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Die Erfindung betrifft Verfahren zur genetischen Diagnose von Hämochromatose sowie Son- den zur genetischen Diagnose von Hämochromatose.
Hämochromatose ist durch eine Störung im Eisenstoffwechsel des menschlichen Körpers gekennzeichnet, die zu einer Eisenüberladung führt. Das überschüssige Eisen lagert sich in einer Vielzahl von Organen ab und verursacht irreversible Schäden und daraus resultierende Krankhei- ten. Da die klinischen Symptome der Hämochromatose oft erst im Alter von 40,50 oder mehr Jahren auftreten, dann aber schon irreversible Organschäden vorliegen können, gibt es viele Befürworter einer präsymptomatischen Diagnostik. Umso mehr als durch regelmässigen Aderlass das übermässig aufgenommene Eisen einfach entfernt werden kann.
Für die genetische Diagnose von Hämochromatose wurde bisher im HFE-Gen auf zwei Mutati- onen untersucht, nämlich C282Y und H63D.
Die H63D Mutation ist eine c G Mutation im Codon 63 und verwandelt die Aminosäure 63 von Histidin in Asparaginsäure. Da die Häufigkeit dieser Mutation bei der allgemeinen Bevölkerung hoch ist, ist ihre Rolle in Bezug auf die Diagnose von Hämochromatose unsicher.
Ein weitaus besseres Kriterium für die Diagnose von Hämochromatose ist die C282Y Mutation, die in 65 bis 95% der Betroffenen gefunden wird. Sie ist eine G A Mutation am Nukleotid 845 des open reading frame des HFE-Gens, die die Aminosäure 282 von Cystein in Tyrosin verwan- delt. Der Anteil jener Hämochromatose-Patienten, welche keine C282Y Mutation tragen, variiert und ist z. B. in Italien höher als in nordeuropäischen Ländern. Es ist daher wichtig, neben den bekannten Mutationen jene genetischen weiteren Ursachen im HFE-Gen und in anderen Genen zu finden, welche in Patienten zur Eisenüberladung führen können.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Möglichkeiten zu finden, genetische Ursachen für Hämochromatose zu diagnostizieren.
Die im Folgenden angeführten Nukleotidpositionen entsprechen der Nomenklatur von Feder et al (1996) (1).
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen einer G A Mu- tation am Nukleotid 506 und/oder einer G T Mutation am Nukleotid 502 des HFE-Gens unter- sucht wird. Diese Mutationen wurden bei Untersuchungen an Hämochromatose Familien in Italien gefunden. Die Mutation G A am Nukleotid 506 bewirkt die Umwandlung der zugeordneten Aminosäure 169 von Tryptophan in ein Stopcodon, ebenso wie die Mutation G T am Nukleotid 502 die Umwandlung der zugeordneten Aminosäure 168 von Glutaminsäure in ein Stopcodon bewirkt.
Oder es wird eine biologische Probe auf Vorliegen einer G C Mutation am Nukleotid 502 des HFE-Gens untersucht. Die Mutation G C am Nukleotid 502 bewirkt die Umwandlung der zuge- ordneten Aminosäure 168 von Glutaminsäure in Glutamin.
Als biologische Probe kann dabei Blut, Gewebs-Biopsie, Mundhöhlenabstrich, Fruchtwasser etc. verwendet werden, wobei die biologische Probe, je nach Auswahl des an sich bekannten Untersuchungsverfahrens, ebenfalls bekannten Vorbehandlungen unterworfen wird.
Vorzugsweise wird die biologische Probe auch auf Vorliegen einer C282Y Mutation und/oder einer H63D Mutation untersucht, so dass auch bei Vorliegen nur einer der nunmehr fünf bekannten Mutationen im HFE-Gen die Diagnose von Hämochromatose erfolgen kann.
Wird die biologische Probe auch auf Vorliegen von Nukleinsäuren untersucht, deren HFE-Gen die genannten Mutationen nicht aufweist, lässt sich nachweisen, ob die Mutationen heterozygot oder homozygot vorliegen.
Die Untersuchung kann in an sich bekannter Weise durch Sequenzierung der aus der biologi- schen Probe erhaltenen Nukleinsäure durchgeführt werden.
Oder die biologische Probe wird mit mindestens einer Sonde, die fähig ist mit dem HFE-Gen im Bereich des Nukleotids 506 bei Vorliegen der G A Mutation und/oder im Bereich des Nukleotids 502, bei Vorliegen der G T Mutation und/oder im Bereich des Nukleotids 502, bei Vorliegen der G C Mutation bzw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripierten RNA zu hybridisieren, in Kontakt gebracht und es wird überprüft, ob entsprechende Hybridisierungsprodukte vorliegen.
