DE69636725T2 - Verfahren zur trennung und/oder erkennung von dns-molekülen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren zum Auftrennen und Identifizieren von DNA-Molekülen in Gemischen von DNA-Molekülen mit derselben Anzahl an Nukleotiden, jedoch unterschiedlichen Basensequenzen.
  • 1. Hintergrund der Erfindung
  • 1.1 Allgemeine Einführung
  • Viele Gene kommen als multiple Allele vor, die voneinander durch kleine Unterschiede in der Sequenz abweichen. Individuen sind oftmals bezüglich der Allele von bestimmten Genen heterozygot; d.h., dass Individuen oftmals zwei unterschiedliche Allele desselben Gens aufweisen.
  • Unter manchen Umständen ist es erwünscht, die Allele eines Gens aus einem Gemisch von Allelen abzutrennen. Wird beispielsweise die Durchführung eines Tests gewünscht, um zu bestimmen, welche Allele eines Gens von einem heterozygoten Individuum getragen werden, so ist es oftmals vor der Durchführung des Tests erforderlich, die beiden Allele zu trennen, da das Vorhandensein von zwei Allelen in einem Test den Erhalt aussagekräftiger Ergebnisse verhindern kann.
  • Angesichts der Tatsache, dass der Unterschied zwischen den Allelen eines Gens in lediglich einem einzigen Nukleotid bestehen kann, ist es oftmals schwierig, die Allele aus einem Gemisch von Allelen herauszutrennen. Diese Schwierigkeiten sind bei Genen erhöht, die eine große Anzahl unterschiedlicher Allele aufweisen, wie etwa die Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Gene (z.B. die Humanes Leukozytenantigen-(HLA)-Klasse I und II-Gene, die über 500 bekannte Allele aufweisen).
  • Die Identität der Allele ist in einem klinischen Zusammenhang oftmals wesentlich; zum Beispiel ist das HLA-Matching zwischen einem Knochenmarks- oder Nierenempfänger und einem Spender einer der Hauptfaktoren, die den Transplantationserfolg beeinflussen. Bis heute sind die günstigsten Knochenmarkstransplantations-(BMT)- und Nierentransplantations-Ergebnisse unter Einsatz von Geschwister-Spendern erzielt worden, die genotypisch mit dem Empfänger HLA-identisch sind, doch stehen solche Spender für lediglich etwa 30% der Patienten zur Verfügung(1-5). Die BMT unter Einsatz nicht-verwandter Spender kann erfolgreich sein, doch zeigen sich bei diesen Transplantationen höhere Raten eines Transplantatversagens, ein erhöhtes Auftreten und Schweregrad der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und häufigere Komplikationen, die mit einer verzögerten oder ungenügenden Immunrekonstitution(4) in Zusammenhang stehen.
  • Neue molekularbiologische Verfahren für den Nachweis von genetischem Polymorphismus bieten derzeit die Möglichkeit, z.B. das HLA-Matching von nicht-verwandten Spendern zu verbessern, als auch ein Forschungsinstrument, um die Beziehung zwischen Disparität und Transplantatkomplikationen zu untersuchen. Diese molekularen Typisierungsmethoden umfassen die Sequenz-spezifische Amplifikation, die Hybridisierung mit Oligonukleotid-Sonden, die Heteroduplex-Analyse, den Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus und die direkte Nukleotidsequenzierung.
  • Jeder dieser molekularen Ansätze ist für die routinemäßige HLA-Klasse II-Typisierung angewendet worden(6), doch hat eine Vielzahl von Gründen bezüglich der HLA-Klasse I-Genstruktur ihre Anwendung für die Klasse I-Typisierung verkompliziert. Die Gründe für diese Einschränkungen liegen im extensiven Polymorphismus jedes Klasse I-Locus und dem Grad der Sequenzhomologie zwischen den Loci. Außerdem kann die Sequenzhomologie zwischen klassisschen und nicht-klassischen Klasse I-Genen und den berichteten 12 Pseudogenen Probleme für die spezifische Locus-Amplifikation verursachen(7).
  • Der geringe Umfang der "Allel-spezifischen" Sequenzen an polymorphen Stellen stellt ein Merkmal der HLA-Klasse I-Gene dar, das die Lösung aller derzeitigen DNA- Typisierungsansätze eingeschränkt hat. Eine "Allel-spezifische" Sequenz ist eine Sequenz, die in nur einem Allel vorhanden ist und daher zur Unterscheidung des Allels von anderen Allelen genutzt werden kann.
  • Das Hauptproblem, durch welches die Identifizierung eines Allels verkompliziert wird, ist das Vorhandensein eines Gemischs von Allelen, ebenso wie die Kontaminierung durch Segmente der DNA, die Homologie zu dem Allel aufweisen, dessen Identifizierung gewünscht wird, und die bei der PCR koamplifiziert werden. Die derzeitigen Typisierungsmethoden sind manchmal nicht dazu in der Lage, das Allel, dessen Identifizierung gewünscht wird, von kontaminierenden DNA-Fragmenten zu trennen.
  • Trenntechniken wie der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP) können dieses Problem lediglich teilweise lösen.
  • Verfahren für die Trennung der Allele
  • 1.2 Sequenz-spezifische Primer-Amplifikation (PCR-SSP)
  • Dieses Verfahren nützt sowohl die Gruppen-spezifischen als auch, sofern vorhanden, Allel-spezifischen Sequenzstellen im PCR-Primer-Design aus. Das SSP-Design basiert auf dem „Amplification Refractory Mutation System" (ARMS), bei dem eine Fehlpaarung an dem 3'-Rest des Primers die nicht-spezifische Amplifikation inhibiert(8,9).
  • Obschon jede SSP-Reaktion einzeln vielleicht keine ausreichende Spezifität liefert, um ein Allel zu definieren, ermöglicht die Verwendung von Kombinationen der Sequenz-spezifischen Primer die Amplifikation ihrer gemeinsamen Sequenzen, um die gewünschte HLA-Spezifität zu erhalten.
  • Trotz ihrer hohen Genauigkeit ist die PCR-SSP jedoch lediglich in einigen Fällen informativer als die Serologie. Der Grund dafür ist das geringe Vorkommen von Allel-spezifischen Sequenzmotiven in den Exons, und diese Einschränkung hat eine enorme Menge an Forschungsarbeit zur Identifizierung von Allel-spezifischen Motiven sogar in den Intronsequenzen stimuliert(10). Bis heute hat dieser Ansatz jedoch nicht wesentlich zur Identifizierung weiterer Allele beigetragen.
  • Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es eine begrenzte Anzahl an polymorphen Sequenzen detektiert, die zur Vorhersage der gesamten Sequenz genützt werden. Ist ein unbekanntes Allel in einer bestimmten Probe vorhanden, so kann diese Extrapolation inkorrekt sein.
  • Außerdem beruht die erfolgreiche Anwendung der Technik auf der Gruppen-spezifischen Amplifikation, weshalb die vorherige Kenntnis einer breiten HLA-Spezifität erforderlich ist.
  • 1.3 Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP)
  • Diese Technik basiert auf der elektrophoretischen Mobilität einzelsträngiger Nukleinsäuren in einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel, die in erster Linie von der Sequenz-bezogenen Konformation abhängt(11-13). Die Technik kann zur Isolierung einzelner Allele angewendet werden, die dann für eine weitere Manipulation und Analyse verwendet werden könnten, wie etwa der Direktsequenzierung. Das erhaltene Muster der Banden nach der Elektrophorese kann für ein Allel diagnostisch sein(14,15).
  • Der wichtigste Nachteil der SSCP besteht in der Neigung eines DNA-Einzelstrangs, viele konformationelle Formen unter denselben elektrophoretischen Bedingungen anzunehmen, was zum Vorhandensein mehrerer Banden von dem Produkt führt; dies macht die Identifizierung schwieriger. Außerdem liegt ein hoher Grad an Variation und Inkonsistenz in der Empfindlichkeit dieses Verfahrens zum Nachweisen von Mutationen oder allelischen Variationen vor, und es gibt eine physikalische Beschränkung der Größe des DNA-Fragments, die in der Größenordnung von 200–400 Basenpaaren liegt(16).
  • 1.4 Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) und Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGEE)(17,18)
  • Das zugrundliegende Prinzip beider Techniken beruht auf dem Unterschied in den Schmelzgraden zwischen zwei Allelen (doppelsträngige DNA), was zu einer Vermin derung der Mobilität der DNA-Fragmente in Polyacrylamidgelen führt, die ein denaturierendes Reagenz (DGGE) oder einen Temperaturgradienten (TGGE) enthalten.
  • Beide Techniken sind häufig für das Screening von Mutationen in genetischen Systemen mit ein oder zwei Varianten angewendet worden. Sie werden nur selten für die Trennung von Allelen in hochpolymorphen Systemen wie HLA verwendet.
  • Beide Techniken erfordern spezifische Bedingungen für ein bestimmtes System unter Erforschung, und außerdem sind sie möglicherweise dort, wo zwei Allele gemeinsame Sequenzsegmente mit niedrigen Schmelzpunkten teilen, nicht immer differenziert. Das gleichzeitige Schmelzen beider Allele wird sehr ähnliche Verzögerungen erzeugen.
  • 1.5 Klonierung von DNA
  • Dies stellt das klassische Verfahren für die Präparierung einer einzelnen Sequenz dar, d.h. der von einem einzelnen Allel abgeleiteten Sequenz. Eine Vielfalt von Konstrukten ist verwendet worden, um das erforderliche DNA-Fragment in ein Plasmid einzuführen und ausreichende Kopien für die Analyse zu züchten. Dieses Verfahren ergibt reine Proben des Analyts, ist aber zeitaufwändig in der Durchführung, da normalerweise mehrere Klone getestet werden, um die Homogenität des Produkts zu ermitteln.
  • Verfahren für die Identifikation der Allele
  • 1.6 Heteroduplex-Analyse
  • Perfekt gepaarte DNA-Duplexe sind stabiler als solche mit Basen-Fehlpaarungen. Die Instabilität des Duplex erhöht sich mit der Anzahl der Nukleotid-Fehlpaarungen; diese führen zur Bildung von Schleifen und Krümmungen in dem linearen DNA-Fragment, die einen zunehmenden "Zugeffekt" in Polyacrylamidgelen erzeugen, welcher die betroffenen migrierenden Banden verzögert(19-12).
  • Fehlgepaarte DNA-Hybride (Heteroduplex) können am Ende jedes PCR-Zyklus zwischen koamplifizierten Allelen von einem bestimmten Locus oder Loci aufgrund einer Primer-Kreuzreaktion an Stellen mit ähnlichen Sequenzen entstehen. Während der Annealing-Stufe jedes Zyklus der PCR kann sich ein Anteil der Sense-Stränge des Allels mit Antisense-Strängen unterschiedlicher Allele vereinigen. Das bei der PAGE-Analyse erhaltene Bandenmuster kann zur Identifizierung der an der Reaktion beteiligten Allele nützlich sein(22-24).
