CN104603268A - 协同引物、探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了关于扩增和检测核酸的组合物和方法。

Description

协同引物、探针及其应用

相关申请案的交叉引用

本申请要求2012年7月17日提交的美国临时申请No.61/672,329和2012年12月3日提交的美国临时申请No.61/732,537的权益，这两件临时申请据此以引用的方式整体并入本文。

发明领域

所公开的发明通常整体上属于核酸扩增领域。

发明背景

核酸试验常常需要扩增核酸获得足够浓度和/或纯度，以进行后续实验。有时核酸扩增在非核酸，例如蛋白质的检测中用作替代法。大部分核酸扩增/延伸反应取决于3’末端，由允许在聚合酶的存在下延伸的经修饰或天然核酸构成的引物的存在。

这种扩增反应的普遍问题是引物-二聚体的存在。当引物延伸时，相互而非与靶核酸，形成引物-二聚体。引物-二聚体用尽引物，导致反应中存在杂质。更糟糕的是，有时引物-二聚体可用尽足够引物而产生假阴性。或者，如果与探针相互作用，引物-二聚体可产生假阳性。

已经开发了多种热起动以处理引物-二聚体的问题，包括使聚合酶悬浮于蜡材料中，用抗体抑制聚合酶，化学改性饰聚合酶，隔绝引物和多种其它方法。关于所有这些方法的问题是，它们只有在第一轮扩增/延伸之前有效。此后形成的任何引物-二聚体均以指数速率扩增。

处理引物-二聚体的其它方法包括例如巢式PCR的方法。然而，这需要两个单独的反应并且增加了污染的机会。

许多扩增/延伸反应也与检测探针相联系。原理往往围绕着标记线性探针例如Taqman或标记发夹型探针例如分子信标(MolecularBeacon)。一些方法通过使用协同连接两个探针，例如触须探针(Tentacle Probe)，实现了难以置信的特异性。然而，这些基于探针的方法的每一种均在野生型高本底下，在检测突变体上受限。虽然它们可实现单核苷酸多态性和其它突变的全部检测或不可实现检测，但是它们在10-20个野生型序列的本底下只可挑选出约1个突变体。这是因为引物扩增了野生型和突变体并且耗尽，不能够检测二者。如ARMS的方法可与探针检测技术结合以在一定程度上客服这个问题，但是当同一通用区域中出现一个以上突变时，不能有效多重于实时检测。

已经开发了包括检测机制的若干种引物，例如Amplifluor引物、Rapid Detex引物和Scorpion引物。前两种特别倾向于出于引物-二聚体问题的假阳性，因为它们无序列特异性。后者为自我探测引物，其中探针与引物延伸产物而非核酸模板结合。因为它具有序列特异性探针，所以不大可能导致假阳性，但是仍存在引物-二聚体相关问题。

发明概述

本文公开了一种协同核酸分子，其包含：a)第一核酸序列，其中所述第一核酸序列基本上与靶核酸的第一区域互补，并且其中所述第一核酸在3’末端可延伸；b)第二核酸序列，其中所述第二核酸序列基本上与所述靶核酸的第二区域互补；其中所述第一核酸序列和第二核酸序列相互连接；并且其中所述第二核酸序列与所述第一核酸序列3’末端下游的所述靶核酸序列杂交；

进一步公开了一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：a)提供如本文所公开的协同核酸分子；b)提供靶核酸；和c)在用于扩增的适当条件下扩增所述靶核酸；从而扩增所述靶核酸。

还公开了一种检测样品中的核酸的方法，所述方法包括：a)提供如本文所公开的协同核酸分子；其中所述协同核酸包含可检标记；b)提供靶核酸；和c)检测所述靶核酸；从而检测所述靶核酸。

附图简述

图1示出协同引物的一个实施方案，其具有在引物内部，连接到捕获序列5’末端的接头。捕获序列与靶核酸结合，并且杂交的捕获序列保持引物靠近靶标。然后引物延伸，裂解捕获序列。

图2示出协同引物的另一实施方案，其具有连接引物5’末端与捕获序列3’末端的接头。捕获序列与靶核酸结合。杂交的捕获序列保持引物靠近靶标。然后引物延伸，裂解捕获序列。

图3示出协同引物的一个优选实施方案，捕获序列5’末端与引物5’末端连接。捕获序列与靶核酸结合。杂交的捕获序列保持引物靠近靶标。然后引物延伸，裂解捕获序列。

图4示出可与引物连接的探针的实例，包括但不限于双标记探针、发夹型探针和单标记探针。

图5示出使用与双标记探针连接的协同引物，检测核酸延伸的一个优选实施方案。探针与靶核酸结合，并且杂交的探针保持引物靠近靶标。引物延伸，裂解探针，引起荧光增加。

图6示出协同引物和正常引物的凝胶。即使在没有掺入P-D时，正常引物也有一些引物-二聚体(P-D)形成，然而，仍具有起始60个拷贝的疟原虫DNA扩增。当掺入600个P-D时，超越疟原虫扩增产物并且仅扩增P-D。相比之下，即使掺入多达600,000个P-D时，协同引物也没有引物-二聚体扩增。P-D不干扰靶核酸的协同引物扩增。

图7示出具有可用于协同引物的内置检测机制的引物的一些实例。

图8示出具有整合探针的协同引物。标记协同引物或正常杂交探针用于5,000,000、50,000、500或0个拷贝恶性疟原虫(P.falciparum)模板的实时检测。即使捕获序列的Tm低于反应温度，但协同引物中标记的捕获序列具有比正常杂交探针高2.5x的荧光信号。

图9示出用协同引物的SNP区分。协同引物使用基于探针的区分，用捕获序列下的SNP(9A)和使用基于ARMS的方法，用引物3’末端下的SNP(9B)，将具有产生利福平抗性的rpoB D516V SNP和没有SNP的结核复合群区分开。

发明详述

所公开的方法利用允许扩增核酸序列和全基因组或其它高度复杂的核酸样品的某些材料和程序。下面详细地描述了这些材料和程序。

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。下列定义补充了本领域中的定义并且针对当前申请而不得转嫁于任何相关或不相关的情况，例如任何共有专利或申请。虽然与本文所述相似或等效的任何方法和材料在实践中可用于试验本发明，但是本文描述了优选材料和方法。相应地，本文使用的术语是仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在限制。

如本文所述，“核酸序列”指沿着核酸链，核苷酸的次序或顺序。一些情况下，这些核苷酸的次序可决定沿着相应多肽链，氨基酸的次序。因此核酸序列编码氨基酸序列。核酸序列可为单链或双链，按照说明，或含有双链和单链序列的一部分。核酸序列可由DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂种构成，其中所述序列包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合和碱基的任何组合，包括尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。其可能包括经修饰的碱基，包括锁核酸、肽核酸和本领域中技术人员已知的其他核酸。

“寡核苷酸”为包含两个或更多个核苷酸的聚合物。所述聚合物可另外包含非核苷酸元件，例如标记、淬灭剂、阻断基等。寡核苷酸的核苷酸可为天然或非天然的并且可未取代、未修饰、经取代或经修饰。核苷酸可通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、硼烷磷酸酯键等连接。

“肽核酸”(PNA)为包含两个或多个肽核酸单体的聚合物。所述聚合物可另外包含例如标记、淬灭剂、阻断基等元件。PNA的单体可未取代、未修饰、经取代或经修饰。

所谓“协同核酸”是指最低限度地并入第一核酸序列和第二核酸序列的核酸序列，其中所述第二核酸序列与所述第一核酸序列3’末端下游的靶核酸杂交。如本文其它地方所讨论那样，核酸的3’末端可延伸。在一个实例中，第一核酸为引物，而第二核酸为捕获序列。例如，第一核酸序列和第二核酸序列可由接头分隔开。

“引物”为含有与模板核酸链的一个区域互补的序列并且起动与模板(或其一部分)互补的链合成的核酸。引物通常但不一定是相对较短、化学合成的寡核苷酸(通常为脱氧核糖核苷酸)。在扩增，例如PCR扩增中，一对引物通常限定了扩增的核酸靶标两条互补链的5'末端。用“协同引物”或第一核酸序列意指经由接头与也称为捕获序列的第二核酸序列连接的引物。第二核酸序列或捕获序列可与引物或第一核酸序列3’末端下游的模板核酸杂交。用“正常引物”意指没有捕获序列或第二核酸序列经由接头与之连接的引物。

用“捕获序列”，本文也称为“第二核酸序列”，意指与靶核酸杂交并且使第一核酸序列或引物序列靠近靶核酸的靶区的序列。

“下游”是相对于核酸合成或延伸期间聚合酶的作用而言。例如，当Taq聚合酶延伸引物时，其向引物的3’末端添加碱基并将朝着“引物3’末端下游”的序列移动。

“靶区”是靶核酸的待扩增、待检测或待进行两者的区域。

指定条件下核酸双链体的“Tm”(解链温度)为一半核酸序列解离而一半缔合的温度。如本文所使用，“独立Tm”指协同核酸中第一或第二核酸序列在未呈协同配对时的单独解链温度。“有效Tm”指第一或第二核酸连接在一起时所得的解链温度。

术语“接头”意为将第一和第二核酸相互连接的组合物。接头包含至少一个不可延伸部分，但是也可能包含可延伸核酸，并且可为任何长度。接头可连接到3’末端、5’末端，或可连接来自第一核酸序列和第二核酸序列末端(“中间”)的一个或多个碱基。连接可为共价、氢键合、离子相互作用、疏水性相互作用等。术语“不可延伸”和天然Taq聚合酶不能识别某一部分，从而不能继续核酸合成有关。各种天然和经修饰的核酸碱基受聚合酶识别并且“可延伸”。其中，不可延伸部分的实例包括荧光团、淬灭剂、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯和本领域中技术人员已知的其它部分。一些情况下，即使具有反方向(例如5’ACGT 3’3’A 5’5’AAGT 3’)或其它致使Taq聚合酶不能通过其延伸的核酸碱基，也可视为“不可延伸”。如本文所使用的术语“非核酸接头”指能够将第一核酸共价连接到第二核酸，或更具体地，将引物共价连接到捕获序列的反应性化学基团。适合的柔性接头通常为链中至少一个或两个原子的线性分子，更通常为长度1-12个碳原子(和/或其它骨架原子)的有机聚合物链。示例性柔性接头包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯等。

如本文所使用，“互补”或“互补性”指多聚核苷酸分子中的核苷酸与第二多聚核苷酸分子中的核苷酸形成碱基对的能力。例如，序列5'-A-C-T-3'与序列3'-T-G-A-5'互补。互补性可能是局部的，其中仅一些核苷酸根据碱基配对匹配，或完全的，其中所有核苷酸根据碱基配对匹配。为了本发明的目的，“基本上互补”指在靶碱基对区域的长度上，90％或更高的同一性。互补性也可为50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％互补，或低于这些量或之间的任何量。

