SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement an der polymorphen Stelle an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 ("polymorphe Stelle C182.1G7") enthält,
wobei die Abwesenheit des Haplotyps die wahrscheinliche Abwesenheit der HFE-Mutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist, und die Anwesenheit des Haplotyps die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein in vitro Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der allgemeinen Genmutation der hereditären Hämochromatose (HFE) in einer Probe von DNA oder RNA, welches umfasst:
Untersuchung der DNA oder RNA auf Anwesenheit oder Abwesenheit eines G-Genotyps an der polymorphen Stelle an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 ("polymorphe Stelle C182.1G7") oder eines C-Gentyps an der komplementären Stelle,
wobei die Abwesenheit des C- oder G-Genotyps an der polymorphen Stelle C182.1G7 die wahrscheinliche Abwesenheit der HFE-Genmutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist, und die Anwesenheit des C- oder G-Genotyps an der polymorphen Stelle C182.1G7 die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Kombination einer genetischen, physikalischen und transkriptionellen Karte der HFE-Genregion. Die erste Linie zeigt die relativen Positionen ausgewählter genetischer Marker, welche die HFE-Region definieren. Der fette Balken darunter stellt den YAC-Klon der, der beim direkten Selektionsexperiment verwendet worden war. Die Anordnung und die Positionen der Bakterienklone, die beim Exon-Trapping und der Probensequenzierung verwendet wurden, sind unterhalb des YAC angegeben. Der dünne Balken unter den Bakterienklonen stellt die annähernden Positionen einer Untergruppe der exprimierten, dem Contig zugeordneten Sequenzfragmente dar. Die dickeren Balken zeigen die Position der klonierten cDNA. Zwei Regionen sind mittels Klammern zusammengefasst: die Butyrophilin-Genfamilie (BTF), und die Region, in der eine vollständige genomische Sequenzierung durchgeführt wurde.
2 ist eine schematische Darstellung der 250 kb genomischen Sequenz, welche das HFE-Gen beinhaltet. Sowohl die Struktur der gesamten cDNA (oben) als auch die, welche den kodierenden Regionen entspricht (unten), sowie die Richtung der Transkription sind gezeigt. Die Positionen der Histon-Gene, des Zink-α2-Glykoprotei-Pseudogens und der EST sind ebenfalls gezeigt.
3 zeigt ein Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz der BTF-Proteine, Sequenzen wurde paarweise ausgerichtet, unter Verwendung von CLUSTAL W (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673–4680) um die ökonomischste Anordnung abzuleiten. Die Sterne unter dem Alignment stellen Aminosäuren dar, die bei allen 6 Proteinen konserviert sind; die "Punkte" stellen konservierte Aminosäureaustausche dar. Eingerahmt sind die Regionen innerhalb der Proteine, welche drei konservierten Motiven entsprechen: 1) die B-G Domäne, 2) die Transmembrandomäne (TM), und 3) die B30-2 Exondomäne.
4, Abbildung (A), zeigt eine Northern Blot Analyse von repräsentativen Mitgliedern der zwei Gruppen von BTF-Proteinen, BTF1 und BTF5. BTF1 hybridisierte an alle Gewebe auf dem Blot als ein Haupttranskript von 2,9 kb und ein Nebentranskript von 5,0 kb. BTF5 hybridisierte an verschiedene Transkripte im Bereich zwischen 4,0 und 3,1 kb und zeigte ein ähnliches Expressionsprofil wie BTF1. Autoradiographie erfolgte wahrend 24 Stunden. Die Hybridisierung von β-Actin zeigte die Variation an poly(A)+-RNA zwischen den Bahnen. Autoradiographie erfolgte während 1 Stunde. In Abbildung (B) zeigt RT-PCR Analyse, dass die Expression beider Gene breit verteilt war. In der Bahn (+) sind cDNA 21 und 44 als positive Kontrollen aufgenommen; die Bahn (–) stellt die Kontrolle ohne DNA dar. Amplifikation unter Verwendung von Primern für das RFP-Gen (Isomura et al., Nucleic Acids Res. 20:5305–5310 (1992)) kontrollierte die Integrität der cDNA. Alle Erststrang-cDNA wurden auf kontaminierende Amplifikation von genomischer DNA überprüft, indem ein identisches Experiment ohne die reverse Transkriptase durchgeführt wurde. In allen Fällen wurde keine Amplifikation erhalten (Daten nicht gezeigt).
5(A) zeigt ein Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz des RoRet-Gens mit dem 52 kD Ro/SSA Autoantigen-Protein. Die Sterne unter dem Alignment stellen konservierte Aminosäuren dar; die "Punkte" stellen konservierte Aminosäureaustausche dar. Die mutmaßliche DNA-bindende Cystein-reiche Domäne und die B30-2 Exondomäne sind eingerahmt. 5(B) zeigt ein Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz der zwei neuen mutmaßlichen Natriumphosphat-Transportproteine mit der von NPT1.
6, Abbildung (A), zeigt eine Northern Blot Analyse des RoRet-Gens. Die RoRet-cDNA hybridisierte an 4 unterschiedliche Transkripte in einem Bereich von 7,1 bis 2,2 kb. Autoradiographie wurde während 4 Tagen durchgeführt. Die erneute Hybridisierung des Blots mit einer β-Actin-Sonde zeigte die Variation an poly(A)+-RNA zwischen den Bahnen. Autoradiographie erfolgte während 1 Stunde. Abbildung (B) zeigt eine RT-PCR Analyse des RoRet-Gens. In der Bahn (+) befand sich cDNA 27 als positive Kontrolle. Schwache Amplifikation der korrekten Größe wurde im Dünndarm, in der Niere und Leber beobachtet. Die anderen Gewebe sowie die Kontrollbahn (–) ohne DNA waren negativ. Die RFP-Primer zeigten die Integrität der cDNA. Abbildung (C) zeigt eine Northern Blot Analyse von NPT3 und NPT4. NPT3 wurde in Herz und Muskel in einer sehr großen Menge als ein einziges 7,2 kb Transkript exprimiert. In den anderen Geweben wurden geringere Mengen gefunden. Das Expressionsmuster von NPT4 war stärker eingeschränkt, es wurde lediglich in der Leber und der Niere als eine verschmierte Bande von Transkripten im Bereich von 2,6 bis 1,7 kb gefunden. Abbildung (D) zeigt eine RT-PCR Analyse der Gene NPT3 und NPT4. In der Bahn (+) waren die entsprechenden cDNA 22E und 22B als positive Kontrollen aufgenommen. Das NPT3-Gen wurde in Niere, Leber, Milz und Hoden als ein PCR-Fragment der richtigen Größe exprimiert. Ein kleineres Fragment wurde in allen Geweben mit Ausnahme der Leber nachgewiesen. Die Kontrollbahn (–) ohne DNA war negativ. NPT4 wurde in Dünndarm, Niere, Leber und Hoden als ein PCR-Fragment der richtigen Größe exprimiert. Größere und kleinere Fragmente wurde in allen anderen Geweben mit Ausnahme des Hirns gefunden. Für beide Gene können diese Fragmente unterschiedlicher Größe alternative Spleißvorgänge anzeigen. Die Kontrollbahn (–) ohne DNA war negativ. Die RFP-Primer zeigten die Integrität der cDNA.