  • Die Heteroduplex-Analyse stellt einen Ansatz dar, der zum Vergleich der HLA-Gene von einem bestimmten Spender und Empfänger angewendet worden ist. HLA-Gene werden amplifiziert, denaturiert (zu Einzelsträngen aufgeschmolzen) und miteinander unter Bedingungen vermischt, die die Renaturierung zum Erhalt doppelsträngiger Moleküle fördern. Sind die HLA-Gene eines Spenders und Empfängers ähnlich, doch nicht identisch, so werden sich Heteroduplexe bilden, die aus einem Strang eines Allels von Spender-Ursprung und einem zweiten Strang eines unterschiedlichen Allels von Empfänger-Ursprung bestehen(25,26). Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens kann durch Zusetzen von DNA von einem HLA-Allel erhöht werden, das nicht im Spender oder Empfänger vorhanden ist. WO 95/01453 beschreibt einen Heteroduplex-Mobilitäts-Assay für die Analyse der Nukleinsäure-Diversität.
  • Der wichtigste Vorteil der Heteroduplex-Analyse ist der, dass sie relativ einfach und preiswert ist. Zu den Grenzen dieses Ansatzes zählen die Unmöglichkeit, bestimmte HLA-Disparitäten zu detektieren, der potenzielle Nachweis irrelevanter stummer Mutationen und das Fehlen einer spezifischen Information bezüglich der Beschaffenheit der beteiligten Allele.
  • Bis heute ist dieser Ansatz für die HLA-Klasse II-Typisierung mit begrenztem Erfolg angewendet worden. Seine Anwendung auf die Klasse I-Typisierung ist nicht erfolgreich gewesen. US-Patent Nr. 5,468,611 beschreibt ein Verfahren für die HLA-Typisierung.
  • 1.7 Sequenz-spezifische Oligonukleotid-Sonden (PCR-SSO)
  • Die SSO-Typisierung bezieht die Amplifikation von HLA-Allelen von einem bestimmten Locus ein, gefolgt von der Hybridisierung mit einem Panel von Oligonukleotid-Sonden zum Nachweis polymorpher Sequenzen, die ein Allel oder eine Gruppe von Allelen von allen anderen unterscheidet. In polymorphen Systemen differenziert eine einstufige Vorgehensweise möglicherweise nicht immer alle der bekannten Allele; ausgewählte Primer können verwendet werden, um die Amplifikation individueller Allele zu erreichen, die dann durch spezifische Sonden identifiziert werden. Diese zweite Stufe der Oligotypisierung wird oftmals als hochauflösende Oligotypisierung bezeichnet(6).
  • Die Vorteile des PCR-SSO-Verfahrens sind Spezifität, Empfindlichkeit, Einfachheit, Reproduzierbarkeit, und es ist relativ kostengünstig durchführbar und erlaubt eine gleichzeitige Prozessierung vieler Proben. Dieser Ansatz ist zum Beispiel auf die Typisierung der HLA-Klasse II-Allele erfolgreich angewendet worden.
  • Der wichtigste methodologische Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Komplexität der Technik in direktem Bezug zur Anzahl der Allele unter Untersuchung steht und dass das Vorhandensein zweier Allele im heterozygoten Zustand den Identifikationsprozess verkomplizieren kann.
  • Das Veröffentlichen von Oligotypisierungsmethoden könnte zu einer inkorrekten Interpretation der Daten führen, wenn bestimmte Kombinationen kürzlich entdeckter Allele in einer Probe vorhanden sind. Es ist daher erforderlich, die im Identifikationsschritt verwendeten Reagenzien zu aktualisieren. Mehrere Typisierungs-Ansätze für HLA-A und -B, die auf PCR-SSO basieren, sind veröffentlicht worden; diese erfordern typischerweise 40 bzw. 90 Sonden(27,28). Die Durchführung dieser Verfahren ist zeitaufwändig und die erzielte Auflösung ist lediglich mäßig.
  • 1.8 Nukleotid-Sequenzierung
  • DNA-Templaten für die Sequenzierung können mittels einer Vielzahl von Methoden erzeugt werden, von denen die bekannteste die Sequenzierung von klonierten genomischen oder cDNA-Fragmenten oder die direkte Sequenzierung von DNA-Fragmenten, die ausschließlich mittels PCR produziert sind, ist (wie in obigem 1.2). Diese Templaten stellen eine einzelne Sequenz dar, die von einem Haplotyp stammt. Allele von beiden Haplotypen einer heterozygoten Probe können koamplifi ziert und unter Verwendung eines Locus-spezifischen PCR-Primers gemeinsam sequenziert werden.
  • Die neue Verfügbarkeit von Computer-Software, die dem Anwender das Alignment der abgeleiteten Sequenz gegen etablierte Sequenz-Bibliotheken ermöglicht, hat die Analyse und Allel-Zuordnungen für heterozygote Proben, bei denen beide Templaten zur selben Zeit sequenziert werden, erleichtert(27). Die Effizienz dieses Verfahrens hängt von der Menge und Häufigkeit unklarer heterozygoter Kombinationen ab, da es beispielsweise viele HLA-Klasse II-Allele gibt, die bei gemeinsamem Vorhandensein in einer Probe mittels dieses Verfahrens nicht differenziert werden können. Die Zahl solcher unklarer Kombinationen von Allel-Sequenzen ist für HLA-Klasse I-Allele sogar noch größer.
  • Bis heute sind zwei HLA-Klasse I-Typisierungsansätze, basierend auf der Direktsequenzierung, veröffentlicht worden. Beide erfordern eine serologische Information, gefolgt durch die Allel-spezifische PCR-Amplifikation und dann die Direktsequenzierung(14,30). Eine jüngere Praxis besteht jedoch in der Amplifizierung von DNA-Fragmenten ohne vorherige Kenntnis der Allel-Gruppen und in der Anwendung einer Locus-spezifischen PCR-Amplifikation. Theoretisch sollten diese Ansätze die höchste Auflösung ergeben, doch sind sie durch unklare Sequenz-Kombinationen beeinträchtigt, die nicht zufriedenstellend aufgelöst werden können, und in der Praxis sind diese Methoden kostspielig und schwer routinemäßig durchführbar.
  • 2. Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung ist durch die beiliegenden Ansprüche definiert. Die Erfindung stellt Verfahren zum Auftrennen und Identifizieren eines DNA-Moleküls in einem Gemisch von DNA-Molekülen bereit. Die Verfahren umfassen
    • (i) Amplifizieren der DNA-Moleküle in dem Gemisch;
    • (ii) Hybridisieren der Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle mit einem kom plementären Strang eines Referenz-DNA-Moleküls, um Testduplexe zu bilden;
    • (iii) Auftrennen der Duplexe, wobei Mobilitätsmarker in die Auftrennphase einbezogen sind;
    • (iv) Zuordnen eines relativen Zahlenwerts als einem Maß der Migrationsposition der Testduplexe unter Verwendung der Positionen der Mobilitätsmarker; und dabei
    • (v) diagnostisches Identifzieren des DNA-Moleküls;
    wobei Schritte (ii) bis (v) für ein zweites oder mehrfaches Mal wiederholt werden und ein unterschiedlicher Referenzstrang bei jeder Wiederholung verwendet wird.
  • Es ist möglich, die Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle zwischen Schritten (i) und (ii) zu isolieren und diese isolierten Einzelstränge mit einem isolierten komplementären Strang eines Referenz-DNA-Moleküls in Schritt (ii) zu hybridisieren.
  • Alternativ können die in Schritt (i) gebildeten Duplexe der amplifizierten DNA in nicht-isolierter Form in (ii) verwendet werden. In diesem Fall können die amplifizierten Duplexe direkt mit einem Referenz-DNA-Molekül, das einen Markierungsstrang enthält, in Schritt (ii) kontaktiert werden. Lediglich die Einzelstränge der amplifizierten Duplexe, die an den markierten Strang des Referenz-DNA-Moleküls hybridisieren, werden in einem nachfolgenden Detektionsschritt detektiert.
  • Die verschiedenen DNA-Moleküle im Ausgangsgemisch lassen Duplexe mit verschiedenen Anzahlen, Positionen und/oder Typen an Fehlpaarungen entstehen. Dies erlaubt die Trennung der Duplexe zum Beispiel durch Gelelektrophorese. Die getrennten Duplexe können dann zur Identifizierung der DNA-Moleküle, die im Ausgangsgemisch vorhanden waren, analysiert werden. Zwei Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung sind in 1 und 2 veranschaulicht.
  • Das Verfahren der Erfindung kann direkt als eine Diagnosetechnik zum Identifizieren eines DNA-Moleküls durch die Verwendung eines spezifischen Referenz-DNA- Moleküls angewendet werden. Die Bildung eines Homoduplex identifiziert ein DNA-Molekül im unbekannten Gemisch als zum Referenz-DNA-Molekül identisch. Die Bildung eines Heteroduplex kann auch zum Identifizieren eines unbekannten DNA-Moleküls unter Verwendung eines bekannten Heteroduplexes als einer Kontrolle angewendet werden. Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum Identifizieren eines DNA-Moleküls, welches Verfahren umfasst:
    • (i) Kontaktieren des DNA-Moleküls mit einem markierten Referenz-DNA-Strang unter solchen Bedingungen, dass der Referenzstrang an einen komplementären Strang des DNA-Moleküls hybridisiert, um einen Testduplex zu bilden;
    • (ii) Laufen lassen des Testduplex und ein oder mehrerer Kontrollduplex(e) in ein Gel mittels Elektrophorese; und
    • (iii) Vergleichen der Position des Testduplex auf dem Gel mit der/den Position(en) des/der Kontrollduplex(e);
    wobei Schritte (i) bis (iii) für ein zweites oder mehrfaches Mal wiederholt werden und ein unterschiedlicher Referenzstrang bei jeder Wiederholung verwendet wird.
  • Die Verwendung eines einzelnen Referenz-DNA-Moleküls ist zum Trennen und/oder Identifizieren vieler DNA-Moleküle, wie etwa Allele von genetischem Loci, in denen lediglich eine kleine Anzahl unterschiedlicher Allele in der Population existiert, wirksam. Wir haben jedoch festgestellt, dass die Verwendung zweier Referenz-DNA-Moleküle unerwarteterweise von Vorteil ist, insbesondere dort, wo eine große Zahl (z.B. von 10 bis 300 oder von 30 bis 100) der Allele in der Population vorliegt, wie etwa im Falle der HLA-Gene. Bei einigen Genen können zwei oder mehr unterschiedliche Allele vorliegen, die Duplexe ergeben, die an dieselbe Position mit einem einzelnen Referenzstrang migrieren. Wir haben nun festgestellt, dass solche Allele voneinander unterschieden werden können, indem ein zweiter Referenzstrang verwendet wird, der Duplexe bildet, die an unterschiedliche Positionen migrieren. Die kombinierten Ergebnisse für zwei Referenzstränge ergeben einen einzigartigen Parameter für jedes Allel. In einigen Fällen kann ein dritter Referenzstrang erwünscht sein, doch werden zwei Referenzstränge die meisten Unklarheiten des Allel-Typs, selbst an genetischen Loci wie HLA, bei dem eine große Vielfalt allelischer Typen vorliegt, beseitigen.
