JP2002516666A - 少なくとも一つの特定のヌクレオチド配列の増幅方法及び使用されるプライマー - Google Patents
少なくとも一つの特定のヌクレオチド配列の増幅方法及び使用されるプライマーInfo
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Abstract
(57)【要約】
反応混合物中に含まれる合成または天然核酸の少なくとも一つの特異的配列を増幅する方法であって、該反応混合物は、少なくとも二つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸、及び／またはそれぞれ少なくとも一つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも二つの核酸より成り、該方法は、関連ヌクレオチド配列の増幅が可能なように核酸とハイブリダイズ可能な少なくとも一つのタイプの増幅プライマーを使用するものであって、− 増幅される特異的なヌクレオチド配列ではない少なくとも一つのヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能で、且つ− 増幅プライマーの伸長を、このヌクレオチドの配列のレベルで妨げることが可能な、ブロッキングプライマーとして機能する、少なくとも一つの配列を該反応混合物中に加えることを含むことを特徴とする方法。
Description
【０００１】
本発明は、反応混合物中に含まれる合成または天然核酸の少なくとも一つの特
異的ヌクレオチド配列の新規な増幅方法に関する。本発明はまた、上記増幅が可
能なプライマーに関する。
異的ヌクレオチド配列の新規な増幅方法に関する。本発明はまた、上記増幅が可
能なプライマーに関する。
【０００２】
従来技術は、増幅されるヌクレオチド配列に特異的なプライマーを使用するヌ
クレオチド配列の増幅方法を記載する。かくして、核酸の調製における、遺伝子
または遺伝子のファミリーを増幅することが可能である。多くの技術は、ポリメ
ラーゼによる伸長のためのプライマーとして機能する、標的配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドを使用する。
クレオチド配列の増幅方法を記載する。かくして、核酸の調製における、遺伝子
または遺伝子のファミリーを増幅することが可能である。多くの技術は、ポリメ
ラーゼによる伸長のためのプライマーとして機能する、標的配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドを使用する。
【０００３】 ＤＮＡの増幅のために、特許US-A-4,683,195、US-A-4,683,202及びUS-A-4,800
,159に記載されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、例えば特許出願EP-A-0,201
,184に示されたＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、または特許出願WO-A-90/01069に
記載されたＲＣＲ（修復連鎖反応）が存在する。
,159に記載されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、例えば特許出願EP-A-0,201
,184に示されたＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、または特許出願WO-A-90/01069に
記載されたＲＣＲ（修復連鎖反応）が存在する。
【０００４】 ＲＮＡの増幅のために、いくつかの技術が、各種の文献において記載されてい
る。これらの技術は、以下のものである： − 特許出願WO-A-90/06995の３ＳＲ（自己維持配列複製） − 特許US-A-5,194,370のＳＰＳＲ（一本鎖プライマー配列複製） − 特許US-A-5,399,491のＴＭＡ（転写介在増幅）。
る。これらの技術は、以下のものである： − 特許出願WO-A-90/06995の３ＳＲ（自己維持配列複製） − 特許US-A-5,194,370のＳＰＳＲ（一本鎖プライマー配列複製） − 特許US-A-5,399,491のＴＭＡ（転写介在増幅）。
【０００５】 しかしながら、これらの技術は、増幅プライマーの厳格な選択を課す。特に、
興味ある配列に対して比較的非特異的なプライマーは、それらが結合する多くの
関連配列の増幅を可能にするであろう。それ故、興味ある配列に対応するアンプ
リコンは、アンプリコンの混合物中に希釈され、それはこの増幅生産物の使用を
困難にする。次いでこれらの条件の下では、非常に特異的な相補的プライマーの
生産を可能にする十分に特異的なヌクレオチド配列の領域を厳格に選択すること
が必須である。しかしながら、プライマーのハイブリダイゼーションのために使
用される配列を選択する場合に、他の問題が生じ得る。特に、真に特異的な領域
は場合により独特であり、興味ある配列の内部に位置する。上記領域に対してプ
ライマーをハイブリダイズさせるように選択することは、上記興味ある配列の可
変的な大きな分画のみの生産を含む。それ故、情報のロスが存在する。さらに、
興味あるヌクレオチド配列に特異的なプライマーの生産は、非常により困難で繁
雑な作業をもたらす。
興味ある配列に対して比較的非特異的なプライマーは、それらが結合する多くの
関連配列の増幅を可能にするであろう。それ故、興味ある配列に対応するアンプ
リコンは、アンプリコンの混合物中に希釈され、それはこの増幅生産物の使用を
困難にする。次いでこれらの条件の下では、非常に特異的な相補的プライマーの
生産を可能にする十分に特異的なヌクレオチド配列の領域を厳格に選択すること
が必須である。しかしながら、プライマーのハイブリダイゼーションのために使
用される配列を選択する場合に、他の問題が生じ得る。特に、真に特異的な領域
は場合により独特であり、興味ある配列の内部に位置する。上記領域に対してプ
ライマーをハイブリダイズさせるように選択することは、上記興味ある配列の可
変的な大きな分画のみの生産を含む。それ故、情報のロスが存在する。さらに、
興味あるヌクレオチド配列に特異的なプライマーの生産は、非常により困難で繁
雑な作業をもたらす。
【０００６】
本発明では、従来のハイブリダイゼーション条件の下で興味あるヌクレオチド
配列を特異的に増幅することが可能であるため、切り詰めた増幅生産物を得る危
険性と、増幅されるヌクレオチド配列に特異的なプライマーを得る困難性は除去
される。
配列を特異的に増幅することが可能であるため、切り詰めた増幅生産物を得る危
険性と、増幅されるヌクレオチド配列に特異的なプライマーを得る困難性は除去
される。
【０００７】 これを実施するために、二つのタイプの相補的プライマーが使用される；第一
は、全ての関連ヌクレオチド配列に差異なくハイブリダイズするプライマーのタ
イプであり、第二は、これらの関連配列の一つのみにハイブリダイズするプライ
マーまたは各プライマーのタイプである。非特異的な第一のものは、伸長のため
のプライマーとして使用され、興味ある配列に関連するヌクレオチド配列に対し
て特異的な第二のものは、これらの関連ヌクレオチド配列のいくつかの伸長をブ
ロックするためのプライマーとして使用される。
は、全ての関連ヌクレオチド配列に差異なくハイブリダイズするプライマーのタ
イプであり、第二は、これらの関連配列の一つのみにハイブリダイズするプライ
マーまたは各プライマーのタイプである。非特異的な第一のものは、伸長のため
のプライマーとして使用され、興味ある配列に関連するヌクレオチド配列に対し
て特異的な第二のものは、これらの関連ヌクレオチド配列のいくつかの伸長をブ
ロックするためのプライマーとして使用される。
【０００８】 非特異的及び特異的プライマーの混合物が使用される場合、使用される特異的
配列のタイプの選択に依存して、特定の非特異的配列の伸長を妨げることができ
る。次いで、得られたアンプリコンを選択することが可能である。
配列のタイプの選択に依存して、特定の非特異的配列の伸長を妨げることができ
る。次いで、得られたアンプリコンを選択することが可能である。
【０００９】 かくして、増幅が所望されない特定の関連配列の増幅が、これらの関連配列に
特異的な相補的配列を加えることによってブロックでき、これらの特異的相補的
配列は、ブロッキングプライマーとして機能する。かくして、選択的に増幅され
た興味ある配列が単離される。それ故、ブロッキングプライマーが加えられてい
ない単一のアンプリコンが、興味ある各配列について得られる。
特異的な相補的配列を加えることによってブロックでき、これらの特異的相補的
配列は、ブロッキングプライマーとして機能する。かくして、選択的に増幅され
た興味ある配列が単離される。それ故、ブロッキングプライマーが加えられてい
ない単一のアンプリコンが、興味ある各配列について得られる。
【００１０】
この目的のために、本発明は、反応混合物中に含まれる合成または天然核酸の
少なくとも一つの特異的なヌクレオチド配列の増幅方法に関し、該反応混合物は
、少なくとも二つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸、及び／
またはそれぞれ少なくとも一つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも二つの
核酸より成り、該方法は、関連ヌクレオチド配列の増幅を可能にするように該核
酸とハイブリダイズ可能な少なくとも一つのタイプの増幅プライマーを使用する
ものであって、 − 増幅される特異的なヌクレオチド配列ではない少なくとも一つのヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズ可能であり、 − 増幅プライマーの伸長を、このヌクレオチド配列のレベルで妨げることが可
能な、 ブロッキングプライマーとして機能する少なくとも一つの配列を、該反応混合物
に加えることを含むことを特徴とする。
少なくとも一つの特異的なヌクレオチド配列の増幅方法に関し、該反応混合物は
、少なくとも二つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸、及び／
またはそれぞれ少なくとも一つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも二つの
核酸より成り、該方法は、関連ヌクレオチド配列の増幅を可能にするように該核
酸とハイブリダイズ可能な少なくとも一つのタイプの増幅プライマーを使用する
ものであって、 − 増幅される特異的なヌクレオチド配列ではない少なくとも一つのヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズ可能であり、 − 増幅プライマーの伸長を、このヌクレオチド配列のレベルで妨げることが可
能な、 ブロッキングプライマーとして機能する少なくとも一つの配列を、該反応混合物
に加えることを含むことを特徴とする。
【００１１】 好ましくは、ブロッキングプライマーは、増幅されるヌクレオチド配列に特異
的ではないヌクレオチド配列、または該配列の全てにハイブリダイズ可能である
。
的ではないヌクレオチド配列、または該配列の全てにハイブリダイズ可能である
。
【００１２】 第一に、上述の増幅法で使用されるブロッキングプライマーの場合、各ブロッ
キングプライマーは、ＰＮＡまたはチオリン酸ヌクレオチドのような、修飾ヌク
レオチド及び／またはリボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチド
に基づくオリゴヌクレオチドである。
キングプライマーは、ＰＮＡまたはチオリン酸ヌクレオチドのような、修飾ヌク
レオチド及び／またはリボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチド
に基づくオリゴヌクレオチドである。
【００１３】 第二に、上述の増幅法で使用されるブロッキングプライマーの場合、各ブロッ
キングプライマーは、増幅を妨げる少なくとも一つのエレメントを含む。
キングプライマーは、増幅を妨げる少なくとも一つのエレメントを含む。
【００１４】 かくして、増幅を妨げるエレメントは、ブロッキングプライマーの３’末端に
位置し、その伸長をさせない。
位置し、その伸長をさせない。
【００１５】 さらに、増幅を妨げる別のエレメントは、ブロッキングプライマーの５’末端
に位置し、保護エレメントとして機能する。
に位置し、保護エレメントとして機能する。
【００１６】 増幅を妨げる各エレメントは、以下のもの： − ヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド、または少なくとも一つの修飾ヌク
レオチドを含んでもよい若しくは含まなくてもよいオリゴヌクレオチドであって
、該ヌクレオチドは、核酸にハイブリダイズしない修飾ヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドである、 − ヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド以外の分子、 のいずれかより成る。
レオチドを含んでもよい若しくは含まなくてもよいオリゴヌクレオチドであって
、該ヌクレオチドは、核酸にハイブリダイズしない修飾ヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドである、 − ヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド以外の分子、 のいずれかより成る。
【００１７】 この場合、該エレメントは、少なくとも５個、特に少なくとも１０個、好まし
くは少なくとも１５個のヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド、またはヌクレ
オチドと修飾ヌクレオチドの混合物より成る。