7 zeigt die Sequenzen von cDNA 21 (BTF1), cDNA 29 (BTF3), cDNA 23 (BTF4), cDNA 44 (BTF5), cDNA 32 (BTF2), cDNA 27 (RoRet), cDNA 22B (NPT3), cDNA 22E (NPT4).
8 zeigt die Nukleotidsequenz von annähernd 235 kb in der HFE-Subregion eines nicht betroffenen Individuums.
9 zeigt die Nukleotidsequenz von annähernd 235 kb in der HFE-Subregion eines von HH betroffenen Individuums. Polymorphe Stellen bei dem von HH betroffenen Individuum, bestimmt durch Vergleich mit einer Sequenz der entsprechenden Region von einem nicht durch HH betroffenen Individuum, sind in Tabelle 1 aufgelistet und beschrieben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
A. Definitionen
Abkürzungen für die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren erfolgen nach dem herkömmlichen Gebrauch. In der hierin verwendeten Polypeptidnotation ist die linke Richtung die aminoterminale Richtung und die rechte Richtung ist die carboxyterminale Richtung, in Übereinstimmung mit Standardgebrauch und Konvention. In ähnlicher Weise ist, wenn nicht anders angegeben, das linke Ende von einzelsträngigen Polynukleotidsequenzen das 5'-Ende; die linke Richtung von doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen wird als die 5'-Richtung bezeichnet. Die Richtung der Hinzufügung von 5' nach 3' von neu entstehenden RNA-Transkripten wird als die Transkriptionsrichtung bezeichnet; Sequenzregionen auf dem DNA-Strang mit der gleichen Sequenz wie die RNA, und die 5' vom 5'-Ende des RNA-Transkripts gelegen sind, werden als "stromaufwärtige Sequenzen" bezeichnet; Sequenzregionen auf dem DNA-Strang mit der gleichen Sequenz wie die RNA, und die 3' vom 3'-Ende des RNA-Transkripts gelegen sind, werden als "stromabwärtige Sequenzen" bezeichnet.
Der Begriff "Nukleinsäuren", wie hierin verwendet, bezeichnet sowohl DNA als auch RNA. "Nukleinsäuresequenz" oder "Polynukleotidsequenz" bezeichnet ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, gelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Er umfasst sowohl selbstreplizierende Plasmide, infektiöse Polymere von DNA oder RNA und nicht-funktionelle DNA oder RNA. Es wird verstanden, dass das Komplement einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz von der Definition dieser Sequenz umfasst ist.
"Nukleinsäuresonden" können DNA- oder RNA-Fragmente sein. DNA-Fragmente können beispielsweise hergestellt werden durch Verdau von Plasmid-DNA oder unter Verwendung von PCR, oder synthetisiert werden, entweder durch das von Beaucage und Carruthers beschriebene Phosphoramidit-Verfahren, Tetrahedron Lett. 22:1859–1862 (1981), oder durch das Triester-Verfahren gemäß Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981). Falls gewünscht, kann danach ein doppelsträngiges Fragment erhalten werden durch Annealing der chemisch synthetisierten Einzelstränge aneinander unter geeigneten Bedingungen, oder durch Synthetisieren des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz. Es wird verstanden, dass wenn eine spezifische Sequenz für eine Nukleinsäuresonde angegeben ist, der komplementäre Strang ebenfalls identifiziert und umfasst ist. Der komplementäre Strang funktioniert in Situationen, bei denen das Target eine doppelsträngige Nukleinsäure ist, genauso gut.
Der Ausdruck "hybridisiert selektiv an" bezeichnet eine Nukleinsäuresonde, die an eine besondere Target DNA- oder RNA-Sequenz hybridisiert, mit dieser einen Doppelstrang bildet oder an diese bindet, wenn die Targetsequenzen in einer Präparation von gesamter zellulärer DNA oder RNA vorhanden sind. "Komplementäre" oder "Target" Nukleinsäuresequenzen bezeichnen diejenigen Nukleinsäuresequenzen, die selektiv an eine Nukleinsäuresonde hybridisieren. Geeignete Annealingbedingungen hängen beispielsweise von der Länge einer Sonde, der Basenzusammensetzung und der Anzahl von Fehlpaarungen (mismatch) und deren Position auf der Sonde ab, und müssen oftmals empirisch bestimmt werden. Hinsichtlich Diskussionen für die Konstruktion von Nukleinsäuresonden und Annealingbedingungen, siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bände 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), oder Current Protocolls in Molecular Biology, Hrsg. F. Ausubel et al., Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York (1987).
Der Ausdruck "Nukleinsäuresequenz, welche kodiert für" bezeichnet eine Nukleinsäure, welche die Expression eines spezifischen Proteins oder Peptids dirigiert. Die Nukleinsäuresequenzen umfassen sowohl die Sequenz des DNA-Strangs, der zu RNA transkribiert wird, als auch die RNA-Sequenz, die zu Protein translatiert wird. Die Nukleinsäuresequenzen umfassen sowohl die Volllänge-Nukleinsäuresequenzen sowie die nicht-Volllänge-Sequenzen, abgeleitet vom Volllänge-Protein. Des Weiteren wird verstanden, dass die Sequenz die degenerierten Kodons der nativen Sequenz umfasst, oder Sequenzen, welche eingeführt werden können um Kodonpräferenz in einer spezifischen Wirtszelle bereitzustellen.
Der Ausdruck "isoliert" oder "im Wesentlichen rein" bezeichnet Nukleinsäurepräparationen, denen mindestens ein Protein oder mindestens eine Nukleinsäure fehlt, das bzw. die normalerweise mit der Nukleinsäure in einer Wirtszelle assoziiert ist.
Der Ausdruck "Expressionskassette" bezeichnet Nukleotidsequenzen, welche fähig sind, die Expression eines Strukturgens in Wirten, die mit derartigen Sequenzen kompatibel sind, zu beeinflussen. Derartige Kassetten umfassen mindestens Promotoren und gegebenenfalls Transkriptionsterminationssignale. Zusätzliche Faktoren, welche notwendig oder nützlich sind um eine Expression zu bewirken, können ebenfalls verwendet werden, wie hierin beschrieben.
Der Begriff "operativ verknüpft", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Verknüpfung eines Promotors stromaufwärts einer DNA-Sequenz derart, so dass der Promotor Transkription der DNA-Sequenz vermittelt.
Der Begriff "Vektor" bezeichnet virale Expressionssysteme, autonom selbst-replizierende zirkuläre DNA (Plasmide), und umfasst sowohl Expressionsplasmide als auch nicht-Expressionsplasmide. Wenn beschrieben ist, dass ein rekombinanter Mikroorganismus oder eine Zellkultur einen "Expressionsvektor" beherbergt, umfasst dies sowohl extrachromosomale zirkuläre DNA als auch DNA, welche in ein oder mehrere Chromosomen des Wirts eingebaut wurde. Wenn ein Vektor von einer Wirtszelle beibehalten wird, kann der Vektor entweder von den Zellen während der Mitose als eine autonome Struktur stabil repliziert werden, oder er ist in das Genom des Wirts eingebaut.