Wenn die biologische Probe auch auf Vorliegen einer C282Y und/oder einer H63D Mutation untersucht werden soll, wird die biologische Probe mit mindestens einer weiteren Sonde in Kontakt gebracht, die fähig ist, mit dem Bereich bzw. den Bereichen des HFE-Gens zu hybridisieren, der bzw. die die C282Y Mutation und/oder die H63D Mutation trägt, oder fähig ist, mit den entspre-
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chenden Bereichen der transkripierten RNA zu hybridisieren und es wird überprüft, ob entspre- chende Hybridisierungsprodukte vorliegen.
Um zu unterscheiden, ob die Mutationen heterozygot oder homzygot vorliegen, wird vorzugs- weise die biologische Probe mit mindestens einer weiteren Sonde in Kontakt gebracht, die fähig ist, mit einem der gleichen Bereiche zu hybridisieren, wenn keine Mutation vorliegt.
Alternativ kann die biologische Probe mittels Antikörper auf Vorliegen eines verkürzten HFE- Proteins untersucht werden, wobei dieses verkürzte Protein durch Abbruch der Translation durch das Stopcodon entsprechend der G A Mutation am Nukleotid 506 und/oder der G T Mutation am Nukleotid 502 des HFE-Gens gebildet wird. Weiters kann die biologische Probe mittels Antikör- per auf Vorliegen eines HFE-Proteins herkömmlicher Länge untersucht werden, um heteozygote von homozygoten Fällen zu unterscheiden. Die Analyse kann mittels Enzymimmunoassay, durch histo-chemische Verfahren oder Western-Blot erfolgen.
Derzeit werden eine Vielzahl von Verfahren zur Analyse von Mutationen verwendet, unter an- derem RFLP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSP (PCR with sequence-specific primers), Allelespezifische Oligonukleotidhybridisierung, SSCP (single-strand conformation poly- morphism, DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), OLA (oligonucleotide litigation assay), Echtzeit-Fluoreszenz-PCR und DNA Sequenzierung. Wenn RNA untersucht wird, kann das z.B. mittels sog. "NAS-BA" erfolgen oder es kann auch RNA mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben werden, dann mit PCR ampflifiziert und anschliessend chrakterisiert werden. All diese bekannten Analyseverfahren können für das erfindungsgemässe Diagnoseverfahren heran- gezogen werden.
Die erfindungsgemässe Sonde zur Diagnose von Hämochromatose anhand einer Mutation im HFE-Gen ist fähig, mit dem HFE-Gen im Bereich des Nukleotids 506 bei Vorliegen der G A Mutation und/oder im Bereich des Nukleotids 502 bei Vorliegen der G T Mutation und/oder im Bereich des Nukleotids 502 bei Vorliegen einer G C Mutation bzw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripierten RNA zu hybridisieren.
Die folgenden Beispiele beschreiben mögliche Ausführungsformen für erfindungsgemässe Ver- fahren zur genetischen Diagnose von Hämochromatose.
BEISPIEL 1:
DNA Isolation und Aplifikation:
DNA wurde aus antikoaguliertem Blut unter Verwendung herkömmlicher Extraktionsverfahren (Miller et al., 1988) (10) oder kommerziell erhältlicher Reagenzien (GenXtract DNA extraction system, ViennaLab, Wien, AT) isoliert. Die Exon 3-Sequenzen des HFE-Gens wurden in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer 5'-GGA TTG GAG AGC AGC AGA AC-3' und 5'-AAA CTC CAA CCA GGG ATT CC-3' amplifiziert. Jeder Primer wurde mit einer Endkonzentration von 0,4 uM in 1 xPCR Puffer enthaltend 1,5mM Mg2+, 200 uM dNTPs (Epicentre, Madison, Wl), und 0,02 U/ l AmpliTaq DNA Polymerase (PE Biosystems, Foster City, CA) verwendet. Ein Thermo- zyklierprogramm mit 30 Zyklen (94 C für 15s, 58 C für 30s und 72 C für 30s) wurde durchgeführt mit dem GeneAmp PCR System 2400 (PE Biosystems, Foster City, CA).
Sequenzieren:
Die PCR Produkte wurden mit "Centricon-100"Säulen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers gereinigt. Die amplifizierte und gereinigte DNA wurde mit UV-Spektrophotometrie quantifiziert und anschliessend sequenziert unter strikter Einhaltung des Protokolls aus "BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit - with AmpliTaq DNA Polymerase, FS" (PE Applied Biosystems) für die ABI Prism instrumentation (PE Applied Biosystems).
BEISPIEL 2 :
Im Folgenden wird über die erfolgreiche Anwendung der reversen Hybridisierung berichtet, um einen Screeningtest zur Diagnose von HFE-Mutationen zu schaffen. Der Test ist rasch und einfach durchzuführen, der Automatisation zugänglich und flexibel bezüglich zur Ergänzung neuer Mutatio- nen.