くは少なくとも１５個のヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド、またはヌクレ
オチドと修飾ヌクレオチドの混合物より成る。
【００１８】
第一の実施態様に従って、且つ該エレメントがヌクレオチドまたは修飾ヌクレ
オチド、または少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含んでもよい若しくは含ま
なくてもよいオリゴヌクレオチドより成る場合、該ヌクレオチド、修飾ヌクレオ
チド若しくはオリゴヌクレオチドは、核酸にハイブリダイズせず、該エレメント
は、ループの形成、及びこのループを構成するヌクレオチド及び／または修飾ヌ
クレオチドの間のハイブリダイゼーションの形成を可能にするのに十分な長さを
有する。
オチド、または少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含んでもよい若しくは含ま
なくてもよいオリゴヌクレオチドより成る場合、該ヌクレオチド、修飾ヌクレオ
チド若しくはオリゴヌクレオチドは、核酸にハイブリダイズせず、該エレメント
は、ループの形成、及びこのループを構成するヌクレオチド及び／または修飾ヌ
クレオチドの間のハイブリダイゼーションの形成を可能にするのに十分な長さを
有する。
【００１９】 第二の実施態様に従って、且つ該エレメントがヌクレオチドまたは修飾ヌクレ
オチド、または少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含んでもよい若しくは含ま
なくてもよいオリゴヌクレオチドより成る場合、該ヌクレオチド、修飾ヌクレオ
チド若しくはオリゴヌクレオチドは、核酸にハイブリダイズせず、該エレメント
は、全て同じ塩基を含むポリヌクレオチド及び／または修飾ポリヌクレオチドの
「テール」より成る。
オチド、または少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含んでもよい若しくは含ま
なくてもよいオリゴヌクレオチドより成る場合、該ヌクレオチド、修飾ヌクレオ
チド若しくはオリゴヌクレオチドは、核酸にハイブリダイズせず、該エレメント
は、全て同じ塩基を含むポリヌクレオチド及び／または修飾ポリヌクレオチドの
「テール」より成る。
【００２０】 増幅法で使用され、伸長を可能にしないエレメントを含むブロッキングプライ
マーの場合、該エレメントは、核酸の３’末端にそれ自体位置する、リボースの
３’位で配置された、ヒドロキシル基の水素原子またはヒドロキシル基と置換さ
れる。
マーの場合、該エレメントは、核酸の３’末端にそれ自体位置する、リボースの
３’位で配置された、ヒドロキシル基の水素原子またはヒドロキシル基と置換さ
れる。
【００２１】 増幅法で使用され、保護エレメントをも含むブロッキングプライマーの場合、
該エレメントは： − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位で配置されたリン酸
基と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
基に接合される。
該エレメントは： − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位で配置されたリン酸
基と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
基に接合される。
【００２２】 添付された図面は、例示として与えられ、本質的に制限するものではない。
【００２３】 それ故本発明は、とりわけ遺伝子を選択的に増幅するための、その末端で修飾
されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用に関する。
されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用に関する。
【００２４】 本発明はまた、関連遺伝子のセット中に存在する特定の遺伝子を選択的に増幅
するための、修飾オリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法に関する。
するための、修飾オリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法に関する。
【００２５】 興味ある遺伝子の分析は、分子生物学の従来法を使用して容易に分析され得る
特異的物質の一定量を、生物学的サンプルから調製可能な遺伝子増幅法の使用に
よって容易である。かくして、遺伝子領域を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーの使用は、興味ある分子中に顕著に富化されるヌクレオチド分子の混合物の生
産を導き、該分子は、電気泳動分析法または分子ハイブリダイゼーション法を使
用して容易に検出可能となる。このアプローチの有効性は、分析される遺伝子領
域に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの使用に基づく。それ故これ
らのプライマーは、サンプル中に存在する興味ある核酸配列と選択的にハイブリ
ダイズ可能なオリゴヌクレオチドでなければならない。
特異的物質の一定量を、生物学的サンプルから調製可能な遺伝子増幅法の使用に
よって容易である。かくして、遺伝子領域を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーの使用は、興味ある分子中に顕著に富化されるヌクレオチド分子の混合物の生
産を導き、該分子は、電気泳動分析法または分子ハイブリダイゼーション法を使
用して容易に検出可能となる。このアプローチの有効性は、分析される遺伝子領
域に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの使用に基づく。それ故これ
らのプライマーは、サンプル中に存在する興味ある核酸配列と選択的にハイブリ
ダイズ可能なオリゴヌクレオチドでなければならない。
【００２６】 しかしながら、構造的に近接する遺伝子のファミリーのメンバーである遺伝子
の分析は、場合によりデリケートである。一つの遺伝子について独特であるヌク
レオチド領域に対する研究は、所望の特異性を達成可能とするが、このアプロー
チは場合により困難であり、または不可能でさえあることとなり得る。
の分析は、場合によりデリケートである。一つの遺伝子について独特であるヌク
レオチド領域に対する研究は、所望の特異性を達成可能とするが、このアプロー
チは場合により困難であり、または不可能でさえあることとなり得る。
【００２７】 それ故本発明は、構造的に近接する遺伝子の制限されたセットの増幅のための
特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの使用、並びに非所望の遺伝子を特異的
にブロック可能な修飾オリゴヌクレオチドプライマーの使用を組み合わせること
を含み、これらの修飾プライマーの各タイプは、非所望の遺伝子の単一のタイプ
に対応する。
特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの使用、並びに非所望の遺伝子を特異的
にブロック可能な修飾オリゴヌクレオチドプライマーの使用を組み合わせること
を含み、これらの修飾プライマーの各タイプは、非所望の遺伝子の単一のタイプ
に対応する。
【００２８】 このストラテジーは、そのヌクレオチド配列を決定することによって（例えば
ゲル中での配列決定によって、または複数のハイブリダイゼーション配列決定−
ＤＮＡチップ−によって）、混合物中の遺伝子の分析を単純化することが可能で
ある。
ゲル中での配列決定によって、または複数のハイブリダイゼーション配列決定−
ＤＮＡチップ−によって）、混合物中の遺伝子の分析を単純化することが可能で
ある。
【００２９】 本発明は、対応する核酸領域の有効な増幅が可能であるヌクレオチドプライマ
ーの混合物の使用、並びに下流配列の伸長、それ故増幅のための開始配列として
機能することができないオリゴヌクレオチドより成る、オーバーラップするまた
は下流に位置する（増幅が可能であるヌクレオチドプライマーに関して）ブロッ
キングヌクレオチドの使用を目的とする。
ーの混合物の使用、並びに下流配列の伸長、それ故増幅のための開始配列として
機能することができないオリゴヌクレオチドより成る、オーバーラップするまた
は下流に位置する（増幅が可能であるヌクレオチドプライマーに関して）ブロッ
キングヌクレオチドの使用を目的とする。
【００３０】 かくして非所望の遺伝子または対立遺伝子について、非ブロッキングプライマ
ー及びブロッキングプライマーは、所定のプライマー極性（分析される領域の５
’プライマー上流、または３’プライマー下流）に対して同じ鎖にハイブリダイ
ズする。非ブロッキングプライマーは、もしそれが増幅される鎖にハイブリダイ
ズするように操作されていたならば、ブロッキングプライマーのハイブリダイゼ
ーション部位に対応する領域を越えてアンプルコンを生産できず、非ブロッキン
グプライマーに対応する増幅を効果的にはしない。図１，２及び１３に説明され
たこの原理は、ブロッキングプライマーと非ブロッキングプライマーの機能性に
関する。
ー及びブロッキングプライマーは、所定のプライマー極性（分析される領域の５
’プライマー上流、または３’プライマー下流）に対して同じ鎖にハイブリダイ
ズする。非ブロッキングプライマーは、もしそれが増幅される鎖にハイブリダイ
ズするように操作されていたならば、ブロッキングプライマーのハイブリダイゼ
ーション部位に対応する領域を越えてアンプルコンを生産できず、非ブロッキン
グプライマーに対応する増幅を効果的にはしない。図１，２及び１３に説明され
たこの原理は、ブロッキングプライマーと非ブロッキングプライマーの機能性に
関する。
【００３１】 図１に従って、増幅は、非ブロッキングプライマーＰ１及びＰ２で実施される
。完全に従来技術では、Ｐ１及びＰ２プライマーの伸長が進行し、複数のアンプ
リコンＡが得られる。
。完全に従来技術では、Ｐ１及びＰ２プライマーの伸長が進行し、複数のアンプ
リコンＡが得られる。
【００３２】 図２に従って、図１は非ブロッキングプライマーＰ１とＰ２での増幅物を含む
ので、正確に繰り返される。しかしながら、相補的な鎖に関して、Ｐ１プライマ
ー伸長の進行の下流で、ブロッキングプライマーＰ１ｂとして機能する、相補的
な鎖にハイブリダイズ可能であり、この鎖のレベルで増幅を妨げることが可能な
配列が加えられる。このシナリオでは、アンプリコンは生産されないであろう。
ので、正確に繰り返される。しかしながら、相補的な鎖に関して、Ｐ１プライマ
ー伸長の進行の下流で、ブロッキングプライマーＰ１ｂとして機能する、相補的
な鎖にハイブリダイズ可能であり、この鎖のレベルで増幅を妨げることが可能な
配列が加えられる。このシナリオでは、アンプリコンは生産されないであろう。
【００３３】 図１３に従って、図１及び図２は特異的なブロッキングプライマーと非特異的
な増幅プライマーを使用して、関連遺伝子Ｇ１とＧ３をブロックすることによっ
て、Ｇ２遺伝子の選択的な増幅を含むため、図１及び図２は正確に繰り返される
。
な増幅プライマーを使用して、関連遺伝子Ｇ１とＧ３をブロックすることによっ
て、Ｇ２遺伝子の選択的な増幅を含むため、図１及び図２は正確に繰り返される
。
【００３４】 本発明は、修飾ヌクレオチドを含むブロッキングプライマーの使用を目的とす
る。この原理は、図３から６において説明される。
る。この原理は、図３から６において説明される。
【００３５】 図３に従って、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端のリボースの
２’または３’位、及び上記オリゴヌクレオチドの５’末端のリボースの５’位
で修飾され得る。
２’または３’位、及び上記オリゴヌクレオチドの５’末端のリボースの５’位
で修飾され得る。
【００３６】 図４に従って、Ｒ１基は、リボースの３’位でヒドロキシルを置換し、核酸／
ブロッキングプライマー二本鎖が形成された場合、ポリメラーゼによるプライマ
ーの３’末端の伸長を妨げることが可能である。
ブロッキングプライマー二本鎖が形成された場合、ポリメラーゼによるプライマ
ーの３’末端の伸長を妨げることが可能である。
【００３７】 図５に従って、Ｒ３基は、リボースの５’位でリン酸基を置換し、増幅プライ
マーの伸長の間で、５’末端の分解から及び／または置換されることから、ブロ
ッキングプライマーを保護することが可能である。
マーの伸長の間で、５’末端の分解から及び／または置換されることから、ブロ
ッキングプライマーを保護することが可能である。
【００３８】 図６に従って、核酸／ブロッキングプライマー二本鎖は、リボースの２’位の
ヒドロキシルまたは水素の置換によって増強され得、この置換はブロッキングプ
ライマーのいくつかのヌクレオチドで生じるであろう。例えばＲ２基は、2'-O-
メチル基であり得、それは疎水性型の相互作用を作製することによってＤＮＡ／
ＲＮＡ二本鎖を安定化する。
ヒドロキシルまたは水素の置換によって増強され得、この置換はブロッキングプ
ライマーのいくつかのヌクレオチドで生じるであろう。例えばＲ２基は、2'-O-
メチル基であり得、それは疎水性型の相互作用を作製することによってＤＮＡ／
ＲＮＡ二本鎖を安定化する。
【００３９】 目的とされるストラテジーには多くの使用が存在し、それぞれで関連配列の混
合物が分析される：ヒトまたは動物遺伝学、感染試薬の分析（ウイルス、細菌、
寄生動物等）。
合物が分析される：ヒトまたは動物遺伝学、感染試薬の分析（ウイルス、細菌、
寄生動物等）。
【００４０】 例として、ＨＬＡ（ヒトリンパ球抗原）のタイピングのドメインにおける使用
が、以下に記載される。
が、以下に記載される。
【００４１】 かくして、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は、ヒトの第６染色体に位置
し、免疫応答の調節に関与する遺伝子のセットを含む(Bodmer等, Momenclature
