CN104845967B - 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用 - Google Patents

寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种选择性扩增目标核酸序列变异体的方法。通过采用一种特殊结构的寡聚核苷酸片段，该片段分为引物区和变异体识别区。当非待检测核酸变异体作为模板时，变异体识别区与引物区延伸产生的序列，形成一种发夹结构；当待检测变异体作为模板时，变异体识别区与引物区延伸产生的序列无法形成稳定的发夹结构。上述发夹结构不适宜作为下一轮扩增的模板，抑制了扩增效率，待检测变异体由于无法形成稳定的发夹结构，因此可以得到有效扩增从而实现选择性扩增。

Description

寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体 的方法及应用
本申请要求申请日为2015年4月15日、申请号为201510177952.5、发明名称为“寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，具体是涉及一种寡聚核苷酸片段、及使用其进行选择性扩增目标核酸序列变异体的方法。本发明还涉及检测核酸变异体的试剂盒的应用，广泛应用于核酸扩增、基因分型等领域。
背景技术
等位基因一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因，具有多态性。等位基因多态性分析应用的领域广泛，包括法医鉴定、药性分析、基因分型、器官移植，也包括检测大量野生型基因背景的肿瘤细胞中的基因突变等。但是通常情况下，肿瘤细胞相较于周围正常的组织细胞所占的比例相当低，检测到肿瘤细胞十分困难，尤其检测大量野生型基因背景中肿瘤基因的单点突变尤为困难。为了检测少量的目的核酸序列的突变变异体，目前一般将选择性扩增的方法与选择性检测的方法结合进行检测。选择性检测方法有高分辨率熔解曲线、探针杂交、TaqManTM探针等方法。美国专利公开的(U.S.Pat.Nos.5,210,015,5,538,848 and 6,326,145)TaqManTM探针方法是探针特异性的与待检测核酸片段杂交，并且在具有5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的作用下酶切，所产生信号用来指示存在待检测目的片段。但由于突变型变异体所占比例十分稀少，易导致信号淹没在与待检测目的序列突变型变异体相似的野生型变异体所产生的信号中，而选择性扩增法的选择性较高。
因此，等位基因选择性扩增允许我们选择性的扩增并检测目的核酸序列的突变型变异体。在一个成功的选择性扩增系统中，只有目的核酸序列中的突变型变异体被扩增，而目的核酸序列的野生型变异体不被扩增、或者目的核酸序列的野生型变异体的扩增效率远远低于目的核酸序列中突变型变异体的扩增效率。为了达到选择性扩增的目的，多种方法被开发出来，如下述的PCR夹子方法、RFLP-PCR方法、数字PCR方法、低变性温度下共扩增PCR方法。
PCR夹子方法(PCR clamping method)通过抑制目的核酸序列的野生型变异体的扩增来达到选择性扩增待检测目的片段的目的。使用肽核酸(PNA)或使用锁核酸(LNA)的方法分别在文献[Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)]和[Luo etal.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2 e12(2006)]中公开。但是，与目的核酸序列的野生型变异体与突变型变异体通常只有一个碱基与待检测目的片段不同，这种方法并不能完美的抑制住这些非目的片段的扩增。
RFLP-PCR方法通过在PCR反应之前或是在PCR反应的过程中使用限制性内切酶，除去了与目的核酸序列突变型变异体相似的野生型变异体，从而达到扩增并富集目的核酸片段的突变型变异体的目的。基于此方法有多种变化，包括限制性酶切位点突变分析PCR(RSM-PCR)方法，通过在突变位点基于引物连接的扩增(APRIL-ATM)方法等等。虽然这类方法具有设计简单和成本低廉的优点，并且在一些特定的实验中具有较好的选择性，但是它依赖于突变位点附近具有限制性内切酶酶切位点，在具体应用中，这类方法的选择性有限。
数字PCR(digital PCR)通过稀释模板和增加PCR反应的数目来检测少量目的核酸序列突变型变异体[Vogelstein B,Kinzler KW.Digital PCR.ProcNatlAcad SciUSA1999；96:9236-41]。理论上，当核酸模板稀释到每个PCR反应中仅有一个或没有核酸模板时，这个PCR反应中要么没有扩增，要么扩增野生型模板或扩增突变型模板。结合相应的检测方法即可以达到检测少量突变型变异体的目的。理论上，该方法通过增加PCR反应的数量选择性是无限的。但是在实际操作中，选择性不仅受限于Taq DNA聚合酶的保真性限制，也受限于同时能进行的PCR数目。虽然有报道基于数字PCR的方法具有高选择性，如[Bielas JH,LoebLA.Quantification of random genomic mutations.Nat Methods 2005；2:285-90]所公开的内容。但该法通常需要专门的仪器并借助芯片技术，过程非常繁琐复杂，成本较高。
低变性温度下共扩增PCR(Coamplification at lower denaturationtemperature PCR，Cold-PCR)是一种通过调节PCR反应的热循环条件来富集目的扩增片段的方法。在低变形温度下(Tc)，目的核酸序列的突变型变异体或者突变型变异体与野生型变异体形成的异源二聚体相较于野生型变异体更容易变性而被进一步扩增并富集。该方法能提供一定的选择性，但是这种选择性仍然是不够的，如[Li J,Wang L,Mamon H,KulkeMH,Berbeco R,Makrigiorgos GM.Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNAsequences and redefines the sensitivity of genetic testing.Nat Med 2008；14:579–84]所公开的内容。