Der Begriff "Gen", wie hierin verwendet, soll eine Nukleinsäuresequenz bezeichnen, die für ein Polypeptid kodiert. Diese Definition umfasst verschiedene Sequenzpolymorphismen, Mutationen und/oder Sequenzvarianten, wobei derartige Änderungen die Funktion des Genprodukts nicht beeinflussen. Der Begriff "Gen" soll nicht nur kodierende Sequenzen umfassen, sondern auch regulatorische Regionen, wie etwa Promotoren, Enhancer und Terminationsregionen. Der Begriff umfasst des Weiteren alle Introns und anderen DNA-Sequenzen, welche aus dem mRNA-Transkript heraus gespleißt werden, zusammen mit Varianten, die aus alternativen Spleißstellen resultieren.
Der Begriff "Plasmid" bezeichnet ein autonomes, zirkuläres DNA-Molekül, das zur Replikation in einer Zelle fähig ist, und umfasst sowohl die Expressions- als auch die nicht-Expressionstypen. Wenn beschrieben ist, dass ein rekombinanter Mikroorganismus oder eine Zellkultur ein "Expressionsplasmid" beherbergt, umfasst dies sowohl extrachromosomale zirkuläre DNA-Moleküle als auch DNA, welche in ein oder mehrere Chromosomen des Wirts eingebaut wurde. Wenn ein Plasmid von einer Wirtszelle beibehalten wird, kann das Plasmid entweder von den Zellen während der Mitose als eine autonome Struktur stabil repliziert werden, oder es ist in das Genom des Wirts eingebaut.
Der Begriff "rekombinates Protein" oder "rekombinant erzeugtes Protein" bezeichnet ein Peptid oder Protein, das erzeugt worden ist unter Verwendung von nicht nativen Zellen, die keine endogene, zur Expression des Proteins fähige DNA-Kopie aufweisen. Die Zellen produzieren das Protein, weil sie durch die Einbringung der entsprechenden Nukleinsäuresequenz gentechnisch verändert worden sind. Das rekombinante Protein wird nicht in Assoziation mit Protein und anderen subzellulären Komponenten gefunden, mit denen es normalerweise, in den Zellen, welche das Protein exprimieren, assoziiert ist. Die Begriffe "Protein" und "Polypeptid" werden hierin untereinander austauschbar verwendet.
Die nachfolgenden Begriffe werden verwendet um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polynukleotiden zu beschreiben: "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität", "prozentuale Sequenzidenität" und "wesentliche Identität". Eine "Referenzsequenz" ist eine definierte Sequenz, welche als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann ein Teil einer größeren Sequenz sein, beispielsweise als ein Abschnitt einer Volllänge-cDNA oder einer in einem Sequenzprotokoll angegebenen Gensequenz, oder sie kann eine vollständige cDNA oder Gensequenz umfassen.
Ein optimales Alignment von Sequenzen zum Ausrichten eines Vergleichsfensters kann beispielsweise durchgeführt werden mit dem lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mit dem Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mit dem Ähnlichkeitssuche-Verfahren von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), oder mit Computerprogrammen dieser Algorithmen (beispielsweise GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
Die Begriffe "wesentliche Identität" (bzw. "im Wesentlich identisch") oder "wesentliche Sequenzidentität", wie auf Nukleinsäuresequenzen angewendet und wie hierin verwendet, bezeichnen eine charakteristische Eigenschaft einer Polynukleotidsequenz, wobei das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die im Vergleich zu einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Nukleotidpositionen, häufig über ein Fenster von mindestens 25–50 Nukleotiden, eines Sequenzidentität von mindestens 85 Prozent, bevorzugt eine Sequenzidentität von mindestens 90 bis 95 Prozent aufweist, wobei der Prozentanteil der Sequenzidentität berechnet wird durch Vergleichen der Referenzsequenz mit der Polynukleotidsequenz, welche Deletionen oder Additionen umfassen kann, die insgesamt 20 Prozent oder weniger der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster ausmachen können. Die Referenzsequenz kann ein Teil einer größeren Sequenz sein.
Wie auf Polypeptide angewandt bedeuten die Begriffe "wesentliche Identität" (bzw. "im Wesentlich identisch") oder "wesentliche Sequenzidentität", dass zwei Peptidsequenzen, in einem optimalen Alignment, wie etwa mit den Programmen GAP oder BESTFIT unter Verwendung von Standardgewichtungen für Lücken (default dap weights), eine Sequenzidentität von mindestens 80 Prozent, bevorzugt eine Sequenzidentität von mindestens 90 Prozent, stärker bevorzugt eine Sequenzidentität von mindestens 95 Prozent oder darüber zeigen. "Prozentuale Aminosäureidentität" oder "prozentuale Aminosäuresequenzidentität" bezeichnen einen Vergleich der Aminosäuren von zwei Polypeptiden, die in einem optimalen Alignment annähernd den angegebenen Prozentanteil der gleichen Aminosäuren aufweisen. "95% Aminosäureidentität" bezeichnet beispielsweise einen Vergleich der Aminosäuren von zwei Polypeptiden, die in einem optimalen Alignment eine Aminosäureidentität von 95% aufweisen. Bevorzugt unterscheiden sich Aminosäurepositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäureaustausche. Es ist nicht wahrscheinlich, dass beispielsweise der Austausch von Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften wie etwa Ladung oder Polarität die Eigenschaften eines Proteins verändert. Beispiele umfassen Glutamin gegen Asparagin oder Glutaminsäure gegen Asparaginsäure.
Der Ausdruck "im Wesentlichen gereinigt" oder "isoliert" bedeutet, wenn er sich auf ein Peptid oder Protein bezieht, eine chemische Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei von anderen zellulären Komponenten ist. Sie liegt bevorzugt in einem homogenen Zustand vor, obwohl sie sowohl in trockenem Zustand als auch als eine wässrige Lösung vorliegen kann. Reinheit und Homogenität werden typischerweise bestimmt unter Verwendung von chemischen Analysetechniken wie etwa Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Ein Protein, das die in einer Präparation vorwiegende Spezies ist, ist im Wesentlichen gereinigt. Im Allgemeinen wird ein im Wesentlichen gereinigtes oder isoliertes Protein mehr als 80% aller in einer Präparation vorhandenen makromolekularen Spezies ausmachen. Bevorzugt ist das Protein gereinigt, so dass es mehr als 90% aller vorhandenen makromolekularen Spezies ausmacht. Stärker bevorzugt ist das Protein zu mehr als 95% gereinigt, und am meisten bevorzugt ist das Protein im Wesentlichen zu Homogenität gereinigt, wobei andere makromolekulare Spezies durch herkömmliche Techniken nicht nachgewiesen werden.
Der Ausdruck "bindet spezifisch an einen Antikörper" oder "spezifisch immunreaktiv mit" bezeichnet, wenn er sich auf ein Protein oder Peptid bezieht, eine Bindereaktion, welche determinativ für die Anwesenheit des Proteins in der Anwesenheit einer heterologen Population von Proteinen und anderen biologischen Substanzen ist. Somit binden die spezifizierten Antikörper unter bezeichneten Immunassay-Bedingungen an ein besonderes Protein und binden nicht in signifikantem Ausmaß an andere, in der Probe vorhandene Proteine. Spezifische Bindung an einen Antikörper unter derartigen Bedingungen kann erfordern, dass ein Antikörper hinsichtlich seiner Spezifität für ein besonderes Protein selektiert wird. Eine Reihe von Immunassay-Formaten können verwendet werden, um Antikörper zu selektieren, die für ein besonderes Protein spezifisch immunreaktiv sind. Beispielsweise werden Festphase-ELISA-Immunassays routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper zu selektieren, die für ein Protein spezifisch immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane (1988), Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, für eine Beschreibung von Immunassay-Formaten und Bedingungen, die verwendet werden können, um spezifische Immunreaktivität zu bestimmen.
