KR20150036537A - 공조 프라이머, 프로브 그리고 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

핵산을 증폭시키고 탐지하는 것과 관련된 조성물 및 방법이 공개된다.

Description

공조 프라이머, 프로브 그리고 이의 용도{COOPERATIVE PRIMERS, PROBES, AND APPLICATIONS THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 7월 17일자로 제출된 U.S. 가출원 번호 61/672,329, 그리고 2012년 12월 3일자로 제출된 U.S. 가출원 번호 61/732,537을 우선권으로 주장하며, 이둘 모두는 전문이 본 명세서에서 참고 자료로 편입된다.
발명의 분야
본 공개된 발명은 일반적으로 본 내용에서 핵산 증폭 분야다.
발명의 배경
핵산 테스팅에서 후속 테스트의 실행을 위한 충분한 농도 및/또는 순도를 획득하기 위하여 핵산의 증폭이 대개 필요하다. 때로 핵산의 증폭은 비-핵산, 이를 테면 단백질의 탐지에 있어서 대리물질로 이용된다. 핵산 증폭/연장 반응의 대부분은 3＇ 단부에서 중합효소 존재 하에 연장을 허용하는 변형된 또는 천연 핵산으로 구성된 프라이머의 존재에 따라 달라진다.
이러한 증폭 반응의 공통적인 문제는 프라이머-이합체들이 존재한다는 점이다. 프라이머들이 표적 핵산이 아닌 서로의 프라이머를 연장시킬 때 프라이머-이합체들이 형성된다. 프라이머-이합체들이 프라이머들을 이용하면, 반응에서 불순물이 존재하게 된다. 더욱 심한 경우, 프라이머-이합체들은 충분한 양의 프라이머들을 이용할 수 있고, 이는 일부 경우에서 가음성(false negatives)을 야기한다. 또는, 프로브, 프라이머-이합체들과 반응된다면, 가양성(false positives)이 야기될 수 있다.
왁스 재료 안에 중합효소가 현탁되거나, 항체에 의해 중합효소가 억제되거나, 중합효소가 화학적 변형되거나, 프라이머들이 격리되는 것이 포함된 프라이머-이합체들의 문제를 다루는 다양한 핫 스타트(hot starts) 및 다른 다양한 방법들이 개발되어왔다. 이런 모든 방법들에 의해 이 문제는 증폭/연장의 제 1 라운드 이전에만 유효하다. 그 다음 형성되는 임의의 프라이머-이합체들은 기하급수적 속도로 증폭된다.
프라이머-이합체들을 다루는 다른 방법들은 네스티드(nested) PCR과 같은 방법들을 포함한다. 그러나, 이 방법은 2개의 별개 반응을 요구하고, 오염 가능성은 증가된다.
많은 증폭/연장 반응은 탐지 프로브와 또한 결합된다. 원리는 대개 라벨된 선형 프로브, 이를 테면 Taqman 또는 라벨된 헤어핀 프로브 이를 테면 Molecular Beacons 중심으로 돌아간다. 일부 방법들은 공조적으로 연결되는 2개의 프로브, 이를 테면 Tentacle 프로브의 이용을 통하여 굉장한 특이성이 획득된다. 그러나, 이러한 프로브 기반 방법은 야생형의 상당한 배경내에서 돌연변이체를 탐지하는데 제한된다. 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphisms) 및 다른 돌연변이들 모두를 탐지하거나 아무것도 탐지 못하는 동안, 이들은 약 10 내지 20개의 야생형 서열의 배경중 약 한 개의 돌연변이체만을 골라낼 수 있다. 그 이유는 프라이머들이 야생형과 돌연변이형 모두를 증폭시킬 수 있고, 이둘 모두를 탐지하는 능력없이 격감되기 때문이다. 이 문제를 어느 정도 해결하기 위하여 ARMS와 같은 방법들은 프로브 탐지 기술과 복합될 수 있지만, 동일한 일반 영역에서 하나 이상의 돌연변이가 발생될 때 실시간(real-time) 탐지를 위하여 효과적으로 다중화(multiplexed) 될 수 없다.
탐지 기전, 이를 테면 Amplifluor 프라이머들, Rapid Detex 프라이머들 그리고 Scorpion 프라이머들이 포함된 몇 가지 프라이머들이 개발되어왔다. 처음 2개는 서열 특이적이지 못하기 때문에 특히 프라이머-이합체 문제로 인하여 가양성(false positives)화 되는 경향이 있다. 후자는 프로브가 핵산 주형보다는 프라이머 연장 산물에 결합되는 자가-프로빙(self-probing) 프라이머다. 이것은 서열 특이적 프로브를 보유하기 때문에, 가양성(false positives)이 될 가능성은 적지만, 그러나 여전히 프라이머-이합체 연합 문제를 겪는다.
발명의 간단한 요약
다음을 포함하는 공조(cooperative) 핵산 분자가 공개된다: a) 핵산 서열, 여기에서 제 1 핵산 서열은 표적 핵산의 제 1 영역(region)에 실질적으로 상보적이며, 그리고 제 1 핵산 서열은 3＇ 단부에서 연장가능하며; b) 제 2 핵산 서열, 여기에서 제 2 핵산 서열은 표적 핵산의 제 2 영역에 실질적으로 상보적이며; 여기에서 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열은 서로 붙어 있고, 제 2 핵산 서열은 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부의 하류 표적 핵산 서열에 혼성화된다.
표적 핵산을 증폭시키는 방법이 더 공개되는데, 이 방법은 a) 본 명세서에서 공개된 공조 핵산 분자를 제공하고; b) 표적 핵산을 제공하고; 그리고 c)증폭을 위한 적절한 조건하에서 표적 핵산을 증폭시키고; 이에 따라 표적 핵산이 증폭되는 것을 포함한다.
시료 안의 핵산을 탐지하는 방법을 또한 공개하는데, 이 방법은 a) 본 명세서에서 공개된 공조 핵산 분자가 제공되고, 여기에서 공조 핵산은 탐지가능한 라벨을 포함하고; b) 표적 핵산이 제공되고; 그리고 c) 표적 핵산이 탐지되고; 이에 따라 표적 핵산이 탐지되는 것을 특징으로 한다.
도 1은 포획(capture) 서열의 5＇ 단부에 부착된 프라이머에 대해 내부 링커를 보유한 공조 프라이머들의 구체예를 보여준다. 상기 포획 서열은 표적 핵산에 결합하고, 그리고 혼성화된 포획 서열은 표적에 아주 근접하게 프라이머를 잡고 있다. 이 프라이머는 연장되고, 포획 서열은 절단된다.
도 2는 프라이머의 5＇ 단부를 포획 서열의 3＇ 단부에 연결시키는 링커를 보유한 공조 프라이머들의 또다른 구체예를 보여준다. 상기 포획 서열은 표적 핵산에 결합된다. 혼성화된 포획 서열은 표적에 아주 근접하게 프라이머를 잡고 있다. 이 프라이머는 연장되고, 포획 서열은 절단된다.
도 3은 포획 서열의 5＇ 단부가 프라이머의 5＇ 단부에 연계된 공조 프라이머의 바람직한 구체예를 보여준다. 상기 포획 서열은 표적 핵산에 결합된다. 혼성화된 포획 서열은 표적에 아주 근접하게 프라이머를 잡고 있다. 이 프라이머는 연장되고, 포획 서열은 절단된다.
도 4는 이중 라벨된 프로브들, 헤어핀 프로브들 그리고 단일 라벨 프로브들이 포함되나 이에 국한되지 않는 프라이머에 연계될 수 있는 프로브들의 예시를 나타낸다.
도 5는 이중 라벨된 프로브에 연계된 공조 프라이머를 이용하여 핵산 연장을 탐지하는 바람직한 구체예를 보여준다. 프로브는 표적 핵산에 결합하고, 그리고 혼성화된 프로브는 표적에 아주 근접하게 프라이머를 잡고 있다. 이 프라이머는 연장되고, 프로브는 절단되고, 형광은 증가하게 된다.
도 6은 공조 프라이머들과 통상(Normal) 프라이머들의 겔을 보여준다. 통상 프라이머들은 P-D가 들어있지(spiked in) 않을 때에도 일부 프라이머-이합체(P-D)가 형성되지만, 말라리아 DNA의 60개 출발 복사체의 증폭은 여전히 보유한다. 600개 P-D가 들어있는 경우, 말라리아 증폭 산물은 가려지고(eclipsed), 오직 P-D만이 증폭된다. 대조적으로, 공조 프라이머들은 최대 600,000개 P-D가 들어있을 때 조차도 프라이머-이합체 증폭을 보유하지 않는다. P-D는 표적 핵산의 공조 프라이머 증폭을 간섭하지 않는다.
도 7은 공조 프라이머들에서 이용될 수 있는 탐지 기전에서 구축된 일부 프라이머들의 예를 보여준다.
도 8은 혼입된(integrated) 프로브들을 가진 공조 프라이머들을 보여준다. 라벨된 공조 프라이머들 또는 통상적 혼성화(hybridization) 프로브들은 5,000,000개, 50,000개, 500개 또는 0개의 복사체 P. 팔시파룸(P. falciparum) 주형의 실시간 탐지에 이용되었다. 공조 프라이머들안에 라벨된 포획 서열은 포획 서열이 반응 온도보다 낮은 Tm을 가질 때 조차도 통상적 혼성화 프로브들보다 2.5x 더 높은 형광 신호를 가진다.
도 9는 공조 프라이머들의 SNP 차별(diffentiation )을 보여준다 . 공조 프라이머들은 포획 서열 (9A) 하에 프로브 기반 차등과 SNP를 이용하여 리팜피신 저항성을 야기하는 rpoB D516V SNP를 가진 투베르쿨로시스 복합체와 SNP 없는 복합체 그리고 프라이머의 3＇ 단부 하에 SNP와 ARMS 기반 방법을 이용한 것들 사이에서 차등적이다 (9B).
공개된 방법은 핵산 서열과 전체 게놈 또는 다른 고도의 복합 핵산 시료들을 증폭시키는 특정 재료 및 과정을 이용한다. 이들 재료 및 과정은 하기에서 상세하게 설명된다.
정의
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다름의 정의는 관련 분야에서 정의를 보충하고, 본 출원에 관련되지만, 임의의 관련된 또는 무관한 경우, 예를 들면, 임의의 통상적으로 소유된 특허 또는 출원에 귀속되지 않는다. 비록 본 명세서에서 설명된 것과 유사한 또는 등가의 임의의 방법 및 재료들이 본 발명의 테스트에 이용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법들이 본 명세서에서 공개된다. 따라서, 본 명세서에서 이용된 용어는 특정 구체예들만을 설명하기 위한 것이며, 이에 제한시키려는 의도는 없다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂핵산 서열＂은 핵산 가닥을 따라 뉴클레오티드들의 순서 또는 서열을 말한다. 일부 경우들에 있어서, 이들 뉴클레오티드의 순서는 대응하는 폴리펩티드 쇄를 따라 있는 아미노산의 순서를 결정할 수 있다. 따라서 핵산 서열은 아미노산 서열을 코드한다. 핵산 서열은 명시된 바와 같이 단일-가닥으로 된 또는 이중-가닥으로 된 서열, 또는 이중-가닥으로 된 서열과 단일-가닥으로 된 서열 둘 모두의 일부분을 포함한다. 핵산 서열은 DNA, 게놈 및 cDNA, RNA, 또는 하이브리드를 포함할 수 있고, 여기에서 서열은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 임의의 조합, 그리고 우라실 (U), 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C), 구아닌 (G), 이노신, 산틴 하이포산틴, 이소시토신, 이소구아닌, 등이 포함된 임의의 염기 조합을 포함한다. 잠김(locked) 핵산, 펩티드 핵산 그리고 당업계 숙현자들에게 공지된 기타의 것들이 포함된 변형된 염기를 포함할 수 있다.
＂올리고뉴클레오티드＂는 2개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리머다. 폴리머는 추가적으로 비-뉴클레오티드 요소들 이를 테면 라벨들, 소광제(quenchers), 차단기들(blocking groups), 또는 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드는 천연 또는 비-천연적이며, 그리고 치환안된, 변형안된, 치환된 또는 변형된 것일 수 있다. 뉴클레오티드들은 포스포디에스테르 결합들(bonds), 또는 포스포로티오에이트 링키지(linkages), 메틸포스포네이트 링키지, 보라노포스페이트 링키지, 또는 이와 유사한 것들에 의해 연계될 수 있다.
＂펩티드 핵산＂ (PNA)은 2개 또는 그 이상의 펩티드 핵산 단량체들을 포함하는 폴리머다. 폴리머는 요소들 이를 테면 라벨들, 소광제(quenchers), 차단기들(blocking groups), 또는 이와 유사한 것들을 추가로 포함할 수 있다. PNA의 단량체들은 치환안되거나, 변형안되거나, 치환되거나 또는 변형될 수 있다.
＂공조 핵산＂은 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열이 최소한으로 혼합된 핵산 서열을 의미하는데, 여기에서 제 2 핵산 서열은 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부 하류의 표적 핵산에 혼성화된다. 본 명세서 도처에서 논의되는 바와 같이, 핵산의 3＇ 단부는 연장될 수 있다. 한 가지 실시예에 있어서, 제 1 핵산은 프라이머이고, 그리고 제 2 핵산은 포획 서열이다. 제 1과 제 2 핵산 서열은 예를 들면 링커에 의해 구별될 수 있다.
＂프라이머＂는 주형 핵산 가닥의 영역에 상보적인 서열을 포함하고, 주형(또는 이의 일부)에 상보적인 가닥의 합성을 준비시키는 핵산이다. 프라이머들은 전형적으로 상대적으로 짧고, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 (전형적으로, 데옥시리보뉴클레오티드)들이지만, 반드시 그렇지는 않는다. 증폭, 예컨데, PCR 증폭에서 한 쌍의 프라이머들은 전형적으로 증폭되는 핵산 표적의 2개 상보적 가닥의 5＇ 단부를 특정짓는다. ＂공조 프라이머,＂ 또는 제 1 핵산 서열은 포획 서열로도 또한 불리는 제 2 핵산 서열에 링커를 통하여 부착된 프라이머를 의미한다. 제 2 핵산 서열, 또는 포획 서열은 프라이머, 또는 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부 하류의 주형 핵산에 혼성화될 수 있다. ＂통상적 프라이머＂는 링커를 통하여 부착된 포획 서열, 또는 제 2 핵산 서열을 보유하지 않는 프라이머를 의미한다.
＂제 2 핵산 서열＂이라고도 불리는 ＂포획 서열＂은 제 1 핵산 서열, 또는 프라이머 서열이 표적 핵산의 표적 영역에 근접되는 것을 허용하는 서열을 말한다.
＂하류(downstream)＂는 핵산 합성 또는 연장 동안 중합 효소의 작용과 관련된다. 예를 들면, Taq 중합효소가 프라이머를 연장시킬 때, 이 효소는 프라이머의 3＇ 단부에 염기를 추가하고, 프라이머의 3＇ 단부로부터 ＂하류＂인 서열 쪽으로 이동될 것이다.
＂표적 영역＂은 증폭되거나, 탐지되거나, 또는 증폭 및 탐지되는 표적 핵산의 영역이다.
핵산 듀플렉스의 ＂Tm＂ (용융 온도)은 명시된 조건하에서 핵산 서열의 절반이 해리되고, 절반은 연합되는 온도를 말한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂단리된 Tm＂은 공조 쌍에서가 아닌 공조 핵산에서 제 1 또는 제 2 핵산 서열의 개별 용융 온도를 말한다. ＂효과적인 Tm＂은 함께 연계되어 있을 때 제 1 또는 제 2 핵산의 결과적으로 초래된 용융 온도를 말한다.