在一个典型的聚合酶链式反应PCR中，上游引物与下游引物分别与目的基因的两条链完全互补。如果在引物的3'末端有一个或多个碱基的不匹配则有可能造成扩增效率的大幅度降低，这样的错配有的影响较大而有的影响较小。在检测单点突变的体系中，有人将引物3’末端最后一个碱基或倒数第二个碱基设计成与突变位点完全互补匹配，从而选择性的扩增突变基因而对正常非突变基因扩增效率很低，这种方法称为等位基因特异性扩增方法(见U.S.Pat 5639611)。这种选择性扩增的方法可以通过调节体系的反应条件来达到较佳选择性。但尽管如此，等位基因特异性PCR在很多应用中选择性远远不够。
针对提高选择性的研究，一种改良的方法是在引物中额外引入一个突变位点来提高体系的选择性(见U.S.Pat.No.5137806)，另一方法通过使用化学修饰的引物来提高等位基因特异性PCR方法的特异性。如对引物上某些核苷酸上脱氧核糖特定位置的2'-C、4'-C修饰可提高选择性[Gaster,J.and Marx,A Chem.Eur.J.2005,11:1861-1870]。还有在引物中引入一个不常见碱基提高体系的选择性的方法(见U.S.Pat No.7408051)，及用热稳定性的错配结合蛋白来提高体系的特异选择性的方法(见US 5877280)。
在等位基因特异性PCR中，体系的选择性是靠扩增的Ct之间的差值来体现的。引物扩增完全匹配的模板和不完全匹配的模板效率是不同的，产生不同的Ct值，他们之间的Ct值差异越大，体系的选择性越好。这种差别的分辨率在很多应用中是足够的，但是在检测肿瘤组织中大量野生型变异体中存在的少量突变型变异体时，这种分辨率可能是不够的。通过前述一系列方法虽然可以提高一定的分辨率，但具体应用时提高仍有限。并且，如果使用3’末端错配的引物一旦错误延伸就相当于人为的引入突变型的变异体，这种人为引入的突变型变异体在随后的每一轮循环中易被作为突变型变异体被扩增。
发明内容
本发明提供一种寡聚核苷酸片段，采用该寡聚核苷酸片段可以选择性扩增目标核酸序列变异体，可应用于检测核酸变异体的试剂盒中，广泛适用核酸扩增、基因分型等领域。
本发明提供的寡聚核苷酸片段，包含以共价相连的引物区和变异体识别区，引物区在3’端，变异体识别区在5’端，所述变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子或含有不能被核酸酶水解的修饰因子，所述变异体识别区与所述引物区延伸产生的序列形成发夹结构。
本发明进一步地，所述修饰因子包括碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。
本发明进一步地，所述的核酸双链稳定因子包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物/类似物中的一种或一种以上的组合。
本发明进一步地，核酸双链稳定因子与变异体识别区直接连接、或者通过共价相连。
本发明还提供一种选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，采用任一项所述的寡聚核苷酸片段进行选择性扩增，该方法包括：
⑴将所述寡聚核苷酸片段中引物区与目标核酸序列在反应体系中进行杂交，为扩增准备模板；
⑵在扩增体系中，所述引物区的3’末端被核酸聚合酶延伸；
⑶以所述待检测样品中的变异体作为模板时，寡聚核苷酸片段变异体识别区与引物区延伸，产生的序列无法形成稳定的发夹结构，扩增反应进行，
以所述待检测样品中的非待检测核酸变异体作为模板时，寡聚核苷酸片段变异体识别区与引物区延伸，产生的序列形成发夹结构，扩增反应被抑制。
本发明进一步地，结结合使用一种不区分不同核酸变异体的检测方法，包括染料法、杂交探针检测法、水解探针检测法、Taqman探针法或分子信标法。
本发明进一步地，结合使用一种区分不同核酸变异体的方法，包括测序法或高分辨率熔解曲线法，或者结合使用区分不同核酸变异体的杂交探针、区分不同核酸变异体的水解探针、区分不同核酸变异体的Taqman探针或区分不同核酸变异体的分子信标的方法。
本发明进一步地，所述扩增体系是一种随温度升高而启动反应的体系。
另一方面，本发明还提供用于检测核酸变异体的试剂盒，采用上述任一项所述的寡聚核苷酸片段检测所述核酸变异体。
本发明进一步地，所述试剂盒还包括核酸检测所需的试剂，所述核酸检测所需的试剂包括核酸染料和/或探针。
本发明进一步地，所述试剂盒还包括试剂盒扩增体系，所述试剂盒扩增体系包括核酸聚合酶、二价金属离子、核苷酸、盐、缓冲剂或辅助因子中的一种或多种组合。
本发明具有下述积极效果：
1、选择性更好。本发明选择性能优越，可以在大量非待检测核酸变异体中检测到微量的待检测核酸变异体。传统的等位基因特异性PCR的方法，使用3’末端错配的引物一旦错误的延伸就相当于人为的引入突变型的变异体，这种人为引入的突变型变异体在随后的每一轮循环中被作为突变型变异体被扩增，而本发明不存在这一问题。在本发明中，即使非待检测变异体在PCR一轮反应中得到了扩增，但是扩增产物在下一轮反应中仍然容易形成发夹结构而无法高效扩增，从而高效的抑制了非待检测变异体的扩增效率，实现选择性扩增。
2、引物设计简单，操作方便。
3、应用广泛，本发明可广泛的应用于核酸扩增，基因分型等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为发夹结构示意图；
图2为利用本发明寡聚核苷酸片段实现选择性扩增的技术原理示意图；
图3为本发明寡聚核苷酸片段对EGFR G719S选择性扩增结果示意图；
图4为本发明寡聚核苷酸片段对EGFR T790M选择性扩增结果示意图；
图5为本发明寡聚核苷酸片段对混合模板选择性扩增结果示意图；
图6为本发明寡聚核苷酸片段及MGB探针实现选择性扩增与选择性检测示意图；
图7为不含核酸双链稳定因子的本发明寡聚核苷酸片段扩增结果示意图；
图8为包含核酸双链稳定因子的本发明寡聚核苷酸片段扩增结果示意图；
图9为本发明的寡聚核苷酸片段对缺失突变的选择性扩增结果示意图。
具体实施方式
为了检测存在于大量非待检测核酸变异体中的少量待检测核酸变异体，发明人进行了大量的研究工作，并提出了本发明技术方案。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
一方面，本发明提供一种选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，该方法包括：采用至少含有一个寡聚核苷酸片段扩增待检测样品，该样品中可能含有一种或多种变异体。该寡聚核苷酸片段包含引物区和变异体识别区，引物区在3’端，变异体识别区在5’端，两者之间共价相连。在合适的反应体系中，引物区与目的核酸序列进行杂交，引物区的3’末端被核酸聚合酶延伸。当目的核酸序列的非待检测变异体作为模板时，变异体识别区与引物区延伸产生的序列完全互补配对或部分互补配对，形成一种发夹结构，如图1所示。