Materialien und Methoden
DNA Isolierung und Amplifizierung
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DNA wurde aus antikoaguliertem Blut mittels Standard-Extraktionsmethoden (Miller et al., 1988) (10) oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenziensets (GenXtract DNA Extraction System, ViennaLab) isoliert. Abschnitte aus den Exons 2,3 und 4 des HFE-Gens wur- den in einer einzelnen Multiplex-PCR Reaktion mit 5'-biotinyliertem Primern (Feder et al., 1996 (1) Jeffrey et al., 1999 (32) ; Douabin et al., 1999 (31)) amplifiziert. Jeder der Primer wurde in einer Endkonzentration von 0,4 uM in 1x PCR-Puffer zuzüglich 1,5 mM Mg2+, 200 uM dNTPs (Epicentre, Madison Wl) und 0,02 U/ l AmpliTaq DNA-Polymerase (PE Biosystems, Foster City, CA) einge- setzt.
Der Reaktionsansatz wurde am GeneAmp PCR System 2400 (PE Biosystems) einem Tem- peraturprogramm von 30 Zyklen (94 C für 15s, 58 C für 30s und 72 C für 30s) unterworfen.
Herstellung der Teststreifen
Das Prinzip des enzymatischen Verlängerns ("Tailing") und Immobilisierens von sequenzspezi- fischen Hybridisierungssonden wurde bereits früher beschrieben (Saiki et al., 1989) (34). Sonden von 16 bis 24 Nukleotiden in Länge, spezifisch entweder für das Wildtyp- oder das mutierte Allel einer Mutation, wurden aus einer HFE Datenbanksequenz (GenBank Zugangsnummer Z92910) ausgewählt und mittels eines Phosphoramidit-Standardverfahrens synthetisiert. Ein 3'-poly(dT)- Schwanz ("tail") von 300-500 Nukleotiden wurde enzymatisch durch Inkubation der Oligonukleotide (200 pmol) in Gegenwart von 60 U Terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Amersham Pharma- cia, Buckinghamshire, UK) und 150 nmol dTTP (Epicentre) für 8h bei 37 C angehängt.
Anschlie- #end wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 mM EDTA beendet, und die Tailingeffizienz mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Poly(dT)-getailte Sonden wurden mittels einer speziell angefertigen Schlitzapparatur als parallel Linien von 1 mm Breite auf Nitrozellulose-Membranblätter (Whatman, Maidstone, UK) aufgetragen, getrocknet und über Nacht bei 60 C fixiert ("Backen").
Zusätzlich wurde ein 5'-biotinyliertes Kontroll-Oligonukleotid zur Überprüfung der Detektionsrea- genzien aufgetragen. Aus den fertigen Membranblättern wurden zuletzt 3 mm breite Teststreifen geschnitten.
Die ausgewählten Sonden sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1
Linie Spezifität der Sonde Mutation Zitat
1 (Kontrolle)
2 nt 157 G > A (Exon 2) V53M de Villiers et al.1999 (7)
3 nt 187 C > G (Exon 2) H63D Feder et al., 1996 (1)
4 nt 189 T > C (Exon 2) H63H de Villiers et al.1999 (7)
5 nt 193 A > T (Exon 2) S65C Mura et al., 1999 {9)
6 nt 381 A > C (Exon 3) Q127H de Villiers et al.1999 (7)
7 nt 502 G > C (Exon 3) E168Q vorliegende Erfindung
8 nt 502 G > T (Exon 3) E168Stop vorliegende Erfindung
9 nt 506 G > A (Exon 3) W169Stop vorliegende Erfindung
10 nt 845 G > A (Exon 4) C282Y Feder et al., 1996 (1 )
11 Wildtyp nt 157
12 Wildtyp nt 187-193
13 Wildtyp nt 381
14 Wildtyp nt 502-506
15 Wildtyp nt 845
Reverse Hybridisierung und Detektion
Der gesamte Vorgang der Hybridisierung und Detektion wurde in individuellen Vertiefungen einer dünnwandigen Plastik-Inkubationswanne durchgeführt (Bio-Rad, Hercules, CA). Gleiche Volumina (10 l) an PCR-Produkt und Denaturierungslösung (400 mM NaOH, 10 mM EDTA) wurden gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das alkalische Reaktionsgemisch
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wurde mit Na-Phosphatpuffer, pH 7, neutralisiert, ein Teststreifen wurde eingelegt und für 30 min bei 45 C in einem Schüttelwasserbad hybridisiert. Nach drei stringenten Waschschritten bei 45 C wurden gebundene PCR-Fragmente mittels Streptavidin-Alkalischer-Phosphatase und Farbsubstraten (NBT/BCIP) nachtgewiesen.
Im Falle einer positiven Reaktion war nach 15 min Inkubationsdauer bei Raumtemperatur eine violette Färbung sichtbar.
Ergebnisse
Ein Multiplex-PCR System wurde etabliert, um biotinylierte DNA-Fragmente aus den Exons 2,3 und 4 des HFE-Gens in einer einzigen Amplifizierungsreaktion zu erhalten. Um mögliche Fehler beim Typisieren der C282Y-Mutation aufgrund eines intronischen Polymorphismus (5569 G > A) an der Bindungsstelle des ursprünglichen reversen Primers von Feder et al. (1996) (1) zu vermeiden, wurde das Exon 4-Fragment gemäss Jeffrey et al. (1999) (32) modifiziert.