如本文所使用，“扩增”指产生靶DNA的一个或多个相同或互补拷贝。所述拷贝可为单链或双链。扩增可为多项工序的一部分，例如引物延伸、反转录、聚合酶链式反应、核酸测序、滚环扩增等。

如本文所使用，“经纯化”指已经将多聚核苷酸，例如靶核酸序列与细胞碎片，例如高分子量DNA、RNA和蛋白质分开。这将包括将与细胞碎片，包括DNA分开的分离RNA样品。其也可意指非天然或非自然存在的核酸。

如本文所使用，“蛋白质”、“肽”和“多肽”可交换用于指氨基酸聚合物或一组两个或多个相互作用或结合的氨基酸聚合物。

如本文所使用，“严格性”指多聚核苷酸之间发生杂交的条件，即温度、离子强度、溶剂等。杂交是扩增工艺的退火步骤期间，引物和模板之间发生的过程。

本文定义或表征了各种附加术语。

材料和方法

本发明涉及协同核酸，例如引物和探针。协同核酸包含与第二寡核苷酸连接的寡核苷酸引物，第二寡核苷酸与所述引物3’末端下游模板的一个区域互补(例如图1所见)。该第二寡核苷酸用作捕获序列。在一些实施方案中，这使得具有低解链温度(“Tm”)的引物有效地与靶标杂交。

捕获序列保持引物靠近模板，使得尽管Tm低，也发生延伸/扩增。然而，没有捕获序列的互补序列的非特异性序列，例如引物-二聚体，未有效延伸。因为捕获序列只有在引物3’末端下游杂交，所以每次循环都获得了扩增特异性。这与特异性在第一次循环后消失的传统热起动法相反。

这也与例如双特异性引物的概念相反(美国专利公布20120135473，为了其关于双特异性引物的教导，以引用的方式整体并入本文)。双特异性引物具有经由肌苷残基与短引物连接的捕获序列，其中捕获序列与引物5’侧上的靶标杂交。结果是，双特异性引物在第一轮扩增中具高度特异性。然而，如果双特异性引物相互扩增，聚合酶一直延伸到5’末端，产生将在此后每一轮中增殖的高Tm引物-二聚体。这与协同核酸相反，其中捕获序列与引物3’侧上的靶标杂交，防止其按允许引物-二聚体增殖所必需的次序并入引物-二聚体中。

协同核酸及其使用方法也不同于“锁式探针(padlockprobe)”(Nilsson等1994:"Padlock probes:circularizing oligonucleotidesfor localized DNA detection".Science 265(5181):2085–2088)、分子倒置探针(MIP)(Hardenbol等2003:“Multiplexed genotyping withsequence-tagged molecular inversion probes”.Nat Biotechnol 21(6):673–678)和接头倒置探针(CIP)(Akhras等2007:Hall,Neil.编辑"Connector inversion probe technology:a powerful one-primer multiplexDNA amplification system for numerous scientific applications".PLoSONE 2(9):e195)。例如，本文公开的探针可具有带至少一个不可延伸部分的接头。此外，本文公开的分子为引物，而连接“锁式探针”，并且在扩增之前消化或去除未连接的锁式探针并不能用作引物。

锁式探针为具有与靶标互补，通过40-核苷酸长接头序列连接的两个20-核苷酸长片段的单链DNA分子。当靶互补区与DNA靶标杂交时，锁式探针也变成环状。然而，与MIP不同，将锁式探针设计为使得靶互补区在杂交后跨越整个靶区，不留空位。因此，锁式探针仅用于检测序列已知的DNA分子。

开发分子倒置探针以进行SNP基因分型，其为经修饰的锁式探针，使得探针与基因组靶标杂交时，在SNP位置存在空位。使用与SNP位置的核苷酸互补的核苷酸填空测定了多态性的同一性。这种设计带来了优于更传统的锁式探针技术的许多益处。使用对似是而非的SNP有特异性的多个锁式探针需要小心平衡这些等位基因特异性探针的浓度，以确保正确标准化指定基因座处的SNP数。

接头倒置探针通过延伸由杂交探针末端限定的空位利用经修饰的MIP设计并命名为接头倒置探针(CIP)设计。空位与待捕获的目标基因组区域(例如外显子)相对应。用DNA聚合酶，使用全部四种核苷酸完成填空反应。然后可通过使用映射到探针的靶互补末端之一的基因座特异性引物，为其测序进行捕获区域的鉴定。

“引物二聚体”(PD)为PCR中的可能副产物。正如其名称所示，PD由已经由于引物中的互补碱基串或通过其它非特异性相互作用，相互连接(杂交)的引物分子组成。因此，DNA聚合酶使PD扩增，导致对PCR试剂的竞争，从而可能抑制靶向PCR扩增的DNA序列的扩增。在实时PCR中，PD可能通过信号阻尼、假阴性、假阳性等干扰精确量化。

本发明还涉及协同连接的核酸，其也包含探针。这种经修饰的引物/探针与协同核酸相似，但是向捕获序列或引物添加了一个或多个可检标记，使其转变成探针。因为协同引物/探针的延伸可检测，所以可用于各种应用，包括需要使用基于ARMS的方法区分SNP的多重应用。在一些实施方案中，设计了Tm低于用于扩增反应的解链温度的引物和探针，使得没有探针结合，引物不会扩增并且没有引物结合，探针不会有信号。这样在同一引物/探针组合中产生了两个特异性点。

本发明的协同核酸，例如引物和探针，用于本领域中技术人员已知的各种引物延伸/扩增反应，包括但不限于聚合酶链式反应、滚环扩增、核酸测序等。本发明的协同引物和探针也可用于具有延伸/扩增后步骤，例如与阵列杂交的应用中。因为本发明中的协同引物/探针大大减少了引物-二聚体，所以其在多重和高度多重反应中具有特殊用途。

与使用正常引物(非协同核酸)时存在的引物-二聚体的量相比，使用协同核酸可使存在的引物-二聚体的量减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％,69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

因此，本文公开了一种协同核酸分子，其包含a)第一核酸序列，其中所述第一核酸序列基本上与靶核酸的第一区域互补，并且其中所述第一核酸序列在3’末端可延伸；b)第二核酸序列，其中所述第二核酸序列基本上与所述靶核酸的第二区域互补；其中所述第一核酸序列和第二核酸序列相互连接；并且其中所述第二核酸序列与所述第一核酸序列3’末端下游的所述靶核酸序列杂交；并且其中与没有第二核酸序列与之连接的第一核酸序列的独立Tm相比，第一核酸分子的有效解链温度(Tm)增加至少1℃。

协同核酸可为线性或环状。

用“在3’末端可延伸”意指第一核酸在这个末端上自由扩增或延伸。在其它技术中，这意在包括热可激活引物，例如Lebedev等描述的热可激活引物。

第一核酸序列为引物，并且第二核酸序列可选择性地称为“捕获核酸序列”。第一或第二序列可具有可检标记，或第三序列可具有可检标记。第一核酸序列和第二核酸序列可经由可为非核酸序列的接头连接。在一个实例中，接头可将第一核酸序列的5’末端连接到第二核酸序列的3’末端。例如，这在图2中可见。可选地，第一核酸序列反向，使得第一核酸序列的5’末端连接到第二核酸序列的5’末端。例如，这在图3中可见。在另一实例中，如图1所见，第二核酸序列的5’末端可在序列中间与第一核酸序列连接。应指出的是，用“序列中间”意指接头并未在核酸的5’末端或3’末端与第一核酸序列连接，而是与5’末端和3’末端上核苷酸内部的核苷酸连接。

在一个实例中，协同核酸包含在同一方向上的75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10个或更少的连续核苷酸。换言之，这是为单个、未断裂核酸序列的一部分并且定向于相同5’-3’方向或3’-5’方向的核苷酸的数量。举例而言，如果接头为核酸序列，如果接头中的核苷酸在和与之直接连接的第一或第二核酸序列相同的方向上，则其可包括接头。

接头可由核酸、非核酸或二者的某种组合构成。如果接头由核酸构成，则其长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个或更多个核苷酸，或之间的任何数量。本文其它地方讨论了接头的类型。接头可为任何长度，并且可比第一核酸序列和第二核酸序列的组合长度长或短，只比第一核酸序列长或短，或比第二核酸序列长或短。

此外，在靶核酸上可存在第一核酸序列和第二核酸序列杂交的间隔。换言之，在靶核酸上存在两个不同区域，一个与第一核酸序列杂交，而另一个与第二核酸序列杂交。靶标上第一和第二区域之间的距离长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个或更多个核苷酸。

本文还公开了一种试剂盒，其包含本文公开的协同核酸分子连同其使用说明书。在一些实施方案中，在试剂盒中提供了另外的协同核酸分子。还有其它实施方案中，包括进行延伸的试剂，例如聚合酶、dNTP、缓冲液等。在一些实施方案中，可能包括阳性和阴性对照。在这种实施方案中，试剂可全部单独包装或合并在单根管子或单个容器内。

进一步公开了扩增靶核酸的方法，所述方法包括：a)提供如本文所公开的协同核酸分子；b)提供靶核酸；和c)在用于扩增的适当条件下扩增所述靶核酸；与没有所述第二核酸序列与之连接的第一核酸序列的独立Tm相比，所述第一核酸分子的有效Tm增加至少1℃；从而扩增了靶核酸。

本文其它地方公开了扩增方法。可提供一种以上的协同核酸分子，并且它们可具有相同或不同序列。例如，可提供具有不同序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100种或更多种核酸分子。

引物设计

在一些实施方案中，本文也称为第一核酸序列的引物的独立解链温度“Tm”低于PCR退火期间或无退火期的反应的延伸期间使用的反应温度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50度或更多。因此，引物序列的解链温度可低于PCR反应中使用的反应温度约1℃-40℃、约3℃-20℃、约5℃-15℃。在一个优选实施方案中，独立Tm低于反应温度约7℃-12℃。这样提供了小于50％，并且更优选小于20％的模板与分离的引物杂交。

本领域的技术人员可设计基于许多因素(例如长度)而具有指定解链温度并且GC含量递增的引物。用于计算(Tm)的简单公式为：

Tm＝4(G+C)+2(A+T)℃

此外，本领域的技术人员将认识到实际Tm受Mg²⁺、K⁺和助溶剂的浓度影响。有许多计算机程序辅助引物设计。

为获得所需解链温度，第一核酸序列或引物的长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个碱基。例如，根据GC含量，引物长度可介于约5-26个、约7-22个、约9-17个碱基之间。

可使用任何所需数量的不同核苷酸序列的引物，但是优选使用一个或几个引物。例如，可用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个引物，进行扩增反应。可使用更多引物。对可用的引物数量没有基本上限。然而，优选使用较少的引物。当使用多个引物时，引物应各自具有不同的特异性核苷酸序列。