当待检测核酸变异体作为模板时，变异体识别区与引物区延伸产生的序列不完全匹配，无法形成稳定的发夹结构。上述形成的发夹结构不适宜作为下一轮扩增的模板，抑制了扩增效率，导致非待检测变异体的扩增遭到了相较于待检测变异体更大的抑制，从而实现选择性扩增，如图2所示。
在一些实施例中，变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子。双链稳定因子可以提高发夹结构的颈部的退火温度，起到稳定发夹结构的作用。在一些实施例中，变异体识别区含有不能被核酸酶水解的修饰，包括碱基类似物的修饰，核酸骨架的修饰，脱氧核糖类似物的修饰，包括但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。这些修饰可以防止该寡聚核苷酸片段被核酸酶水解，使得发夹结构不被破坏。
在一些实施方式中，与变异体识别区直接或者通过其他基团共价相连的核酸双链稳定因子连接在该寡聚核苷酸片段的5’端的核苷酸上。其中，核酸双链稳定因子可以是锁核酸，肽核酸或者DNA小沟结合物及其类似物等。
在一些实施例中，结合使用一种核酸检测的方法，包括不区分核酸变异体的核酸检测方法，也包括区分不同核酸变异体的检测方法。不区分核酸变异体的核酸检测方法包括染料法、杂交探针检测法、水解探针检测法、Taqman探针法或分子信标法。区分不同核酸变异体的检测方法包括测序法或高分辨率熔解曲线法，或者结合使用区分不同核酸变异体的杂交探针、区分不同核酸变异体的水解探针、区分不同核酸变异体的Taqman探针或区分不同核酸变异体的分子信标的方法。
在一些实施例中，合适的反应体系是一种随温度升高而启动反应的体系。这种随温度升高而启动反应的体系可以提高反应的特异性。
另一方面，本发明提供了一种寡聚核苷酸片段，它由引物区和变异体识别区组成，两者之间共价相连。当变异体识别区与引物区的延伸产生的序列完全互补或部分互补时，形成了一个发夹结构。所述变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子或者含有不能被核酸酶水解的修饰，包括碱基类似物的修饰，核酸骨架的修饰，脱氧核糖类似物的修饰，包括但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。其中，核酸双链稳定因子可以是锁核酸，肽核酸或者DNA小沟结合物及其类似物等。寡聚核苷酸片段的变异体识别区直接或者通过其他基团共价相连的核酸双链稳定因子连接在该寡聚核苷酸片段的5’端的核苷酸上。
另一方面，本发明提供了一种检测核酸变异体的试剂盒，该试剂盒包括前述寡聚核苷酸片段，该片段包含引物区和变异体识别区，两者之间共价相连。当变异体识别区与引物区的延伸产生的序列完全互补或部分互补时，形成了一个发夹结构。所述变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子或者含有不能被核酸酶水解的修饰，包括碱基类似物的修饰，核酸骨架的修饰，脱氧核糖类似物的修饰，包括但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。其中，核酸双链稳定因子可以是锁核酸，肽核酸或者DNA小沟结合物及其类似物等。该试剂盒还包括合适的试剂盒扩增体系，如包括核酸聚合酶延伸所需要的核酸聚合酶、二价金属离子、核苷酸、盐、缓冲剂及其他辅助因子等。此外该试剂盒还包括核酸检测所需的试剂，包括但不限于核酸染料、探针等中的一种或几种。
本发明寡聚核苷酸片段至少包含引物区和变异体识别区，两者之间可以共价相连，当引物区与其互补的靶核酸完全互补时，在合适的核酸聚合酶延伸体系中，核酸聚合酶利用核苷酸为原料延伸引物区。“互补”指的是寡聚核苷酸片段与其靶核酸通过氢键形成碱基对，包括A腺嘌呤与T胸腺嘧啶或者U尿嘧啶，C胞嘧啶与G鸟嘌呤之间形成的碱基对，也包括一些自然或者非自然的核苷酸类似物参与形成的氢键。例如，5-溴尿嘧啶与胸腺嘧啶类似可以与腺嘌呤形成互补碱基对，但在其烯醇形式下可以和鸟嘌呤一起形成互补碱基对。设计的本专利提及的寡聚核苷酸片段、及其它引物和探针见表1。
表1设计的寡聚核苷酸片段、及其它引物和探针
Figure GDA0002648636170000091
Figure GDA0002648636170000101
上述寡聚核苷酸片段及其它引物和探针，修饰在片段中间的，由所修饰片段，如MGB、spacer C3、FAM、QMGB，前后两两段片段表示，见核苷酸和氨基酸序列表。序列4相当于是由MGB、4a、spacer C3、4b连接的序列；序列8相当于是由MGB、8a、spacer C3、8b连接的序列；序列11相当于是由MGB、11a、spacer C3、11b连接的序列。
在合适的条件下，变异体识别区与引物区的延伸片段完全互补配对或者不完全互补配对。当变异体识别区与引物区的延伸产生的序列完全互补或部分互补时，形成了一个发夹结构。当变异体识别区与引物区的延伸片段不完全互补配对时，不形成稳定的发夹结构。上述形成的发夹结构不适宜作为下一轮扩增的模板。在一些实施例中，变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子。双链稳定因子可以提高发夹结构的颈部的退火温度，起到稳定发夹结构的作用。在一些实施例中，变异体识别区含有不能被核酸酶水解的修饰，包括碱基类似物的修饰，核酸骨架的修饰，脱氧核糖类似物的修饰，包括但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。这些修饰可以防止该寡聚核苷酸片段被核酸酶水解，使得发夹结构不被破坏。稳定的发夹结构抑制了扩增效率，导致野生型变异体的扩增遭到了相较于突变型变异体更大的抑制，从而实现选择性扩增，如图2所示。在初始核酸数量一致的情况下，由于不同的扩增效率，在若干循环后，其数量差异也会十分巨大，如表2所示。
表2不同扩增效率产生的核酸数量差异
Figure GDA0002648636170000102
Figure GDA0002648636170000111
引物区与变异体识别区之间的连接，核酸聚合酶延伸抑制剂与寡聚核苷酸之间的连接可以是直接共价键，例如通过核酸骨架的3’-5’磷酸二脂键，也可以是通过其他的化学基团共价相连，包括但不限于烷基，核苷酸及其类似物，糖，含氮杂环等。引物区和变异体识别区之间连接的长度可以为零(即直接相连)，也可以是数十个碱基对的长度或者其他合适的长度。