Zur Entwicklung des Revers-Hybridisierungsassays wurden von Individuen, die folgende exo- nische HFE-Mutationen trugen, DNA-Proben gesammelt : H63D, H63H, S65C, Q127H, E168Stop, W169Stop und C282Y (Tabelle 1). Darüberhinaus wurde eine bisher unbekannte Mutation im Exon 3 (Nukleotid 502 G > C oder E168Q), welche in einer 79-jährigen kaukasischen Frau aus Südafrika identifiziert worden war, in den Test eingebaut. Diese Frau war ausserdem heterozygot für die H63D-Mutation, und ihr Serum-Ferritin war zum Zeitpunkt der Testung mässig erhöht (242 ng/ml; Referenzbereich : 12-119 ng/ml). Ansonsten waren keine auffälligen klinischen Symptome nachweisbar, allerdings war eine familiäre Häufung von sowohl Herzerkrankungen als auch unterschiedliche Arten von Krebserkrankungen bekannt.
Die E168Q-Mutation wurde ursprünglich mittels Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) Analyse (de Villiers et al. 1999 (7) identifiziert und anschliessend durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Eine Reihe von möglichen Sonden zwischen 16 und 24 Nukleotiden in Länge spezifisch entweder für das Wildtyp- oder das mutierte Allel einer der Mutationen, wurde aus der GenBankSequenz für HFE ausgewählt. Nach enzymatischem poly(dT)-tailing wurden die Oligonukleotide auf eine Nitrozellulose-Membran als Anordnung paralleler Linien aufgetragen und mittels Backen fixiert. Zuletzt wurden einzelne Teststreifen aus dem Membranblatt ausgeschnitten. Amplifizierungsprodukte der verschiedenen DNA Proben, welche alle neun Mutationen umfassten, wurden mit den vorläufigen Teststreifen unter gleichen und exakt kontrollierten Stringenzbedingungen hybridisiert. Gebundene biotinylierte Sequenzen wurden mittels Streptavidin-Enzym-Konjugat und Farbreaktion nachgewiesen.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden Sonden ausgewählt, die unter gleichen und standardisierten Bedingungen spezifisch entweder das Wildtyp- oder das mutierte Allel erkannten, und das Design des endgültigen Teststreifens festgelegt. Eine biotinylierte Kontrollsonde, welche unabhängig von der Anwesenheit hybridisierender DNA ein positives Testergebnis liefern sollte, wurde zur Überprüfung der Detektionsreagenzien zusätzlich aufgetragen. Einige beispielhafte Ergebnisse mit verschiedenen Proben, die sowohl Wildtyp- als auch mutierte HFE Allele enthalten, sind in Figur 1 dargestellt. In Fig. 1 sind Teststreifen gezeigt (siehe Tabelle 1 bezüglich Anordnung der Sonden) nach Hybridisierung mit verschiedenen amplifizierten DNAs und Farbreaktion.
Folgende Proben wurden verwendet: nichtmutiert (Spur 1), V53M (Spur 2), H63D/H63D (Spur 3), H63H (Spur 4), S65C (Spur 5), S65C/S65C) (Spur 6), H63D/S65C (Spur 7), H63D/Q127H (Spur 8), H63D/E168Q (Spur 9), H63D/W169Stop (Spur 10), E168Stop/C282Y (Spur 11),C282Y (Spur 12), H63D/C282Y (Spur 13), S65C/C282Y (Spur 14), C282Y/C282Y (Spur 15), negative PCR Kontrolle (Spur 16).
Eine Reihe unterschiedlicher Methoden, darunter Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP), PCR mit sequenzspezifischen Primem (PCR-SSP), Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonukleotiden, SSCP, Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese (DGGE), OligonukleotidLigationsassay (OLA), Echtzeit-Fluoreszenz-PCR, und DNA-Sequenzierung, werden drzeit für den Nachweis von HFE Mutationen angewandt (Feder et al., 1999 (1) ; Jazwinska et al., 1996 (2); Oberkanins et al., 1997 (3); Steffensen et al., 1998 (4): Bollhalder et al., (5) ; Christiansen et al.,1999 (6) ; de Villiers et al., 1999 (7) ; Mangasser-Stephan et al., 1999 (8) ; Mura et al., 1999 (9)).
Die meisten dieser Techniken sind in ihrer Kapazität, mehr als eine Mutation pro Ansatz nachzuweisen, sehr beschränkt, wodurch eine umfassende genetische Analyse sehr arbeitsaufwendig werden kann. Andererseits sind informativere Methoden, wie z. B. DNA-Sequenzierung, für routinediagnostische Laboratorien mit hohem Probendurchsatz ungeeignet. Wir haben erfolgreich die
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Technik der reversen Hybridisierung angewandt, um neun verschiedene HFE Mutationen gleichzei- tig in einem einzigen experimentellen Ansatz nachzuweisen. In der Vergangenheit war diese Methode bereits öfter zur Genotypisierung komplexer Erbkrankheiten, wie etwa Zystischer Fibrose (Chehab and Wall, 1992 (30)) und Thalassämie (Maggio et al., 1993 (33)) sowie infektiöser Agen- tien, wie Hepatitis C Virus (Stuyver et al., 1993 (35)) verwendet worden.