  • Die Wirksamkeit der Verwendung zweier Referenzstränge ist zum Beispiel durch 7 und 9 veranschaulicht. Diese Figuren zeigen, dass die beiden HLA-Klasse I-Allele A*3001 und A*0201 an ähnliche Positionen migrieren, wenn A*0101 als dem Referenzstrang verwendet wird, weshalb es schwierig wäre, zwischen diesen beiden Allelen unter Verwendung lediglich des A*0101-Referenzstrangs zu unterscheiden. Wird jedoch A*0217 als dem Referenzstrang verwendet, so sind die beiden Allele durch einen großen Abstand getrennt. Somit erlaubt die Kombination der Referenzstränge A*0101 und A*0217 die eindeutige Identifizierung der Allele, wohingegen unter Verwendung lediglich eines Referenzstranges dies nicht der Fall wäre. Da die HLA-Loci zu den als am komplexesten bekannten Loci zählen, ist klar, dass die Erfindung auf eine breite Vielfalt genetischer Loci breit anwendbar ist, sogar auf solche, die in ihrer genetischen Variation komplex sind.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden die Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle mittels eines Verfahrens bereitbestellt, welches umfasst
    • (i) Amplifizieren der DNA-Moleküle im Gemisch unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer einen Liganden trägt, um ein amplifiziertes Gemisch von doppelsträngigen DNA-Molekülen zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt;
    • (ii) Kontaktieren des amplifizierten Gemischs der doppelsträngigen DNA-Moleküle mit einem Rezeptor an einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet;
    • (iii) Auftrennen des Gemischs der doppelsträngigen DNA-Moleküle in Einzelstränge und Entfernen der Stränge, die nicht durch den Liganden an den Träger gebunden sind; und
    • (iv) Rückgewinnen der verbliebenen Stränge vom Träger.
  • Diese Ausführungsform und alle nachfolgenden Anwendungen der Ausführungsform können durch Rückgewinnen der Einzelstränge, die nicht an den Träger in Schritt (iv) binden, und Verwenden dieser Stränge anstelle der Stränge, die an den Träger binden, zur Bildung von Duplexen in Schritt (v) modifiziert werden.
  • Der komplementäre Strang des Referenz-DNA-Moleküls kann im Wesentlichen mittels derselben Technik wie der oben in Schritten (i) bis (iv) zur Bereitstellung des Gemischs der DNA-Moleküle in einzelsträngiger standardmäßiger Form bereitgestellt werden. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann das DNA-Molekül des komplementären Referenzstrangs mittels eines Verfahrens bereitgestellt werden, welches umfasst
    • (i) Amplifizieren des Referenz-DNA-Moleküls unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer einen Liganden trägt, um ein amplifiziertes doppelsträngiges Referenz-DNA-Molekül zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt;
    • (ii) Kontaktieren des doppelsträngigen Referenz-DNA-Moleküls mit einem Rezeptor an einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet;
    • (iii) Auftrennen des doppelsträngigen Referenz-DNA-Moleküls in Einzelstränge und Entfernen des Strangs, der nicht durch den Liganden an den Träger gebunden ist; und
    • (iv) Rückgewinnen des verbliebenen Strangs vom Träger.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle mittels eines Verfahrens bereitgestellt, welches umfasst
    • (i) Amplifizieren der DNA-Moleküle im Gemisch unter Verwendung eines Primer paars, bei dem einer der Primer ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt, um ein amplifiziertes Gemisch von doppelsträngigen DNA-Molekülen zu erzeugen, worin einer der Stränge ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt; und
    • (ii) Auftrennen des Gemischs der doppelsträngigen DNA-Moleküle in Einzelstränge.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der komplementäre Strang des Referenz-DNA-Moleküls mittels eines Verfahrens bereitgestellt werden, welches umfasst
    • (i) Amplifizieren des Referenz-DNA-Moleküls unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt, um ein amplifiziertes doppelsträngiges Referenz-DNA-Molekül zu erzeugen, worin einer der Stränge ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt; und
    • (b) Auftrennen des doppelsträngigen Referenz-DNA-Moleküls in Einzelstränge.
  • Mit dieser Ausführungsform wird das Erfordernis fester Trägersysteme überwunden, indem ein Primer eines Primerpaars direkt an ein Molekül mit hohem Molekulargewicht (z.B. ein Protein) für die Referenz- und Testsysteme konjugiert wird. Das amplifizierte Produkt nach der Hybridisierung kann direkt auf ein Trenngel aufgebracht werden. Die Konjugate mit hohem Molekulargewicht werden im Gel rückgehalten, relativ zu dem Duplex ohne angelagertes Molekül mit hohem Molekulargewicht.
  • Die Identität der im Gemisch vorhanden Moleküle kann unter Durchführung eines oder mehrerer der folgenden Schritte bestätigt werden:
    • (viii) Sequenzieren jedes der getrennten Moleküle;
    • (ix) Sequenz-spezifische Primer-(SSP)-Amplifikationsanalyse; und
    • (x) Sequenz-spezifische Oligonukleotid-(SSO)-Analyse.
  • Die Erfindung bietet eine Verbesserung gegenüber den Verfahren zur Trennung von DNA-Molekülen nach dem Stand der Technik. Die durch die Erfindung gebotenen Vorteile lassen sich wie folgt zusammenfassen:
    • (a) Die Erfindung bietet eine hohe Auflösung zwischen verschiedenen DNA-Molekülen, und Unterschiede von lediglich einem Nukleotid zwischen den Molekülen können detektiert werden.
    • (b) Die Erfindung erlaubt eine gleichzeitige und schnelle Prozessierung einer großen Anzahl von Proben.
    • (c) Die Erfindung ist in der Durchführung vergleichsweise preiswert, insbesondere im Vergleich zu Verfahren nach dem Stand der Technik, die einen hohen Grad an Auflösung erzielen.
    • (d) Die Erfindung nützt Techniken aus, die sich leicht und ohne Rückgriff auf eine komplexe und teure Technologie durchführen lassen.
  • 3. Der Erfindung zugrundeliegendes Prinzip
  • Perfekt gepaarte DNA-Duplexe sind stabiler als solche mit Basen-Fehlpaarungen. Regionen der Nukleotidsequenz, die komplementär sind, behalten die doppelsträngige Struktur bei, doch fehlgepaarte Regionen bilden einzelsträngige Schleifen, die Knicke entlang der Länge des DNA-Moleküls hervorrufen. Relativ zu einem Referenzstrang variiert die Zahl, Größe, Zusammensetzung und Position der einzelsträngigen Schleifen für jedes Allel. Heteroduplex-DNA migriert langsamer als die entsprechende Homoduplex-DNA. Denaturierende Reagenzien und/oder Hitze erhöhen den Effekt von Fehlpaarungen. Da die Rate, bei der die DNA in Polyacrylamid- oder speziellen Agarosegelen migriert, sowohl von der molekularen Konformation als auch dem Molekulargewicht abhängt, liefert das beschriebene Verfahren zum Ein führen von konformationellen Veränderungen im Hybrid-Duplex die Grundlage für die hochspezifische Trennung der Allele.
  • Da die molekulare Konformation der Heteroduplexe durch Hybridisierung einer bekannten Einzelstrang-Referenz mit unbekanntem/n komplementärem/n Einzelstrang/strängen manipuliert werden kann, wird vorgeschlagen, dass Heteroduplexe voneinander z.B. durch denaturierende oder nicht-denaturierende Polyacrylamid-elektrophoretische Analyse getrennt werden können. Dies erlaubt die Trennung zweier amplifizierter Allele von einem bestimmten Locus für die weitere Analyse. Außerdem erlaubt das Verfahren der Erfindung (welches wir "Komplementärstrang-Analyse" (CSA) nennen) die Beurteilung der Qualität des PCR-Produkts, bevor der Prozess der Identifizierung durchgeführt wird. CSA ist in der Lage, das Vorhandensein koamplifizierter nicht-erwünschter Allele von unterschiedlichen Loci und, potenziell, PCR-Fragmente zu identifizieren, die Artefakte, wie Taq-Fehler und in vitro-Rekombinationen, enthalten.
  • Außerdem kann CSA selbst als eine diagnostische Technik angewendet werden. Sie kann Allele durch Hybridisieren eines Allel-spezifischen Einzelstrangs mit unbekanntem/n komplementärem/n Einzelstrang/strängen, gefolgt z.B. von einer Polyacrylamidgel-elektrophoretischen Analyse, mit oder ohne denaturierende Bedingungen und/oder mit oder ohne einen Temperaturgradienten, identifizieren. Die Bildung eines Homoduplex weist die Identität zwischen wenigstens einem der unbekannten Allele und der Allel-spezifischen Referenz nach, da die Nicht-identität zwischen diesen einen/mehrere Heteroduplex(e) erzeugt.
  • 4. Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Arten von DNA-Molekülen, die mittels der Verfahren der Erfindung getrennt und identifiziert werden können, umfassen Allele von polyallelischen Genen, Segmente von Genen und nicht-exprimierte Fragmente.
  • Beispiele der Gene mit multiplen Allelen, auf die die Erfindung angewendet werden kann, sind die Säuger-MHC-Gene, wie etwa die HLA-Klasse I- und -Klasse II-Gene, die T-Zell-Rezeptorgene in Säugern(33,34), TAP, LMP, ras(32), nicht-klassische HLA-Klasse I-Gene, die Gene für die humanen Komplementfaktoren C4 und C2, Bf im humanen HLA-Komplex und Gene, die in der mitochondrialen DNA, in bakteriellen Chromosomen und in viraler DNA lokalisiert sind. Die Erfindung kann bei der Analyse und Identifizierung von Mutationen (z.B. Punktmutationen) in diesen und anderen Genen und von chromosomalen Abweichungen, wie etwas Translokalisationen, Deletionen und Inversionen, angewendet werden.
  • Es gibt drei unterschiedliche Gene innerhalb der HLA-Klasse I-Gruppe der Gene, nämlich HLA-A, HLA-B und HLA-C, und jedes dieser drei Gene liegt in Form multipler Allele vor. Es gibt insgesamt etwa 222 bekannte Allele der HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Gene, wobei die Sequenzen der bekannten Allele in Arnett und Parham (1995) Tissue Antigens 45 217–257, dargestellt sind. Es gibt auch multiple Gene innerhalb der HLA-Klasse II-Gruppe der Gene, bekannt als DR, DQ und DP.
  • Bei dem Verfahren der Erfindung ist es erforderlich, Primersequenzen zu identifizieren, die für das Ziel-Gen einzigartig sind, um alle polymorphen Stellen von Interesse in das amplifizierte Fragment aufzunehmen, welches außerdem in der Länge handhabbar sein sollte. Zum Beispiel würden die polymorphen Stellen in Exons 2 und 3 and HLA-Klasse I die Identifizierung aller erkannter Allele von HLA-A, -B und -C, mit 5 Ausnahmen, erleichtern. Daher können die in der Erfindung verwendeten Primer beispielsweise so ausgewählt werden, dass Exons 2 und 3 jeweils von HLA-A, HLA-B und HLA-C separat und spezifisch amplifiziert werden. Cereb(31) und Mitarbeiter haben Primersequenzen beschrieben, die in den ersten und dritten Exons lokalisiert sind, die für die Locus-spezifische Amplifikation der gesamten Exon 2- und 3-Region jeweils der HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Gene verwendet werden können. Die Sequenzen von geeigneten Primern sind in nachstehendem Beispiel 1 angegeben.