可用单个引物进行扩增反应，并且例如，不用附加引物、用1个附加引物、用2个附加引物、用3个附加引物、用4个附加引物、用5个附加引物、用6个附加引物、用7个附加引物、用8个附加引物、用9个附加引物、用10个附加引物、用11个附加引物、用12个附加引物、用13个附加引物、用14个附加引物、用15个附加引物、用16个附加引物、用17个附加引物、用18个附加引物、用19个附加引物、用20个附加引物、用21个附加引物、用22个附加引物、用23个附加引物、用24个附加引物、用25个附加引物、用26个附加引物、用27个附加引物、用28个附加引物、用29个附加引物、用30个附加引物、用31个附加引物、用32个附加引物、用33个附加引物、用34个附加引物、用35个附加引物、用36个附加引物、用37个附加引物、用38个附加引物、用39个附加引物、用40个附加引物、用41个附加引物、用42个附加引物、用43个附加引物、用44个附加引物、用45个附加引物、用46个附加引物、用47个附加引物、用48个附加引物、用49个附加引物、用50个附加引物、用51个附加引物、用52个附加引物、用53个附加引物、用54个附加引物、用55个附加引物、用56个附加引物、用57个附加引物、用58个附加引物、用59个附加引物、用60个附加引物、用61个附加引物、用62个附加引物、用63个附加引物、用64个附加引物、用65个附加引物、用66个附加引物、用67个附加引物、用68个附加引物、用69个附加引物、用70个附加引物、用71个附加引物、用72个附加引物、用73个附加引物、用74个附加引物、用75个附加引物、用76个附加引物、用77个附加引物、用78个附加引物、用79个附加引物、用80个附加引物、用81个附加引物、用82个附加引物、用83个附加引物、用84个附加引物、用85个附加引物、用86个附加引物、用87个附加引物、用88个附加引物、用89个附加引物、用90个附加引物、用91个附加引物、用92个附加引物、用93个附加引物、用94个附加引物、用95个附加引物、用96个附加引物、用97个附加引物、用98个附加引物、用99个附加引物、用100个附加引物、用110个附加引物、用120个附加引物、用130个附加引物、用140个附加引物、用150个附加引物、用160个附加引物、用170个附加引物、用180个附加引物、用190个附加引物、用200个附加引物、用210个附加引物、用220个附加引物、用230个附加引物、用240个附加引物、用250个附加引物、用260个附加引物、用270个附加引物、用280个附加引物、用290个附加引物、用300个附加引物、用310个附加引物、用320个附加引物、用330个附加引物、用340个附加引物、用350个附加引物、用360个附加引物、用370个附加引物、用380个附加引物、用390个附加引物、用400个附加引物、用410个附加引物、用420个附加引物、用430个附加引物、用440个附加引物、用450个附加引物、用460个附加引物、用470个附加引物、用480个附加引物、用490个附加引物、用500个附加引物、用550个附加引物、用600个附加引物、用650个附加引物、用700个附加引物、用750个附加引物、用800个附加引物、用850个附加引物、用900个附加引物、用950个附加引物、用1,000个附加引物、用1,100个附加引物、用1,200个附加引物、用1,300个附加引物、用1,400个附加引物、用1,500个附加引物、用1,600个附加引物、用1,700个附加引物、用1,800个附加引物、用1,900个附加引物、用2,000个附加引物、用2,100个附加引物、用2,200个附加引物、用2,300个附加引物、用2,400个附加引物、用2,500个附加引物、用2,600个附加引物、用2,700个附加引物、用2,800个附加引物、用2,900个附加引物、用3,000个附加引物、用3,500个附加引物、用4,000个附加引物。

可用单个引物进行扩增反应，并且例如，不用附加引物、用少于2个附加引物、用少于3个附加引物、用少于4个附加引物、用少于5个附加引物、用少于6个附加引物、用少于7个附加引物、用少于8个附加引物、用少于9个附加引物、用少于10个附加引物、用少于11个附加引物、用少于12个附加引物、用少于13个附加引物、用少于14个附加引物、用少于15个附加引物、用少于16个附加引物、用少于17个附加引物、用少于18个附加引物、用少于19个附加引物、用少于20个附加引物、用少于21个附加引物、用少于22个附加引物、用少于23个附加引物、用少于24个附加引物、用少于25个附加引物、用少于26个附加引物、用少于27个附加引物、用少于28个附加引物、用少于29个附加引物、用少于30个附加引物、用少于31个附加引物、用少于32个附加引物、用少于33个附加引物、用少于34个附加引物、用少于35个附加引物、用少于36个附加引物、用少于37个附加引物、用少于38个附加引物、用少于39个附加引物、用少于40个附加引物、用少于41个附加引物、用少于42个附加引物、用少于43个附加引物、用少于44个附加引物、用少于45个附加引物、用少于46个附加引物、用少于47个附加引物、用少于48个附加引物、用少于49个附加引物、用少于50个附加引物、用少于51个附加引物、用少于52个附加引物、用少于53个附加引物、用少于54个附加引物、用少于55个附加引物、用少于56个附加引物、用少于57个附加引物、用少于58个附加引物、用少于59个附加引物、用少于60个附加引物、用少于61个附加引物、用少于62个附加引物、用少于63个附加引物、用少于64个附加引物、用少于65个附加引物、用少于66个附加引物、用少于67个附加引物、用少于68个附加引物、用少于69个附加引物、用少于70个附加引物、用少于71个附加引物、用少于72个附加引物、用少于73个附加引物、用少于74个附加引物、用少于75个附加引物、用少于76个附加引物、用少于77个附加引物、用少于78个附加引物、用少于79个附加引物、用少于80个附加引物、用少于81个附加引物、用少于82个附加引物、用少于83个附加引物、用少于84个附加引物、用少于85个附加引物、用少于86个附加引物、用少于87个附加引物、用少于88个附加引物、用少于89个附加引物、用少于90个附加引物、用少于91个附加引物、用少于92个附加引物、用少于93个附加引物、用少于94个附加引物、用少于95个附加引物、用少于96个附加引物、用少于97个附加引物、用少于98个附加引物、用少于99个附加引物、用少于100个附加引物、用少于110个附加引物、用少于120个附加引物、用少于130个附加引物、用少于140个附加引物、用少于150个附加引物、用少于160个附加引物、用少于170个附加引物、用少于180个附加引物、用少于190个附加引物、用少于200个附加引物、用少于210个附加引物、用少于220个附加引物、用少于230个附加引物、用少于240个附加引物、用少于250个附加引物、用少于260个附加引物、用少于270个附加引物、用少于280个附加引物、用少于290个附加引物、用少于300个附加引物、用少于310个附加引物、用少于320个附加引物、用少于330个附加引物、用少于340个附加引物、用少于350个附加引物、用少于360个附加引物、用少于370个附加引物、用少于380个附加引物、用少于390个附加引物、用少于400个附加引物、用少于410个附加引物、用少于420个附加引物、用少于430个附加引物、用少于440个附加引物、用少于450个附加引物、用少于460个附加引物、用少于470个附加引物、用少于480个附加引物、用少于490个附加引物、用少于500个附加引物、用少于550个附加引物、用少于600个附加引物、用少于650个附加引物、用少于700个附加引物、用少于750个附加引物、用少于800个附加引物、用少于850个附加引物、用少于900个附加引物、用少于950个附加引物、用少于1,000个附加引物、用少于1,100个附加引物、用少于1,200个附加引物、用少于1,300个附加引物、用少于1,400个附加引物、用少于1,500个附加引物、用少于1,600个附加引物、用少于1,700个附加引物、用少于1,800个附加引物、用少于1,900个附加引物、用少于2,000个附加引物、用少于2,100个附加引物、用少于2,200个附加引物、用少于2,300个附加引物、用少于2,400个附加引物、用少于2,500个附加引物、用少于2,600个附加引物、用少于2,700个附加引物、用少于2,800个附加引物、用少于2,900个附加引物、用少于3,000个附加引物、用少于3,500个附加引物、用少于4,000个附加引物。

例如，可用少于2个引物、用少于3个引物、用少于4个引物、用少于5个引物、用少于6个引物、用少于7个引物、用少于8个引物、用少于9个引物、用少于10个引物、用少于11个引物、用少于12个引物、用少于13个引物、用少于14个引物、用少于15个引物、用少于16个引物、用少于17个引物、用少于18个引物、用少于19个引物、用少于20个引物、用少于21个引物、用少于22个引物、用少于23个引物、用少于24个引物、用少于25个引物、用少于26个引物、用少于27个引物、用少于28个引物、用少于29个引物、用少于30个引物、用少于31个引物、用少于32个引物、用少于33个引物、用少于34个引物、用少于35个引物、用少于36个引物、用少于37个引物、用少于38个引物、用少于39个引物、用少于40个引物、用少于41个引物、用少于42个引物、用少于43个引物、用少于44个引物、用少于45个引物、用少于46个引物、用少于47个引物、用少于48个引物、用少于49个引物、用少于50个引物、用少于51个引物、用少于52个引物、用少于53个引物、用少于54个引物、用少于55个引物、用少于56个引物、用少于57个引物、用少于58个引物、用少于59个引物、用少于60个引物、用少于61个引物、用少于62个引物、用少于63个引物、用少于64个引物、用少于65个引物、用少于66个引物、用少于67个引物、用少于68个引物、用少于69个引物、用少于70个引物、用少于71个引物、用少于72个引物、用少于73个引物、用少于74个引物、用少于75个引物、用少于76个引物、用少于77个引物、用少于78个引物、用少于79个引物、用少于80个引物、用少于81个引物、用少于82个引物、用少于83个引物、用少于84个引物、用少于85个引物、用少于86个引物、用少于87个引物、用少于88个引物、用少于89个引物、用少于90个引物、用少于91个引物、用少于92个引物、用少于93个引物、用少于94个引物、用少于95个引物、用少于96个引物、用少于97个引物、用少于98个引物、用少于99个引物、用少于100个引物、用少于110个引物、用少于120个引物、用少于130个引物、用少于140个引物、用少于150个引物、用少于160个引物、用少于170个引物、用少于180个引物、用少于190个引物、用少于200个引物、用少于210个引物、用少于220个引物、用少于230个引物、用少于240个引物、用少于250个引物、用少于260个引物、用少于270个引物、用少于280个引物、用少于290个引物、用少于300个引物、用少于310个引物、用少于320个引物、用少于330个引物、用少于340个引物、用少于350个引物、用少于360个引物、用少于370个引物、用少于380个引物、用少于390个引物、用少于400个引物、用少于410个引物、用少于420个引物、用少于430个引物、用少于440个引物、用少于450个引物、用少于460个引物、用少于470个引物、用少于480个引物、用少于490个引物、用少于500个引物、用少于550个引物、用少于600个引物、用少于650个引物、用少于700个引物、用少于750个引物、用少于800个引物、用少于850个引物、用少于900个引物、用少于950个引物、用少于1,000个引物、用少于1,100个引物、用少于1,200个引物、用少于1,300个引物、用少于1,400个引物、用少于1,500个引物、用少于1,600个引物、用少于1,700个引物、用少于1,800个引物、用少于1,900个引物、用少于2,000个引物、用少于2,100个引物、用少于2,200个引物、用少于2,300个引物、用少于2,400个引物、用少于2,500个引物、用少于2,600个引物、用少于2,700个引物、用少于2,800个引物、用少于2,900个引物、用少于3,000个引物、用少于3,500个引物、用少于4,000个引物进行扩增反应。