Das Färbemuster einer Mutanten- und der dazugehörigen Wildtyp-Sonde erlaubt die Unter- scheidung von drei möglichen Genotypen : keine Mutation liegt vor, wenn nur die Wildtyp-Sonde gefärbt ist, in Heterozygoten sind beide Signale sichtbar, während in homozygot mutierten Proben ausschliesslich die Mutanten-Sonde positiv ist. Dasselbe gilt im Prinzip für die Mehrzahl von Hete- rozygoten für zwei unterschiedliche Mutationen (Fig. 1, Spuren 8-11,13, 14). Allerdings enthält das HFE-Gen zumindest zwei Regionen, eine davon in Exon 2 (Nukleotide 187-193) und die andere in Exon 3 (Nukleotide 502-506), innerhalb derer mehrere Mutationen in unmittelbarer Nachbarschaft gefunden worden waren. Da die Hybridisierungssonden in diesem Bereich mehr als eine Mutation abdecken, ist kein Wildtyp-Signal sichtbar, wenn zwei Mutationen aus der gleichen Region (z. B.
H63D und S65C) auf unterschiedlichen Chromosomen in derselben Probe vorkommen (Fig. 1, Spur 7). Das Auftreten zweier benachbarter Mutationen auf einem Chromosom würde wiederum zu einem anderen Muster führen, ein solcher Fall wurde bisher allerdings noch nicht beobachtet.
Der hier beschriebene Revers-Hybridisierungsassay ist geeignet, ein wertvolles Hilfsmittel für die Routinediagnostik von unterschiedlichen HFE Mutationen zu werden. Durch die Verwendung einer einzigen Multiplex-PCR Amplifizierungsreaktion und vorproduzierter, gebrauchsfertiger Test- streifen ist die Methode einfach und zuverlässig und kann von der Blutabnahme bis zum fertigen Resultat innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Für hohen Probendurchsatz kann die Testung mit Hilfe im Handel erhältlicher Geräte, wie z. B. dem profiBlot ll T (TECAN AG, Hombrechtikon, Schweiz), automatisiert werden. Die Zahl der vom gegenwärtigen Test erfassten Mutationen lässt sich leicht erhöhen, indem die gleiche Strategie für die Auswahl neuer, zusätzlicher Hybridisierungssonden angewandt wird.
BEISPIEL 3 :
Weiters wird eine Untersuchung von fünf nicht verwandten italienischen Patienten beschrieben.
Hintergrund und Fragestellung:
Die meisten Hämochromatose-Patienten nordeuropäischer Abstammung sind homozygot für die C282Y Mutation des HFE-Gens. In Italien jedoch ist eine grosse Anzahl von Patienten mit Eisenüberladung nicht homozygot für C282Y, weshalb vermutet wurde, dass diesen Fällen andere Mutationen oder genetische Veränderungen zugrunde liegen.
Methoden :
Fünf C282Y heterozygote, nicht verwandte Patienten italienischer Abstammung und mit klassi- schem Phänotyp einer Hämochromatose wurden untersucht. Die codierenden Abschnitte sowie die Exon-Intron Übergänge des HFE Gens wurden analysiert. Die Haplotypen aller Patienten auf Chromosom 6p wurden mit den Mikrosatelliten D6S265, D6S105 und D6S1281 bestimmt.
Ergebnisse :
Zwei neue Nonsens-Mutationen des HFE-Gens wurden im Exon 3 des C282Y-negativen Chro- mosomes identifiziert : erste eine G # T Mutation im Codon 168 wurde in drei Patienten und die zweite eine G # A Mutation im Codon 169 in den anderen nachgewiesen.
Jede der beiden Nonsense Mutationen wurde in C282Y-heterozygoten, nicht verwandten Pati- enten mit klassischem Hämochromatose Phänotyp aus Italien gefunden. Das bestätigt die Annah- me, dass der genetische Hintergrund von Hämochromatose in Italien weniger homogen ist als in nordeuropäischen Ländern und dass in C282Y- oder H63D-heterozygoten Patienten mit Eisen- überladung weitere Mutationen vorliegen. Dieses Ergebnis ist von praktischer Bedeutung für die Diagnose von Hämochromatose und für Strategien zum Screening.