for Factors of the HLA System, 1996, Tissue Antigens, 1997, 49, 297-321)
。非常に多くの多型がこれらの遺伝子について観察され、これらの遺伝子のそれ
ぞれの完全に特異的なセットの変異型（または対立遺伝子）が各患者について観
察される。何れの患者も母親から遺伝したものと父親から遺伝したものの、各遺
伝子につき二つの対立遺伝子を有することに注意することは重要である。
し、免疫応答の調節に関与する遺伝子のセットを含む(Bodmer等, Momenclature
for Factors of the HLA System, 1996, Tissue Antigens, 1997, 49, 297-321)
。非常に多くの多型がこれらの遺伝子について観察され、これらの遺伝子のそれ
ぞれの完全に特異的なセットの変異型（または対立遺伝子）が各患者について観
察される。何れの患者も母親から遺伝したものと父親から遺伝したものの、各遺
伝子につき二つの対立遺伝子を有することに注意することは重要である。
【００４２】 このセットのＭＨＣ遺伝子において、最も一般的な名称は「ＨＬＡ遺伝子」で
あり、いくつかはその核酸配列及び対応するタンパク質の機能の両者について現
在周知である。それらは本質的に、クラスＩＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ
−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃｗ）の名称を有するＨＬＡ遺伝子、並びにクラスＩＩＨＬＡ遺
伝子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ）の名称を有するＨＬＡ遺
伝子である。これらの遺伝子は、医薬的なドメインにおける各種の重要性を有す
る、自己完全性のサーベイランスのレベルで免疫応答の調節に寄与する。第一の
使用は器官または骨髄移植の分野に関し、多くの研究が、期間提供者と受容者の
間のＨＬＡ遺伝子の最適なペアの重要性を示し、それ故組織適合性に関与する。
第二の使用は、感染試薬（ウイルス、細菌、寄生動物）または今まで十分に理解
されていない他の機構（例えば自己免疫疾患の場合）によって誘導される特定の
病理を進行する各患者の感受性の研究に関する。次いでＨＬＡ遺伝子は、所定の
民族の群について各患者で観察される免疫応答の非常に大きな多様性の形成に関
与する。最後に、ＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子の決定は、いずれかの患者の正確な
特徴付けまたは同定を可能にし、ＨＬＡタイピングの使用の第三のドメインを構
成する。
あり、いくつかはその核酸配列及び対応するタンパク質の機能の両者について現
在周知である。それらは本質的に、クラスＩＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ
−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃｗ）の名称を有するＨＬＡ遺伝子、並びにクラスＩＩＨＬＡ遺
伝子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ）の名称を有するＨＬＡ遺
伝子である。これらの遺伝子は、医薬的なドメインにおける各種の重要性を有す
る、自己完全性のサーベイランスのレベルで免疫応答の調節に寄与する。第一の
使用は器官または骨髄移植の分野に関し、多くの研究が、期間提供者と受容者の
間のＨＬＡ遺伝子の最適なペアの重要性を示し、それ故組織適合性に関与する。
第二の使用は、感染試薬（ウイルス、細菌、寄生動物）または今まで十分に理解
されていない他の機構（例えば自己免疫疾患の場合）によって誘導される特定の
病理を進行する各患者の感受性の研究に関する。次いでＨＬＡ遺伝子は、所定の
民族の群について各患者で観察される免疫応答の非常に大きな多様性の形成に関
与する。最後に、ＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子の決定は、いずれかの患者の正確な
特徴付けまたは同定を可能にし、ＨＬＡタイピングの使用の第三のドメインを構
成する。
【００４３】 ＨＬＡタイピングの主要な差異の一つは、共通の祖先から進化したために、こ
れらの遺伝子で観察される構造的なホモロジーに存する。そこから、興味ある遺
伝子は、近接する構造遺伝子または非構造遺伝子（シュードジーン）のセット中
で分析できる。それ故、配列決定される領域の増幅のための技術を最適化するこ
とによって、核酸配列の分析を制御すること並びに標的化の可能性を探ることが
必須である。
れらの遺伝子で観察される構造的なホモロジーに存する。そこから、興味ある遺
伝子は、近接する構造遺伝子または非構造遺伝子（シュードジーン）のセット中
で分析できる。それ故、配列決定される領域の増幅のための技術を最適化するこ
とによって、核酸配列の分析を制御すること並びに標的化の可能性を探ることが
必須である。
【００４４】 例えば、ＨＬＡ−Ａタイピングは、患者において観察されるＨＬＡ−Ａ遺伝子
の二つの対立遺伝子の選択的な分析に基づき、一方で構造的に近接する遺伝子Ｈ
ＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃｗの分析を避ける。それ故、ＨＬＡ−Ａ遺伝子上に標的
化される領域のみとハイブリダイズ可能なヌクレオチドプライマーを使用して、
ＨＬＡ−Ａ遺伝子について観察される関連領域を特異的に増幅可能であることが
必須である。
の二つの対立遺伝子の選択的な分析に基づき、一方で構造的に近接する遺伝子Ｈ
ＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃｗの分析を避ける。それ故、ＨＬＡ−Ａ遺伝子上に標的
化される領域のみとハイブリダイズ可能なヌクレオチドプライマーを使用して、
ＨＬＡ−Ａ遺伝子について観察される関連領域を特異的に増幅可能であることが
必須である。
【００４５】 別の例はＨＬＡ−ＤＲタイピングに関し、この場合多型の分析は、ＨＬＡ−Ｄ
ＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４及びＨＬＡ−ＤＲＢ５にのみ関し
、それらは細胞の表面で発現される機能的タンパク質を構成するポリペプチド鎖
をコードする遺伝子に対応し、一方で、ＨＬＡ−ＤＲＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ６、
ＨＬＡ−ＤＲＢ７、ＨＬＡ−ＤＲＢ８及びＨＬＡ−ＤＲＢ９シュードジーンの共
増幅及び分析を避ける。ＨＬＡ−ＤＲタイピングの例は、所定のサンプルと出会
う同定される核酸配列の混合物の大きな複雑性を説明し、遺伝子のそれぞれに対
する二つの対立遺伝子の存在は困難性をさらに増大し、場合により結果の説明を
非常にデリケートにする（タイピングの曖昧性）。
ＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４及びＨＬＡ−ＤＲＢ５にのみ関し
、それらは細胞の表面で発現される機能的タンパク質を構成するポリペプチド鎖
をコードする遺伝子に対応し、一方で、ＨＬＡ−ＤＲＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ６、
ＨＬＡ−ＤＲＢ７、ＨＬＡ−ＤＲＢ８及びＨＬＡ−ＤＲＢ９シュードジーンの共
増幅及び分析を避ける。ＨＬＡ−ＤＲタイピングの例は、所定のサンプルと出会
う同定される核酸配列の混合物の大きな複雑性を説明し、遺伝子のそれぞれに対
する二つの対立遺伝子の存在は困難性をさらに増大し、場合により結果の説明を
非常にデリケートにする（タイピングの曖昧性）。
【００４６】 例としてＨＬＡ−ＤＲタイピングを考慮すると、もし使用される分子分析技術
が、例えばシグナル強度（配列決定のため増大したサイズの分子に対する蛍光の
強度）またはオリゴプローブハイブリダイゼーション反応性プロフィールの解明
を使用するならば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子（各患者につき二つの対立遺伝子を
有する）の分析のみに対して分析を制限することによって、分析を単純化するこ
とは非常に有益であることがわかる。この目的は、ＨＡＬ−ＤＲＢ１特異的増幅
のためのオリゴヌクレオチドプライマーを選択することによって達成されるが、
ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の各種の対立遺伝子について観察される核酸配列のため
、及び大きいホモロジーを有する他のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の配列のため、この
アプローチは常に可能であるわけではない。一つの別法が本発明より成り、ＨＬ
Ａ−ＤＲＢ遺伝子に対して特異的であるが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子に対して非
特異的であるプライマーの混合物の使用、並びにＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−Ｄ
ＲＢ４及びＨＬＡ−ＤＲＢ５に特異的であるブロッキングプライマーの使用に基
づく。それ故、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の選択的な増幅がここから生じ、所定の
患者に対して観察された二つのＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子がより容易に測定で
きる。
が、例えばシグナル強度（配列決定のため増大したサイズの分子に対する蛍光の
強度）またはオリゴプローブハイブリダイゼーション反応性プロフィールの解明
を使用するならば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子（各患者につき二つの対立遺伝子を
有する）の分析のみに対して分析を制限することによって、分析を単純化するこ
とは非常に有益であることがわかる。この目的は、ＨＡＬ−ＤＲＢ１特異的増幅
のためのオリゴヌクレオチドプライマーを選択することによって達成されるが、
ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の各種の対立遺伝子について観察される核酸配列のため
、及び大きいホモロジーを有する他のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の配列のため、この
アプローチは常に可能であるわけではない。一つの別法が本発明より成り、ＨＬ
Ａ−ＤＲＢ遺伝子に対して特異的であるが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子に対して非
特異的であるプライマーの混合物の使用、並びにＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−Ｄ
ＲＢ４及びＨＬＡ−ＤＲＢ５に特異的であるブロッキングプライマーの使用に基
づく。それ故、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の選択的な増幅がここから生じ、所定の
患者に対して観察された二つのＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子がより容易に測定で
きる。
【００４７】 ヌクレオチドプライマーは、例えば固相合成を使用するもののような従来法に
従って合成され、他に断り書きがなければ、糖の３’領域中の−ＯＨ残基を含み
（３’−ＯＨ）、それは増幅工程の間のその伸長を可能にする。それらは必須に
、使用に従って１０から３０マーの間の長さを有するオリゴヌクレオチドであり
、これは考慮される核酸配列に依存する。
従って合成され、他に断り書きがなければ、糖の３’領域中の−ＯＨ残基を含み
（３’−ＯＨ）、それは増幅工程の間のその伸長を可能にする。それらは必須に
、使用に従って１０から３０マーの間の長さを有するオリゴヌクレオチドであり
、これは考慮される核酸配列に依存する。
【００４８】 ブロッキングヌクレオチドプライマーは、上述の方法に従って調製され、該オ
リゴヌクレオチドの３’末端に位置する、伸長を阻害する官能基を含む。このブ
ロッキング官能基の目的は、相補的な配列上で読まれる情報に従って次の塩基の
ＤＮＡポリメラーゼによる付加を妨げることである。例として、この３’ブロッ
キング官能基は、リン酸−アルキルアミン基（Ｃ６−ＮＨ２）、リン酸基または
ダブシル基である；この主題に関しては図７参照。これらの基はヒドロキシル官
能基（３’−ＯＨ）を保護し、かくしてＤＮＡポリメラーゼによって触媒される
ポリヌクレオチド重合の間でその反応性をブロックする。酵素的重合のブロッキ
ングはまた、３’位のでヒドロキシル化によっても得ることができる。実際、３
’−Ｈ、２’−ＯＨ末端を含むプライマーは、適切な試薬及び固相支持体上のオ
リゴヌクレオチド集合体の技術を使用して得ることができる。
リゴヌクレオチドの３’末端に位置する、伸長を阻害する官能基を含む。このブ
ロッキング官能基の目的は、相補的な配列上で読まれる情報に従って次の塩基の
ＤＮＡポリメラーゼによる付加を妨げることである。例として、この３’ブロッ
キング官能基は、リン酸−アルキルアミン基（Ｃ６−ＮＨ２）、リン酸基または
ダブシル基である；この主題に関しては図７参照。これらの基はヒドロキシル官
能基（３’−ＯＨ）を保護し、かくしてＤＮＡポリメラーゼによって触媒される
ポリヌクレオチド重合の間でその反応性をブロックする。酵素的重合のブロッキ
ングはまた、３’位のでヒドロキシル化によっても得ることができる。実際、３
’−Ｈ、２’−ＯＨ末端を含むプライマーは、適切な試薬及び固相支持体上のオ
リゴヌクレオチド集合体の技術を使用して得ることができる。
【００４９】 非ブロッキングポリマーとオーバーラップしないブロッキングポリマーの使用