용어 ＂링커＂는 제 1 핵산과 제 2 핵산을 서로 연결시키는 조성물을 말한다. 링커는 최소한 한 개의 연장불가능한 모이어티를 포함하지만, 연장가능한 핵산을 또한 포함할 수 있고, 그리고 임의의 길이를 가질 수 있다. 이 링커는 3＇ 단부, 5＇ 단부에 연결되거나, 또는 제 1과 제 2 핵산 서열 모두의 단부로부터 하나 또는 그 이상의 염기(＂중간＂)에 연결될 수 있다. 이러한 연결은 공유, 수소 결합, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 그리고 이와 유사한 것들일 수 있다. 용어 ＂연장불가능한＂이란 고유의 Taq 중합효소가 모이어티를 인지하지 못하여, 이에 따라 핵산 합성을 지속하지 못하는 능력을 말한다. 수 많은 천연 핵산 염기 및 변형된 핵산 염기는 중합효소에 의해 인지되며, 그리고 ＂연장가능하다.＂ 연장불가능한 모이어티의 예로는 무엇보다도 형광단, 소광제, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르 그리고 당분야의 숙련자에게 공지된 기타의 것들을 포함한다. 일부 경우들에 있어서, 역방향 (예컨데 5＇ ACGT 3＇ 3＇A 5＇ 5＇ AAGT 3＇)의 핵산 염기 또는 그 외의 것들은 Taq 중합효소가 ＂연장불가능한＂ 것으로 간주하여 연장시킬 수 없는 것들이다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이 용어 ＂비-핵산 링커＂는 제 1 핵산을 제 2 핵산에 공유적으로 부착시킬 수 있는, 또는 더 구체적으로, 프라이머를 포획 서열에 부착시킬 수 있는 반응성 화학기를 말한다. 적합한 유연성 링커는 전형적으로 최소한 한 개 또는 두 개의 원자의 선형 분자 쇄, 더욱 전형적으로 길이가 1 내지 12개인 탄소 원자(및/또는 다른 기본골격 원자)의 유기 폴리머 쇄가 된다. 예시적인 유연성 링커들은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂상보적인(complementary)＂ 또는 ＂상보성(complementarity)＂은 폴리뉴클레오티드 분자에 있는 뉴클레오티드가 제 2 폴리뉴클레오티드 분자에 있는 또다른 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하는 능력을 말한다. 예를 들면, 서열 5＇-A-C-T-3＇는 서열 3＇-T-G-A-5＇에 상보적이다. 상보성은 뉴클레오티드중 단지 일부만이 염기 쌍형성에 따라 정합되는 부분적인 상보성일 수 있거나, 또는 모든 뉴클레오티드가 염기 쌍형성에 따라 완전하게 정합되는 완전한 상보성일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, ＂실질적으로 상보적인＂은 표적 염기쌍 영역 길이를 따라 90% 또는 그 이상의 동일성을 말한다. 상보성은 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보적인, 또는 이 값 아래에 있는 임의의 양 또는 이 양들 사이에 있는 임의의 양이 또한 될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂증폭하다, 증폭하는, 증폭하다, 증폭된, 증폭＂이란 표적 DNA의 하나 또는 그 이상의 동일한 또는 상보적인 복사체의 창조를 말한다. 복사체는 단일 가닥으로된 또는 이중 가닥으로 된 것일 수 있다. 증폭은 다수의 공정, 이를 테면 프라이머의 연장, 역전사, 중합효소 쇄 반응, 핵산 서열화, 롤링 서클 증폭 및 이와 유사한 것들의 일부일 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂정제된(purified)＂이란 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 세포 찌꺼기, 가령 고분자량 DNA, RNA 및 단백질로부터 단리된 표적 핵산 서열을 말한다. 여기에는 DNA가 포함된 세포 찌꺼지로부터 분리될 수 있는 단리된 RNA 시료를 포함할 것이다. 이것은 또한 비-고유의, 또는 비-자연적으로 발생되는 핵산을 또한 의미할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂단백질＂, ＂펩티드＂ 및 ＂폴리펩티드＂는 호환적으로 이용되며 아미노산 폴리머 또는 2개 또는 그 이상의 상호작용하는 또는 결합된 아미노산 폴리머 세포를 말할 때 이용된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂엄격성(stringency)＂은 폴리뉴클레오티드 사이에 혼성화가 일어나는 조건, 이를 테면, 온도, 이온 강도, 용매, 그리고 이와 유사한 것들을 말한다. 혼성화(hybridization)는 증폭 공정의 어닐링 단계 동안 프라이머와 주형 DNA 사이에 일어나는 공정이다.
다양한 추가 용어들이 정의되거나 또는 본 명세서에서 특정된다.
재료 및 방법들
본 발명은 공조 핵산, 이를 테면 프라이머들과 프로브들에 관계한다. 공조 핵산은 프라이머의 3＇ 단부의 하류 주형 영역에 상보적인 제 2 폴리뉴클레오티드에 연계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다 (예를 들면, 도 1에서 볼 수 있는 것과 같다). 제 2 올리고뉴클레오티드는 포획 서열 기능을 한다. 일부 구체예들에 있어서, 공조핵산은 낮은 용융 온도 (＂Tm＂)를 가진 프라이머가 표적에 효과적으로 혼성화되는 것을 허용한다.
포획 서열은 낮은 Tm에도 불구하고 연장/증폭이 허용되도록 주형에 아주 근접하게 프라이머를 유지한다. 그러나, 포획 서열에 상보적이지 않은 비특이적 서열, 이를 테면 프라이머-이합체들은 효과적으로 연장되지 않는다. 프라이머의 3＇ 단부의 하류에 독특하기 혼성화되기 때문에, 매 주기마다 특이적 증폭이 이루어진다. 이것은 제 1 주기 후에 특이성이 사라지는 통상적인 핫 스타트(hot start) 방법과 대조적이다.
이는 이를 테면 이중 특이성 프라이머 개념과도 또한 대조적이다(US 특허 공개 20120135473, 이중 특이성 프라이머들과 관련된 교시에 대하여 이의 전문이 참고자료에 통합됨). 이중 특이성 프라이머는 이노신 잔기들을 통하여 짧은 프라이머에 연결된 포획 서열을 보유하는데, 여기에서 포획 서열은 프라이머의 5＇ 측면에 혼성화된다. 그 결과는 이중 특이성 프라이머가 증폭의 제 2 라운드에 매우 특이적라는 것이다. 그러나, 이중 특이성 프라이머들이 각각 증폭된다면, 중합효소는 5＇ 단부까지 모든 방식으로 연장되어, 그 이후 모든 라운드에서 증식될 높은 Tm 프라이머-이합체가 만들어진다. 이것은 프라이머의 3＇ 측면에서 표적에 혼성화되어, 프라이머-이합체의 증식을 허용하는데 필수적인 순서로 프라이머-이합체에 통합되는 것을 방해하는 공조 핵산과는 대조적이다.
공조 핵산과 이를 이용하는 방법은 ＂padlock 프로브들＂ (Nilsson et al. 1994: ＂Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA 탐지＂. Science 265 (5181): 2085-2088), 분자 역전 프로브 (MIPs) (Hardenbol et al 2003: ＂Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes＂. Nat Biotechnol 21 (6): 673-678) 그리고 연결자 역전 프로브 (CIPs) (Akhras et al. 2007: Hall, Neil. ed. ＂Connector inversion probe technology: a powerful one-primer multiplex DNA amplification system for numerous scientific applications＂. PLoS ONE 2 (9): e195)의 것들과 또한 상이하다. 예를 들면, 본 명세서에 공개된 프로브들은 최소한 한 개의 연장불가능한 모이어티가 있는 링커를 보유할 수 있다. 더욱이, 본 명세서에 공개된 분자는 프라이머이고, 반면 ＂padlock 프로브들＂은 결찰되고, 비-결찰된(ligated) padlock 프로브들은 분해되거나(digested) 또는 증폭되기에 앞서 제거되고, 그리고 프라이머들로 이용될 수 없다.
Padlock 프로브들은 40개-뉴클레오티드 길이의 링커 서열에 의해 표적에 연결된 상보적인 20개 뉴클레오티드 길이의 분절(segment) 2개를 가진 단일 가닥의 DNA 분자들이다. 표적 상보적인 영역들이 DNA 표적에 혼성화될 때, padlock 프로브들 또한 원형화된다. 그러나, MIP와는 달리, padlock 프로브들은 표적 상보적인 영역이 혼성화될 때 갭(gap)을 남기지 않고 전체 표적 영역에 걸쳐 있도록 기획된다. 따라서, padlock 프로브들은 공지의 서열을 가진 DNA 분자들을 탐지할 때만 유용하다.
분자 역전 프로브들은 SNP 유전자형을 실행하도록 개발되었고, 이는 프로브가 게놈 표적에 혼성화될 때, SNP 위치에서 갭이 생기도록 변형된 padlock 프로브다. SNP 위치에서 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 이용한 갭 메움은 다형성(polymorphism) 실체를 결정한다. 이러한 기획으로 좀더 통상적인 padlock 프로브 기술보다 많은 잇점을 가진다. 주어진 좌(locus)에서 SNP 카운터가 제대로 표준화되는 것을 보증하기 위하여, 타당한 SNP에 특이적인 다중 padlock 프로브들의 이용은 이들 대립형질 특이적 프로브들의 농도 균형을 상당히 요구한다.
연결자 역전 프로브는 혼성화된 프로브 단부에 의해 한계가 정해된 갭을 연장시킴으로써 MIP의 변형된 기획안을 이용하고 이를 연결자 역전 프로브 (CIP)라고 명명한다. 이 갭은 포획될 관심대상(예컨데, 엑손)의 게놈 영역에 대응한다. 갭 체움(gap filling) 반응은 4가지 뉴클레오티드 모두에서 이용가능한 DNA 중합효소로 이루어진다. 포획된 영역의 식별은 프로브들의 단부에 상보적인 표적 중 하나에 대해 그려진 좌-특이적 프라이머를 이용하여 이들을 서열화시킴으로써 실행될 수 있다.
＂프라이머 이합체＂ (PD)는 PCR에서 잠재적 부산물이다. 이의 이름으로부터 나타나는 것과 같이, PD는 다른 비특이적 상호작용을 통하여 상보적인 염기 끈으로 인하여 서로 부착(혼성화된) 프라이머 분자들로 구성된다. 그 결과, DNA 중합효소는 PD를 증폭시키고, PCR 시약들에 대하여 경쟁을 이끌고, 따라서 PCR 증폭을 표적으로하는 DNA의 증폭을 잠재적으로 억제시킨다. 실시간 PCR에 있어서, PDs는 신호 꺽기(약화), 가음성(false negatives), 가양성(false positives) 그리고 이와 유사한 것들을 통하여 정확한 정량화를 간섭한다.
본 발명은 프로브를 또한 포함하는 공조적으로 연계된 핵산에 관계된다. 이러한 변형된 프라이머/프로브는 공조 핵산과 유사하지만, 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 라벨들을 포획 서열 또는 프라이머에 추가함으로써, 이를 프로브로 돌린다. 공조 프라이머/프로브의 연장은 탐지가능하기 때문에, ARMS 기반의 방식을 이용하여 차등적 SNP를 요구하는 다중 용도가 포함된 다양한 용도에 유용할 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 프라이머와 프로브는 모두 증폭 반응에 이용되는 낮은 용융 온도를 가지도록 기획되어, 프라이머는 프로브 결합없이 증폭되지 않고, 프로브는 프라이머 결합 없이는 신호를 가지지 않을 것이다. 이로써 동일한 프라이머/프로브 조합에서 두 가지 특이성이 만들어진다.
공조 핵산, 이를 테면 본 발명의 프라이머들과 프로브들은 중합효소 쇄 반응, 롤링 서클 증폭, 핵산 서열화 그리고 다른 것들을 포함하나 이에 한정되지 않은 당업계 숙련자들에게 공지된 다양한 프라이머 연장/증폭 반응에 유용하다. 본 발명의 공조 프라이머들과 프로브들은 연장/증폭 단계 이후의 용도, 이를 테면 어레이(array)에 혼성화에 또한 유용하다. 본 발명의 공조 프라이머들/프로브들은 실질적으로 프라이머-이합체들을 감소시키기 때문에, 이들은 특히 다중화된 그리고 고도의 다중화된 반응에 유용하다.
공조 핵산의 사용으로 존재하는 프라이머-이합체의 양은 통상적 프라이머 (비-공조 핵산)이 이용될 때 존재하는 프라이머-이합체의 양과 비교하였을 때, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 % 감소될 수 있다.
따라서, 다음을 포함하는 공조 핵산 분자가 공개된다: a) 제 1 핵산 서열, 여기에서 제 1 핵산 서열은 표적 핵산의 제 1 영역에 실질적으로 상보적이며, 그리고 제 1 핵산 서열은 3＇ 단부에서 연장가능하고; b) 제 2 핵산 서열, 여기에서 제 2 핵산 서열은 표적 핵산의 제 2 영역에 실질적으로 상보적이며; 여기에서 제 1과 제 2 핵산 서열은 서로 부착되어 있고; 제 2 핵산 서열은 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부 하류 표적 핵산 서열에 혼성화되고; 제 1 핵산 분자의 효과적인 용융 온도 (Tm)는 제2 핵산 서열이 부착되지 않은 제 1 핵산 서열의 단리된 Tm과 비교하였을 때 최소한 1℃ 증가된다.
공조 핵산은 선형 또는 원형이 될 수 있다(circularized).
＂3＇ 단부에서 연장가능한＂이란 말은 제 1 핵산은 이 단부에서 증폭 또는 연장되도록 이 단부에서 자유롭다는 의미다. 이는 열 활성화가능한 프라이머들, 이를 테면 무엇보다 Lebedev et al,에서 설명된 것들이 포함된다는 의미다.
제 1 핵산 서열은 프라이머이고, 그리고 제 2 핵산 서열은 다른 말로＂포획 핵산 서열＂로 지칭된다. 제 1 또는 제 2 서열은 탐지가능한 라벨을 보유할 수 있거나, 또는 제 3 서열이 탐지가능한 라벨을 보유할 수 있다. 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열은 링커를 통하여 부착될 수 있으며, 이때 링커는 비-핵산 서열일 수 있다. 한 가지 실시예에 있어서, 링커는 제 1 핵산 서열의 5＇ 단부를 제 2 핵산 서열의 3＇ 단부에 부착시킬 수 있다. 이것은 예를 들면 도 2에서 볼 수 있다. 대안으로, 제 1 핵산 서열은 역전되어, 제 1 핵산 서열의 5＇ 단부가 제 2 핵산 서열의 5＇ 단부에 부착된다. 이것은 예를 들면 도 3에서 볼 수 있다. 또다른 실시예에 있어서, 제 2 핵산 서열의 5＇ 단부는 도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 서열의 중간에서 제 1 핵산 서열에 연계될 수 있다. ＂서열의 중간＂이란 핵산의 5＇ 단부 또는 3＇ 단부에서 제 1 핵산 서열에 연합되지 않고, 오히려 5＇ 및 3＇ 단부에 있는 뉴클레오티드의 내부에 있는 뉴클레오티드에 부착된다는 것을 말한다.
한 가지 실시예에 있어서, 공조 핵산은 동일 방향에서 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10개, 또는 이보다 적은 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 환언하면, 이것은 5＇ 에서 3＇ 방향, 또는 3＇ 에서 5＇ 로의 동일한 방향으로 절단되지 않은 단일 핵산 서열의 일부가 되는 뉴클레오티드 수를 말한다. 예를 들면, 링커가 핵산 서열인 경우, 링커를 포함할 수 있고, 링커안에 뉴클레오티드는 제 1 또는 제 2 핵산 서열에 직접적으로 연계된 것과 동일한 방향에 있을 수 있다.
이 링커는 핵산, 비-핵산, 또는 핵산과 비핵산의 일부 조합으로 만들어질 수 있다. 링커가 핵산으로 만들어질 경우, 이의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 또는 이 사이의 임의의 수일 수 있다. 링커의 유형들은 본 명세서의 도처에서 논의된다. 이 링커는 임의의 길이가 될 수 있고, 제 1과 제 2 핵산 서열의 복합된 길이보다 더 길거나 또는 더 짧을 수 있고, 제 1 핵산 서열보다 더 길거나 또는 더 짧을 수 있고, 또는 제 2 핵산 서열보다 더 길거나 또는 더 짧을 수 있다.
더욱이, 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열이 혼성화될 때 표적 핵산상에 공간이 있을 수 있다. 환언하면, 제 1 핵산 서열과 혼성화되는 영역과 제 2 핵산 서열과 혼성화되는 영역, 즉 2개의 별개 영역이 표적 핵산상에 있다. 표적 상의 제 1 영역과 제 2 영역간의 거리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이가 될 수 있다.
또한 본원 명세서에서는 본 명세서에서 공개된 공조 핵산 분자들과 이의 용도에 대한 지침이 포함된 키트가 공개된다. 일부 구체예들에 있어서, 키트에는 추가적인 공조 핵산 분자들이 제공된다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 연장을 실행하기 위한 시약들, 이를 테면 중합효소, dNTP＇s, 완충액 그리고 이와 유사한 것들이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 양성 및 음성 대조군들이 포함될 수 있다. 이러한 구체예들에 있어서, 시약은 모두 별도로 포장되거나, 또는 단일 튜브 또는 용기 안에 복합될 수 있다.
표적 핵산을 증폭시키는 방법이 또한 공개되는데, 이 방법은 a) 본 명세서에서 공개된 공조 핵산 분자를 제공하고; b) 표적 핵산을 제공하고; 그리고 c)증폭을 위한 적절한 조건하에서 표적 핵산을 증폭시키고; 여기에서 제 1 핵산 분자의 효과적인 Tm은 제 2 핵산 서열이 부착되지 않은 제 1 핵산 서열의 단리된 Tm과 비교하였을 때 최소한 1℃ 증가되며; 이에 따라 표적 핵산이 증폭되는 것을 포함한다.
증폭 방법들은 본 명세서 도처에서 공개된다. 한 개 이상의 공조 핵산 분자가 제공될 수 있고, 그리고 이들은 동일한 또는 상이한 서열을 보유할 수 있다. 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 또는 그 이상의 핵산 분자의 상이한 서열이 제공될 수 있다.