Einleitung
Hereditäre Hämochromatose (HH) (11) ist eine sehr häufige autosomal-rezessive Erkrankung, welche durch erhöhte Aufnahme von Eisen und progressive Eisenüberladung charakterisiert ist (12). Das HFE-Gen wurde 1996 identifiziert und zwei Mutationen, C282Y und H63D, wurden
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ursprünglich beschrieben (1). Die meisten Patienten mit HH sind homozygot für C282Y (1,13, 14, 15). 5 - 7% der Fälle sind C282Y/H63D gemischtheterozygot (1,16) und weisen ebenso wie die sehr seltenen H63D homozygoten Fälle meist eine abgeschwächte Form der Hämochromatose auf (17). Ein geringer Anteil der Fälle mit HH Phänotyp ist heterozygot für C282Y oder H63D oder weder für C282Y noch für H63D. Diese Fälle scheinen in Südeuropa häufiger zu sein als in Nord- europa (18,19).
In einer kollaborativen Studie an 188 italienischen Patienten mit HH Phänotyp konnte in 28% auf einem der Chromosomen keine Mutation identifiziert werden (19). Das Vorliegen von anderen HFE Mutationen, anderen 6p-assoziierten Mutationen oder aber das Vorhandensein einer anderen Form genetisch bedingter Eisenüberladung, welche nicht auf Chromosom 6 lokali- siert sind, wurde in manchen dieser Fälle vermutet (19, 20, 21).
Drei weitere HFE Mutationen wurden heterozygot und gemeinsam mit C282Y in einzelnen Fäl- len mit klassischer HH gefunden ; eineSplice-Mutation (IVS3 + 1G-T), verbunden mit dem obliga- ten Ausfall von Exon 3 (22) und zwei Missense-Mutationen (1105T und G93R) in der a1 Domäne, welche vermutlich die Bindung des HFE Proteins an den Transferrin-Rezeptor beeinflusst (23). Die Missense-Mutation S65C wurde gehäuft auf sowohl C282Y- als auch H63D-negativen HH Chro- mosomen lokalisiert gefunden und es wird vermutet, dass S65C im Zusammenhang mit C282Y oder H63D die Ursache für eine weitere milde Form von HH ist (9). Weitere Missense-Mutationen wurden beschrieben, aber ihre Bedeutung für die Pathogenese von HH ist nicht bekannt (7).
Mit diesem Stand des Wissens wurde an C282Y heterozygoten italienischen Patienten mit klassischem HH Phänotyp die Hypothese geprüft, ob andere HFE Mutationen in nicht C282Y- mutierten Chromosomen als Ursache für den vollständig ausgeprägten Phänotyp gefunden werden können. Hier wird die Untersuchung von fünf dieser Patienten beschrieben.
Materialien und Methoden
Patienten
Fünf C282Y-heterozygote und H63D negative Probanden aus Italien mit HH wurden unter- sucht. Alle wiesen phänotypische Merkmale klassischer homozygoter HH auf:
1.Erhöhte Transferrin-Sättigung ( > 50% nach Fasten) und erhöhte Konzentration von Serum-
Ferritin;
2. Hepatozelluläre Hemosiderin-Ablagerungen dritten und vierten Grades nach Scheuer et al.(24);
3. Leber-Eisenindex 2, Anämie, chronische Hepatitis B und C sowie überdurchschnittlicher
Alkoholkonsum sowie Bluttransfusionen konnten ausgeschlossen werden.
Von allen Patienten und deren Verwandten liegen Einverständniserklärungen zur Studie vor.
Klinische Untersuchungen
Fibrose und Zirrhose wurden durch Biopsie der Leber befundet. Alle Zirrhosen waren vom Typ A nach Child. Das Vorliegen von klinischen Symptomen einer HH wurden nach beschriebenen Kriterien befundet (25). Transferrin-Sättigung und Serum-Ferritin wurden nach Standardmethoden bestimmt. Leber-Eisenkonzentrationen (hepatitic iron concentration, "HIC") wurden mittels Ato- mabsorptionsspektrometrie bestimmt (Perkin-Elmer S2380, Nowak, CT) und daraus der Leber- Eisenindex (hepatitic iron index, "HII") (Verhältnis von HIC [ mol/g Trockengewicht] zu Alter [Jah- re] ) berechnet. Die Gesamtmenge an durch Aderlass (IR) entferntem Eisen wurde, wie beschrie- ben, bestimmt (25). Die geographische Abstammung der Patienten wurde bis in die vierte Eltern- generation ermittelt.
Molekulare Untersuchungen
Genomische DNA wurde aus periphären Blutzellen isoliert. Die C282Y und H63D Mutationen wurden mittels Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction, "PCR") und Verdau mit den Restriktionsenzymen Rsa I bzw. Bei 1 untersucht (18). Die Mikrosatelliten Marker D6S265, D6S105 und D6S1281 wurden, wie beschrieben eingesetzt (26). HLA-A Antigene wurden in Mikrolympho- toxizitätstests bestimmt. Haplotypen wurden entsprechend den Verteilungen der Marker in den Familien erstellt.