を考慮しなければならない場合、このプライマーがポリメラーゼのエクソヌクレ
アーゼ活性によって分解されず、且つ増幅される領域のさらに上流（さらに５’
部位）に位置する非ブロッキングプライマーの伸長の間で置換されないように、
ブロッキングプライマーの５’末端もまた保護することが有利であろう。このた
めに、各種の修飾が、不活性化される核酸配列にハイブリダイズするブロッキン
グプライマーの完全性を維持できるであろう。いくつかの可能性が例として挙げ
られる：アクリジン核、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、トリリン酸基、及び「
ステムループ」付加配列。上記修飾は、図８に集合して表される。
を考慮しなければならない場合、このプライマーがポリメラーゼのエクソヌクレ
アーゼ活性によって分解されず、且つ増幅される領域のさらに上流（さらに５’
部位）に位置する非ブロッキングプライマーの伸長の間で置換されないように、
ブロッキングプライマーの５’末端もまた保護することが有利であろう。このた
めに、各種の修飾が、不活性化される核酸配列にハイブリダイズするブロッキン
グプライマーの完全性を維持できるであろう。いくつかの可能性が例として挙げ
られる：アクリジン核、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、トリリン酸基、及び「
ステムループ」付加配列。上記修飾は、図８に集合して表される。
【００５０】 アクリジン核は、強力な内部キレート剤である；かくしてそれはプライマー／
標的配列二本鎖に非常に大きな安定性を与え、プライマーの置換を避ける。５’
−ヒドロキシル末端に対する保護基として使用されるジメトキシトリチル（ＤＭ
Ｔ）、アンチセンスストラテジーにおいて使用されるトリリン酸基、及び二次「
ステム−ループ」構造を形成可能な付加的配列は、エキソヌクレアーゼ活性によ
り生じ得る分解からプライマーを保護する。
標的配列二本鎖に非常に大きな安定性を与え、プライマーの置換を避ける。５’
−ヒドロキシル末端に対する保護基として使用されるジメトキシトリチル（ＤＭ
Ｔ）、アンチセンスストラテジーにおいて使用されるトリリン酸基、及び二次「
ステム−ループ」構造を形成可能な付加的配列は、エキソヌクレアーゼ活性によ
り生じ得る分解からプライマーを保護する。
【００５１】 表１：ブロッキングプライマーの３’（及び）５’末端の修飾
【表１】
【００５２】 非ブロッキングプライマー及びブロッキングプライマーの混合物を使用する原
理は、３’末端（下流）、または３’末端及び５’末端（分析される領域の上流
）に対して使用でき、核酸配列の特徴付けに依存し、または分析される領域の遺
伝子の複雑性に依存する。
理は、３’末端（下流）、または３’末端及び５’末端（分析される領域の上流
）に対して使用でき、核酸配列の特徴付けに依存し、または分析される領域の遺
伝子の複雑性に依存する。
【００５３】 ブロッキングプライマーを使用する増幅のアプローチはまた、分析される各種
の核酸配列（各種のローカス、各種の遺伝子、または各種の遺伝子の領域）に対
して同じ増幅の間、分析される同じ核酸配列にハイブリダイズ可能なプライマー
の混合物に対応する単一の増幅、またはハイブリダイズ可能なプライマーのいく
つかの混合物に対応する複数の増幅のストラテジーとしても使用できる。
の核酸配列（各種のローカス、各種の遺伝子、または各種の遺伝子の領域）に対
して同じ増幅の間、分析される同じ核酸配列にハイブリダイズ可能なプライマー
の混合物に対応する単一の増幅、またはハイブリダイズ可能なプライマーのいく
つかの混合物に対応する複数の増幅のストラテジーとしても使用できる。
【００５４】 ３’及び５’ブロック化オリゴヌクレオチドプライマーの合成例 ブロック化オリゴヌクレオチドプライマーを、製造者によって提案されたプロ
トコールに従った自動ホスホルアミダイト法に従って、Expidite機械(Perseptiv
e Biosystems)を使用して合成した。３’及び５’修飾の導入のために必要とさ
れるホスホルアミダイト試薬は、Glenn Researchから得られた。
トコールに従った自動ホスホルアミダイト法に従って、Expidite機械(Perseptiv
e Biosystems)を使用して合成した。３’及び５’修飾の導入のために必要とさ
れるホスホルアミダイト試薬は、Glenn Researchから得られた。
【００５５】 オリゴヌクレオチド精製を、逆相ＨＰＬＣによって実施する（半調製１０ｍｍ
×２５ｃｍBeckman ODSカラム；Ｃ１８；５μｍの孔；溶出；０．１Ｍ酢酸トリ
エチルアンモニウム、ｐＨ７の水溶液と混合した１０から３０％のアセトニトリ
ルの３０分勾配）。オリゴヌクレオチドを含む分画を回収し、乾燥した。次いで
各種のオリゴヌクレオチドを精製水中に取り出し、ＵＶ吸収を測定することによ
って定量した。
×２５ｃｍBeckman ODSカラム；Ｃ１８；５μｍの孔；溶出；０．１Ｍ酢酸トリ
エチルアンモニウム、ｐＨ７の水溶液と混合した１０から３０％のアセトニトリ
ルの３０分勾配）。オリゴヌクレオチドを含む分画を回収し、乾燥した。次いで
各種のオリゴヌクレオチドを精製水中に取り出し、ＵＶ吸収を測定することによ
って定量した。
【００５６】 本発明の原理を説明するために、ＨＬＡドメインにおける使用の二つの例を以
下に記載する。
下に記載する。
【００５７】
実施例１：ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の増幅の特異的ブロッキング いくつかのＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲβポリペプチド鎖をコード
できる：ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、及びＨＬＡ
−ＤＲＢ５。遺伝的な様式で移行するこのセットの機能的遺伝子の配置は、患者
によって変化し、かくして患者は各種の保存的なハプロタイプを示す。もしＨＬ
Ａ−ＤＲＢ１遺伝子の存在が常に観察されるのであれば、一つ以上の他の遺伝子
（ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５）の存在は任意であ
り、同じ染色体によって運ばれるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子に依存する。さら
に、二つのハプロタイプ（一方は母親から由来し、他方は父親から遺伝する）の
存在のため、分析されるＨＬＡ−ＤＲＢ配列の混合物の複雑性は、非常に可変的
である。それ故、ＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子と関連する主な情報の分析は、例
えばＨＬＡ−ＤＲＢ３のような他のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子が存在するか否かに従
って、説明が困難である。それ故、存在する可能性のあるＨＬＡ−ＤＲＢ３対立
遺伝子を増幅することなく（1997の文献に挙げられた１１の対立遺伝子の間で１
または２の生じ得る対立遺伝子）全ての生じ得るＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子（
1997の文献, Nomenclature for factors of the HLA system, 1996, Tissue Ant
igens, 49, 3-II, March 1997に上げられた１８４）を増幅できることが有利で
あろう。
できる：ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、及びＨＬＡ
−ＤＲＢ５。遺伝的な様式で移行するこのセットの機能的遺伝子の配置は、患者
によって変化し、かくして患者は各種の保存的なハプロタイプを示す。もしＨＬ
Ａ−ＤＲＢ１遺伝子の存在が常に観察されるのであれば、一つ以上の他の遺伝子
（ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５）の存在は任意であ
り、同じ染色体によって運ばれるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子に依存する。さら
に、二つのハプロタイプ（一方は母親から由来し、他方は父親から遺伝する）の
存在のため、分析されるＨＬＡ−ＤＲＢ配列の混合物の複雑性は、非常に可変的
である。それ故、ＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子と関連する主な情報の分析は、例
えばＨＬＡ−ＤＲＢ３のような他のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子が存在するか否かに従
って、説明が困難である。それ故、存在する可能性のあるＨＬＡ−ＤＲＢ３対立
遺伝子を増幅することなく（1997の文献に挙げられた１１の対立遺伝子の間で１
または２の生じ得る対立遺伝子）全ての生じ得るＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子（
1997の文献, Nomenclature for factors of the HLA system, 1996, Tissue Ant
igens, 49, 3-II, March 1997に上げられた１８４）を増幅できることが有利で
あろう。
【００５８】 ＤＲＢ３遺伝子の増幅の特異的な阻害を説明するために、二つの実施例が以下
に記載され、第一は、アミン含有アーム（オリゴヌクレオチド５８５８、配列番
号３）を取り込むことによって修飾された３’末端を含むオリゴヌクレオチドを
使用し、第二は、−Ｈを含む修飾３’末端及びアクリジンを含む修飾５’末端を
含むオリゴヌクレオチドを使用する（オリゴヌクレオチド５９６７、配列番号４
）。
に記載され、第一は、アミン含有アーム（オリゴヌクレオチド５８５８、配列番
号３）を取り込むことによって修飾された３’末端を含むオリゴヌクレオチドを
使用し、第二は、−Ｈを含む修飾３’末端及びアクリジンを含む修飾５’末端を
含むオリゴヌクレオチドを使用する（オリゴヌクレオチド５９６７、配列番号４
）。
【００５９】 ＤＮＡを細胞溶解及びプロテイナーゼＫ切断の従来法に従って抽出し、次いで
フェノール抽出の後エタノール沈降によって精製した。ＤＮＡ溶液（Ｈ2Ｏ中に
１００ｎｇ／μｌに調節した濃度）を２−８℃で保存する。
フェノール抽出の後エタノール沈降によって精製した。ＤＮＡ溶液（Ｈ2Ｏ中に
１００ｎｇ／μｌに調節した濃度）を２−８℃で保存する。
【００６０】 増幅のために使用される一般的条件は、以下の通りである： − １０×バッファー ： １０μｌ − 非保護５’プライマー（５８６７、配列番号１） （１０μＭ）（最終０．１μＭ） ： １μｌ − ブロッキング５’プライマー （１０μＭ）（最終０から１．２μＭ） ：０から１２μｌ − 非保護３’プライマー（Ｐ２、配列番号２） （１０μＭ）（最終０．１μＭ） ： １μｌ − ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）（最終０．２ｍＭ） ： １μｌ − Ｔａｑポリメラーゼ（５ＩＵ／μｌ）（１．５Ｕ）： ０．３μｌ − ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）（１００ｎｇ） ： １μｌ − Ｈ2Ｏ（ＱＳ） ： １００μｌ
【００６１】 Perkin Elmer GeneAmp 9600機で使用される増幅プログラムの特徴は、以下の
ものであった： ９５℃で２分（１サイクル） ９５℃で３０秒＋５５℃で３０秒＋７２℃で３０秒（３２サイクル） ７２℃で７分（１サイクル） 得られた増幅生産物を、アガロースゲル電気泳動によって等量の部分（５μｌ
）を分析して回収し、次いでエチジウムブロマイドで染色した。このコントロー
ルの後、調製された増幅物を、bioMerieuxオリゴ検出ＨＬＡ−ＤＲタイピングキ
ット(Ref. 74 500)で分析した。この試験により、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−
ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４及びＨＬＡ−ＤＲＢ５対立遺伝子を検出し分析する
ことによって、ミクロタイタープレート中の可逆的ハイブリダイゼーション技術
を使用してＨＬＡ−ＤＲタイピングを決定することが可能である。
ものであった： ９５℃で２分（１サイクル） ９５℃で３０秒＋５５℃で３０秒＋７２℃で３０秒（３２サイクル） ７２℃で７分（１サイクル） 得られた増幅生産物を、アガロースゲル電気泳動によって等量の部分（５μｌ
）を分析して回収し、次いでエチジウムブロマイドで染色した。このコントロー
ルの後、調製された増幅物を、bioMerieuxオリゴ検出ＨＬＡ−ＤＲタイピングキ
ット(Ref. 74 500)で分析した。この試験により、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−
ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４及びＨＬＡ−ＤＲＢ５対立遺伝子を検出し分析する
ことによって、ミクロタイタープレート中の可逆的ハイブリダイゼーション技術
を使用してＨＬＡ−ＤＲタイピングを決定することが可能である。
【００６２】 ５’−リン酸／３’−Ｃ6−ＮＨ2オリゴでのＤＲＢ３ブロッキング： ＤＮＡ：ＯＭＷ系(ECCAC 9058)、ＤＲＢ１★１３０１、ＤＲＢ３★０１ ５’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチド５８６７、配列番号
１）：最終０．１μＭ ３’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチドＰ２、配列番号２）