公开的引物可具有一个或多个经修饰的核苷酸。本文将这种引物称为经修饰引物。也可使用嵌合引物。嵌合引物是具有至少两种类型的核苷酸的引物，例如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸、核糖核苷酸和经修饰核苷酸、两种或更多种类型的经修饰核苷酸、脱氧核糖核苷酸和两种或更多种不同类型的经修饰核苷酸、核糖核苷酸和两种或更多种不同类型的经修饰核苷酸或脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和两种或更多种不同类型的经修饰核苷酸。嵌合引物的一种形式为肽核酸/核酸引物。例如，5’-PNA-DNA-3’或5’-PNA-RNA-3’引物可用于更有效的链侵入和聚合侵入。嵌合引物的其它形式为(例如)5’-(2’-O-甲基)RNA-RNA-3’或5’-(2’-O-甲基)RNA-DNA-3’。

已知许多经修饰核苷酸(核苷酸类似物)并且可用于寡核苷酸中。核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸部分的某些类型的修饰的核苷酸。对碱基部分的修饰将包括A、C、G和T/U以及不同嘌呤或嘧啶碱基，例如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基的天然和合成修饰。经修饰的碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤及3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。例如在美国专利No.3,687,808，Englisch等，Angewandte Chemie，国际版，1991,30,613和Sanghvi,Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑，CRC Press,1993中可找到另外的碱基修饰。某些核苷酸类似物，例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可增加双链体形成的稳定性。其它经修饰的碱基为起通用碱基作用的碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基取代正常碱基，但是在碱基配对中没有偏差。即，通用碱基可与任何其它碱基配对。具有一个或多个通用碱基的引物未被视为具有特异性序列的引物。

碱基修饰往往可与(例如)糖修饰，例如2'-O-甲氧基乙基结合，以获得独特性质，例如增加的双链体稳定性。有许多美国专利，例如4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121,5,596,091、5,614,617和5,681,941，详述了一系列碱基修饰。这些专利的每一个均以引用的方式并入本文。

核苷酸类似物也可包括对糖部分的修饰。对糖部分的修饰将包括对核糖和脱氧核糖的天然修饰以及合成修饰。糖修饰包括但不限于在2'位置的下列修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可为经取代或未经取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。2'糖修饰还包括但不限于-O[(CH₂)n O]m CH₃、-O(CH₂)nOCH₃、-O(CH₂)nNH₂、-O(CH₂)nCH₃、-O(CH₂)n-ONH₂和-O(CH₂)nON[(CH₂)n CH₃)]₂，其中n和m为1至约10。

2'位置的其它修饰包括但不限于：C1-C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基。杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、信息基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团和具有相似性质的其它取代基。也可在糖上其它位置，特别是3'末端寡核苷酸上或2'-5'连接的寡核苷酸中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置产生类似修饰。经修饰的糖还将包括在桥接环氧处含有修饰，例如CH₂和S的糖。核苷酸糖类似物也可具有糖模拟物，例如代替呋喃戊糖的环丁基部分。有许多美国专利教导了这种经修饰糖结构的制备，例如4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，其各自以引用的方式整体并入本文。

也可在磷酸部分产生核苷酸类似物。经修饰的磷酸部分包括但不限于可修饰，使得两个核苷酸之间的连接含有硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-烃基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、磷酰胺酯(包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯的磷酸部分。应理解，两个核苷酸之间的这些磷酸酯或经修饰的磷酸酯连接可通过3'-5'连接或2'-5'连接，并且所述连接可含有反向极性，例如3'-5'转化为5'-3'或2'-5'转化为5'-2'。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。许多美国专利教导了如何制备和使用含有经修饰磷酸酯的核苷酸，包括但不限于3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，其各自以引用的方式并入本文。

应理解，核苷酸类似物只需含有单个修饰，但是也可能在其中一个部分或在不同部分之间含有多个修饰。

核苷酸替代物是具有与核苷酸相似的功能性质，但是不含磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是会识别并以Watson-Crick或Hoogsteen方式与互补核酸杂交，但是通过除磷酸部分以外的部分连接在一起的分子。核苷酸替代物在与适当核酸分子相互作用时，能够与双螺旋类结构一致。

核苷酸替代物是磷酸部分和/或糖部分已经置换的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸替代物不含标准磷原子。例如，磷酸酯的替代物可为短链烷基或环烷基核苷酸间连接、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间连接或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间连接。这些包括具有吗啉基连接(部分由核苷酸的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；和其它具有N、O、S和CH2混合组分部分的骨架的替代物。许多美国专利公开了如何制备和使用这些类型的磷酸置换，包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，其各自以引用的方式并入本文。

在核苷酸替代物中还应理解，核苷酸的糖和磷酸部分可经(例如)酰胺类连接(氨基乙基甘氨酸)(PNA)置换。美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262教导了如何制备和使用PNA分子，其各自以引用的方式并入本文。(还见Nielsen等，Science 254:1497-1500(1991))。

引物可由核苷酸组成并且可由不同类型的核苷酸或相同类型的核苷酸构成。例如，引物中的一个或多个核苷酸可为核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2'-O-甲基核糖核苷酸的混合；约10％至约50％的核苷酸可为核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2'-O-甲基核糖核苷酸的混合；约50％或更多的核苷酸可为核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2'-O-甲基核糖核苷酸的混合；或全部核苷酸均为核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2'-O-甲基核糖核苷酸的混合。核苷酸由碱基组成(即，核苷酸的碱基部分)并且可(并且通常将)包含不同类型的碱基。

捕获序列设计

捕获序列，本文也称为“第二核酸序列”，与模板杂交，使得其与引物3’末端下游的靶核酸分子杂交。在一些实施方案中，需要对靶核酸中突变的抗性并且设计解链温度高于反应温度的捕获序列。在这些实施方案中，设计独立Tm高于反应温度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50度或更多的捕获序列。例如，捕获或第二序列高于反应温度约0℃-40℃、约5℃-30℃、约7℃-25℃。在一些实施方案中，也对预期突变体产生了捕获序列的预测解链温度。在这些实施方案中，捕获序列转变为预期突变体的独立Tm可介于低于反应温度约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1516、17、18、19、20度或更多，或高于反应温度约10、11、12、13、14,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50度或更多之间。例如，可低于反应温度10℃和高于反应温度30℃，介于低于反应温度3℃和高于反应温度10℃之间。

为达到这些解链温度，捕获序列长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个或更多个碱基。例如，其可为介于约20-约50个、约22-约40个、约23-约37个碱基之间。

在一些实施方案中，需要对靶序列中修饰的更高抗性。在这些实施方案中，除独立Tm高于反应温度约0℃-40℃的捕获序列外，设计了独立Tm介于低于反应温度约7℃和高于反应温度约20℃之间，介于低于反应温度约5℃和高于反应温度约10℃之间，介于低于反应温度约3℃和高于反应温度约3℃之间的协同引物。引物和捕获序列之间的协同作用将为协同引物产生更高的有效Tm，致使其几乎不受序列中的突变影响。通过比较，正常引物可能必须是长度上附加的5-30个碱基才具有对靶序列中突变的等效抗性，因此，将更易受引物-二聚体形成影响。

在其它实施方案中，优选对引物-二聚体的更高抗性并且将独立捕获或第二核酸序列的解链温度设计为低于反应温度。例如，捕获或第二核酸序列低于PCR退火期的反应温度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50度或更多。在优选实施方案中，独立捕获或第二核酸序列的Tm低于反应温度约0℃-12℃、约1℃-8℃、约2℃-5℃。为达到这些低解链温度，捕获序列长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或更多个碱基。例如，捕获或第二核酸序列可介于约5-30个、约8-25个、约10-22个碱基之间。

在一些实施方案中，捕获序列迅速结合和释放靶序列，使得聚合酶可在捕获序列下面衍射，让捕获序列完整。在一些实施方案中，这使用具有与捕获序列5’末端连接的接头的协同引物增强。在一个优选实施方案中，聚合酶能够在延伸期间裂解捕获序列。在一个优选实施方案中，这使用具有与捕获序列3’末端连接的接头的协同引物增强。

接头

模板中第一核酸或引物序列3’末端与第二核酸或捕获序列杂交位置5’末端之间碱基的数量很重要。在一些实施方案中，引物和捕获序列之间碱基的数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。例如，它们可介于约0-30、约0-20、约0-10个碱基之间。

介于两个位点之间的碱基越多，如果需要裂解捕获序列时，需要接头越长。接头越长，进入系统的熵越高，这样降低了协同结合的效应。这用以下方程式表示：

K_效应＝K_引物+K_捕获+L_CK_引物K_捕获

其中K效应为有效或协同平衡常数，K引物为分离时引物的平衡常数，K捕获为平衡中捕获序列的平衡常数并且Lc为局部浓度，定义为：

$L_C=\frac{\left(\frac{1}{6.022E23}\right)}{\frac{4}{3}\mathrm{\π}{r}^3}$

其中r为按分米计的接头长度。这样由于引物和探针之间的协同作用，以摩尔浓度提供了有效局部浓度。相应地，接头长度直接决定了对有效平衡常数的协同贡献(L_cK_引物K_捕获)。

可通过使用最近邻域获得引物和捕获序列的焓和熵值或通过本领域中技术人员已知的其它计算法计算K_引物和K_捕获。

可如下计算引物结合的模板总量：

其中T引物为引物结合的模板，T_o为模板总量并且P_o为协同引物起始浓度。可以看出，当L_cK_引物K_捕获远远高于K_引物时，协同效应最高。要实现这一点，接头长度应尽可能短。

虽然数学显示接头长度应尽可能短，但是对于实际上接头可有多短存在几种限制。当捕获序列和探针与模板结合时，它们形成刚性双螺旋线。接头长度必须足以适应这种结构。

在一些实施方案中，接头连接引物5’末端与捕获序列3’末端(图2)。在该实施方案中，接头比引物和捕获序列的组合长度大。在接头连接到捕获序列3’末端的一个优选实施方案中，接头包含6个六乙二醇。在另一实施方案中，引物反向，使得引物5’末端与捕获序列5’末端连接(图3)。在该实施方案中，接头比引物长。在接头连接到捕获序列5’末端的一个优选实施方案中，接头包含3个六乙二醇。在另一实施方案中，捕获序列3’末端连接到引物中间(图1)。在这种情况下，接头可能比引物长度短。

本领域的技术人员已知各种接头类型和组成。实例包括但不限于聚乙二醇和碳接头。接头可通过各种方法连接，包括但不限于共价键、离子键、氢键合、极性缔合、磁性缔合和范德华缔合。优选的方法是通过标准DNA合成方法的共价键结合。