프라이머 기획(Primer Design)
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제 1 핵산 서열로도 불리는 프라이머의 단리된 용융 온도 ＂Tm＂은 PCR의 어닐링(annealing) 단계, 또는 어닐링 단계가 없이 반응의 연장 단계 동안 이용되는 반응 온도보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 또는 그 이상이 낮은 온도이다. 따라서, 프라이머 서열의 용융 온도는 PCR 반응에서 이용된 반응 온도보다 약 1℃ 내지 40℃, 약 3℃ 내지 20℃, 약 5℃ 내지 15℃ 낮을 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 단리된 Tm은 반응 온도보다 약 7℃ 내지 12℃ 사이 범위로 낮다. 이는 단리된 프라이머에 혼성화되는 주형의 50% 미만, 그리고 더욱 바람직하게는 20% 미만을 제공한다.
당업자는 이를 테면 길이와 같은 많은 인자들에 근거하여 제시된 용융 온도를 가지고, GC 함량이 증가된 프라이머들을 기획할 수 있다. (Tm)의 산출을 위한 간단한 식은 다음과 같다:
Tm = 4(G + C) + 2(A + T) ℃
더욱이, 당업자는 실제 Tm이 Mg2+, K+의 농도, 및 공용매에 의해 영향을 받는다는 것을 인지할 것이다. 프라이머 기획을 지원하는 많은 컴퓨터 프로그램들이 있다.
원하는 용융 온도를 획득하기 위하여, 제 1 핵산 서열, 또는 프라이머의 길이는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40개의 염기일 수 있다. 예를 들면, 프라이머들은 GC 함량에 따라 길이가 약 5개 내지 26개, 약 7개 내지 22개, 약 9개 내지 17개의 염기일 수 있다.
상이한 뉴클레오티드 서열의 임의의 바람직한 수의 프라이머들이 이용될 수 있지만, 한 개 또는 소수의 프라이머들이 바람직하다. 증폭 반응은 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 프라이머들로 실행될 수 있다. 더 많은 프라이머들이 이용될 수 있다. 이용되는 프라이머의 수에 기본적인 상한은 없다. 그러나, 더 적은 수의 프라이머가 이용되는 것이 바람직하다. 다중 프라이머들이 이용될 때, 프라이머들은 각각 상이한 특이적 뉴클레오티드 서열을 보유해야 한다.
증폭 반응은 예를 들면, 추가적인 프라이머 없이, 단일 프라이머로 실행될 수 있는데, 1개의 추가적인 프라이머와 함께, 2개의 추가적인 프라이머들과 함께, 3개의 추가적인 프라이머들과 함께, 4개의 추가적인 프라이머들과 함께, 5개의 추가적인 프라이머들과 함께, 6개의 추가적인 프라이머들과 함께, 7개의 추가적인 프라이머들과 함께, 8개의 추가적인 프라이머들과 함께, 9개의 추가적인 프라이머들과 함께, 10개의 추가적인 프라이머들과 함께, 11개의 추가적인 프라이머들과 함께, 12개의 추가적인 프라이머들과 함께, 13개의 추가적인 프라이머들과 함께, 14개의 추가적인 프라이머들과 함께, 15개의 추가적인 프라이머들과 함께, 16개의 추가적인 프라이머들과 함께, 17개의 추가적인 프라이머들과 함께, 18개의 추가적인 프라이머들과 함께, 19개의 추가적인 프라이머들과 함께, 20개의 추가적인 프라이머들과 함께, 21개의 추가적인 프라이머들과 함께, 22개의 추가적인 프라이머들과 함께, 23개의 추가적인 프라이머들과 함께, 24개의 추가적인 프라이머들과 함께, 25개의 추가적인 프라이머들과 함께, 26개의 추가적인 프라이머들과 함께, 27개의 추가적인 프라이머들과 함께, 28개의 추가적인 프라이머들과 함께, 29개의 추가적인 프라이머들과 함께, 30개의 추가적인 프라이머들과 함께, 31개의 추가적인 프라이머들과 함께, 32개의 추가적인 프라이머들과 함께, 33개의 추가적인 프라이머들과 함께, 34개의 추가적인 프라이머들과 함께, 35개의 추가적인 프라이머들과 함께, 36개의 추가적인 프라이머들과 함께, 37개의 추가적인 프라이머들과 함께, 38개의 추가적인 프라이머들과 함께, 39개의 추가적인 프라이머들과 함께, 40개의 추가적인 프라이머들과 함께, 41개의 추가적인 프라이머들과 함께, 42개의 추가적인 프라이머들과 함께, 43개의 추가적인 프라이머들과 함께, 44개의 추가적인 프라이머들과 함께, 45개의 추가적인 프라이머들과 함께, 46개의 추가적인 프라이머들과 함께, 47개의 추가적인 프라이머들과 함께, 48개의 추가적인 프라이머들과 함께, 49개의 추가적인 프라이머들과 함께, 50개의 추가적인 프라이머들과 함께, 51개의 추가적인 프라이머들과 함께, 52개의 추가적인 프라이머들과 함께, 53개의 추가적인 프라이머들과 함께, 54개의 추가적인 프라이머들과 함께, 55개의 추가적인 프라이머들과 함께, 56개의 추가적인 프라이머들과 함께, 57개의 추가적인 프라이머들과 함께, 58개의 추가적인 프라이머들과 함께, 59개의 추가적인 프라이머들과 함께, 60개의 추가적인 프라이머들과 함께, 61개의 추가적인 프라이머들과 함께, 62개의 추가적인 프라이머들과 함께, 63개의 추가적인 프라이머들과 함께, 64개의 추가적인 프라이머들과 함께, 65개의 추가적인 프라이머들과 함께, 66개의 추가적인 프라이머들과 함께, 67개의 추가적인 프라이머들과 함께, 68개의 추가적인 프라이머들과 함께, 69개의 추가적인 프라이머들과 함께, 70개의 추가적인 프라이머들과 함께, 71개의 추가적인 프라이머들과 함께, 72개의 추가적인 프라이머들과 함께, 73개의 추가적인 프라이머들과 함께, 74개의 추가적인 프라이머들과 함께, 75개의 추가적인 프라이머들과 함께, 76개의 추가적인 프라이머들과 함께, 77개의 추가적인 프라이머들과 함께, 78개의 추가적인 프라이머들과 함께, 79개의 추가적인 프라이머들과 함께, 80개의 추가적인 프라이머들과 함께, 81개의 추가적인 프라이머들과 함께, 82개의 추가적인 프라이머들과 함께, 83개의 추가적인 프라이머들과 함께, 84개의 추가적인 프라이머들과 함께, 85개의 추가적인 프라이머들과 함께, 86개의 추가적인 프라이머들과 함께, 87개의 추가적인 프라이머들과 함께, 88개의 추가적인 프라이머들과 함께, 89개의 추가적인 프라이머들과 함께, 90개의 추가적인 프라이머들과 함께, 91개의 추가적인 프라이머들과 함께, 92개의 추가적인 프라이머들과 함께, 93개의 추가적인 프라이머들과 함께, 94개의 추가적인 프라이머들과 함께, 95개의 추가적인 프라이머들과 함께, 96개의 추가적인 프라이머들과 함께, 97개의 추가적인 프라이머들과 함께, 98개의 추가적인 프라이머들과 함께, 99개의 추가적인 프라이머들과 함께, 100개의 추가적인 프라이머들과 함께, 110개의 추가적인 프라이머들과 함께, 120개의 추가적인 프라이머들과 함께, 130개의 추가적인 프라이머들과 함께, 140개의 추가적인 프라이머들과 함께, 150개의 추가적인 프라이머들과 함께, 160개의 추가적인 프라이머들과 함께, 170개의 추가적인 프라이머들과 함께, 180개의 추가적인 프라이머들과 함께, 190개의 추가적인 프라이머들과 함께, 200개의 추가적인 프라이머들과 함께, 210개의 추가적인 프라이머들과 함께, 220개의 추가적인 프라이머들과 함께, 230개의 추가적인 프라이머들과 함께, 240개의 추가적인 프라이머들과 함께, 250개의 추가적인 프라이머들과 함께, 260개의 추가적인 프라이머들과 함께, 270개의 추가적인 프라이머들과 함께, 280개의 추가적인 프라이머들과 함께, 290개의 추가적인 프라이머들과 함께, 300개의 추가적인 프라이머들과 함께, 310개의 추가적인 프라이머들과 함께, 320개의 추가적인 프라이머들과 함께, 330개의 추가적인 프라이머들과 함께, 340개의 추가적인 프라이머들과 함께, 350개의 추가적인 프라이머들과 함께, 360개의 추가적인 프라이머들과 함께, 370개의 추가적인 프라이머들과 함께, 380개의 추가적인 프라이머들과 함께, 390개의 추가적인 프라이머들과 함께, 400개의 추가적인 프라이머들과 함께, 410개의 추가적인 프라이머들과 함께, 420개의 추가적인 프라이머들과 함께, 430개의 추가적인 프라이머들과 함께, 440개의 추가적인 프라이머들과 함께, 450개의 추가적인 프라이머들과 함께, 460개의 추가적인 프라이머들과 함께, 470개의 추가적인 프라이머들과 함께, 480개의 추가적인 프라이머들과 함께, 490개의 추가적인 프라이머들과 함께, 500개의 추가적인 프라이머들과 함께, 550개의 추가적인 프라이머들과 함께, 600개의 추가적인 프라이머들과 함께, 650개의 추가적인 프라이머들과 함께, 700개의 추가적인 프라이머들과 함께, 750개의 추가적인 프라이머들과 함께, 800개의 추가적인 프라이머들과 함께, 850개의 추가적인 프라이머들과 함께, 900개의 추가적인 프라이머들과 함께, 950개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,000개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,100개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,200개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,300개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,400개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,500개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,600개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,700개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,800개의 추가적인 프라이머들과 함께, 1,900개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,000개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,100개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,200개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,300개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,400개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,500개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,600개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,700개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,800개의 추가적인 프라이머들과 함께, 2,900개의 추가적인 프라이머들과 함께, 3,000개의 추가적인 프라이머들과 함께, 3,500개의 추가적인 프라이머들과 함께, 또는 4,000개의 추가적인 프라이머들과 함께 실행될 수 있다.
증폭 반응은 예를 들면, 추가적인 프라이머들 없이, 단일 프라이머로 실행될 수 있는데, 2개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 3개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 4개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 5개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 6개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 7개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 8개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 9개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 10개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 11개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 12개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 13개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 14개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 15개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 16개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 17개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 18개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 19개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 20개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 21개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 22개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 23개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 24개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 25개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 26개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 27개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 28개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 29개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 30개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 31개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 32개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 33개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 34개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 35개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 36개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 37개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 38개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 39개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 40개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 41개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 42개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 43개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 44개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 45개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 46개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 47개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 48개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 49개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 50개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 51개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 52개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 53개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 54개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 55개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 56개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 57개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 58개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 59개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 60개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 61개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 62개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 63개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 64개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 65개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 66개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 67개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 68개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 69개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 70개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 71개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 72개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 73개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 74개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 75개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 76개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 77개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 78개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 79개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 80개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 81개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 82개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 83개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 84개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 85개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 86개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 87개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 88개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 89개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 90개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 91개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 92개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 93개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 94개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 95개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 96개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 97개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 98개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 99개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 100개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 110개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 120개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 130개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 140개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 150개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 160개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 170개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 180개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 190개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 200개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 210개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 220개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 230개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 240개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 250개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 260개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 270개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 280개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 290개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 300개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 310개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 320개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 330개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 340개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 350개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 360개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 370개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 380개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 390개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 400개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 410개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 420개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 430개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 440개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 450개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 460개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 470개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 480개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 490개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 500 개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 550개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 600개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 650개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 700개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 750개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 800개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 850개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 900개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 950개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,000개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,100개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,200개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,300개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,400개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,500개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,600개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,700개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,800개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 1,900개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,000개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,100개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,200개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,300개 보다 적은추가적인 프라이머들과 함께, 2,400 추가적인 프라이머들과 함께, 2,500개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,600개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,700개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,800개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 2,900개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 3,000개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 3,500개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께, 또는 4,000개 보다 적은 추가적인 프라이머들과 함께 실행될 수 있다.
증폭 반응은 예를 들면, 2개의 프라이머들과 함께, 3개의 프라이머들과 함께, 4개의 프라이머들과 함께, 5개의 프라이머들과 함께, 6개의 프라이머들과 함께, 7개의 프라이머들과 함께, 8개의 프라이머들과 함께, 9개의 프라이머들과 함께, 10개의 프라이머들과 함께, 11개의 프라이머들과 함께, 12개의 프라이머들과 함께, 13개의 프라이머들과 함께, 14개의 프라이머들과 함께, 15개의 프라이머들과 함께, 16개의 프라이머들과 함께, 17개의 프라이머들과 함께, 18개의 프라이머들과 함께, 19개의 프라이머들과 함께, 20개의 프라이머들과 함께, 21개의 프라이머들과 함께, 22개의 프라이머들과 함께, 23개의 프라이머들과 함께, 24개의 프라이머들과 함께, 25개의 프라이머들과 함께, 26개의 프라이머들과 함께, 27개의 프라이머들과 함께, 28개의 프라이머들과 함께, 29개의 프라이머들과 함께, 30개의 프라이머들과 함께, 31개의 프라이머들과 함께, 32개의 프라이머들과 함께, 33개의 프라이머들과 함께, 34개의 프라이머들과 함께, 35개의 프라이머들과 함께, 36개의 프라이머들과 함께, 37개의 프라이머들과 함께, 38개의 프라이머들과 함께, 39개의 프라이머들과 함께, 40개의 프라이머들과 함께, 41개의 프라이머들과 함께, 42개의 프라이머들과 함께, 43개의 프라이머들과 함께, 44개의 프라이머들과 함께, 45개의 프라이머들과 함께, 46개의 프라이머들과 함께, 47개의 프라이머들과 함께, 48개의 프라이머들과 함께, 49개의 프라이머들과 함께, 50개의 프라이머들과 함께, 51개의 프라이머들과 함께, 52개의 프라이머들과 함께, 53개의 프라이머들과 함께, 54개의 프라이머들과 함께, 55개의 프라이머들과 함께, 56개의 프라이머들과 함께, 57개의 프라이머들과 함께, 58개의 프라이머들과 함께, 59개의 프라이머들과 함께, 60개의 프라이머들과 함께, 61개의 프라이머들과 함께, 62개의 프라이머들과 함께, 63개의 프라이머들과 함께, 64개의 프라이머들과 함께, 65개의 프라이머들과 함께, 66개의 프라이머들과 함께, 67개의 프라이머들과 함께, 68개의 프라이머들과 함께, 69개의 프라이머들과 함께, 70개의 프라이머들과 함께, 71개의 프라이머들과 함께, 72개의 프라이머들과 함께, 73개의 프라이머들과 함께, 74개의 프라이머들과 함께, 75개의 프라이머들과 함께, 76개의 프라이머들과 함께, 77개의 프라이머들과 함께, 78개의 프라이머들과 함께, 79개의 프라이머들과 함께, 80개의 프라이머들과 함께, 81개의 프라이머들과 함께, 82개의 프라이머들과 함께, 83개의 프라이머들과 함께, 84개의 프라이머들과 함께, 85개의 프라이머들과 함께, 86개의 프라이머들과 함께, 87개의 프라이머들과 함께, 88개의 프라이머들과 함께, 89개의 프라이머들과 함께, 90개의 프라이머들과 함께, 91개의 프라이머들과 함께, 92개의 프라이머들과 함께, 93개의 프라이머들과 함께, 94개의 프라이머들과 함께, 95개의 프라이머들과 함께, 96개의 프라이머들과 함께, 97개의 프라이머들과 함께, 98개의 프라이머들과 함께, 99개의 프라이머들과 함께, 100개의 프라이머들과 함께, 110개의 프라이머들과 함께, 120개의 프라이머들과 함께, 130개의 프라이머들과 함께, 140개의 프라이머들과 함께, 150개의 프라이머들과 함께, 160개의 프라이머들과 함께, 170개의 프라이머들과 함께, 180개의 프라이머들과 함께, 190개의 프라이머들과 함께, 200개의 프라이머들과 함께, 210개의 프라이머들과 함께, 220개의 프라이머들과 함께, 230개의 프라이머들과 함께, 240개의 프라이머들과 함께, 250개의 프라이머들과 함께, 260개의 프라이머들과 함께, 270개의 프라이머들과 함께, 280개의 프라이머들과 함께, 290개의 프라이머들과 함께, 300개의 프라이머들과 함께, 310개의 프라이머들과 함께, 320개의 프라이머들과 함께, 330개의 프라이머들과 함께, 340개의 프라이머들과 함께, 350개의 프라이머들과 함께, 360개의 프라이머들과 함께, 370개의 프라이머들과 함께, 380 프라이머들과 함께, 390개의 프라이머들과 함께, 400개의 프라이머들과 함께, 410개의 프라이머들과 함께, 420개의 프라이머들과 함께, 430개의 프라이머들과 함께, 440개의 프라이머들과 함께, 450개의 프라이머들과 함께, 460개의 프라이머들과 함께, 470개의 프라이머들과 함께, 480개의 프라이머들과 함께, 490개의 프라이머들과 함께, 500개의 프라이머들과 함께, 550개의 프라이머들과 함께, 600개의 프라이머들과 함께, 650개의 프라이머들과 함께, 700개의 프라이머들과 함께, 750개의 프라이머들과 함께, 800개의 프라이머들과 함께, 850개의 프라이머들과 함께, 900개의 프라이머들과 함께, 950개의 프라이머들과 함께, 1,000개의 프라이머들과 함께, 1,100개의 프라이머들과 함께, 1,200개의 프라이머들과 함께, 1,300개의 프라이머들과 함께, 1,400개의 프라이머들과 함께, 1,500개의 프라이머들과 함께, 1,600개의 프라이머들과 함께, 1,700개의 프라이머들과 함께, 1,800개의 프라이머들과 함께, 1,900개의 프라이머들과 함께, 2,000개의 프라이머들과 함께, 2,100개의 프라이머들과 함께, 2,200개의 프라이머들과 함께, 2,300개의 프라이머들과 함께, 2,400개의 프라이머들과 함께, 2,500개의 프라이머들과 함께, 2,600개의 프라이머들과 함께, 2,700개의 프라이머들과 함께, 2,800개의 프라이머들과 함께, 2,900개의 프라이머들과 함께, 3,000개의 프라이머들과 함께, 3,500개의 프라이머들, 또는 4,000개의 프라이머들과 함께 실행될 수 있다.