：最終０．１μＭ ５’ブロッキングＨＬＡ−ＤＲＢ３プライマー（オリゴヌクレオチド５８５８、
配列番号３）：最終０，０．３，０．６，０．９，１．２μＭ
１）：最終０．１μＭ ３’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチドＰ２、配列番号２）
：最終０．１μＭ ５’ブロッキングＨＬＡ−ＤＲＢ３プライマー（オリゴヌクレオチド５８５８、
配列番号３）：最終０，０．３，０．６，０．９，１．２μＭ
【００６３】 ミクロプレートハイブリダイゼーション： 特異的プローブのそれぞれについて観察されるハイブリダイゼーションシグナ
ル（４９２ｎｍ×１０００で読み取られた光学密度）の値が、以下の表２に示さ
れている：
ル（４９２ｎｍ×１０００で読み取られた光学密度）の値が、以下の表２に示さ
れている：
【００６４】 表２：濃度の関数としての各種の標的配列に対するブロッキングプライマー５８
５８のハイブリダイゼーションに対するシグナル
５８のハイブリダイゼーションに対するシグナル
【表２】
【００６５】 ブロッキングなしで読み取られた値に対する、０．６μＭについて読み取られ
た値の比の計算により、ＤＲＢ３遺伝子の増幅の阻害を評価することが可能であ
る。
た値の比の計算により、ＤＲＢ３遺伝子の増幅の阻害を評価することが可能であ
る。
【００６６】 プローブ１３及び３＋６は、ＤＲＢ１遺伝子について特異的であり、プローブ
５２ａは、ＤＲＢ３遺伝子について特異的である。増幅の間のオリゴヌクレオチ
ド５８５８の添加は、ＤＲＢ１遺伝子の増幅に影響することなくＤＲＢ３遺伝子
の増幅を阻害する。この阻害は量依存的であり、全体の阻害は、０．６μＭ以上
のブロッキングＤＲＢ３オリゴヌクレオチド濃度について観察される。
５２ａは、ＤＲＢ３遺伝子について特異的である。増幅の間のオリゴヌクレオチ
ド５８５８の添加は、ＤＲＢ１遺伝子の増幅に影響することなくＤＲＢ３遺伝子
の増幅を阻害する。この阻害は量依存的であり、全体の阻害は、０．６μＭ以上
のブロッキングＤＲＢ３オリゴヌクレオチド濃度について観察される。
【００６７】 配列決定： ＤＲＢ３遺伝子のブロッキングの存在下または不存在下で得られた増幅生産物
を、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(P
erkin-Elmer Ref. 4303152)を使用して配列決定した。可逆的反応の電気泳動に
より、ブロッキングなしのアッセイについて、及びオリゴヌクレオチド５８５８
の０．９μＭを使用するブロッキング有りのアッセイについて以下のものが得ら
れる。
を、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(P
erkin-Elmer Ref. 4303152)を使用して配列決定した。可逆的反応の電気泳動に
より、ブロッキングなしのアッセイについて、及びオリゴヌクレオチド５８５８
の０．９μＭを使用するブロッキング有りのアッセイについて以下のものが得ら
れる。
【００６８】 ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式
文献）に関する電気泳動のモンタージュにより、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の増幅
の阻害が説明される（図９及び１０）。
文献）に関する電気泳動のモンタージュにより、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の増幅
の阻害が説明される（図９及び１０）。
【００６９】 予測配列 ５’＞３’ 56 60 65 DRB1★1301 CCT GAT GCC GAG TAC TGG AAC AGC CAG AAG GAC DRB3★01 CCT GTC GCC GAG TCC TGG AAC AGC CAG AAG GAC DRB1★1301+DRB3★01（正方向） CCT GWY GCC GAG TMC TGG AAG AGC CAG AAG GA
C DRB1★1301+DRB3★01（逆方向） GGA CWR CGG CTC AKG ACC TTG TCG GTC TTC CT
G 読み取り配列フ゛ロッキンク゛ なしのアッセイ GGA CWR CGG CTC AKG ACC TTG TCG GTC TTC CTGフ゛ロッキンク゛ 有りのアッセイ(0.9μM) GGA CTA CGG CTC ATG ACC TTG TCG GTC TTC CTG
C DRB1★1301+DRB3★01（逆方向） GGA CWR CGG CTC AKG ACC TTG TCG GTC TTC CT
G 読み取り配列フ゛ロッキンク゛ なしのアッセイ GGA CWR CGG CTC AKG ACC TTG TCG GTC TTC CTGフ゛ロッキンク゛ 有りのアッセイ(0.9μM) GGA CTA CGG CTC ATG ACC TTG TCG GTC TTC CTG
【００７０】 かくして、ＤＲＢ３特異的ブロッキングプライマー（オリゴヌクレオチド５８
５８、３’−Ｃ6−ＮＨ2）の添加は、５７位及び６０位での関連塩基の消失によ
って示されるように、ＤＲＢ３遺伝子の増幅を阻害し、ＤＲＢ３★０１対立遺伝
子に対応する配列の不存在を示す。
５８、３’−Ｃ6−ＮＨ2）の添加は、５７位及び６０位での関連塩基の消失によ
って示されるように、ＤＲＢ３遺伝子の増幅を阻害し、ＤＲＢ３★０１対立遺伝
子に対応する配列の不存在を示す。
【００７１】 ５’−アクリジン／３’−ＨオリゴヌクレオチドでのＤＲＢ３ブロッキング ＤＮＡ：ＯＭＷ系(ECCAC 9058)、ＤＲＢ１★１３０１、ＤＲＢ３★０１ ５’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチド５８６７、配列番号
１）：最終０．１μＭ ３’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチドＰ２、配列番号２）
：最終０．１μＭ ５’ブロッキングＨＬＡ−ＤＲＢ３プライマー（オリゴヌクレオチド５９６７、
配列番号４）：最終０，０．３，０．６，０．９，１．２μＭ
１）：最終０．１μＭ ３’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチドＰ２、配列番号２）
：最終０．１μＭ ５’ブロッキングＨＬＡ−ＤＲＢ３プライマー（オリゴヌクレオチド５９６７、
配列番号４）：最終０，０．３，０．６，０．９，１．２μＭ
【００７２】 ミクロプレートハイブリダイゼーション： 特異的プローブのそれぞれについて観察されるハイブリダイゼーションシグナ
ル（４９２ｎｍ×１０００で読み取られた光学密度）の値が、以下の表３に示さ
れている：
ル（４９２ｎｍ×１０００で読み取られた光学密度）の値が、以下の表３に示さ
れている：
【００７３】 表３：濃度の関数としての各種の標的配列に対するブロッキングプライマー５９
６７のハイブリダイゼーションに対するシグナル
６７のハイブリダイゼーションに対するシグナル
【表３】
【００７４】 「０．６μＭについての読み取り値／ブロッキングなしでの読み取り値」の比
の計算により、ＤＲＢ３遺伝子の増幅の阻害を評価可能である。
の計算により、ＤＲＢ３遺伝子の増幅の阻害を評価可能である。
【００７５】 ここで再言するが、増幅の間のオリゴヌクレオチド５９６７の添加は、ＤＲＢ
１遺伝子の増幅に影響することなくＤＲＢ３遺伝子の増幅を阻害する。この阻害
は量依存的であり、全体の阻害は、０．３μＭ以上のブロッキングＤＲＢ３オリ
ゴヌクレオチド濃度について観察される。
１遺伝子の増幅に影響することなくＤＲＢ３遺伝子の増幅を阻害する。この阻害
は量依存的であり、全体の阻害は、０．３μＭ以上のブロッキングＤＲＢ３オリ
ゴヌクレオチド濃度について観察される。
【００７６】 実施例２：ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子の増幅の特異的ブロッキング 実施例１に記載されたものと状況は匹敵する。ＨＬＡ−ＤＲＢ１タイピングの
相互作用を単純化するために、ＤＲＢ４遺伝子を共増幅することなく、ＤＲＢ１
遺伝子対してゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマーでＨＬＡ−ＤＲＢ増幅を制限する
ことが有利であろう。本発明は、ＤＲＢ４特異的ブロッキングプライマーの使用
を記載する。
相互作用を単純化するために、ＤＲＢ４遺伝子を共増幅することなく、ＤＲＢ１
遺伝子対してゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマーでＨＬＡ−ＤＲＢ増幅を制限する
ことが有利であろう。本発明は、ＤＲＢ４特異的ブロッキングプライマーの使用
を記載する。
【００７７】 実験プロトコールは、実施例１に記載されたものと同様である： ＤＮＡ：Ｔ７５３６系(ECCAC 9076)、ＤＲＢ１★−０９０１、ＤＲＢ４★０１ ５’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチド５８６７、配列番号
１）：最終０．１μＭ ３’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチドＰ２、配列番号２）
：最終０．１μＭ ５’ブロッキングＨＬＡ−ＤＲＢ４プライマー（オリゴヌクレオチド５９６５、
配列番号５）：最終０，０．３，０．６，０．９，１．２μＭ
１）：最終０．１μＭ ３’ゲノムＨＬＡ−ＤＲＢプライマー（オリゴヌクレオチドＰ２、配列番号２）
：最終０．１μＭ ５’ブロッキングＨＬＡ−ＤＲＢ４プライマー（オリゴヌクレオチド５９６５、
配列番号５）：最終０，０．３，０．６，０．９，１．２μＭ
【００７８】 ミクロプレートハイブリダイゼーション： 特異的プローブのそれぞれについて観察されるハイブリダイゼーションシグナ
ル（４９２ｎｍ×１０００で読み取られた光学密度）の値が、以下の表４に示さ
れている：
ル（４９２ｎｍ×１０００で読み取られた光学密度）の値が、以下の表４に示さ
れている：
【００７９】 表４：濃度の関数としての各種の標的配列に対するブロッキングプライマー５９
６５のハイブリダイゼーションに対するシグナル
６５のハイブリダイゼーションに対するシグナル
【表４】
【００８０】 「０．６μＭについての読み取り値／ブロッキングなしでの読み取り値」の比
の計算により、ＤＲＢ４遺伝子の増幅の阻害を評価可能である。
の計算により、ＤＲＢ４遺伝子の増幅の阻害を評価可能である。
【００８１】 プローブｇはＤＲＢ１遺伝子について特異的であり、プローブ５３はＤＲＢ４
遺伝子について特異的である。増幅の間のオリゴヌクレオチド５９６５の添加は
、ＤＲＢ１遺伝子の増幅に影響することなく、ＤＲＢ４遺伝子の増幅を阻害する
。この阻害は量依存的であり、全体の阻害は、０．６μＭ以上のブロッキングＤ
ＲＢ４オリゴヌクレオチド濃度で観察される。
遺伝子について特異的である。増幅の間のオリゴヌクレオチド５９６５の添加は
、ＤＲＢ１遺伝子の増幅に影響することなく、ＤＲＢ４遺伝子の増幅を阻害する
。この阻害は量依存的であり、全体の阻害は、０．６μＭ以上のブロッキングＤ
ＲＢ４オリゴヌクレオチド濃度で観察される。
【００８２】 配列決定： ＤＲＢ４遺伝子のブロッキングの存在下または不存在下で得られた増幅生産物
を、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(P
erkin-Elmer Ref. 4303152)を使用して配列決定した。可逆的反応の電気泳動に
より、ブロッキングなしのアッセイについて、及びオリゴヌクレオチド５９６５
の０．９μＭを使用するブロッキング有りのアッセイについて以下のものが得ら
れる。
を、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(P
erkin-Elmer Ref. 4303152)を使用して配列決定した。可逆的反応の電気泳動に
より、ブロッキングなしのアッセイについて、及びオリゴヌクレオチド５９６５
の０．９μＭを使用するブロッキング有りのアッセイについて以下のものが得ら
れる。
【００８３】 ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式
文献）に関する電気泳動のモンタージュにより、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子の増幅
の阻害が説明される（図１１及び１２）。
文献）に関する電気泳動のモンタージュにより、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子の増幅
の阻害が説明される（図１１及び１２）。
【００８４】 予測配列 ５’＞３’ 30 35 DRB1★0901 AGA GGC ATC TAT AAC CAA GAG GAG AAC GTG CGC
TTC GAC AGC GAC GTG GGG GAG TAC DRB4★01 AGA TAC ATC TAT AAC CAA GAG GAG TAC GCG CGC
TAC AAC AGT GAC CTG GGG GAG TAC DRB1★0901+DRB4★01（正方向） AGA KRC ATC TAT AAC CAA GAG GAG WAC GYG CG
C TWC RAC AGY GAC STG GGG GAG TAC DRB1★0901+DRB4★01（逆方向） TCT MYG TAG ATA TTG GTT CTC CTC MTG CRC GC
G AWG YTG TCR CTG SAC CCC CTC ATG 読み取り配列フ゛ロッキンク゛ なしのアッセイ TCT MYG TAG ATA TTG GTT CTC CTC WTG CRC GCG AWG TTG TCR CTG SAC CCC CTC ATGフ゛ロッキンク゛ 有りのアッセイ(0.9μM) TCT CCG TAG ATA TTG GTT CTC CTC TTG CAC GCG AAG CTC TCC CTG CAC CCC CTC ATG