  • Das bei der Erfindung verwendete Referenz-DNA-Molekül kann eine bekannte Sequenz aufweisen. Die Referenz kann so gewählt werden, dass sie einen ähnlichen Allotyp zu einem Allotyp aufweist, den zumindest eines der Testallele mutmaßlich besitzt. Beispielsweise mag es aus serologischen Daten bekannt sein, dass ein Testallel vom HLA-A02-Typ ist, wobei es aber nicht bekannt sein mag, von welchem der siebzehn A0-Subtypen das Allel ist. In diesem Fall kann das Referenzallel so gewählt werden, dass es vom A0201-Subtyp ist, und das Verfahren der vorliegenden Erfindung könnte dann zur Bestimmung dessen angewendet werden, von welchem der A02-Subtypen das Testallel ist. Der Referenzstrang kann erhalten werden aus (a) einer homozygoten Quelle, (b) einer heterozygoten Quelle, aus der einzelne Stränge durch Geltrennung nach Amplifikationsschritten isoliert werden, oder (c) durch DNA-Synthese. Es gibt nun etwa 500 international zugelassene Zelllinien, die HLA-Allele von bekanntem Subtyp enthalten, wobei diese Zelllinien als einer Quelle der Referenzallele verwendet werden können.
  • Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendete Kontroll-DNA kann ein Homoduplex zwischen zwei Strängen desselben DNA-Moleküls sein (z.B. das Referenz-DNA-Molekül), so dass die Migration eines Testduplex an dieselbe Position auf dem elektrophoretischen Gel wie der Kontroll-Homoduplex anzeigt, dass das Testduplex ein Homoduplex ist. Ist der Testduplex ein Homoduplex, so kann gefolgert werden, dass das unbekannte DNA-Molekül dasselbe wie das Referenz-Molekül ist.
  • Kontroll-DNAs können durch einfaches Amplifizieren eines bekannten DNA-Moleküls unter Verwendung derselben Primer, wie bei dem Verfahren der Erfindung zum Amplifizieren der Referenz- und unbekannten Moleküle verwendet, erhalten werden.
  • Die Kontroll-DNA kann auch ein Heteroduplex von bekannten DNA-Molekülen sein. Dies erlaubt die Anwendung des Verfahrens der Erfindung auf die Identifikation von Molekülen in Heteroduplexen, die durch Testproben gebildet werden. Dieselben Heteroduplexe aus unterschiedlichen Quellen migrieren an dieselbe Position auf einem Gel.
  • Ein potenzielles Problem mit der Identifizierung von Molekülen in Heteroduplexen ist, dass bestimmte unterschiedliche Heteroduplexe Kombinationen von Fehlpaarungen enthalten können, die sie zum Migrieren an dieselbe Position bringen. Eine Methode zur Bewältigung dieses Problems bestünde in der Verwendung eines zweiten Referenzstrangs, welcher unterschiedliche Kombinationen von Fehlpaarungen liefert.
  • Im Typisieren der HLA-Klasse I-Allele könnten die verschiedenen Duplexe anhand ihrer unterschiedlichen Größen identifiziert werden (die HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Gene sind von unterschiedlichen Größen) oder durch Amplifizieren jedes der HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Gene mit Primern, die unterschiedliche Markierungen tragen. Jeder Locus-spezifische Heteroduplex hätte eine unterschiedliche Größe oder würde eine unterschiedliche Markierung tragen und könnte gleichzeitig in derselben Spur eines Gels elektrophoretisch getrennt werden. Die Duplexe könnten dann identifiziert werden, indem sie mit Kontroll-Duplexen in demselben Gel verglichen werden. Zu Beispielen geeigneter Markierungen zählen Radiomarkierungen, Farbstoffmarkierungen und Fluoreszenzmarkierungen.
  • Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten Gemische von Allelen können von einem prospektiven (vorgesehenen) Spender oder einem prospektiven Empfänger bei einer Gewebe- oder Organtransplantationsoperation stammen. Die Ergebnisse des Verfahrens können daher dazu verwendet werden, einen prospektiven Empfänger mit einem prospektiven Spender abzugleichen.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden die Allele des prospektiven Spenders oder des prospektiven Empfängers im Effekt als Referenz-Allele verwendet, wobei Duplexe zwischen den Strängen der Allele des prospektiven Empfängers und der Allele des prospektiven Spenders gebildet werden. Die Analyse der zwischen den Strängen jeweils vom prospektiven Empfänger und Spender gebildeten Duplexe zeigt auf, ob sie dieseiben Allele aufweisen. Somit stellt die Erfindung bei einer Ausführungsform ein Verfahren zur Bestimmung dessen bereit, ob ein prospektiver Empfänger bei einer Gewebe- oder Organtransplantationsoperation Allele eines Gens aufweist, die mit den Allelen eines prospektiven Spenders bei der Operation kompatibel sind, welches Verfahren umfasst
    • (i) Amplifizieren der Allele des vorgesehenen Empfängers unter Verwendung eines Primerpaars, bei welchem einer der Primer einen Liganden trägt, um amplifizierte doppelsträngige Allele des vorgesehenen Empfängers zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt;
    • (ii) Kontaktieren der amplifizierten doppelsträngigen Allele mit einem Rezeptor auf einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet;
    • (iii) Auftrennen der doppelsträngigen Allele in Einzelstränge und Entfernen der Stränge, die nicht durch den Liganden an den Träger gebunden sind;
    • (iv) Rückgewinnen der verbliebenen Stränge vom Träger;
    • (v) Mischen der rückgewonnenen Stränge mit komplementären Strängen der Allele von dem vorgesehenen Spender, um Testduplexe zu bilden;
    • (vi) Auftrennen der Testduplexe mittels Gelelektrophorese; und Ausführen eines oder mehrerer der folgenden Schritte:
    • (vii) Vergleichen der Positionen, an die die Testduplexe auf dem Gel wandern, mit der Position einer Kontroll-DNA;
    • (viii) Sequenzieren eines oder beider Stränge jedes der Testduplexe;
    • (ix) Sequenz-spezifische Primer-(SSP)-Amplifikationsanalyse; und
    • (x) Sequenz-spezifische Oligonukleotid-(SSO)-Analyse.
  • Zu weiteren vorgeschlagenen Anwendungen der Erfindung zählen die Bestimmung der Vaterschaft eines Individuums durch Identifizieren eines (oder mehrerer) seiner Allele, um zu sehen, ob es dasselbe ist wie das entsprechende Allel eines mutmaßlichen Vaters. Die Erfindung kann auch in der forensischen Medizin angewendet werden, um den Ursprung einer Probe von Körpergewebe oder -flüssigkeit zu bestimmen, als einer Nachuntersuchungs-Technik in der Behandlung von hämatologischen Malignitäten oder ererbten Störungen, in der adoptiven Immuntherapie und in der Identifizierung von Bakterien und Viren.
  • Bei dem Verfahren der Erfindung können die Amplifikationsschritte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt werden.
  • Das bei der Erfindung verwendete Liganden/Rezeptor-System kann zum Beispiel das Biotin/Streptavidin-System oder ein Hapten/Antikörper-System sein. Die direkte Konjugation des Primers über eine Verknüpfungsgruppe, wie etwa ein kurzes poly A, an die Kügelchen stellt eine Alternative dar. Wird das Biotin/Streptavidin-System verwendet, so kann einer der bei jedem der Amplifikationsschritte verwendeten Primer mit Biotin markiert sein, so dass dann, wenn die Amplifikationsreaktion durchgeführt wird, doppelsträngige DNA produziert wird, in der ein Strang eine Biotin-Markierung trägt. Die doppelsträngige DNA kann dann an einen mit Streptavidin überzogenen festen Träger gebunden werden.
  • Der bei der Erfindung verwendete feste Träger besteht typischerweise aus Magnetkügelchen. Andere Träger können jedoch verwendet werden, wie etwa die Matrix einer Affinitätschromatographiesäule. Liegt der Träger in Form von Magnetkügelchen vor, so werden die beiden Stränge der amplifizierten DNA getrennt, indem die Kügelchen von einem Magnet angezogen werden und die Kügelchen unter Bedingungen gewaschen werden, so dass die doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen dissoziiert. Die Dissoziation wird typischerweise durch Inkubieren der Kügelchen (z.B. dreimalig) unter alkalischen Bedingungen (z.B. 0,1 M oder 0,15 M NaOH) bei Raumtemperatur für etwa 5 oder 10 Minuten vorgenommen. Gewöhnlich wird dann der Strang, der nicht durch den Liganden an den Träger gebunden ist, verworfen, obschon es ebenso möglich ist, den Strang, der nicht an den Träger gebunden ist, rückzubehalten und den Strang, der an den Träger gebunden ist, zu verwerfen.
  • Der Strang, der an den Träger gebunden bleibt, kann vom Träger durch Inkubieren des Trägers unter Bedingungen rückgewonnen werden, bei denen der Ligand/Rezeptor-Komplex dissoziiert. Wird das Biotin/Streptavidin-System verwendet, so wird der Träger typischerweise auf z.B. 95°C für etwa 5 Minuten erhitzt; dies gewährleistet die Denaturierung des Streptavidin-Moleküls zur Freisetzung des biotinylierten Einzelstrangs, der dann rückgewonnen wird.
  • Zu diesem Stadium sind ein einzelsträngiges unbekanntes Allel und der komplementäre Strang eines Referenz-Allels bereitgestellt worden. Die beiden Stränge werden dann unter Bedingungen miteinander vermischt, bei denen sie hybridisieren, um Duplexe zu erhalten. Typischerweise wird der Hybridisierungsschritt durch Erhitzen des Gemischs der Stränge bei etwa 95°C für etwa 3 Min., bei etwa 70°C für etwa 5 Min. und dann bei 65°C für etwa 45 Min. vorgenommen.
  • Unter diesen Bedingungen werden Duplexe gebildet, die anschließend durch Gelektrophorese (z.B. Polyacrylamid-Gelelektrophorese) getrennt werden können. Die Elektrophorese kann unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden, da dies die Trennung fördern kann.
  • Als einer alternativen Trenntechnik zur Gelelektrophorese kann die Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) angewendet werden.
  • Bei der Ausführungsform der Erfindung, bei der einer des Primerpaares an ein Molekül mit hohem Molekulargewicht konjugiert wird, kann das Molekül ein Protein sein, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA). Das Molekulargewicht des hochmolekularen Moleküls ist ein solches, dass es das DNA-Molekül, an das es gebunden ist, ausreichend im Trennschritt (z.B. dem Elektrophoreseschritt) verzögert, um die Trennung des DNA-Moleküls von einem Duplex, an den keine Verbindung mit hohem Molekulargewicht gebunden ist, zu ermöglichen. Zum Beispiel kann das Molekulargewicht des hochmolekularen Moleküls von 10 bis 200 kDa, bevorzugt 20 bis 100 kDa, betragen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können DNA-Fragmente von einem bestimmten Segment eines Genoms abgetrennt und unter Verwendung eines markierten Referenzstrangs ohne der Isolierung des Duplex aus der Trennungsphase identifiziert werden. Dieser Ansatz kann unter Anwendung der derzeit verfügbaren Technologie für die gleichzeitige Trennung und Identifizierung von Allelen automatisiert werden.