除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。以下的文献中本领域中大部分专业名词的一般定义：[Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)]；[The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)]；[The Glossary ofGenetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)]；[Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)]除非另外定义，本专利中所使用的专业名词与上述文献中对该专业名词描述一致。
名词“核苷”包括了一个碱基或碱性基团共价相连在一个糖分子或糖分子类似物上。如上所述，一个碱基可以是自然发生的碱基，也可以是非自然发生的碱基[Seela etal.(1999)Helv.Chim.Acta 82:1640]。一些碱基是为了改变核酸的熔解温度(Tm)，例如，那些包括7-氮杂嘌呤(例如7-氮杂鸟嘌呤，7-氮杂腺嘌呤等)，或者如专利U.S.Pat.No.5990303提到的。其他典型的杂环碱基包括但不限于：次黄嘌呤、肌醇、黄嘌呤、以2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤，肌醇，黄嘌呤的衍生物；以及腺嘌呤，鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤，肌醇，黄嘌呤的7-叠氮-8氮衍生物；6-氮杂胞苷；5-氟胞嘧啶核苷；5-氯胞嘧啶核苷；5-碘胞嘧啶核苷；5-溴胞嘧啶核苷；5-甲基胞嘧啶核苷；5-丙炔基胞嘧啶核苷；5-溴乙烯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。典型的核苷包括但不限于核糖核苷，脱氧核糖核苷，双脱氧核糖核苷和碳环核苷。
名词“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物，例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
名词“寡聚核苷酸”指的是一种核苷酸之间通过共价键相连形成的多聚体。一个寡聚核苷酸通常包括至少3个核苷酸。在某些情况下，寡聚核苷酸也有可能包含有磷氨[Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10):1925]，硫代磷酸酯[Mag et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:1437；and U.S.Pat.No.5644048)]，二硫代磷酸酯[Briu et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321]，O-甲基磷氨连接[Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach,Oxford University Press(1992))]，肽核酸骨架连接[Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895]。其他的寡聚核苷酸还包括那些带正电的骨架[Denpcy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097]，非离子型骨架(U.S.Pat.Nos.5386023,5637684,5602240,5216141和4469863)和非核糖骨架(U.S.Pat.Nos.5235033和5034506)。寡聚核苷酸包含一个或多个碳环糖也在核酸的定义中[Jenkins et al.(1995)Chem.Soc.Rev.pp.169-176]。那些为了提高分子在特定条件下的稳定性或者为了对寡聚核苷酸进行标签等目的在核糖-磷酸骨架上进行修饰的情况也包含在寡聚核苷酸的定义范围内。寡聚核苷酸还可能包括各种空间子(spacer)修饰，例如Spacer C3，Spacer C9，Spacer C18等。
名词“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA杂交体，寡聚核苷酸，适配体(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA杂交体，PNA-RNA杂交体等等。包括一切线性形式(单链或双链)或分支状形式的共价相连的核苷酸。一个典型的核酸通常是单链或者双链的，并包含磷酸二脂键。
名词“发夹结构”指的是核酸中的一段序列与其自身的另一段序列杂交配对所形成的结构。一个典型的发夹结构如图1所示。
名词“目标核酸序列”指的是待扩增的一段核酸序列，该序列作为核酸扩增的模板。
名词“核酸序列变异体”、“核酸变异体”指的是一段特定的核酸序列，不同变异体之间存在差别，这种差别可以是单个或多个碱基的不同，也可以是插入、缺失、易位或者以上所有类型的组合。
名词“野生型变异体”指的是自然存在的“正常”的基因序列，它在大多数群体中同一基因序列出现频率最高的序列。
名词“突变型变异体”指的是相比于“野生型变异体”不同的核酸序列。这种不同可以是单个或多个碱基的不同，也可以是插入或缺失或者以上所有类型的组合，例如，肿瘤细胞中突变的核酸序列。在一些实施例中，相较于野生型变异体，突变型变异体所占比例很少。
名词“引物区”指的是一段寡聚核苷酸序列，它与目的核酸序列的一条链互补配对，通常作为核酸聚合酶延伸的起点。
名词“变异体识别区”指的是一段寡聚核苷酸序列，它通常与核酸变异体之间有差别的序列配对，通过配对程度不同，能够区分不同的核酸变异体。
名词“核酸聚合酶”指的是能够将核苷酸通过生物催化反应，掺入到核酸中的酶。包括但不限于DNA聚合酶，RNA聚合酶，反转录酶，末端转移酶等。
名词“延伸”指的是寡聚核苷酸片段在核酸聚合酶的作用下与新掺入的核苷酸共价连接，形成新的寡聚核苷酸。
名词“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，核酸序列基础扩增(NASBA)，转录介导扩增(TMA)，环介导等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)，解旋酶依赖扩增(HDA)等。
在本发明实施例中，扩增指的是是聚合酶链式反应(PCR)。模板变性解链，寡聚核苷酸引物与模板退火杂交，伴随着核苷酸加入的延伸，如此反复循环一定轮数，实现目的核苷酸片段的增多。有时候，退火和延伸会使用同一温度。