Wie hierin verwendet, bedeutet "EST" (expressed sequence tag) oder "exprimierter Sequenzmarker" eine partielle DNA- oder cDNA-Sequenz von etwa 150 bis 500, stärker bevorzugt etwa 300 aufeinander folgenden Nukleotiden einer längeren Sequenz, erhalten aus einer genomischen Bibliothek oder cDNA-Bibliothek, welche aus einer ausgewählten Zelle, einem ausgewählten Zelltyp, Gewebe oder Gewebetyp oder ausgewählten Organismen hergestellt wurde, wobei die längere Sequenz einer mRNA oder einem Gen entspricht, die bzw. das in dieser Bibliothek gefunden wird. Ein EST ist im Allgemeinen DNA. Eine oder mehrere Bibliotheken, hergestellt aus einem einzigen Gewebetyp, stellen typischerweise mindestens 3000 unterschiedliche (d.h. einzigartige) EST bereit, und potenziell den vollständigen Satz aller möglichen EST, der alle möglichen cDNA darstellt, z.B. 50.000–100.000 in einem Tier wie etwa einem Menschen (siehe beispielsweise Adams et al., Science 252:1651–1656 (1991)).
"Stringent", wie hierin verwendet, bezeichnet Hybridisierungs- und Waschbedingungen von 50% Formamid bei 42°C. Andere stringente Hybridisierungsbedingungen können ebenfalls ausgewählt werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen derart ausgewählt, so dass sie in etwa 5°C niedriger liegen als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Die Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Targetsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Stringente Bedingungen werden typischerweise diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration mindestens etwa 0,02 molar bei pH 7 beträgt und die Temperatur mindestens etwa 60°C beträgt. Da andere Faktoren die Stringenz einer Hybridisierung signifikant beeinflussen können, umfassend unter anderem die Basenzusammensetzung und die Größe der komplementären Stränge, die Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, und das Ausmaß der nicht zusammenpassenden Basen, ist die Kombination der Parameter wichtiger als die absolute Messung von einem beliebigen davon.
B. Transkriptkarte und neue Gene in Nähe von HH
Die vorliegende Erfindung stellt eine Feinstrukturkarte der 1 Megabasen-Region bereit, welche das HFE-Gen umgibt. Als Teil dieser Karte stellt die vorliegende Erfindung annähernd 250 kb DNA-Sequenz bereit, wovon etwa 235 kb in 8 bereitgestellt sind, und acht besonders interessante Loci, entsprechend Kandidatengenen innerhalb der 1 Megabasen-Region. Diese Loci sind nützlich als genetische und physikalische Marker für weitere Kartierungsstudien. Zusätzlich sind die acht cDNA-Sequenzen, welche diesen Loci entsprechen, nützlich, beispielsweise für die Isolierung anderer Gene in mutmaßlichen Genfamilien, die Identifizierung von Homologa aus anderen Spezies, und als Sonden für diagnostische Assays. Insbesondere sind isolierte Nukleinsäuresequenzen von mindestens 18 Nukleotiden, die im Wesentlichen identisch sind zu aufeinander folgenden Nukleotiden einer cDNA der Erfindung, nützlich als PCR-Primer. Typischerweise wird der PCR-Primer als ein Bestandteil eines Primerpaars in einer PCR-Reaktion verwendet. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, die bevorzugt etwa 18–100 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 18 Nukleotide umfassen, im Wesentlichen identisch zu aufeinander folgenden Nukleotiden einer cDNA der Erfindung, sind nützlich für die Konstruktion von PCR-Primern und Sonden für Hybridisierungsassays. Zusätzlich sind die von diesen cDNA kodierten Proteine nützlich für die Erzeugung von Antikörpern, zur Analyse von Genexpression und in diagnostischen Assays, und für die Reinigung von verwandten Proteinen.
Eine 235 kb Sequenz für die HFE-Subregion innerhalb der kartierten Region von 1 Megabase ist bereitgestellt. Diese Sequenz kann als eine Referenz bei der genetischen oder physikalischen Analyse von Deletionen, Substitutionen und Insertionen in dieser Region dienen. Zusätzlich stellt die Sequenzinformation eine Quelle für die weitere Identifizierung von neuen Genen in dieser Region bereit.
C. Polymorphe Marker
397 Polymorphe Stellen wurden in der Region des HFE-Gens identifiziert. Diese Polymorphismen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Wie nachstehend beschrieben, wurden diese Polymorphismen identifiziert durch Vergleich der DNA-Sequenz eines betroffenen Individuums, das für die allgemeine anzestrale HH-Mutation homozygot ist, mit der eines nicht betroffenen Individuums, offenbart in der ebenfalls anhängigen U.S. 08/724,394 .
Tabelle 1. Polymorphe Stellen in der HH-Region
Tabelle 2. Polymorphe Allelhäufigkeiten
Diese Polymorphismen stellen als einen Hintergrund Ersatzmarker zur Verwendung in diagnostischen Assays bereit, um die wahrscheinliche Anwesenheit der Mutationen 24d1 und/oder 24d2, bevorzugt 24d1 in Homozygoten oder Heterozygoten zu detektieren. Somit wird beispielsweise DNA oder RNA aus einem Individuum auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines durch ein polymorphes Allel von Tabelle 1 definierten Genotyps untersucht, wobei die Abwesenheit eines durch ein polymorphes Allel von Tabelle 1 definierten Genotyps als ein Ergebnis die wahrscheinliche Abwesenheit der HFE-Genmutation im Genom des Individuums anzeigt, und die Anwesenheit des Genotyps die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom des Individuums anzeigt.
Diese Marker können einzeln, in beliebiger Kombination miteinander oder mit anderen polymorphen Markern (wie etwa den in der ebenfalls anhängigen PCT-Anmeldung WO 96/06583 offenbarten) in diagnostischen Assays für die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation in einem Individuum verwendet werden. Beispielsweise kann jeder der durch die polymorphen Stellen von Tabelle 1 definierten Marker in diagnostischen Assays verwendet werden in Kombination mit 24d1 oder 24d2, oder mindestens einem der Polymorphismen HHP-1, HHP-19 oder HHP-29, oder der Mikrosatellitenwiederholung-Allele 19O9:205, 18B4:235, 1A2:239, 1E4:271, 24E2:245, 2B8:206, 3321-1:98, 4073-1:182, 4440-1:180, 4440-2:139, 731-1:177, 5091-1:148, 3218-1:221, 4072-2:170, 950-1:142, 950-2:164, 950-3:165, 950-4:128, 950-6:151, 950-8:137, 63-1:151, 63-2:113, 63-3:169, 65-1:206, 65-2:159, 68-1:167, 241-5:108, 241-29:113, 373-8:151 und 373-29:113, D6S258:199, D6S265:122, D6S105:124, D6S306:238, D6S464:206 und D6S1001:180.