공개된 프라이머들은 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 이러한 프라이머들은 본 명세서에서 변형된 프라이머들로 불린다.
키메라(Chimeric) 프라이머들이 또한 이용될 수 있다. 키메라 프라이머들은 최소한 두 가지 유형의 뉴클레오티드, 이를 테면 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드, 2개 또는 그 이상의 유형의 변형된 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드와 2개 또는 그 이상의 상이한 유형의 변형된 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드와 2개 또는 그 이상의 상이한 유형의 변형된 뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드와 2개 또는 그 이상의 상이한 유형의 변형된 뉴클레오티드를 보유한 프라이머들이다. 한 가지 형태의 키메라 프라이머는 펩티드 핵산/핵산 프라이머들이다. 예를 들면, 5＇-PNA-DNA-3＇ 또는 5＇-PNA-RNA-3＇ 프라이머들이 좀더 효과적인 가닥 침투 및 중합화 침투에 이용될 수 있다. 또다른 형태의 키메라 프라이머들은 예를 들면, 5＇- (2＇-O-메틸) RNA-RNA-3＇ 또는 5＇- (2＇-O-메틸) RNA-DNA-3＇이다.
많은 변형된 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 유사체)가 공지되어 있으며, 그리고 올리고뉴클레오티드에 이용될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당, 또는 포스페이트 모이어티에 일부 변형 유형이 포함된 뉴클레오티드다. 염기 모이어티에 있어서 변형은 A, C, G, 및 T/U의 천연 및 합성에 의한 변형 뿐만 아니라 상이한 퓨린 또는 피리미딘 염기, 이를 테면 우라실-5-일, 하이포산틴-9-일 (I), 그리고 2-아미노아데닌-9-일이 포함될 것이다. 변형된 염기는 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 그리고 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체들, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체들, 2-티오우라실, 2-티오티민 그리고 2-티오시토신, 5-할로우라실 그리고 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 구체적으로 5-브로모, 5-트리플로오르메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가 염기 변형은 예를 들면 U.S. 특허 번호. 3,687,808, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, 그리고 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. 그리고 Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993에서 찾아볼 수 있다. 특정 뉴클레오티드 유사체, 이를 테면 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 그리고 5-프로피닐시토신, 5-메틸시토신이 포함된 N-2, N-6 그리고 O-6 치환된 퓨린이 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시킬 수 있다. 다른 변형된 염기는 범용(universal) 염기로 기능을 하는 것들이다. 범용 염기는 3-니트로피롤과 5-니트로인돌을 포함한다. 범용 염기는 통상적 염기를 대체하지만 염기쌍 형성에 있어서 편향은 없다. 즉, 범용 염기는 임의의 다른 염기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 범용 염기를 보유한 프라이머는 특이적 서열을 가진 프라이머로 간주되지 않는다.
염기 변형은 대개 예를 들면 당 변형, 이를 테면 2＇-O-메톡시에틸과 복합되어 독특한 성질, 이를 테면 듀플렉스의 안정성 증가가 이루어진다. 염기 변형의 범위를 상세하게 설명하는 다수의 미국 특허 이를 테면 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 그리고 5,681,941이 있다. 이들 각 특허는 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
뉴클레오티드 유사체는 당 모이어티의 변형을 또한 포함할 수 있다. 당 모이어티에 대한 변형은 리보스 및 데옥시리보스의 천연 변형 뿐만 아니라 합성 변형을 포함할 수 있다. 당 변형은 2＇ 위치에서 다음의 변형을 포함하나 이에 국한되지 않는다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기에서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 치환안된 C1 내지 C10, 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐을 대체할 수 있다. 2＇ 당 변형은 또한 -O[(CH2)n O]m CH3, -O(CH2)n OCH3, -O(CH2)n NH2, -O(CH2)n CH3, -O(CH2)n -ONH2, 그리고 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2을 포함하나 이에 국한되지 않으며, 이때 n 및 m은 1 내지 약 10이 된다.
2＇ 위치에서 다른 변형은 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: C1 내지 C10 저가 알킬, 치환된 저가 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 절단기(cleaving group), 리포터기, 삽입기(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선시키는 기(group), 또는 올리고뉴클레오티드의 약물력학적 성질을 개선시키는 기, 그리고 유사한 성질을 보유하는 다른 치환체들. 유사한 변형은 당에서 다른 위치 구체적으로 3＇ 말단 뉴클레오티드 상에서 당의 3＇ 위치 또는 2＇-5＇ 연계된 올리고뉴클레오티드와 5＇ 말단 뉴클레오티드의 5＇ 위치에서 또한 만들어질 수 있다. 변형된 당들은 연결되는 고리 산소에서 변형, 이를 테면 CH2 및 S가 또한 포함될 수 있다. 뉴클레오티드 당 유사체는 펜토퓨라노실 당을 대신하여 당 모방체, 이를 테면 시클로부틸 모이어티를 또한 보유할 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 다수의 미국 특허 이를 테면 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 그리고 5,700,920이 있으며, 이들은 각각 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
뉴클레오티드 유사체는 포스페이트 모이어티에서 또한 변형될 수 있다. 변형된 포스페이트 모이어티는 2개의 뉴클레오티드 사이에 링키지에 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3＇-알킬렌 포스포네이트 그리고 키랄 포스포네이트가 포함된 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트 , 3＇-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트가 포함된 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 그리고 보라노포스페이트가 포함되도록 변형될 수 있는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 2개의 뉴클레오티드 사이에 이러한 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 링키지는 3＇-5＇ 링키지 또는 2＇-5＇ 링키지를 통할 수 있으며, 링키지는 역전된 극성, 이를 테면 3＇-5＇에서 5＇-3＇ 또는 2＇-5＇ 에서 5＇-2＇를 보유할 수 있음을 인지할 것이다. 다양한 염, 혼합된 염 그리고 자유 산 형태가 또한 포함된다. 많은 미국 특허들은 변형된 포스페이트가 포함된 뉴클레오티드를 만들고 이용하는 방법을 교시하고 있으며, 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 그리고 5,625,050을 포함하며, 이들 각각은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다.
뉴클레오티드 유사체는 단일 변형만을 필요할 수 있지만, 모이어티 중 하나에 또는 상이한 모이어티 사이에 다중 변형이 또한 포함될 수 있음을 인지해야 한다.
뉴클레오티드 치환체는 뉴클레오티드와 유사한 기능적 성질을 보유하지만, 포스페이트 모이어티를 포함하지 않는 분자, 이를 테면 펩티드 핵산 (PNA)이다. 뉴클레오티드 치환체는 Watson-Crick 또는 Hoogsteen 방식에서 상보적 핵산을 인지하고 이에 혼성화되지만 포스페이트 모이어티이외의 모이어티를 통하여 서로 연결된 분자들이다. 뉴클레오티드 치환체는 적절한 핵산 분자들과 상호작용될 때 이중 나선 유형 구조에 순응할 것이다.
뉴클레오티드 치환체는 대체된 포스페이트 모이어티 및/또는 당 모이어티를 보유한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체이다. 뉴클레오티드 치환체는 표준 원자를 보유하지 않는다. 포스페이트의 치환체는 예를 들면, 짧은 쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간(internucleoside) 링키지, 혼합형 헤테로원자 그리고 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간(internucleoside) 링키지, 또는 하나 또는 그 이상의 짧은 쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클 뉴클레오시드간(internucleoside) 링키지가 될 수 있다. 여기에는 몰포리노 링키지 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 일부 형성된); 실옥산 기본골격; 설피드, 술폭시드 및 술폰 기본골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 알켄 보유 기본골격; 술파메이트 기본골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 기본골격; 술포네이트 및 술폰아미드 기본골격; 아미드 기본골격; 그리고 혼합형 N, O, S 및 CH2 성분 부분들을 보유한 다른 것들이 포함된다. 많은 미국 특허들은 이들 유형의 포스페이트 대체를 만들고 이용하는 방법들을 교시하고 있으며, 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 그리고 5,677,439를 포함하나 이에 국한되지 않으며, 이들 각각은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다.
뉴클레오티드 치환체에서 뉴클레오티드의 당과 포스페이트 모이어티는 모두 예를 들면 아미드 유형 링키지 (아미노에틸글리신) (PNA)에 의해 대체될 수 있다는 것 또한 인지된다. 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 그리고 5,719,262는 PNA 분자를 어떻게 만들고 이용하는지에 대해 교시하고 있으며, 이들 각각은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다. (또한 Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991) 참고).
프라이머들은 뉴클레오티드를 포함하며, 상이한 유형의 뉴클레오티드 또는 동일한 유형의 뉴클레오티드로 만들어질 수 있다. 예를 들면, 프라이머에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고; 약 10% 내지 약 50%의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고; 약 50% 또는 그 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고; 또는 모든 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는리보뉴클레오티드와 2＇-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 뉴클레오티드들은 염기 (즉, 뉴클레오티드의 염기 부분)를 포함할 수 있으며, 그리고 상이한 유형의 염기를 포함할 수 있다(그리고 통상적으로 포함할 것이다).
포획 서열 기획 (Capture Sequence Design)
본 명세서에서 ＂제 2 핵산 서열＂로도 불리는 포획 서열은 프라이머의 3＇ 단부 하류의 표적 핵산 분자에 혼성화되도록 주형에 대하여 상보적이다. 일부 구체예들에 있어서, 표적 핵산에서 돌연변이에 대하여 저항성이 바람직하고, 포획 서열은 반응 온도보다 더 높은 용융 온도를 가지도록 기획된다. 이들 구체예에 있어서, 포획 서열은 반응 온도보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 또는 그 이상 높은 단리된 Tm을 갖도록 기획된다. 예를 들면, 포획, 또는 제 2 서열은 반응 온도 이상의 약 0℃ 내지 40℃, 약 5℃ 내지 30℃, 약 7℃ 내지 25℃ 범위에 있다. 일부 구체예들에 있어서, 포획 서열의 예상 용융 온도는 또한 예상된 돌연변이형에 대해 또한 만들어진다. 이들 구체예에 있어서, 예상된 돌연변이형에 대한 포획 서열의 단리된 Tm은 반응 온도보다 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 온도이거나, 또는 반응 온도보다 10, 11, 12, 13, 14,1 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 그리고 50 또는 그 이상 낮은 온도이다. 예를 들면, 반응 온도보다 10℃ 낮고 반응 온도보다 30℃ 높거나, 반응 온도보다 약 3℃ 낮고 반응 온도보다 약 10℃ 높을 수 있다.
이들 용융 온도를 얻기 위하여, 포획 서열 길이는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 또는 75개 또는 그 이상의 염기가 될 수 있다. 예를 들면, 길이는 약 20개 내지 약 50개 사이, 약 22 개 내지 약 40개 사이, 약 23 개 내지 약 37개 사이의 염기가 될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 표적 서열에 있어서 돌연변이에 더 높은 저항성이 바람직하다. 이들 구체예에 있어서, 반응 온도 보다 약 0℃ 내지 40℃ 사이의 높은 단리된 Tm을 가진 포획 서열에 추가하여, 공조 프라이머는 반응 온도보다 약 7℃ 낮은 범위에서 약 20℃ 높은 범위 까지, 약 5℃ 낮은 범위에서 약 10℃ 높은 범위까지, 약 3℃ 낮은 범위에서 약 3℃ 높은 범위까지의 단리된 Tm을 가지도록 기획된다. 프라이머와 포획 서열 간에 공조 상호작용은 공조 프라이머를 위한 좀더 효과적인 더 큰 Tm을 초래할 것이고, 이는 서열에서 돌연변이들에 대해 거의 영향을 받지 않도록 한다. 비교하자면, 통상적 프라이머는 표적 서열에서 돌연변이들에 대해 등가의 저항성을 갖는 추가 5개 내지 30개의 염기를 보유할 것이며, 결과적으로 프라이머-이합체 형성에 더더욱 민감해질 것이다.
다른 구체예들에 있어서, 프라이머-이합체들에 대하여 더 높은 저항성이 바람직하고, 단리된 포획 또는 제 2 핵산 서열의 용융 온도는 반응 온도보다 낮도록 기획된다. 예를 들면, 포획 또는 제 2 핵산 서열은 PCR의 반응 온도 또는 어닐링 단계보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 또는 그 이상 낮은 온도이다. 바람직한 구체예들에 있어서, 단리된 포획 또는 제 2 핵산 서열의 Tm은 반응 온도보다 약 0℃ 내지 12℃ 사이, 약 1℃ 내지 8℃ 사이, 약 2℃ 내지 5℃ 사이 범위로 낮다. 이러한 낮은 용융 온도를 얻기 위하여, 포획 서열 길이는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 또는 그 이상의 염기가 될 수 있다. 예를 들면, 포획 또는 제 2 핵산 서열은 약 5 내지 30개의 염기, 약 8 내지 25개의 염기, 그리고 약 10 내지 22개의 염기일 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 포획 서열은 표적 서열에 결합하여 이를 신속하게 방출함으로써 중합효소는 가려져있는 포획 서열을 연장시키고, 포획 서열은 온전한 상태로 남게된다. 일부 구체예들에 있어서, 이는 포획 서열의 5＇ 단부에 부착된 링커를 가진 공조 프라이머를 이용하여 강화된다. 바람직한 구체예에 있어서, 중합효소는 연장 동안 포획 서열을 절단할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 이는 포획 서열의 3＇ 단부에 부착된 링커를 가진 공조 프라이머를 이용하여 강화된다.
링커(Linker)
제 1 핵산 또는 프라이머 서열의 3＇ 단부와 주형에서 제 2 핵산 또는 포획 서열 혼성화 위치의 5＇ 단부 사이의 염기 수가 중요하다. 일부 구체예들에 있어서, 프라이머와 포획 서열 사이의 염기 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개다. 예를 들면, 이 수는 약 0 내지 30개, 약 0 내지 20개, 약 0 내지 10 염기 사이가 될 수 있다.
두 부위 사이에 염기가 더 많을 수록, 포획 서열의 절단이 필요할 경우 더 긴 링커가 요구된다. 링커의 길이가 길 수록 시스템에 더 많은 엔트로피가 유입되고, 공조 결합의 효과는 낮아지게 된다. 이것은 다음의 식으로 표현된다:
Figure pct00001
여기에서 Keff는 효과적인 또는 공조 평형 상수(equilibrium constant), K프라이머는 단리시 프라이머의 평형 상수이며, K포획은 평형상태에서 포획 서열의 평형 상수이고, 그리고 Lc는 다음에서 정의된 바와 같이 국소 농도이다:
Figure pct00002
여기에서 r은 링커 길이(데시미터)다. 이는 프라이머와 프로브 사이에 공조 상호작용으로 인하여 효과적인 국소 농도(몰 농도)를 제공한다. 따라서, 링커 길이는 효과적인 평형 상수에 대한 공조 기여(LcK프라이머K포획)를 직접적으로 결정한다.
K프라이머 및 K포획은 최근린 내삽법(nearest neighbor) 또는 당업계 숙련자들에게 공지된 다른 산출식을 이용하여 프라이머 및 포획 서열에 대한 엔탈피 및 엔트로피 값을 얻음으로써 산출될 수 있다.
프라이머에 의해 결합된 주형의 총량은 다음과 같이 산출될 수 있다:
Figure pct00003
여기에서 T프라이머는 프라이머에 의해 결합된 주형이며, To는 주형의 총량이며, 그리고 Po는 공조 프라이머 출발 농도이다. LcK프라이머K포획이 K프라이머보다 훨씬 더 클 때 공조 효과가 최대가 된다는 것을 볼 수 있다. 이렇게 되도록 하기 위해서는 링커 길이는 가능한 짧아야 한다.
식에서 링커 길이가 가능한 짧아야 한다는 것을 볼 수 있지만, 실질적으로 링커가 얼마나 짧아야 하는 지에 대해서는 몇 가지 제약이 있다. 포획 서열과 프로브가 주형에 결합될 때, 이들은 단단한 이중 나선(helices)을 형성한다. 이 링커 길이는 이 구조를 수용할 정도로 충분히 길어야 한다.