名词“完全互补”用在本专利中形容一条寡聚核苷酸链时是指该寡聚核苷酸链的每一个碱基与双链核酸中另一条寡聚核苷酸链或者核酸链中的碱基形成沃森-克里克碱基对或类似氢键对。“部分互补”用在本专利中形容一条寡聚核苷酸链时是指该寡聚核苷酸链中有不止一个但不是全部的碱基与另一条寡聚核苷酸链或者核酸中的碱基形成沃森-克里克碱基对或类似氢键对。
“错配”的核酸指的是一个包含有一个或不止一个的错配碱基对的核酸。错配碱基对指的是双链核酸中相对的两个碱基之间无法形成沃森-克里克碱基对或类似氢键对。
本专利中的“核酸双链稳定因子”指的是可以帮助稳定核酸双链结构的化合物或基团，它可以是锁核酸，也可以是肽核酸或者是DNA小沟结合物。优选的，修饰是DNA小沟结合物。之前有文献报告DNA小沟结合物分子可以显著的提高杂交核酸二聚体的退火温度，通常DNA小沟结合物连接在寡聚核苷酸片段的3‘端。由于连接DNA小沟结合物可以显著的提高杂交核酸二聚体的退火温度，不同的核酸变异体与修饰的寡聚核苷酸片段互补程度不同而产生较大的退火温度的差异，从而产生不同的阻碍核酸聚合酶延伸的效果。本发明中，优选的，DNA小沟结合物连接在寡聚核苷酸的5‘端。
名词“小沟结合物”指的是能与DNA小沟相结合的化合物。DNA双螺旋的表面有两条沟，分别命名为大沟和小沟。DNA大沟相比于DNA小沟拥有更多的氢键供体、受体、电荷等信息，并且细胞内蛋白更喜好识别大沟内的位点来调控基因的表达或者行使其他的细胞内功能。
DNA小沟是自然界中一些抗生素的靶点，比如纺锤霉素(netropsin)，远霉素(distamycin)。这两种化合物结合DNA的解离常数均为10～5M数量级，并且表现出对DNAAT-rich区域的偏好性。这两种化合物在选择性，毒性等方面具有一定的局限。研究人员找到了许多类似的化合物用来克服这些局限性，比如以下综述文献中提及的化合物[Sondhiet al.(Curr.Med.Chem.4,313(1997))，[Reddy et al.(Pharmacology&Therapeutics 84,1(1999)],Wemmer(Biopolymers 52,197(2001)]，[Dervan(Bioorg.Med.Chem.9,2215(2001)]。
还有一些化合物据称更喜好结合DNA GC碱基对区域，比如以下文献中提及的化合物[Anti-Cancer Drug Design 5,3(1990)]，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,7586(1992)]，[Biochemistry 32,4237(1993)]，[Science 266,647(1994)]，[Anti-Cancer Drug Design10,155(1995)]，[Bioorg Med.Chem.8,985(2000)]，[Mol.Biol.34,357(2000)]。不同的纺锤霉素(netropsin)，远霉素(distamycin)的类似物被发现，例如[J Am.Chem.Soc.114(15),5911(1992)]，[Biochemistry 31,8349(1992)]，[Bioconjugate Chem.5,475(1994)]，[Biochem.Biophys.Res.Commun.222,764(1996)]，[J Med.Chem.43,3257(2000)]，[Tetrahedron 56,5225(2000)]，[Molecular Pharmacology 54,280(1998)]，[Bioorg Med.Chem.Lett.6(18),2169(1996)]，[J.Med.Chem.45,805(2002)]，[Bioorg.Med.Chem.Lett.12,2007(2002)]，(international patent applications WO97/28123,WO 98/21202,WO 01/74898and WO 02/00650,US patent numbers 4,912,199,5,273,991,5,637,621,5,698,674and 5,753,629)。纺锤霉素(netropsin)，远霉素(distamycin)的多肽同系物被以下专利WO/2003/059881公开。
名词“测序法”是指分析特定核酸片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。在循环阵列合成测序法中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下,通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。新型纳米孔测序法(nanoporesequencing)是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而不同的单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。核酸测序方法有多种，并且新的方法在不断的被开发中。
名词“染料法”指的是通过使用与核酸相互作用的染料从而获取信号的核酸检测方法。
名词“高分辨率熔解曲线法”指的是通过荧光染料嵌合到核酸中，通过实时检测不同核酸熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将不同核酸中存在的差异直观地展示出来。
名词“杂交探针检测法”指的是通过一小段带有可能被检测到的信号分子的核酸与待检测核酸之间形成碱基互补配对，从而产生信号变化以检测核酸的方法。探针可以是区分不同核酸变异体的探针，也可以是不区分不同核酸变异体的探针。
名词“水解探针检测法”指的是在有待检测核酸的情况下，通过核酸酶水解一小段带有可能被检测到的信号分子的核酸从而产生信号变化以检测核酸的方法。探针可以是区分不同核酸变异体的探针，也可以是不区分不同核酸变异体的探针。
名词“Taqman探针法”指的是美国专利公开的(U.S.Pat.Nos.5,210,015,5,538,848and 6,326,145)TaqManTM探针方法，通过探针特异性的与待检测核酸片段杂交，并且在具有5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的作用下酶切，所产生信号用来指示存在待检测目的片段。探针可以是区分不同核酸变异体的探针，也可以是不区分不同核酸变异体的探针。