  • Bei dieser diagnostischen Anwendung des Verfahrens ist die Trennung der DNA-Fragmente einer Probe zu einem Einzelstrang oder die Verwendung von Liganden-tragenden Primern nicht erforderlich. Der vormarkierte Referenzstrang wird mit der Probe gemischt und das Gemisch wird, im Anschluss an den Hybridisierungsschritt, mittels eines Verfahrens analysiert, das die DNA-Duplexe trennen wird (z.B. Elektrophorese oder Hochdruck-Flüssigchromatographie). Diese Ausführungsform wird als "Doppelstrangkonformationsanalyse" (DSCA) bezeichnet.
  • Die selektive Identifizierung der Marker-tragenden Referenz-Proben-Duplexe schließt jene Hybride aus, die keinen Komplex mit dem Referenzstrang gebildet haben. Die Position der identifizierten Banden ist diagnostisch. Diese können durch die Einbeziehung von Referenz-Mobilitätsmarkern genau zugeordnet werden, welche sein könnten (a) interne Marker mit schnelleren und langsameren Mobilitäten als der Duplex unter Untersuchung, oder (b) multiple Marker, die bei elektrophoretischen Läufen gleichzeitig in einer separaten Spur getrennt werden würden und eine Referenzleiter mit abgestuften Mobilitäten bilden würden.
  • Bei dieser Ausführungsform können die Fragmente der DNA-Probe erhalten werden durch (a) spezifische Amplifikation, z.B. PCR, oder (b) enzymatischen Verdau des Genoms, wobei die Zahl der Gene beschränkt ist (z.B. virale Genome, mikrobielle Plasmide, Vektorkassetten oder Segmente von (a)).
  • Der Referenzstrang, der teilweise komplementär in der Sequenz zum vorgesehenen Probenziel ist, kann durch Einführen spezifischer Nukleotide an ausgewählte Positionen, die die Trennung der Duplexe während der Trennstufe erhöhen, präpariert werden. Der Referenzstrang kann synthetisch sein, d.h. vom Menschen geschaffen und nicht von irgendeinem natürlich vorkommenden Allel abstammend. Eine optimale Referenz kann entworfen werden, die eine optimierte Verteilung der Banden produziert. Eine zweite und weitere Referenzen können verwendet werden, die die Trennung jener Banden, die durch Verwendung einer einzelnen Referenz nicht gut getrennt werden, verbessert. Dies erhöht die Genauigkeit der Identifizierung, insbesondere für eng verwandte Allele.
  • Die Referenz kann synthetisiert werden:
    • a. Durch eine Kombination spezifischer Primer, die einen Strang mit drei Nukleotid-Unterschieden am 3'-Ende generieren; dies würde die Spezifität der Amplifikation nach der Trennung der Probenstränge gewährleisten.
    • b. Durch Herstellen kurzer Fragmente der Ziel-Sequenz entweder durch spezifische Amplifikation oder, wo erforderlich, synthetisch. Nach spezifischen Alterationen an den Sequenzen werden diese Fragmente ligiert, um einen einzelnen Referenzstrang zu erzeugen.
    • c. Der Referenzstrang kann einen fluoreszierenden Liganden, der an ein Ende angelagert ist, für die Identifizierung aufweisen oder könnte einen Liganden oder eine Verbindung (z.B. Biotin) tragen, der die Anlagerung eines Enzym-Moleküls (z.B. über Streptavidin) ermöglichen würde. Der Referenz-Proben-Duplex kann dann entweder durch Fluoreszenz-Nachweismethoden oder durch Enzym-amplifizierte Methoden unter Anwendung z.B. einer kolorimetrischen oder Chemilumineszenz-Technik identifiziert werden.
  • Dieser Ansatz ist für die automatisierte Trennung und Detektion geeignet. Um die Analyse zu automatisieren, wird vorgeschlagen, Mobilitätsmarker in die Trennphase aufzunehmen. Diese markierten Marker wären entweder definierte Segmente der genomischen DNA, wie durch Amplifikation präpariert, oder synthetisch präpariert, um als Referenzpunkte für die automatisierte Berechnung der exakten Position der Probe unter Untersuchung zu dienen.
  • Anwendung der Erfindung zur Analyse von ras-Onkogen-Punktmutationen:
  • ras ist in die Onkogenese vieler Tumoren mit einbezogen worden und scheint durch Punktmutationen aktiviert zu werden. Diese Mutationen können in allen drei ras-Genen (N-ras, Harvey-ras und Kirsten-ras) bei Codons 12/13 und 61 mit entsprechenden Aminosäure-Substitutionen in ras-Proteinen (p21) auftreten. Diese Punktmutationen können durch Anwendung der Erfindung detektiert werden.
  • Zwei Primerpaare sind erforderlich, eines für die 12/13-Codons und eines für Codon 61. Die von Lyons(32) beschriebenen Primer können verwendet werden, mit einer Modifikation durch die kovalente Bindung eines Liganden an einen Primer jedes Paars bei jeweils dem Test-Fragment und dem Referenz-Fragment. Zum Beispiel kann ein Ligand an Primer P1a (ein 12/13-Codon-Primer) und Primer P1b (ein 61-Codon-Primer) für das Referenz-Fragment angelagert werden, und an Primer P2a (ein 12/13-Codon-Primer) und Primer P2b (ein 61-Codon-Primer) für das Test-Fragment. Auf diese Weisen werden komplementäre Liganden-markierte Einzelstränge für die Referenz- und Test-Fragmente erhalten. Die komplementären Stränge werden hybridisiert und einer Elektrophorese unterzogen. Der Nachweis eines Homoduplex zwischen dem Test-Fragment und einem mutierten Referenz-Fragment wird auf das Vorhandensein der Mutation im Test-Fragment hinweisen.
  • Anwendung der Erfindung zum Identifizieren von T-Zellrezeptor-(TCR)-Umlagerungen (rearrangements) bei T-Zell-Tumoren und bei der adoptiven Immuntherapie:
  • Einige T-Zell-Tumoren können im Ursprung monoklonal sein, und ein Anteil der T-Zellen von einem Patienten kann eine bestimmte Alpha/Beta- oder Gamma/Delta-Umlagerung der Gene der variablen Domäne von T-Zellen in Abhängigkeit vom T-Zelltyp tragen. Die Wirksamkeit einer bestimmten Behandlung oder der Verlauf der Erkrankung kann durch die Identifizierung der malignen klonalen TCR-Umlagerung ausgewertet werden. Das Verfahren der Erfindung unter Anwendung einer geeigneten Anzahl an Kontrollen kann semiquantitativ gemacht werden, was die Auswertung des Verlaufs der Behandlung oder der Erkrankung ermöglichen würde.
  • In der adoptiven Immuntherapie kann ein spezifisches Rearrangement der Gene der variablen Domäne des TCR als ein Marker für die selektierte cytotoxische T-Zelle, die in vitro generiert worden ist, genützt werden. Das Schicksal dieser Zellen nach der Infusion kann mittels eines semiquantitativen Nachweises des bestimmten Rearrangements überwacht werden.
  • Bei beiden Verfahren können die Primer der Gene der variablen Domäne von T-Zellen(33,34) durch kovalente Bindung eines Liganden an das 5'-Ende des Primer paars modifiziert werden, und der Referenzstrang wird hinsichtlich seiner Komplementarität zu den Test-DNA-Fragmenten ausgewählt werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt einen schematischen Überblick über eine Ausführungsform der Erfindung.
  • 2 zeigt einen schematischen Überblick über eine andere Ausführungsform der Erfindung. Der Unterschied bei Allelen A*0201 und A*0206 besteht in einem Nukleotid an Position 102 auf Exon 2. Der Referenzstrang weist Adenin an dieser Position auf, und es gibt weitere Unterschiede zwischen den Referenz- und den Probensequenzen. Sense- oder Antisense-DNA-Stränge können verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Basensequenz der Referenz-DNA zu der unbekannten Proben-DNA komplementär ist.
  • 3 zeigt das Bandenmuster bei Gelelektrophorese zwischen dem Sense-Referenzstrang des Allels HLA-A*0101 und den Antisense-Strängen von verschiedenen Locus A-Allelen. Bahn 1: STEINLIN (A*0101), Bahn 2: KIME (A*0211–A*3201), Bahn 3: DAUDI (A*0102–A*6601), Bahn 4: EA (A*0301), Bahn 5: LCL721 (A*0101–A*0201), Bahn 6: M7 (A*0202–A0301), Bahn 7: CJO-A (A*1101), Bahn 8: T5-1 (A0101–A*0201), Bahn 9: L0541265 (A*0101), Bahn 10 AM (A*0205–A3201).
  • Nach der HLA-A-Locus-spezifischen Amplifikation der Exons 2 und 3 wurden die Antisense-DNA-Stränge isoliert, wie in untenstehendem Beispiel 1 beschrieben, und mit komplementärem Locus-Referenzstrang hybridisiert. Die Proben wurden auf eine PAG/Agarose-Kassette aufgebracht, und die Elektrophorese wurde bei 230 Volt für 6 Std. bei Raumtemperatur vorgenommen; das Gel wurde mit SYBR Green I gefärbt. Einzelne Banden wurden von homozygoten Zelllinien erhalten und doppelte Banden von heterozygoten Linien. Duplexe von identischen Allelen weisen dieselbe Mobilität im Gel auf. Die Proben in Bahnen 5 und 8 sind von Allelen A0101 und A0201, und die Proben in Bahnen 1 und 9 sind von der homozygoten Linie mit A0101, welche dieselbe Mobilität wie die schnellen Linien in Bahnen 5 und 8 aufweist.
  • 4 zeigt die Analyse der DNA-Fragmente des HLA-Klasse I-Locus von drei Zelllinien, getrennt durch CSA in nicht-denaturierendem PAGE unter Verwendung von Referenzsträngen von jedem Locus.
  • Die PCR-Produkte der Locus-spezifischen Amplifikation wurden prozessiert, um Antisense-Einzelstränge zu isolieren, und diese wurden mit komplementären Referenzsträngen (A*0101, B*4402 und Cw*0701) entsprechend hybridisiert.
  • M = Marker-DNA-Fragmente; HS67-Allele, A = 1101 und 2402, B = 5801 und 6701; Cw = 0701/unbekannt; M7-Allele, A = 0202 und 0301, B = 5301 und 35 (Serologie), Cw = 4 (Serologie) homozygot; AM-Allele, A = 0205 und 3201, B = 4901 und 5301? (Standard für die Identifizierung nicht verfügbar), Cw = 0701 und 10 (Serologie). Für die serologischen Typen waren allelische Standards für die Identifizierung nicht verfügbar. Die homozygote Cw-Probe M7 ergibt eine einzelne Bande (Bahn 7).
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem CSA für das Crossmatching von HLA-B-Allelen in einem Versuch verwendet wurde, einen potenziellen Knochenmarksspender aus einer siebenköpfigen Familie zu identifizieren.