Die vollständige kodierende Sequenz sowie die Exon-Intron Grenzen des HFE-Gens wurden mittels PCR amplifiziert, wie von Carella et al. (18) beschrieben. Die Nukleotidsequenz beider DNA-Stränge wurde in allen Probanden und in jenen Verwandten mit identen, C282Y-negativen Chromosomen bestimmt mittels Dideoxy-Kettenbestimmungsreaktion mit Sequenase 2. 0 (USB Amersham, Cleveland, Ohio) und 35S-a-dATP nach dem Protokoll des Herstellers. Die Reaktions-
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ansätze wurden über 6%ige denaturierende Polyacrylamidgele elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographiert. Die gleichen Primer wurden sowohl für die PCR als auch die Sequenzreaktion eingesetzt.
Als weitere Bestätigung für die neuen Mutationen (siehe Ergebnisse) wurde ein Re-striktionsfragment-Längenpolymorphismus durchgeführt (restriction fragment length poly- morphism, "RFLP"). Da die beiden Mutationen weder eine Schnittstelle für Restriktionsenzyme generierten noch zerstörten, wurde der die Mutationen tragende Abschnitt von Exon 3 mit PCR amplifiziert und zwar unter Verwendung von Oligonukleotiden mit veränderter Ausrichtung entspre- chend jeder Mutation (Bria-F: 5'TGGCCCACCAAGCTGGACT 3' ; Dom-F : 5'GCCTGGCCCACCAAACTG 3'), dass dabei für jede Mutation eine informative Restriktionsen- zymschnittstelle für BsrSI in der normalen ("wild-Typ") HFE Sequenz entstand. Der Antisense- Primer war gleich wie für die Sequenzreaktion.
In Tabelle 2 sind die klinischen Daten und die Eisen-Werte der fünf Probanden dargestellt.
Tabelle 2 - Daten der fünf Probanden mit Hämochromatose
EMI7.1
<tb> Sex <SEP> Alter <SEP> TS <SEP> SF <SEP> Scheuer's <SEP> HIC <SEP> HII <SEP> IR <SEP> klinische
<tb>
<tb> Jahre <SEP> % <SEP> g/L <SEP> Grad <SEP> pmol/g <SEP> g <SEP> Komplikationen
<tb>
<tb> 1 <SEP> M <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 694 <SEP> 4 <SEP> 238 <SEP> 4. <SEP> 9 <SEP> 4 <SEP> keine
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> M <SEP> 47 <SEP> 79 <SEP> 1206 <SEP> 4 <SEP> 359 <SEP> 7. <SEP> 6 <SEP> 23 <SEP> C
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> M <SEP> 42 <SEP> 86 <SEP> 608 <SEP> 3 <SEP> 144 <SEP> 3. <SEP> 4 <SEP> 3. <SEP> 6 <SEP> keine
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> M <SEP> 50 <SEP> 106 <SEP> 2740 <SEP> 4 <SEP> 425 <SEP> 8. <SEP> 5 <SEP> 21 <SEP> C,H,D
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> M <SEP> 66 <SEP> 100 <SEP> 1351 <SEP> 4 <SEP> 421 <SEP> 5. <SEP> 4 <SEP> - <SEP> C,H,A,D
<tb>
Legende :
TS = Transferrin-Sättigung ; = Serum Ferritin;
HIC = Leber-Eisenkonzentration; HII = Leber-Eisenindex;
IR = ausgeschiedenes Eisen ; C = Leberzirrhose; H = Hypogonadismus; A = Arthropathie ; = Diabetes
Drei Patienten (1, 2 und 3) stammen aus einem Tal im Nordwesten (Ossola) und zwei (4 und 5) aus der Umgebung von Monza (Brianza). Durch Sequenzanalyse des HFE-Gens wurden zwei neue Nonsense-Mutationen im Exon 3 in heterozygotem Status identifiziert. Die erste, ein G nach
EMI7.2
gefunden. Die zweite, ein G nach A Austausch im Codon 169 (TGG TAG, Trp Stop) wurde in Probanden aus der Region Brianza gefunden. Die neuen Mutationen wurden deshalb HFE-Ossola und HFE-Brianza nach der Herkunft der Probanden benannt.
In Familie 1 wurde ein betroffener Bruder mit gleichem Chromosom 6p-Haplotyp und den glei- chen HFE Mutationen wie der Proband befundet. Sein HIC war 176,2 mol/g und der HII war 3,92.
Die zwei neuen Mutationen waren in vollständigem Kopplungs-Ungleichgewicht mit C282Y und H63D Mutationen. HFE-Ossola war mit dem Haplotyp D6S265-3, HLA-A24, D6S105-5 und D6S1281-6 in Familie 1 und 2 assoziiert, während in Familie 3 der Haplotyp davon abwich in den Markern D6S265 und HLA-A, was auf ein Rekombinationsereignis zwischen HLA-A und D6S105 schliessen lässt. HFE-Brianza war mit Haplotyp D6S265-3, HLA-A24, D6S105-6 und D6S1281-6 assoziiert.