名词“分子信标法”指的是通过分子信标来检测待检测核酸的方法，分子信标(molecular beacon)是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近从而不产生荧光。而当存在待检测核酸时，分子信标与待检测核酸杂交，从而使荧光基团与淬灭基团远离而成产生荧光信号的增加来检测待检测核酸。分子信标可以是区分不同核酸变异体的寡核苷酸探针，也可以是不区分不同核酸变异体的寡核苷酸探针。
在本发明实施例中，扩增反应包含了一个热启动的过程。本发明中的选择性扩增的选择性可能因为热启动的缘故而得到增强。本领域中有很多种热启动的方法，比如，使用蜡，将反应的关键组分与剩下的组分分离，而当温度升高时，蜡融化使得关键组分与剩下的组分相遇，从而使反应得以发生(U.S.Pat.No.5411876)，使用抗体使得核酸聚合酶可逆性的失活(US Pat 5338671)，或者使用与核酸聚合酶结合的寡聚核苷酸使核酸聚合酶失活(US Pat 5840867)。或者使用可逆的化学修饰的核酸聚合酶来达到热启动的效果(US Pat5677152，Pat 5773528)。
在本发明实施例中，核酸扩增实验是荧光定量PCR实验。在荧光定量PCR反应中，衡量扩增的参数是Ct值，较早的Ct值反应的是信号更快的达到阈值。扩增样品中不同核酸变异体之间的Ct差值，往往反映了扩增体系对不同核酸变异体扩增效率的差异，进一步反应了扩增体系的选择性。
对扩增产物的检测在本领域中也有很多方法。这些方法包括使用荧光标记的探针，或者各种与核酸结合的染料。这些检测可以是特异性的检测核酸变异体中一种或者多种，也可以是非选择性的检测所有核酸信号。对扩增产物的检测可以发生在扩增反应完成之后，比如通过凝胶电泳的方法，或者对核酸进行染色的方法。另外，对扩增产物的检测也可以发生在扩增反应的过程之中。通过区分不同核酸变异体的选择性检测的方法配合本专利提供的选择性扩增的方法可以进一步增强本专利方法的选择性。
实施例1：使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现对EGFR G719S选择性扩增
在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为104copies和105copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR G719S突变序列(SEQ ID NO：1)，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列(SEQ ID NO：2)。
(EGFR G719S突变型序列片段)：SEQ ID NO：1
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGaGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
(EGFR G719S野生型序列片段)：SEQ ID NO：2
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
正向引物序列为序列10，使用本专利提供的寡聚核苷酸片段作为反向引物，其序列为序列4(见表1)。
PCR反应体系为25ul，每个反应体系中均含有2％甘油，dATP,dCTP,dGTP,dTTP各含有200uM，正向引物(序列10)和本专利提供的寡聚核苷酸片段作为反向引物(序列4)的浓度均为200nM,SYBR Green浓度为0.4*，5个单位的热启动Taq DNA聚合酶。
使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；45cycles(95℃，15s；60℃，40s，single)；melting(95℃，1min；40℃，2min；99℃，continuous)；cool(37℃,30s)。
实验结果见图3，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。而体系的选择性则通过对不同变异体模板扩增的Ct值的差值来体现的，deltaCt的数据已表明在图3中。这些实验结果说明，使用本专利提供的寡聚核苷酸片段扩增不同变异体模板实现了对EGFR G719S选择性扩增。
实施例2：使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现对EGFR T790M选择性扩增
在这个例子中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为104copies和105copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR T790M突变序列(SEQ ID NO：5)，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列(SEQ ID NO：6)。
(EGFR T790M突变型序列片段)：SEQ ID NO：5
CTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT
(EGFR T790M野生型序列片段)：SEQ ID NO：6
CTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT
正向引物序列为序列7，使用本发明提供的寡聚核苷酸片段作为反向引物，其序列为序列8(见表1)。
PCR反应体系为25ul，每个反应体系中均含，2％甘油，dATP,dCTP,dGTP,dTTP各含有200uM，正向引物(序列7)和本发明提供的寡聚核苷酸片段作为的反向引物(序列8)的浓度均为200nM,SYBR Green浓度为0.4*，5个单位的热启动Taq DNA聚合酶。
使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；45cycles(95℃，15s；60℃，40s，single)；melting(95℃，1min；40℃，2min；99℃，continuous)；cool(37℃,30s)。
实验结果见图4，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。而体系的选择性则通过对不同变异体模板扩增的Ct值的差值来体现的，deltaCt的数据已表明在图4中。这些实验结果说明：使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现了对EGFR T790M选择性扩增。