聚乙二醇接头的长度为每个单体约0.34nm。在一些实施方案中，聚乙二醇接头的长度介于约1-90、约2-50、约3-30个单体(完全延伸介于约1-10nm)。

用捕获序列作为探针

在一些实施方案中，优选将捕获序列也用作探针。在一些实施方案中，这通过向捕获序列添加一个或多个标记来进行。在一个优选实施方案中，标记包括FRET对。

本领域中的技术人员已知各种核酸探针构建体。这些包括但不限于双标记探针、发夹型探针和单标记探针(见图4)。

在一些实施方案中，对于高信噪比而言需要低本底信号。在一些实施方案中，发夹型探针用于提供更强的接触淬灭以帮助提供高信噪比。

在其它实施方案中，需要较短的探针以将引物-探针二聚体减到最少。在需要较短探针的一些实施方案中，使用双标记探针。在需要更加重视减少假延伸产物的实施方案中，独立探针靶标复合物的解链温度低于反应温度。

本领域中技术人员已知各种用于检测来自标记探针的信号的方法。在一些实施方案中，使用裂解探针的聚合酶，释放出改变信号的标记。在其它实施方案中，使用不裂解探针的聚合酶。相反通过探针与模板的杂交改变了信号。

使用具有内置检测机制的引物

在一些实施方案中，引物具有内置检测机制。在一些实施方案中，检测机制包括一个或多个可检标记。在一个优选实施方案中，检测机制包括FRET对。具有内置检测机制的引物的实例包括但不限于Amplifluor引物、Rapid Detex引物和本领域中技术人员已知的其它引物。在图7中看到了这种引物的实例。

具有内置检测机制的协同核酸可以比具有内置检测机制的非协同核酸(正常引物)对测定设计人员更有用。不受理论限制，这是因为协同核酸不大倾向于生成来自非特异性产物，例如引物-二聚体的信号。

在一些实施方案中，核酸结合染料，例如SYBR绿，用于监测扩增反应的进度。

荧光变化探针和荧光变化引物指基于待检测、测定或复制的探针或引物和核酸形式或构象上的变化，牵涉荧光强度或波长的变化的所有探针和引物。荧光变化探针和引物的实例包括分子信标、Amplifluor、FRET探针、可裂解FRET探针、TaqMan探针、蝎形引物、荧光三链寡核苷酸、荧光水溶性共轭聚合物、PNA探针和QPNA探针。

荧光变化探针和引物可根据其结构和/或功能分类。荧光变化探针包括发夹淬灭探针、裂解淬灭探针、裂解激活探针和荧光激活探针。荧光变化引物包括茎淬灭引物和发夹淬灭引物。在Schweitzer和Kingsmore，Curr.Opin.Biotech.12:21-27(2001)中评论了几种类型的荧光变化探针和引物的用途。Hall等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8272-8277(2000)，以侵染测定法描述了荧光变化探针的用途。

发夹淬灭探针是在未与靶序列结合时，形成使得荧光标记和淬灭部分靠近的发夹结构(并且通常为环)，使得淬灭来自标记的荧光的探针。当探针与靶序列结合时，茎破坏，淬灭部分不再靠近荧光标记并且荧光增加。发夹淬灭探针的实例为分子信标、荧光三链寡核苷酸和QPNA探针。

裂解激活探针是通过裂解探针增加荧光的探针。裂解激活探针可包括靠近的荧光标记和淬灭部分，使得淬灭来自标记的荧光。当探针被剪短或消化时(通常在扩增期间通过聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性)，淬灭部分不再靠近荧光标记并且荧光增加。TaqMan探针(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280(1991))是裂解激活探针的实例。

裂解淬灭探针是通过裂解探针减少或改变荧光的探针。裂解淬灭探针可包括受体荧光标记和供体部分，使得当受体和供体靠近时，从供体到受体的荧光共振能量转移使受体发荧光。因此例如探针在与靶序列杂交时有荧光性。当探针被剪短或消化时(通常在扩增期间通过聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性)，供体部分不再靠近受体荧光标记并且来自受体的荧光减少。如果供体部分本身为荧光标记，则它在不靠近受体时，可释放出呈荧光的能量(通常与受体荧光的波长不同)。然后整体效应将是受体荧光减少而供体荧光增加。在裂解淬灭探针的情况下，供体荧光与用为淬灭部分的受体和为荧光标记的供体，由裂解激活探针产生的荧光相当。可裂解FRET(荧光共振能量转移)探针为裂解淬灭探针的实例。

荧光激活探针是通过探针与靶序列杂交，增加或改变荧光的探针或探针对。荧光激活探针可包括受体荧光标记和供体部分，使得当受体和供体靠近时(当探针与靶序列杂交时)，从供体到受体的荧光共振能量转移使受体发荧光。荧光激活探针通常是设计为与相邻序列杂交使得使得受体和供体靠近的探针对。荧光激活探针也可为含有供体和受体的单个探针，其中当探针未与靶序列杂交时，供体和受体未靠近，但是其中当探针与靶序列杂交时，使得供体和受体靠近。例如，这可通过将供体和受体置于探针的相对端并且将互补靶序列置于探针的每一端实现，其中互补靶序列与靶序列中的相邻序列互补。如果荧光激活探针的供体部分本身为荧光标记，则它在不靠近受体时(即，探针未与靶序列杂交时)，可释放出呈荧光的能量(通常与受体荧光的波长不同)。当探针与靶序列杂交时，整体效应将是供体荧光减少而受体荧光增加。FRET探针为荧光激活探针的实例。

茎淬灭引物是未与互补序列杂交时，形成使得荧光标记和淬灭部分靠近的茎结构(分子内茎结构或分子间茎结构)，使得淬灭来自标记的荧光的引物。当引物与互补序列结合时，茎破坏，淬灭部分不再靠近荧光标记并且荧光增加。在公开的方法中，茎淬灭引物用作核酸合成的引物并且因此变成并入合成或扩增的核酸中。茎淬灭引物的实例为肽核酸淬灭引物和发夹淬灭引物。

肽核酸淬灭引物是与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧石缔合形成茎结构的引物。引物含有荧光标记或淬灭部分并且分别与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧石缔合。这样靠近淬灭部分放置荧光标记。当复制引物时，置换肽核酸，从而使荧光标记产生荧光信号。

发夹淬灭引物是未与互补序列杂交时，形成使得荧光标记和淬灭部分靠近的发夹结构(并且通常为环)，使得淬灭来自标记的荧光的引物。当引物与互补序列结合时，茎破坏，淬灭部分不再靠近荧光标记并且荧光增加。发夹淬灭引物通常用作核酸合成的引物并且因此变成并入合成或扩增的核酸中。发夹淬灭引物的实例为Amplifluor引物(Nazerenko等，Nucleic Acids Res.25:2516-2521(1997))和蝎形引物(Thelwell等，Nucleic Acids Res.28(19):3752-3761(2000))。

除裂解激活引物是并入复制链中，随后再裂解的引物外，它们与裂解激活探针相似。Little等，Clin.Chem.45:777-784(1999)，描述了裂解激活引物的用途。

用ARMS进行倍增

在一些实施方案中，需要检测多种多态性、插入、缺失或其它突变。在一些实施方案中，这样设计引物，使得3’末端上的碱基越过突变。在一些实施方案中，将附加有意多态性设计到引物中。在一个实施方案中，与引物连接的探针的存在允许在同一位置对多种多态性的等位基因特异性实时检测。

用探针区分突变

在一些实施方案中，使用与引物连接的捕获序列实现多态性的区分。在一些实施方案中，捕获序列具有有意添加以提高区分的附加突变。在一些实施方案中，当存在多态性时，捕获序列不会结合，防止一轮接一轮的有效扩增。在捕获序列具有可检标记的一些实施方案中，即使确实发生一些扩增，捕获序列也并未有效结合而不产生可检信号。

RNA和其它反应

在一些实施方案中，使用除DNA聚合酶外的聚合酶。本领域中技术人员已知各种聚合物酶和能够将一个或多个碱基添加到核酸模板的酶。在一些实施方案中，需要反转录。在一些实施方案中，探针具有足够低的解链温度，使得聚合酶可在其下面延伸。在其它实施方案中，初始聚合一段时间后温度的增加使捕获序列从模板上移开，使聚合酶延伸。在其它实施方案中，使用没有捕获序列的附加引物序列，使聚合酶在较低反应温度下以不受抑制的方式产生拷贝。

靶核酸分子

为扩增对象的核酸分子可为来自任何来源的任何核酸。一般而言，使用含有(或怀疑含有)待扩增核酸分子的核酸样品进行公开的方法。

核酸样品可为任何目标核酸样品。已知许多这种核酸样品的来源、同一性和制备。优选，已知或经鉴定用于扩增或检测方法的核酸样品用于本发明所述的方法。例如，核酸样品可为来自一个或多个细胞、组织或体液例如血液、尿、精液、淋巴液、脑脊髓液或羊水，或其它生物样品例如组织培养细胞、口腔拭子、嗽口水、粪便、组织切片、活检穿刺和考古样品例如骨或干化组织的核酸样品。有用的核酸样品类型包括血样、尿样、精液样品、淋巴液样品、脑脊髓液样品、羊水样品、活检样品、针吸活检样品、癌样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞溶解产物样品、粗细胞溶解产物样品、法医样品、考古样品、感染样品、院内感染样品、生产样品、药物制备样品、生物分子生产样品、蛋白质制备样品、脂质制备样品和/或碳水化合物制备样品。

对于全基因组扩增，优选的核酸样品为来自单细胞的核酸样品。用于公开方法的核酸样品优选为复合并且非重复性的核酸分子和样品。核酸样品为基因组核酸样品时，基因组可为来自任何目标生物的基因组。例如，基因组可为病毒基因组、细菌基因组、真细菌基因组、古细菌基因组、真菌基因组、微生物基因组、真核基因组、植物基因组、动物基因组、脊椎动物基因组、无脊椎动物基因组、昆虫基因组、哺乳动物基因组或人类基因组。靶基因组优选纯净或基本上纯净，但是这并不需要。例如，来自动物来源的基因组样品可包括来自污染或感染生物的核酸。

核酸样品可以是或可源自，例如来自于相同或不同生物、组织、细胞或组合的一个或多个全基因组；来自于相同或不同生物、组织、细胞或组合的一个或多个部分基因组；来自于相同或不同生物、组织、细胞或组合的一条或多条全染色体；来自于相同或不同生物、组织、细胞或组合的一条或多条部分染色体；来自于相同或不同生物、组织、细胞或组合的一个或多个染色体片段；一条或多条人工染色体；一条或多条酵母人工染色体；一条或多条细菌人工染色体；一个或多个粘粒；或这些的任何组合。