일부 구체예들에 있어서, 링커는 프라이머의 5＇ 단부를 포획 서열의 3＇ 단부에 부착시킨다 (도 2). 이 구체예에 있어서, 링커는 프라이머와 포획 서열의 복합된 길이보다 더 길다. 링커가 포획 서열의 3＇ 단부에 부착된 바람직한 구체예에 있어서, 링커는 6 헥사에틸렌 글리콜을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 프라이머는 역전되어, 프라이머의 5＇ 단부가 포획 서열의 5＇ 단부에 부착된다 (도 3). 이 구체예에 있어서, 링커는 프라이머 보다 더 길다. 링커가 포획 서열의 5＇ 단부에 부착된 바람직한 구체예에 있어서, 링커는 3 헥사에틸렌 글리콜을 포함한다. 여전히 또다른 구체예에 있어서, 포획 서열의 3＇ 단부는 프라이머의 중간에 연계된다 (도 1). 이 경우에 있어서, 링커는 프라이머의 길이보다 더 짧을 수 있다.
다양한 링커 유형 및 조성이 당업계 숙련자들에게 공지되어 있다. 예로는 폴리에틸렌 글리콜과 탄소 링커들이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 링커는 공유 결합들, 이온 결합들, 수소 결합, 극 연합(polar association), 자석에 의한 연합, 그리고 반데르발스 연합(van der wals association)이 포함되나 이에 한정되지 않는 다양한 방법들을 통하여 부착될 수 있다. 바람직한 방법은 표준 DNA 합성 방법을 통한 공유 결합이다.
폴리에틸렌 글리콜 링커들의 길이는 단량체당 약 0.34 nm이다. 일부 구체예들에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 링커의 길이는 약 1 내지 90, 약 2 내지 50, 약 3 내지 30개의 단량체다 (완전하게 연장될 때 약 1 내지 10 nm).
프로브로 포획 서열을 이용(Using the Capture Sequence as a Probe)
일부 구체예들에 있어서, 프로브로써 포획 서열을 보유하는 것 또한 바람직하다. 일부 구체예들에 있어서, 이것은 하나 또는 그 이상의 라벨들을 포획 서열에 추가하면 된다. 바람직한 구체예에 있어서, 라벨들은 FRET 쌍을 포함한다.
다양한 핵산 프로브 구조는 당업계 숙련자들에게 공지되어 있다. 여기에는 이중 라벨된 프로브들, 헤어핀 프로브들, 그리고 단일 라벨 프로브들이 포함되나 이에 한정되지 않는다 (도 4 참고).
일부 구체예들에 있어서, 노이즈에 대한 신호 비율을 높이기 위하여 낮은 배경 신호는 낮은 것이 바람직하다. 일부 구체예들에 있어서, 노이즈에 대하여 높은 신호를 제공함에 있어서 헤어핀 프로브를 이용하여 증가된 접촉 소광(quenching)이 제공된다.
다른 구체예들에 있어서, 프라이머-프로브 이합체들을 최소화시키기 위하여 프로브는 짧을 수록 바람직하다. 더 짧은 프로브를 요구하는 일부 구체예들에 있어서, 이중 라벨된 프로브가 이용된다. 허위(spurious) 연장 산물의 감소를 상당히 강조하는 구체예들에 있어서, 단리된 프로브 표적 복합물의 용융 온도는 반응 온도보다 낮다.
라벨된 프로브들로부터 신호를 탐지하기 위한 다양한 방법들이 당업계 숙련자들에게 공지되어 있다. 일부 구체예들에 있어서 프로브를 절단하고, 신호를 변화시키는 라벨을 방출시키는 중합효소가 이용된다. 다른 구체예들에 있어서, 프로브를 절단시키지 못하는 중합효소가 이용된다. 오히려 신호는 프로브가 주형에 혼성화됨으로써 변형된다.
탐지 기전에서 빌트를 가진 프라미어를 이용(Using a Primer with a built in detection mechanism)
일부 구체예들에 있어서, 프라이머는 탐지 기전 안에 빌트(buit)를 보유한다. 일부 구체예들에 있어서 탐지 기전은 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 라벨들을 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 탐지 기전은 FRET 쌍을 포함한다. 탐지기전내 빌트를 가진 프라이머들의 예로는 Amplifluor프라이머들, Rapid Detex 프라이머들, 그리고 당분야의 숙련자에게 공지된 기타 다른 것들이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 이것의 예는 도 7에서 볼 수 있다.
탐지기전 안에 빌트를 가진 공조 핵산들은 탐지 기전 안에 빌트를 가진 비-공조 핵산 (통상적 프라이머들) 보다 디자이너를 분석하는데 더욱 유용할 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 그 이유는 공조 핵산은 비특이적 산물, 이를 테면 프라이머-이합체들로부터 신호를 덜 발생시키는 경향이 있기 때문이다.
일부 구체예들에 있어서, 핵산 결합 염료, 이를 테면 SYBR Green은 증폭 반응의 진행을 감시하는데 이용된다.
형광 변화 프로브들과 형광 변화 프라이머들은 프로브 또는 프라이머 및 탐지되는, 분석되는 또는 복제되는 핵산의 형태 또는 구조(conformation)의 변화에 근거하여 형광 강도 또는 파장의 변화에 관련된 모든 프로브 및 프라이머를 지칭한다. 형광 변화 프로브와 프라이머의 예로는 분자 비컨(molecular beacons), Amplifluors, FRET 프로브들, 절단가능한 FRET 프로브들, TaqMan 프로브들, 스콜피온(scorpion) 프라이머들, 형광 트리플렉스 올리고, 형광 수용성 접합된 폴리머, PNA 프로브들 그리고 QPNA 프로브들을 포함한다.
형광 변화 프로브들과 프라이머들은 이들의 구조 및/또는 기능에 따라 분류될 수 있다. 형광 변화 프로브들은 헤어핀 소광된(quenched) 프로브들, 분열(cleavage) 소광된 프로브들, 분열 활성화된 프로브들, 그리고 형광 활성화된 프로브들을 포함한다. 형광 변화 프라이머들은 스템(stem) 소광된 프라이머들과 헤어핀 소광된 프라이머들을 포함한다. 몇 가지 유형의 형광 변화 프로브들과 프라이머들의 용도는 Schweitzer and Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12:21-27 (2001)에서 검토된다. Hall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8272-8277 (2000)는 Invader 분석으로 형광 변화 프로브들의 용도를 설명한다.
헤어핀 소광된 프로브들은 표적 서열에 결합되지 않을 때 형광 라벨과 소광 모이어티를 근접하게 이동시키는 헤어핀 구조 (그리고, 전형적으로, 루프)를 형성하여, 라벨로부터 형광이 소광되게 하는 프로브들이다. 프로브가 표적 서열에 결합될 때, 스템이 와해되고, 소광 모이어티는 형광 라벨에 더 이상 근접하지 못하여, 형광이 증가된다. 헤어핀 소광된 프로브들의 예로는 분자 비컨, 형광 트리플렉스 올리고, 그리고 QPNA 프로브들이 있다.
분열 활성화된 프로브들은 프로브의 분열에 의해 형광이 증가되는 프로브들이다. 분열 활성화된 프로브들은 형광 라벨과 인접된 소광 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 라벨로부터의 형광은 소광된다. 프로브가 꺽이거나(clipped) 또는 절단될 때 (전형적으로 증폭되는 동안 중합 효소의 5＇-3＇ 엑소뉴클레아제 활성에 의해), 소광 모이어티는 더 이상 형광 라벨에 인접하지 않고, 형광은 증가된다. TaqMan 프로브들 (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280 (1991))은 분열 활성화된 프로브들의 예가 된다.
분열 소광된 프로브들은 프로브의 분열에 의해 형광이 감소되거나 또는 변경되는 프로브들이다. 분열 소광된 프로브들은 수용자(acceptor) 형광 라벨과 공여자(donor) 모이어티를 포함할 수 있고, 수용자와 공여자가 근접해있을 때, 형광 공명 에너지는 공여자로부터 수용자로 전이되어, 수용자가 형광을 발생하시키도록 만든다. 따라서, 프로브들은 표적 서열에 혼성화될 때 형광성이다. 프로브가 꺽이거나 또는 절단될 때 (전형적으로 증폭되는 동안 중합 효소의 5＇-3＇ 엑소뉴클레아제 활성에 의해), 공여자 모이어티는 더 이상 수용자 형광 라벨에 인접하지 않고, 수용자로부터의 형광은 감소된다. 공여자 모이어티 자체가 형광 라벨인 경우라면, 수용자와 근접해있지 않을 때 형광으로 에너지를 방출할 수 있다 (전형적으로 수용자의 형광과는 상이한 파장에서). 그 다음 전반적인 효과는 수용자 형광의 감소와 공여자 형광의 증가가 될 것이다. 분열 소광된 프로브들의 경우에 있어서 공여자 형광은 분열 활성화된 프로브들에 의해 생성되는 형광에 대등하며, 수용자는 소광 모이어티가 되고, 공여자는 형광 라벨아 된다. 절단가능한 FRET (형광 공명 에너지 전달) 프로브들은 분열 소광된 프로브의 예가 된다.
형광 활성화된 프로브들은 이들 프로브가 표적 서열에 혼성화됨으로써 형광이 증가 또는 변경되는 프로브 또는 프로브 쌍이다. 형광 활성화된 프로브들은 수용자 형광 라벨과 공여자 모이어티를 포함할 수 있고, 수용자와 공여자가 근접해 있을 때(프로브들이 표적 서열에 혼성화될 때), 형광 공명 에너지는 공여자로부터 수용자로 전이되어, 수용자가 형광을 발생하시키도록 만든다. 형광 활성화된 프로브들은 전형적으로 인접 서열에 혼성화되도록 기획된 프로브의 쌍이 되고, 수용자와 공여자는 인접되게 된다. 형광 활성화된 프로브들은 또한 공여자와 수용자 모두 포함된 단일 프로브일 수 있으며 여기에서 프로브가 표적 서열에 혼성화되지 않을 때 공여자와 수용자는 인접해있지 않지만, 프로브가 표적 서열에 혼성화될 때 공여자와 수용자는 근접해있다. 이것은 예를 들면, 공여자와 수용자를 프로브의 반대 단부에 위치시키고, 프로브의 각 단부에 표적 상보 서열을 위치시킴으로써 이루어질 수 있고, 이때 표적 상보 서열은 표적 서열내에서 인접 서열에 상보적이다. 형광 활성화된 프로브의 공여자 모이어티 자체가 형광 라벨이라면, 수용자와 근접해있지 않을 때(즉, 프로브들이 표적 서열에 혼성화되지 않을 때) 형광으로 에너지를 방출할 수 있다 (전형적으로 수용자의 형광과는 상이한 파장에서). 프로브들이 표적 서열에 혼성화될 때, 그 다음 전반적인 효과는 공여자 형광의 감소와 수용자 형광의 증가가 될 것이다. FRET 프로브들이 형광 활성화된 프로브들의 예가 된다.
스템 소광된 프라이머들은 상보적인 서열에 혼성화되지 않을 때 형광 라벨과 소광 모이어티를 근접하게 이동시키는 스템 구조 (분자내(intramolecular) 스템 구조 또는 분자간(intermolecular) 스템 구조)를 형성하여, 라벨로부터 형광이 소광되게 하는 프로브들이다. 프라이머가 상보적인 서열에 결합될 때, 스템이 와해되고, 소광 모이어티는 형광 라벨에 더 이상 근접하지 못하여, 형광이 증가된다. 공개된 방법에서, 스템 소광된 프라이머들은 핵산 합성을 위한 프라이머로 이용되고, 따라서 합성된 또는 증폭된 핵산에 혼입된다. 스템 소광된 프라이머들의 예는 펩티드 핵산 소광된 프라이머들과 헤어핀 소광된 프라이머들이다.
펩티드 핵산 소광된 프라이머들은 스템 구조를 형성하기 위하여 펩티드 핵산 소광제(quencher) 또는 펩티드 핵산 플루어(fluor)와 연합된 프라이머들이다. 이 프라이머는 형광 라벨 또는 소광 모이어티를 포함하며, 펩티드 핵산 소광제 또는 펩티드 핵산 플루어에 각각 연합된다. 이 프라이머는 형광 라벨을 소광 모이어티에 인접하게 둔다. 프라이머가 복제될 때, 펩티드 핵산은 위치에서 밀려나고(displace), 따라서 형광 라벨에 의한 형광 신호의 생성이 허용된다.
헤어핀 소광된 프라이머들은 상보적인 서열에 혼성화되지 않을 때, 형광 라벨과 소광 모이어티를 근접하게 이동시키는 헤어핀 구조 (그리고, 전형적으로, 루프)를 형성하여, 라벨로부터 형광이 소광되게 하는 프로브들이다. 프라이머가 상보적인 서열에 결합될 때, 스템이 와해되고, 소광 모이어티는 형광 라벨에 더 이상 근접하지 못하여, 형광이 증가된다. 헤어핀 소광된 프라이머들은 전형적으로 핵산 합성을 위한 프라이머로 이용되고, 따라서 합성된 또는 증폭된 핵산에 혼입된다. 헤어핀 소광된 프라이머들의 예로는 Amplifluor 프라이머들 (Nazerenko et al., Nucleic Acids Res. 25:2516-2521 (1997)) 그리고 스콜피온 프라이머들 (Thelwell et al., Nucleic Acids Res. 28(19):3752-3761 (2000))이다.
분열 활성화된 프라이머들은 오직 복제된가닥으로 혼입되고, 그 다음 후속적으로 분열되는 프라이머인 것을 제외하고는 분열 활성화된 프로브들과 유사하다. Little et al., Clin. Chem. 45:777-784 (1999)는 분열 활성화된 프라이머들의 용도에 대해 설명한다.
ARMS을 이용한 다중화( Multiplexing with ARMS)
일부 구체예들에 있어서, 다중 다형성, 삽입, 결손 또는 기타 돌연변이들의 탐지가 바람직하다. 일부 구체예들에 있어서, 3＇ 단부의 염기가 돌연변이 위에 있도록 프라이머가 기획된다. 일부 구체예들에 있어서, 추가의 의도적 다형성도 프라이머에 기획된다. 한 구체예에서, 프라이머에 부착된 프로브의 존재로 동일한 위치에 있는 다중 다형성의 대립형질 특이적인 실시간 탐지가 허용된다.
프로브에 의한 돌연변이 차등 ( Mutation differentiation with the Probe)
일부 구체예들에 있어서 프라이머에 부착된 포획 서열을 이용하여 다형성이 차등된다. 일부 구체예들에 있어서 포획 서열은 차등을 개선시키기 위하여 의도적으로 추가된 추가적인 돌연변이들을 갖는다. 일부 구체예들에 있어서, 다형성이 존재할 때 포획 서열은 결합되지 않을 것이며, 효과적인 증폭 라운드의 연속이 방해된다. 포획 서열이 탐지가능한 라벨을 보유하는 일부 구체예들에 있어서, 어느 정도의 증폭이 발생되더라도, 포획 서열은 탐지가능한 신호를 생성시키는데 충분하도록 결합되지 않은다.
RNA 및 기타 반응
일부 구체예들에 있어서, DNA 중합효소 이외의 중합효소가 이용된다. 중합효소와 하나 또는 그 이상의 염기를 핵산 주형에 추가시킬 수 있는 다양한 효소들이 당업계 숙련자들에게 공지되어 있다. 일부 구체예들에 있어서, 역전사가 바람직하다. 일부 구체예들에 있어서, 프로브는 충분히 낮은 용융 온도를 보유하여 중합효소는 프로브 아래를 연장시킬 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 처음 중합화를 위한 시간 이후 온도가 증가되면 포획 서열은 주형으로부터 제거되고, 중합효소의 연장이 허용된다. 다른 구체예들에 있어서, 포획 서열을 보유하지 않는 추가 프라이머 서열이 이용되어, 저가 반응 온도에서 중합효소가 복사체를 방해받지 않는 방식으로 만들수 있도록 한다.
표적 핵산 분자 (Target Nucleic Acid Molecules)
증폭 대상이 되는 핵산 분자는 임의의 원천의 임의의 핵산일 수 있다. 일반적으로, 공개된 방법은 증폭될 핵산 분자를 포함하는(또는 포함하는 것으로 의심되는) 핵산 시료를 이용하여 실행된다.
핵산 시료는 관심 대상의 임의의 핵산 시료일 수 있다. 이러한 핵산 시료의 원천, 확인 및 제조는 공지되어 있다. 증폭 또는 탐지방법에 사용되는 것으로 공지된 또는 확인된 핵산 시료는 본 명세서에서 설명된 방법에 이용되는 것이 바람직하다. 핵산 시료는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 세포, 조직, 또는 체액 이를 테면 혈액, 소변, 정액, 림프액, 뇌척수액, 또는 양수, 또는 기타 생물학적 시료, 이를 테면 조직 배양 세포, 볼의 스왑, 구강청결제, 대변, 조직 편, 흡입 생검, 그리고 고고학적 시료 이를 테면 뼈 또는 미라 조직에서 취한 핵산 시료가 될 수 있다. 유용한 유형의 핵산 시료는 혈액 시료, 소변 시료, 정액 시료, 림프액 시료, 뇌척수액 시료, 양수 시료, 생검 시료, 세침흡인 생검 시료, 암 시료, 종양 시료, 조직 시료, 세포 시료, 세포 용해물 시료, 미정제 세포 용해물 시료, 법의학적 시료, 고고학적 시료, 감염 시료, 병원 감염 시료, 생산 시료, 약물 준비 시료, 생물학적 분자 생산 시료, 단백질 조제물(preparation) 시료, 지질 조제물 시료, 및/또는 탄수화물 조제물 시료를 포함한다.