Tabelle 2 listet die Häufigkeit von etwa 100 der durch die identifizierten polymorphen Stellen definierten Allele auf. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, sind bestimmte dieser Allele in der allgemeinen Population selten vorhanden. Von den Genotypen, die durch die in Tabelle 2 aufgelisteten Allele definiert sind, sind Polymorphismen, welche an Base 35983 auftreten, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass die durch die polymorphen Stellen von Tabelle 1 definierten Haplotypen eine Vorhersage über die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation 24d1 ermöglichen, da sie in einem Homozygoten für anzestrale HH identifiziert wurden. Somit ist beispielsweise die Wahrscheinlichkeit für ein betroffenes Individuum mit mindestens zwei oder mehr beliebigen der in Tabelle 1 definierten polymorphen Allele größer als die für ein nicht betroffenes Individuum. In ähnlicher Weise ist die Wahrscheinlichkeit für ein betroffenes Individuum mit mindestens drei oder mehr beliebigen der in Tabelle 1 definierten polymorphen Allele größer als die für ein nicht betroffenes Individuum.
Somit wird beispielsweise in einem diagnostischen Assay auf die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom des Individuums DNA oder RNA aus dem Individuum auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Haplotyps von Tabelle 1 untersucht, wobei die Abwesenheit eines Haplotyps von Tabelle 1 als ein Ergebnis die wahrscheinliche Abwesenheit der HFE-Genmutation im Genom des Individuums anzeigt, und die Anwesenheit des Haplotyps die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom des Individuums anzeigt.
Die durch die polymorphen Stellen von Tabelle 1 definierten Marker sind zusätzlich nützlich als Marker für die genetische Analyse der Vererbung bestimmter HFE-Allele und anderer Gene, die innerhalb der chromosomalen Region vorhanden sind, welche der Sequenz von 9 entspricht, umfassend beispielsweise diejenigen, welche in der ebenfalls anhängigen U.S.S.N. 08/724,394 offenbart sind.
Da die gesamte Nukleotidsequenz der Region in 9 bereitgestellt ist, wird für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein, welche Sequenzen als Primer oder Sonden zu verwenden sind, um jeden interessierenden Polymorphismus zu detektieren. Somit umfassen in manchen Ausführungsformen der Erfindung die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mindestens ein Oligonukleotidpaar, ausgewählt aus der Sequenz von 9 oder deren Komplement, für die Amplifikation der polymorphen Stelle bei Base 35983 von Tabelle 1. Des Weiteren ist in manchen Ausführungsformen der Erfindung eine bevorzugte Hybridisierungssonde ein Oligonukleotid, umfassend mindestens 8 bis etwa 100 aufeinander folgende Basen aus der Sequenz von 9 oder dem Komplement der Sequenz, wobei die mindestens 8 bis etwa 100 aufeinander folgenden Basen mindestens die polymorphe Stelle 35983 von Tabelle 1 umfassen.
Derartige isolierte DNA-Sequenzen sind nützlich als Primer, Sonden, oder als eine Komponente eines Kits in diagnostischen Assays zur Detektierung der wahrscheinlichen Anwesenheit der HFE-Genmutation in einem Individuum.
D. Screening auf Basis von Nukleinsäure
Individuen, die polymorphe Allele der Erfindung haben, können unter Verwendung einer Reihe von Techniken, die in der Technik gut bekannt sind, auf dem Niveau von entweder der DNA, der RNA oder dem Protein detektiert werden. Die für die Diagnose verwendete genomische DNA kann aus Körperzellen erhalten werden, wie etwa denjenigen, welche vorhanden sind in peripherem Blut, Urin, Speichel, der Wange, chirurgischen Proben und Autopsieproben. Die DNA kann direkt verwendet werden oder sie kann vor der Mutationsanalyse in vitro enzymatisch amplifiziert werden durch Verwendung von PCR (Saiki et al., Science 239:487–491 (1988)) oder andere in vitro Amplifikationsmethoden, wie etwa die Ligasekettenreaktion (LCR) (Wu und Wallace, Genomics 4:560–569 (1989)), Strangverdrängungsamplifikation (SDA, strand displacement amplification) (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392–398 (1992)), selbst erhaltende Sequenzreplikation (3SR, self-sustained sequence replication) (Fahy et al., PCR Methods Appl. 1:25–33 (1992)). Die Methodik zur Herstellung von Nukleinsäuren in einer Form, welche für die Detektion von Mutationen geeignet ist, ist in der Technik gut bekannt.
Die Detektion von Polymorphismen in spezifischen DNA-Sequenzen, wie etwa in der Region des HFE-Gens, kann durch eine Reihe von Methoden bewerkstelligt werden, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, die Detektion von Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen auf Basis von Allel-spezifischer Restriktionsendonuklease-Spaltung (Kan und Dozy, Lancet 8:910–912 (1978)), Hybridisierung mit Allel-spezifischen Oligonukleotidsonden (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 8:3543–3557 (1978)), umfassend immobilisierte Oligonukleotide (Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230–6234 (1989)) oder Oligonulkeotid-Anordnungen (Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 21:2269–2270 (1993)), Allel-spezifische PCR (Newton et al., Nucleic Acids Res. 17:2503–2516 (1989)), Fehlpaarung-Reparatur-Detektion (MRD, mismatch-repair detection) (Faham und Cox, Genome Res. 5:474–482 (1995)), Bindung von MutS-Protein (Wagner et al., Nucleic Acids Res. 23:3944–3948 (1995)), denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) (Fisher und Lerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1579–1583 (1983)), Einzelstrangkonformation-Polymorphismusdetektion (Orita et al., Genomics 5:874–879 (1983)), RNAse-Spaltung bei ungepaarten Basenpaaren (Myers et al., Science 230:1242 (1985)), chemische (Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397–4401 (1988)) oder enzymatische (Youll et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:87–91 (1995)) Spaltung von Heteroduplex-DNA, Methoden auf Basis von Allel-spezifischer Primerextension (Syvänen et al., Genomics 8:684–692 (1990)), genetische Bit-Analyse (GBA) (Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22:4167–4175 (1994)), den Oligonukleotid-Ligationsassay (OLA) (Landegren et al., Science 241:1077 (1988)), die Allel-spezifische Ligationskettenreaktion (LCR) (Barrany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189–193 (1991)), Lücken-LCR (gap LCR) (Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23:675–682 (1995)), radioaktive und/oder fluoreszierende DNA-Sequenzierung unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Standardverfahren, und Peptid-Nukleinsäure (PNA) Assays (Orum et al., Nucleic Acids Res. 21:5332–5358 (1993); Thiede et al., Nucleic Acids Res. 24:983–984 (1998)).