实施例3：使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现对混合模板选择性扩增
在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为104copies和105copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR G719S突变序列(SEQ ID NO：1)，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列(SEQ ID NO：2)。
(EGFR G719S突变型序列片段)：SEQ ID NO：1
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGaGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
(EGFR G719S野生型序列片段)：SEQ ID NO：2
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
正向引物序列为序列10，使用本发明提供的寡聚核苷酸片段作为反向引物，其序列为序列4(见表1)
PCR反应体系为25ul，每个反应体系中均含有2％甘油，dATP,dCTP,dGTP,dTTP各含有200uM，正向引物(序列10)和本发明提供的寡聚核苷酸片段作为的反向引物(序列4)的浓度均为200nM,SYBR Green浓度为0.4*，5个单位的热启动Taq DNA聚合酶。
使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；45cycles(95℃，15s；60℃，40s，single)；melting(95℃，1min；40℃，2min；99℃，continuous)；cool(37℃,30s)。
实验结果见图5，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。而体系的选择性则通过对不同变异体模板扩增的Ct值的差值来体现的，deltaCt的数据已表明在图5中。这些实验结果说明，使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现了对混合模板选择性扩增。
实施例4：联合使用发明提供的寡聚核苷酸片段及MGB探针实现选择性扩增与选择性检测
在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为100copies和104copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR G719S突变序列(SEQ ID NO：1)，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列(SEQ ID NO：2)。
(EGFR G719S突变型序列片段)：SEQ ID NO：1
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGaGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
(EGFR G719S野生型序列片段)：SEQ ID NO：2
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
正向引物序列为序列10，使用本发明提供的寡聚核苷酸片段作为反向引物，其序列为序列4。MGB探针的序列为SEQ ID NO：9(见表1)。
PCR反应体系为25ul，每个反应体系中均含有2％甘油，dATP,dCTP,dGTP,dTTP各含有200uM，正向引物(序列10)和本发明提供的寡聚核苷酸片段作为的反向引物(序列4)以及探针(序列9)的浓度均为200nM,1个单位的热启动Taq DNA聚合酶。
使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；45cycles(95℃，15s；60℃，40s，single)。
实验结果见图6，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。而体系的选择性则通过对不同变异体模板扩增的Ct值的差值来体现的，deltaCt的数据已表明在图6中。这些实验结果说明联合使用本发明提供的寡聚核苷酸片段及MGB探针实现了选择性扩增与选择性检测。
实施例5：不包含核酸双链稳定因子的本发明提及的寡聚核苷酸片段与包含核酸双链稳定因子的本发明提及的寡聚核苷酸片段的比较
在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体都是同样的量，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR G719S突变序列(SEQ ID NO：1)，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列(SEQ ID NO：2)。
(EGFR G719S突变型序列片段)：SEQ ID NO：1
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGaGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
(EGFR G719S野生型序列片段)：SEQ ID NO：2
TTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGT
正向引物序列为序列3，有的实验组中作为反向引物的寡聚核苷酸片段5’端被双链稳定因子修饰，其序列为序列11；而有的实验组中作为反向引物的寡聚核苷酸片段没有双链稳定因子的修饰，其序列为序列16(见表1)。
PCR反应体系为25ul，每个反应体系中均含有2％甘油，dATP,dCTP,dGTP,dTTP各含有200uM，正向引物(序列3)和本发明提供的寡聚核苷酸片段作为的反向引物(序列11和序列16)的浓度均为200nM,SYBR Green浓度为0.4*，5个单位的热启动Taq DNA聚合酶。
使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；45cycles(95℃，15s；60℃，40s，single)；melting(95℃，1min；40℃，2min；99℃，continuous)；cool(37℃,30s)。