전체 게놈 증폭을 위하여, 바람직한 핵산 시료는 단일 세포에서 취한 핵산 시료이다. 공개된 방법에 이용하기 위한 핵산 시료는 바람직하게는 복합적이고, 비-반복적인 핵산분자와 시료들이다. 핵산 시료가 게놈 핵산 시료인 경우, 게놈은 임의의 관심 유기체의 게놈이 될 수 있다. 예를 들면, 게놈은 바이러스 게놈, 박테리아 게놈, 진정세균(eubacterial) 게놈, 고고학 박테리아 게놈, 곰팡이 게놈, 미생물 게놈, 진핵생물 게놈, 식물 게놈, 동물 게놈, 척추동물 게놈, 무척추동물 게놈, 곤충 게놈, 포유류 게놈, 또는 인간 게놈일 수 있다. 표적 게놈은 바람직하게는 순수 또는 실질적으로 순수하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 예를 들면, 동물 원천의 게놈 시료는 오염 또는 감염 유기체로부터 취한 핵산을 포함할 수 있다.
핵산 시료는 예를 들면, 동일한 또는 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 조합으로부터 취한 하나 또는 그 이상의 전체 게놈; 동일한 또는 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 조합으로부터 취한 하나 또는 그 이상의 부분적 게놈; 동일한 또는 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 조합으로부터 취한 하나 또는 그 이상의 전체 염색체; 동일한 또는 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 조합으로부터 취한 하나 또는 그 이상의 부분 염색체; 동일한 또는 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 조합으로부터 취한 하나 또는 그 이상의 염색체 단편들; 하나 또는 그 이상의 인공 염색체; 하나 또는 그 이상의 효모 인공 염색체; 하나 또는 그 이상의 박테리아 인공 염색체; 하나 또는 그 이상의 코스미드; 또는 이들의 임의의 조합이거나 또는 이로부터 유도될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성
프라이머들, 탐지 프로브들, 어드레스(address) 프로브들, 그리고 임의의 다른 올리고뉴클레오티드는 확립된 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 생산 또는 합성하는 방법들은 당분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법들은 표준 효소적 절단에 이어서 뉴클레오티드 단편 단리에서부터 순수한 합성 방법, 예를 들면, 시아노에틸 포스포라미디트 방법에 의한 합성 방법까지 다양할 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6). DNA 단편들의 고형 상 화학 합성은 보호된 뉴클레오시드 시아노에틸 포스포라미디트를 이용하여 통상적으로 실행된다(S. L. Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859). 이 방법에서 처음 5＇-보호된 뉴클레오시드의 3＇-히드록실기는 우선 폴리머 서포트에 우선 공유적으로 부착된다 (R. C. Pless et al. (1975) Nucleic Acids Res. 2:773 (1975)). 그 다음 올리고뉴클레오티드의 합성은 부착된 뉴클레오시드의 5＇-히드록실기의 탈보호, 그 다음 이어나오는 뉴클레오시드-3＇-포스포라미디트를 탈보호된 히드록실기에 연결시켜 진행된다 (M. D. Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185). 생성된 아인산염 트리에스테르는 최종적으로 포스포로트리에스테르로 산화되어 뉴클레오티드간 결합이 완성된다 (R. L. Letsinger et al. (1976) J. Am. Chem. Soc. 9:3655). 대안으로, 포스포로티오에이트 링키지의 합성은 아인산염 트리에스테르의 유황처리(sulfurization)에 의해 실행될 수 있다. 몇 가지 화학물질이 이 반응을 실행하는데 이용될 수 있는데, 그 중에서 3H-1,2-벤조디티올-3-온, 1,1-디옥시드가 있다 (R.P. Iyer, W. Egan, J.B. Regan, and S.L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 1253-1254). 원하는 길이 및 서열의 올리고뉴클레오티드가 수득될 때까지 탈보호, 커플링 그리고 산화 단계는 반복된다. 올리고뉴클레오티드를 생성시키는 다른 방법들 이를 테면 H-포스포네이트 방법 (Hall et al, (1957) J. Chem. Soc., 3291-3296) 또는 Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (포스포트리에스테르 및 아인산염-트리에스테르 방법), 그리고 Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (포스포트리에스테르 방법)에서 설명된 것과 같은 포스포트리에스테르 방법이 있다. 단백질 핵산 분자들은 공지된 방법들 이를 테면 Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)에서 설명된 방법들을 이용하여 만들 수 있다. 다른 형태의 올리고뉴클레오티드 합성은 U.S. 특허 번호 6,294,664 및 U.S. 특허 번호 6,291,669에서 설명된다.
올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 하부단위 블록의 하부단위들이 합성되는 동안 올리고뉴클레오티드 쇄에 추가되는, 순차적인 순서에 의해 일반적으로 결정된다. 각 추가 라운드는 상이한, 특이적 뉴클레오티드 전구물질(precursor), 또는 하나 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오티드 전구물질들의 혼합물이 관련될 수 있다. 특이적 서열의 공개된 프라이머들의 경우, 특이적 뉴클레오티드 전구물질들이 순차적으로 추가될 것이다.
본 명세서에서 설명된 많은 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 특정 부분에 상보적이도록 기획되어, 안정적인 하이브리드가 이들 사이에 형성될 수 있다. 이들 하이브리드의 안정성은 공지된 방법들 이를 테면 Lesnick and Freier, Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw et al., Biotechniques 8:674-678 (1990), 그리고 Rychlik et al., Nucleic Acids Res. 18:6409-6412 (1990)에서 설명된 방법들에 의해 산출될 수 있다.
이들의 관련 기능이 유지되는 한, 프라이머들, 탐지 프로브들, 어드레스 프로브들, 그리고 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이 만들어질 수 있거나 또는 변형된 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다. 많은 변형된 뉴클레오티드가 공지되어 있으며, 올리고뉴클레오티드에 이용될 수 있고, 그리고 본 명세서의 도처에서 공개된다.
키트( Kits)
상기에서 설명된 재료들 뿐만 아니라 다른 재료들은 임의의 적절한 조합에 의해 공개된 방법을 실행하거나 또는 지원하는데 유용한 키트로 포장될 수 있다. 주어진 키트 안에 키트 성분은 공개된 방법에 함께 이용되도록 적합하게 기획되는 것이 유용하다. 예를 들면 핵산 시료의 증폭을 위한 키트, 공조 핵산과 DNA 중합효소가 포함된 키트가 공개된다. 또한 키트는 뉴클레오티드, 완충액, 탐지프로브들, 형광 변화 프로브들, 용해 용액, 안정화 용액, 변성 용액, 또는 조합을 포함할 수 있다.
용도(Uses)
공개된 방법 및 조성물은 세포 안에 존재하는 핵산 분석 (예를 들면, 세포 내 게놈 DNA의 분석), 질환 탐지, 돌연변이 탐지, 유전자 발견, 유전자 메핑(분자 하플로타이핑), 그리고 농업 연구등이 포함되나 이에 국한되지 않는 많은 분야에 응용될 수 있다. 전체 게놈 증폭이 특히 유용하다. 다른 용도에는 예를 들면, 세포 안 그리고 게놈 DNA 어레이상에서 핵산 탐지; 분자 하플로타이핑; 돌연변이 탐지; 유전되는 질환의 탐지 이를 테면 낭성섬유증, 근위축병, 당뇨병, 혈우병, 겸상적혈구빈혈; 암 이를 테면 전립선암, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 고환암, 췌장암의 전조에 대한 평가가 포함된다.
증폭(Amplification)
본 방법에 사용하는데 적합한 증폭 방법은 예를 들면, 중합효소 쇄 반응 (PCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 리게이즈(ligase) 쇄 반응 (LCR), 전사-기반 증폭 시스템 (TAS), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) 반응, 자체-지속된 서열 복제 (3SR), 가닥 변위 증폭 (SDA) 반응, 부메랑 DNA 증폭 (BDA), Q-베타 복제: 또는 등온(isothermal) 핵산 서열 기반 증폭을 포함한다. 각각 설명된 증폭 방법들은 하기에 간단하게 설명되며, 이들은 당업계에 잘 알려져 있다.
PCR은 특이적 주형 DNA 서열의 많은 복사체를 만드는 기술이다. 이 반응은 다중 증폭 사이클로 구성되며, 복사되는 서열의 5＇ 및 3＇ 단부에 혼성화되는 한 쌍의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 이용하여 시작된다. 증폭 사이클은 처음 변성, 그리고 최대 50회 사이클의 어닐링, 가닥 연장 (또는 연장) 그리고 가닥 분리 (변성)를 포함한다. 반응의 각 사이클에서, 프라이머들 사이의 DNA 서열이 복사된다. 프라이머들은 복사된 DNA 뿐만 아니라 원래 주형 서열에 결합할 수 있고, 따라서, 총 복사체의 수는 시간의 경과에 따라 기하급수적으로 증가된다. PCR은 Whelan, et al, Journal of Clinical Microbiology, 33(3):556-561 (1995)에 따라 실행될 수 있다. 간략하게 설명하자면, PCR 반응 혼합물은 2가지 특이적 프라이머들, dNTPs, Taq 중합효소, 그리고 1X PCR 완충액을 포함하고, 이 반응 혼합물은 유전자 증폭장치(thermal cycler)를 이용하여 증폭된다. 사이클링(Cycling) 매개변수는 예를 들면, 프라이머의 용융 온도 또는 연장되는 핵산의 길이 등에 따라 변화될 수 있다. 당업자는 표적 서열을 증폭시키는데 적절한 프라이머들을 기획하고 준비할 수 있다. 본 발명에 이용되는 증폭 프라이머들의 길이는 뉴클레오티드 서열 실체 그리고 시험관 핵산 증폭 동안 핵산이 혼성화되는 또는 이용되는 온도가 포함된 몇 가지 인자들에 따라 달라진다. 특정 서열 실체의 증폭 프라이머에 적합한 길이를 결정하는데 필수적인 고려사항은 당업계 숙련자들에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 설명된 사항들이 포함된다. 예를 들면, 짧은 핵산 또는 올리고뉴클레오티드의 길이는 이의 혼성화 특이성 또는 선택성과 관련될 수 있다.
실시간 PCR은 PCR-기반 증폭 방법으로, 이때 PCR 산물은 실시간으로 탐지되며, 즉, PCR 산물의 축적은 각 사이클에서 결정될 수 있다. 실시간 PCR의 예로는 적합한 증폭/분석기 이를 테면, 고처리량 실시간 PCR 시스템인 Applied Biosystems (ABI) Prism 7900HT 서열 Detection System과 함께 TaqMan 프로브들을 이용하여 실행된다. 간략하게 설명하자면, 증폭된 표적 서열에 특이적인 TaqMan 프로브들이 PCR 증폭 반응에 포함된다. 이들 프로브는 5＇ 단부에 리포터 염료를 그리고 3＇ 단부에 소광제 염료를 포함한다. 상이한 표적 서열에 혼성화되는 프로브들은 상이한 형광 리포터 염료에 접합된다(conjugated). 이 방식에서 한 개 이상의 표적 서열은 동일한 반응 용기에서 분석될 수 있다. PCR 동안, 형광 라벨된 프로브들은 이들의 각 표적 서열에 특이적으로 결합되고; Taq 중합효소의 5＇ 뉴클레아제 활성은 프로브로부터 리포터 염료를 절단하고, 그리고 형광 신호가 생성된다. 표적 서열은 프로브에 상보적이며, PCR 동안 증폭된 경우에만, 형광 신호의 증가가 탐지된다. 프로브와 표적 사이에 부정합(mismatch)은 프로브 혼성화와 분열의 효과를 상당히 감소시킨다. ABI Prism 7700HT 또는 7900HT 서열 탐지 시스템은 PCR 유전자 증폭 사이클 동안 형광의 증가를 측정하고, 이는 PCR 산물 축적의 ＂실시간＂ 탐지를 제공한다. ABI Prism 7900HT 또는 7900HT 서열 탐지기 상에서 실시간 탐지는 형광을 감시하고, 각 PCR 사이클 동안 Rn을 산출한다. 임계 사이클, 또는 Ct 값은 형광이 임계값(threshold value)을 교차하는 사이클이다. 임계값은 서열 탐지 시스템 소프트웨어에 의해 또는 수작업으로 결정된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 ＂RT-PCR＂은 단일 분석에서 역전사와 PCR의 조합을 지칭한다. ＂역 전사＂는 RNA 주형이 역 전사효소에 의해 DNA 분자로 전사되는 과정이다. 따라서, ＂역전사효소＂는 RNA-의존적 DNA 중합효소로 특징화되는 중합효소의 한 종류이며, 즉, 이러한 중합효소는 DNA 분자를 합성하기 위하여 RNA 주형을 이용한다. 역사적으로, 역전사효소는 mRNA를 cDNA로 역전사시킬 때 이용되었다. 그러나, 역전사효소는 다른 유형의 RNAs 이를 테면 바이러스 게놈 RNA 또는 바이러스 서브-게놈 RNA를 역전사시킬 때 이용될 수 있다. 표준 역전사효소는 Maloney 뮤린 백혈병 바이러스 역 전사효소 (MoMuLV RT) 및 Avian 근원세포 바이러스 (AMV)를 포함한다. 이들 효소는 5＇->3＇ RNA-의존적 DNA 중합효소 활성, 5＇->3＇ DNA-의존적 DNA 중합효소 활성, 그리고 RNase H 활성을 보유한다. 그러나, 많은 DNA-의존적 DNA 중합효소들과는 달리, 이들 효소는 ＂프루트리딩(proofreading)＂(이를 테면, 전사 동안 만들어진 오류의 수정)에 필요한 3＇->5＇ 엑소뉴클레아제 활성이 부족하다. RNA의 DNA 복사체가 준비된 후, DNA 복사체는 다양한 DNA 증폭 방법 이를 테면 PCR을 받게될 수 있다.
LCR은 PCR과 유사한 DNA 증폭 방법이지만, 단 차이점은 2개의 프라이머를 사용하는 대신 4개의 프라이머를 이용하며, 효소 리게이즈를 이용하여 DNA의 2개 분절을 결찰 또는 연결시킨다는 점이다. LCR은 Moore et al., Journal of Clinical Microbiology 36(4)1028-1031 (1998)에 따라 실행될 수 있다. 간략하게 설명하자면, LCR 반응 혼합물은 두 쌍의 프라이머들, dNTP, DNA 리게이즈 그리고 DNA 중합효소를 포함하며, 표적 유기체로부터 단리된 핵산 100 μl에 추가되는 약 90 μl에 상당하다. 증폭은 유전자 증폭기(thermal cycler) (예컨데, Abbott Labs의 LCx, North Chicago, Ill.)에서 실행된다.
TAS는 각 사이클이 cDNA 합성 단계와 RNA 전사 단계를 포함하는 핵산 증폭 시스템이다. cDNA 합성 단계에서, DNA-의존적 RNA 중합효소 (이를 테면, 중합효소-결합 서열 또는 PBS)에 의해 인지되는 서열이 두개-도메인 올리고뉴클레오티드 프라이머을 이용하여 증폭되는 표적 또는 마커 서열의 하류 cDNA 복사체 안으로 삽입된다. 제 2 단계에서 RNA 중합효소는 cDNA 주형으로부터 RNA의 다중 복합체를 합성하는데 이용된다. TAS를 이용한 증폭은 단지 몇개의 사이클만을 요구하는데 그 이유는 DNA-의존적 RNA 전사는 cDNA 주형의 각 복사체에 대해 10-1000개의 복사체를 야기할 수 있기 때문이다. TAS는 Kwoh et al., PNAS 86:1173-7 (1989)에 따라 실행될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 추출된 RNA는 TAS 증폭 완충액 및 소 혈청 알부민, dNTPs, NTPs, 그리고 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머들와 복합되며, 이중 하나는 PBS를 포함한다. 시료는 가열되어 RNA 주형이 변성되고, 그리고 프라이머 어닐링 온도로 냉각된다. 역전사효소 (RT)는 cDNA 연장을 허용하는 적절한 온도에서 항온처리된 시료에 추가된다. 후속적으로 T7 RNA 중합효소가 추가되고, 그리고 시료는 RNA 합성을 위하여 37℃에서 대략적으로 25 분간 항온처리된다. 그 다음 상기 단계들이 반복된다. 대안으로, 처음 cDNA 합성 후, 100℃에서 1분간 변성 후 RT와 RNA 중합효소 둘다 추가되고, 대략적으로 30 분간 37℃ 에서 RNA 연장이 이어진다. TAS는 Wylie et al., Journal of Clinical Microbiology, 36(12):3488-3491 (1998)에 따라 고형 상에서 또한 실행될 수 있다. 이 방법에서 특이적 포획 프라이머들이 포함된 자성 비드에 의해 핵산 표적들이 포획된다. 포획된 표적을 가진 비드는 세척되고, 펠렛화된 후 증폭 프라이머들, dNTP, NTP, 2500 U의 역전사효소 및 2500 U의 T7 RNA 중합효소가 포함된 증폭 시약들이 추가된다. 100 μl의 TMA 반응 혼합물은 튜브 안에 넣고, 200 μl의 오일 시약이 추가되고, 증폭은 한 시간 동안 수조 안에서 42℃에서 항온처리에 의해 실행된다.