Zusätzlich zu den durch die Polymorphismen der Erfindung definierten Genotypen können, wie beschrieben in der ebenfalls anhängigen PCT-Anmeldung WO 96/35802 , veröffentlicht am 14. November 1998, Genotypen, gekennzeichnet durch die Anwesenheit der Allele 19O9:205, 18B4:235, 1A2:239, 1E4:271, 24E2:245, 2B8:206, 3321-1:98 (dort als 3321-1:197 bezeichnet), 4073-1:182, 4440-1:180, 4440-2:139, 731-1:177, 5091-1:148, 3218-1:221, 4072-2:170 (dort als 4072-2:148 bezeichnet), 950-1:142, 950-2:164, 950-3:165, 950-4:128, 950-6:151, 950-8:137, 63-1:151, 63-2:113, 63-3:169, 65-1:206, 65-2:159, 68-1:167, 241-5:108, 241-29:113, 373-8:151 und 373-29:113, die Allele D6S258:199, D6S265:122, D6S105:124, D6S306:238, D6S464:206 und D6S1001:180, und/oder Allele, die mit den Einzelbasenpaar-Polymorphismen HHP-1, HHP-19 oder HHP-29 assoziiert sind, ebenfalls verwendet werden, um bei der Identifizierung eines Individuums, dessen Genom 24d1 und/oder 24d2 enthält, beizutragen. Der Untersuchungsschritt kann beispielsweise mittels eines Verfahrens durchgeführt werden, welches umfasst das Amplifizieren von DNA oder RNA unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die den Polymorphismus bei Base 35983 von Tabelle 1 flankieren, und von Oligonukleotiden, die 24d1 und/oder 24d2 flankieren, Oligonukleotidprimern, die mindestens einen der Basenpaar-Polymorphismen HHP-1, HHP-19 und HHP-29 flankieren, Oligonukleotidprimern, die mindestens eines der Mikrosatellitenwiederholung-Allele flankieren, oder Oligonukleotidprimern für eine beliebige Kombination von Polymorphismen oder Mikrosatellitenwiederholung-Allelen davon.
Oligonukleotide, die für diagnostische Assays nützlich sind, haben typischerweise eine Länge von mindestens 8 aufeinander folgenden Nukleotiden, und können eine Länge von mehr als 18 Nukleotiden bis zu mehr als 100 aufeinander folgenden Nukleotiden oder darüber aufweisen. Derartige Oligonukleotide können entweder von der genomischen DNA von 8 oder 9 abgeleitet werden, oder von davon abgeleiteten cDNA-Sequenzen, oder sie können synthetisiert werden.
Zusätzlich sind die Proteine, welche von derartigen cDNA kodiert werden, nützlich für die Erzeugung von Antikörpern, zur Analyse von Genexpression und in diagnostischen Assays, und für die Reinigung von verwandten Proteinen.
E. Allgemeine Verfahren
Die Nukleinsäurezusammensetzungen dieser Erfindung, ob RNA, cDNA, genomische DNA oder. eine Hybride der verschiedenen Kombinationen, können von natürlichen Quellen, umfassend klonierte DNA, isoliert werden, oder in vitro synthetisiert werden. Die beanspruchten Nukleinsäuren können in transformierten oder transfizierten ganzen Zellen vorhanden sein, in einem transformierten oder transfizierten Zelllysat, oder in einer partiell gereinigten oder im Wesentlichen reinen Form vorliegen.
Techniken für die Nukleinsäuremanipulation der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen, wie etwa Subklonierung von Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide kodieren, in Expressionsvektoren, Markierung von Sonden, DNA-Hybridisierung und dergleichen, sind allgemein beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bände 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), das durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Dieses Handbuch wird nachstehend hierin als "Sambrook et al." bezeichnet.
Es gibt verschiedene Methoden zur Isolation der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen. DNA wird beispielsweise von einer genomischen Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek isoliert, unter Verwendung von markierten Oligonukleotidsonden mit Sequenzen, die komplementär zu den hierin offenbarten Sequenzen sind. Derartige Sonden können in Hybridisierungsassays direkt verwendet werden. Alternativ können Sonden zur Verwendung in Amplifikationstechniken wie etwa PCR konstruiert werden.
Um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, wird RNA aus Gewebe wie etwa dem Herz oder dem Pankreas, bevorzugt einem Gewebe bei dem Expression des Gens oder der Genfamilie wahrscheinlich stattfindet, isoliert. Aus der RNA wird cDNA hergestellt und in einen rekombinanten Vektor ligiert. Für Propagation, Screening und Klonierung wird der Vektor in einen rekombinanten Wirt transfiziert. Verfahren zur Herstellung und für das Screening von cDNA-Bibliotheken sind gut bekannt. Siehe Gubler, U., und Hofmann, B.J., Gene 25:263–289 (1983) und Sambrook et al.
Für beispielsweise eine genomische Bibliothek wird die DNA von Gewebe extrahiert und entweder mechanisch geschert oder enzymatisch verdaut, so dass Fragmente von etwa 12 bis 20 kb erhalten werden. Die Fragmente werden danach durch Gradientenzentrifugation von unerwünschten Größen abgetrennt, und in Bakteriophage lambda Vektoren eingebaut. Diese Vektoren und Phagen werden in vitro verpackt, wie in Sambrook et al. beschrieben. Rekombinante Phagen werden durch Plaquehybridisierung analysiert, wie beschrieben in Benton und Davies, Science 196:180–182 (1977). Koloniehybridisierung wird durchgeführt, wie allgemein beschrieben in M. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961–3965 (1975).
Interessierende DNA wird entweder in cDNA-Bibliotheken oder in genomischen Bibliotheken identifiziert, da sie, beispielsweise in Southern Blots, mit Nukleinsäuresonden hybridisieren kann, und diese DNA-Regionen werden durch Standardmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert. Siehe Sambrook et al.
Bei PCR-Techniken werden Oligonukleotidprimer, welche zu den zwei 3'-Grenzen der zu amplifizierenden DNA-Region komplementär sind, synthetisiert. Die Polymerasekettenreaktion wird danach unter Verwendung der zwei Primer durchgeführt. Siehe PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications (Hrsg. Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J., und White, T.), Academic Press, San Diego (1990). Primer können, je nach Wunsch, ausgewählt werden um die gesamten, für eine interessierende Volllängensequenz kodierenden Regionen zu amplifizieren, oder um kleinere DNA-Abschnitte zu amplifizieren.
PCR kann in einer Reihe von Protokollen verwendet werden, um cDNA zu isolieren, die für eine interessierende Sequenz kodieren. In diesen Protokollen werden geeignete Primer und Sonden zur Amplifikation von DNA, welche für eine interessierende Sequenz kodiert, aus einer Analyse der hierin aufgelisteten DNA-Sequenzen geschaffen. Sobald derartige Regionen PCR-amplifiziert vorliegen, können sie sequenziert werden und von der erhaltenen Sequenz können Oligonukleotidsonden hergestellt werden.
Oligonukleotide zur Verwendung als Primer oder Sonden werden chemisch synthetisiert, gemäß dem von Beaucage, S.L., und Carruthers, M.H. zuerst beschriebenen Festphase-Phosphoramidit-Triester-Verfahren, Tetrahedron Lett. 22(20):1859–1862 (1981), unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers, wie beschrieben in Neadham-VanDevanter, D.R., et al., Nucleic Acids Res. 12:6159–6168 (1984). Die Reinigung von Oligonukleotiden erfolgt entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC, wie beschrieben in Pearson, J.D., und Regnier, F.E., J. Chrom. 255:137–149 (1983). Die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids kann verifiziert werden unter Verwendung des chemischen Abbauverfahrens von Maxam, A.M., und Gilbert, W., in Methods in Enzymology 65:499–560 (1980), Hrsg. Grossman, L., und Moldave, D., Academic Press, New York.