TTC GAC AGC GAC GTG GGG GAG TAC DRB4★01 AGA TAC ATC TAT AAC CAA GAG GAG TAC GCG CGC
TAC AAC AGT GAC CTG GGG GAG TAC DRB1★0901+DRB4★01（正方向） AGA KRC ATC TAT AAC CAA GAG GAG WAC GYG CG
C TWC RAC AGY GAC STG GGG GAG TAC DRB1★0901+DRB4★01（逆方向） TCT MYG TAG ATA TTG GTT CTC CTC MTG CRC GC
G AWG YTG TCR CTG SAC CCC CTC ATG 読み取り配列フ゛ロッキンク゛ なしのアッセイ TCT MYG TAG ATA TTG GTT CTC CTC WTG CRC GCG AWG TTG TCR CTG SAC CCC CTC ATGフ゛ロッキンク゛ 有りのアッセイ(0.9μM) TCT CCG TAG ATA TTG GTT CTC CTC TTG CAC GCG AAG CTC TCC CTG CAC CCC CTC ATG
【００８５】 かくして、ＤＲＢ４特異的ブロッキングプライマー（オリゴヌクレオチド５８
６５、３’−Ｃ6−ＮＨ2）の添加は、３０位、３７位、３８位、４０位、４１位
、４２位及び４４位での関連塩基の消失によって示されるように、ＤＲＢ４遺伝
子の増幅を阻害し、ＤＲＢ４★０１対立遺伝子に対応する配列の不存在を示す。
６５、３’−Ｃ6−ＮＨ2）の添加は、３０位、３７位、３８位、４０位、４１位
、４２位及び４４位での関連塩基の消失によって示されるように、ＤＲＢ４遺伝
子の増幅を阻害し、ＤＲＢ４★０１対立遺伝子に対応する配列の不存在を示す。
【００８６】 本発明は、一つ（同種サンプルの場合）または二つ（異種サンプルの場合）の
ヌクレオチド配列の混合物に対する分析を減少するブロッキングプライマーを使
用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４及び−ＤＲＢ５遺伝子の、並びにＨＬＡ
−ＤＲＢ２、−ＤＲＢ６、−ＤＲＢ７、−ＤＲＢ８及び−ＤＲＢ９シュードジー
ンの特異的な増幅の特異的ブロッキングを含む、高解像ＨＬＡ−ＤＲＢ１タイピ
ングのために使用され得る。上記ストラテジーは、上述のようにその３’及び５
’末端で修飾された、ＨＬＡ−ＤＲＢ３特異的ブロッキングプライマー（例えば
オリゴヌクレオチド５８１６（配列番号６）、５８６８（配列番号７）及び５８
８５（配列番号８））、ＨＬＡ−ＤＲＢ４プライマー（例えばオリゴヌクレオチ
ド５８８３（配列番号９）、５９１６（配列番号１０）及び５９１７（配列番号
１１））並びにＨＬＡ−ＤＲＢ５特異的プライマー（例えばオリゴヌクレオチド
５０２１（配列番号１２）、５８７０（配列番号１３）、５８７１（配列番号１
４）、５８８１（配列番号１５）、５９０２（配列番号１６）、５９０３（配列
番号１７）、５９１３（配列番号１８）及び５９１４（配列番号１９））を使用
する。
ヌクレオチド配列の混合物に対する分析を減少するブロッキングプライマーを使
用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４及び−ＤＲＢ５遺伝子の、並びにＨＬＡ
−ＤＲＢ２、−ＤＲＢ６、−ＤＲＢ７、−ＤＲＢ８及び−ＤＲＢ９シュードジー
ンの特異的な増幅の特異的ブロッキングを含む、高解像ＨＬＡ−ＤＲＢ１タイピ
ングのために使用され得る。上記ストラテジーは、上述のようにその３’及び５
’末端で修飾された、ＨＬＡ−ＤＲＢ３特異的ブロッキングプライマー（例えば
オリゴヌクレオチド５８１６（配列番号６）、５８６８（配列番号７）及び５８
８５（配列番号８））、ＨＬＡ−ＤＲＢ４プライマー（例えばオリゴヌクレオチ
ド５８８３（配列番号９）、５９１６（配列番号１０）及び５９１７（配列番号
１１））並びにＨＬＡ−ＤＲＢ５特異的プライマー（例えばオリゴヌクレオチド
５０２１（配列番号１２）、５８７０（配列番号１３）、５８７１（配列番号１
４）、５８８１（配列番号１５）、５９０２（配列番号１６）、５９０３（配列
番号１７）、５９１３（配列番号１８）及び５９１４（配列番号１９））を使用
する。
【００８７】 ＨＬＡ−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４及び−ＤＲＢ５遺伝子の完全なブロッキングは
、ブロッキングプライマーの混合物を使用して実施できる。
、ブロッキングプライマーの混合物を使用して実施できる。
【００８８】 以下の表５において、ｉはイノシンを表す：
【００８９】 表５：増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオ
チド配列
チド配列
【表５】
【００９０】 天然の塩基ではないイノシンは、核酸／ブロッキングプライマーハイブリッド
を弱めるために使用される。特にイノシンは、二つの水素結合を経て相補的なヌ
クレオチドに結合し、それ故ピリミジンに置換された場合、二つの鎖の間の結合
はその領域でより弱くなる。遺伝子は単一の塩基によって他の関連遺伝子とは異
なり得るため、該遺伝子に相補的なブロッキングプライマーの側で、イノシンで
この必須位置の周りの塩基を置換することは有利である。かくして核酸／ブロッ
キングプライマー二本鎖の結合が弱くなり、ハイブリダイゼーションはプライマ
ーが標的遺伝子配列に完全に相補的な場合にのみ生じ得る。ブロッキングプライ
マーの特異性は、かくして強化される。
を弱めるために使用される。特にイノシンは、二つの水素結合を経て相補的なヌ
クレオチドに結合し、それ故ピリミジンに置換された場合、二つの鎖の間の結合
はその領域でより弱くなる。遺伝子は単一の塩基によって他の関連遺伝子とは異
なり得るため、該遺伝子に相補的なブロッキングプライマーの側で、イノシンで
この必須位置の周りの塩基を置換することは有利である。かくして核酸／ブロッ
キングプライマー二本鎖の結合が弱くなり、ハイブリダイゼーションはプライマ
ーが標的遺伝子配列に完全に相補的な場合にのみ生じ得る。ブロッキングプライ
マーの特異性は、かくして強化される。
【００９１】 それ故本発明は、酵素的な標的遺伝子の増幅のための工程の間その伸長を可能
にしない、修飾３’末端を含むオリゴヌクレオチドに対応するブロッキングオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用する、関連遺伝子の混合物中に存在する遺伝子
を選択的に増幅するための方法に関する。
にしない、修飾３’末端を含むオリゴヌクレオチドに対応するブロッキングオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用する、関連遺伝子の混合物中に存在する遺伝子
を選択的に増幅するための方法に関する。
【００９２】 本発明はまた、標的遺伝子のさらに５’末端に向かって位置する領域に対して
特異的なプライマーを使用する、標的遺伝子の酵素的な増幅のための工程におい
て、移転または分解をしないようにする修飾５’末端を含む、請求項１に記載さ
れた文脈においてブロックするプライマーの使用に関する。
特異的なプライマーを使用する、標的遺伝子の酵素的な増幅のための工程におい
て、移転または分解をしないようにする修飾５’末端を含む、請求項１に記載さ
れた文脈においてブロックするプライマーの使用に関する。
【００９３】 上述の文脈においてブロックするプライマーの使用の場合、５’末端での修飾
は容易である。かくして二つの異なる可能性が存在する。
は容易である。かくして二つの異なる可能性が存在する。
【００９４】 第一の実施態様に従って、３’−ＯＨ基は、例えば−Ｈ、−リン酸若しくは−
ダブシル基、または−ＮＨ２基で終結する炭素ベースの鎖のような、天然で見出
されない基で置換される。
ダブシル基、または−ＮＨ２基で終結する炭素ベースの鎖のような、天然で見出
されない基で置換される。
【００９５】 第二の実施態様に従って、５’例えば−リン酸基は、−ＤＭＴ、アクリジン若
しくは−チオリン酸基、または「ステム−ループ」構造のような、天然で見出さ
れない基で置換される。
しくは−チオリン酸基、または「ステム−ループ」構造のような、天然で見出さ
れない基で置換される。
【００９６】 上述のようなブロッキングプライマーはまた、非末端位でオリゴヌクレオチド
の修飾を含み得、その標的配列に対するハイブリダイゼーションを促進するため
に使用される。
の修飾を含み得、その標的配列に対するハイブリダイゼーションを促進するため
に使用される。
【００９７】 上述のようなブロッキングプライマーは、コード鎖または相補的鎖にハイブリ
ダイズ可能である（５’ブロッキングプライマーまたは３’ブロッキングプライ
マーの使用）。
ダイズ可能である（５’ブロッキングプライマーまたは３’ブロッキングプライ
マーの使用）。
【００９８】 一つのブロッキングプライマー、またはブロッキングプライマーの混合物を使
用することも可能である。
用することも可能である。
【００９９】 ブロッキングプライマーの使用は、例えばＰＣＲ、ＴＭＡ、またはいずれかの
他の技術のような、標的配列を増幅するための方法に対して特に有利である。
他の技術のような、標的配列を増幅するための方法に対して特に有利である。
【０１００】 最後に本発明は、配列番号３から１９，及びその相補的な配列によって定義さ
れるものから選択される一つ以上のブロッキングプライマーの、ＨＬＡ−ＤＲＢ
３、−ＤＲＢ４及び−ＤＲＢ５遺伝子の増幅を阻害するための使用に関する。
れるものから選択される一つ以上のブロッキングプライマーの、ＨＬＡ−ＤＲＢ
３、−ＤＲＢ４及び−ＤＲＢ５遺伝子の増幅を阻害するための使用に関する。
【配列表】
【図１】 図１は、二つのプライマーを使用する、核酸の鎖とその相補的
な鎖の増幅の原理の模式図である；この場合、単純化するために鎖当たり一つの
プライマーが存在する。
な鎖の増幅の原理の模式図である；この場合、単純化するために鎖当たり一つの
プライマーが存在する。
【図２】 図２は、本発明に示された技術を使用した、図１に従った増幅
の原理の模式図である。
の原理の模式図である。
【図３】 図３は、ブロッキングプライマーのヌクレオチドで実施可能な
各種の置換基を表し、式中： − Ｒ１は、ブロッキングプライマーの３’末端に存在し、増幅の間の何れの延
長をも妨げるエレメントであり； − Ｒ２は、ブロッキングプライマーのヌクレオチドのリボースの２’位の少な
くとも一つに存在し得、ブロッキングプライマー／核酸二本鎖の安定性を補強す
るエレメントであり、並びに； − Ｒ３は、ブロッキングプライマーの５’末端に存在し、保護エレメントとし
て機能するエレメントである。
各種の置換基を表し、式中： − Ｒ１は、ブロッキングプライマーの３’末端に存在し、増幅の間の何れの延
長をも妨げるエレメントであり； − Ｒ２は、ブロッキングプライマーのヌクレオチドのリボースの２’位の少な
くとも一つに存在し得、ブロッキングプライマー／核酸二本鎖の安定性を補強す
るエレメントであり、並びに； − Ｒ３は、ブロッキングプライマーの５’末端に存在し、保護エレメントとし
て機能するエレメントである。
【図４】 図４は、ブロッキングプライマーが核酸にハイブリダイズする
場合の、該ブロッキングプライマーの３’末端でのＲ１エレメントの位置を表す
。
場合の、該ブロッキングプライマーの３’末端でのＲ１エレメントの位置を表す
。
【図５】 図５は、ブロッキングプライマーが核酸にハイブリダイズする
場合の、該ブロッキングプライマーの５’末端でのＲ３エレメントの位置を表す
。
場合の、該ブロッキングプライマーの５’末端でのＲ３エレメントの位置を表す
。
【図６】 図６は、ブロッキングプライマー／核酸二本鎖を表し、Ｘは、
このヌクレオチドのリボース上の位置で、二本鎖の安定性を増強するＲ２エレメ
ントを含む、ブロッキングプライマーのヌクレオチドを表す。
このヌクレオチドのリボース上の位置で、二本鎖の安定性を増強するＲ２エレメ
ントを含む、ブロッキングプライマーのヌクレオチドを表す。
【図７】 図７は、ブロッキングプライマーの３’位で加えることによっ
て、増幅の間の何れの伸長をも妨げる、各種の構造体を表す。
て、増幅の間の何れの伸長をも妨げる、各種の構造体を表す。
【図８】 図８は、図３に表されたように、３’位での修飾に加えて、ブ
ロッキング位置の５’位で加えられることによって、増幅の間のブロッキングプ
ライマーの分解または排出を妨げることで保護エレメントとして機能する、各種
の構造体を表す。
ロッキング位置の５’位で加えられることによって、増幅の間のブロッキングプ
ライマーの分解または排出を妨げることで保護エレメントとして機能する、各種
の構造体を表す。
【図９】 図９は、ブロッキングプライマーを使用することなく、ＨＬＡ
−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従
って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３
★０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対
応する電気泳動図を表す。
−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従
って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３
★０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対
応する電気泳動図を表す。
【図１０】 図１０は、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の増幅を阻害する５’−
リン酸／３’−Ｃ6−ＮＨ2オリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝
子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）につい
て観察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３★０１リンパ
芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳
動図を表す。
リン酸／３’−Ｃ6−ＮＨ2オリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝
子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）につい
て観察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３★０１リンパ
芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳
動図を表す。
【図１１】 図１１は、ブロッキングプライマーを使用することなく、Ｈ
ＬＡ−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称
に従って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲ
Ｂ４★０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果
に対応する電気泳動図を表す。
ＬＡ−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称
に従って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲ
Ｂ４★０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果
に対応する電気泳動図を表す。
【図１２】 図１２は、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子の増幅を阻害する５’−
アクリジン／３’−Ｈオリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の
アミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）について観
察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ４★０１リンパ芽球
系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳動図
を表す。
アクリジン／３’−Ｈオリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の
アミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）について観
察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ４★０１リンパ芽球
系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳動図
を表す。
【図１３】 図１３は、同じ染色体に位置する関連遺伝子のファミリー中
の遺伝子の選択的増幅の原理の模式図である。
の遺伝子の選択的増幅の原理の模式図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年５月２３日（２０００．５．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】 しかしながら、これらの技術は、増幅プライマーの厳格な選択を課す。特に、
興味ある配列に対して比較的非特異的なプライマーは、それらが結合する多くの
関連配列の増幅を可能にするであろう。それ故、興味ある配列に対応するアンプ
リコンは、アンプリコンの混合物中に希釈され、それはこの増幅生産物の使用を
困難にする。次いでこれらの条件の下では、非常に特異的な相補的プライマーの
生産を可能にする十分に特異的なヌクレオチド配列の領域を厳格に選択すること
が必須である。しかしながら、プライマーのハイブリダイゼーションのために使
用される配列を選択する場合に、他の問題が生じ得る。特に、真に特異的な領域
は場合により独特であり、興味ある配列の内部に位置する。上記領域に対してプ
ライマーをハイブリダイズさせるように選択することは、上記興味ある配列の可
変的な大きな分画のみの生産を含む。それ故、情報のロスが存在する。さらに、
興味あるヌクレオチド配列に特異的なプライマーの生産は、非常により困難で繁
雑な作業をもたらす。 文献GB-A-2 293 328は、増幅が可能なプライマーに組み合わせたブロッキング
配列を提案する。二つの区別されるシナリオが存在する。第一に、ブロッキング
配列は、増幅が企図されるプライマーとはわずかに異なる。それらが使用される
場合、貧弱なペアリングと非特異的な増幅を避けるために、これらの二つのタイ
プのプライマーの間で競合が存在するであろう。第二に、増幅のためのプライマ
ーは、増幅される標的配列の上流にある一方で、ブロッキング配列は異なり、上
記標的配列の下流に位置し、増幅生産物が周知の部位にものであるようにし、ブ
ロッキングプライマーは伸長の継続を妨げる。全ての場合において、ブロッキン
グは３’位のｄｄＮＴＰを介して生産される。 文献WO-A-96/40992は、必要な場合に機能的になるマスクされたプライマーを
使用する増幅法を記載する。上記プライマーは例えば、特にループの形態で、ヌ
クレオチドの助けの下でのブロッキングにより得られる。
興味ある配列に対して比較的非特異的なプライマーは、それらが結合する多くの
関連配列の増幅を可能にするであろう。それ故、興味ある配列に対応するアンプ
リコンは、アンプリコンの混合物中に希釈され、それはこの増幅生産物の使用を
困難にする。次いでこれらの条件の下では、非常に特異的な相補的プライマーの
生産を可能にする十分に特異的なヌクレオチド配列の領域を厳格に選択すること
が必須である。しかしながら、プライマーのハイブリダイゼーションのために使
用される配列を選択する場合に、他の問題が生じ得る。特に、真に特異的な領域
は場合により独特であり、興味ある配列の内部に位置する。上記領域に対してプ
ライマーをハイブリダイズさせるように選択することは、上記興味ある配列の可
変的な大きな分画のみの生産を含む。それ故、情報のロスが存在する。さらに、
興味あるヌクレオチド配列に特異的なプライマーの生産は、非常により困難で繁
雑な作業をもたらす。 文献GB-A-2 293 328は、増幅が可能なプライマーに組み合わせたブロッキング
配列を提案する。二つの区別されるシナリオが存在する。第一に、ブロッキング
配列は、増幅が企図されるプライマーとはわずかに異なる。それらが使用される
場合、貧弱なペアリングと非特異的な増幅を避けるために、これらの二つのタイ
プのプライマーの間で競合が存在するであろう。第二に、増幅のためのプライマ
ーは、増幅される標的配列の上流にある一方で、ブロッキング配列は異なり、上
記標的配列の下流に位置し、増幅生産物が周知の部位にものであるようにし、ブ
ロッキングプライマーは伸長の継続を妨げる。全ての場合において、ブロッキン
グは３’位のｄｄＮＴＰを介して生産される。 文献WO-A-96/40992は、必要な場合に機能的になるマスクされたプライマーを
使用する増幅法を記載する。上記プライマーは例えば、特にループの形態で、ヌ
クレオチドの助けの下でのブロッキングにより得られる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】 この目的のために、本発明は、反応混合物中に含まれる合成または天然核酸の
少なくとも一つの特異的なヌクレオチド配列の増幅方法に関し、該反応混合物は
、少なくとも二つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸、及び／
またはそれぞれ少なくとも一つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも二つの
核酸より成り、該方法は、関連ヌクレオチド配列の増幅を可能にするように該核
酸とハイブリダイズ可能な少なくとも一つのタイプの増幅プライマーを使用する
ものであって、 − 増幅される特異的なヌクレオチド配列ではない少なくとも一つのヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズ可能であり、 − 増幅プライマーの伸長を、この配列の濃度で妨げることが可能な、 ブロッキングプライマーとして機能する少なくとも一つの配列を、該反応混合物
に加えることを含むことを特徴とする。
少なくとも一つの特異的なヌクレオチド配列の増幅方法に関し、該反応混合物は
、少なくとも二つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸、及び／
またはそれぞれ少なくとも一つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも二つの
核酸より成り、該方法は、関連ヌクレオチド配列の増幅を可能にするように該核
酸とハイブリダイズ可能な少なくとも一つのタイプの増幅プライマーを使用する
ものであって、 − 増幅される特異的なヌクレオチド配列ではない少なくとも一つのヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズ可能であり、 − 増幅プライマーの伸長を、この配列の濃度で妨げることが可能な、 ブロッキングプライマーとして機能する少なくとも一つの配列を、該反応混合物
に加えることを含むことを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】 第一に、上述の増幅法で使用されるブロッキング配列の場合、各ブロッキング
配列は、ＰＮＡまたはチオリン酸ヌクレオチドのような、修飾ヌクレオチド及び
／またはリボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチドに基づくオリ
ゴヌクレオチドである。
配列は、ＰＮＡまたはチオリン酸ヌクレオチドのような、修飾ヌクレオチド及び
／またはリボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチドに基づくオリ
ゴヌクレオチドである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】 第二に、上述の増幅法で使用されるブロッキング配列の場合、各ブロッキング
配列は、増幅を妨げる少なくとも一つのエレメントを含む。
配列は、増幅を妨げる少なくとも一つのエレメントを含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】 かくして、増幅を妨げるエレメントは、ブロッキング配列の３’末端に位置し
、その伸長をさせない。
、その伸長をさせない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】 さらに、増幅を妨げる別のエレメントは、ブロッキング配列の５’末端に位置
し、保護エレメントとして機能する。
し、保護エレメントとして機能する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】 増幅法で使用され、保護エレメントをも含むブロッキング配列の場合、該エレ
メントは： − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位で配置されたリン酸
基と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
基に接合される。
メントは： − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位で配置されたリン酸
基と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
基に接合される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】 増幅法で使用され、保護エレメントをも含むブロッキング配列の場合、該エレ
メントは： − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位で配置されたリン酸
基と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
基に接合される。
メントは： − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位で配置されたリン酸
基と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
基に接合される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、二つのプライマーを使用する、核酸の鎖とその相補的
な鎖の増幅の原理の模式図である；この場合、単純化するために鎖当たり一つの
プライマーが存在する。
な鎖の増幅の原理の模式図である；この場合、単純化するために鎖当たり一つの
プライマーが存在する。
【図２】 図２は、本発明に示された技術を使用した、図１に従った増幅
の原理の模式図である。
の原理の模式図である。
【図３】 図３は、ブロッキングプライマーのヌクレオチドで実施可能な
各種の置換基を表し、式中： − Ｒ１は、ブロッキングプライマーの３’末端に存在し、増幅の間の何れの延
長をも妨げるエレメントであり； − Ｒ２は、ブロッキングプライマーのヌクレオチドのリボースの２’位の少な
くとも一つに存在し得、ブロッキングプライマー／核酸二本鎖の安定性を補強す
るエレメントであり、並びに； − Ｒ３は、ブロッキングプライマーの５’末端に存在し、保護エレメントとし
て機能するエレメントである。