NASBA는 RNA 또는 DNA 표적으로부터 RNA를 증폭시키는 전사-기반 증폭 방법이다. NASBA는 한 가지 온도에서 단일 혼합물 안에 있는 핵산의 연속 증폭을 위한 방법이다. 예를 들면, RNA 증폭을 위하여, 조류 골수아세포종 바이러스 (AMV) 역전사효소, RNase H 및 T7 RNA 중합효소가 이용된다. 이 방법은 Heim, et al., Nucleic Acids Res., 26(9):2250-2251 (1998)에 따라 실행될 수 있다. 간략하게 설명하자면, NASBA 반응 혼합물은 2가지 특이적 프라이머들, dNTP, NTP, 6.4 U의 AMV 역전사효소, 0.08 U의 대장균(Escherichia coli) Rnase H, 그리고 32 U의 T7 RNA 중합효소를 포함한다. 증폭은 201의 총 용적에서 120분간 41℃에서 실행된다.
관련된 방법에서, 자가-지속된 서열-복제 (3SR) 반응, 3가지 효소 활성을 이용하여 시험관에서 표적 DNA 또는 RNA 서열의 등온 증폭: 역전사효소, DNA-의존적 RNA 중합효소 그리고 대장균(Escherichia coli) 리보뉴클레아제 H. 이 방법은 E. coli 리보뉴클레아제 H없이 T7 RNA 중합효소로 증폭이 되도록 조류 골수아세포종 바이러스 (AMV) 역전사효소 대신 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-1 역전사효소를 이용함으로써 3-효소 시스템에서 2-효소 시스템으로 변형될 수 있다. 2-효소 3SR에서, 3-효소 3SR와 비교하였을 때 더 순수한 형태의 증폭된 RNA가 획득된다 (Gebinoga & Oehlenschlager European Journal of Biochemistry, 235:256-261, 1996).
SDA는 등온 핵산 증폭 방법이다. 제한효소 부위가 포함된 프라이머가 이 주형에 어닐된다. 그 다음 증폭 프라이머들은 5＇ 인접 서열에 어닐되고 (니크가 형성) 그리고 증폭은 고정된 온도에서 시작된다. 새로 합성된 DNA 가닥들은 제한 효소에 의해 니크(nicked)되고, 중합효소 증폭은 다시 시작되어 새로 합성된 가닥은 대체된다. SDA는 Walker, et al., PNAS, 89:392-6 (1992)에 따라 실행될 수 있다. 간략하게 설명하자면, SDA 반응 혼합물은 4가지 SDA 프라이머들, dGTP, dCTP, TTP, dATP, 150 U의 Hinc II, 그리고 5 U의 엑소뉴클레아제-결손된 E. coli DNA 중합효소 I의 큰 단편 (exo.sup.- Klenow 중합효소). 시료 혼합물은 4분간 95℃ 에서 가열되어 표적 DNA가 변성되고, 그 다음 효소가 추가된다. 두 가지 효소가 추가된 후, 증폭은 37℃에서 120분간 50 μl의 총 용적에서 실행된다. 그 다음, 95℃에서 2분간 가열됨으로써 반응은 종료된다.
부메랑 DNA 증폭 (BDA)은 중합효소가 단일 프라이머-결합 부위로부터 연장이 시작되고, 그 다음 다른 가닥 주변에 루프를 만들고, 결국 DNA 상에 있는 원래 프라이밍 부위로 회귀되는 방법이다. BDA는 이의 단일 프라이머 사용함으로써 PCR과는 상이하다. 이 방법은 시료 DNA의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 점착성 단부들을 가진 별개 DNA 단편들이 만들어지고, 이 단편들은 ＂어뎁터＂ 폴리뉴클레오티드 (결찰가능한 단부와 스페이스 서열에 의해 분리되는 제 1 및 제 2의 자가-상보적인 서열을 포함)에 결찰되고, 이에 따라 결찰된 듀플렉스가 형성되는 것과 관련된다. 결찰된 듀플렉스들은 변성되어 주형이 형성되고, 주형의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 관심의 표적 또는 마커 서열 안에 특이적 서열에 어닐된다. 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장되어 듀플렉스 산물이 형성되고, 이어서 듀플렉스 산물이 변성된다. 어닐링, 연장, 및 변성의 후속 다중 사이클이 실행되어 원하는 수준의 증폭이 획득된다 (U.S. 특허 번호 5,470,724).
Q-베타 복제 시스템은 주형으로 RNA를 이용한다. Q-베타 복제효소는 콜리파아지 Qβ의 단일-가닥으로 된 RNA 게놈을 합성한다. RNA가 Q-베타 복제효소에 의해 복제될 때, RNA를 절단하고, 관심 핵산에 결찰시키면 이 서열의 복제가 허용된다 (Kramer & Lizardi Trends Biotechnol. 1991 9(2):53-8, 1991).
다양한 증폭 효소들은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 역전사효소, Q-베타 복제효소, 열안정적인 DNA 및 RNA 중합효소들이 포함된다. 이러한 그리고 기타 증폭 반응은 효소에 의해 촉매되기 때문에, 단일 단계 분석에서 최종 탐지가 증폭 기반인 경우라면 핵산 방출 시약과 탐지 시약은 증폭 효소의 잠재적인 억제제가 되어서는 안된다.
핵산 시료 안에 핵산 분자들의 증폭은 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 0.01%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 0.1%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 1%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 5%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 10%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 20%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 30%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 40%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 50%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 60%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 70%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 80%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 90%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 95%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 96%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 97%를 복제, 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 98%를 복제, 또는 핵산 시료 안에 핵산 서열의 최소한 99%를 복제할 수 있다.
상기에서 설명되고, 본원 명세서 도처에서 설명된 다양한 서열은 예를 들면, 1개의 표적 서열, 2개의 표적 서열, 3개의 표적 서열, 4개의 표적 서열, 5개의 표적 서열, 6개의 표적 서열, 7개의 표적 서열, 8개의 표적 서열, 9개의 표적 서열, 10개의 표적 서열, 11개의 표적 서열, 12개의 표적 서열, 13개의 표적 서열, 14개의 표적 서열, 15개의 표적 서열, 16개의 표적 서열, 17개의 표적 서열, 18개의 표적 서열, 19개의 표적 서열, 20개의 표적 서열, 25개의 표적 서열, 30개의 표적 서열, 40개의 표적 서열, 50개의 표적 서열, 75개의 표적 서열, 또는 100개의 표적 서열이 될 수 있다. 서열은 예를 들면, 최소한 1개의 표적 서열, 최소한 2개의 표적 서열, 최소한 3개의 표적 서열, 최소한 4개의 표적 서열, 최소한 5개의 표적 서열, 최소한 6개의 표적 서열, 최소한 7개의 표적 서열, 최소한 8개의 표적 서열, 최소한 9개의 표적 서열, 최소한 10개의 표적 서열, 최소한 11개의 표적 서열, 최소한 12개의 표적 서열, 최소한 13개의 표적 서열, 최소한 14개의 표적 서열, 최소한 15개의 표적 서열, 최소한 16개의 표적 서열, 최소한 17개의 표적 서열, 최소한 18개의 표적 서열, 최소한 19개의 표적 서열, 최소한 20개의 표적 서열, 최소한 25개의 표적 서열, 최소한 30개의 표적 서열, 최소한 40개의 표적 서열, 최소한 50개의 표적 서열, 최소한 75개의 표적 서열, 또는 최소한 100개의 표적 서열이 될 수 있다.
서열은 예를 들면, 1개의 표적 서열, 2개의 상이한 표적 서열, 3개의 상이한 표적 서열, 4개의 상이한 표적 서열, 5개의 상이한 표적 서열, 6개의 상이한 표적 서열, 7개의 상이한 표적 서열, 8개의 상이한 표적 서열, 9개의 상이한 표적 서열, 10개의 상이한 표적 서열, 11개의 상이한 표적 서열, 12개의 상이한 표적 서열, 13개의 상이한 표적 서열, 14개의 상이한 표적 서열, 15개의 상이한 표적 서열, 16개의 상이한 표적 서열, 17개의 상이한 표적 서열, 18개의 상이한 표적 서열, 19개의 상이한 표적 서열, 20개의 상이한 표적 서열, 25개의 상이한 표적 서열, 30개의 상이한 표적 서열, 40개의 상이한 표적 서열, 50개의 상이한 표적 서열, 75개의 상이한 표적 서열, 또는 100개의 상이한 표적 서열이 될 수 있다. 서열은 예를 들면, 최소한 1개의 표적 서열, 최소한 2개의 상이한 표적 서열, 최소한 3개의 상이한 표적 서열, 최소한 4개의 상이한 표적 서열, 최소한 5개의 상이한 표적 서열, 최소한 6개의 상이한 표적 서열, 최소한 7개의 상이한 표적 서열, 최소한 8개의 상이한 표적 서열, 최소한 9개의 상이한 표적 서열, 최소한 10개의 상이한 표적 서열, 최소한 11개의 상이한 표적 서열, 최소한 12개의 상이한 표적 서열, 최소한 13개의 상이한 표적 서열, 최소한 14개의 상이한 표적 서열, 최소한 15개의 상이한 표적 서열, 최소한 16개의 상이한 표적 서열, 최소한 17개의 상이한 표적 서열, 최소한 18개의 상이한 표적 서열, 최소한 19개의 상이한 표적 서열, 최소한 20개의 상이한 표적 서열, 최소한 25개의 상이한 표적 서열, 최소한 30개의 상이한 표적 서열, 최소한 40개의 상이한 표적 서열, 최소한 50개의 상이한 표적 서열, 최소한 75개의 상이한 표적 서열, 또는 최소한 100개의 상이한 표적 서열일 수 있다.
탐지
증폭 산물은 임의의 핵산 탐지 기술을 이용하여 탐지될 수 있다. 실시간 탐지를 위하여, 증폭 동안 증폭 산물과 증폭 과정이 탐지된다. 실시간 탐지는 형광 변화 프로브들과 형광 변화 프라이머들의 한 가지 또는 그 이상의 조합을 이용하여 통상 실시된다. 기타 탐지 기술은 단독으로 또는 실시간 탐지 및/또는 형광 변화 프로브들과 프라이머들이 관련된 탐지와 함께 이용될 수 있다. 핵산을 탐지하기 위한 많은 기술들이 공지되어 있다. 증폭된 서열의 뉴클레오티드 서열은 임의의 적합한 기술을 이용하여 또한 결정될 수 있다.
예를 들면, 핵산 산물은 다양한 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 전기영동 (예컨데, 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동)에 의해 탐지될 수 있다. 증폭된 단편들은 추가 탐지 방법들, 예를 들면, 변이체 서열 (예컨데, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs))을 겪을 수 있다. 예시적인 방법은 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장이다(Lindblad-Toh et al., Large-scale discovery and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse. Nature Genet. 2000 April; 24(4):381-6). 이 반응에서 올리고뉴클레오티드 프라이머는 특이적 돌연변이 부위의 5＇에 한 개 뉴클레오티드인 3＇ 단부를 가지도록 기획된다. 일부 구체예들에 있어서, 연장 프라이머들은 태그(tag) 또는 고형상에서 프라이머의 포획을 허용하는 결합쌍 구성요소로 라벨된다. 특정 구체예들에 있어서, 프라이머들은 단일 반응에서 바람직하게는 2개 또는 그 이상의, 더욱 바람직하게는 3개 또는 그 이상의, 4개 또는 그 이상의, 5개 또는 그 이상의, 심지어 10개 또는 그 이상의 상이한 돌연변이들 (다형성)의 다중 탐지가 허용되도록 다양한 길이의 비특이적 폴리뉴클레오티드 (예컨데, 폴리-GACT)로 태그될 수 있다 프라이머는 하나 또는 그 이상의 라벨된 ddNTPs 및 DNA 중합효소 존재하에서 PCR 앰플리콘에 혼성화된다. 중합효소는 한 개 뉴클레오티드에 의해 프라이머를 연장시키고, 연장 프라이머의 3＇ 단부에 한 개의 라벨된 ddNTP가 추가된다. 디데옥시 뉴클레오티드의 추가에 의해 쇄 연장은 종료된다. 한 개 이상의 디데옥시 뉴클레오티드 (예컨데, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP, etc.)가 반응에 이용된다면, 하나 또는 그 이상이 라벨될 수 있다. 다중 라벨들이 이용된다면, 라벨들은 식별가능한 것일 수 있으며, 예컨데, 각각은 상이한 형광 색을 띈 염료로 라벨된다. 산물은 라벨된 올리고뉴클레오티드이며, 이들 각각은 라벨에 근거하여 탐지될 수 있다. 변이체 서열을 탐지하는 추가 방법들은 READIT SNP Genotyping System (Promega Corporation, Madison Wis.) 및 올리고뉴클레오티드 결찰 분석을 포함한다.
실시예
실시예 I: 말라리아를 위한 프라이머들
포획 서열은 55℃의 반응 온도보다 2 내지 5℃ 낮은 Tm을 갖도록 기획된다. 프라이머 서열은 반응 온도보다 대략 10℃ 낮은 Tm을 갖도록 기획되었다. 프라이머의 5＇ 단부를 프로브의 5＇ 단부에 부착시키는 링커가 이용되었다 (도 5 참고).
3＇ TCGCTACGCA 5＇ (서열 번호: 1) [스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18] 5＇ [T(FAM)] ACGGTGAACTCTCA [DABCYL] 3＇ (서열 번호: 2)
3＇ TCGCTACGCA 5＇ (서열 번호: 3) [스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18] 5＇ [T(FAM)]
ACGGTGAACTCTCA [DABCYL] 3＇ (서열 번호: 4)
3＇ TCGCTACGCA 5＇ (서열 번호: 5) [스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18] 5＇ [T(FAM)]
TCTAACGGTGAACTC [DABCYL] 3＇ (서열 번호: 6)
역 프라이머로 레귤라 프라이머가 이용되었으며 포워드(forward) 프라이머로 오직 레귤라 프라이머를 그리고 탐지용으로 Rapid Probe를 이용한 콘트롤이 이용되었다. 프라이머들은 최종 농도 5 mM의 MgCl2 를 가진 GoTaq DNA 마스터 믹스를 이용한 실시간 PCR 반응에서 실행되었다. 최종 프라이머 농도는 250 nM이었다. 반응 조건은 95℃에서 20s, 이어서 95℃, 1s를 45회, 그리고 55℃ 에서 20s이었다.
세 가지 공조 프라이머들 모두 탐지가능한 엠플리콘(amplicon)을 만들었고, 라벨된 포획 서열로부터 탐지가능한 신호를 보유하였다. 프라이머와 포획 서열 사이에 거리가 없는 공조 프라이머는 다른 것들보다 덜 효율적으로 증폭되었다.
어닐링/50℃의 연장 온도로 동일한 실시간 PCR 반응이 반복되었다. 라벨된 포획 서열로부터 생성된 신호는 세 가지 모든 공조 프라이머들에서 더 컸다. 실시간 PCR 효율은 저가 온도에서 개선되지 않은 것으로 나타났다.
실시예 2: 높은 Tm 포획 서열
라벨된 포획 서열은 55℃의 반응 온도보다 7 내지 10℃ 높은 Tm을 가지도록 기획되었다. 역 공조 프라이머는 반응 온도보다 약 2℃ 낮은 Tm을 가진 라벨안된 포획 서열로 만들었다. 프라이머 서열은 반응 온도보다 대략 7 내지 10℃ 높은 Tm을 가지도록 기획되었다.
3＇ TCGCTACGCA 5＇ (서열 번호: 7) [스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18] 5＇ [T(FAM)] ACGGTGAACTCTCATTCCA [DABCYL] 3＇ (서열 번호: 8)
3＇ TCGCTACGCA 5＇ (서열 번호: 9) [스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18] 5＇ [T(FAM)] ACGGTGAACTCTCATTCCA CCG [DABCYL] 3＇ (서열 번호: 10)
3＇ ATTGACATACCTGC 5＇(서열 번호: 11) [스페이스 18][스페이스 18][스페이스 18] 5＇
AGCAAGTGGAATGTT [Phos] 3＇ (서열 번호: 12)
프라이머들은 최종 농도 5 mM의 MgCl2 를 가진 GoTaq DNA 마스터 믹스를 이용한 실시간 PCR 반응에서 실행되었다. 최종 프라이머 농도는 250 nM이었다. 반응 조건은 95℃, 20s에 이어서, 95℃ 에서 1s 를 50회 그리고 55℃에서 20s이다. 실시간 PCR은 40s의 연장 단계와 함께 도한 반복되었다.