寡核苷酸合成

使用确定的寡核苷酸合成法合成引物、检测探针、寻址探针和任何其它寡核苷酸。生成或合成寡核苷酸的方法在本领域中众所周知。这种方法的范围可从标准酶消化，接着是核苷酸片段分离(例如见Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)第5、6章)到纯合成方法，例如通过氰乙基亚磷酰胺法。常规性地使用受保护的核苷氰乙基亚磷酰胺进行DNA片段的固相化学合成(S.L.Beaucage等(1981)Tetrahedron Lett.22:1859)。在这种方法中，初始5'-受保护核苷的3'-羟基首先与聚合物载体共价连接(R.C.Pless等(1975)Nucleic Acids Res.2:773(1975))。然后通过所连核苷的5'-羟基去保护，接着引入的核苷-3'-亚磷酰胺与去保护的羟基偶联，继续进行寡核苷酸的合成(M.D.Matteucci等(1981)J.Am.Chem.Soc.103:3185)。所生成的亚磷酸三酯最后氧化为磷酸三酯以完善核苷酸间键(R.L.Letsinger等(1976)J.Am.Chem.Soc.9:3655)。可选地，可通过硫化亚磷酸三酯进行硫代磷酸酯连接的合成。可使用几种化学药品进行该反应，其中为3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、1,1-二氧化物(R.P.Iyer、W.Egan、J.B.Regan和S.L.Beaucage，J.Am.Chem.Soc.,1990,112,1253-1254)。重复去保护、偶联和氧化步骤，直至获得所需长度和序列的寡核苷酸。存在生成寡核苷酸的其它方法，例如H-膦酸酯法(Hall等，(1957)J.Chem.Soc.,3291-3296)或如Ikuta等，Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)(磷酸三酯和亚磷酸三酯法)和Narang等，Methods Enzymol.,65:610-620(1980)(磷酸三酯法)描述的磷酸三酯法。可使用已知方法，例如Nielsen等，Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)描述的方法，制备蛋白质核酸分子。在美国专利No.6,294,664和美国专利No.6,291,669中描述了其它形式的寡核苷酸合成。

寡核苷酸的核苷酸顺序通常由合成期间向寡核苷酸链添加亚基嵌段的亚基所按相继次序决定。每轮添加可牵涉不同的特定核苷酸前体或一种或多种不同核苷酸前体的混合物。对于公开的特定序列的引物而言，将依次添加特定核苷酸前体。

本文所述许多寡核苷酸设计为与其它寡核苷酸或核酸的某些部分互补，使得可在它们之间形成稳定的杂种。可使用已知方法，例如Lesnick和Freier，Biochemistry 34:10807-10815(1995)；McGraw等，Biotechniques 8:674-678(1990)和Rychlik等，Nucleic Acids Res.18:6409-6412(1990)描述的方法，计算这些杂种的稳定性。

只要保持其相关功能，引物、检测探针、寻址探针和任何其它寡核苷酸就可由经修饰的核苷酸(核苷酸类似物)构成或包括经修饰的核苷酸。已知许多经修饰的核苷酸并且可用于寡核苷酸中，并且在本文其它地方有公开。

试剂盒

上述材料以及其它材料可呈任何适合的组合包装在一起，作为用于进行或帮助进行公开方法的试剂盒。如果将指定试剂盒中的试剂盒组分设计并适应于一起用于公开方法中，则试剂盒有用。例如公开了用于扩增核酸样品的试剂盒，所述试剂盒包含协同核酸和DNA聚合酶。所述试剂盒还可装有核苷酸、缓冲液、检测探针、荧光变化探针、裂解液、稳定液、变性液或组合。

用途

公开的方法和组合物适用于许多领域，包括但不限于分析细胞中存在的核酸(例如，分析细胞中的基因组DNA)、疾病检测、突变检测、基因组发现、基因作图(分子单倍型分型)和农业研究。特别有用的是全基因组扩增。其它用途包括，例如，检测细胞中和基因组DNA阵列上的核酸；分子单倍型分型；突变检测；检测遗传病例如囊肿性纤维化、肌肉萎缩症、糖尿病、血友病、镰状细胞贫血；评估对癌症例如前列腺癌、乳癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、睾丸癌、胰腺癌的易感性。

扩增

适合与本发明一起使用的扩增方法包括，例如聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)反应、自我持续序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)反应、自返式DNA扩增(BDA)、Q-β复制或基于核酸序列的恒温扩增。下面各自简要描述了这些扩增方法并且在本领域中众所周知。

PCR是用于产生特异性模板DNA序列的许多拷贝的技术。反应由多个扩增周期组成并且使用与待拷贝序列的5'和3'末端杂交的一对引物寡核苷酸引发。扩增周期包括初始变性和多达50次循环的退火、链伸长(或延伸)和链分离(变性)。在反应的每次循环中，拷贝引物之间的DNA序列。引物可与拷贝的DNA以及原始模板序列结合，所以拷贝总数随时间呈指数增加。可根据Whelan等，Journal of ClinicalMicrobiology,33(3):556-561(1995)，进行PCR。简言之，PCR反应混合物包括两种特异性引物、dNTP、Taq聚合酶和1XPCR缓冲液，其使用热循环仪扩增。例如，可根据引物的解链温度或要延伸的核酸长度改变循环参数。技术人员能够设计并制备适于扩增靶序列的引物。用于本发明的扩增引物的长度取决于几个因素，包括核苷酸序列同一性和体外核酸扩增期间这些核酸杂交或使用时的温度。决定具特定序列同一性的扩增引物的优选长度所必需的因素为技术人员众所周知并且包括本文所述因素。例如，短核酸或寡核苷酸的长度可与其杂交特异性或选择性有关。

实时PCR是基于PCR的扩增方法，其中实时检测PCR产物，即可在每个循环测定PCR产物的累积量。实时PCR的实例使用TaqMan探针结合适合的扩增/分析仪例如为高通量实时PCR系统的美国应用生物系统公司(ABI)Prism 7900HT序列检测系统进行。简言之，PCR扩增反应中包括对扩增靶序列有特异性的TaqMan探针。这些探针含有在5'末端的报告染料和在3'末端的淬灭染料。与不同靶序列杂交的探针与不同荧光报告染料接合。这样，在同一反应容器中可检测到一种以上靶序列。PCR期间，荧光标记探针与其各自的靶序列特异性结合；Taq聚合酶的5'核酸酶活性从探针上裂解掉报告染料并且产生荧光信号。只有当靶序列与探针互补并且在PCR期间扩增时，才检测到荧光信号增加。探针和靶标之间的错配大大降低了探针杂交和裂解的效率。ABI Prism 7700HT或7900HT序列检测系统测量了PCR热循环期间的荧光增加，提供了PCR产物累积量的“实时”检测。ABI Prism 7900HT或7900HT序列检测器上的实时检测监测了荧光并且计算了每个PCR循环期间的Rn。阈值循环数或Ct值是荧光贯穿阈值时的循环数。用序列检测系统软件或手动测定阈值。

如本文所使用的“RT-PCR”指在单次测定中反转录和PCR的组合。“反转录”是借此RNA模板由反转录酶转录成DNA分子的过程。因此“反转录酶”描述了一类表征为RNA依赖性DNA聚合酶的聚合酶，即这种聚合酶使用RNA模板合成DNA分子。历史上，反转录酶已经用于将mRNA反转录成cDNA。然后，反转录酶可用于反转录其它类型的RNA，例如病毒基因组RNA或病毒亚基因组RNA。标准的反转录酶包括莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MoMuLV RT)和禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。这些酶具有5'->3'RNA依赖性DNA聚合酶活性、5'->3'DNA依赖性DNA聚合酶活性和RNA酶H活性。然而，与许多DNA依赖性DNA聚合酶不同，这些酶缺乏“校对”(即，校正转录期间产生的错误)所必需的3'->5'核酸外切酶活性。已经制备RNA的DNA拷贝后，可使DNA拷贝经受各种DNA扩增方法，例如PCR。

LCR是除了使用四种引物而不是两种并且使用连接酶连接或接合两个DNA片段外，与PCR类似的DNA扩增方法。可根据Moore等，Journal of Clinical Microbiology 36(4)1028-1031(1998)进行LCR。简言之，LCR反应混合物含两对引物、dNTP、DNA连接酶和DNA聚合酶，提供约90μl，向其中添加100μl来自靶生物的分离核酸。扩增在热循环仪中进行(例如，Abbott Labs的LCx，North Chicago,Ill.)

TAS是其中每个循环由cDNA合成步骤和RNA转录步骤构成的核酸扩增系统。在cDNA合成步骤，DNA依赖性RNA聚合酶识别的序列(即，聚合酶结合序列或PBS)插入靶序列或标记序列下游的cDNA拷贝中，以使用双结构域寡核苷酸引物扩增。在第二个步骤中，使用RNA聚合酶由cDNA模板合成多个拷贝的RNA。使用TAS扩增仅需几次循环，因为DNA依赖性RNA转录可对cDNA模板的每个拷贝产生10-1000个拷贝。可根据Kwoh等，PNAS 86:1173-7(1989)进行TAS。简言之，将提取的RNA与TAS扩增缓冲液和牛血清白蛋白、dNTP、NTP和两个寡核苷酸引物合并，其中一个引物含有PBS。加热样品以使RNA模板变性并且冷却到引物退火温度。添加反转录酶(RT)，在适当温度下温育样品以允许cDNA伸长。随后添加T7RNA聚合酶并且在37℃下温育样品约25min，以合成RNA。然后重复以上步骤。可选地，在cDNA初始合成后，在1min 100℃变性后添加RT和RNA聚合酶，接着在37℃下RNA伸长约30min。根据Wylie等，Journal of Clinical Microbiology,36(12):3488-3491(1998)，也可在固相上进行TAS。在这种方法中，用含有特异性捕获引物的磁珠捕获核酸靶标。添加含有扩增引物、dNTP、NTP、2500U反转录酶和2500U的T7RNA聚合酶的扩增试剂之前，洗涤并粒化带捕获靶标的珠粒。将100μl TMA反应混合物置于管内，添加200μl油剂并且通过在42℃下于水浴中温育1h实现扩增。

NASBA是基于转录的扩增方法，其由RNA或DNA靶标扩增RNA。NASBA是用于在一个温度下，于单种混合物中连续扩增核酸的方法。例如，对于RNA扩增，使用禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶、RNA酶H和T7RNA聚合酶。这种方法可根据Heim等，Nucleic Acids Res.,26(9):2250-2251(1998)进行。简言之，NASBA反应混合物含有两种特异性引物、dNTP、NTP、6.4U的AMV反转录酶、0.08U大肠杆菌(Escherichia coli)RNA酶H和32U的T7RNA聚合酶。在41℃下于201的总体积中进行扩增120min。