  • Die Eltern und Geschwister wurden lediglich durch Serologie typisiert, und die CSA wurde zum Identifizieren eines Match angewendet. Die DNA wurde mit Locus-spezifischen Primern amplifiziert, und die PCR-Produkte wurden prozessiert, um Antisense-Einzelstränge zu isolieren. Diese wurden mit dem komplementären Referenzstrang B*4402 hybridisiert. Die Duplexe wurden in nicht-denaturierender PAGE analysiert. Die Migrationsrichtung ist durch Pfeile markiert.
  • Das vollständige allelische Profil der Familie ist nicht verfügbar. Der Patient (Bahn 4) hat das mütterliche Allel B7 und das väterliche Allel B44 an diesem Locus geerbt. Der Vater weist das (langsame) B44-Allel und ein unidentifiziertes zweites Allel auf; die Mutter weist das (langsame) B51- und das (schnelle) B7-Allel auf. Ein Geschwister (Bahn 5) weist identische B-Allele zu dem Patienten auf.
  • 6 veranschaulicht die Verwendung von CSA zum Identifizieren von Mutationen in Exon 13 des cystischen Fibrose-Gens.
  • Die DNA von einem gesunden Individuum und zwei cystischen Fibrose-Patienten wurde zum Amplifizieren von Exon 13 des cystischen Fibrose-Gens mittels PCR verwendet; die Einzelstrang-DNA wurde isoliert und mit komplementärem Referenz-Einzelstrang-Wildtyp hybridisiert; die Duplexe wurden in nicht-denaturierender PAGE analysiert.
  • Der senkrechte Pfeil zeigt die Migrationsrichtung der Banden an; die waagerechten Pfeile zeigen auf die Position der Banden.
  • Der Wildtyp in Bahn 1 erbringt einen einzelnen Homoduplex (schnelle Bande). Die Patienten weisen eine Mutation in Exon 13 auf und sind für dieses Exon heterozygot. Die langsame Bande in Bahn 2 steht für einen Heteroduplex aufgrund der Deletion eines einzelnen Nukleotids (T) an Position 2603 in dem Exon. In Bahn 3 ist die langsame Bande auf eine Heteroduplex-Bildung mit dem mutierten R709X zurückzuführen, welches sich vom Wildtyp durch eine einzelne Substitution unterscheidet.
  • 7 zeigt die beobachteten Fluoreszenz-Peaks bei einer Ausführungsform der Doppelstrangkonformationsanalyse (DSCA) und veranschaulicht die Verwendung zweier Referenzstränge.
  • HLA-A-0201- und -3001-Allele von zwei Proben wurden amplifiziert und mit zwei Referenzsträngen hybridisiert. Die Ergebnisse in der oberen Box zeigen die Duplex-Migration mit Referenz A*0101, und die untere Box mit Referenz A*0217. Die Differenz bei der Trennung der Peaks ist auf die Anzahl von Nukleotid-Fehlpaarungen zurückzuführen, die die Migrationsraten der jeweiligen Duplexe beeinflussen. Dieser Ansatz erlaubt eine akkurate Identifizierung der Allele, die dicht migrierende Banden aufweisen, die zu überlappenden Peaks mit lediglich einem Referenzstrang führen.
  • 8 zeigt die Empfindlichkeit des DSCA-Verfahrens in der Analyse von HLA-B- und Cw-Allelen.
  • Die obere Box zeigt die Analyse des HLA-B-Locus für die Zelllinie DAUDI. Die detektierten Fluoreszenz-Peaks unterscheiden zwischen den beiden Allelen B*5801 und B*5802, die sich durch drei Nukleotide unterscheiden. Die Zelllinie WT49 ist für das B*5801-Allel homozygot. Die Position der Peaks für B*5801 ist unabhängig von seiner Quelle identisch. Der Referenzstrang bei diesem Experiment war B*4402.
  • Die untere Box zeigt die Analyse des HLA-Cw-Locus von der Zelllinie CLA. Diese Zelllinie ist für diesen Locus heterozygot, und die Allele Cw*0701 und Cw*0702 unterscheiden sich durch zwei Nukleotide. Der Referenzstrang bei diesem Experiment war Cw*0303.
  • 9 und 10 zeigen die Analyse von HLA-A-Allelen durch DSCA unter Verwendung zweier Referenzstränge. DNA wurde von B-lymphoblastoiden Zelllinien erhalten und amplifiziert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Hybridisierte Duplexe wurden durch nicht-denaturierende PAGE in einem automatischen DNA-Sequenziergerät analysiert. Die senkrechte Achse gibt die RV-Zahl an.
  • 11 zeigt eine graphische Analyse der kombinierten Ergebnisse aus 9 und 10. Das Diagramm des RV aus den beiden Referenzsträngen erlaubt eine eindeutige Identifizierung der mittels DSCA typisierten Allele.
  • 12 und 13 zeigen die Analyse der HLA-B-Allele unter Verwendung zweier Referenzstränge. DNA wurde aus B-lymphoblastoiden Zelllinien erhalten und amplifiziert, wie beschrieben in Beispiel 3. Hybridisierte Duplexe wurden mittels nicht-denaturierender PAGE in einem automatischen DNA-Sequenziergerät analysiert. Die senkrechte Achse gibt die RV-Zahl an.
  • 14 zeigt eine graphische Analyse der kombinierten Ergebnisse aus 12 und 13. Das RV-Diagramm aus zwei Referenzsträngen erlaubt die eindeutige Identi fizierung der mittels DSCA typisierten Allele.
  • 15 veranschaulicht die Analyse mittels DSCA von vier verschiedenen Proben für jedes von zwei Allelen. In allen Fällen waren die Mobilitäten der Banden für jedes Allel identisch. Box A zeigt die Analyse von HLA*0301; der Peak bei RV 1000 ist der Homoduplex in diesem Textlauf, und weitere Peaks weisen auf die Heterozygosität der relevanten Probe hin. Box B zeigt die Analyse von HLA-B*4402; bei diesem Testlauf waren alle vier Proben heterozygot.
  • EXPERIMENT 1: TRENNUNG DER HLA-ALLELISCHEN STRÄNGE MITTELS CSA
  • 1. Methoden
  • 1.1 Zusammenfassung
  • Die Amplifikation und Isolierung des/der biotinylierten Antisense-Stränge wurde vorgenommen. Sie wurden dann mit Allel-spezifischen Referenz-Sense-Einzelsträngen hybridisiert.
  • Um die Trennkraft dieses Verfahrens zu testen, wurden 7 Allel-spezifische Referenz-Sense-Einzelstränge präpariert. Diese wurden mit mehreren isolierten Antisense-Strang-HLA-A-Allelen hybridisiert, die dahingehend ausgewählt waren, Allele mit ein oder mehreren Nukleotid-Unterschieden im Vergleich zum Referenzstrang zu enthalten.
  • Im Anschluss an diesen Schritt wurde eine PAGE-Analyse unter nicht-denaturierenden Bedingungen (Harnstoff in einem Bereich von 2–6 M und Formamid zwischen 10%–30% Konzentrationen wurden in weiteren Experimenten aufgenommen) vorgenommen, und die Gele wurden entweder bei Raumtemperatur oder bei 50–58°C (200 Volt für 6 Stunden) laufen gelassen.
  • Die Identifizierung einer einzelnen Bande in PAGE-Gelen zeigte die Identität zwischen dem Allel und dem Referenzstrang und die Homozygosität der Probe.
  • Als einer positiven Kontrolle wurde immer ein doppelsträngiges DNA-PCR-Produkt von der Allel-Referenz verwendet.
  • 1.2 Locus-spezifische Amplifikation der HLA-Klasse I-Gene
  • Für Typisierungszwecke ist die Amplifikation der Exons 2 und 3 erwünscht, und die Primer wurden daher so selektiert, dass sie die Strecke des Genoms zwischen Intron 1 und Intron 3 amplifizierten. Die Lokalisation und Nukleotidsequenzen der verwendeten HLA-Locus-spezifischen Primer sind im Abschnitt der Reagenzien wiedergegeben.
  • PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 100 μl unter Verwendung von 1 μg der genomischen DNA und 25 pmol jedes Locus-spezifischen Primers vorgenommen. Der 3'-Primer wurde am 5'-Ende biotinyliert. Diese Anordnung gewährleistet den Einbau des biotinylierten Primers auf dem amplifizierten Antisense-DNA-Strang. Die PCR-Bedingungen sind in der folgenden Tabelle angegeben.
  • Thermozyklier-Bedingungen
    Figure 00300001
  • 1.3 Trennung der amplifizierten DNA-Stränge
  • 1.3a Entfernung des nicht-biotinylierten Strangs:
  • Magnetkügelchen mit kovalent gebundedem Streptavidin an der Oberfläche wurden dem PCR-Produkt zugegeben und für 30 Minuten bei 43°C inkubiert. In dieser Weise wurde das amplifizierte PCR-Produkt durch die Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin immobilisiert. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen gegen einen Magnet platziert, und die Kügelchen wurden mit Waschpuffer zur Entfernung der verbliebenen PCR-Reaktionskomponenten gewaschen.
  • Der nicht-biotinylierte DNA-Strang wurde dann von den Kügelchen durch Inkubation mit 0,15 M NaOH bei Raumtemperatur (r.t.) für 10 Minuten getrennt. Daraufhin wurden die Kügelchen gewaschen, um überschüssiges NaOH zu entfernen, und in 50 μl Hybridisierungspuffer resuspendiert.
  • 1.3b Entfernung des biotinylierten DNA-Strangs:
  • Die Kügelchen-Suspension wurde bei 95°C für 5 Minuten erhitzt; dies gewährleistet die Denaturierung des Streptavidin-Moleküls zur Freisetzung des biotinylierten amplifizierten Antisense-Einzelstrangs, der dann entfernt und in ein sauberes Röhrchen eingebracht wurde. In diesem Stadium enthielten die Isolate biotinylierte DNA-Stränge von jedem Allel.
  • 1.4 Präparierung der Allel-spezifischen Referenz-Einzelstrang-DNA
  • DNA wurde aus 10th IHW-Zelllinien extrahiert. Die folgenden homozygoten Zelllinien wurden selektiert:
    Figure 00310001
  • Die PCR-Bedingungen für die Amplifikation waren wie oben, mit der Ausnahme, dass in jedem Fall der Locus-spezifische 5'-Primer biotinyliert war (5'-Ende). Die PCR-Produkte wurden mittels PAGE analysiert, um die genaue Übereinstimmung der Amplifikation zu bewerten, und in allen Fällen wurde eine einzelne Bande beobachtet.
  • 1.5 Hybridisierung
  • Der/die biotinylierten Antisense-Stränge von oben wurden mit den Sense-Strängen gemischt, und das Gemisch wurde bei 95°C für 3 Min. erhitzt, bei 70°C für 5 Min. inkubiert und dann bei 65°C für 45 Min. Unter diesen Bedingungen waren die Sense- und Antisense-Stränge optimal hybridisiert und erbrachten gute Ausbeuten. Die entstandenen Heteroduplexe konnten anschließend mittels Elektrophorese in Polyacrylamidgel voneinander getrennt werden.