Diese Erfindung umfasst auch diagnostische Kits zur Detektion von DNA oder RNA, welche den Polymorphismus bei Base 35983 von Tabelle 1 umfasst, in Gewebe- oder Blutproben, wobei die Kits Nukleinsäuresonden, wie hierin beschrieben, und Instruktionsmaterial umfassen. Das Kit kann auch zusätzliche Komponenten umfassen, wie etwa markierte Verbindungen, wie hierin beschrieben, zur Identifizierung von doppelsträngigen Nukleinsäuren.
Die nachfolgenden Beispiele sind bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht um ihren Umfang zu beschränken. Weitere Varianten der Erfindung werden für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein und sind von den beigefügten Ansprüchen umfasst.
F. EXPERIMENTELLE BEISPIELE
Sequenzierung von 235 kb von einem homozygoten anzestralen (betroffenen) Individuum
In diesen Studien wurde die gesamte genomische Sequenz von einem durch HH betroffenen Individuum für eine Region bestimmt, entsprechend einer 235.033 bp Region, welche das HFE-Gen zwischen den flankierenden Markern D6S2238 und D6S2241 umgibt. Die Sequenz wurde abgeleitet aus einer humanen lymphoblastoiden Zelllinie, HC14, welche für die anzestrale HH-Mutation und Region homozygot ist. Die Sequenz des anzestralen Chromosoms (9) wurde verglichen mit der Sequenz der Region in einem nicht betroffenen Individuum (8), die in der ebenfalls anhängigen U.S.S.N. 08/724,394 offenbart ist, um polymorphe Stellen zu identifizieren. Eine Subgruppe der derart definierten polymorphen Allele wurde weiter untersucht, um ihre Häufigkeit in einer Kollektion von nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Individuen zu bestimmen.
Die Zelllinie HC14 wurde am 25. Juni 1997 bei der ATCC hinterlegt, und trägt die Bezeichnung ATCC CRL-12371.
a. Screening von Cosmid-Bibliotheken
Die Strategie und Methodik zur Sequenzierung der genomischen DNA des betroffenen Individuums war im Wesentlichen, wie in der ebenfalls anhängigen U.S.S.N. 08/724,394 beschrieben: Grundlegend wurde eine Cosmid-Bibliothek konstruiert unter Verwendung von DNA mit hohem Molekulargewicht aus HC14 Zellen. Die Bibliothek wurde im Vektor Supercos (Stratagene, La Jolla, CA) konstruiert. Kolonien wurden unter Verwendung von Standardtechniken auf Biotrans Nylonfilter (ICN) repliziert. Sonden von genomischen Subklonen, welche bei der Erzeugung der Sequenz der nicht-betroffenen, in 08/724,394 offenbarten Sequenz verwendet worden waren, wurden mittels Gelelektrophorese und Elektroporation isoliert. Subklone wurden in einem Abstand von annähernd 20 kb über die gesamte 235 kb Region ausgewählt. Die DNA wurde markiert durch Einbau von 32P dCTP mittels des Randomprimer-Markierungsansatzes. Positiv hybridisierende Klone wurden mittels eines sekundären Screeningschritts zur Reinheit isoliert. Die Enden von Cosmidinserts wurden sequenziert, um zu bestimmen, ob eine vollständige Abdeckung erhalten worden war, und welche Klone einen minimalen Weg von Cosmiden durch die 235 kb Region bilden.
b. Sequenzierung von Proben
Ein Minimalsatz von Cosmidklonen, der ausgewählt worden war um die 235 kb Region abzudecken, wurde mit dem Qiagen Maxi-Prep System präpariert. Zehn Mikrogramm DNA aus jeder Cosmidpräparation wurden in einem Heat Systems Sonicator XL beschallt, und die Enden wurden mit Klenow (USB) und T4-DNA-Polymerase (USB) repariert. Die gescherten Fragmente wurden auf einem 0,7% Agarosegel auf zwischen drei und vier Kilobasen größenselektiert und danach an BstXI-Linker (Invitrogen) ligiert. Die Ligationen wurden auf einem 0,7% Agarosegel Gel-gereinigt und in einen pSP72-Derivat Plasmidvektor kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden in elektrokompetente DH5α-Zellen transformiert und auf LB-Carbenicillin-Platten plattiert. Es wurde eine ausreichende Anzahl an Kolonien gepickt um eine 15-fache Klonabdeckung zu erreichen. Die geeignete Anzahl an Kolonien zur Erzeugung einer einfachen Sequenzabdeckung wurde durch die nachfolgende Gleichung berechnet: Anzahl an Kolonien = Größe des Bakterienklons (in kb)/mittlere Sequenzleselänge (0,4 kb). Diese Kolonien wurden in der 96-Well Qiagen REAL und mit dem 5' nach 3' DNA Prep Kit präpariert, und unter Verwendung von ABI Dye Terminator Srandardprotokollen mit Oligo MAP1 AGCT End-sequenziert. MAP1 war CGTTAGAACGCGGCTACAAT.
c. Genomische Sequenzierung
Die MAP1-Sequenzen von den Cosmidklonen HC182, HC187, HC189, HC195, HC199, HC200, HC201, HC206, HC207 und HC212 wurden mit dem Staden-Package (erhältlich von Roger Staden, MRC) zu Contigs zusammengesetzt. Ein Minimalsatz an 3 kb Klonen wurde ausgewählt zur Sequenzierung mit Oligo-markiertem MAP2, das am entgegen gesetzten Ende des Plasmidvektors sitzt. Die Sequenz von MAP2 war GCCGATTCATTAATGCAGGT. Die MAP2-Sequenzen wurden zusammen mit den MAP1-Sequenzen in die Staden-Datenbank eingegeben, um einen Tiling Path von 3 kb Klonen über die Region hinweg zu erzeugen. Die 3 kb Plasmidbibliotheken wurden gleichzeitig im 96-Well-Format in pox38UR (erhältlich von C. Martin, Lawrence Berkeley Laboratories) transformiert. Die Transformanten wurden danach im 96-Well-Format mit JGM (Strathman et al., P.N.A.S. 88:1247–1250 (1991)) gekreuzt. Alle Kreuzungen der 3 kb Klone innerhalb des Tiling Path wurden auf LB-Carbenicillin-Kanamycin-Platten ausgestrichen und eine Zufallsauswahl von 12 Kolonien pro 3 kb Klon wurde im AGCT-System präpariert. Die Oligos -21: CTGTAAAACGACGGCCAGTC und REV: GCAGGAAACAGCTATGACC wurden verwendet um von beiden Enden des Transposons weg zu sequenzieren. Jeder 3 kb Klon wurde zusammen mit der Endsequenzinformation von allen Cosmidklonen in der Region zusammengesetzt.