实验结果见图7，图8，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。而体系的选择性则通过对不同变异体模板扩增的Ct值的差值来体现的。deltaCt的数据已表明在图7，图8中。这些实验结果说明包含核酸双链稳定因子的本发明提供的寡聚核苷酸片段比不包含核酸双链稳定因子的本发明提供的寡聚核苷酸片段更具选择性。
实施例6：使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现对缺失突变的选择性扩增
在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体都是同样的量，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR 19外显子缺失突变序列(SEQ ID NO：12)，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR 19外显子野生型序列(SEQ ID NO：13)。
EGFR 19外显子缺失突变序列(SEQ ID NO：12)
TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC
EGFR 19外显子野生型序列(SEQ ID NO：13)：
TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC
正向引物序列为序列14，使用本发明提供的寡聚核苷酸片段作为反向引物，其序列为序列15。
PCR反应体系为25ul，每个反应体系中均含有2％甘油，dATP，dCTP，dGTP，dTTP各含有200uM，正向引物(序列14)和本发明提供的寡聚核苷酸片段作为的反向引物(序列15)的浓度均为200nM,SYBR Green浓度为0.4*，5个单位的热启动Taq DNA聚合酶。
使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；45cycles(95℃，15s；60℃，40s，single)；melting(95℃，1min；40℃，2min；99℃，continuous)；cool(37℃,30s)。
实验结果见图9，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。而体系的选择性则通过对不同变异体模板扩增的Ct值的差值来体现的。deltaCt的数据已表明在图9中。这些实验结果说明使用本发明提供的寡聚核苷酸片段实现了对缺失突变的选择性扩增。
本发明前述Spacer C3、MGB、Q-MGB、FAM修饰片段结构如下：
Figure GDA0002648636170000261
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Figure IDA0000731934040000011
Figure IDA0000731934040000021
Figure IDA0000731934040000031
Figure IDA0000731934040000041
Figure IDA0000731934040000051
Figure IDA0000731934040000061

Claims (11)

1.寡聚核苷酸片段，其特征在于:
包含以共价相连的引物区和变异体识别区，引物区在3’端，变异体识别区在5’端，所述变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子或含有不能被核酸酶水解的修饰因子，所述变异体识别区与所述引物区延伸产生的序列形成发夹结构。
2.如权利要求1所述的寡聚核苷酸片段，其特征在于：所述修饰因子包括碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。
3.如权利要求1所述寡聚核苷酸片段，其特征在于：所述的核酸双链稳定因子包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物中的一种或一种以上的组合。
4.如权利要求1所述寡聚核苷酸片段，其特征在于：核酸双链稳定因子与变异体识别区直接连接、或者通过共价相连。
5.一种选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，采用权利要求1至4任一项所述的寡聚核苷酸片段进行选择性扩增，该方法包括：
⑴将所述寡聚核苷酸片段中引物区与目标核酸序列在反应体系中进行杂交，为扩增准备模板；
⑵在扩增体系中，所述引物区的3’末端被核酸聚合酶延伸；
⑶以待检测样品中的变异体作为模板时，寡聚核苷酸片段变异体识别区与引物区延伸，产生的序列无法形成稳定的发夹结构，扩增反应进行，
以所述待检测样品中的非待检测核酸变异体作为模板时，寡聚核苷酸片段变异体识别区与引物区延伸，产生的序列形成发夹结构，扩增反应被抑制。
6.如权利要求5所述的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，其特征在于：结合使用一种不区分不同核酸变异体的检测方法，包括染料法、杂交探针检测法、水解探针检测法、Taqman探针法或分子信标法。
7.如权利要求5所述的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，其特征在于：结合使用一种区分不同核酸变异体的方法，包括测序法或高分辨率熔解曲线法，或者结合使用区分不同核酸变异体的杂交探针、区分不同核酸变异体的水解探针、区分不同核酸变异体的Taqman探针或区分不同核酸变异体的分子信标的方法。
8.如权利要求5所述的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，其特征在于：所述扩增体系是一种随温度升高而启动反应的体系。
9.一种用于检测核酸变异体的试剂盒，采用权利要求1至4任一项所述的寡聚核苷酸片段检测所述核酸变异体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括核酸检测所需的试剂，所述核酸检测所需的试剂包括核酸染料和/或探针。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括试剂盒扩增体系，所述试剂盒扩增体系包括核酸聚合酶、二价金属离子、核苷酸、盐、缓冲剂或辅助因子中的一种或多种组合。
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