In diesem Manuskript werden fünf C282Y heterozygote Patienten italienischer Abstammung mit klassischer HH und zwei neuen Nonsense-Mutationen im HFE-Gen beschrieben. Die beiden Mutationen führen zu einem Stop Codon an Position 502 und 506 des offenen Leserahmens (nt 502 GAG-TAG und nt 506 TGG- > TAG) und in weiterer Folge zu Proteinen mit Fehlen der a3 Domaine, der transmembranalen Domaine und des cytoplasmatischen Abschnitts. Diese Mutatio- nen bewirken vermutlich im Gegensatz zu C282Y eine vollständige Funktionsstörung des HFE Proteins vergleichbar mit der partiellen Deletion von Exon 4 in HFE-deffizienten Mäusen (27,28).
Folglich könnten die so mutierten Allele die Funktion von Null-Allelen tragen. Es kann vermutet werden, dass die Kombinationen dieser Mutationen mit einem heterozygoten C282Y zu einem
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stark ausgeprägten Phänotyp führt. Drei der fünf Probanden (2,4 und 5) wiesen auch schwere Krankheitsbilder auf mit hohem Ausmass an Eisenüberladung und HH-bedingten klinischen Beschwerden. Proband 3 wies einen weniger ausgeprägten Phänotyp auf; vermutlich da er seit zehn Jahren regelmässig Blut spendete, während Proband 1 und sein betroffener Bruder ebenfalls einen wenig ausgeprägten Phänotyp ohne offensichtlich schützende Faktoren, wie Blutverlust oder verschlechterte Absorption, aufweisen. Es besteht also phänotypisch Heterogenität in diesen Patienten, die sowohl auf Umweltfaktoren als auch auf genetischen Faktoren beruhen können.
Die Existenz von den Phänotyp in C282Y-homozygoten Patienten modulierenden Genen in der Region um D6S105 wurde postuliert (25,29), aber weitere Studien sind notwendig, um den GenotypPhänotyp Zusammenhang in HH Patienten besser erklären zu können.
Sowohl HFE-Ossola als auch HFE-Brianza heterozygote Patienten wiesen keine erhöhten Eisenwerte auf, darauf hinweisend, dass auch eine Mutation nicht zu einer Eisenüberladung im heterozygoten Zustand führt. Auch die heterozygote Kombination von HFE-Ossola oder HFEBrianza mit H63D zeigte kein Zeichen von Eisenüberladung. Da aber diese Probanden Frauen oder sehr jung waren, kann nicht ausgeschlossen werden, dass, wie bei C282Y, die Kombination einer dieser beiden Nonsense Mutationen mit H63D oder einer anderen "milden" HFE Mutation zu einem HH Phänotyp mit niedriger Penetranz führt (17).
Dieses ist die erste Beschreibung von Nonsense-Mutationen im HFE-Gen und auch der erste Befund über mehrere nichtverwandte von HH betroffenen Trägern einer heterozygoten C282Y mit einer anderen Mutation als H63D. Die beiden hier beschriebenen Mutationen entstanden wahrscheinlich in den genannten nördlichen Regionen Italiens und haben sich vermutlich durch einen "Founder-Effekt" verbreitet. Da in den beiden geographischen Regionen zwischen den betroffenen Familien bis in die vierte Generation keine Blutsverwandtschaft vorliegt, sollten die beiden Mutationen vor weit mehr als hundert Jahren entstanden sein. Die Untersuchung der HFE AllelFrequenzen in HH Patienten aus diesen beiden italienischen Regionen Ossola und Brianza zeigte, dass die heterozygote Kombination von C282Y mit HFE Brianza oder HFE Ossola gleich häufig oder häufiger ist als mit H63D.
C282Y/HFE-Ossola wurde in 25% der Probanden aus Ossola gefunden (C282Y/H63D in 8,3%) und sowohl C282Y/HFE-Brianza als auch C282Y/H63D in 8,4% der HH Probanden aus Brianza. Während die geringe Häufigkeit von C282Y/H63D heterozygoten Kombinationen mit einer niedrigen Penetranz dieses Genotyps assoziiert ist (von 0,44% bis 1,5% in unterschiedlichen Populationen) (17), wird angenommen, dass die Genotypen C282YIHFEBrianza oder C282Y/HFE-Ossola eine 100%ige Penetranz aufweisen, aufgrund der Schwere beider Mutationen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass HH in Italien nicht so homogen ist wie in Nordeuropa und weisen hin auf das mögliche Vorhandensein anderer HFE-Mutationen, die in unterschiedlichen Ländern verschieden relevant sind. Das Wissen um diese Mutationen sollte wichtige Konsequenzen für die Diagnose und das Screening von HH implizieren.
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PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zur Diagnose von Hämochromatose, dadurch gekennzeichnet, dass eine bio- logische Probe auf Vorliegen einer G A Mutation am Nukleotid 506 und/oder einer
G T Mutation am Nukleotid 502 des HFE-Gens untersucht wird.
2. Verfahren zur Diagnose von Hämochromatose, dadurch gekennzeichnet, dass eine bio- logische Probe auf Vorliegen einer G C Mutation am Nukleotid 502 des HFE-Gens untersucht wird.