Bei manchen Regionen war die Abdeckung der genomischen Sequenz durch Cosmide unvollständig. Alle Lücken in der Sequenz wurden aufgefüllt unter Verwendung von PCR-Standardtechniken, um genomische DNA in diesen Regionen zu amplifizieren, und von ABI Dye Terminator-Standardchemie, um die Amplifikationsprodukte zu sequenzieren.
d. Identifizierung von polymorphen Stellen
Die zusammengesetzte Sequenz der Cosmidklone zusammen mit der PCR-amplifizierten genomischen DNA wurde unter Verwendung des Algorithmus FASTA mit der genomischen Sequenz des nicht betroffenen Individuums verglichen. Den sequenzierten Regionen wurden numerische Werte von 1 bis 235.303 zugeordnet, wobei Base 1 das erste C im CA-Repeat von D6S2238 bezeichnet, und Base 235.303 das letzte T im GT-Repeat von D6S2241 der nicht betroffenen Sequenz ist (8). Tabelle 1 listet die Unterschiede zwischen den zwei verglichenen Sequenzen auf. Es ist zu bemerken, dass die früher offenbarten (Feder et al., Nature Genetics 13:399–408 (1996)) polymorphen Stellen D6S2238 (Base 1), D6S2241 (Base 235.032), 24d1 (Base 41.316) und D6S2239 (Base 84.841) nicht in die Liste von neuen Polymorphismen aufgenommen sind, obwohl sie als Referenz in einer Fußnote zu der Tabelle angegeben sind und in der anzestralen Sequenz beobachtet wurden. In der Tabelle bezeichnet ein Einzelbasenaustausch wie etwa C-T ein C in der nicht betroffenen Sequenz an der angegebenen Basenposition, das als ein T an der entsprechenden Position in der betroffenen Sequenz auftrat. In ähnlicher Weise ist eine Insertion einer oder mehrerer Basen, wie etwa TTT in der betroffenen Sequenz, als "TTT INS" zwischen den angegebenen Basen der nicht betroffenen Sequenz dargestellt. Eine in der betroffenen Sequenz auftretende Deletion einer oder mehrerer Basen, wie etwa AAA DEL ist dargestellt als die Deletion der angegebenen Basen in der nicht betroffenen Sequenz.
e. Charakterisierung seltener Polymorphismen
In dieser Studie wurden etwa 100 der Polymorphismen von Tabelle 1 zur weiteren Charakterisierung willkürlich ausgewählt. Allelfrequenzen in der allgemeinen Population wurden geschätzt durch OLA-Analyse unter Verwendung einer Population von nach dem Zufallsprinzip ausgewählten DNA (der "CEPH" Kollektion, J. Dausset et al., Genomics 6(3):575–577 (1990)). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 bereitgestellt.
Ein Einzelbasenpaarunterschied, der bei Base 35.983 auftritt und als C182.1G7T/C bezeichnet wird (ein A nach G Austausch auf dem Gegenstrang) war im anzestralen Chromosom vorhanden und in den nach dem Zufallsprinzip ausgewählten DNA selten. Dieser Austausch trat in einer nicht kodierenden Region des Hämochromatose-Gens nahe Exon 7 annähernd 5,3 kb entfernt von der 24d1 Mutation (Cys282Tyr) auf. OLA wurde verwendet um 90 Hdmochromatose-Patienten im Hinblick auf den C182.1G7T/C Basenpaaraustausch zu genotypisieren. Die Häufigkeit bei den Patienten, dass C an dieser Position vorlag, betrug 79,4%, im Vergleich zu 5% bei den nach dem Zufallsprinzip ausgewählten DNA.
Fünfundachtzig der 90 untersuchten Patienten hatten identische 24d1 und C182.1G7T/C Gentypen. Vier der restlichen 5 Patienten waren homozygot an 24d1 und heterozygot an C182.1G7T/C; einer war heterozygot an 24d1 und homozygot an C182.1G7T/C. Die für diese Analyse verwendeten Primer waren wie folgt.
PCR Primer für die Detektion:
182.1G7.F 5'-GCATCAGCGATTAACTTCTAC-3'
182.1G7.R 5'-TTGCATTGTGGTGAAATCAGGG-3'
Für den Detektionsassay waren die verwendeten biotinylierten Primer wie folgt.
182.1G7.C 5'-(b)CTGAGTAATTGTTTAAGGTGC-3'
182.1G7.T 5'-(b)CTGAGTAATTGTTTAAGGTGT-3'
Der verwendete phosphorylierte Digoxigenin-markierte Primer war:
182.1G7.D 5'-(p)AGAAGAGATAGATATGGTGG-3'
Das vorstehende seltene Allel ist als ein Marker für 24d1 zu verwenden, und ist besonders nützlich in Screening-Assays auf die wahrscheinliche Anwesenheit von 24d1 und/oder 24d2.
SEQUENCE LISTING

Claims

Oligonukleotid, welches aus mindestens acht bis ungefähr 100 aufeinander folgenden Basen aus der Sequenz der SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement besteht, einschließlich der polymorphen Stelle (Site) an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 („polymorphe Stelle C182.1G7").
Oligonukleotidpaar, welches aus SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41 besteht zur Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement, das die polymorphe Stelle an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 („polymorphe Stelle C182.1G7") enthält.
In vitro-Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Genmutation der allgemeinen hereditären Hämochromatose (HFE) in einer Probe von DNA oder RNA, welches umfasst: Untersuchung der DNA oder RNA auf Anwesenheit oder Abwesenheit eines Haplotyps, welcher das Allel der SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement an der polymorphen Stelle an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 („polymorphe Stelle C182.1G7") umfasst, wobei die Abwesenheit des Haplotyps die wahrscheinliche Abwesenheit der HFE-Mutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist, und die Anwesenheit des Haplotyps die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren weiter umfasst die Untersuchung der DNA oder RNA auf Anwesenheit wenigstens eines der Polymorphismen 24d1, 24d2, HHP-1, HHP-19 oder HHP-29; oder Mikrosatelliten-Repeat-Allele 19D9:205, 18B4:235, 1A2:239, 1E4:271; 24E2:245, 2B8:206, 3321-1:98, 4073-1:182, 4440-1:180, 4440-2:139, 731-1:177, 5091-1:148, 3216-1:221, 4072-2:170, 950-1:142, 950-2:164, 950-3:165, 950-4:128, 950-6:151, 950-8:137, 63-1:151, 63-2:113, 63-3:169, 65-1:206, 65-2:159, 68-1:167, 241-5:108, 241-29:113, 373-8:151, 373-29:113, D6S258:199, D6S265:122, D6S105:124, D6S306:238, D6S464:206 oder D6S1001:180.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Haplotyp weiter umfasst ein Allel der SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement in wenigstens einer polymorphen Stelle der Tabelle 1 mit Ausnahme der polymorphen Stelle C182.1G7.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Haplotyp weiter umfasst ein Allel der SEQ ID NO: 21 oder deren Komplement in wenigstens zwei polymorphen Stellen der Tabelle 1 mit Ausnahme der polymorphen Stelle C182.1G7.
In vitro-Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Genmutation der allgemeinen hereditären Hämochromatose (HFE) in einer Probe von DNA oder RNA, welches umfasst: Untersuchung der DNA oder RNA auf Anwesenheit oder Abwesenheit eines G-Gentyps an der polymorphen Stelle an der Base 35935 der SEQ ID NO: 21 („polymorphe Stelle C182,1G7") oder eines C-Gentyps an der komplementären Stelle, wobei die Abwesenheit des C- oder G-Genotyps an der polymorphen Stelle C182.1G7 die wahrscheinliche Abwesenheit der HFE-Genmutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist, und die Anwesenheit des C- oder G-Gentyps an der polymorphen Stelle C182.10G7 die wahrscheinliche Anwesenheit der HFE-Genmutation im Genom anzeigt, aus welchem die Probe erhalten worden ist.
Kit, welches ein oder mehrere Oligonukleotide des Anspruchs 1 umfasst.
Kit, welches wenigstens ein Oligonukleotidpaar des Anspruchs 2 umfasst.