在相关方法中，自我持续序列复制(3SR)反应，使用3种酶活性体外恒温扩增DNA或RNA靶序列：反转录酶、DNA依赖性RNA聚合酶和大肠杆菌核糖核酸酶H。通过使用人免疫缺陷病毒(HIV)-1反转录酶代替禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶将这种方法由3-酶系统改为2-酶系统，以允许用T7RNA聚合酶扩增，但是不用大肠杆菌核糖核酸酶H。与3-酶3SR相比，在2-酶3SR中，获得呈纯净形式的扩增RNA(Gebinoga和Oehlenschlager European Journal ofBiochemistry,235:256-261,1996)。

SDA是恒温核酸扩增方法。含限制位点的引物退火为模板。然后使扩增引物退火为5'相邻序列(形成缺口)并且在固定温度下开始扩增。用限制酶使新合成的DNA链带缺口并且再次开始聚合酶扩增，置换新合成的链。可根据Walker等，PNAS,89:392-6(1992)进行SDA。简言之，SDA反应混合物含有4种SDA引物dGTP、dCTP、TTP、dATP、150U的Hinc II和5U缺乏大肠杆菌DNA聚合酶I(exo.sup.-克列诺聚合酶(Klenow polymerase))大片段的核酸外切酶。添加酶之前，95℃加热样品混合物4min以使靶DNA变性。添加两种酶之后，在37℃下于50μl总体积中进行扩增120min。然后，通过在95℃下加热2min终止反应。

自返式DNA扩增(BDA)是其中聚合酶从单个引物结合位点开始延伸，然后围绕另一条产生环，最终回到DNA上的初始引发位点的方法。BDA通过使用单个引物而不同于PCR。这种方法牵涉核酸内切酶消化样品DNA、产生带黏性末端的离散DNA片段、连接所述片段与“适配子”多聚核苷酸(由可连接末端和由间隔序列分隔开的第一和第二自我互补序列构成)，从而形成连接的双链体。连接的双链体变性形成寡核苷酸引物在目标靶序列或标记序列内的特定序列处退火的模板。引物经DNA聚合酶延伸形成双链体产物，接着双链体产物变性。进行后续多次循环的退火、延伸和变性以达到所需扩增程度(美国专利No.5,470,724)。

Q-β复制系统使用RNA作为模板。Q-β复制酶合成大肠杆菌噬菌体Qβ的单链RNA基因组。当RNA经Q-β复制酶复制时，裂解RNA并连接在目标核酸中使该序列复制(Kramer和Lizardi TrendsBiotechnol.19919(2):53-8,1991)。

各种扩增酶在本领域中众所周知并且包括，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、Q-β复制酶、热稳定性DNA和RNA聚合酶。因为这些和其它扩增反应受酶催化，所以在一步测定法中，如果最终检测将基于扩增，则核酸释放剂和检测剂不应为扩增酶的潜在抑制剂。

扩增核酸样品中的核酸分子可导致核酸样品中至少0.01％的核酸序列，核酸样品中至少0.1％的核酸序列，核酸样品中至少1％的核酸序列，核酸样品中至少5％的核酸序列，核酸样品中至少10％的核酸序列，核酸样品中至少20％的核酸序列，核酸样品中至少30％的核酸序列，核酸样品中至少40％的核酸序列，核酸样品中至少50％的核酸序列，核酸样品中至少60％的核酸序列，核酸样品中至少70％的核酸序列，核酸样品中至少80％的核酸序列，核酸样品中至少90％的核酸序列，核酸样品中至少95％的核酸序列，核酸样品中至少96％的核酸序列，核酸样品中至少97％的核酸序列，核酸样品中至少98％的核酸序列或核酸样品中至少99％的核酸序列复制。

以上和本文其它地方描述的各种序列表示法可(例如)用于1个靶序列、2个靶序列、3个靶序列、4个靶序列、5个靶序列、6个靶序列、7个靶序列、8个靶序列、9个靶序列、10个靶序列、11个靶序列、12个靶序列、13个靶序列、14个靶序列、15个靶序列、16个靶序列、17个靶序列、18个靶序列、19个靶序列、20个靶序列、25个靶序列、30个靶序列、40个靶序列、50个靶序列、75个靶序列或100个靶序列。序列表示法可(例如)用于至少1个靶序列、至少2个靶序列、至少3个靶序列、至少4个靶序列、至少5个靶序列、至少6个靶序列、至少7个靶序列、至少8个靶序列、至少9个靶序列、至少10个靶序列、至少11个靶序列、至少12个靶序列、至少13个靶序列、至少14个靶序列、至少15个靶序列、至少16个靶序列、至少17个靶序列、至少18个靶序列、至少19个靶序列、至少20个靶序列、至少25个靶序列、至少30个靶序列、至少40个靶序列、至少50个靶序列、至少75个靶序列或至少100个靶序列。

序列表示法可(例如)用于1个不同靶序列、2个不同靶序列、3个不同靶序列、4个不同靶序列、5个不同靶序列、6个不同靶序列、7个不同靶序列、8个不同靶序列、9个不同靶序列、10个不同靶序列、11个不同靶序列、12个不同靶序列、13个不同靶序列、14个不同靶序列、15个不同靶序列、16个不同靶序列、17个不同靶序列、18个不同靶序列、19个不同靶序列、20个不同靶序列、25个不同靶序列、30个不同靶序列、40个不同靶序列、50个不同靶序列、75个不同靶序列或100个不同靶序列。序列表示法可(例如)用于至少1个不同靶序列、至少2个不同靶序列、至少3个不同靶序列、至少4个不同靶序列、至少5个不同靶序列、至少6个不同靶序列、至少7个不同靶序列、至少8个不同靶序列、至少9个不同靶序列、至少10个不同靶序列、至少11个不同靶序列、至少12个不同靶序列、至少13个不同靶序列、至少14个不同靶序列、至少15个不同靶序列、至少16个不同靶序列、至少17个不同靶序列、至少18个不同靶序列、至少19个不同靶序列、至少20个不同靶序列、至少25个不同靶序列、至少30个不同靶序列、至少40个不同靶序列、至少50个不同靶序列、至少75个不同靶序列或至少100个不同靶序列。

检测

可使用任何核酸检测技术检测扩增产物。对于实时检测而言，在扩增期间检测扩增产物和扩增进度。使用荧光变化探针和荧光变化引物的一种或多种或其中一种或组合有效地实现实时检测。可使用其它检测技术，单独地或与实时检测和/或牵涉荧光变化探针和引物的检测结合。已知许多技术用于检测核酸。也可使用任何适合技术测定扩增序列的核苷酸序列。

例如，可通过各种众所周知的方法中的任一种，例如电泳(例如，凝胶电泳或毛细管电泳)检测核酸产物。可使扩增片段经受其它检测(例如)变异序列(例如，单核苷酸多态性(SNP))的方法。示例性方法为单核苷酸引物延伸(Lindblad-Toh等，Large-scale discovery andgenotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse.NatureGenet.2000年4月；24(4):381-6)。在该反应中，将寡核苷酸引物设计为具有为特异性突变位点5'的一个核苷酸的3'末端。在一些实施方案中，延伸引物标记有标签或结合对的成员以使得在固相上捕获引物。在特定实施方案中，引物标记有不同长度的非特异性多聚核苷酸(例如，聚GACT)以使得在单次反应中多重检测优选2个或更多个，更优选3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，甚至10个或更多个不同突变(多态性)。在一个或多个标记ddNTP和DNA聚合酶的存在下，引物与PCR扩增子杂交。聚合酶使引物延伸一个核苷酸，向延伸引物的3'末端添加单个标记ddNTP。添加双脱氧核苷酸终止链伸长。如果在反应中使用一种以上双脱氧核苷酸(例如，ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP、ddUTP等)，则可标记一种或多种。如果使用多种标记，则标记可区别，例如每一个经不同颜色的荧光染料标记。产物为标记的寡核苷酸，可基于其标记检测其中每一个。检测变异序列的其它方法包括READIT SNP基因分型系统(Promega Corporation,Madison Wis.)和寡核苷酸连接测定法。

实施例

实施例I：用于疟原虫的引物

设计Tm低于55℃反应温度2-5℃的捕获序列。设计Tm低于反应温度10℃左右的引物序列。使用连接引物5’末端与探针5’末端的接头(见图5)。

3′TCGCTACGCA 5′(SEQ ID NO：1)[间隔区18][间隔区18][间隔区18]5′[T(FAM)]ACGGTGAACTCTCA[DABCYL]3′(SEQ ID NO：2)

3′TCGCTACGCA 5′(SEQ ID NO：3)[间隔区18][间隔区18][间隔区18][间隔区18]5′[T(FAM)]

ACGGTGAACTCTCA[DABCYL]3′(SEQ ID NO：4)

3′TCGCTACGCA 5′(SEQ ID NO：5)[间隔区18][间隔区18][间隔区18][间隔区18]5′[T(FAM)]

TCTAACGGTGAACTC[DABCYL]3′(SEQ ID NO：6)

常规引物用于反向引物并且使用仅使用常规引物用于正向引物和使用快速探针进行检测的对照。用最终MgCl2浓度为5mM的GoTaq DNA主混合物，使引物进行实时PCR反应。最终引物浓度为250nM。反应条件为95℃，20s，接着是95℃，1s和55℃，20s循环45次。

3种协同引物全部生成可检扩增子并且具有来自标记捕获序列的可检信号。引物和捕获序列之间没有间距的协同引物扩增效率低于其它引物。

以50℃的退火/延伸温度重复相同实时PCR反应。对于3种协同引物全部而言，由标记捕获序列产生的信号较强。实时PCR效率在较低温度下似乎并未提高。

实施例2：高Tm捕获序列

设计Tm高于55℃反应温度7-10℃的标记捕获序列。制备具有Tm低于反应温度约2℃的未标记捕获序列的反向协同引物。设计Tm低于反应温度7-10℃的引物序列。

3′TCGCTACGCA 5′(SEQ ID NO：7)[间隔区18][间隔区18][间隔区18]5′[T(FAM)]

ACGGTGAACTCTCATTCCA[DABCYL]3′(SEQ ID NO：8)

3′TCGCTACGCA 5′(SEQ ID NO：9)[间隔区18][间隔区18][间隔区18]5′[T(FAM)]

ACGGTGAACTCTCATTCCA CCG[DABCYL]3′(SEQ ID NO：10)

3′ATTGACATACCTGC 5′(SEQ ID NO：11)[间隔区18][间隔区18][间隔区18]5′

AGCAAGTGGAATGTT[Phos]3′(SEQ ID NO：12)

用最终MgCl2浓度为5mM的GoTaq DNA主混合物，使引物进行实时PCR反应。最终引物浓度为250nM。反应条件为95℃，20s，接着是95℃，1s和55℃，20s循环50次。以40s的延伸步骤重复实时PCR反应。

具有高Tm捕获序列的协同引物具有与来自实施例1的低Tm捕获序列类似的扩增效率和荧光变化。增加延伸似乎并未增加扩增效率。

实施例3：引物-二聚体的消除

对于协同引物和正常引物，合成引物-二聚体。向含有60个拷贝的疟原虫DNA的反应掺入0、600、6,000或600,000个引物-二聚体。用最终MgCl₂浓度为5mM的GoTaq DNA主混合物，使引物进行实时PCR反应。最终引物浓度为250nM。反应条件为95℃，20s，接着是95℃，1s和55℃，20s循环50次。