各種の置換基を表し、式中： − Ｒ１は、ブロッキングプライマーの３’末端に存在し、増幅の間の何れの延
長をも妨げるエレメントであり； − Ｒ２は、ブロッキングプライマーのヌクレオチドのリボースの２’位の少な
くとも一つに存在し得、ブロッキングプライマー／核酸二本鎖の安定性を補強す
るエレメントであり、並びに； − Ｒ３は、ブロッキングプライマーの５’末端に存在し、保護エレメントとし
て機能するエレメントである。
【図４】 図４は、ブロッキング配列が核酸にハイブリダイズする場合の
、該ブロッキングプライマーの３’末端でのＲ１エレメントの位置を表す。
、該ブロッキングプライマーの３’末端でのＲ１エレメントの位置を表す。
【図５】 図５は、ブロッキング配列が核酸にハイブリダイズする場合の
、該ブロッキングプライマーの５’末端でのＲ３エレメントの位置を表す。
、該ブロッキングプライマーの５’末端でのＲ３エレメントの位置を表す。
【図６】 図６は、ブロッキング配列／核酸二本鎖を表し、Ｘは、このヌ
クレオチドのリボース上の位置で、二本鎖の安定性を増強するＲ２エレメントを
含む、ブロッキング配列のヌクレオチドを表す。
クレオチドのリボース上の位置で、二本鎖の安定性を増強するＲ２エレメントを
含む、ブロッキング配列のヌクレオチドを表す。
【図７】 図７は、ブロッキングプライマーの３’位で加えることによっ
て、増幅の間の何れの伸長をも妨げる、各種の構造体を表す。
て、増幅の間の何れの伸長をも妨げる、各種の構造体を表す。
【図８】 図８は、図３に表されたように、３’位での修飾に加えて、ブ
ロッキング位置の５’位で加えられることによって、増幅の間のブロッキング配
列の分解または排出を妨げることで保護エレメントとして機能する、各種の構造
体を表す。
ロッキング位置の５’位で加えられることによって、増幅の間のブロッキング配
列の分解または排出を妨げることで保護エレメントとして機能する、各種の構造
体を表す。
【図９】 図９は、ブロッキングプライマーを使用することなく、ＨＬＡ
−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従
って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３ ★ ０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対
応する電気泳動図を表す。
−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従
って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３ ★ ０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対
応する電気泳動図を表す。
【図１０】 図１０は、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の増幅を阻害する５’−
リン酸／３’−Ｃ6−ＮＨ2オリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝
子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）につい
て観察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３★０１リンパ
芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳
動図を表す。
リン酸／３’−Ｃ6−ＮＨ2オリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝
子のアミノ酸５６から６５をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）につい
て観察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★１３０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ３★０１リンパ
芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳
動図を表す。
【図１１】 図１１は、ブロッキングプライマーを使用することなく、Ｈ
ＬＡ−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称
に従って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲ
Ｂ４★０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果
に対応する電気泳動図を表す。
ＬＡ−ＤＲＢ遺伝子のアミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称
に従って）について観察される、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲ
Ｂ４★０１リンパ芽球系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果
に対応する電気泳動図を表す。
【図１２】 図１２は、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子の増幅を阻害する５’−
アクリジン／３’−Ｈオリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の
アミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）について観
察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ４★０１リンパ芽球
系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳動図
を表す。
アクリジン／３’−Ｈオリゴヌクレオチドを使用する、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の
アミノ酸２９から４７をコードする領域（ＨＬＡ公式名称に従って）について観
察された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１★０９０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ４★０１リンパ芽球
系から得たＤＮＡのサンプルに対する配列決定反応の結果に対応する電気泳動図
を表す。
【図１３】 図１３は、同じ染色体に位置する関連遺伝子のファミリー中
の遺伝子の選択的増幅の原理の模式図である。
の遺伝子の選択的増幅の原理の模式図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１１月２８日（２０００．１１．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA09 CA20 HA08 HA11 HA14 HA19 4B063 QA13 QA19 QQ42 QR08 QR31 QR42 QR55 QR62 QS24 QS34
Claims (13)
- 【請求項１】 反応混合物中に含まれる合成または天然核酸の少なくとも一
つの特異的配列を増幅する方法であって、該反応混合物は、少なくとも二つの関
連ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの核酸、及び／またはそれぞれ少なく
とも一つの関連ヌクレオチド配列を含む少なくとも二つの核酸より成り、該方法
は、関連ヌクレオチド配列の増幅が可能なように核酸とハイブリダイズ可能な少
なくとも一つのタイプの増幅プライマーを使用するものであって、 − 増幅される特異的なヌクレオチド配列ではない少なくとも一つのヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズ可能で、且つ − 増幅プライマーの伸長を、このヌクレオチドの配列のレベルで妨げることが
可能な、 ブロッキングプライマーとして機能する、少なくとも一つの配列を該反応混合物
中に加えることを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 ブロッキングプライマーが、増幅される特異的ヌクレオチド
配列ではないヌクレオチド配列または該配列の全てにハイブリダイズ可能である
ことを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 各ブロッキングプライマーが、ＰＮＡまたはチオリン酸ヌク
レオチドのような、修飾ヌクレオチド及び／またはリボヌクレオチド及び／また
はデオキシリボヌクレオチドに基づくオリゴヌクレオチドであることを特徴とす
る、請求項１または２記載の増幅方法において使用されるブロッキングプライマ
ー。 - 【請求項４】 各ブロッキングプライマーが、増幅を妨げる少なくとも一つ
のエレメントを含むことを特徴とする、請求項３記載のプライマー。 - 【請求項５】 該増幅を妨げるエレメントが、ブロッキングプライマーの３
’末端に位置し、伸長させないことを特徴とする、請求項４記載のプライマー。 - 【請求項６】 該増幅を妨げるエレメントが、ブロッキングプライマーの５
’末端に位置し、保護エレメントとして機能することを特徴とする、請求項５記
載のプライマー。 - 【請求項７】 増幅を妨げる各エレメントが、ヌクレオチド若しくは修飾ヌ
クレオチド、または少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む若しくは含まない
オリゴヌクレオチドより成り、該ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくはオリ
ゴヌクレオチドが核酸にハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項４から
６のいずれか一項記載のプライマー。 - 【請求項８】 増幅を妨げる各エレメントが、ヌクレオチドまたは修飾ヌク
レオチド以外の分子より成ることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項
記載のプライマー。 - 【請求項９】 該エレメントが、少なくとも５個、特に少なくとも１０個、
好ましくは少なくとも１５個の、ヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド、また
はヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの混合物より成ることを特徴とする、請求
項４から７のいずれか一項記載のプライマー。 - 【請求項１０】 該エレメントが、ループの形成、並びにこのループを構成
するヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドの間のハイブリダイゼーション
の形成を可能にするのに十分な長さを有することを特徴とする、請求項４から７
または９のいずれか一項記載のプライマー。 - 【請求項１１】 該エレメントが、全て同じ塩基を含む、ポリヌクレオチド
及び／または修飾ポリヌクレオチドの「テール」より成ることを特徴とする、請
求項４から７または９のいずれか一項記載のプライマー。 - 【請求項１２】 該エレメントが、核酸の３’末端にそれ自体位置する、リ
ボースの３’位に配置された、ヒドロキシル基の水素原子、またはヒドロキシル
基と置換されていることを特徴とする、請求項４，５または７から１１のいずれ
か一項記載の、含まれたエレメントが伸長を可能にしないプライマー。 - 【請求項１３】 該エレメントが： − 核酸の５’末端にそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
と置換され、または − 核酸の５’末端でそれ自体位置する、リボースの５’位に配置されたリン酸
に接合される、 ことを特徴とする、請求項４及び６から１２のいずれか一項記載の、含まれたエ
レメントが保護的であるプライマー。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR98/06866 | 1998-05-27 | ||
| FR9806866A FR2779154B1 (fr) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre |
| PCT/FR1999/001247 WO1999061661A1 (fr) | 1998-05-27 | 1999-05-27 | Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002516666A true JP2002516666A (ja) | 2002-06-11 |
Family
ID=9526907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000551041A Withdrawn JP2002516666A (ja) | 1998-05-27 | 1999-05-27 | 少なくとも一つの特定のヌクレオチド配列の増幅方法及び使用されるプライマー |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1082461A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002516666A (ja) |
| AU (1) | AU3935599A (ja) |
| FR (1) | FR2779154B1 (ja) |
| WO (1) | WO1999061661A1 (ja) |
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