높은 Tm 포획 서열과 함께 공조 프라이머들은 실시예 1의 낮은 Tm 포획 서열과 유사한 증폭 효과 및 형광 변화를 가졌다. 연장 시간을 늘려도 증폭 효과가 증가되는 것 같지는 않았다.
실시예 3: 프라이머-이합체들의 제거
공조 프라이머들과 통상적 프라이머들을 위하여 프라이머-이합체들이 합성되었다. 0, 600개, 6,000개 또는 600,000개의 프라이머-이합체들은 60개의 복사체의 말라리아 DNA가 포함된 반응물에 박아넣었다. 프라이머들은 최종 농도 5 mM의 MgCl2 를 가진 GoTaq DNA 마스터 믹스를 이용한 실시간 PCR 반응에서 실행되었다. 최종 프라이머 농도는 250 nM이었다. 반응 조건은 95℃ 에서 20s, 이어서 95℃, 1s를 50회, 그리고 55℃ 에서 20s이었다.
통상적 프라이머들을 가진 콘트롤은 프라이머-이합체들이 박혀있지 않을 때 용이하게 볼 수 있는 양성을 가졌다. 그러나, 600개 정도의 적은 수의 프라이머-이합체들이 박혀있을 때, 신호가 사라졌으며, 가음성(false negatives)이 초래된다. 대조적으로, 공조 프라이머들은 600,000개와 같이 많은 수의 프라이머-이합체들이 박혀있을 때에도 신호 약화 또는 증폭 산물의 손실이 없었다.
2.2% Lonza 플래쉬겔에 PCR 산물을 작용시킬 때, 공조 프라이머들의 경우 프라이머-이합체들이 증폭되지 않았다는 사실이 겔에서 확인되었다. 그러나, 통상적 프라이머들은 명백하게 말라리아 DNA 보다는 프라이머-이합체들을 증폭시켰고, 이는 가음성(false negatives)을 초래하였다.
실시예 4: 프라이머상에서 탐지 기전을 가진 공조 프라이머들
프라이머 상에 탐지 기전이 있는 공조 프라이머들이 만들어졌다:
3＇ [스페이스 3] TTGTAAGGTGAACGA 5＇ (서열 번호: 13) 5＇ [스페이스 18][T(FAM)] actgtatgg [T(BHQ-1)][스페이스 9] CGTCCATACAGTTA 3＇ (서열 번호: 14)
3＇ [스페이스 3] TTGTAAGGTGAACGA 5＇ (서열 번호: 15) 5＇ [스페이스 9][스페이스 18][T(FAM)] atggacg [T(BHQ-1)][스페이스 9] CGTCCATACAGTTA 3＇ (서열 번호: 16)
3＇ [스페이스 3] TTGTAAGGTGAACGA 5＇ (서열 번호: 17) 5＇ [T(FAM)][스페이스 3] taactgtatg [T(BHQ-1)][스페이스 18] CGTCCATACAGTTA 3＇ (서열 번호: 18)
3＇ [스페이스 3] TTGTAAGGTGAACGA 5＇ (서열 번호: 19) [스페이스 9][T(FAM)] actgtatgg [T(BHQ-1)][스페이스 18] CGTCCATACAGTTA 3＇ (서열 번호: 20)
3＇ [스페이스 3] AGATTGTAAGGTGAACGA 5＇ (서열 번호: 21) 5＇ [스페이스 18][T(FAM)] actgtatgg [T(BHQ-1)][스페이스 9] CGTCCATACAGTTA 3＇ (서열 번호: 22)
3＇ [스페이스 3] TTGTAAGGTGAACGA 5＇ (서열 번호: 23) 5＇ [스페이스 18][T(FAM)] actgtatgg [T(BHQ-1)][스페이스 9] CGTCCATACAGTTAT 3＇ (서열 번호: 24)
실시예 5: 포획 서열의 라벨링
P. 팔시파룸(P. falciparum) 실시간 PCR은 GoTaq Colorless Master Mix (Promega)에서 최종 농도 250 nM의 각 프라이머 (PfcF inv, PfcF inv62, PfcF inv62HP 또는 PfcF와 PfcR), 최종 농도 5 mM의 MgCl2 그리고 추가적인 0.25 U/반응의 GoTaq 중합효소 (Promega)로 마스터 믹스를 만들어 실행되었다. 주형의 5,000,000개, 600,000개, 50,000개, 500개 또는 0개의 복사체가 각 반응에 추가되었다. 이 반응은 ABI StepOne에서 실시되었고, 그리고 95℃에서 20s간 변성에 이어서 95℃에서 1 s를 45회, 그리고 55℃ 에서 20 s가 포함되었다. 각 반응은 이중으로 실시되었다.
공조 프라이머들은 효과적인 증폭을 할 수 잇으며, 프라이머-이합체들의 간섭을 제거할 수 있다고 설명된 바, 우리는 프로브를 프라이머 안에 혼입시키려는 시도를 하였다. 이는 포획 서열을 라벨링함으로써 실행되었다. 우선, 역전된 프라이머들은 반응 온도보다 낮고, 그리고 반응 온도보다 높은 Tm을 가지고, 형광단의 더 큰 소광을 독려하기 위한 헤어핀 형성되는 포획 서열(Pf cF inv, Pf cF inv 62 그리고 Pf cF inv 62HP)이 포함된, 포획 서열의 5＇ 단부에 부착된다. 그러나, 이들 프라이머로부터는 거의 신호가 관찰되지 않았고, 전기영동 겔에서 매우 소수의 프라이머들이 포획 서열을 절단함을 보여주었다 (도 8 - 공조 프라이머들의 앰플리콘 아래 거의 보이지 않은 밴드들).
링커의 입체 형태적 착색은 포획 서열의 5＇ 단부를 들어올리고, 중합효소가 이 서열을 절단하기 보다는 전치시키는 것으로 보인다. 결과적으로, 착색은 5＇ 단부로부터 3＇ 단부로 이동되는 경우(예컨데 링커가 부착된 위치의 변경에 의해), 중합효소는 더 큰 효율로 포획 서열을 절단할 수 있을 것이다. 이 가설을 테스트할 때, 형광 신호는 급격하게 상승되었다 (도 8). 라벨된 포획 서열은 반응 온도보다 낮은 Tm을 보유하지만, 신호는 통상적 혼성화 프로브들로부터 얻은 신호보다는 여전히 2.5배 더 높았다.
실시예 6: SNP 차등
리팜피신 저항성을 부여하는 rpoB 유전자내 D516V 돌연변이에 대하여 M. 투베로클로시스(M. tuberculosis) 실시간 PCR은 GoTaq Colorless Master Mix (Promega)에서 최종 농도 250 nM의 각 프라이머/프로브 (MTb cF, MTb P, 그리고 MTb cR1, MTb cR2, MTb cR3, MTb cR4, MTb cR5, MTb cR6, MTb cR7, MTb cR8 또는 MTb cR9중 하나), 최종 농도 5 mM의 MgCl2 그리고 추가적인 0.25 U/반응의 GoTaq 중합효소 (Promega)로 마스터 믹스를 만들어서 실시되었다. 주형 (MTb WT 또는 MTb D516V)의 50,000개 복사체가 각 반응에 추가되었다. 각 반응은 이중으로 실시되었다. 이 반응은 ABI 7500에서 실시되었고, 그리고 95℃에서 20s간 변성에 이어서 95℃에서 3 s를 45회, 그리고 55℃ 에서 3 s가 포함되었다. Ct＇s는 10,000의 임계치와 함께 기계에 의해 자동 측정되며, △Rn은 사이클 45의 송출된 데이터로부터 얻었다.
끝으로, SNP를 차등시키는 이들 효율적인 프라이머-이합체 없는, 공조 프라이머들의 능력이 분석되었다. 공조 프라이머들은 인도에서 최대 7.4%의 리팜피신 저항성 M. 투베로클로시스(M. tuberculosis ) 단리체에 존재하는 rpoB 유전자 D516V 돌연변이에 대해 기획되었다. 2가지 상이한 전략이 이용되었다: 1) ARMS 방법 그리고 2) 라벨된 포획 서열 차등. 두 방법들은 표준 프라이머들과 프로브들에 유사하게 SNP를 차등시키는 능력을 초래하였다 (도 9 및 표 1에 요약된 데이터).
프로브 기반 방법의 경우, 공조 프라이머 MTb cR6은 돌연변이형과 야생형 균주들 간에 최대 비율의 형광 신호를 제공하였다. ARMS 기반 방법의 경우, MTb cR8은 Ct 값에서 최고의 차이를 제공하였다. 이 둘 모두 도 9에 나타낸다.
Figure pct00004
표 1은 SNP 차등 방법의 요약을 나타낸다. 각 프라이머는 이용된 ARMS 또는 프로브 (라벨된 포획 서열)의 기반 차등, 프라이머 또는 프로브의 예상 Tm의 숫자가 반응온도보다 낮은지 또는 높은지(반응 온도보다 낮은 값은 괄호안에 붉은 글씨로 나타낸다), 돌연변이형과 야생형 Ct 값의 차이 그리고 돌연변이형과 야생형 형광의 비율과 함께 나타낸다.
Figure pct00005
공개된 방법 및 조성물은 설명된 특정 방법, 프로토콜 및 시약은 변화될 수 있기 때문에 이에 국한되지 않음을 인지해야 한다. 또한, 본 명세서에서 설명된 방법은 특정 구체예들을 설명하기 위함이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니며, 오직 본원 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다는 것 또한 인지해야 한다.
본원 명세서 및 첨부된 청구범위에서 이용된 바와 같이 단수는 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들면, ＂한 개 프라이머＂에는 다수의 이러한 프라이머들이 포함되고, ＂상기 프라이머＂는 하나 또는 그 이상의 프라이머 및 당업계 숙련자들에게 공지된 이의 등가의 것들이 포함된다.
＂임의선택적＂ 또는 ＂임의선택적으로＂는 후속적으로 설명된 사건, 환경 또는 재료들이 발생되거나 또는 발생되지 않거나 또는 존재할 수 있고, 그리고 설명은 사건, 환경 또는 재료가 발생되는 또는 존재하는 경우와 그리고 발생되지 않거나 또는 존재하지 않는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 설명된 범위는 ＂약(about)＂ 한 가지 특정 값에서부터 및/또는 ＂약(about)＂ 또다른 한 가지 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위로 표현될 때 또는 다른 명시적인 언급이 없는 한, 한 가지 특정 값에서부터 및/또는 다른 한 가지 특정 값까지의 범위로 간주된다. 유사하게, 값이 ＂약＂이라는 어구와 함께 근사치로 표현될 때, 다른 명시적인 표현이 없는 한 특정 값은 또다른 값을 이루며, 이는 구체적으로 공개된 구체예로 간주되어야 한다는 것도 인지할 것이다. 각 범위의 종점은 다른 명시적인 표현이 없는 한, 다른 종점과 관련되며, 그리고 다른 종점과는 독립적으로 의미가 있음을 더 인지할 것이다. 끝으로, 모든 개별 값과 명시적으로 공개된 범위내에 포함되는 하위 범위 값은 다른 명시적 언급이 없는 한 구체적으로 고려되고, 공개된 것으로 이해되어야 할 것이다. 전술한 내용은 특정 경우에서 구체예 일부 또는 전부가 명시적으로 공개됨과 상관없이 적용된다.
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 공개된 방법 및 조성물이 속하는 당업계 숙련자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 공개된 유사한 또는 대등한 임의의 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 교시에 이용될 수 있지만, 구체적으로 유용한 방법, 장치 및 재료들은 설명된 것과 같다. 본 명세서에서 언급된 공개물 및 이들이 언급하는 재료들은 참고자료에 편입된다. 본원에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공개에 선행하지 않는다는 것의 승인으로서 간주되는 것은 없다
당업자는 본 명세서에서 공개된 방법 및 조성물의 특이적 구체예들에 대해 많은 등가물을 인지하고 통상적인 실험을 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포괄된다.

Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 공조 핵산 분자:
    a. 제 1 핵산 서열, 여기에서 제 1 핵산 서열은 표적 핵산의 제 1 영역에 상보적이며, 그리고 제 1 핵산은 3＇ 단부에서 연장가능하고;
    b. 제 2 핵산 서열, 여기에서 제 2 핵산 서열은 표적 핵산의 제 2 영역에 상보적이며, 표적 핵산 존재하에서 이것은 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부의 하류에서 표적 핵산에 혼성화되며;
    c. 상기 제 1 및 제 2 핵산 서열은 동시에 표적에 혼성화는 것이 허용되는 방식으로 상기 제1 및 제 2 핵산 서열을 연결시키는 링커.
  2. 청구항 1에 있어서, 여기에서 제 1 핵산 분자는 표적에 혼성화되는 제 2 핵산 분자없이 표적에 혼성화되지 않는, 공조 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 여기에서 제 2 핵산 분자는 표적에 혼성화되는 제 1 핵산 분자없이 표적에 혼성화되지 않는, 공조 핵산 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 여기에서 제 1 또는 제 2 핵산 분자는 표적에 이둘중 하나가 혼성화되는 않으면, 나머지 하나도 표적에 혼성화되지 않는, 공조 핵산 분자.
  5. 청구항 1에 있어서, 여기에서 제 1 핵산 분자의 효과적인 용융 온도 (Tm)는 이에 부착된 제 2 핵산 서열 없이 제 1 핵산 서열의 단리된 Tm과 비교하였을 때 최소한 1℃ 증가된, 공조 핵산 분자.
  6. 청구항 1에 있어서, 여기에서 공조 핵산 분자는 라벨을 포함하는, 공조 핵산 분자.
  7. 청구항 6에 있어서, 여기에서 제 2 핵산 서열은 라벨을 포함하는, 공조 핵산 분자.
  8. 다음을 포함하는 핵산의 합성 방법:
    a. 표적 핵산에 다음을 포함하는
    b. 공조 핵산 분자를 접촉시키고:
    i. 제 1 핵산 서열, 여기에서 제 1 핵산 서열은 표적 핵산의 제 1 영역에 상보적이며, 그리고 제 1 핵산은 3＇ 단부에서 연장가능하고;
    ii. 제 2 핵산 서열, 여기에서 제 2 핵산 서열은 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부의 하류에서 표적 핵산에 혼성화되도록 표적 핵산의 제 2 영역에 상보적이며;
    iii. 상기 제 1 및 제 2 핵산 서열은 동시에 표적에 혼성화는 것이 허용되는 방식으로 상기 제1 및 제 2 핵산 서열을 연결시키는 링커; 그리고
    c. 핵산 합성에 적합한 조건들이 제공되고, 이에 따라 핵산이 합성된다.
  9. 청구항 8에 있어서, 여기에서 공조 핵산 분자는 라벨을 포함하는, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 여기에서 상이한 서열을 가진 한 개 이상의 공조 핵산 분자가 제공되는, 방법.
  11. 다음을 포함하는 표적 핵산 탐지 방법:
    a. 표적 핵산이 포함된 시료에
    b. 다음을 포함하는 공조 핵산 분자를 접촉시키고 :
    i. 제 1 핵산 서열, 여기에서 제 1 핵산 서열은 표적 핵산의 제 1 영역에 상보적이며, 그리고 제 1 핵산은 3＇ 단부에서 연장가능하고;
    ii. 제 2 핵산 서열, 여기에서 제 2 핵산 서열은 제 1 핵산 서열의 3＇ 단부의 하류에서 표적 핵산에 혼성화되도록 표적 핵산의 제 2 영역에 상보적이며;
    iii. 상기 제 1 및 제 2 핵산 서열은 동시에 표적에 혼성화는 것이 허용되는 방식으로 상기 제1 및 제 2 핵산 서열을 연결시키는 링커; 그리고
    c. 그리고 표적 피분석물(analyte)을 탐지한다.
  12. 청구항 11에 있어서, 여기에서 라벨은 전술한 제 2 핵산 서열에 부착되는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 여기에서 신호에서 변화는 제 2 핵산 서열의 뉴클레아제 분열로 인하여 신호 변화로 부터 유도되는, 방법.
  14. 다음을 포함하는 표적 핵산을 증폭시키는 방법:
    a) 청구항 1의 공조 핵산 분자를 제공하고;
    b) 표적 핵산을 제공하고; 그리고
    c)증폭을 위한 적절한 조건하에서 표적 핵산을 증폭시킨다.
    청구항 14에 있어서, 여기에서 제 1 핵산 서열은 프라이머인, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 여기에서 제 2 핵산 서열은 프로브인, 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 여기에서 상이한 서열을 가진 한 개 이상의 공조 핵산 분자가 제공되는, 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 여기에서 제 2 핵산 서열 부착되지 않은 제 1 핵산 서열은 통상적 프라이머인, 방법.
  18. 다음을 포함하는 핵산 탐지 방법:
    a) 청구항 1의 공조 핵산 분자를 제공하고, 여기에서 공조 핵산은 탐지가능한 라벨을 포함하고;
    b) 표적 핵산을 제공하고; 그리고
    c) 표적 핵산이 탐지된다.
  19. 청구항 18에 있어서, 여기에서 탐지가능한 라벨은 제 1 핵산 서열에 부착되는 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 여기에서 탐지가능한 라벨은 제 2 핵산 서열에 부착되는 방법.
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