  • 2. Reagenzien:
  • A) Nukleotidsequenzen der für die Locus-spezifische Amplifikation verwendeten Primer:
    • 5'-A-Locus-Primer: GAA ACG/C GCC TCT GT/CG GGG AGA AGC AA (Intron 1: 21–46)
    • 3'-A-Locus-Primer: TGT TGG TCC CAA TTG TCT CCC CTC (Intron 3: 66–89)
    • 5'-B-Locus-Primer: GGG AGG AGC GAG GGG ACC G/CCA G (Intron 1: 36–57)
    • 3'-B-Locus-Primer: GGA GGC CAT CCC CGG CGA CCT AT (Intron 3: 37–59)
    • 5'-C-Locus-Primer: AGC GAG GG/TG CCC GCC CGG CGA (Intron 1: 42–61)
    • 3'-C-Locus-Primer: GGA GAT GGG GAA GGC TCC CCA CT (Intron 3: 12–35)
  • B) Puffer:
    Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • C) Verschiedenes
    • Dynabeads M-280 Streptavidin* (10 mg/ml)
    • Magnetpartikelkonzentrator – Dynal MPC
    • Ein Thermozyklierer (PTC-200 Peltier Thermal Cycler MJ Research*)
    • Ultrareiner DNTP-Satz, 2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphat (Pharmacia Biotech)
    • Taq-DNA-Polymerase* (verschiedene kommerzielle Quellen)
    • 50 mM MgCl2
    • 0,15 M NaOH
    • SeaPlaque Agarose* (Flowgen Instruments Ltd.)
    • Long Ranger 50% Acrylamid (Flowgen)
    • * = Handelsnamen
  • 3. Ergebnisse: Identifizierung der Allele mittels CSA
  • Sieben Allel-spezifische Referenz-Sense-Stränge wurden aus homozygoten Zelllinien isoliert und an mehrere Antisense-Stränge von anderen Zelllinien, deren HLA-Spezifität durch Sequenzierung, und in einigen Fällen lediglich durch Serologie, definiert war, hybridisiert.
  • Allelbanden konnten durch Homoduplex-Bildung mit einem Referenz-Strang, die bei derselben Rate wie die doppelsträngige DNA-Referenz-Bande (Kontrollbande) oder Heteroduplex-Banden migrieren, die aber relativ zu der Kontrollbande kathodisch sind, identifiziert werden.
  • Es wurde beobachtet, dass dann, wenn der Referenz-Strang ein perfektes Match zu dem Antisense-Strang bildete, eine einzelne Homoduplex-Bande im Gel sichtbar war. In Fällen, bei denen sich der Referenz-Strang um drei oder mehr Basen vom Antisense-Strang unterschied, war eine kathodische Bande entsprechend einem Heteroduplex sichtbar. Dieses Muster wurde reproduzierbar für alle der Allel-spezifischen Referenz-Stränge beobachtet und ist daher von der Position der Fehlpaarung(en) auf den Strängen und der spezifischen Basensequenz der allelischen Referenz unabhängig (3).
  • Bei anderen Experimenten mit einer längeren PAGE war es möglich, allelische Stränge zu trennen, die sich lediglich durch ein einziges Nukleotid unterschieden. Die Anwendung der denaturierenden PAGE erhöhte die Trennung der allelischen Banden.
  • Diese Methode der Alleltrennung ist zum Analysieren von HLA-A-, HLA-B- und HLA-Cw-Allelen von 22 heterozygoten und 41 homozygoten Zelllinien (HLA-A 33-; HLA-B 30- und HLA-Cw 18-Allele) und zum eindeutigen Identifizieren der individuellen Allele mittels einer Methode mit der Bezeichnung "URSTO" und beschrieben in Ref. 35 und in einer internationalen (PCT) Patentanmeldung, die eingereicht wurde an demselben Tag wie diese Anmeldung im Namen des Anthony Nolan Bone Marrow Trust, angewendet worden. Genau gesagt wurde DNA aus 63 B-lymphoblastoiden Zelllinien extrahiert, die 22 heterozygote und 41 homozygote Linien umfassten. Nach der PCR-Amplifikation mit Locus-spezifischen Primern wurden die Antisense-Einzelstränge isoliert und mit den entsprechenden Referenz-Strängen (A*0101, B*4402, Cw*0701) hybridisiert. Die allelischen Banden wurden in nicht-denaturierender PAGE getrennt und aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eluiert. Die Allele wurden eindeutig aus der isolierten DNA identifiziert. Die im Einzelnen isolierten Allele sind in der folgenden Tabelle angegeben. Tabelle 1 HLA-KLASSE I-ALLELE, ISOLIERT DURCH KOMPLEMENTÄRSTRANG-ANALYSE
    Figure 00350001
    • Anzahl der verschiedenen getesteten heterozygoten Kombinatinonen: HLA-A 19, HLA-B 14 und HLA-Cw 11.
  • In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass heteroduplexe derselben Allele von unterschiedlichen Quellen an dieselbe Position auf dem Gel migrieren. 3 zeigt die Ergebnisse aus solch einem Experiment. Bahnen 1, 5 und 8 enthalten Duplexe, die A0101 von unterschiedlichen Quellen umfassen, und die Duplexe migrierten alle an dieselbe Position. Bahnen 5 und 8 enthalten ebenfalls Duplexe, umfassend A0201 aus unterschiedlichen Quellen, und diese migrierten bei derselben Geschwindigkeit, doch langsamer als die A0101-Duplexe.
  • Diese reproduzierbare Mobilität der allelischen Banden kann als ein Verfahren für die diagnostische Identifizierung von Allelen verwendet werden.
  • EXPERIMENT 2: TRENNUNG VON EXON 13-MUTATIONEN DES CYSTISCHEN FIBROSE-GENS
  • Die CSA kann für die Isolierung eines jeglichen polyallelischen Gens angewendet werden. Dieses Beispiel zeigt die Analyse des cystischen Fibrose-Gens. Das größte codierte Exon dieses Gens ist Exon 13. Proben von einem nicht betroffenen Individuum, welches homozygot für das Wildtyp-Exon 13 ist, und Proben von zwei Mutationen wurden präpariert und mittels CSA analysiert. Die Mutationsproben waren von Individuen mit einer einzelnen Basen-Deletion 2603delT(36) und einer einzelnen Nukleotid-Substition bei Position 709 – R709X(37). Diese Proben waren zuvor mittels anderer Methoden typisiert worden.
  • Die PCR-Amplifikation des Exons 13 des cystischen Fibrose-Gens wurde durchgeführt, wie beschrieben bei Zielenski et al.(38), außer, dass der 5'-Primer am 5'-Ende biotinyliert wurde. Der Referenz-Strang wurde aus der Wildtyp-Probe präpariert, und nach der Präparierung der Einzelstränge aus drei Proben, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden diese mit dem Referenz-Strang hybridisiert und in nicht-denaturierender PAGE analysiert. Das Ergebnis ist in 6 gezeigt. Die Mutationen führen zu chimären Duplexen, die zu einer Verzögerung der mutierten allelischen Banden im Gel (siehe Bahnen 2 und 3) relativ zum Wildtyp-Homoduplex (siehe Bahn 1) führen.
  • EXPERIMENT 3: ALLEL-IDENTIFIZIERUNG DURCH DOPPELSTRANG-KONFORMATIONSANALYSE (DSCA)
  • Dieses Beispiel zeigt, wie DNA-Fragmente von einem bestimmten Segment eines Genoms analysiert und unter Verwendung eines markierten Referenz-Strangs ohne Isolierung des Duplex aus der Analyse-Phase identifiziert werden können. Das Beispiel verwendet spezifische Referenz-Stränge für HLA-A-, -B- und -Cw-Allele.
  • Die Referenz-Stränge wurden unter Verwendung von Sense-Primern für die drei Loci präpariert, die Fluoreszenzfarbstoff (Pharmacia Ltd.) am 5'-Ende aufwiesen. Diese waren nicht biotinyliert. Separate PCR-Reaktionen wurden für jeden Locus vorgenommen, um die Referenz-Reagenzien zu erzeugen. Die Primersequenzen und PCR-Bedingungen waren wie oben in Beispiel 1 beschrieben, und die amplifizierten Referenz-Stränge umfassten Exons 2 und 3, Intron 2 und kurze Segmente von Introns 1 und 3 von jedem Locus. Lymphoblastoide, homozygote Zelllinien wurden für jede Locus-Amplifikation verwendet, und eine Anzahl von Referenz-Strängen wurde getestet, um eine optimale Trennung und die geringste Ambiguität in der Identifizierung der relevanten Allele zu erzielen (siehe 7 und untenstehende Tabelle 2). Für die Analyse der HLA-Klasse I-Allele erlaubt die Verwendung zweier Referenz-Stränge für jeden Locus eine optimale Differenzierung zwischen den getesteten Allelen. 8 veranschaulicht die Resolution der DSCA-Methode.
  • TABELLE 2 DOPPELSTRANG-KONFORMATIONS-ANALYTISCHE TESTUNG DER REFERENZ-STRÄNGE
    Figure 00380001
  • RV = relativer Wert, stellt das Maß der Migration der Banden dar. Dieser wird erhalten unter Verwendung der Positionen der an der Front laufenden Primer-Bande und des Referenz-Homoduplex (Werte 1 bzw. 1000) in jeder Spur, um eine Standardkurve zu berechnen. Die Werte der Migration der nachfolgenden Banden werden aus dieser Kurve berechnet. Dem RV folgt die SD für jedes Set der Tests.
  • DNA-Proben wurden in derselben Weise aus anderen Zelllinien unter Verwendung von nicht-biotinylierten Locus-spezifischen Primern präpariert. Die amplifizierte Probe und die Referenz-Präparierung wurden in einem Verhältnis von 2:1 oder 3:1 gemischt und hybridisiert (wie in Punkt 2.5 des Beispiels 1) und auf 6% nicht-denaturierendes PAG (Long Ranger, Handelsname) aufgebracht. Die elektrophoretische Analyse wurde in einem ALFexpress DNA-SequenziererTM (Pharmacia Ltd.) vorgenommen, und die Mobilitäten der markierten Duplexe wurden mit einem Inte grallaser-aktivitierten System mit Fotodioden-Detektoren bestimmt. Die Ergebnisse sind in 9–14 und in der folgenden Tabelle gezeigt.
  • TABELLE 3
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Die Analyse der kombinierten Daten aus zwei Referenz-Strängen ist in 11 für den HLA-A- und in 14 für den HLA-B-Locus gezeigt. Bei dieser graphischen Analyse ist der RV für einen Referenz-Strang gegen den RV einer zweiten Referenz aufgetragen. Dies ergibt einen einzigartigen Parameter für jedes Allel, der für jedes getestete Allel diagnostisch ist.
  • EXPERIMENT 4: DSCA-ANALYSE DER INTRON 2-SEQUENZEN VON HLA-KLASSE I-ALLELEN
  • Es herrscht allgemeine Übereinstimmung darüber, dass der extensive Polymorphismus der HLA-Allele hauptsächlich auf die Antigen-Erkennungsstellen beschränkt ist. Diese sind durch Exons 2 und 3 der HLA-Klasse I-Gene codiert. Dieses Segment des Gens, welches in Beispiel 3 für die allelische Definition durch DSCA verwendet worden ist, umfasst Intron 2. Kleine Variationen in den intronischen Sequenzen der HLA-Klasse I-Gene sind berichtet worden (39), und diese werden die Mobilitäten der Banden beeinflussen, wo die Sequenzen von der Referenz-Strangsequenz verschieden sind. Wichtiger für die DSCA-Analyse ist die Möglichkeit solcher Variationen in einer allelischen Sequenz, die in verschiedenen Haplotypen entstanden sein können, unabhängig von den Exon-Rekombinanten. Die DSCA ist hinreichend empfindlich, um auf intra-allelische Sequenzvariationen zu testen.