未掺入引物-二聚体时，用正常引物的对照具有易于可见的阳性。然而，掺入少至600个引物-二聚体，信号消失，导致假阴性。相比之下，即使掺入多达600,000个引物-二聚体，协同引物也没有信号阻尼或扩增产物损失。

当用PCR产物跑2.2％Lonza闪胶时，凝胶确认了对于协同引物而言，未扩增引物-二聚体的事实。然而，正常引物明显扩增了引物-二聚体，而不是疟原虫DNA，导致假阴性。

实施例4：引物上具有检测机制的协同引物

制备引物上具有检测机制的协同引物：

3′[间隔区3]TTGTAAGGTGAACGA 5′(SEQ ID NO：13)5′[间隔区18][T(FAM)]

actgtatgg[T(BHQ-1)][间隔区9]CGTCCATACAGTTA 3′(SEQ ID NO：14)

3′[间隔区3]TTGTAAGGTGAACGA 5′(SEQ ID NO：15)5′[间隔区9][间隔区18][T(FAM)]atggacg[T(BHQ-1)][间隔区9]CGTCCATACAGTTA 3′(SEQ ID NO：16)

3′[间隔区3]TTGTAAGGTGAACGA 5′(SEQ ID NO：17)5′[T(FAM)][间隔区3]taactgtatg[T(BHQ-1)][间隔区18]CGTCCATACAGTTA 3′(SEQ ID NO：18)

3′[间隔区3]TTGTAAGGTGAACGA 5′(SEQ ID NO：19)[间隔区9][T(FAM)]actgtatgg[T(BHQ-1)][间隔区18]CGTCCATACAGTTA 3′(SEQ ID NO：20)

3′[间隔区3]AGATTGTAAGGTGAACGA 5′(SEQ ID NO：21)5′[间隔区18][T(FAM)]

actgtatgg[T(BHQ-1)][间隔区9]CGTCCATACAGTTA 3′(SEQ ID NO：22)

3′[间隔区3]TTGTAAGGTGAACGA 5′(SEQ ID NO：23)5′[间隔区18][T(FAM)]

actgtatgg[T(BHQ-1)][间隔区9]CGTCCATACAGTTAT 3′(SEQ ID NO：24)

实施例5：标记捕获序列

通过用最终浓度为250nM的每种引物(PfcF inv、PfcF inv62、PfcFinv62HP或PfcF和PfcR)、最终浓度为5mM的MgCl₂和附加0.25U/个反应的GoTaq聚合酶(Promega)，于GoTaq无色主混合物(Promega)中制备主混合物，进行恶性疟原虫实时PCR。向每个反应添加5,000,000、600,000、50,000、500或0个拷贝的模板。反应在ABIStepOne上进行并且包括在95℃下的20s变性步骤，接着是95℃，1s和55℃，20s循环45次。每个反应进行两次。

已经证明协同引物能够有效扩增并且可消除来自引物-二聚体的干扰，我们试图将探针并入引物。这通过标记捕获序列进行。首先，将反向引物连接到Tm低于和高于反应温度的捕获序列的5’末端，包括有发夹形成的捕获序列，以促进对荧光团的更强淬灭(Pf cF inv、PfcF inv 62和Pf cF inv 62HP)。然而从这些引物观察到很少信号并且电泳凝胶显示，极少引物正在裂解捕获序列(图8-协同引物扩增子下的几乎看不见的条带)。

据信，来自接头的构象染剂提升捕获序列的5’末端并且使聚合酶置换序列而不是裂解序列。相比之下，如果染剂从5’末端移到3’末端(例如，通过改变接头连接的位置)，聚合酶可能以更高效率裂解捕获序列。测试这种假说时，荧光信号急剧上升(图8)。即使标记捕获序列的Tm低于反应温度，但是信号仍比来自正常杂交探针的信号高2.5倍。

实施例6：SNP区分

通过用最终浓度为250nM的每种引物/探针(MTb cF、MTb P和MTb cR1、MTb cR2、MTb cR3、MTb cR4、MTb cR5、MTb cR6、MTb cR7、MTb cR8或MTb cR9其中之一)、最终浓度为5mM的MgCl₂和附加0.25U/个反应的GoTaq聚合酶(Promega)，于GoTaq无色主混合物(Promega)中制备主混合物，进行对赋予利福平抗性的rpoB基因中D516V突变的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)实时PCR。向每个反应添加50,000个拷贝的模板(MTb WT或MTb D516V)。每个反应进行两次。反应在ABI 7500上进行并且包括在95℃下的20s变性步骤，接着是95℃，3s和55℃，3s循环45次。由机器以阈值10,000自动测定Ct并且从输出数据的第45次循环取ΔRn。

最后，分析这些有效、无引物-二聚体的协同引物区分SNP的能力。为rpoB基因D516V突变设计协同引物，在印度其存在于多达7.4％的利福平抗性结核分枝杆菌分离株中。采用两种不同策略：1)ARMS方法和2)标记捕获序列区分。两种方法均产生与标准引物和探针类似的区分SNP的能力(图9和表1中的数据汇总)。

对于基于探针的方法，协同引物MTb cR6在突变体和野生型菌株之间产生最佳荧光信号比。对于基于ARMS的方法，MTb cR8产生最佳Ct值差。二者均示于图9中。

表1

表1示出SNP区分方法的概要。每种引物均连接在一起，而无论其使用基于ARMS还是探针(标记捕获序列)的区分，引物或探针的预测Tm高于或低于反应温度的度数(低于反应温度的值为红色字体并且在括号内)，突变体与野生型Ct值之差和突变体与野生型荧光之比。

应理解，公开的方法和组合物不限于描述的特定方法论、规程和试剂，因为它们可变。还应理解，本文使用的术语是仅仅是为了描述特定实施方案，而非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求限制。

必须指出的是，如本文和所附权利要求中所使用，除非上下文中另有明确规定，单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提到“一个引物”包括多个此类引物，提到“所述引物”是提到一个或多个引物和本领域中技术人员已知的其等效物，等等。

“任选”或“任选地”意指随后描述的事件、情形或材料可能或可能不出现或存在，并且描述包括所述事件、情形或材料出现或存在的情况和不出现或不存在的情况。

本文可将范围表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一特定值。在表示这样一个范围时，除非上下文另外特别说明，也特别考虑和视为公开了从所述一个特定值和/或到另一特定值的范围。类似地，当使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解除非上下文另外特别指出，特定值形成了应视为公开的另一特别考虑的实施方案。应进一步理解，除非上下文另外特别指出，每个范围的端点相对于另一端点和独立于另一端点均很重要。最后，应理解除非上下文另外特别指出，还特别考虑了明确公开范围内所含的所有单值和值的子区间并且应视为公开。无论是否在特定情况下，明确公开了这些实施方案中的一些或全部，前述均适用。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与公开方法和组合物所属领域中技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等效的任何方法和材料均可用于本发明和组合物的实践或试验中，但是特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物和因为其引用出版物的材料特别以引用的方式并入。不得将本文任何内容解释为承认无权凭借先前发明使本发明先于此公开。

本领域的技术人员将认识到或能够确定仅仅使用常规实验、本文所述方法和组合物的特定实施方案的许多等效方案。这种等效方案旨在为下列权利要求所涵盖。

Claims (20)

1.一种协同核酸分子，其包含：

a.第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与靶核酸的第一区域互补，并且其中所述第一核酸在3’末端可延伸；

b.第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与所述靶核酸的第二区域互补，使得其在所述靶核酸的存在下与所述第一核酸序列3’末端下游的所述靶核酸杂交；

c.接头，其以允许所述第一核酸序列和第二核酸序列同时与所述靶标杂交的方式连接所述第一核酸序列和第二核酸序列。

2.根据权利要求1所述的协同核酸分子，其中在所述第二核酸分子不与所述靶标杂交的情况下所述第一核酸分子不会与所述靶标杂交。

3.根据权利要求1所述的协同核酸分子，其中在所述第一核酸分子不与所述靶标杂交的情况下所述第二核酸分子不会与所述靶标杂交。

4.根据权利要求1所述的协同核酸分子，其中在两者之一不与所述靶标杂交的情况下所述第一核酸分子和第二核酸分子均不会与所述靶标杂交。

5.根据权利要求1所述的协同核酸分子，其中与没有所述第二核酸序列与之连接的第一核酸序列的独立Tm相比，所述第一核酸分子的有效解链温度(Tm)增加至少1℃。

6.根据权利要求1所述的协同核酸分子，其中所述协同核酸分子包含标记。

7.根据权利要求6所述的协同核酸分子，其中所述第二核酸序列包含标记。

8.一种合成核酸的方法，所述方法包括：

a.使靶核酸接触

b.协同核酸分子，其包含：

i.第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与靶核酸的第一区域互补，并且其中所述第一核酸在3’末端可延伸；

ii.第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与所述靶核酸的第二区域互补，使得其与所述第一核酸序列3’末端下游的所述靶核酸杂交；

iii.接头，其以允许所述第一核酸序列和第二核酸序列同时与所述靶标杂交的方式连接所述第一核酸序列和第二核酸序列；

c.和提供适于核酸合成的条件，从而合成核酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述协同核酸分子包含标记。

10.根据权利要求8所述的方法，其中提供一种以上具有不同序列的协同核酸分子。

11.一种检测靶核酸的方法，所述方法包括：

a.使含有所述靶核酸的样品接触

b.协同核酸分子，其包含：

i.第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与靶核酸的第一区域互补，并且其中所述第一核酸在3’末端可延伸；

ii.第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与所述靶核酸的第二区域互补，使得其与所述第一核酸序列3’末端下游的所述靶核酸杂交；

iii.接头，其以允许所述第一核酸序列和第二核酸序列同时与所述靶标杂交的方式连接所述第一核酸序列和第二核酸序列；

c.和检测所述靶分析物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述标记与所述第二核酸序列连接。

13.根据权利要求12所述的方法，其中信号的变化源于由核酸酶裂解所述第二核酸序列引起的信号变化。

14.一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求1所述的协同核酸分子；

b)提供靶核酸；和

c)在用于扩增的适当条件下扩增所述靶核酸

根据权利要求14所述的方法，其中所述第一核酸序列为引物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二核酸序列为探针。

16.根据权利要求14所述的方法，其中提供一种以上具有不同序列的协同核酸分子。

17.根据权利要求14所述的方法，其中没有所述第二核酸序列与之连接的所述第一核酸序列为正常引物。

18.一种检测核酸的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求1所述的协同核酸分子，其中所述协同核酸分子包含可检标记；

b)提供靶核酸；和

c)检测所述靶核酸。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可检标记与所述第一核酸序列连接。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述可检标记与所述第二核酸序列连接。