  • Acht gewöhnliche und häufig vorkommende kaukasoide Allele von HLA-A- und HLA-B-Loci wurden untersucht. Locus-spezifische Amplifikationen wurden wie in Beispiel 3 vorgenommen. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden sowohl unter denaturierenden als auch nicht-denaturierenden Bedingungen unter Verwendung mehrerer markierter Referenz-Stränge von beiden Loci analysiert.
  • Die Nummern der analysierten Allele waren:
    Figure 00410001
  • In allen Fällen migrierten die allelischen Banden mit identischer Mobilität, was anzeigt, dass kein intra-allelischer Polymorphismus in den getesteten Proben vorlag (15). Es scheint sich daher so zu verhalten, dass die Intronsequenzen für jedes Allel konserviert sind.
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Claims (34)

  1. Verfahren zum Auftrennen und Identifizieren eines DNA-Moleküls in einem Gemisch von DNA-Molekülen, welches Verfahren umfasst: (i) Amplifizieren der DNA-Moleküle in dem Gemisch; (ii) Hybridisieren der Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle mit einem komplementären Strang eines Referenz-DNA-Moleküls, um Testduplexe zu bilden; (iii) Auftrennen der Duplexe, wobei Mobilitätsmarker in die Auftrennphase einbezogen sind; (iv) Zuordnen eines relativen Zahlenwerts als einem Maß der Migrationsposition der Testduplexe unter Verwendung der Positionen der Mobilitätsmarker; und dabei (v) diagnostisches Identifzieren des DNA-Moleküls; wobei Schritte (ii) bis (v) für ein zweites oder mehrfaches Mal wiederholt werden und ein unterschiedlicher Referenzstrang bei jeder Wiederholung verwendet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle bereitgestellt werden durch: (a) Amplifizieren der DNA-Moleküle im Gemisch unter Verwendung eines Pri merpaars, bei dem einer der Primer einen Liganden trägt, um ein amplifiziertes Gemisch von doppelsträngigen DNA-Molekülen zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt; (b) Kontaktieren des amplifizierten Gemischs der doppelsträngigen DNA-Moleküle mit einem Rezeptor an einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet; (c) Auftrennen des Gemischs der doppelsträngigen DNA-Moleküle in Einzelstränge und Entfernen der Stränge, die nicht durch den Liganden an den Träger gebunden sind; und (d) Rückgewinnen der verbliebenen Stränge vom Träger.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der komplementäre Strang des Referenz-DNA-Moleküls bereitgestellt wird durch: (i) Amplifizieren des Referenz-DNA-Moleküls unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer einen Liganden trägt, um ein amplifiziertes doppelsträngiges Referenz-DNA-Molekül zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt; (ii) Kontaktieren des doppelsträngigen Referenz-DNA-Moleküls mit einem Rezeptor an einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet; (iii) Auftrennen des doppelsträngigen Referenz-DNA-Moleküls in Einzelstränge und Entfernen des Strangs, der nicht durch den Liganden an den Träger gebunden ist; und (iv) Rückgewinnen des verbliebenen Strangs vom Träger.
  4. Verfahren nach Anspruch 2 modifiziert durch Ruckgewinnen der Stränge, die nicht an den Träger gebunden sind, anstelle der Stränge, die an den Träger ge bunden sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, modifiziert durch Rückgewinnen des Strangs des Referenz-DNA-Moleküls, der nicht an den Träger gebunden ist, anstelle des Strangs, der an den Träger gebunden ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Einzelstränge der amplifizierten DNA-Moleküle bereitgestellt werden durch: (a) Amplifizieren der DNA-Moleküle im Gemisch unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt, um ein amplifiziertes Gemisch von doppelsträngigen DNA-Molekülen zu erzeugen, worin einer der Stränge ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt; und (b) Auftrennen des Gemischs der doppelsträngigen DNA-Moleküle in Einzelstränge.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der komplementäre Strang des Referenz-DNA-Moleküls bereitgestellt wird durch: (a) Amplifizieren des Referenz-DNA-Moleküls unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt, um ein amplifiziertes doppelsträngiges Referenz-DNA-Molekül zu erzeugen, worin einer der Stränge ein Molekül mit hohem Molekulargewicht trägt; und (b) Auftrennen des doppelsträngigen Referenz-DNA-Moleküls in Einzelstränge.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Referenz-DNA-Molekül eine bekannte Sequenz aufweist.
  9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Duplexe durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gemisch der DNA-Moleküle ein Gemisch von Allelen eines polyallelen Gens ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Referenz-DNA-Molekül ein Allel ist, welches denselben Serotyp aufweist wie wenigstens eines der Allele im Gemisch der Allele.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Gemisch von Allelen von einem vorgesehenen Empfänger oder einem vorgesehenen Spender bei einer Gewebs- oder Organtransplantationsoperation ist.
  14. Verfahren zum Bestimmen, ob ein vorgesehener Empfänger bei einer Gewebs- oder Organtransplantationsoperation Allele eines Gens aufweist, die mit den Allelen eines vorgesehenen Spenders bei der Operation kompatibel sind, welches Verfahren umfasst: (i) Amplifizieren der Allele des vorgesehenen Empfängers unter Verwendung eines Primerpaars, bei welchem einer der Primer einen Liganden trägt, um amplifizierte doppelsträngige Allele des vorgesehenen Empfängers zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt; (ii) Kontaktieren der amplifizierten doppelsträngigen Allele mit einem Rezeptor auf einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet; (iii) Auftrennen der doppelsträngigen Allele in Einzelstränge und Entfernen der Stränge, die nicht durch den Liganden an den Träger gebunden sind; (iv) Rückgewinnen der verbliebenen Stränge vom Träger; (v) Mischen der rückgewonnenen Stränge mit komplementären Strängen der Allele von dem vorgesehenen Spender, um Testduplexe zu bilden; (vi) Auftrennen der Testduplexe mittels Gelelektrophorese; und Ausführen eines oder mehrerer der folgenden Schritte: (vii) Vergleichen der Positionen, an die die Testduplexe auf dem Gel wandern, mit der Position eines Kontroll-DNA-Moleküls; (viii) Sequenzieren der Testduplexe; (ix) Sequenz-spezifische Primer-(SSP)-Amplifikationsanalyse; und (x) Sequenz-spezifische Oligonukleotid-(SSO)-Analyse.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die komplementären Stränge der Allele des vorgesehenen Spenders bereitgestellt werden durch: (i) Amplifizieren der Allele des vorgesehenen Spenders unter Verwendung eines Primerpaars, bei dem einer der Primer einen Liganden trägt, um amplifizierte doppelsträngige Allele des vorgesehenen Spenders zu erzeugen, worin einer der Stränge einen Liganden trägt; (ii) Kontaktieren der amplifizierten doppelsträngigen Allele mit einem Rezeptor an einem festen Träger unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an den Rezeptor bindet; (iii) Auftrennen der doppelsträngigen Allele in Einzelstränge und Entfernen der Stränge, die nicht durch den Liganden an den Träger gebunden sind; und (d) Rückgewinnen der verbliebenen Stränge vom Träger.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei der vorgesehene Spender danach ausgewählt ist, Allele desselben Serotyps wie der vorgesehene Empfänger auf zuweisen.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Kontroll-DNA ein Homoduplex zwischen zwei Strängen desselben Allels ist und die Wanderung der Testduplexe zu derselben Position auf dem Gel wie der Homoduplex anzeigt, dass der vorgesehene Empfänger und der vorgesehene Spender dieselben Allele aufweisen.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei die Allele von einem Humanes Leukozytenantigen-(HLA)-Klasse I-Gen oder einem HLA-Klasse II-Gen sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Allele von dem HLA-A-Gen, dem HLA-B-Gen oder dem HLA-C-Gen sind.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 und 14 bis 17, wobei der Ligand Biotin ist und der Rezeptor Streptavidin ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 und 20, wobei der feste Träger in Magnetkügelchen besteht, und die Stränge, die keinen Liganden tragen, durch Anziehen der Kügelchen an einen Magneten und Waschen der Kügelchen unter Bedingungen entfernt werden, so dass sich die doppelsträngigen DNA-Moleküle zu Einzelsträngen dissoziieren.
  22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Amplifikation der DNA-Moleküle durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vorgenommen wird.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei der vorgesehene Empfänger und der vorgesehene Spender ein vorgesehener Knochenmarksempfänger und ein vorgesehener Knochenmarksspender, oder ein vorgesehener Nierenempfänger und ein vorgesehener Nierenspender sind.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die DNA-Moleküle im Gemisch der DNA-Moleküle dieselbe Anzahl von Nukleotiden, doch unterschiedliche Basensequenzen, aufweisen.
  25. Verfahren zum Identifizieren eines DNA-Moleküls, welches Verfahren umfasst: (i) Kontaktieren des DNA-Moleküls mit einem markierten Referenz-DNA-Strang unter solchen Bedingungen, dass der Referenzstrang an einen komplementären Strang des DNA-Moleküls hybridisiert, um einen Testduplex zu bilden; (ii) Laufen lassen des Testduplex und ein oder mehrerer Kontrollduplex(e) in ein Gel mittels Elektrophorese; und (iii) Vergleichen der Position des Testduplex auf dem Gel mit der/den Position(en) des/der Kontrollduplex(e); wobei Schritte (i) bis (iii) für ein zweites oder mehrfaches Mal wiederholt werden und ein unterschiedlicher Referenzstrang bei jeder Wiederholung verwendet wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 1 oder 25, wobei die Mobilitätsmarker entweder (a) Duplexe sind, die eine schnellere und/oder langsamere Mobilität als der Testduplex aufweisen, wenn sie in dieselbe Spur auf einem Gel wie der Testduplex laufen, oder (b) Duplexe sind, die abgestufte Mobilitäten aufweisen, wenn sie in eine unterschiedliche Spur auf einem Gel wie der Testduplex laufen.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Referenzstrang markiert ist.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 25, 26 und 27, wobei die Schritte (ii) bis (v) ein zweites Mal unter Verwendung eines zweiten Referenzstrangs wiederholt werden.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 25 und 28, wobei das zu identifizierende DNA-Molekül ein Allel eines Gens mit 10 bis 300 Allelen ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Gen 30 bis 100 Allele aufweist.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 25 bis 30, wobei das Gen ein HLA-Gen ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Gen ein HLA-Klasse I-Gen ist.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Gen HLA-A, HLA-B oder HLA-C ist.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 25, 26 und 27, welches einen Unterschied von ein, zwei oder drei Nukleotidpositionen zwischen dem zu identifizierenden DNA-Molekül und dem komplementären Strang des Referenz-DNA-Moleküls analysieren kann.
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